BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Hemoglobin merupakan protein yang tersusun dari empat subunit

masing-masing yang masing-masing berisi heme yang separuhnya

menempel pada rantai polipepida. Karena berisi empat deoksihemoglobin,

molekul hemoglobin juga dipresentasikan sebagai Hb4 dan sebenarnya

bereaksi dengan empat O2 untuk membentuk Hb4O8. Reaksi tersebut

berlangsung dengan sangat cepat, hanya kurang dari 0.01 detik. Begitu

juga dengan deoksigenasi Hb4O8 juga berlangsung dengan sangat cepat.1

Hemoglobin yang terikat pada oksigen disebut oksigen

teroksigenasi atau oksihemoglobin (HbO2). Hemoglobin juga dapat

mengikat suatu gas hasil pembakaran yang tidak sempurna yaitu

karbonmonoksida (HbCO). Ikatan Hb dengan CO ini 200 kali lebih kuat

daripada ikatan Hb dengan oksigen, dan akibatnya Hb tidak dapat

mengikat, membawa dan mendistribusikan ke jaringan. Beberapa derivate

dari hemoglobin, misalnya OksiHb, Hb, dan HbCO dapat dibedakan

dengan menlakukan pengenceran. Untuk lebih jelas lagi setiap derivate Hb

dapat pula dibedakan dengan menggunakan spektroskop. 2

Semua membran biologis mempunyai suatu struktur yang sama

yaitu dibentuk dari molekul molekul lipid dan protein satu dengan lainnya

yang saling dihubungkan dengan dengan ikatan nonkovalen. Lipid ini

berperan sebagai pembatas yang bersifat impermeabel relatif terhadap

aliran molekul-molekul yang larut dalam air. Dalam larutan hipotonik, sel

darah merah akan menggembung karena cairan dari luar sel akan masuk ke

dalam sel darah merah. Bila pembengkakan sel darah merah melewati

batas fragilitas sel darah merah, sel itu akan pecah menjadi hemolisis. Hb

akan larut di dalam larutan hipotonik. Sedangkan didalam larutan larutan

hipertonik, cairan dari sel darah merah akan keluar, yang menyebabkan sel

darah merah mengkerut (creanated). Kemudian jika pada pelarut organik,

lipid membran sel darah merah akan hemolisis, karena pelarut organik

bersifat melarutkan lemak. 2

Oksigen diperlukan dalam proses metabolisme dalam makhluk

hidup untuk mengasilkan energi. Proses oksidasi ini dapat berlangsung

secara enzimatis dengan melibatkan enzim superoksida dismutase (SOD),

katalase dan peroksidase. Pada proses oksidasi dapat terbentuk radikal

bebas yang berasal dari oksigen yaitu senyawa oksigen reaktif (ROS).

Reaksi radikal bebas dengan lipid membentuk peroksidase lipid, salah satu

contohnya dalah MDA, sehingga kadar peroksida lipid dapat

menggambarkan banyaknya radikal bebas yang terbentuk. 2

Terdapat banyak sekali proses biokimia mengani sistem respirasi

ini, baik hemoglobin, maupun sel darah merah secara umum. Oleh karena

itu akan dibahas satu persatu mengenai pembahasan yang telah dijabarkan

diatas. Sehingga semua hal diatas dapat diketahui dengan praktikum ini.

1.2 Tujuan

a. Memperlihatkan bahwa Hb dapat mengikat dan melepas O2

b. Memperlihatkan ikatan Hb dengan CO lebih larut dibanding dengan

oksigen

c. Demonstrasi spektrum derivat Hb

d. Memperlihatkan pengaruh larutan hipotonik dan pelarut organik

terhadap membran sel darah merah

e. Penetapan kadar Hb Kuantitatif

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Sifat Hemoglobin dan Sel Darah Merah

2.1.1. Uji Oksihemoglobin dan Deoksihemoglobin

Hemoglobin merupakan pembawa oksigen yang baik. Hemoglobin

merupakan protein yang tersusun atas empat subunit yang masing-masing

berisi heme yang separuhnya menempel pada rantai polipeptida. Pada

orang dewasa normal, kebanyakan hemoglobin berisi dua rantai alfa dan

dua rantaI beta. Heme merupakan komplek cincin porfirin yang meliputi

satu atom ferrous besi. Masing-masing atom besi tersebut secara reversible

dapat mengikat sehingga reaksi tersebut dinamakan oksigenasi. Bukan

oksidasi. Reaksi dengan oksigen adalah1

Hb(Fe2+) + O2 Hb(Fe2+)O2

Karena berisi empat deoksihemoglobin, molekul hemoglobin juga

direpresentasikan sebagai Hb4 dan sebenarnya bereaksi dengan empat

molekul O2 untuk membentuk Hb4O8. Reaksi tersebut berlangsung dengan

sangat cepat, hanya kurang dari 0.01 detik. Begitu pula dengan

deoksigenasi Hb4O8 juga berkangsung dengan sangat cepat. 1

Hemoglobin yang terikat pada oksigen disebut oksigen teroksigenasi

atau oksihemoglobin (HbO2), dan senyawa ini dapat terurai kembali

menjadi dioksihemoglobin, yaitu hemoglobin yang melepas oksigen. 2

2.1.2. Uji Karbonmonoksidahemoglobin (HbCO)

Dalam keadaan tereduksi Fe dalam molekul Hb dapat mengikat dan

melepaskan oksigen tergantung pada tekanan O2 dan CO2. Hemoglobin

juga dapat mengikat suatu gas hasil pembakaran yang tidak sempurna

yaitu karbonmonoksida (HbCO). Ikatan Hb dengan CO ini 200 kali lebih

kuat daripada ikatan Hb dengan oksigen, dan akibatnya Hb tidak dapat

mengikat, membawa dan mendistribusikan ke jaringan.2

2.1.3. Uji untuk Methemoglobin

Besi fero pada Hemoglobin rentan mengakami oksidasi oleh

superoksida dana gen ereduksi lainnya yang membentuk metemoglobin

yang tidak mampu mengangkut oksigen. Muatan atom Fe yang terdapat

pada pusat hem dapat berubah menjadi Fe3+. Hal in dapat terjadi karena

oksidasi atau methemoglobin (MetHb) atau Hb(Fe3+). Perubahan menjadi

Fe3+ biasanya sebagai efek samping obat, seperti sulfonamide, dari

hemoglobin M herediter, atau akibat berkurangnya aktivitas enzim

methemoglobin reduktase. 3

2.1.4. Penetapan Kadar Hb dengan Metode Sianmethemoglobin

Hemoglobin darah diubah menjadi Sianmethemoglobin (hemoglobin

sianida) dalam larutan yang berisi kaliumferrisidanida dan kalium sianida.

Absorbansi larutan diukr pada gelombang 540 nm atau filter hijau. Larutan

drabkin yang digunakan pada cara ini mengubah hemoglobin,

oksihemoglobin, methemoglobin, dan karboksimoglobin menjadi

sianmethoglobin. Sulhemoglobin tidak berubah karena itu tidak ikut

diukur. 4

2.2 Sifat Membran Sel Darah Merah

Semua membran biologis mempunyai suatu struktur yang sama yaitu

dibentuk dari molekul-molekul lipid dan protein yang satu sama lainnya

saling dihubungkan dengan ikatan-ikatan nonkovalen, molekul lipid terdiri

atas dua lapis lipid dan meurpakan struktur pembatas yang bersifat

impermabel relative terhadap aliran molekul molekul dalam air2

2.2.1 Hemolisis sel darah merah

Dalam larutan hipotonis sel darah merah akan menggembung karena

cairan dari luar sel akan masuk kedalam sel darah merah. Bila

pembengkakan sel darah merah larut dalam cairan hipotonik, maka larutan

ini akan berwarna merah jernih. Sedangkan di dalam larutan hipertonik sel

darah merah akan mengkerut karena pengaruh tekanan osmotik plasma,

cairan plasma sel darah merah akan keluar dari sel. 2,3

2.2.2 Pengaruh pelarut organik terhadap membran sel darah merah

Membran sel darah merah yang mengandung lipid akan lisis

(hemolisis) pada pelarut organik tertentu yang bersifat melarutkan lemak.

Dinding sel darah merah adalah lipoprotein. Lemak merupakan pelarut

organik. Dalam pelarut lemak, dinding sel darah merah akan larut

sehingga akan terjadi hemolisis. Oleh karena itu lemak tersebut termasuk

larutan hipotonis karena dapat membuat sel menjadi lisis. 3 Reaksi lisis sel

darah merah oleh pelarut organic disebut hemolisis kimia, seperti

kloroform, alkohol, eter, aseton, benzene, dan substansi lainnya5

Osmosis memainkan peranan yang sangat penting pda tubuh

makhluk hidup, misalnya pada membrane sel darah merah. Jika

meletakkan sel darah merah dalam suatu pelarut hipertrofi, air yang

terdapat didalam sel akan ditarik keluar dari sel, sehingga sel mengerut

dan rusak (krenasi). Sebaliknya jika sel darah merah diletakkan di dalam

sel darah merah, maka cairan dalam plasma akan masuk ke dalam sel,

membuat sel terus membesar dan menjadi pecah (hemolisis).6

2.3 Pengukuran kadar peroksida lipid dalam serum

Oksigen diperlukan dalam proses metabolism dalam makhluk hidup

untuk menghasilkan energi. Proses oksidasi ini dapat berlangsung secara

enzimatik yang melibatkan enzim seperti superoksida dismutase, katalase

dan peroksidase. Proses oksidasi dapat berlangsung secara nonenzimatik

yang berlangsung spontan dan melibatkan logam-logam transisi seperti Fe

dan Cu. Pada proses ini dapat terbentuk radikal bebas yang berasal dari

oksigen reaktif (ROS). 2

Radikal bebas dapat terbentuk melalui dua cara yaitu secara endogen

(sebagai respon normal proses biokimia intrasel maupun ekstrasel) dan

secara eksogen (berasal dari polusi, makanan, injeksi, dan absorpsi melalui

kulit).7

Radikal bebas pada umumnya dapat mempunyai efek yang

menguntungkan, seperti membentu destruksi sel-sel mikroorganisme dan

kanker. Akan tetapi produksi yang berlebihan dan produksi antioksidan

yang tidak memadai dapat menyebabkan kerusakan sel-sel jaringan dan

enzim-enzim. kerusakan jaringan dapat terjadi akibat gangguan oksidatif

yang disebabkan oleh radikal bebas asam lemak atau dikenal dengan

peroksidasi lipid. 2

Radikal hidroksil merupakan oksigen reaktif yang baling berbahaya

karena mempunyai tingkat reaktivasi yang tinggi. Radikal hidroksil dapat

merusak tiga jenis senyawa penting untuk mempertakankan integritas sel,

yaitu PUFA yang merupakan komponen penting fosfolipid penyusun

membran sel; DNA; dan protein yang memegang peran penting seperti

enzim, reseptor, antibodi, dll 1,2

Pengukuran radikal bebas didalam tubuh sangat sulit dilakukan

karena radikal bebas bereaksi sangat cepat sehingga seringkali dilakukan

pengukuran tidak langsung dengan MDA, senyawa ini sering dilakukan

untuk pengukuran reaksi radikal bebas lipid. MDA merupakan produk

enzimatis dan nonenzimatis dari pemecahan prostaglandin endoperoksida

dan prosduk akhir lipid peroksidasi. MDA merupakan molekul reakif yang

dikenal sebagai penanda peroksidase lipid.2

BAB III

METODELOGI

1.1 Alat Dan Bahan

1.1.1 Uji Oksihemoglobin dan Deoksihemoglobin

a. Darah segar

b. Pereaksi stokes

c. Larutan NH4OH

1.1.2 Uji karbonmonoksidahemoglobin (HbCO)

a. Darah segar

b. Sumber gas CO

c. Pereaksi stokes

d. NH4OH

1.1.3 Uji untuk methemoglobin

a. Darah segar

b. Pereaksi K3Fe (CN)6

c. Pereaksi stokes

1.1.4 Penetapan kadar Hb dengan metode Sianmethemoglobin

a. Darah yang akan diperiksa

b. Pipet sahli 0,2 ml

c. Pipet volumetric 5 ml

d. Pereaksi Drabkin (larutan NaHCO3, 52 mg KCN beracun dan 18 mg

K3Fe(CN)6 dalam 1 L air suling (simpan dalam botol)

e. Spektofotometer dan kuvet

f. Standar Hb

1.1.5 Hemolisis sel darah merah

a. Darah segar

b. Larutan NaCl 2%

c. Pengaruh pelarut organik terhadap membran sel darah merah

d. Darah segar

e. Larutan NaCl 0,9%

f. Kloroform

g. Eter

1.1.6 Pengukuran kadar peroksida lipid dalam serum

a. Hemolisat darah

b. Larutan asam trikloroasetat (TCA) 10%

c. Larutan TBA 0,67%

1.2 Cara Kerja

1.2.1 Uji Oksihemoglobin Dan Deoksihemoglobin

1.2.1.1 OksiHb

a. Ke dalam sebuah tabung reaksi encerkan 2 ml darah dengan 6 ml air.

Campur dengan baik dan perhatikan warna merah terang dari

oksihemoglobin yang terbentuk.

b. Bagi 2 isi tabung tersebut sehingga masing-masing tabung berisi 4 ml.

Gunakan tabung 1 sebagai kontrol.

1.2.1.2 Pembentukan DeoksiHb

a. Isi tabung ketiga dengan 2 ml pereaksi Stokes dan tambahkan NH4OH

secukupnya untuk melarutkan endapan yang segera terbentuk.

Campuran ini merupakan larutan pereduksi yang kuat.

b. Masukkan beberapa tetes larutan Stokes ke dalam tabung 2. Terlihat

perubahan warna karena terbentuknya deoksiHb. Bandingkan dengan

tabung 1.

1.2.1.3 Pembentukan Kembali OksiHb dari DeoksiHb

a. Kocok kuat-kuat tabung yang berisi deoksiHb, maka akan terjadi

kembali oksigenasi dari udara. Perhatikan dan catat warna HbO2 yang

kembali terbentuk.

b. Oksigenasi dan deoksigenasi kembali ini dapat dilakukan berulang-

ulang.

1.2.2 Uji Karbonmonoksidahemoglobin (HbCO)

a. Encerkan 2 mL darah dengan 8 mL air suling. Bagi 2 darah encer itu

(masing-masing 5 mL) dalam dua tabung reaksi.

b. Pada tabung 1 alirkan gas CO (dalam lemari asam). Oksihemoglobin

akan berubah menjadi karbonmonoksihemoglobin. Bandingkan warna

kedua tabung tadi.

c. Pindahkan masing-masing 1 mL dari tabung 1 (yang berisi HbCO) ke

dalam tabung 3 dan 4, dan masing-masing 1 mL dari tabung 2 (yang

berisi HbO2) ke dalam tabung 5 dan 6.

d. Tambahkan pereaksi stokes pada tabung ke 3 dan 5. Jelaskan hasil

yang didapat!

e. Encerkan isi tabung 4 dan 6 dengan 4 mL air suling. Bandingkan

warna kedua cairan itu. OksiHb berwarna kekuning-kuningkan,

sedangkan HbCO bersemu kemerahan (carmine tint).

1.2.3 Uji untuk Methemoglobin

a. Encerkan 1 mL darah dengan 4 mL air suling dalam tabung reaksi.

b. Ke dalam tabung itu tambahkan beberapa tetes K3Fe(CN)6 33%.

Perhatikan dan catat perubahan warna yang terjadi. Kemudian

tambahkan pereaksi Stokes ke dalam tabung itu dan kocok kuat-kuat.

Perubahan apakah yang terlihat?

c. Encerkan 3 mL darah dengan 3 mL air suling dan panaskan sebentar,

lalu tambahkan 6 mL K3Fe(CN)6. Campur dengan membalik-

balikkannya. Perhatikan gelembung- gelembung oksigen yang

terbentuk.

1.2.4 Penetapan Kadar Hb dengan Metode Sianmethemoglobin

a. Pipetkan dengan pipet volumetric 5 mL perekasi drabkin ke dalam

sebuah tabung reaksi

b. Tambahkan 0,02 mL darah yang akan diperiksa pada tabung yang

berisi pereaksi Drabkin, bilas pipet tersebut 3 kali dengan pereaksi

Drabkin dalam tabung tersebut

c. Diamkan selama 10 menit

d. Pindahkan campuran tersebut ke dalam kuvet spektofometer dan

tentukan serapannya pada 540nm. Sebagai blanko digunakan pereaksi

Drabkin

e. Tentukan kadar Hb dalam 9% dari standar Hb yang disediakan dengan

rumus sbb

f. Kadar Hb =Ru/Rs x 10 g%= …g%

1.2.5 Hemolisis Sel Darah Merah

a. Ke dalam 10 tabung reaksi, isiskan campuran akuades, dan NaCl 2%

b. Campurkan dengan baik

c. Tambahkan 2 tetes suspense ke dalam setiap tabung dan kocok dengan

membalik-balikkan tabung perlahan. Diamkan 1 jam

d. Perhatikan dan catatlah derajat hemolisis pada tiap tabung

1.2.6 Pengaruh Pelarut Organik terhadap Membran Sel Darah Merah

a. Ke dalam 6 tabung reaksi, masukkan setiap 10 mL larutan NaCl 0,9%.

b. Tabung pertama digunakan sebagai kontrol dan pada ke 5 tabung

lainnya tambahkan setiap 2 tetes kloroform, eter, aseton, toluen, dan

alkohol secara berurutan.

c. Tambahkan ke dalam tiap tabung 2 tetes suspensi darah, biarkan

selama setengah jam. Perhatikan warna yang terbentuk dan

bandingkan dengan kontrol.

1.2.7 Pengukuran kadar peroksida lipid dalam serum

Bahan Uji (mL) Blanko

Hemolisat darah 0,25 -

Akuades - 0,25

Larutan TCA 10% dingin 0,50 0,50

Kosong, pusing, ambil

supernatant

Larutan TBA 0,067% 0,75 0,75

Masukkan penangas mendidih 10 menit, didinginkan/

baca serapan pada panjang gelomang 532 nm

Hasil A 532 kadar MDA

BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil

3.1.1 Uji Oksihemoglobin dan Deoksihemoglobin

Hasil Tabung 1

(OksiHb)

Tabung 2

(DeoksiHb)

Tabung 3

(Reoksigenasi

DeoksiHb)

Warna Tabung

yang Terbentuk

Merah Terang Merah tua,

kental

Merah Terang

3.1.2 Uji untuk Methoglobin

Tabung Warna Tabung

+ K3Fe(CN)6 Hitam Kecoklatan

Pengocokan kuat Hitam Kecoklatan + buih

+stokes Hitam Pekat

Pengocokan kuat Hitam Pekat + buih

Tabung Warna Tabung 2

+ K3Fe(CN)6 Hitam, terdapat endapan saat dipanaskan

Gelembung Udara Positif

3.1.3 Penetapan Kadar Hb dengan Metode Sianmethoglobin

Tabung Absorbansi

Blanko 0.040

Standard 0.211

Uji 0.222

Kadar Hb = Ru/Rs x Konsentrasi Standar

= 0.222/0.211 x 6

= 6.3 g/dl

3.1.4 Pengaruh Pelarut Organik Terhadap Membran Sel Darah Merah

Pelarut Hemolisis Keterangan

NaCl 0.9%

(Kontrol)

(-) Ada endapan, terlarut sebagian, terlihat

kabut tebal warna merah

Kloroform (++) Tidak ada endapan, terlarut sempurna

dibanding kontrol

Eter (+) Ada endapan sedikit, terlarut sebagian

Aseton (+) Ada endapan, terlarut sebagian, terlihat

kabut tebal warna merah

Toluen (+) Ada endapan, tidak larut, terlihat kabut

tipis warna merah

Alkohol (+) Ada endapan, larut sebagian, terlihat

kabut tebal berwarna merah

3.1.5 Demo

Tabung Akuades NaCl 2% NaCl

1. 10 0 0

2. 9 1 0.2%

3. 8 2 0.4%

4. 7.5 2.5 0.5%

5. 7 3 0.6%

6. 6.5 3.5 0.7%

7. 6 4 0.8%

8. 5.5 4.5 0.9%

9. 5 5 1.0%

10. 4.5 5.5 1.1%

R = [NaCl/ (NaCl + Akuades)] x 2%

3.2 Pembahasan

3.2.1 Uji Oksihemoglobin dan Deoksihemoglobin

Berdasarkan hasil praktikum yang didapat, terlihat warna darah

saat proses oksigenasi berwarna merah terang. Kemudian saat Hb

dideoksigenasikan, terlihat warna merah gelap yang mengental, dan saat

di reoksigenasikan kembali, warna merah gelap tersebut, menjadi warna

merah terang kembali.

Pada prinsipnya, saat Hb dikombinasikan dengan oksigen

(oksigenasiHb), terdapat suatu penyimpangan spektrum absorban, warna

darah berubah dari merah gelap menjadi merah terang. Dan proses ini

berkembalikan saat deoksigenasiHb, dimana warna terang akan berubah

menjadi warna gelap. Pada Hb dan oksiHb, zat besi berada dalam bentuk

ferro dan tidak dioksidasi pada proses oksigenasi. Jika terjadi proses

okisdasi dimana ferro dioksidasi menjadi ferri maka akan terbentuk

methemoglobin (uji selanjutnya).

Oleh karena itu, munculnya warna terang pada tabung 1,

menandakan adanya oksigenasi Hb (Hb dikombinasikan dengan

oksigen). Tabung 2 terbentuk warna merah gelap dan kental, hal tersebut

dikarenakan adanya proses deoksigenasi, dimana ikatan atau kombinasi

antara Hb dan oksigen dipecah. Sedangkan untuk tabung 3, terbentuk

warna merah terang lagi, karena terbentuk reoksigenasi deoksiHb, jadi

deoksiHb yang terbentuk, akan di ubah lagi menjadi oksiHb (kombinasi

oksigen dan Hb) dengan cara pengocokan tabung dengan kuat. Proses

oksiHb dan deoksiHb dapat diulang terus menerus.

3.2.2 Uji untuk Methoglobin

Berdasarkan hasil uji kali ini, terdapat 2 tabung yang akan diujikan.

Tabung 1 adalah tabung yang diberikan +(K3Fe[CN]6) dan pereaksi

stokes. Sedangkan tabung 2 adalah tabung yang diberikan +(K3Fe[CN]6)

dan dipanaskan.

Tabung 1, larutan +(K3Fe[CN]6) akan membentuk Hb menjadi

methemoglobin, akibat adanya oksidasi Fe2+ menjadi Fe3+.3 Kemudian

dilakukan penambahan larutan stokes yang bertujuan menguji teori

methemoglobin terhadap pengangkuatan oksigen. Hasilnya adalah

oksigen akan terlepas dari Hb darah dan tidak dapat diangkut lagi oleh

Hb yang berubah menjadi methemoglobin. Lepasnya oksigen dibuktikan

dengan adanya buih diatas permukaan. Semakin banyak buih maka

membuktikan bahwa semakin banyak oksigen yang tidak dapat diangkut

oleh hemoglobin dalam darah. Buih semakin banyak saat dilakukan

pengocokan kuat, hal tersebut menandai bahwa pengocokan kuat

membuat semakin banyak oksigen yang terlepas pada methemoglobin

Selain itu, tabung 2 yang diberikan + (K3Fe[CN]6), prinsipnya

sama, akan terbentuk methemoglobin akibat okisdasi dari Fe2+ menjadi

Fe3+. Kemudian tabung dipanaskan, ternyata hasilnya adalah masih

terbentuk buih sedikit, hal tersebut juga menunjukkan bahwa

Methemoglobin tidak dapat mengangkut oksigen lagi walaupun dengan

metode dipanaskan.

3.2.3 Uji Sianmethemoglobin

Metode sianmethemoglin didasarkan pada pembentukan

Sianmethemoglobin yang intensitas warnanya diukur dengan

menggunakan fotometri. Reagen yang digunakan adalah larutan Drabkin

yang mengandung Kalium ferisianida (K3Fe[CN]6) dan kalium sianida

(KCN). Ferisianida (K3Fe[CN]6)mengubah besi dalam bentuk ferro ke

bentuk ferri menjadi methemoglobin yang kemudian bereaksi dengan

KCN membentuk Sianmethemoglobin (pigmen yang stabil yaitu).4

Intensitas warna yang terbentuk diukur secara fotometri dengan panjang

gelombang 540 nm.

Larutan Drabkin juga mengandung kalium dihidrogen fosfat

(KH2PO4) dan deterjen. Kalium dihidrogen fosfat berfungsi

menstabilkan pH. Deterjen berfungsi mempercepat hemolisis darah serta

mencegah kekeruhan yang terjadi pada protein plasma.

Setelah dilakukan pembacaan fotometri, kadar Hb dapat diukur

dengan rumus Ru/Rs x Konsentrasi Standar, didapatlah hasil 6.3 g/dl.

3.2.4 Pengaruh Pelarut Organik Terhadap Membran Sel Darah Merah

Berdasarkan hasil yang diperoleh pada uji ini, didapatkan semua

pelarut organik, kecuali kontrol (NaCl 0.9%), dapat melisiskan

Hemoglobin. Namun pelisisan hemoglobin ini berbeda-beda

penampakannya (total dan parsial). Cara mengukur hemolisis sel darah

merah, dengan cara melihat warna darah yang ada saat diberikan pelarut

organik. Apabila darah merata keseluruh tabung, maka dapat dikatakan

sel darah merah lisis dan bercampur dengan plasma. Ada dua macam

jenis hemolisis, hemolisis osmotik (perbedaan tekanan osmosa cairan

cairan di dalam sel darah merah dengan cairan yang berada disekeliling

sel darah merah) dan hemolisis kimiawi, sel darah merah rusak akibat

penambahan bahan kimiawi, seperti kloroform, aseton, benzene, eter,

alkohol, dan substansi lainnya).7 Kemudian cara mengetahui intensitas

hemolisis sel darah merah dengan membandingkannya dengan tabung

kontrol yang berisi NaCl 0.9%.

Tabung uji mengandung berbagai pelarut organik. Jika pelarut

organik bersifat melarutkan lemak akan menyebabkan lipid membran

larut, sehingga terjadi hemolisis.3 Pelarut yang dapat melisiskan sel

darah merah yang bersifat hipotonis. Jika phi cairan < phi darah, maka

cairan bersifat hipotonik terhadap plasma darah. Hal ini menyebabkan

net aliran pelarut air dari cairan ke plasma darah.8 Larutan hipotonis

akan masuk ke dalam eritrosit melalui membran yang bersifat

impermeabel dan menyebabkan sel eritrosit menggembung. Bila

membran tidak kuat lagi menahan tekanan yang ada di dalam sel

eritrosit, maka sel akan pecah akibatnya Hb akan bebas ke dalam

medium sekelilingnya.3

Sebelum diberikan pelarut organik yang bermacam-macam, semua

tabung (termasuk tabung kontrol) diberi NaCl terlebih dahulu. NaCl

0.9% adalah larutan isotonis, artinya larutan ini tidak melisiskan sel

darah merah. Terlihat terdapat endapan pada tabung kontrol,

membuktikan bahwa sel darah merah tidak lisis.

Tabung 1 berisi NaCl + kloroform, terlihat warna dari tabung ini

merah merata, dan tidak terdapat endapan, sehingga dapat dikatakan

bahwa kloroform membuat membran sel darah merah lisis total dan

sempurna.

Tabung 2 berisi eter, masih terdapat endapan sedikit jika

dibandingkan dengan tabung kontrol. Eter adalah larutan hipotonis,

artinya eter dapat melisiskan sel darah merah. Dari hasil pengamatan

kemarin, penampaknnya hampir sama dengan tabung kontrol (isotonis).

Seharusnya sel darah merah yang dilarutkan dengan eter terlihat terlarut

karena eter adalah hipotonis. Namun hasilnya kurang sempurna, hal

tersebut mungkin karena mungkin diperlukan tambahan waktu untuk

dapat melisiskan sel darah merah yang telah terisi banyak air

didalamnya, atau mungkin karena dinding sel darah merah pada sampel

kuat untuk menampung kelebihan cairan didalam sel darah merah,

sehingga dibutuhkan waktu untuk melisiskan sel darah merah.

Tabung 3 berisi Aseton yang terlihat terdapat endapan sedikit

dibawah tabung, dan dipermukaan tabung terlihat sel darah merah

terlarut. Aseton adalah larutan hipotonis yang mana akan melisiskan sel

darah merah.

Tabung 4 berisi pelarut toluene, dikenal juga sebagai

metilbenzena ataupun fenilmetana, adalah cairan bening tak berwarna

yang tak larut dalam air dengan aroma seperti pengencer cat dan berbau

harum seperti benzena. Toluena adalah hidrokarbon aromatik yang

digunakan secara luas dalam stok umpan industri dan juga

sebagai pelarut.9,10 Sesuai dengan teori bahwa hemolisis disebabkan oleh

toluene kimiawi, bahwa sel darah merah akan lisis jika diberikan

toluene. Namun hasil menunjukkan bahwa hemolisis yang terjadi sangat

kecil, dan terbentuk endapan pada tabung toluene. Saat toluene

diteteskan sebanyak 2 tetes pada tabung yang terlebih dahulu di berikan

NaCl, pengamatan pertama saat diteteskan darah, darah menggumpal di

atas permukaan tabung sebentar (selama 5 detik), kemudian ke bawah

menjadi sebuah endapan yang cukup banyak.

Tabung 5 diisi oleh NaCl dan alkohol. Alkohol juga merupakan

larutan hipotonis, sehingga dapat melisiskan sel darah merah sebagian

karena masih terdapat sedikit endapan pada bagian bawah tabung.

Kloroform juga merupakan bahan kimia untuk melisiskan sel darah

merah.

3.2.5 Demo

Pada demo kali ini diberikan pembahasan mengenai hemolisis

dengan penggunakan pelarut akuades dan NaCl. Hemolisis adalah

pecahnya membran eritrosit, sehingga Hb bebas dalam medium

sekelilingya (plasma).2 Kerusakan membran ini disebabkan oleh

penambahan larutan hipotonis.

Kali ini darah yang mengandung Hb dimasukkan kedalam

beberapa larutan yang memiliki kelarutan dan tekanan osmotik yang

berbeda-beda. Pada tabung 1 yang berisi akuades sebagai pembanding,

darah yang ditambahkan akuades mengalami hemolisis, karena akuades

adalah hipotonis. Darah yang diberi akuades terlihat menggelembung

karena oksigen yang terlepas dari ikatannya dengan Hb dan memudar

warna merahnya karena oksigen terlepas dari ikatan dasar Hb.

Hemolisis yang sedang dibahas adalah hemolisis osmotik, terjadi

akibat perbedaan yang besar antara tekanan osmosa cairan di dalam sel

darah merah dengan cairan yang berada disekitar sel darah merah.

Tekanan osmosa sel darah merah sama dengan tekanan osmosa NaCl

0.9%. Jika sel darah merah dimasukkan ke dalam larutan NaCl 0.8%,

masi belum terlihat adanya hemolisis. Jika diberikan 0.4% NaCl maka

hanya sebagian yang hemolisis. Jika diberikan NaCl 0.3%, maka akan

terjadi hemolisis total.5

Pada tabung 2 yang berisi NaCl 2%, hemolisis juga terjadi dengan

sempurna sehingga dapat diamati adanya gelembung dan warna darah

yang pudar. Setelah dilakukan pengujian dan penghitungan dengan

rumus, maka tercantumlah hasil pada tabel yang melibatkan NaCl dan

Akuades. Rumus ini hanya ingin memudahkan kita untuk menentukan

NaCl dalam konsentrasi persenan. NaCl < 0.2% merupakan larutan

hipotonik, menyebabkan hemolisis. NaCl 0.4-0.6% merupakan larutan

hipotonik yang kecil, sehingga terjadi hemolisis parsial. Sedangkan 0.7-

0.9% merupakan larutan isotonis, maka tidak akan terjadi proses

hemolisis, semua bersifat isotonis, terutama NaCl 0.9%. Oleh karena itu,

NaCl 0.9% dijadikan cairan paling sering digunakan untuk keperluan

medis karena memberikan tekanan osmotik sama dengan yang dimiliki

sel darah merah.

BAB V

PENUTUP

5.1. Kesimpulan

a. OksiHb diutujukkan pada tabung pertama, terlihat perubahan warna

merah terang, karena terdapat suatu penyimpangan spektrum absorban.

Begitu juga dengan DeoksiHb.

b. Uji methemoglobin membuktikan bahwa oksidasi Fe2+ menjadi Fe3+

dapat membentuk methemoglobin yang tidak dapat mengangkut oksigen

lagi. Hal tersebut dibuktikan dengan keluarnya buih (oksigen) saat

methemoglobin terbentuk

c. Metode sianmethemoglin didasarkan pada pembentukan

Sianmethemoglobin yang intensitas warnanya diukur dengan

menggunakan fotometri, Setelah itu Hb diukur dengan rumus tertentu

d. Cairan isotonis (NaCl 0.9%) tidak dapat melisiskan sel darah merah;

cairan hipotonis (kloroform, NaCl 0.2%) dapat melisiskan sel darah

merah; dan cairan hipertonis (NaCl 3.0%) dapat membuat sel darah

merah krenasi.

e. Akuades adalah cairan hipotonis, sehingga dapat melisiskan sel darah

merah. Sedangkan NaCl merupakan cairan yang memiliki sifat hipotonis

dan hipertonis, tergantung pada derajat konsentrasinya.

5.2. Saran

Dibutuhkan ketelitian dan pemahaman yang dalam sebelum dan saat

melakukan uji-uji dalam praktikum ini, sehingga memudahkan praktikan

dalam mendapatkan hasil dan membahas hasil tersebut.

DAFTAR PUSTAKA

1. Barret KE, Barman SM, Boitano S. Brooks HL. Ganong’s Review of Medical

Physiology: Ga Transport & Ph Dalam Paru. 23rd Ed. United States: Mcgraw

Hill; 2010, P. 609-13

2. Bagian Biokimia FKUI. Biokimia Eksperimen Laboratorium. Jakarta: Widya

Medika; 2000

3. Murray RK. Biokimia Harper. Edisi 27. Jakarta: EGC; 2013

4. Gandasoebrata R. Penuntun Laboratorium. Jakarta: Dian Rakyat; 2010, P.11-2

5. Wulangi. Prinsip-prinsip Fisiologis Hewan. Bandung: Jurusan biologi, ITB;

2009

6. Hendrayani. Dasar- dasar Biokimia. Jakarta: Universitas Indonesia Press;

2007

7. Winarsih, H. Antioksidan Alami Dan Radikal Bebas: Potensi Dan Aplikasinya

Dalam Kesehatan. Yogyakarta: Kanusius. 2007, P.49-80

8. Frandson. Anatomi dan Fisiologi Ternak. Yogyakarta: Gadjah Mada

University Press; 200

9. Streicher HZ, Gabow PA, Moss AH, Kono D, Kaehny WD. Syndromes of

toluene sniffing in adults". Ann. Intern. Med; 1981.94 (6): 758–62

10. Devathasan G, Low D, Teoh PC, Wan SH, Wong PK. Complications of

chronic glue (toluene) abuse in adolescents".Aust N Z J Med;1984. 14 (1): 39–

43