23
LAPORAN PRAKTIKUM BIOINFORMATIKA DESIGN PICK PRIMER MENGGUNAKAN PRIMER3PLUS, PRIMERQUEST DAN PERLPRIMER Nama : Baital Izzatul Badriyah NIM : 0910910001 Tanggal Praktikum : 29 Maret 2012 LABORATORIUM BIOLOGI KOMPUTASI JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

LAPORAN PRAKTIKUM BIOINFORMATIKA

DESIGN PICK PRIMER MENGGUNAKAN PRIMER3PLUS, PRIMERQUEST DAN

PERLPRIMER

Nama : Baital Izzatul Badriyah

NIM : 0910910001

Tanggal Praktikum : 29 Maret 2012

LABORATORIUM BIOLOGI KOMPUTASI

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2012

Page 2: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

BAB III

METODE PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Bioinformatika yang berjudul Design Pick Primer Menggunakan Primer3Plus,

PrimerQuest dan PerlPrimer ini dilaksanakan hari Kamis, 29 Maret 2012, pukul 15.10-17.00

WIB dan bertempat di Laboratorium Biologi Komputasi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang.

3.2 Cara Kerja

3.2.1 Design Pick Primer Menggunakan Primer 3 Plus

- Langkah-langkah membut design pick primer menggunakan Primer3Plus, yaitu

diketikan keyword primer3plus pada jendela browsing Google>search, atau

dapat pula diakses melalui www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus.cgi.

Selanjutnya akan muncul kotak dialog seperti pada kotak dialog berikut.

-

- Untuk memulai mendesain primer dengan Primer3Plus ini, dapat dilakukan dengan cara

mengcopy format FASTA sekuens nukleotida dari spesies yang diinginkan (dalam hal

ini digunakan sekuens nukleotida S. purpuratus late histone H1-

beta gene, complete cds) ke dalam paste source sequence below, seperti yang

terlihat pada kotak dialog berikut.

Page 3: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

- Sekuens dalam format FASTA yang telah dicopy dari genebank NCBI, kemudian

dipaste pada kolom yang telah tersedia pada Primer3Plus. Selanjutnya, ditentukan

beberapa parameter yang dibutuhkan terutama daerah target yang ingin diamplifikasi,

dimana primer (forward maupun reverse) harus mengapit daerah ini; excluded region

yang merupakan daerah dimana primer tidak boleh menempel; serta included region

yagmana kedua primer harus berada di dalam daerah ini. Langkah-langkah ini dapat

dilihat pada kotak dialog berikut.

Ditentukan target

yang diinginkan

Dicopy

Dipaste sekuens

FASTA dari NCBI

Pengaturan daerah

penempelan primer

Dapat juga mengupload

sekuens menggunakan ini

Page 4: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

- Agar diperoleh primer yang memenuhi kriteria yang baik dan benar dan dapat

digunakan dalam PCR, maka perlu dilakukan pengaturan terhadap primer yag ingin

dihasilkan yaitu dengan mengklik General Setting, selanjutnya dilakukan pengaturan

yang meliputi ukuran primer, Tm, %GC, dll, seperti yang tampak pada kotak dialog

berikut.

3.2.2 Design Pick Primer Menggunakan PrimerQuest

- Design primer untuk PCR juga dapat dilakukan menggunakan PrimerQuest. Langkah-

langkah membut design pick primer menggunakan PrimerQuest, yaitu diketikan

keyword primerquest pada jendela browsing Google>search, atau dapat pula diakses

melalui eu.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest/default.aspx, maka selanjutnya

akan muncul kotak dialog seperti berikut. Pada halama tersebut dimasukkan kode pada

NCBI ID dari sekuens yang ingin didesign primernya, selanjutnya diklik Get Sequence.

Page 5: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

- Setelah sekuens nukleotid dimasukkan ke dalam kolom yang sudah disediakan pada

PrimerQuest, maka selanjutnya ditentukan design primer sesuai dengan kebutuhan

pada Design for dan Use Parameter Set > diklik calculate, seperti yang terihat pada

kotak dialog berikut.

- Hasil yang muncul setelah dilakukan beberapa langkah dalam prosedur yang telah

dijelaskan diatas, maka pada jendela PrimerQuest akan muncul hasil dari design primer

dari sekuens yang ingin dibuat design primernya (dalam hal ini digunakan sekuens

nukleotida dari S. purpuratus late histone H1-beta gene, complete cds. Pada

pasangan-pasangan primer yang telah diperoleh dari pengaturan awal yang dilakukan,

selanjutnya diklik Set Detail untuk mengetahui letak forward primer maupun reverse

primer pada sekuens nukleotida spesies yang digunakan. Selain dapat diketahui secara

detail mengenai letak forward maupun reverse primer, dapat pula diketahui terjadinya

hairpin pada pasangan primer tersebut dengan cara diklik Hairpin, baik pada forward

primer maupun reverse primer. Langkah-langkah dalam melaksanakan prosedur ini

dapat dilihat pada kotak dialog berikut.

Dipilih sesuai

dengan dengan

design yang

diinginkan

Page 6: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

Pasangan

primer 1

Pasangan

primer 2

Page 7: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

Pasangan

primer 3

Pasangan

primer 4

Page 8: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

Melalui PrimerQuest dalam membuat design primer, dapat pula dilihat BLAST dari

sekuens referensi yag dipilih (dalam hal ini S. purpuratus late histone H1-

beta gene, complete cds.). Secara otomatis, PrimerQuest dapat tesambung dengan genebank

NCBI untuk menampilkan BLAST dari sekuens referensi tersebut.

3.2.3 Design Pick Primer Menggunakan Perl Primer

- Design primer untuk PCR juga dapat dilakukan menggunakan PerlPrimer. Langkah-

langkah membut design pick primer menggunakan Perl Primer, yaitu dibuka software

PerlPrimer, maka selanjutnya akan muncul kotak dialog seperti berikut. Pada halaman

Pasangan

primer 5

Page 9: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

tersebut dimasukkan format FASTA dari sekuens referensi dalam hal ini digunakan (S.

purpuratus late histone H1-beta gene, complete cds).

- Selanjutnya, dilakukan pengaturan primer yang ingin dibuat, meliputi Primer Tm, Primer

Lenght, dst., seperti yang terlihat pada kotak dialog berikut.

Sekuens referensi

yang ingin dibuat

primernya

Page 10: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Design Pick Primer Menggunakan Primer3Plus

Berdasarkan design pick primer menggunakan Primer3Plus, dengan memasukkan

sekuens referensi suatu spesies yang diambil dari NCBI, maka diperoleh beberapa design

primer (dalam hal ini diperoleh 5 pasang design primer) yang dapat dilihat pada kotak dialog

berikut.

Pasangan primer 1

Reverse

primer

Forward

primer

Amplikon

Forward primer

Reverse primer

Page 11: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

Berdasarkan pada pasangan primer 1 yang ditampilkan dalam kotak dialog pada halaman

sebelumnya dapat diketahui bahwa, forward primer dari pasangan primer 1 memiliki panjang

nukleotida sebanyak 21 bp, suhu melting Tm 58.70C, %GC 42.9%, ANY 4.0, serta self

complementarity 2.0. Forward primer ini kurang memenuhi kriteria sebagai primer yang baik

dan benar untuk digunakan dalam PCR, hal ini dapat dilihat dari panjang nukleotida yang

berada diantara 18-22 bp, namun memiliki Tm di bawah 60-650C, serta %GC di bawah 45-60%.

Reverse primer dari pasangan primer 1 ini memilki panjag nukleotida sebanyak 20bp, Tm

61.40C, %GC 50.0%, ANY 7.0, serta self complementarity 3.0. Reverse primer ini telah

memenuhi kriteria sebagai primer yang baik dan benar untuk digunakan dalam PCR, hal ini

dapat dilihat dari panjang nukleotida yang berada diantara 18-22 bp, Tm diantara 60-650C,

serta %GC diantara 45-60%. Selain informasi mengenai pasangan primer 1 yang dijelaskan

secara detail, dapat diketahui pula informasi mengenai pasangan primer lain yang dihasilkan

dari design primer yang diperoleh dari sekuens nukleotida yang diinginkan untuk dibuat

primernya. Informasi secara rinci dari pasangan-pasangan primer dapat dilihat pada kotak-

kotak dialog berikut.

Pasangan primer 2

Pasangan primer 3

Pasangan primer 4

Page 12: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

3.2.1 Design Pick Primer Menggunakan Perl Primer

Primer3Plus memiliki beberapa kelebihan, diantaranya memiliki tampilan yang sangat

sederhana, namun kemampuannya sudah teruji dan digunakan oleh banyak peneliti di seluruh

dunia (Science Biotech, 2012). Primer3Plus juga memberikan beberapa alternatif pasangan

primer yang dapat dipilih (Rybicky, 2001)

4.2 Design Pick Primer Menggunakan PrimerQuest

Design primer dengan menggunakan PrimerQuest juga tidak jauh berbeda dengan design

primer yang diperoleh menggunakan Primer3Plus, namun pada PrimerQuest informasi yang

disajikan lebih lengkap dibandingkan pada Primer3Plus. PrimerQuest menyajikan informasi

mengenai terjadinya Hairpin pada pasangan primer yang diperoleh dari hasil design primer

yang telah dilakukan.

Kotak dialog di atas menunjukkan informasi umum mengenai pasangan primer yang

dihasilkan. Berdasarkan informasi yang ditampilkan, dapat dilihat kode sekuens pada

Sequence Name, yaitu ACC M20314.1; tanggal dilakukan design primer; serta panjang

nukleotida dari sekuens yang dijadikan referensi (dalam hal ini digunakan S.

Pasangan primer 5

Page 13: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

purpuratus late histone H1-beta gene, complete cds.), yaitu sebanyak 1698 bp yang dapat

dilihat pula pada grafik yang ditampilkan dibawahnya (ditunjukkan oleh garis tebal berwarna

hijau, yang artinya garis hijau tersebut termasuk dalam Included Region).

Berdasarkan hasil design primer menggunakan PrimerQuest yang ditampilkan pada kotak

dialog di atas dapat diketahui bahwa, forward primer pasangan primer 1 memiliki panjang

sekuens 24 bp, start kodon terletak pada basa ke-700, Tm sebesar 59.90C, %GC 50.0%, dst.

Berdasarkan syarat primer yang baik dan benar untuk digunakan dalam PCR, dapat dilihat

bahwa forward primer pasangan primer 1 tersebut kurang memenuhi syarat primer yang benar

karena memiliki panjang primer yang lebih dari panjang primer yang baik, yaitu antara 18-22 bp.

Selain itu, forward primer tersebut juga memiliki Tm dibawah batas primer yang baik, yaitu

antara 60-650C, namun primer tersebut memiliki %GC yang memenuhi syarat pembuatan

primer yang baik, yaitu berada diantara 45-60%. Informasi lain yang dapat diperoleh yaitu

mengenai reverse primer pasangan primer 1 yang menunjukkan primer ini dimulai dari basa ke-

1367, memilki panjang primer sebanyak 24 bp, Tm (Melting Temperature) 59.80C, %GC 50.0%,

dst. Berdasarkan syarat primer yang baik dan benar untuk digunakan dalam PCR, dapat dilihat

bahwa reverse primer pasangan primer 1 tersebut juga kurang memenuhi syarat primer yang

benar karena memiliki panjang primer yang lebih dari panjang primer yang baik, yaitu antara

18-22 bp, memiliki Tm dibawah batas primer yang baik, yaitu antara 60-650C, namun primer

tersebut memiliki %GC yang memenuhi syarat pembuatan primer yang baik, yaitu berada

diantara 45-60%.

Selain informasi yang telah dijelaskan di atas dapat diketahui pula informasi mengenai

produk hasil PCR yang diperoleh jika menggunkan pasangan primer yang telah diperoleh dari

hasil desain, seperti yang terlihat pada kotak dialog di atasmengenai pasangan primer 1 yang

menghasilkan produk sebanyak 668 bp. Informasi secara detail dari pasangan-pasangan primer

lain yang diperoleh dari penggunaan PrimerQuest dalam mendesain primer dapat dilihat pada

kotak-kotak dialog yang ditampilkan berikut.

Pasangan

primer 1

Letak forward dan

reverse primer pada

sekuens

Page 14: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

Pasangan

primer 2

Pasangan

primer 3

Letak forward dan

reverse primer pada

sekuens

Letak forward dan

reverse primer pada

sekuens

Page 15: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

Setelah diklik pada Set Detail pada pasangan primer yang ingin diketahui informasi lebih

terperinci baik forward maupun reverse primer, maka akan diperoleh informasi letak baik

forward maupun reverse primer pada sekuens referensi yang dirujuk untuk dibuat primernya,

hal ini dapat dilihat pada kotak dialog berikut.

Pasangan

primer 4

Pasangan

primer 5

Letak forward dan

reverse primer pada

sekuens

Letak forward dan

reverse primer pada

sekuens

Page 16: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

Selain informasi lebih detail mengenai letak forward maupun reverse primer dari

pasangan primer 1 seperti yang telah ditampilakan pada kotak dialog di atas, dapat pula

diketahui terjadinya hairpin pada primer yang dihasilkan dari design menggunakan

PrimerQuest, hal ini dapat dilihat pada kotak dialog berikut.

Forward primer

pasangan primer 1

Reverse primer

pasangan primer 1

Amplicon

Page 17: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

Berdasarkan kotak dialog di atas dapat diketahui bahwa, forward primer pasangan primer

1 memiliki dua struktur hairpin yang dapat terjadi pada primer tersebut. Hal ini dapat

disebabkan karena primer ini tidak sepenuhnya memenuhi syarat pembuatan design primer

yang baik dan benar, sehingga saat menempel pada sekuens template akan mengalami 2

bentuk haipin, seperti yang terlihat pada kotak-kotak dialog di bawah ini.

Page 18: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

Struktur hairpin II

forward primer 1

Struktur hairpin I

forward primer 1

Page 19: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

Menurut Clark (2005) hairpins terbentuk akibat interaksi intramolekuler primer sehingga

membentuk semacam lipatan. Biasanya hairpin ujung 3′ dengan ΔG-2 kcal/mol dan hairpin

internal dengan ΔG -3 kcal/mol masih dapat ditoleransi.ΔG atau energi bebas Gibbs adalah

ukuran jumlah kerja yang dapat diekstrak dari sebuah proses yang terjadi pada tekanan tetap.

Ini merupakan ukuran kespontanan reaksi. Stabilitas hairpin biasanya direpresentasikan oleh

nilai ΔG-nya, yaitu energi yang diperlukan untuk mengurai struktur sekunder. Semakin negatif

nilai ΔG maka semakin stabil ia, tentu tidak kita inginkan. Adanya hairpin pada ujung 3′ sangat

mempengaruhi reaksi.

4.3 Design Pick Primer Menggunakan Perl Primer

Design primer dengan menggunakan Perl Primer juga tidak jauh berbeda dengan design

primer yang diperoleh menggunakan Primer3Plus dan PrimerQuest. Perl Primer menyajikan

informasi yang lebih detail dibandingkan pada Primer3Plus, namun PerlPrimer ini masih lebih

sulit dalam pengaturan pembuatan design primer yang diinginkan. Pasangan primer yang

diperoleh dari design primer menggunakan PerlPrimer ini dapat dilihat pada kotak dialog

berikut.

Struktur hairpin

reverse primer 1

Page 20: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

Berdasarkan kotak dialog yang disajikan di atas dapat diketahui primer-primer yang

diperoleh dari hasil design primer menggunakan perlprimer. Selain itu, jumlah primer yang

diperoleh juga dapat dilihat pada bagian bawah kotak dialog di atas yang ditunjuk oleh tanda

panah merah, yaitu sebanyak 208 pasangan primer.

Berdasarkan hasil design primer menggunakan PerlPrimer yang ditunjukkan pada kotak

dialog sebelumnya dapat dilihat informasi mengenai primer yang diperoleh, baik forward primer

Forward primer

Reverse primer

Dimer pasangan

primer 1

Jumlah primer yang dihasilkan

Primer yang diperoleh dari sekuens

referensi

Page 21: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

maupun reverse. Pasangan primer yang baik ditunjukkan oleh munculnya tanda None saat

diklik dua kali pada pasangan primer. Jika pada kolom Dimer ditunjukkan pasangan primer

yang mengalami dimer.

PerlPrimer memiliki beberapa kelebihan, yaitu merupakan software yang dapat diguanakn

untuk mendesain secara mudah dan otomatis primer untuk standard PCR, bisulphite PCR,

real-time PCR (QPCR) dan sekuensing, software yang yang dikembangkan dengan bahasa

Perl dan Perl/TK untuk tampilannya sehingga bisa dijalankan di MacOSX, Linux dan Windows,

saat ini versi terakhir dari PerlPrimer adalah 1.1.17. Proses insatalasi PerlPrimer ini tergantung

sistem operasi yang digunakan, PerlPrimer menyediakan paket instalasi untuk sistem operasi

Mac, Linux dan Windows dengan proses intalasi yang tidak rumit, paket instalasi bisa di unduh

disini (Science Biotech, 2012).

Kelebihan lain yang dimiliki oleh PerlPrimer, yaitu dapat menghitung kemungkinan primer

dimmers yang terbentuk, dapat mendownload langsung sekuen genom atau cDNA dari

Ensembl, dapat langsung melakukan BLAST ke server NCBI atau server lokal (Mullis, 1993).

Hasil dari desain perimer dapat di simpan, atau di eksport ke format tab-delimited sehingga bisa

dibuka oleh aplikasi spreadsheet standar (OpenOffice, Microsoft Office) (David, 2005).

Page 22: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Setelah dilakukan praktikum ini dapat disimpulkan bahwa, ketiga jenis media atau

software yang digunakan untuk mendesain primer, yaitu Primer3Plus, PrimerQuest maupun

perlPrimer memiliki kelebihan dan kelemahan masing-masing. Diantara ketiga jenis software

yang digunakan, PrimerQuest merupakan media online yang memiliki kelebihan yang lebih

banyak dalam membuat design primer. PrimerQuest menyediakan fitur yang dapat

menunjukkan informasi yang lebih banyak mengenai primer yang diperoleh dari hasil design

primer (misalnya struktur haipins) dibandingkan dengan kedua software lainnya, yaitu

Primer3plus dan PerlPrimer.

5.2 Saran

Praktikum telah berjalan dengan lancar, namun sebaiknya saat dilakukan tentoring

kelompok, semua anggota kelompok diberi kesempatan untuk melakukan tentoring. Sehingga,

semua anggota kelompok memiliki pengalaman yang sama dalam menjelaskan suatu program

di depan kelas praktikum.

Page 23: laporan 4 informatika-Baital Izzatul B.-0910910001.pdf

DAFTAR PUSTAKA

Clark, D. P. 2005. Molecular Biology : Understanding the Genetic Evolution. California: Elsevier

Inc.

David, N. G. 2005. Molecular Technique Lecture Note 2005. http://www.biotech ubc.ca. Diakses

tanggal 1 April 2012

Mullis. 1993. DNA & PCR. http:// www. science-projects.com /onionDNA.htm. Diakses tanggal

27 Maret 2012

Rybicky, E. 2001. PCR Primer Design and Reaction Optimalization.http://www.

meb.vct.ac.2a/ed.htm. Diakses tanggal 1 April 2012

Science Biotech. 2012. Yuk Mendesain Primer Dengan PerlPrimer. http://sciencebiotech.net/

yuk-mendesain-primer-dengan-perlprimer/. Diakses tanggal 1 April 2012

Science Biotech. 2012. Yuk Mendesain Primer Dengan Primer3Plus. http://sciencebiotech.net/

yuk-mendesain-primer-dengan-primer3plus/. Diakses tanggal 1 April 2012