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Université de Montréal
L’apolipoprotéine A-I interagit avec l’adhésine impliquée
dans l’adhérence diffuse (AIDA-I) d’Escherichia coli :
rôle lors du processus d’adhésion et d’invasion
par
MÉLISSA RENÉ
Département de pathologie et de microbiologie
Faculté de médecine vétérinaire
Mémoire présenté à la Faculté de médecine vétérinaire
en vue de l’obtention du grade de maître ès sciences (M. Sc.)
en sciences vétérinaires
option microbiologie
Mai, 2010
© Mélissa René, 2010
Université de Montréal
Faculté de médecine vétérinaire
Ce mémoire intitulé
L’apolipoprotéine A-I interagit avec l’adhésine impliquée dans l’adhérence diffuse (AIDA-
I) d’Escherichia coli : rôle lors du processus d’adhésion et d’invasion
Présenté par :
MÉLISSA RENÉ
a été évalué par un jury composé des personnes suivantes :
J. Daniel Dubreuil, président-rapporteur
Michaël Mourez, directeur de recherche
Éric Nadeau, co-directeur
Josée Harel, membre du jury
iii
Résumé L’adhésine impliquée dans l’adhérence diffuse (AIDA-I) est une adhésine
bactérienne présente chez certaines souches d’Escherichia coli qui, associée aux toxines
Stx2e ou STb, contribue à l’apparition de la maladie de l’œdème ou de la diarrhée post-
sevrage chez les porcelets. AIDA-I est un autotransporteur qui confère des capacités
d’autoaggrégation, de formation de biofilms et d’adhésion. L’objectif principal du projet
de recherche consistait en la recherche de récepteur(s) potentiel(s) d’AIDA-I.
Les bactéries pathogènes adhèrent aux cellules-cibles soit en liant directement des
molécules à la surface cellulaire ou en utilisant des molécules intermédiaires qui
permettent de diminuer la distance séparant la bactérie de la cellule-cible. Puisque le
sérum est un fluide qui contient de nombreuses molécules, celui-ci a été utilisé comme
matériel de départ pour l’isolement de récepteur(s) potentiels. Nous avons isolé un
récepteur potentiel à partir du sérum porcin : l’apolipoprotéine A-I. L’interaction entre
l’apolipoprotéine A-I et AIDA-I a été confirmée par ELISA et microscopie à
fluorescence.
La capacité à envahir les cellules épithéliales offre aux pathogènes la possibilité
d’établir une niche intracellulaire qui les protègent contre les attaques du milieu extérieur.
La présente étude a démontré que la présence d’AIDA-I en tant que seul facteur de
virulence chez une souche de laboratoire permet de conférer la capacité d’envahir les
cellules sans promouvoir la survie intracellulaire. L’étude de la souche sauvage 2787,
exprimant AIDA-I en association avec d’autres facteurs de virulence, a démontré une
différence significative pour les phénotypes d’invasion et de survie intracellulaire face à
la souche de laboratoire exprimant AIDA-I.
Mots-clés : Autotransporteur, AIDA-I, Escherichia coli, Adhésine bactérienne,
Adhésion, Invasion, Apolipoprotéine A-I, Microscopie à fluorescence, Survie
intracellulaire.
iv
Abstract The adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I) is a bacterial adhesin
associated with some Escherichia coli strains that might, when associated with toxin
Stx2e or STb, contribute to the development of edema disease or post-weaning diarrhea
in piglets. AIDA-I is an autotransporter that mediates various phenotypes such as
adhesion, autoaggregation and biofilm formation. The main aim of our project was to
find potential receptor(s) for AIDA-I.
Pathogens can either bind cell directly by targeting exposed cell surface molecules
or use an intermediate molecule as a bridge to lessen the space separating them from their
target cell. Serum is known to contain a wide range of molecules so it has been used as
raw material for the isolation of a putative receptor for AIDA-I. We isolated a putative
receptor for AIDA-I: the apolipoprotein A-I. The interaction between the apolipoprotein
A-I and AIDA-I was confirmed by ELISA and fluorescent microscopy.
The capacity to invade epithelial cell enables pathogens to create an intracellular
niche that protects them against attacks from the extracellular environment. The present
report has shown that the presence of AIDA-I as the sole virulence factor in a laboratory
strain, enable bacteria to invade cultured cells but does not promote intracellular survival.
Studies conducted on wild-type strain 2787, which express AIDA-I in association with
other virulence factors, has shown a significant difference in invasion and intracellular
survival phenotypes compared to the laboratory strain expressing AIDA-I.
Keywords : Autotransporter, AIDA-I, Escherichia coli, Bacterial adhesin, Adhesion,
Invasion, Apolipoprotein A-I, Fluorescent microscopy, Intracellular survival.
iii
TABLE DES MATIÈRES
LISTE DES TABLEAUX………....……..……………………………………........ vi
LISTE DES FIGURES……………………..…………………………………....... vii
LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONS..……………………………………. ix
DÉDICACE…………………………...……………………………………………. xi
REMERCIEMENTS………………….…………………………………………... xii
INTRODUCTION…....................................................................... ..........…….....…1
RECENSION DE LITTÉRATURE...........................................................................4
1.0 La maladie de l’œdème et la diarrhée post-sevrage ......................................... 5
1.1 La maladie de l’œdème (MO)........................................................................ 5
1.2 La diarrhée post-sevrage ............................................................................... 6
2.0 Les pathotypes d’Escherichia coli ..................................................................... 6
3.0 Les adhésines chez E. coli ................................................................................ 12
3.1 Les adhésines fimbriales............................................................................. 13
3.1.1 Le système de chaperonne-placier........................................................... 14
3.1.2 Le pili de type IV..................................................................................... 16
3.1.3 La voie de nucléation/précipitation ......................................................... 17
3.2 Adhésines afimbriales................................................................................. 18
3.2.1 Les adhésines membranaires................................................................... 18
3.2.2 Adhésines reliées au système de sécrétion de type 3 ................................ 19
3.2.3 Les flagelles ............................................................................................ 20
3.2.4 Le système de sécrétion de type V............................................................ 20
3.2.5 Les autotransporteurs et l’adhésion ........................................................ 21
3.3 Les adhésines non protéiques ...................................................................... 25
3.3.1 Les lipopolysaccharides .......................................................................... 25
4.0 Les invasines d’E. coli...................................................................................... 25
iv
4.1 L’invasion par endocytose induite .............................................................. 26
4.1.1 Invasion engendrée par le système de sécrétion de type 3........................ 26
4.2 L’invasion active.......................................................................................... 27
4.2.1 Les autotransporteurs et l’invasion ......................................................... 28
5.0 Récepteurs engagés par les adhésines/invasines bactériennes ....................... 29
5.1 Composés d’adhérence des cellules eucaryotes .......................................... 29
5.1.1 Composés de la matrice extracellulaire................................................... 29
5.1.2 Les sucres et les molécules glycosylées ................................................... 31
5.2 Autres récepteurs engagés par les adhésines/invasines .............................. 33
5.2.1 Les radeaux lipidiques ............................................................................ 33
5.2.2 Les lectines ............................................................................................. 33
5.2.3 Les contre-récepteurs des intégrines ....................................................... 34
5.2.4 Les molécules sériques : les apolipoprotéines ...........................................34
6.0 L’autotransporteur AIDA-I ............................................................................ 36
6.1 Prévalence d’AIDA-I dans les souches d’E. coli pathogènes...................... 38
7.0 Étude sur l’autotransporteur AIDA-I ............................................................ 39
7.1 Étude sur le récepteur d’AIDA-I ................................................................ 39
7.2 Étude de l’invasion in vitro conférée par AIDA-I....................................... 40
MÉTHODOLOGIE ET RÉSULTATS................................................................. 42
ARTICLE 1 : The apolipoprotein A-I interacts with the adhesin involved in diffuse
adherence (AIDA-I) of Escherichia coli : involvement in the adhesion and invasion
process...............................................................................................................................43
DISCUSSION ........................................................................................................ 72
v
CONCLUSION...................................................................................................... 82
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................ 85
ANNEXE 1 ………………………………………………………………………… 99
vi
LISTE DES TABLEAUX
REVUE DE LITTÉRATURE
Tableau I. Les adhésines autotransporteurs……………………………………........ 24
Tableau II. Exemple d’études montrant la prévalence d’AIDA-I chez les souches
porcines isolées de diarrhée…………………………………………………………… 39
vii
LISTE DES FIGURES
REVUE DE LITTÉRATURE
Figure 1. Mode d’adhésion des différents pathotypes d’E.coli causant la diarrhée. 11
Figure 2. Adhésion bactérienne à la cellule-hôte……………………………………. 12
Figure 3. Schématisation de divers types d’adhésines………………………………. 13
Figure 4. Représentation schématique du système de sécrétion de type V………… 23
Figure 5. Routes d’invasion utilisées par les bactéries pour envahir une cellule-hôte..
……………………………………………..……………………………………………. 26
Figure 6. Représentation schématique de la translocalisation et de la présentation de
l’AT AIDA-I…………………………………………………………………………… 37
MÉTHODOLOGIE ET RÉSULTATS
ARTICLE 1
Figure 1. Interaction between purified AIDA-I and extracellular matrix proteins. 60
Figure 2. Interaction between AIDA-I and porcine serum…………………………. 61
Figure 3. Bands obtained by serum fractionation by means of ion exchange
chromatography followed by gel filtration………………………………………...… 62
Figure 4. Interaction between purified apolipoprotein A-I and AIDA-I…………... 63
viii
Figure 5. Interaction between apolipoprotein A-I and solution of purified AIDA-I
free of LPS……………………………………………………………………………... 64
Figure 6. Interaction between purified apolipoproteins and AIDA-I……………… 65
Figure 7. Colocalization of bacteria expressing AIDA-I and the apolipoprotein A-I
on cultured epithelial cell……………………………………………………………... 66
ANNEXE 1
Figure 1. Cinétique d’invasion et survie intracellulaire des E. coli exprimant AIDA-
I…………………………………………………………………………………………. 76
Figure 2. Cinétique d’invasion et survie intracellulaire des E. coli 2787…………... 77
ix
LISTE DES SIGLES ET DES ABRÉVIATIONS
AAF Aah ADN Afa AIDA AIEC Ag43 APEC Apo A-I ARN AT BFP Cah CEACAM CF Csg DAEC DAF DMEM DPBS DPS EAEC EAST1 E. coli EHEC EIEC ELISA EPEC Esp ETEC ExPEC GFP Hap HDL Hia HisG HlyA HRP ICAM
Aggregative Adhesion Fimbriae Adhesin Aida heptosyltransférase Acide désoxyribonucléique Afimbrial Adhesins Adhesin Involved in Diffuse Adherence Adherent Invasive E. coli Antigen 43 Avian Pathogenic E. coli Apolipoprotéine A-I Acide ribonucléique Autotransporteur Bundle-forming Pili Calcium-binding Ag43 homologue Carcinoembryonic Antigen-related Cell Adhesion Molecules Colonization Factor Curli synthesis gene Diffusely Adhering E. coli Decay Accelerating Factor Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Diarrhée Post-Sevrage Enteroaggregative E. coli Enteroaggregative E. coli Heat-Stable Toxin 1 Escherichia coli Enterohemorragic E. coli Enteroinvasive E. coli Enzyme-linked Immunosorbent Assay Enteropathogenic E. coli E. coli Secreted Proteins Enterotoxigenic E. coli Extra-intestinal Pathogenic E. coli Green-Fluorescent Protein Haemophilus Adhesin and Penetration protein High-density Lipoprotein Haemophilus influenzae adhesin Six Histidine and Glycine Tag Haemolysin A Horseradish-Peroxidase Inter-Cellular Adhesion Molecule
x
Iha IPTG kb kDa LB LDL LEE LP LT LPV MBP MO NS Omp PBS PBS-CM RT-PCR S Saa SAAT SDS-PAGE SOF SPR ST STEC Stx Tia Tib Tir TMB UPEC VacA VCAM VLDL Yad
IrgA homologue adhesin Isopropyl-β-d- Thiogalactopyranoside Kilobase Kilo Dalton Luria-Bertani Low-Density Lipoprotein Locus of Enterocyte Effacement Long Polar Heat-Labile Toxin Lipo-Viro-Particles Maltose-Binding Protein Maladie de l’œdème Nonstructural Outer membrane protein Phosphate-buffered-saline PBS + 0.0001 M CaCl2 + 0.001 M MgCl2 Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction Test standard STEC autoagglutinating adhesin Self-Associating Autotransporter Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis Serum Opacity Factor Surface Plasmon Resonance Heat-stable Toxin Shiga-toxin E. coli Shiga-toxin like Toxigenic Invasion Loci A Toxigenic Invasion Loci B Translocated Intimin Receptor 3,3’,5,5’ –tetramethylbenzidine Uropathogenic E. coli Vascular Cell Adhesion Molecule Vacuolating Cytotoxin Very-Low Density Lipoprotein Yersinia enterocolitica Adhesin
xi
À mes parents, qui m’ont toujours
épaulée tout au long du chemin que je
désirais parcourir dans le domaine du
savoir!
xii
Remerciements
Mon tout premier remerciement est dédié à mon directeur de recherche, le Dr
Michaël Mourez. Je n’aurais pu accomplir ces travaux sans son influence positive,
son soutien, sa patience et, il ne faut pas le passer sous le silence, ses nombreux
efforts pour transmettre à ses étudiants sa passion pour le domaine de la science.
Grâce aux nombreux dialogues entamés en réunion, à son bureau ou même encore
dans le couloir entre deux réfrigérateurs, j’ai pu développer une vision globale du
domaine de la science tout en ne perdant pas de vu les découvertes et les événements
possédant des liens plus étroits avec mon domaine d’étude. Je lui suis grée d’avoir su
me guider intelligemment tout au long de mon parcours et d’avoir également
démontré à de nombreuses occasions l’étendue de ses qualités professionnelles et
humaines. J’aimerais également le remercier chaleureusement de m’avoir soutenue
lors mes nombreuses démarches particulières pour me permettre d’explorer un peu
plus le monde. J’espère sincèrement pouvoir rendre honneur à la qualité de son
enseignement en transmettant une partie de sa passion et de son savoir à mes futurs
étudiants.
Je remercie vivement mes collaborateurs, notamment le Dr François Lépine
et le Dr Mark Hancock pour leur participation active à ce projet. Ils ont contribué à la
réussite de ce projet et je les en remercie.
Je remercie mon co-directeur, Éric Nadeau, pour les conseils et les
encouragements proférés lors de mes comités conseils. J’aimerais également
remercier les membres de mon comité conseil, Josée Harel et Carl A. Gagnon, pour
leur écoute attentive et leurs judicieux conseils.
Merci à mon président de jury, J. Daniel Dubreuil, d’avoir accepté de juger
mon travail. Merci également à Josée Harel de faire partie de mon jury.
Merci également à tous les étudiants du laboratoire, présent et passé, dont
particulièrement Victoria Girard et Marie-Ève Charbonneau pour leur aide technique
ainsi que pour les discussions intéressantes.
xiii
Merci également à l’assistant de laboratoire Frédéric Berthiaume pour sa
disponibilité, sa patience et sa bonne humeur légendaire ainsi que pour son aide et ses
ressources de savoir technique.
J’aimerais remercier mes amis et amies, particulièrement Dave Boucher,
Isabelle Martel, Isabelle Ménard et Karen St-Pierre, pour leur amitié, leur support. Ils
m’ont souvent écouté, conseillée, encouragée et ont également su partager mes hauts
et mes bas. Votre présence à mes côtés m’a été très précieuse.
J’aimerais vivement remercier mes parents qui m’ont appuyé sans compter
tout au long de mes études. J’aimerais également remercier ma famille pour leurs
encouragements et leur soutien. La réussite de mon parcours scolaire leur revient en
grande partie, merci mille et une fois!
xi
INTRODUCTION
2
L’adhésion est une étape essentielle dans l’établissement du processus
infectieux. Il est reconnu qu’une bactérie, pour s’établir dans l’organisme, doit
d’abord adhérer aux cellules de l’hôte ou à la matrice extracellulaire, afin de pouvoir
résister aux différents mécanismes susceptibles de l’éliminer, comme le flux urinaire
ou le péristaltisme intestinal. Cette adhésion peut être engagée directement c’est-à-
dire via l’interaction de molécules présentes à la surface de la cellule, ou
indirectement, c’est-à-dire via l’attachement de l’adhésine à un facteur soluble
servant de «pont» entre la bactérie et la cellule de l’hôte. La grande diversité des
molécules se retrouvant à la surface des cellules ainsi que dans les fluides entourant
ces dernières constituent des cibles de choix pouvant être utilisées comme récepteur
direct ou indirect par les pathogènes lors de l’adhésion. La grande diversité des
adhésines présentes chez les différents pathotypes de la bactérie Escherichia coli
démontre que ce groupe possède la capacité d’utiliser un nombre important de
molécules diverses et variées à la surface cellulaire afin de promouvoir son adhésion
aux cellules épithéliales. Les récepteurs reconnus par les adhésines autotransporteurs
ne font pas exception. Les adhésines autotransporteurs sont une catégorie d’adhésine
formée d’un regroupement de protéines multifonctionnelles possédant une
organisation structurale distincte : séquence signal en N-terminal suivit d’un domaine
passager, d’un domaine de jonction et d’une unité de translocalisation en C-terminal.
Les récepteurs cellulaires de diverses adhésines autotransporteurs ont été identifiés
cependant, le récepteur cellulaire de l’adhésine impliquée dans l’adhérence diffuse
(AIDA-I) n’est pas connu. L’objectif principal de ce mémoire est la recherche du
récepteur de l’autotransporteur AIDA-I.
L’environnement extracellulaire intestinal est un milieu hostile à l’égard des
bactéries. Ce milieu présente diverses caractéristiques mécaniques, chimiques et
immunitaires représentant une menace pour les bactéries. De nombreuses espèces
bactériennes ont développé diverses stratégies d’invasion afin de pénétrer à l’intérieur
des cellules, là où elles sont partiellement protégées contre les agressions du milieu
extérieur. Il a été démontré que plusieurs autotransporteurs confèrent un phénotype
d’invasion de la cellule-hôte aux bactéries qui les expriment. Le second objectif de ce
3
mémoire est d’étudier la capacité de l’autotransporteur AIDA-I à entraîner l’invasion
des cellules-hôte et à permettre la survie subséquente des bactéries intracellulaire.
4
RECENSION DE LITTÉRATURE
5
1.0 La maladie de l’œdème et la diarrhée post-sevrage
Les propriétaires des cheptels de l’industrie porcine doivent faire face aux
répercussions engendrées par les pathologies d’origine bactérienne qui affectent les
porcelets. Deux de ces pathologies, la maladie de l’œdème (MO) et la diarrhée post-
sevrage (DPS), affectent les porcelets lors d’une étape primordiale de leur
croissance : le sevrage. Cette étape du développement de l’animal est cruciale
puisqu’elle occasionne un stress alimentaire et comportemental important. Les
porcelets soumis à ces stress deviennent plus vulnérables aux bactéries pathogènes
présentes dans leur environnement. (110) En effet, la privation de lait maternel
occasionne de nombreux désavantages pour le porcelet puisque le lait contient de
multiples molécules bénéfiques transférées verticalement de la mère à sa progéniture.
(107) Les anticorps contenus dans le lait maternel permettent l’inhibition de la
croissance des bactéries, dont Escherichia coli, lors de l’allaitement. De plus, ces
anticorps permettent l’inhibition de l’adhésion des bactéries telle que E. coli aux
entérocytes et favorise leur phagocytose. Le lait de truie renferme également des
transferrines et des lactoferrines, deux protéines reconnues pour leur action inhibitrice
sur la croissance bactérienne. Bien entendu, tous ces effets protecteurs sont perdus
lors du sevrage des porcelets ce qui peut entraîner le développement de pathogénies
telle que la MO et la DPS. (177)
1.1 La maladie de l’œdème
La MO est une affection qui se déclare généralement lors des deux premières
semaines suivant le sevrage du porcelet. Elle est principalement causée par des
Escherichia coli qui expriment la toxine Stx2e (73, 112, 172). Lors de l’étape
préliminaire à la pathogénèse, l’agent infectieux adhère et colonise le petit intestin.
L’adhésion et la colonisation est généralement effectuée via le fimbriae F18 mais
diverses études ont également démontré la présence de d’autres adhésines telles que
l’autotransporteur (AT) AIDA-I (36, 65, 66, 68, 118, 160, 179, 187). Une fois
adhérée aux cellules, la bactérie sécrète la toxine Stx2e dans le lumen de l’intestin. Le
transfert subséquent de la toxine dans le sang permettra sa dissémination à travers
6
tout l’organisme entraînant le développement de la MO. Les sujets atteints de la MO
présentent de nombreux symptômes pathologiques tels que la perte d’appétit,
l’œdème, l’ataxia et leur état peut également dégénérer jusqu’à entraîner la mort de
l’animal. L’analyse post-mortem des animaux atteint de MO démontre la présence de
lésions intestinales, d’œdème de l’estomac, des paupières et du méso côlon ainsi
qu’un estomac plein (73, 107, 177).
1.2 La diarrhée post-sevrage
La DPS se déclare également aussi lors des 2 premières semaines suivant le sevrage
du porcelet. Elle est principalement causée par la prolifération et la colonisation
d’Escherichia coli dans le jéjunum et l’iléum des porcelets. L’adhésion aux parois
intestinales est effectuée par diverses adhésines (ex. F4, F18, AIDA-I). Les
Escherichia coli engendrant la DPS expriment et sécrètent une ou plusieurs des
entérotoxines suivantes : STa, STb, LT et/ou EAST1 (36, 56, 65, 66, 68, 118, 160,
179). La sécrétion des toxines dans le petit intestin entraîne un débalancement de
l’eau et des électrolytes qui se traduisent par le développement d’une diarrhée
aqueuse de couleur jaune chez le porcelet. L’observation de l’animal permet
couramment de dénoter un bleuissement des oreilles et de l’abdomen. La DPS
entraîne une perte de poids importante chez l’animal et peut se solder par la mort de
celui-ci. L’analyse post-mortem des animaux atteints de DPS démontre fréquemment
une déshydratation importante, un petit intestin dilaté présentant de l’œdème (177).
2.0 Les pathotypes d’Escherichia coli
Escherichia coli est une entérobactérie Gram négatif retrouvée dans le tractus gastro-
intestinal de nombreux animaux à sang chaud, dont l’homme, où elle joue
communément le rôle de bactérie commensale. Cependant, l’acquisition et la
combinaison de facteurs de virulence chez une bactérie peut entraîner des
modifications de son comportement pouvant occasionner le développement de
7
diverses infections telles que des méningites, des septicémies, des infections gastro-
intestinales ou urinaires. Les facteurs de virulence peuvent être des éléments
structuraux, tels les flagelles et les adhésines; des éléments physiologiques telles la
production de toxines ou la synthèse d’enzymes permettant l’infection de l’hôte.
Traditionnellement, les E. coli pathogènes sont divisées en 7 groupes majeurs (113,
137, 154, 183) selon le type de pathogénie engendrée et les facteurs de virulence
possédés: ETEC (E. coli Entérotoxinogènes), EHEC (E. coli Entérohémorragiques),
EPEC (E. coli Entéropathogènes), DAEC (E. coli médiant l’Adhérence Diffuse),
EAEC (E. coli Entéroagrégatives), EIEC (E. coli Entéroinvasives) et les ExPEC (E.
coli responsables d’infections Extra-intestinales) (Figure 1). Cependant, il est
important de noter que différentes classifications coexistent. Diverses revues font
état de l’existence de groupes distincts; nous pourrions citer entre-autres le groupe
des APEC (Avian Pathogenic E. coli) rassemblant les E. coli qui engendre des
pathologies chez le poulet (41, 88) ainsi que le groupe des AIEC (Adherent Invasive
E. coli) qui est associé avec la maladie de Crohn (33, 106).
- Chez le porc, certains sérogroupes d’ETEC, dont majoritairement O8, O138, O139,
O141, O149 et O157, sont associés à la DPS. Ces ETEC sont également responsables
de l’apparition de diarrhées néonatales et post-sevrage chez les porcelets. L’infection
chez le porc est effectuée via la colonisation du petit intestin grâce à la présence
d’adhésines fimbriale péritriches telles que F4, F5, F18 et F41. Les ETEC arborent
deux classe de toxines qui peuvent être retrouvées seule ou en combinaison : les
toxines ST (Heat-stable enterotoxin) et LT (Heat-labile enterotoxin) (35, 74, 80, 147).
-Les EPEC engendrent des diarrhées chroniques ou mucoïdes chez les porcs infectés.
Les EPEC adhèrent intimement à la membrane des cellules épithéliales intestinales
où elles forment des microcolonies. L’adhésion est caractérisée par l’accumulation
d’actine polarisée sous la bactérie, l’élaboration d’un piédestal et la formation de
lésions de type attachant et effaçant chez les sujets atteints. L’adhésion intime avec la
cellule épithéliale est effectuée via l’intimine et/ou le pili de type IV aussi désigné
sous le nom de Bfp (Buddle forming pili). La présence du locus d’effacement des
8
entérocytes (LEE; Locus of Enterocyte Effacement) permet la formation du système
de sécrétion de type 3 qui sécrète des effecteurs nommés Esp (E. coli Secreted
Protein) dans la cellule épithéliale. L’action combinée engendrée par les facteurs de
virulence des EPEC provoque l’effacement des microvillis de l’intestin ce qui peut
entraîner de graves conséquences pour le sujet atteint puisque ce phénomène peut
diminuer la capacité d’absorption des nutriments chez l’hôte atteint (80, 148, 167).
-Les EHEC provoquent une diarrhée sanguinolente accompagnée d’œdème chez les
sujets atteints. Le LEE présent chez les EHEC permet l’expression d’effecteurs
associés au système de sécrétion de type 3 permettant l’adhésion et la formation de
lésions attachantes et effaçantes qui sont, pour ce pathotype, confinées au gros
intestin. Les EHEC possèdent de nombreuses adhésines afimbriales et fimbriales
telles que le fimbriae LP (Long Polar), les adhésines Iha (IrgA Homolog Adhesin),
Efa (EHEC Factor for Adherence) ainsi que de nombreuses toxines dont
majoritairement Stx, EAST1 et l’hémolysine. (148, 161)
-Les EAEC sont associées aux infections se traduisant par une diarrhée aigüe et
persistante accompagnée d’une augmentation de la sécrétion du mucus intestinal.
L’adhésion s’effectue dans le petit et le gros intestin via les fimbriae AAFs
(Aggregative adherence fimbiae) et est caractérisée par des masses importantes de
bactéries agrégées à la surface cellulaire (stacked-brick pattern). La production
massive de mucus stimulée par ce type d’adhérence permet aux EAEC de s’enfermer
à l’intérieur de biofilms protecteurs. Les toxines telles que Pet, EAST1, ShET1 sont
retrouvées chez ce pathotype d’E. coli sont présentes en association variée dans les
différentes souches (94, 148).
-Les EIEC sont associées aux cas de diarrhée aqueuse, de dysenterie bacillaire et
d’ulcération mucosale. L’adhésion et l’invasion sont effectuées via les effecteurs du
système de sécrétion de type 3 codées par le LEE et par les invasines Ipa (Invasin
Plasmid Antigen). Il est généralement accepté que les shigelles font partie intégrante
du groupe des EIEC puisque la différence génomique entre les deux espèces est
9
faible, par exemple elle n’est évaluée qu’à environ 1.5%. entre E. coli K-12 et
Shigella flexneri. De plus, les EIEC et les shigelles utilisent le même mécanisme
d’invasion. Il est donc commun d’inclure les shigelles dans le groupe des EIEC.
L’invasion des cellules épithéliales du gros intestin par les EIEC est effectuée via un
mécanisme particulier qui implique la pénétration initiale des cellules M ainsi que la
phagocytose par les macrophages. Subséquemment, les EIEC lysent les vacuoles
endocytiques et induisent l’apoptose des macrophages ce qui leur permet d’échapper
à la destruction par la cellule de l’hôte. Une fois libérées, les bactéries se multiplient
et pénètrent les entérocytes via le côté basolatéral de la cellule. Une vacuole sera alors
formée autour de la bactérie et mais sera par la suite détruite afin que les bactéries
puissent se retrouver dans le cytoplasme de la cellule. Les EIEC envahissent ensuite
les cellules adjacentes grâce au mouvement engendré par les projections d’actine
polarisée. Ce mécanisme d’invasion des cellules adjacentes sans quitter le cytoplasme
de la cellule hôte constitue un avantage important pour la bactérie car celle-ci évite
l’exposition au milieu extracellulaire et de ce fait, aux mécanismes immunitaires de
l’hôte (148).
-Les ExPEC sont classées dans un groupe très différent des autres E. coli pathogènes
puisqu’elles causent des infections extra-intestinales chez les sujets atteints. Ce
groupe comprend les E. coli créant des méningites ainsi que les E. coli uropathogènes
(UPEC) créant des infections urinaires. Les diverses ExPEC possèdent de
nombreuses adhésines comprenant des AT trimériques, des curli, des adhésines
fimbriales et afimbriales. Les diverses souches d’UPEC sont caractérisées par la
présence de fimbriae importants, le fimbriae de type 1 et le pili P, ainsi que par
plusieurs toxines dont entre-autres Vat (Vacuolating autotransporter toxin) et HlyA
(Haemolysin A) (83, 94, 121, 148).
-Les DAEC sont impliquées dans des cas de diarrhée chez les porcs. Ce pathotype est
caractérisé par un patron d’adhérence diffuse à la surface des cellules épithéliales. Ce
pathotype possède de nombreuses adhésines dont plusieurs adhésines de la famille
Afa/Dr (Afimbrial Adhesin) telles que les adhésines Afa, des adhésines fimbriales
10
dont F1845 ainsi que des AT tels que AIDA-I (94, 148). Cette dernière est l’objet
d’étude du présent mémoire.
11
Figure 1 : Mode d’adhésion des différents pathotypes d’E.coli causant la diarrhée. Les six pathotypes représentés ici sont tous capables d’adhérer aux cellules de l’hôte par l’intermédiaire d’adhésines propres à chaque pathotype. Dans le cas des EPEC, des ETEC et des EHEC, l’adhésion initiale (A) et l’adhésion ultérieure (B) sont figurées. Adapté de la Nataro et Kaper, 1998 (113).
12
3.0 Les adhésines chez E. coli
L’adhésion d’E. coli aux tissus de l’hôte est une étape primordiale lors du
développement de la pathogenèse. En adhérant aux tissus de l’hôte, les bactéries
acquièrent une résistance vis-à-vis les forces mécaniques qui tendent à promouvoir
leur élimination. L’attachement aux tissus de l’hôte peut être effectué directement,
c’est-à-dire via l’interaction de l’adhésine avec des molécules de la surface de la
cellule, ou indirectement, c’est-à-dire via l’attachement de l’adhésine à un facteur
soluble servant de «pont» entre la bactérie et la cellule de l’hôte (Figure 2) (52, 96).
Les différents pathotypes d’E. coli ont cumulé un nombre prodigieux d’adhésines
diverses et tenter de les citer en entier serait laborieux. Le lecteur est invité à se
référer aux nombreuses revues traitant de ce sujet pour une liste complète (94, 147,
158, 161, 167, 170). Les principales adhésines d’E. coli peuvent être divisées en trois
groupes : les adhésines fimbriales, afimbriales et autres types d’adhésines (Figure 3).
Figure 2. Adhésion bactérienne à la cellule-hôte. La bactérie utilise un récepteur
présent à la surface de la cellule (A) ou utilise l’interaction d’une molécule de l’hôte
avec son récepteur cellulaire pour former un pont entre la bactérie et la cellule-hôte
(B). Adapté de Finlay and Caparon, 2005 (52).
13
Figure 3. Schématisation de divers types d’adhésines. Adapté de Finlay and
Caparon, 2005 (52).
3.1 Les adhésines fimbriales
Les adhésines fimbriales sont des protéines formant des appendices rigides, droits et
filamenteux ancrés dans la membrane bactérienne qui permettent l’adhésion
bactérienne aux tissus de l’hôte. Elles sont constituées de centaines, voir de milliers
de sous-unités et se distinguent des flagelles par leur absence de motilité et par leur
diamètre exigu (2 à 8 nm contrairement à 20 nm pour les flagelles). Ce groupe
comprends de nombreuses adhésines dont les plus connues sont le pili de type I, le
pili P, les adhésines Afa/Dr (fimbrial adhesin family), les adhésines AAF, le pili de
type IV, les fimbriae F4, F18 et les curli. Ces diverses adhésines peuvent être
regroupées selon leur mode d’assemblage et de sécrétion soit le système de
chaperonne-placier, le système homologue au système de sécrétion de type 2 et la
voie de nucléation/précipitation (44, 101, 148, 167).
14
3.1.1 Le système de chaperonne-placier
Le système de chaperonne-placier est couramment utilisé lors de l’assemblage des
pili à la surface bactérienne. La synthèse des adhésines sécrétées par ce système peut
être divisée en quatre étapes : le passage de la membrane interne, la prise en charge
par la chaperonne, le transfert au placier et finalement la sécrétion à la surface
bactérienne. La première étape, qui consiste en la traversée de la membrane interne
des sous-unités du pilus, est effectuée via la machinerie de sécrétion sec. Les sous-
unités sont ainsi retrouvées dans le périplasme d’où elles sont prises en charge par la
chaperonne périplasmique. La chaperonne assure divers rôles primordiaux : 1)
empêcher la polymérisation des sous-unités du pilus puisque dans le cas contraire,
celles-ci seront dégradées par la protéase DegP 2) favoriser le repliement conforme
des sous-unités et 3) diriger les sous-unités vers le placier. Le placier est une protéine
de la membrane externe servant de plateforme d’assemblage pour la formation du
pilus grâce à sa capacité à recruter les chaperonnes périplasmiques dans un ordre très
précis. Suite au recrutement et à l’assemblage des sous-unités, le placier sécrète le
pilus à la surface bactérienne (18).
Plusieurs adhésines fimbriales sont assemblées et sécrétées par le système de
chaperonne-placier. Les plus connues et communes sont le pilus de type I, le pilus P
(pyelonephritis-associated P pilus), les fimbriae F4, F18, la famille des adhésines
Afa/Dr ainsi que les fimbriae AAF. Le pilus de type I est très répandu et peut être
retrouvé chez les souches commensales d’E. coli ainsi que dans plus de 90% des
UPEC tandis que le pilus P est retrouvé chez plus de 80% des UPEC engendrant des
pyélonéphrites et également chez certains autres types d’ExPEC. Les pili de types I et
P sont respectivement codés par les regroupements de gènes fim et pap possèdant une
organisation génétique semblable. Ces deux pili sont soumis à une régulation de
phase, c’est à dire que la bactérie varie entre des cycles où sa surface est exempte de
pilus (aussi appelé phase «off») et des cycles où le pilus y est présent (aussi appelé
phase «on»). Cependant, il est à noter qu’une divergence au niveau du mécanisme
utilisé pour la régulation de phase de ces deux pili existe. En effet, l’alternance entre
les phases «on» et «off» chez le pilus de type I est effectuée grâce à la recombinase
15
FimB et la protéine FimE dont l’action combinée provoque l’inversion d’un segment
d’ADN en aval de la sous-unité majeure ce qui permet ou non la transcription des
gènes du pilus de type I. Chez le pilus P, la régulation de phase est contrôlée grâce à
une méthylation différentielle de l’ADN effectuée par les protéines PapI et PapB.
Puisque ces deux pili possèdent une biogenèse similaire, nous pouvons utiliser
l’exemple du pilus de type I afin d’illustrer le principe de l’assemblage des pili par le
système de chaperonne-placier. La biogenèse du pilus de type I est assuré par la
chaperonne périplasmique FimC qui lie et guide les sous-unités du pilus vers le
placier FimD qui assemble et sécrète le pilus. Le pilus de type I est formé de
nombreuses répétitions (500-3000) de la sous-unité structurale majeure FimA
assemblées en une hélice droite dont les sous-unités sont liées entres-elles par des
liens non covalents. Au bout de l’hélice est annexé le fimbrillum, structure composée
de plusieurs sous-unités de FimF et FimG. À l’extrémité du fimbrillum est adjointe la
sous-unité FimH responsable de la capacité d’adhésion au pilus de type I (29, 60, 83,
85, 117). Il a été observé que l’adhésine FimH présente une hétérogénéité
significative au niveau de sa séquence pouvant engendrer une modification de
l’affinité de FimH pour les motifs d’oligomannose qui peut se traduire par une
altération du pouvoir pathogène de la bactérie. Pour de plus amples détails, se référer
à la section 5.1.2 page 31.
Le système de chaperonne-placier permet également l’assemblage de d’autres
adhésines dont les fimbriae AAF et les adhésines de la famille Afa/Dr. Les fimbriae
AAF sont retrouvés chez les pathotypes EAEC et les gènes nécessaires à la formation
des ces fimbriae sont situés à l’intérieur de plasmides transmissibles de 60-65 MDa
nommés pAA. Ces plasmides présentent des caractéristiques variées tant au niveau du
gène codant pour l’adhésine que de la toxine, ce qui ne les empêchent pas d’avoir des
loci génétiques conservés et d’appartenir à une même famille. L’absence de
ressemblance significative au niveau de la séquence d’ADN des adhésines AAF avec
d’autres adhésines connues fait des adhésines AAF une famille unique. Les gènes
codant pour ces adhésines sont retrouvés sous deux groupes de gènes distincts. Le
premier groupe comprend les gènes codant pour la chaperonne (aafD), l’adhésine
16
(aafA) et l’activateur de transcription (aggR). Le deuxième groupe comprend les
gènes de la chaperonne silencieuse (AafD'), du placier (AafC) ainsi qu’un gène relié à
l’invasine AfaD (AafB). Cette organisation génique particulière et conservée est
caractéristique des adhésines AAF des EAEC (94, 132). La seconde famille à être
assemblée et sécrétée par le système de chaperonne-placier est la famille Afa/Dr.
Cependant, il est à noter que quelques adhésines afimbriales de cette famille ne sont
pas sécrétées par le système de chaperonne-placier. La famille d’adhésine Afa/Dr
constitue un groupe peu homogène d’adhésines dont les membres sont sélectionnés
en fonction de leur capacité à reconnaître l’antigène Dr du DAF (decay-accelerating
factor aussi appelé CD55) situé à la surface des cellules épithéliales intestinales ou
urinaires. La biogenèse des adhésines Afa/Dr nécessite l’action conjointe de la
chaperonne périplasmique AfaB, du placier AfaC ainsi que des deux régulateurs de
transcription AfaA et AfaF. Chez les E. coli, la présence des adhésines Afa est
associée à la capacité de créer des infections urinaires et des diarrhées tandis que la
présence des adhésines Dr est associée à la capacité à créer uniquement des infections
urinaires (95, 132).
La grande variété des adhésines sécrétées et assemblées par le système de
chaperonne-placier fait de ce dernier un mode d’assemblage et de sécrétion des
adhésines d’E. coli d’une importance capitale.
3.1.2 Le pili de type IV
Les adhésines sécrétées par le système homologue au système de sécrétion de type 2
chez E. coli sont désignées sous le nom de pili de type IV. Les pili de type IV sont
des structures longues, flexibles et formés de sous-unités de piline polymérisées qui
sont assemblées dans la membrane cytoplasmique puis exportées à travers la
membrane externe jusqu’à la surface bactérienne via un système homologue au
système de sécrétion de type 2. Ils peuvent être divisés en deux classes en fonction de
leur longueur et de leur séquence en acides aminés: le type IVa et le type IVb. À
l’heure actuelle, les membres appartenant à la classe du type IVb ne comprennent que
des pathogènes possédant la capacité à infecter l’homme. Il existe différents pili de
17
type IV comme par exemple les longus pili des ETEC (64) et les bundle-forming pili
(BFP) chez les EPEC (64, 167). L’exemple du BFP des EPEC est couramment utilisé
afin d’illustrer les particularités du mode de sécrétion homologue au système de
sécrétion de type 2. Le BFP est codé par un opéron constitué de 14 gènes désignés
bfpA à bfpL, bfpP et bfpU dont l’unité majeure consiste en BfpA, aussi appelé
bundline (134). La biogenèse est effectuée en trois étapes : le processing de la
bundline, la formation du pilus et son extrusion. Les deux dernières étapes sont
dépendantes de deux complexes protéiques, le complexe de membrane interne
composé de BfpC, BfpD, BfpE et BfpF (28) et le complexe de membrane externe
composé de la sécrétine BfpB et des protéines BfpG et BfpU (30). Les pili de type IV
possèdent la capacité unique de se rétracter à l’intérieur de la paroi cellulaire de la
bactérie tout en conservant leur extrémité solidement attachée à la cellule. Cette
aptitude est à l’origine du mouvement spécialisé nommé twitching motility qui est
observé lors du déplacement bactérien sur une matrice semi-solide (17, 27). Les pili
de type IV sont des structures multifonctionnelles uniques permettant également
l’adhésion aux cellules hôtes, la formation de microcolonies, la modulation des
cellules ainsi que l’absorption des bactériophages.
3.1.3 La voie de nucléation/précipitation
Les curli sont de minces fimbriae de 6-12 nm de diamètre, de longueur irrégulière,
agrégés à la surface de la bactérie sur une épaisseur de 0.5 à 1 nm (20). Ils sont
présents chez de nombreux pathotypes d’E. coli, notamment chez les EHEC, où ils
sont responsables de la formation des biofilms et de l’adhésion bactérienne. Ces
adhésines possèdent un mode d’assemblage remarquable et inusité. En effet, les curli
sont assemblés à l’extérieur de la bactérie grâce à l’action de protéines nucléatrices
qui précipitent les sous-unités protéiques solubles à la surface bactérienne. La
formation des curli nécessite deux opérons: l’opéron csgBA codant pour les composés
structuraux et l’opéron csgDEFG (curli synthesis gene) codant pour les protéines
nécessaires à la régulation, au transport des sous-unités et à la stabilisation des fibres
(138). La lipoprotéine CsgG située dans la membrane externe constitue une partie
intégrante du complexe de sécrétion nécessaire à la formation des curli. Ses fonctions
18
incluent l’export à la surface cellulaire de la sous-unité majeure CsgA (ou curline) et
de son auxiliaire à la polymérisation CsgB ainsi que leur protection contre la
protéolyse. La présence de CsgG à la surface cellulaire sert également de support à la
formation des curli. Des études récentes portant sur la fonction des protéines CsgE et
CsgF semblent leur attribuer le rôle de chaperonne et de nucléateur lors de
l’assemblage du curli. La sécrétion de ces protéines faciliterait également le transport
des protéines CsgA et CsgB à travers la membrane externe. La formation des curli est
possible grâce au nucléateur CsgB, présent le long du filament, qui polymérise les
sous-unités CsgA. Une fois assemblés à la surface bactérienne, les curli sont des
structures stables et difficiles à dissocier (83).
3.2 Adhésines afimbriales
Les adhésines afimbriales se définissent comme des structures non-filamenteuses,
formées le plus souvent d’une seule protéine monomérique ou oligomérique. Ces
adhésines sont sécrétées de diverses manières à la surface de la bactérie (60, 117).
Dans la majorité des cas, les adhésines demeurent liées à la membrane bactérienne
mais certaines adhésines existent également sous une forme sécrétée.
3.2.1 Les adhésines membranaires
On peut citer comme adhésine membranaire la porine OmpA qui est une protéine de
membrane externe, composée d’un tonneau et de plusieurs boucles extracellulaires
(129). OmpA possède plusieurs fonctions (155). La protéine purifiée peut se lier aux
cellules endothéliales microvasculaires du cerveau et permettre ainsi aux E. coli
responsables de méningite de traverser la barrière hémato-encéphalique (151). Les
EHEC O157:H7 semblent aussi utiliser OmpA pour adhérer aux cellules épithéliales
Hela et Caco-2 (168). OmpA est insérée dans la membrane externe par le système de
biogénèse des protéines de la membrane externe, qui a fait l’objet d’une revue récente
(15). Il existe d’autres protéines de membrane externe contribuant à l’adhésion d’E.
coli. On peut citer la protéine Hek (hemagglutinin from E. coli K1) présente chez les
19
E. coli causant des méningites (43). Cette protéine permet l’adhésion et l’invasion
aux cellules épithéliales ainsi que l’autoaggrégation. La protéine de membrane
externe Tia (enterotoxigenic invasion protein A) des ETEC médie l’adhésion et
l’invasion de cellules épithéliales gastrointestinales en se liant à un protéoglycane
(54). Les EHEC possèdent aussi plusieurs protéines de la membrane externe qui
contribuent à leur adhérence comme la protéine Saa (STEC autoagglutinating
adhesin) (128) ou la protéine Iha (IrgA homologue adhesin) (165).
3.2.2 Adhésines reliées au système de sécrétion de type 3
Les EPEC et les EHEC possèdent la capacité de former des lésions de type attachant
et effaçant se manifestant par l’attachement intime de la bactérie aux cellules hôtes, la
formation d’un piédestal sur lequel repose la bactérie et l’effacement des
microvillosités intestinales (55). La formation des lésions de type attachant et effaçant
par la bactérie requiert la présence de l’îlot de pathogénicité appelé LEE (Locus of
Entrerocyte Effacement) codant pour une adhésine membranaire nommé intimine,
son récepteur Tir (Translocated Intimine Receptor), le système de sécrétion de type 3
ainsi que pour de nombreux effecteurs (57, 119). L’attachement intime des EPEC et
des EHEC à la surface de la cellule-hôte requiert la liaison de l’intimine avec son
récepteur Tir. La protéine Tir a longtemps été considérée comme une protéine de
l’hôte mais il s’agit en réalité d’une protéine bactérienne transloquée par le système
de sécrétion de type 3 qui est intégrée dans la membrane de l’hôte. Cependant il est à
noter que l’adhésine intimine n’est pas sécrétée par le système de sécrétion de type 3.
Le système de sécrétion de type 3 permet l’injection de nombreux effecteurs
bactériens, nommés Esp chez E. coli, dans le cytosol de la cellule hôte. Ces effecteurs
interfèrent avec les métabolismes normaux de la cellule hôte modulant l’activité de
cette dernière à l’avantage de la bactérie ce qui entraîne la formation des lésions de
type attachant et effaçant.
Une autre protéine ayant une importance dans la formation des lésions de type
attachant et effaçant est la protéine EspA. Son rôle en tant qu’adhésine est encore
controversé (57, 119). EspA, sécrétée par le système de sécrétion de type 3, est une
protéine particulière aux EPEC, qui forme un appendice filamenteux constituant le
20
pont entre l’extrémité de l’aiguille et la membrane de la cellule hôte (31). EspB et
EspD sont deux autres protéines sécrétées par le système de sécrétion de type 3 qui
forment un pore dans la membrane plasmique (150). EspA pourrait fonctionner
comme une adhésine, soit en se liant au complexe EspB-EspD, soit en se liant
directement à la cellule hôte (57, 119, 150, 167).
3.2.3 Les flagelles Le rôle principal des flagelles est la motilité. Ils sont cependant considérés depuis peu
comme des adhésines (63). Des souches EPEC mutées pour le gène structural du
flagelle fliC sont en effet moins adhérentes à des cellules épithéliales en culture. Des
flagelles purifiés sont aussi capables d’adhérer aux cellules, suggérant que les
flagelles eux-mêmes ont des propriétés adhésives. De plus, la propriété d’adhésion
des flagelles est indépendante de leur motilité (63). Les flagelles sont sécrétés par un
système de sécrétion de type 3 qui diffère de celui des EPEC et qui a fait l’objet de
nombreuses revues (6, 103).
3.2.4 Le système de sécrétion de type V
Plusieurs adhésines d’E. coli nécessitent l’action du système de sécrétion de type V
pour leur présentation à la surface cellulaire. Le système de sécrétion de type V
comprend le système des AT (système de sécrétion Va), le système à deux partenaires
(système de sécrétion Vb) et le système des AT trimériques, parfois désignés Vc (74).
La caractéristique commune à ces trois systèmes consiste en la translocation des
protéines à travers la membrane externe par l’intermédiaire d’un pore
transmembranaire formé par un tonneau β. Le système à deux partenaires est
composé de deux protéines séparées dont TpsA constitue la protéine sécrétée et TpsB
le domaine translocateur (Figure 4). En ce qui concerne les AT, ceux-ci contiennent
les deux domaines dans une seule protéine. Dans le cas des AT conventionnels (Va),
ces deux domaines sont monomériques tandis que chez les AT trimériques (Vc), le
tonneau β est un homotrimère formé de 12 brins β dans lequel chaque monomère
fournit 4 brins. Pour les trois classes du système de sécrétion de type V, le passage de
la membrane interne est effectuée par le système Sec (74, 75).
21
3.2.5 Les autotransporteurs et l’adhésion
Les protéines AT peuvent conférer plusieurs fonctions à la bactérie telle que la
protéolyse, la cytotoxicité, la résistance au sérum, l’adhésion et l’invasion (75, 126).
Les AT possèdent une organisation structurale exclusive formée d’une séquence
signal en N-terminal suivi d’un domaine passager qui sera transloqué à la surface
cellulaire (correspondant à la fonction de la protéine), suivi d’un domaine de jonction
et d’une unité de translocalisation en C-terminal (62). Le domaine de jonction, aussi
appelé autochaperonne, occupe une fonction importante pour le repliement et la
translocation du domaine extracellulaire (123). La sécrétion des AT est effectuées via
le système de sécrétion de type Va et chez les bactéries Gram négatif, la sécrétion
peut être divisée en trois étapes. La première étape consiste en le passage de la
membrane interne via la machinerie de sécrétion Sec grâce à la présence du peptide
signal situé dans la région N-terminale de l’AT (153). Une fois dans le périplasme,
l’AT se replie par un processus qui semble dépendant des facteurs génétiques de
l’hôte. Le repliement de l’AT serait très limité car celui-ci doit rester partiellement
déplié pour permettre sa translocation. La dernière étape consiste en l’insertion de
l’unité de translocalisation de l’AT dans la membrane externe suivit de la
translocation du domaine passager à travers l’unité de translocalisation permettant
ainsi la présentation de l’AT à la surface bactérienne (37, 38, 143).
Les AT possédant une fonction adhésive sont récapitulés dans le tableau 1 et ont fait
l’objet d’une revue récente par notre laboratoire (62). Il est intéressant de noter que
d’une part, les adhésines AT occupent souvent d’autres fonctions en plus de leur
capacité à adhérer comme l’invasion ou l’autoaggrégation et que d’autre part, leurs
substrats sont souvent non identifiés. Plusieurs AT conférant la capacité d’adhésion
aux bactéries subissent une coupure à la surface cellulaire ce qui provoque la
séparation de la partie extracellulaire de l’AT et du domaine passager (21). Cette
coupure pourrait être avantageuse au niveau de la régulation de l’activité adhésive,
c’est-à-dire que le contrôle de la protéolyse par le milieu extérieur pourrait
promouvoir une adhésion optimale au bon endroit ainsi qu’au bon moment tout en
22
permettant de modifier la force de l’adhésion. Les AT adhérents consistent
généralement en des protéines multifonctionnelles, il est donc probable que le
relâchement de la partie extracellulaire puisse servir à augmenter les fonctions
alternatives de ces AT. Finalement, la protéolyse et le relâchement pourrait en
prévenir la reconnaissance immune de la bactérie par l’hôte dans le cas où ce dernier
produit des anticorps dirigés contre la forme libre de l’adhésine (34, 62).
Il existe quatorze adhésines AT connues chez E. coli et cinq d’entre-elles font partie
de la famille des SAAT (Self-Associating Autotransporters) qui regroupent les AT
possédant une similarité de séquence et de propriété agrégatives (84). Les membres
des SAAT sont AIDA-I, l’antigène 43 (Ag43), l’adhésine/invasine TibA (Toxigenic
Invasion loci A), cah (calcium-binding ag43 homologue) et YpjA. Nous décrirons
plus en détail AIDA-I puisqu’il s’agit du sujet d’étude du présent mémoire.
23
Figure 4. Représentation schématique du système de sécrétion de type V. Dans les
trois cas, le passage de la membrane externe est effectué via la machinerie Sec et
l’autotransporteur est présenté à la surface bactérienne suite à la traversée de la
membrane externe via le tonneau β. Le système de sécrétion de type V est divisé en 3
sous-catégories : Va, Vb et Vc. Les autotransporteurs sécrétés par les systèmes Va et
Vc possèdent leur domaine passager et leur domaine translocateur fusionnés à
l’intérieur de la même protéine. Dans le cas du système Vc, ces deux domaines sont
des homotrimères. Le système Vb est le système à deux partenaires pour lequel le
domaine passager et le domaine translocateur sont situés sur deux protéines
différentes. Adapté de Henderson and al., 2004 (75).
24
Organisme Adhésinea Autres fonctions Substratc Ref. Actinobacillus actinomycetecomitans
EmaA Omp100
Aae
Résistance au sérum, Invasion
Col
(111) (8) (49)
Bartonella henselae BadA Résistance à la phagocytose Col, FN, L (136) Bartonella quintana Vomps Autoaggrégation Col (184) Bordetella pertussis Perctactin
TcfA BrkA
Résistance au sérum, Invasion
(97) (53) (46)
Campylobacter jejuni CapA Invasion (9) Chlamydia pneumoniae Pmp21/PmpD (181) Escherichia coli AIDA
Ag43 TibA Cah
YpjA YfaL YcgV
Tsh/Hbp EheA
EibA/C/D/E RpeA
autoprotéase, autoaggrégation, Biofilm
autoprotéase, autoaggrégation, Biofilm
autoaggrégation, Biofilm, Invasion Biofilm Biofilm Biofilm Biofilm
Hémoglobine protéase Biofilm
Ig
(11) (82)
(100) (169) (141) (141) (141) (86)
(182) (144) (99)
Haemophilus ducreyi DrsA (24) Haemophilus influenzae Hap
Hia Hsf
Protéase, Autoaggrégation, Invasion
FN, L, Col
(50) (89)
(159)
Helicobacter pylori BabA SabA AlpA
LewisB Ag S-LewisX
Ag
(77) (104) (120)
Moraxella catarrhalis UspA1 UspA2
UspA2h Hag
McaP
Résistance au sérum Résistance au sérum
Autoaggrégation
Estérase, Phospholipase
FN VN
(2) (109) (92)
(130) (166)
Neisseria meningitidis NadA App Nhha MspA
Invasion Protéase
L, HS
(25) (149) (146) (173)
Ricktessiales rOmpA rOmpB
Invasion
(4) (174)
Salmonella enterica ShdA MisL
Invasion
Col, FN Col, FN
(81) (40)
Yersinia enterocolitica YadA Résistance sérum/phagocytose Autoaggrégation, Invasion
Col, L (139)
Tableau 1 : Les adhésines autotransporteurs.
a : seules les protéines dont la fonction adhésive a été confirmée sont indiquées. Les
autotransporteurs en gras appartiennent à la famille des SAAT.
b : C : autotransporteur conventionnel, T : autotransporteur trimérique.
c : Col : collagène. FN : Fibronectine. L : Laminine. VN : Vitronectine. HS : Heparan
sulfate. Ig : Immunoglobuline Adapté de Girard and Mourez, 2006 (62).
25
3.3 Les adhésines non protéiques
3.3.1 Les lipopolysaccharides
Le rôle des lipopolysaccharides comme adhésines d’E. coli reste controversé.
L’utilisation d’anticorps dirigés contre les antigènes O des LPS O111 et O157
diminue l’adhérence des EHEC à des cellules en culture. Cependant, la préincubation
de cellules avec des LPS n’inhibe pas l’adhésion des EHEC, suggérant que les LPS
ne sont pas des adhésines en tant que telles (161). De plus, des mutants O157:H7
déficients pour la synthèse de l’antigène O sont hyperadhérents. Ceci pourrait être du
à une modification globale de l’hydrophobicité de la membrane ou à une adhésion par
des protéines qui étaient auparavant masquées par les lipopolysaccharides (58).
L’hyperadhérence de ces mutants pourrait aussi être dû à l’implication du core du
LPS dans l’adhésion, comme il a été montré pour Actinobacillus pleuropneumoniae
(127). Ainsi, l’absence de la chaine d’antigène O offrirait une meilleure présentation
du core du LPS aux cellules, ce qui pourrait rendre les mutants hyperadhérents dans
le cas d’une adhésion médiée par le core du lipopolysaccharide. Les
lipopolysaccharides semblent aussi jouer un rôle dans la colonisation du tractus
intestinal (105). Les lipopolysaccharides ont donc un rôle dans l’adhésion soit
directement en tant qu’adhésine soit indirectement par leur implication dans la
stabilité membranaire, l’hydrophobicité et le repliement des protéines de membrane
externe. Leur biosynthèse est complexe et a fait l’objet de plusieurs revues (39, 171).
4.0 Les invasines d’E. coli
L’environnement extracellulaire intestinal est un milieu hostile à l’égard des
bactéries. Ce milieu présente diverses caractéristiques mécaniques, chimiques et
immunitaires représentant une menace pour les bactéries. Plusieurs espèces
bactériennes ont développé diverses stratégies d’invasion afin de pénétrer à l’intérieur
des cellules, là où elles sont partiellement protégées contre les agressions du milieu
extérieur (29, 85). L’invasion des cellules-hôte peut être effectuée via deux
26
mécanismes : l’endocytose induite et l’invasion active. L’invasion par endocytose
induite est engendrée par l’injection d’effecteurs bactériens dans une cellule-hôte afin
de stimuler l’invasion dans les cellules non-phagocytaires. Lors de ce type
d’invasion, la bactérie et la cellule-hôte sont actives (Figure 5). L’invasion engendrée
par le système de sécrétion de type 3 constitue le mécanisme d’invasion par
endocytose induite le mieux caractérisé. L’invasion active consiste en l’invasion de la
cellule-hôte sans déclencher de mouvements contractiles chez la cellule-hôte. Ainsi,
seule la bactérie est active lors de ce processus d’invasion (132, 142). Plusieurs
pathogènes possèdent des invasines engendrant l’invasion des cellules hôtes,
cependant, nous ne nous concentrerons que sur les principales invasines d’E. coli.
Figure 5. Routes d’invasion utilisées par les bactéries pour envahir une cellule-hôte.
La phagocytose implique seulement l’activation de la cellule phagocytaire,
l’endocytose induite requiert l’activation de la cellule bactérienne et de la cellule hôte
tandis que l’invasion active ne requiert que l’activation de la cellule bactérienne.
Adapté de la référence Russell, 2005 (142).
4.1 L’invasion par endocytose induite
4.1.1 Invasion engendrée par le système de sécrétion de type 3
Il est généralement accepté que les shigelles font partie intégrante du groupe des
EIEC. (93, 148). L’invasion engendrée par les EIEC et les shigelles utilise le système
Les cellules actives sont représentées par un +
27
de sécrétion de type 3 qui fait appel à la translocalisation d’effecteurs capables de
moduler le cytosquelette de la cellule hôte afin d’entraîner la formation d’une
protusion qui, éventuellement, enfermeras la bactérie dans une vacuole. Chez les
shigelles les effecteurs sécrétés sont IpaA, IpaB, IpaC, IpgB1, IpgB2, IpgD et VirA.
Ces effecteurs sont impliqués dans l’invasion bactérienne (IpaA, IpaC, IpgB1, IpgD,
VirA), la programmation de la mort cellulaire et l’arrêt du cycle cellulaire de la
cellule hôte (IpaB) ainsi que dans la survie de la bactérie dans la cellule hôte (IpgD)
et la dispersion bactérienne de cellule à cellule (VirA) (29, 122, 148).
4.2 L’invasion active
L’adhésion d’une bactérie à une cellule hôte peut permettre à celle-ci d’engager
différents récepteurs à la surface de la cellule. L’engagement de récepteur(s) par
l’invasine permet de déclencher une cascade de signalisation qui entraine la
phosphorylation de protéines kinases et l’activation de réarrangements du
cytosquelette. Chez E. coli de nombreuses invasines utilisent cette manœuvre pour
envahir les cellules épithéliales citons par exemple le pilus de type I. Chez les UPEC,
l’adhésion de la bactérie aux cellules de la vessie est effectuée via la liaison entre le
pilus de type I et le monomannose de l’uroplaquine 1a. Cette interaction active une
cascade de signalisation qui résulte en l’invasion des bactéries dans la cellule (29, 83,
121). Des études ont démontré que l’invasion engendrée par le pilus de type I est
dépendante de la présence de radeaux lipidiques au site d’entrée de la bactérie, ces
derniers servant de plateforme pour le recrutement des molécules de signalement (1,
183). Un autre exemple d’invasion active chez E. coli est illustré par les adhésines
Afa. Les E. coli possédant une ou plusieurs adhésines Afa ne sont pas considérées
comme des pathogènes invasifs au même titre que les salmonelles et les shigelles
mais leur capacité à envahir les cellules épithéliales in vitro ainsi que des explants
d’entérocytes porcins différenciés a été démontrée. Des expériences effectuées avec
E. coli exprimant cette invasine ont démontré la capacité de cette dernière à
promouvoir l’internalisation de la bactérie dans les cellules HeLa ainsi que dans des
28
cellules non-différenciées Caco-2 (29, 94). Le faible pourcentage d’invasion
engendrée par AfaE/AfaD est compensé par la capacité de survie et de multiplication
des bactéries invasives à l’intérieur des inclusions pendant plusieurs jours. L’invasion
engendrée par AfaE/AfaD est indépendante de l’adhésion assurée par AfaE.
Cependant, la concentration de protéines AfaD retrouvée chez la bactérie revêt une
importance cruciale lors du processus d’internalisation. Ainsi, l’invasion engendrée
par les adhésines Afa des ExPEC pourrait entraîner la formation de niches
intracellulaires qui permettraient aux bactéries de persister et de créer un réservoir
chez l’hôte à partir duquel elles pourraient redémarrer le processus d’infection (95). Il
existe plusieurs autres invasines utilisant l’invasion active comme mécanisme
d’invasion chez E. coli, citons par exemple les invasines Ipa des EIEC permettant
l’invasion des cellules épithéliales intestinales et qui sont codées par le plasmide Ipa,
les hémagglutinines Dr, Dr-II des ExPEC qui permettent l’invasion des cellules
épithéliales ainsi que les AT possédant une fonction invasive (29, 94).
4.2.1 Les autotransporteurs et l’invasion
Certains AT d’E. coli possèdent la capacité de promouvoir l’invasion des cellules
hôtes tels que TibA (42), Ag43 (47) et AIDA-I (21). Les bactéries exprimant les AT
semblent utiliser le mécanisme de l’invasion active pour pénétrer les cellules
épithéliales, cependant, la cascade de signalisation menant à l’internalisation n’est pas
définie. Toutefois, des études ont démontré clairement que l’AT TibA permet
l’invasion des cellules épithéliales en culture (42) et que la présence d’Ag43 à la
surface bactérienne augmentait l’absorption des bactéries à l’intérieur des
neutrophiles (47). Également, des études effectuées sur l’AT AIDA-I ont démontré la
capacité de celle-ci à promouvoir l’invasion dans les cellules épithéliales. Une étude
effectuée sur AIDA-I a démontré que le mécanisme d’adhésion de cette protéine n’est
pas tout à fait le même que le mécanisme d’invasion. En effet, dans cette étude, les
auteurs ont créé des variants d’AIDA-I possédant une capacité d’adhésion amoindrie
sans affecter la capacité d’invasion de la bactérie porteuse et vise versa (22).
29
5.0 Récepteurs reconnus par les adhésines/invasines bactériennes
L’adhésion et l’invasion des cellules hôte sont considérées comme des
processus intimement liés. L’adhésion et l’invasion bactériennes peuvent être
engagées directement c’est-à-dire via l’interaction de molécules présentes à la surface
de la cellule, ou indirectement, c’est-à-dire via l’attachement de l’adhésine à un
facteur soluble servant de «pont» entre la bactérie et la cellule de l’hôte (52). La
grande diversité des molécules se retrouvant à la surface des cellules constituent des
cibles de choix pouvant être utilisées comme récepteur par les pathogènes lors de
l’adhésion et l’invasion (16, 70, 133). Les molécules reconnues par les adhésines et
invasines bactériennes peuvent être classées en catégories dont les deux plus
importantes sont les composés d’adhérence des cellules eucaryotes et les molécules
glycosylées. Il existe également de nombreuses autres catégories citons par exemple
les radeaux lipidiques, les lectines et les contre-récepteurs des intégrines. La revue
qui suit décrit les principales catégories de récepteurs cellulaires reconnus par les
adhésines et invasines bactériennes, sans limitation au groupe des E. coli.
5.1 Composantes d’adhérence des cellules eucaryotes
5.1.1 Composantes de la matrice extracellulaire
Les composantes de la matrice extracellulaire constituent un ensemble de molécules
retrouvées à la surface cellulaire occupant diverses fonctions allant du support et de
l’ancrage de la cellule à la régulation des communications intercellulaires. Plusieurs
molécules de diverses natures sont regroupées dans ce groupe, citons par exemple la
laminine, la fibronectine et les différents types de collagènes (133). Plusieurs
adhésines et invasines d’E. coli possèdent la capacité de lier les composantes de la
matrice extracellulaire. Les curli possèdent la capacité de lier certaines composantes
de la matrice extracellulaire tels que la laminine et la fibronectine en plus de
nombreuses protéines sériques (ex : plasminogène) et tissulaires humaines (ex :
complexe majeur d’histocompatibilité de classe I) ce qui contribue à augmenter la
virulence des souches (52, 83). Certains variants du pili de type I possèdent
30
également la capacité d’interagir avec quelques composantes de la matrice
extracellulaire : la laminine, la fibronectine et le collagène de type IV et V (83). Il a
aussi été reporté que l’hémagglutinine Dr peut lier le collagène de type IV (94, 95). Il
existe également d’autres molécules de la matrice extracellulaire, notamment
différents types de collagène, la fibronectine et la laminine qui peuvent être utilisées
par les pathogènes comme récepteur direct. Puisqu’il existe plus de 25 types de
collagène, les diverses adhésines peuvent utiliser différents type de collagène comme
récepteur cellulaire afin, par exemple, de conférer un tropisme cellulaire aux
pathogènes. Citons par exemple le fimbriae de type III de Klebsiella pneumoniae qui
reconnaît spécifiquement le collagène de type IV et V (133). La fibronectine est une
protéine ubiquitaire de la matrice extracellulaire qui est essentielle à l’adhésion de
tous les types de cellules eucaryotes. Cette molécule est recrutée lors de l’adhésion
par 16 espèces bactériennes dont Staphylococcus aureus et certains streptocoques
(71, 117, 121). La laminine est un constituant de la membrane basale des cellules qui
peut être exposée lorsque les tissus sont endommagés ou inflammés. Certains
pathogènes tels que Pseudomonas aeruginosa, Helicobacter pylori ainsi que certains
streptocoques expriment des adhésines possédant la capacité de lier la laminine
augmentant ainsi leur chances d’engager le processus d’infection lorsque la barrière
cutanée de l’hôte est endommagée (133).
Certaines molécules de la matrice extracellulaire sont également liées indirectement
lors de l’adhésion et l’invasion de certains pathogènes. Il est intéressant de
mentionner le cas des streptoccoques de groupe A qui peuvent lier le collagène via
l’interaction de la fibronectine (117, 133). Citons également l’exemple du
protéoglycan qui possède la capacité d’interagir directement avec les molécules de la
matrice extracellulaire. Le protéoglycan est une molécule impliquée dans les
mécanismes de l’adhésion cellulaire, de la croissance des cellules, du contrôle des
voies protéolytiques et lipolytiques. Certains pathogènes tels que Plasmodium,
Leishmania et Trypanosoma utilisent les protéoglycans ainsi que les molécules avec
lesquelles ils interagissent afin de promouvoir leur invasion dans les tissus de l’hôte
(133).
31
Les intégrines sont des récepteurs présents à la surface apicale et basolatérale des
cellules qui sont impliquées dans les échanges de signaux entre le milieu
extracellulaire et le cytosquelette de la cellule. Ils sont, de ce fait même, impliqués
dans les processus de signalisation cellulaire et permettent l’attachement des cellules
aux tissus et entrent également en relation avec des composantes de la matrice
extracellulaire tels que la fibronectine, la laminine et le collagène. Certains
pathogènes favorisent l’utilisation de ces molécules en tant que récepteurs puisque le
contact direct entre les intégrines et le cytosquelette permet à la bactérie adhérée de
manipuler la machinerie de l’hôte afin de promouvoir l’entrée subséquente de la
bactérie dans la cellule hôte (16, 70, 71). C’est le cas du pili de type I des UPEC qui
possède la faculté de lier les intégrines α3 et β1 présentes sur les cellules épithéliales
urinaires (29). Il a été rapporté que certaines intégrines basolatérales semblaient
également jouer un rôle lors du processus d’infection. En effet, l’invasine AfaD
utilise les intégrines β1 comme récepteur. Ces intégrines sont retrouvées à la surface
basolatérale des cellules, ce qui nous amène à nous poser des questions sur leur
accessibilité lors de l’infection. Des observations suggèrent que les intégrines β1 sont
présentes au site d’interaction entre bactérie-cellule (94, 167). Ce phénomène,
combiné à la possibilité de présentation des intégrines basolatérales dans les tissus
endommagés ou enflammés, pourrait expliquer l’utilité de la reconnaissance de
l’intégrine basolatérale β1 par AfaD.
5.1.2 Les sucres et les molécules glycosylées
La surface des cellules est majoritairement recouverte de molécules glycosylées de
diverses natures et ces molécules représentent une cible de choix pour l’adhésion des
pathogènes. Citons l’exemple de l’adhésine FimH du fimbriae de type 1 qui reconnaît
et lie le mannose et les oligosaccharides de mannose via un mécanisme semblable
aux lectines (117). Le fimbriae de type I des UPEC lie l’uroplaquine Ia et Ib, deux
glycoprotéines des cellules urothéliales riches en mannose (29, 83). L’étude de
l’affinité de liaison entre FimH et l’oligomannose a démontré que l’affinité FimH -
récepteur varie en fonction des espèces bactériennes. De plus, l’analyse des variants
de l’adhésines FimH a démontré que le tropisme tissulaire et l’affinité entre FimH et
32
son récepteur sont dus à des variations dans la structure primaire de l’adhésine (7, 83,
157). Il a également été démontré que l’affinité FimH - récepteur est affectée par la
nature du filament à partir duquel l’adhésine FimH est présentée. De plus, l’analyse
de FimH chez les isolats d’E. coli commensaux a démontré que dans ceux-ci, FimH
possède une faible affinité pour les résidus de monomannose mais une forte affinité
pour les structures complexes de mannoses. Contrairement aux souches
commensales, les UPEC possèdent une forte affinité pour les deux types de cible, ce
qui pourrait expliquer en partie leur pouvoir pathogène (5, 156). D’autres E. coli
pathogènes utilisent un récepteur glycoprotéique précis pour contrôler leur tropisme
cellulaire, citons par exemple les adhésines Afa/Dr des DAEC. Les adhésines Afa/Dr
reconnaissent l’antigène Dr à la surface du DAF, une glycoprotéine qui n’est
retrouvée qu’à la surface des cellules hématopoïétiques, intestinales, urinaires et
endothéliales. La densité de DAF présente à la surface des cellules est dépendante du
type cellulaire et présente des caractéristiques de spécificité d’hôte. Ainsi, les souches
DAEC liant cette glycoprotéine via les adhésines Afa/Dr présentent un tropisme
cellulaire. Chez l’homme, les adhésines Afa/Dr de la bactérie permettent
l’attachement aux cellules intestinales (94, 121). Une accumulation importante de
DAF est observable in vitro sous la bactérie suite à son attachement à la cellule
intestinale. D’autres adhésines/invasines telle que l’hémagglutinine Dr et AfaE-III,
utilisent des glycoprotéines biliaires en tant que récepteurs (95). Plusieurs autres
adhésines d’E. coli utilisent des molécules glycosylées pour leur adhésion, citons par
exemple le pili P liant les Galα(1-4)Galβ globosides des glycolipides des cellules des
reins, le pili de type IV qui reconnaît le N-acetyl-lactosamine à la surface des cellules
de l’hôte et plus récemment les adhésines CFs pour lequel des études ont démontré
une interaction entre le CFA/I et les carbohydrates contenus dans les
glycosphingolipides non-acides ainsi que dans les glycoprotéines.
Les récepteurs CEACAM constituent une famille de protéines glycosylées retrouvés à
la surface des cellules, en particulier à l’intérieur des radeaux lipidiques, qui sont
impliqués dans les interactions cellule-cellule. Il a été démontré qu’une sous-
catégorie des fimbriae Afa-Dr, comprenant l’adhésine Dr, F1845 et AfaE-III, possède
la capacité d’interagir avec ces récepteurs. L’interaction entre une bactérie et les
33
CEACAM entraîne l’activation de CDC42 ce qui provoque une augmentation de la
concentration des CEACAM sous la bactérie adhérée et entraîne l’effacement des
microvillis (29). Il existe de nombreux autres exemples d’adhésines et d’invasines
utilisant des molécules glycosylées en tant que récepteurs mais nous nous limiterons
ici à ceux illustrés précédemment.
5.2 Autres récepteurs reconnus par les adhésines/invasines
5.2.1 Les radeaux lipidiques
Les radeaux lipidiques sont des micro-domaines enrichis en cholestérol et en
sphingolipides présents à la surface des cellules. Plusieurs études effectuées sur
l’invasion bactérienne ont noté la présence d’une accumulation importante de radeaux
lipidiques au point d’entrée de la bactérie. Ce phénomène pourrait suggérer une
implication des radeaux lipidiques lors du processus d’invasion. Plusieurs études ont
été effectuées afin de déterminer le rôle exact des radeaux lipidiques lors des
mécanismes d’adhésion et d’invasion bactérienne. Il semble que les radeaux
lipidiques jouent un rôle important lors de l’adhésion de diverses bactéries; dont les
EPEC, les DAEC et les shigelles. Cependant, jusqu’à présent, aucune étude n’a
caractérisé en profondeur les mécanismes d’invasion impliquant les radeaux
lipidiques et une certaine controverse quand à leur rôle exact lors de l’invasion
persiste (1, 29, 91).
5.2.2 Les lectines
Les lectines sont divisées en deux catégories selon leur fonctionnalité et leur structure
de liaison aux carbohydrates. Les lectines de type C sont dites dépendantes du
calcium et sont des protéines extracellulaires solubles ou ancrées dans la membrane.
Lors de l’adhésion bactérienne, l’interaction est effectuée entre la lectine de type C
multimérique et les complexes saccharidiques complémentaires à la surface de la
bactérie. La lectine de type S comprend de nombreuses protéines solubles qui sont
caractérisées par leur affinité avec le lactose ou autres β-galactoside. Elles sont
34
composées de deux sous-unités capables de lier les glucides. Ces sous-unités peuvent
servir de pont entre la bactérie et les carbohydrates de la cellule. Citons l’exemple de
l’attachement de Pneumocystis carinii et de S. aureus aux épithéliums ou aux
macrophages alvéolaires, respectivement, qui est effectué via les domaines lectines de
type C des collectines et les carbohydrates bactériens (133).
5.2.3 Les contre-récepteurs des intégrines
Les contre-récepteurs des intégrines comprennent les ICAM-1, les VCAM-1, la E-
selectine, CD36 et CD44. Certaines bactéries possèdent la capacité d’utiliser ces
protéines ancrées dans le cytosquelette comme récepteur direct tandis que d’autres
interagissent avec des protéines d’adhésion ou des polysaccharides sécrétés par l’hôte
avant de lier ces contre-récepteurs des intégrines. Citons l’exemple de Haemophilus
influenzae non typique qui adhère aux cellules épithéliales respiratoires via la liaison
aux ICAM-1 (133).
5.2.4 Les molécules sériques : les apolipoprotéines
Le sérum contient de nombreuses molécules diverses et variées dont les
apolipoprotéines (48, 152, 162). Les apolipoprotéines sont une famille de protéines
reliées entre elles par leur capacité à lier les lipides. Il existe une grande variété
d’apolipoprotéines dont les plus communes sont les apolipoprotéines A-I, A-IV, B, C,
D et E. La nomenclature sous forme d’alphabet des apolipoprotéines a été introduite
en 1982 par Alaupovic. Cette nomenclature désigne l’apolipoprotéine sous la forme
d’une lettre majuscule qui est suivit d’un chiffre romain représentant les différents
polypeptides de cette apolipoprotéine. Finalement, la présence de polymorphisme de
l’apolipoprotéine est indiquée par la présence d’un chiffre arabe accolé au chiffre
désignant le polypeptide. La désignation alphabétique des apolipoprotéines a été
attribuée selon l’ordre de leur découverte ainsi que selon le type de vésicules
lipidiques à l’intérieur desquels elles sont retrouvées (3).
Le rôle principal des apolipoprotéines consiste à transporter des lipides et des
diverses molécules hydrophobes dans le sang sous forme de vésicules lipoprotéique.
Ces vésicules sont divisées en 4 classes selon leur composition et leur densité :
35
chylomicrons, VLDL (Very Low Density Lipoproteins), LDL (Low Density
Lipoproteins) et HDL (High Density Lipoproteins). L’apolipoprotéine A-I présente
dans la circulation sanguine est associée à deux types de vésicules
lipoprotéiques spécifiques: les chylomicrons et les vésicules HDL. Parmi les 4 classes
de vésicules lipoprotéiques, les chylomicrons sont les particules les plus imposantes,
mesurant de 100-500 nm, mais possédant une faible densité. Ils sont composés
principalement de triacylglycérols (près de 90% du poids total) et leur contenu en
apolipoprotéines constituent environ 1% de leur composition. Les principales
apolipoprotéines sont l’apolipoprotéine A-I (20% du contenu protéique),
l’apolipoprotéine B-48 et l’apolipoprotéine A-IV. Les chylomicrons sont impliqués
lors du transport des lipides diététiques et de certaines vitamines insolubles dans
l’eau. Par conséquent, ce sont les particules les plus sécrétées dans la circulation
sanguine par l’intestin. Contrairement aux chylomicrons, les vésicules HDL
possèdent une densité élevée et sont les plus petites vésicules lipoprotéiques
(mesurant de 6 à 12.5 nm). Ces particules contiennent plusieurs apolipoprotéines :
l’apolipoprotéine A-I (majoritaire), A-II (deuxième en importance), A-IV, C-I, C-II,
C-III, D et E. Ces particules sont riches en phospholipides et sont impliquées dans le
transport du cholestérol et des cholestéryl ester. Ces deux molécules sont des
composé de la membrane plasmique et elles peuvent être utilisées dans le
métabolisme oxydatif, le métabolisme des sels biliaires et en tant que précurseur
d’hormones (48, 152, 162).
L’étude spécifique de l’apolipoprotéine A-I démontre que celle-ci est
commune à une grande variété d’espèces animales dont l’homme. La synthèse de
cette apolipoprotéine de 28.3 kDa est effectuée en trois étapes à l’intérieur du foie et
de l’intestin. L’apolipoprotéine A-I est initialement synthétisée sous la forme d’une
pré-pro-apolipoprotéine de 267 acides aminés comprenant une séquence signal dans
le domaine N-terminal. La coupure de 18 acides aminés dans la séquence signal
entraîne le relâchement de la pro-apolipoprotéine. La dernière étape de la synthèse
consiste en la modification de la pro-apolipoprotéine par une protéase qui permet le
relâchement de l’apolipoprotéine A-I mature. Suite à sa synthèse, l’apolipoprotéine
36
A-I est sécrétée dans le lumen de l’intestin ainsi que dans la circulation sanguine sous
forme de vésicules lipidiques (98, 162).
6.0 L’autotransporteur AIDA-I
AIDA-I a été découverte en 1989 chez la souche E. coli 2787 isolée d’un cas de
diarrhée infantile (12). Les auteurs de cette première étude transformèrent des E. coli
C600 avec des fragments d’ADN plasmidique provenant de la souche 2787 et
examinèrent la capacité des transformants à adhérer de manière diffuse. Ils définirent
ainsi la région responsable du phénotype d’adhérence diffuse comme un fragment de
6 kb provenant du plus grand des deux plasmides de la souche et baptisèrent la
protéine membranaire codée par ce fragment AIDA-I pour « Adhesin Involved in
Diffuse Adherence ». L’obtention par la suite de la séquence nucléotidique d’AIDA-I
montra que le fragment de 6 kb codait en réalité pour deux protéines de 45 kDa
(orfA) et de 132 kDa (orfB), qui furent identifiées comme étant la glycosyltransférase
désignée aah pour « adhesin aida heptosyltransferase » (14) et le précurseur de
AIDA-I (11, 13). L’heptosyltransférase Aah glycolyse AIDA-I en utilisant des
précurseurs provenant de la biosynthèse des lipopolysaccharides. La glycosylation est
une étape essentielle pour le phénotype d’adhésion et la conformation normale de
l’AT. Cependant, cette étape n’est pas requise pour les phénotypes d’autoaggregation
et de formation de biofilms.
L’AT AIDA-I est initialement synthétisé sous la forme d’une pré-pro-protéine
d’environ 132 KDa possédant une organisation modulaire (163). AIDA-I est modifié
post-transcriptionnellement par l’heptosyltransférase Aah via l’addition de résidus
heptoses sur une thréonine et sur 15 sérines. La région N-terminale de la pré-pro-
protéine corresponds à une séquence signal sec-dépendante de 49 acides aminés. Le
passage de la pré-pro-protéine à travers la membrane interne est possible grâce à cette
séquence signal qui dirige la pré-pro-protéine vers la machinerie de sécrétion Sec.
Après la traversée de la membrane interne, la séquence signal est coupée afin de
37
permettre le relâchement de la pro-protéine dans le périplasme. La pro-protéine est
ensuite insérée dans la membrane externe, présentée à la surface puis coupée
probablement par un mécanisme autocatalytique (21, 163). La protéine possède deux
domaines: le domaine α nommé AIDA-I mature (100 KDa) situé en N-terminal et
attaché de façon non-covalente à la surface de la bactérie ainsi que le domaine β
nommé AIDAc (45 KDa) situé en C-terminal et ancré à l’intérieur de la membrane
externe. Ce dernier formerait un pore dans la membrane externe qui pourrait servir de
conduit de translocation pour AIDA-I mature (21, 163) (Figure 6)
Figure 6. Représentation schématique de la translocalisation et de la
présentation de l’AT AIDA-I. Adapté de Rutherford et Mourez, 2006 (143).
38
6.1 Prévalence d’AIDA-I dans les souches d’E. coli pathogènes
Le développement d’une pathologie chez l’hôte peut être accompli par E. coli
exprimant AIDA-I à sa surface en combinaison avec d’autres facteurs de virulences
telles les toxines (135). L’analyse des nombreuses souches d’E. coli pathogènes
appartenant aux pathotypes DAEC, ETEC, EPEC et STEC a permis d’identifier
AIDA-I dans certaines de ces souches (12, 65, 118). L’observation d’une fréquence
plus élevée de la présence d’AIDA-I chez les isolats d’E. coli pathogènes provenant
du porc confirme l’existence d’un réservoir animal pour cette adhésine.
Une corrélation entre E. coli exprimant AIDA-I et le développement de la MO et de
la DPS a été démontrée chez le porc. Par exemple, une étude sur 104 souches isolées
de porcs montre une prévalence élevée de souches possédant AIDA-I (25%) et une
association significative entre la présence du gène intact d’AIDA-I et le
développement de MO-DPS. De même, des délétions dans le gène codant pour
AIDA-I sont associées avec l’absence de la diarrhée (118). Une autre étude sur 604
souches isolées de porcs malades montre que 7 d’entre elles possèdent AIDA-I (65).
Parmi les souches positives pour AIDA-I, 11% possèdent aussi des gènes codant pour
la toxine EAST1, 50% possèdent des gènes codant pour Stx et 40% des gènes pour le
fimbriae F18, ce qui montre qu’AIDA-I est souvent associée avec d’autres facteurs de
virulence (65). Certains pathotypes d’E. coli, comme AIDA-I :STb :EAST1 ou
AIDA-I :STb, ne se retrouvent que chez les porcs atteints de diarrhée (116). Plusieurs
études récentes ont démontré qu’un pourcentage significatif d’E. coli isolés du porc
possédaient AIDA-I. En effet, une étude réalisée par Ngeleka et al. au Canada en
2003 a démontré que 20.5% des porcs présentant une diarrhée possédaient les gènes
codant pour AIDA-I (116). Une autre étude par Zhang et al. en 2007 a démontré que
cette proportion était de 26.9% au Etats-Unis (185). Cependant, d’autres études
menées dans divers pays ont démontré que la prévalence d’AIDA-I n’était pas aussi
élevée. En 2009, une étude réalisée en Chine par Zhao et al. démontre que 6.5% des
isolats de E. coli des porcelets atteints de la MO ou de DPS possédaient le gène
39
AIDA-I (187). Le tableau II résume les principales études effectuées sur la prévalence
d’AIDA chez le porc atteint de diarrhée.
Chez les humains, la prévalence des DAEC et le rôle d’AIDA-I dans la pathogénèse
ne sont pas clairs. Dans une étude au Brésil sur 40 enfants atteints de diarrhée, 10%
des souches présentaient un phénotype d’adhérence diffuse mais aucune ne possédait
AIDA-I (145). Une autre étude en France sur 335 souches d’E. coli isolées de cas
sporadiques de diarrhée montrent que seulement 4% des souches possèdent AIDA-I
(78).
7.0 Étude sur AIDA-I
7.1 Étude sur le récepteur d’AIDA-I
La présence de l’AT AIDA-I en combinaison avec d’autres facteurs de virulence, en
particulier des toxines, dans les DAEC, EPEC et ETEC entraîne le développement de
deux maladies chez le porcelet : la MO et la DPS. Ces deux pathologies peuvent
entraîner de graves séquelles chez les animaux atteints. Il y a donc un intérêt du point
de vue de la santé de l’animal et économique du point de vue des producteurs à tenter
d’éliminer ou, à tout le moins, de diminuer la fréquence d’apparition de ces
pathologies. Puisque l’adhésion est considérée comme une étape primordiale lors de
l’établissement d’une infection, une méthode pouvant être envisagée serait
40
d’empêcher l’adhésion des bactéries pathogènes à l’intestin de l’animal. Pour ce faire,
il est nécessaire d’identifier le récepteur de l’adhésine AIDA-I. Deux études
indépendantes ont été menées afin d’isoler les récepteurs potentiels d’AIDA-I.
L’équipe Laarmann et Schmidt (90) a identifié une glycoprotéine de 119 kDa de la
membrane des cellules épithéliale tandis que l’équipe de Fang et al. (45) a isolé deux
protéines distinctes du mucus intestinal. La première protéine consiste en une
protéine nucléaire ou cytoplasmique de 120 kDa et la deuxième est une protéine de
nature inconnue de 65 kDa. Malheureusement, aucune de ces deux études n’a
effectué d’expériences avec les protéines purifiées afin de déterminer et caractériser
le niveau d’interaction entre AIDA-I et le récepteur potentiel. De plus, aucune étude
n’a été effectuée afin de caractériser l’importance de cette interaction lors des
processus d’adhésion, d’invasion, d’autoaggrégation et de formation de biofilms.
Des études précédentes ont démontré la capacité de nombreux pathogènes exprimant
des AT à utiliser des molécules contenues dans le sérum pour adhérer à la surface des
cellules épithéliales. Il est connu que le sérum contient de nombreuses molécules dont
les précurseurs de la matrice extracellulaire, des protéines, des sucres, des lipides, des
immunoglobulines, etc. Les pathogènes peuvent utiliser les molécules du sérum soit
comme récepteur direct à la surface cellulaire ou comme récepteur indirect, un «pont»
permettant de réduire l’espace séparant la bactérie de la cellule cible. Le présent
mémoire se concentre sur l’isolement, à partir du sérum porcin, de récepteur(s)
potentiel(s) pour l’AT AIDA-I.
7.2 Étude de l’invasion in vitro conférée par AIDA-I
Plusieurs membres des SAAT présents chez E. coli, dont TibA, confèrent le
phénotype d’invasion des cellules épithéliales en culture. Il a été démontré que l’AT
AIDA-I permettait l’adhésion, l’autoaggrégation et la formation de biofilm. Un
certain phénotype d’invasion est également observé en laboratoire chez les bactéries
exprimant AIDA-I. La capacité d’invasion et de survie à l’intérieur des cellules
épithéliales présente de nombreux avantages pour la bactérie : camouflage contre les
41
défenses de l’hôte, protection contre les agressions mécaniques et chimiques, capacité
à recréer rapidement l’infection et capacité à se créer un réservoir. L’étude présenté
en annexe de ce mémoire se concentre sur le phénotype d’invasion in vitro engendré
par les E. coli exprimant AIDA-I ainsi que sur l’avantage qui pourrait être retiré de ce
phénotype. La capacité d’AIDAI-I à engager l’invasion de cellules épithéliales en
culture sera étudiée ainsi que le rôle potentiel d’AIDA-I lors de la survie des bactéries
à l’intérieur de la cellule hôte.
42
MÉTHODOLOGIE ET RÉSULTATS
43
ARTICLE 1
The apolipoprotein A-I interacts with the adhesin involved in diffuse
adherence (AIDA-I) of Escherichia coli: involvement in the adhesion
and invasion process.
Mélissa René1, Victoria Girard1, Frédéric Berthiaume1, Mark Hancock2 and
Michaël Mourez1* 1Canada Reasearch Chaire on Bacterial Animal Diseases, Université de Montréal,
Faculté de Médecine Vétérinaire, St-Hyacinthe, 3200 Sicotte, St-Hyacinthe, Québec,
J2S 7C6 2Sheldon biotechnology center, McGill University, 3773 University Street, Montréal,
Québec, H3A 2B4
Running title: The apolipoprotein A-I interacts with the AIDA-I autotransporter.
Keywords: Autotransporter, AIDA-I, Escherichia coli, Bacterial adhesin, Adhesion,
Apolipoprotein A-I
*Corresponding author : Michaël Mourez, Université de Montréal, Faculté de
médecine vétérinaire, 3200 Sicotte, Saint-Hyacinthe, J2S 7C6, Quebec, Canada.
Phone : (450) 773 8521 ext 8430. Fax : (450) 778 8108.
Soumission à venir
44
ABSTRACT
In the present report, we isolated a potential receptor for the autotransporter AIDA-I
from porcine serum. An interaction between the porcine serum and AIDA-I was
shown by ELISA. We carried out porcine serum fractionation by ion exchange
chromatography followed by gel filtration as to isolate potential(s) receptor(s). The
presence of the potential(s) receptor(s) in the various fractions was monitored by
ELISA. We also used an affinity chromatography assay to isolate potential(s)
receptor(s) from whole or boiled porcine serum. Analyses of samples were conducted
by fingerprint mass spectrometry. Both techniques succeeded to isolate a potential
receptor from porcine serum: the apolipoprotein A-I. The interaction between
purified apolipoprotein A-I and AIDA-I was shown by ELISA. Further investigation
also showed a colocalization between adhered bacteria and apolipoprotein A-I on
Hep-2 cells.
INTRODUCTION
The Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA-I) is a bacterial adhesin
associated with certain pathogenic Escherichia coli strains. AIDA-I is a surface-
displayed autotransporter that belongs to the self-Associating Autotransporter
(SAAT) family because of its capacities to autoaggregate and form biofilms, in
addition to its adhesive function. The adhesion, as the initial step in infection, is
considered as an important step in the development of a disease. The adhesion of a
bacteria to epithelial cells can be mediated directly by binding proteins at the cell
surface or can be mediated by the use of an intermediate molecule acting as a bridge
to lessen the space separating the bacteria from its target cell.
Edema disease (ED) and post-weaning diarrhoea (PWD) are recurrent threats to the
swine industry and their frequent occurrence forces a major economical constraint
upon the industry. These diseases are caused by Escherichia coli and they principally
occur throughout the two weeks following weaning of the piglet. The OD is
45
principally cause by E. coli adhering to the small intestine by the fimbriae F18 and
expressing Shiga-toxin 2e (Stx2e) (73, 112, 172). The PWD is mainly cause by E.
coli adhering to the jejunum and ileum by diverse attaching factors (ex. F4, F18) and
expressing one or more enterotoxins (STa, STb, LT, EAST1) (36, 56, 65, 66, 68, 118,
160, 179). Several studies have established the prevalence of an assortment of
virulence factors in E. coli isolated from piglets affected by ED or PWD. One of
these virulence factor is the adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I) (12, 65,
118). In 2007, a study conducted in the United States by Zhang et al., demonstrated
that 26.9% of pig affected by PWD had genes coding for the AIDA-I adhesin (185).
Furthermore, several other studies have demonstrated various occurrence of the
AIDA-I gene in piglet with ED or PWD worldwide (12, 65, 68, 78, 116, 118, 145,
185, 187).
AIDA-I has been isolated in 1989 from the outer membrane of a Diffusely Adherent
Escherichia coli (DAEC) (12). Subsequently, it has been observed that AIDA-I, often
in association with the bacterial toxin STb, is an important virulence factor that
contributes to the development of severe diarrhea in piglet (135). Along with Ag43
and TibA, AIDA-I is an autotransporter (AT)ut from the Self-Associating
Autotransporters family (SAAT). The members of the SAAT family mediate various
virulence phenotypes such as adhesion, invasion, autoaggregation and biofilm
formation (84). Adhesion, as the initial step in infection, is thought to be important in
the development of a disease. In the past years, two independent studies have
investigated and identified potential receptors for AIDA-I. Laarmann and Schmidt
isolated and identified a glycoprotein of 119 kDa from epithelial cell membrane of
HeLa cells (90). Fang and al. isolated a nuclear or cytoplasmidic protein of 120 kDa
and a protein of unknown nature of 65 kDa from the intestinal mucus (45). However,
these two studies have not characterized the interaction between AIDA-I and the
purified receptor. Furthermore theses studies have not carefully investigated the
importance of the receptor/AIDA-I interaction during adhesion, invasion,
autoaggregation or biofilm formation process.
46
Pathogens can directly bind proteins to adhere to the cell surface or can use an
intermediate molecule as a bridge to lessen the space separating them from their
target cell. Previous works have demonstrated that a variety of pathogens expressing
AT can use extracellular matrix (ECM) proteins in order to adhere to epithelial cells
(40, 51, 62, 72, 81, 86, 111, 136, 146, 176, 184). Serum is known to contain a wide
range of molecules including extracellular matrix proteins precursors, proteins, sugar,
lipids, immunoglobulins, etc. Here, we have isolated and identified a receptor for the
AIDA-I AT into the porcine serum. We have isolated the apolipoprotein A-I from
porcine serum by two different ways namely affinity chromatography and serum
fractionation. We have shown that purified proteins interacted with AIDA-I by
ELISA and that the apolipoprotein A-I colocalized with bacteria adhered to epithelial
cells.
MATERIALS AND METHODS
Bacterial strains and plasmids. The Escherichia coli K12 strain C600 (thr-1, leuB6,
thi-1, lacY1, supE44, rfbD1, fhuA21; obtained from New England Biolabs) was used
in this study. Plasmid pTRC99a vector (Pharmacia Biotech) was used in bacteria as a
negative control. Plasmid pAg containing the whole aidA operon (aah and aidA)
under the control of ptrc, a promoter inducible with isopropyl-β-D-
thiogalactopyranoside (IPTG), has been described before (21). pAg allows the
expression of glycosylated AIDA-I. Plasmid pAgH, also previously described (21), is
derived from pAg and allows expression of glycosylated AIDA-I tagged at the N
terminus of the proprotein with six histidine amino acids and a glycine (HisG).
Plasmid pAngH, allowing the expression of the HisG-tagged AIDA-I, was obtained
by introducing an oligonucleotide coding for the HisG tag in the pAng plasmid by
site-directed mutagenesis using mutagenic primers, as described previously for pAg
(21). The plasmid pACYC-gfp was constructed as follow. The ptrc promoter region
was extracted from the pTRC99a vector (Pharmacia Biotech) using PvuII and BamHI
and then cloned upstream of the promoterless gfp gene in the pFPV25 vector (175) in
47
SmaI and BamHI restriction sites. The resulting vector was then digested with SspI
and HindIII and the fragment (containing the ptrc promoter and the gfp gene) was
cloned into the pACYC184 plasmid (Pharmacia Biotech) in the HincII and HindIII
restriction sites. The resulting plasmid is pACUC-gfp.
Surface Plasmon Resonance (SPR) analysis of AIDA-I/serum interaction.
Porcine serum (Invitrogen) was filtrated on a membrane of 0.22 µm to remove
potential contaminants, such as bacteria. Boiled porcine serum was obtained by
incubating porcine serum in boiling water during 10 minutes. The sample was
homogenised and centrifugated at 16000Xg during 10 minutes. The supernatant was
recovered and filtrated on the same membrane as used for porcine serum. Boiled or
porcine serum (1:500) was injected on the surface of a chip coupled with AIDA-I.
SPR measurements were carried out using a Biacore 3000 system. AIDA-I was
immobilized on a CM4 sensor chip using amine coupling conditions and experiments
were optimized with HBL-P running buffer using a low flow rate (10 µL/min) and
‘QUICKINJECT’ mode (3 – 5 min association). The serum pre-treatments were
boiling for 10 min at 100oC or separation according to molecular weight (Millipore
microcons YM10, YM30, YM100). Experiments were performed two times and the
data represented are typical binding curves.
Adhesion assay. The adhesion assay was adapted from the assay performed by Benz
and Schmidt, 1989 (12). Briefly, Hep-2 cells were grown to confluence in DMEM
without antibiotic. The E. coli strains C600 harboring pACUC-gfp in combinaison
with either the empty vector pTRC99a or pAg were grown overnight at 30oC in LB
medium containing chloramphenicol and ampicillin. The cells were incubated with
107 bacteria in culture media at 37oC for 3 hours. After extensive washing with PBS-
CM, cells were fixed in PFA 4% for 10 minutes and then sealed in gelvatol.
ELISA assay testing the interaction between AIDA-I and porcine serum or
extracellular matrix proteins. We investigated by competitive ELISA the
possibility of an interaction between AIDA-I proteins and purified common
48
molecules of the extracellular matrix, namely type III / IV / V collagen, type II and III
porcine mucin and human and bovine fibronectine. We also investigated by ELISA
the possibility of an interaction between purified AIDA-I proteins and porcine serum.
Porcine serum or extracellular matrix proteins were bound on 96-flat bottom wells
plates for 2 hours at 37°C followed by blocking of non-reacting site with a solution of
PBS-casein 0,3% for 2 hours at 37°C. For wells with competitor, 85 µl/well of
competitor was incubated for an hour prior to addition of AIDA-I. Solutions of
AIDA-I in PBS-casein 0.3% - tween-20 0.05% were added at a final concentration of
150 nM and incubated for an hour at 37°C. Rabbit anti-AIDA-I serum 1:15000
(kindly provided by Dr M. Ngeleka, University of Saskatchewan) and anti-rabbit
coupled to HRP 1:5 000 (Sigma) were pre-treated to eliminate the antibodies reacting
with the porcine serum. The antibody solution was used to detect the presence of
AIDA-I. A total of 100 µl of TMB was added to each well for 20 minutes and the
reaction was stopped by addition of 100 µl of 1% sulphuric acid. Plates were read at
450 nm. The concentrations of tested extracellular matrix proteins are as followed:
type III and V collagen (Sigma): 50 µg/well; type IV collagen (BD Bioscience): 2.5
µg/well; type II and III mucin (Sigma): 4 mg/well; fibronectin (Sigma): 50 µg/well.
To pursue the characterization of the interacting molecules, we boiled porcine serum
for 10 minutes and used the supernatant and assayed the sample for resulting binding.
The interaction between AIDA-I and apolipoprotein A-I was performed by ELISA
using purified human apolipoprotein A-I (Sigma). Apolipoprotein A-I at a
concentration of 50 µg/well was fixed on an ELISA microtiter plate. The interaction
between AIDA-I and apolipoprotein A-I was investigated in the presence and absence
of competitors (apolipoprotein A-I and boiled serum). The AIDA-I adhesin might be
able to interact with other apolipoproteins, especially the apolipoprotein C-III which
was isolated in combination with apolipoprotein A-I by porcine serum fractionation.
Other purified apolipoproteins, namely B, C-I, C-II, C-III and E2 (Sigma) were also
tested for their interaction with AIDA-I.
49
Affinity chromatography. AIDA-I proteins were coupled to UltraLink Biosupport
beads (PIERCE). The coupling followed the general coupling instructions provided
by manufacturer. Briefly, a solution of AIDA-I was added to the beads and allowed
coupling at room temperature for 2 hours. Following centrifugation and removal of
supernatant, a quench solution consisting of 3M ethanolamine hydrochloride (pH9)
was added for 2.5 hours. Subsequently, beads were centrifuged, washed in PBS and
resuspended in a solution of NaCl (1M) to remove nonspecifically attached proteins.
Following extensive wash, beads were place in a column. Porcine serum was applied
to a column containing bound AIDA-I (AIDA column) and to a negative control
column without bound AIDA-I (empty column). The flow was dictated by gravity.
Following flow-thru of the serum, extensive wash with PBS was performed and
elution was carried out with PBS- NaCl (1M) – Triton X-100 (1%). Fractions of 1 ml
were collected and assayed for their potential interaction with AIDA-I by ELISA.
Ion exchange chromatography. To isolate the interacting molecule(s), boiled
porcine serum was fractionated by ion exchange chromatography. Filtrated (0.22 µm)
boiled porcine serum was loaded on a Mono Q 10/100 GL (GE Healtcare). The
mobile phase consisted of Tris-HCL 20 mM (pH8) and the elution buffer was Tris-
HCl (20 mM) + NaCl (1M); flow rate was 2 ml/min. A first elution step at 15%
elution buffer was proceeded to eliminate proteins that are weakly binding to the
column. Following the first elution step, a gradient ranging from 15-30% elution
buffer was applied to the column. Fractions of 3 ml were collected and assayed for
their potential interaction with AIDA-I by ELISA.
Gel filtration. The fraction from ion exchange chromatography that presented the
higher interaction was then submitted to gel filtration to separate serum components.
Fraction #28 from ion exchange chromatography was concentrated on Amicon Ultra
3K (Millipore) from 3 ml to 1 ml. Concentrated fraction #28 was loaded on a
Superdex 75 xk16 column (GE Healtcare). The mobile phase consisted of Tris-HCL
20 mM (pH8). The flow rate for the gel filtration column was 0.7 ml/min and
50
fractions of 3 ml were collected. Resulting fractions were assayed for their interaction
potential with AIDA-I and then separated by gel electrophoresis.
Mass spectrometry. Fractions were concentrated on Amicon Ultra 30K and run on
PAGEr® Gold Precast Gel 4-20% Tris-Glycine gel (LONZA). The bands were cut
from gel and destained with water-sodium bicarbonate buffer and acetonitrile. The
proteins were reduced with dithiothreitol and alkylated with iodoacetamide prior to
in-gel digestion with trypsin or chymotrypsin. The tryptic peptides were eluted from
the gel with acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid. The tryptic peptides
were then separated on an Agilent Nanopump system using a C18 ZORBAX trap and
a SB-C18 ZORBAX 300 reversed-phase column (Agilent Technologies, Inc.) (150
mm by 75 µm; 3.5 µm particle size). All mass spectra were recorded on a hybrid
linear ion trap-triple quadrupole mass spectrometer (Q-Trap; AB
Applied Biosystems) equipped with a nanoelectrospray ionization source. The
accumulation of MS-MS data was performed with Analyst software, version 1.4 (AB
Applied Biosystems). MASCOT software (Matrix Science, London, United
Kingdom) was used to create peak lists from MS and MS-MS raw data.
Removal of bacterial lipopolysaccharides (LPS) in the AIDA-I solution.
Apolipoprotein A-I has been reported to bind to LPS (102, 108, 125). The solution of
purified AIDA-I contains a great amount of LPS. To determine whether the
interaction between the apolipoprotein A-I and AIDA-I is the result of a molecular
bridge mediated by the LPS, bacterial LPS was remove from the AIDA-I solution.
Solution of purified AIDA-I was loaded on a Detoxi-GelTM Endotoxin Removing Gel
(ThermoScientific). The removal of the LPS was performed as indicated by the
supplier. Quantification of LPS content was performed with Limulus Amebocyte
Lysate PYROCHROME® (Associates of CAPE COD Incorporated). The final LPS
concentration in AIDA-I solution is 0.1 ng/ml.
Colocalization assay. Following the adhesion assay of E. coli strains C600 pACUC-
gfp with either the empty vector pTRC99a or pAg on Hep-2 cells, the microscope
51
cover glass were blocked with PBS-CM containing 0.2% BSA. Anti-apolipoprotein
A-I (Santa Cruz Biotechnology; apoA-I (5F4F5):sc-101438) at a concentration of
1:500 and anti-mouse coupled to Alexa Fluor 568 (Molecular probe) at a
concentration of 1:500 were pre-incubated together to prevent subsequent extensive
wash and possible elimination of attached bacteria. The antibody solution was used to
detect the presence of apolipoprotein A-I. Following incubation with the antibody
solution, cells were washed in PBS-CM and sealed in gelvatol.
Confocal microscopy. Microscopy was performed on a confocal microscope at 60X
in Kalman mode. Excitation of GFP was performed with a 488 nm laser and
excitation of Alexa Fluor 568 was performed with a 543 nm laser. Emission was
observed at 515/15 for GFP and at 605/50 for Alexa Fluor 568.
RESULTS
AIDA-I does not bind to purified extracellular matrix molecules. The level of
interaction with AIDA-I for all tested purified extracellular matrix molecules was not
different than the one observed for the negative control (Figure 1).
AIDA-I binds to porcine serum molecules. The results of the ELISA assay on
porcine serum shown in figure 2 reveal an interaction between adhered porcine serum
molecules and AIDA-I. The molecules interacting with AIDA-I is heat-resistant and
seems to be enriched in the supernatant of boiled porcine serum. We then treated the
porcine serum by ultrafiltration with cut off of 30 kDa and 100 kDa. The analyses of
the results indicate that the molecule interacting with AIDA-I have a molecular
weight between 30 kDa and 100 kDa (data not shown).
Isolation of molecule(s) interacting with AIDA-I.
Ion exchange chromatography and gel filtration. Obtained fractions were tested by
ELISA for their interacting potential with AIDA-I. Three bands were obtained
(Figure 3) and analysed by fingerprint mass spectrometry. Two bands corresponded
52
to the pig apolipoprotein A-I (bands A and B) and the third band consisted of pig
apolipoprotein C-III (band C).
Affinity chromatography. The eluted fraction from both columns was separated by
SDS-PAGE and compared. Three bands present in the AIDA column fraction were
absent in the empty column fraction were analyzed by mass spectrometry (Figure 4).
The band A corresponded to IgM antibodies while the band C corresponded to a
trypsin precursor. The presence of antibodies and trypsin in high concentration into
porcine serum and the use of trypsin in the mass spectrometry analysis ruled out the
significance of these results. The band B corresponded to the pig apolipoprotein A-I
precursor.
Interaction between apolipoprotein A-I and AIDA-I. The isolation of
apolipoprotein A-I from porcine serum by various means indicate the existence of a
possible interaction between that protein and AIDA-I. An interaction was observed
between AIDA-I and purified apolipoprotein A-I (Figure 5). That interaction was
greatly diminished by the addition of competitors (boiled porcine serum or purified
solution of apolipoprotein A-I (0.5 mg/ml)).
A second ELISA assay on fixed apolipoprotein A-I was performed and as showed in
figure 6 the interaction between the apolipoprotein A-I and AIDA-I still occurs in
very-limited amount of LPS.
Purified AIDA-I interacts with apolipoprotein A-I and apolipoprotein B but not
with other apolipoproteins. Interaction of the apolipoprotein with purified AIDA-I
adhesin was observed for apolipoprotein A-I and B but not for any other
apolipoproteins (Figure 7).
Colocalization of bacteria expressing AIDA-I and the apolipoprotein A-I. Figure
8 shows a significant colocalization between the apolipoprotein A-I and GFP-
fluorescent bacteria expressing AIDA-I (AIDA-I +). Residual adhered GFP-
53
fluorescent bacteria without AIDA-I (AIDA-I -) do not colocalize specifically with
the apolipoprotein A-I.
DISCUSSION
Identification of receptor for a specific adhesin is a crucial step into the
comprehension of pathogenicity and in the elaboration of a potential therapy.
Previous studies have been conducted to identify the receptor for the AIDA-I adhesin.
Published reports by Laarmann and Schmidt (2003) and Fang et al. (2008) have
isolated different receptors from, respectively, cultured epithelial cell and porcine
intestinal mucus. A glycoprotein of 119 kDa was isolated from epithelial cell
membrane and experiences conducted on intestinal mucus isolated two proteins: a
nuclear or cytoplasmic protein of 120 kDa and a protein of unknown nature of 65
kDa (45, 90). However, these two studies did not characterized the interaction
between AIDA-I and the purified potential receptor molecule. Furthermore theses
studies haven’t carefully investigated the importance of the receptor/AIDA-I
interaction during adhesion, invasion, autoaggregation or biofilm formation
processes. The invasion process mediated by the AT AIDA-I haven’t been fully
characterized. Our laboratory has investigated the potential of the AIDA-I AT to
mediate invasion. The results are presented in annex 1. Previous works have
demonstrated that a variety of pathogens expressing AT can use extracellular matrix
proteins in order to adhere to epithelial cells. The AIDA-I protein was present in
several E. coli isolated from pigs with PWD or ED and as an AT. Thus AIDA-I might
be able to bind to molecules contained in porcine serum (62). Our laboratory
investigated if the AT AIDA-I utilized serum molecules as potential receptor. Serum
proteins can be used as a direct receptor for the adhesin or as a molecular bridge to
adhere to targeted cells. The apolipoprotein A-I was isolated by means of affinity
chromatography and serum fractionation. The interaction between the potential
receptor and the AIDA-I AT was confirmed by an ELISA assay performed with
purified human apolipoprotein A-I and by means of an colocalization assay during
the adhesion process of bacteria expressing AIDA-I adhered to cultured epithelial
cells. Apolipoproteins are blood proteins with various known properties. They are
54
found in lipoproteins vesicles of various size and density and many of them are
present in combination with other apolipoproteins.
The apolipoprotein A-I is common to many species including man kind. This
apolipoprotein is present in the blood and the small intestine. It is synthesised in both
the liver and the small intestine as a preproapolipoprotein of 267 amino acids. The N-
terminal domain of the preproapolipoprotein contains a signal sequence and the
cleavage of 18 amino acids form the proapolipoprotein which will be further
processed in the mature apolipoprotein A-I of 28.3 kDa by a protease (98, 162).
The possibility of an interaction between AIDA-I and the apolipoprotein A-I
can only be feasible in the intestinal lumen, where E. coli expressing AIDA-I can
mediate infection. The secretion of the apolipoprotein A-I into the lumen of the
intestine is essential for an interaction between these two proteins. It has been
reported that piglet cultured small intestinal segments were able to secrete
apolipoprotein A-I from their apical surface (32, 180). What are the factors that
regulate the secretion of the apolipoprotein A-I in the intestine? Dietary lipid
absorption seems to up regulate the synthesis and secretion of the apolipoprotein A-I
in the intestinal lumen. However, during the fasting of piglets, 90% of the
intracellular apolipoprotein A-I is not associated with dietary lipids. The absence of
implication of the apolipoprotein A-I in the transport and/or absorption of dietary fats
raises an important question: what is the role of the apolipoprotein A-I in the
intestinal lumen? Unfortunately, no studies were performed to elucidate this question
and little is known on the presence and role of intestinal apically secreted
apolipoprotein A-I.
It is surprising to notice the presence of the apolipoprotein A-I in the final
fraction obtained after porcine serum fractionation since its molecular weight (28.3
kDa) is smaller than the filter used to concentrate the fraction (30 kDa filter).
Logically, the vast majority of the apolipoprotein A-I should have been found in the
filtrate. However, in regard to the origin of the sample, it is consistent that the
apolipoprotein A-I wouldn’t be discarded in the filtrate after concentration of the
55
sample since serum apolipoprotein A-I is found in High Density Lipoprotein (HDL)
vesicles in association with other apolipoproteins, phospholipids and cholesterol.
HDL molecules are 6 to 12.5 nm in diameter so they locate in the supernatant of the
concentrated fraction. A surprising data is that the apolipoprotein C-III isolated by
serum fractionation doesn’t interact with AIDA-I by ELISA. Since, the
apolipoprotein C-III is found in HDL together with apolipoprotein A-I it is most
likely that its presence in the interacting fraction resulted from its common location in
the HDL vesicle.
Many interactions between pathogens and apolipoproteins have been
described and these interactions can either be useful for the pathogen or for the host.
Bacteria might use the interaction with an apolipoprotein to improve its pathogenesis
as with the serum opacity factor (SOF) of group A Streptococcus. The SOF interacts
with apolipoproteins A-I and A-II contained in HDL vesicles, disrupt their structure
which might diminish their anti-inflammatory action contributing at the establishment
of pathogenesis (26, 61, 67, 140). An other example consists of hepatitis C virus
interaction with the apolipoprotein E. It has been established that infectious virions
specifically interact with the apolipoprotein E thus improving their ability to infect
and produce virus in host cells (10, 19, 76, 87).
The interaction of an apolipoprotein with bacteria can also be useful for the
host. During Staphylococcus aureus infection, the apolipoproteins B confers an
important protection role for the host. The apolipoprotein B contained in LDL and
VLDL interferes with the quorum sensing agr system thus blocking the activation of
the invasive genes of S. aureus (115, 131). Finally, it is interesting to mention that
reports established that the apolipoprotein A-I has an inhibitory effect in vitro on E.
coli growth (186).
CONCLUSION
The AT AIDA-I interacts with the host-protein apolipoprotein A-I. Further
characterization of the interaction by the identification of the AIDA-I residues
56
interacting with the apolipoprotein A-I will be necessary. Future works will also
focus on the purpose of this interaction i.e. whether useful for the bacteria during the
infection process or if the interaction is the result of the host immune system
response. As an example, an adhesion assay comprising the efficacy of the adhesion
of bacteria expressing AIDA-I pre-incubated or not with apolipoprotein A-I could be
performed.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by financial contributions from the Groupe de
Recherche et d’Etudes sur les Maladies Infectieuses du Porc (GREMIP), the Natural
Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC discovery grant
262746) and the Canada Research Chair program.
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xi
TIIIc TIVc TVc TIIm TIIIm Hf Bf Bs C0.0
0.5
1.0
1.5
AIDA-I [150 nM]
OD
450n
m
Figure 1. : Interaction between purified AIDA-I and extracellular matrix proteins. Tested compounds were bound on 96-flat bottom wells plates and interaction between fixed proteins with a solution of AIDA-I (150 nM) was assayed by ELISA. Boiled porcine serum (Bs) is use as a positive control and casein blocked wells as a negative control (C). The results represent the interaction between AIDA-I and extracellular matrix proteins or boiled porcine serum. Tested extracellular matrix proteins: Type III collagen (TIIIc); Type IV collagen (TIVc); Type V collagen (TVc); Type II mucin (TIIm); type III mucin (TIIIm); Human fibronectine (Hf) and Bovine fibronectine (Bf).
64
65
Figure 2. : Interaction between AIDA-I and porcine serum. Porcine serum was bound on 96-flat bottom wells plates and interaction with solutions of AIDA-I ranging from 1 nM to 1 M was assayed by ELISA. Casein blocked wells were use as a negative control. The results show AIDA-I binding to components of porcine serum (squares) and a control showing the binding of AIDA-I to casein (triangle).
66
Figure 3. Bands obtained after serum fractionation on ion exchange chromatography followed by gel filtration. Fractions obtained by fractionation of the porcine serum on an ion exchange chromatography (mono Q) followed by gel filtration (Superdex) were tested for their interaction with purified AIDA-I by ELISA. The fraction presenting the highest interaction with AIDA-I was concentrated on Amicon Ultra 30K and run on PAGEr® Gold Precast Gel 4-20% Tris-Glycine gel (LONZA). Three bands (A; B; C) were obtained and analysed by mass spectrometry. The concentrated fraction is indicated by F.
1 2
75
50
10
MW kDa
B
C
A
67
Figure 4. Bands obtained after affinity chromatography on porcine serum with the AIDA column and the empty column. Fractions obtained by affinity chromatography on the porcine serum on AIDA column (column 2) and on the empty column (column 3) were run on PAGEr® Gold Precast Gel 4-20% Tris-Glycine gel (LONZA). Four bands (D; E; F;G) were obtained differentially in the AIDA column by comparison with the empty column and analysed by mass spectrometry.
1 2 3
75
50
10
MW kDa
D
F
G
E
68
N BsAA-I N
AA-I N BsAA-I
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
AA-I Bs CCoatingCompetitor
AIDA-I [150 nM]
OD
450n
m
Figure 5. : Interaction between purified apolipoprotein A-I and AIDA-I. Apolipoprotein A-I (AA-I) was bind on 96-flat bottom wells plates and interaction between fixed apolipoprotein A-I and a solution of 150 nM of AIDA-I was assayed by ELISA. Competition assay with AA-I, boiled serum (Bs) or no competitor (N) was also performed. Bs is use as a positive interaction and casein blocked wells as a negative control (C). The results represent the interaction between AIDA-I and apolipoprotein A-I and boiled porcine serum.
69
AA-I Bs C0.0
0.5
1.0
1.5
AIDA-I [150 nM]
OD
450n
m
Figure 6. : Interaction between apolipoprotein A-I and AIDA-I. Apolipoprotein A-I (AA-I) was bound on a 96-flat bottom well plates and interaction between fixed apolipoprotein A-I and a solution of 150 nM of AIDA-I free of LPS was assayed by ELISA. Boiled porcine serum (Bs) is used as a positive control and casein blocked wells as a negative control (C). The results show the interaction between AIDA-I and apolipoprotein A-I and boiled porcine serum.
70
AA-I ABAC-I
AC-IIAC-III AE2 Bs C
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
AIDA-I [150 nM]
OD
450n
m
Figure 7. : Interaction between purified apolipoproteins and AIDA-I. Apolipoproteins were bound on 96-flat bottom well plates and interaction between fixed apolipoproteins and a solution of 150 nM of AIDA-I was assayed by ELISA. Bs is used as a positive control and casein blocked wells as a negative control (C). The results show the interaction between AIDA-I and apolipoprotein A-I and boiled porcine serum. Tested apolipoproteins are: Apolipoprotein A-I (AA-I); Apolipoprotein B (AB); Apolipoprotein CI (AC-I); Apolipoprotein C-II (AC-II); Apolipoprotein C-III (AC-III) et Apolipoprotein E2 (AE2).
71
Figure 8. : Colocalization of bacteria expressing AIDA-I and the apolipoprotein A-I on Hep-2 cultured epithelial cell using confocal microscopy. Adhesion of E. coli strains expressing the green fluorescent protein (GFP) with AIDA-I (AIDA +) or without AIDA-I (AIDA-I -) on Hep-2 cultured cell line. Detection of the apolipoprotein A-I (AA-I) was performed with antibodies against apolipoprotein A-I and α-mouse monoclonal secondary antibody coupled to Alexa Fluor 568. The antibody solution was used to detect the presence of apolipoprotein A-I.
Merge Merge Merge
GFP GFP GFP
AIDA-I + AIDA-I - Hep-2 cells
AA-I AA-I AA-I
Bright Field Bright Field Bright Field
72
DISCUSSION
73
Notre étude portant sur la recherche du récepteur de l’autotransporteur AIDA-I
d’E. coli nous a permis d’éliminer l’hypothèse selon laquelle certaines molécules de la
matrice extracellulaire telles que le collagène de type III, IV, V et la fibronectine
servirait de récepteur à AIDA-I. La recherche de récepteurs effectuée à partir de la
mucine gastrique de type II et III ainsi que dans des prélèvements de lumen intestinal
porcin n’a également pas permis d’isoler et d’identifier un récepteur potentiel.
Cependant, la recherche à partir du sérum porcin nous a permis d’isoler et d’identifier
une protéine, l’apolipoprotéine A-I, en tant que récepteur potentiel. En effet, deux
méthodes distinctes nous ont permis d’identifier l’apolipoprotéine A-I comme récepteur
potentiel pour AIDA-I. L’apolipoprotéine A-I a été isolée du sérum porcin par
chromatographie d’affinité utilisant une colonne formée de billes sur lesquelles AIDA-I
était couplé de façon covalente et par le fractionnement du sérum via une
chromatographie échangeuse d’ions suivie du fractionnement sur une colonne de
filtration moléculaire. L’interaction spécifique entre AIDA-I et l’apolipoprotéine A-I
humaine purifiée a été démontrée par ELISA. La présence de l’interaction a également
été établie grâce à la microscopie en fluorescence par la visualisation de la présence
d’apolipoprotéine A-I lors du phénotype d’adhésion d’E. coli exprimant AIDA-I sur
cellules Hep-2 en culture. Cependant, l’analyse de l’interaction AIDA-I –
apolipoprotéine A-I requiert l’acquisition préalable de notions de base sur les
apolipoprotéines.
La MO et la DPS sont deux maladies principalement engendrées par la présence d’E.
coli pathogènes dans le lumen intestinal des porcelets. Certaines souches d’E. coli
isolées des porcelets affectés par ces deux maladies ont démontré la présence de
l’adhésine AIDA-I. L’AT AIDA-I confère plusieurs fonctions aux bactéries l’exprimant
dont la capacité d’invasion des cellules hôte. Cependant, la capacité d’invasion
engendrée par AIDA-I est peu caractérisée et encore mal comprise. La recherche d’un
récepteur pour AIDA-I nécessite une bonne compréhension de cette adhésine et de ces
fonctions. Nous avons donc étudié la fonction d’invasion engendrée par AIDA-I (annexe
1). Notre étude de l’invasion in vitro d’E. coli exprimant AIDA-I nous as permis de
74
déduire que l’AT AIDA-I permet l’invasion des cellules épithéliales Hep-2 en culture.
Cependant, l’unique présence d’AIDA-I ne permet pas la survie de la bactérie à
l’intérieur de la cellule. Par contre, la cinétique d’invasion effectuée avec la souche
sauvage 2787 a démontré que cette dernière possédait la capacité de survivre à
l’intérieur des cellules-hôtes. Face à ces résultats, il est logique d’assumer que la souche
sauvage possède un ou plusieurs facteurs de virulence lui permettant de survivre dans la
cellule. Cependant, l’étude présente ne permet pas de discerner si la survie des bactéries
2787 observée est le résultat de la survie de la majorité ou d’une sous-population
possédant la capacité de se multiplier à l’intérieur de la cellule. Afin d’éclaircir ce point,
des expériences de microscopie électronique permettant de visualiser les bactéries à
l’intérieur de la cellule pourraient être effectuées. Des marqueurs différentiels pour les
bactéries vivantes/mortes pourraient également êtres utilisées lors de visualisation en
microscopie de fluorescence. La microscopie possède également l’avantage de localiser
les bactéries à l’intérieur de la cellule. Il serait également intéressant de comparer les
génomes de la souche sauvage avec d’autres génomes de bactéries qui ont des capacités
d’invasion, i.e. EIEC, Shigella, Listeria, etc., afin de déterminer si certains gènes codent
pour des facteurs de virulence impliqués dans la survie intracellulaire sont présents chez
la souche pathogénique E. coli 2787.
Notre étude sur la recherche d’un récepteur de l’adhésine AIDA-I a établi que
cette dernière possédait la capacité d’interagir avec l’apolipoprotéine A-I, une protéine
sanguine soluble. La possibilité d’une interaction entre AIDA-I et l’apolipoprotéine A-I
ne peut avoir lieu que dans l’intestin, là où les E. coli exprimant AIDA-I sont présentes.
Il est donc essentiel que l’apolipoprotéine A-I soit sécrétée dans le lumen intestinal ou
présente à la surface des entérocytes afin qu’une telle interaction puisse avoir lieu.
L’apolipoprotéine A-I est-elle sécrétée dans le lumen de l’intestin?
Il a été démontré que des segments de petit intestin prélevé chez des porcelets et
mis en culture possèdent la capacité de sécréter l’apolipoprotéine A-I à partir de leur
surface apicale. En effet, l’étude de Poulsen et al. (1993) a démontré la présence
d’apolipoprotéine A-I dans le milieu de culture apical grâce à des expériences utilisant
les techniques d’immunobuvadarge et d’immunoprécipitation (32). Une autre étude
75
effectuée sur la lignée cellulaire intestinale Caco-2 a démontré par ELISA que cette
lignée possédait la capacité de sécréter l’apolipoprotéine A-I dans le milieu de culture à
partir de sa surface apicale (180). L’apolipoprotéine A-I est donc sécrétée dans le lumen
de l’intestin. Afin de mieux comprendre le métabolisme dans lesquel l’apolipoprotéine
A-I est impliquée, il est intéressant d’étudier les facteurs régulant sa sécrétion. Quels
sont donc les facteurs qui régulent la sécrétion de l’apolipoprotéine A-I? Il semble que
l’absorption de lipides diététiques augmente considérablement la synthèse ainsi que la
sécrétion de l’apolipoprotéine A–I. En effet, une étude a démontré que des segments
d’intestin prélevés chez le porc 3 heures après l’ingestion de lipides diététiques
produisaient l’apolipoprotéine A-I en grande quantité. L’étude de Poulsen et al. (1993) a
également démontré par pulse-chase qu’environ 85% de l’apolipoprotéine A-I
nouvellement synthétisée est sécrétée dans le lumen du petit intestin où elle est retrouvée
non-associée à des lipides diététiques. Cette dernière observation est surprenante
puisqu’il est connu que les apolipoprotéines sont impliquées dans le transport des lipides
dans le sang (32, 180). L’augmentation de la sécrétion de l’apolipoprotéine A-I dans
l’intestin lors de l’absorption de lipides diététiques aurait pu indiquer une implication de
cette protéine dans le transport et/ou l’absorption des lipides diététiques, mais cela ne
semble pas être le cas. L’absence de l’implication de l’apolipoprotéine A-I lors de ces
phénomènes soulève une question importante : quel est alors le rôle de la sécrétion de
l’apolipoprotéine A-I dans le lumen intestinal? Malheureusement, aucune étude
complémentaire n’a été effectuée afin de déterminer le rôle joué par l’apolipoprotéine A-
I à l’intérieur de l’intestin. De plus, les connaissances actuelles sur l’apolipoprotéine A-I
ne permettent pas d’obtenir un consensus quand à la nature de son récepteur ce qui
limite l’élaboration d’hypothèses en ce qui a trait à son rôle à l’intérieur de l’intestin.
Contrairement à l’apolipoprotéine A-I dans le lumen intestinal, suite à l’absorption des
lipides par les entérocytes, l’apolipoprotéine A-I intracellulaire colocalise avec la surface
des chylomicrons retrouvés dans le Golgi et avec la membrane basolatérale. D’autres
études ayant examinées la localisation de l’apolipoprotéine A-I à l’intérieur des cellules
intestinales ont démontrés que l’apolipoprotéine A-I intestinale est présente dans le
système de sécrétion intracellulaire et qu’elle se colocalise avec les microvillis, la
membrane des vésicules lisses apicales et la région du trans-Golgi. La localisation de
76
l’apolipoprotéine A-I à l’intérieur des entérocytes correspond à son implication dans la
formation des vésicules lipoprotéiques (32, 180). Cependant, le rôle de l’apolipoprotéine
A-I lors de l’absorption des lipides diététiques n’est pas défini.
La présence d’apolipoprotéine A-I sécrétée dans le lumen intestinal rend
plausible l’interaction apolipoprotéine A-I - AIDA-I. Il est donc intéressant de se
pencher sur les avantages qui pourraient être retirés par une telle interaction. Il semble
vraisemblable que la forte quantité d’apolipoprotéine A-I présente dans l’intestin lors de
la prise du lait maternel et surtout immédiatement après le début du sevrage puisse être
un facteur permettant aux E. coli exprimant AIDA-I en combinaison avec d’autres
facteurs de virulence d’engager la pathogenèse. En effet, les porcelets affectés par la
DPS et l’MO développent généralement la maladie lors des deux premières semaines
suivant le sevrage. Tout au long de cette fenêtre de temps, la concentration de
l’apolipoprotéine A-I à l’intérieur de l’intestin est élevée, augmentant de ce fait les
possibilités d’interaction entre les deux protéines. De plus, l’apolipoprotéine A-I est
sécrétée dans le lumen de l’intestin où elle demeure libre et non-associée aux lipides ce
qui augmente le nombre de sites potentiels libres pour l’interaction avec AIDA-I.
Quelles sont les hypothèses envisageables qui permettraient d’expliquer et de
comprendre le rôle de l’interaction entre ces deux protéines? Le recrutement de
l’apolipoprotéine A-I par AIDA-I pourrait être un moyen utilisé par la bactérie afin de
favoriser l’établissement du processus d’infection soit en lui permettant de dissimiler sa
présence grâce au recouvrement de la bactérie par des protéines de l’hôte ou bien en
améliorant la capacité d’adhésion, d’invasion, de formation du biofilm ou
d’autoaggrégation de la bactérie. Des observations préalables ont décrit la capacité de
divers pathogènes à utiliser des apolipoprotéines spécifiques afin d’améliorer leur
pathogénicité.
Une bactérie peut utiliser certains de ses facteurs de virulence afin de favoriser sa
pathogenèse; citons l’exemple du facteur d’opacification du sérum (serum opacity
factor, SOF) des streptococoques du groupe A. Une étude a démontré, grâce à une
expérience mesurant l’opacification d’échantillon de sérum contenant des vésicules
HDL, LDL ou VLDL, que le SOF perturbe la structure des vésicules HDL. Une
77
opacification du sérum a été observée uniquement dans le sérum contenant des vésicules
HDL. La diminution colossale du niveau d’opacification du sérum lors d’une expérience
complémentaire effectuée avec un sérum de souris inactivées pour la production
d’apolipoprotéine A-I (possédant donc un niveau très réduit de vésicules HDL)
démontre que la réaction d’opacification du sérum est effectuée via l’interaction du SOF
avec les vésicules HDL. Finalement l’interaction du SOF avec les apolipoprotéines a été
démontrée par une expérience mesurant l’interaction entre des billes recouvertes avec
l’une des deux apolipoprotéines majeures des HDL, l’apolipoprotéine A-I et A-II, et le
SOF. Il a ainsi été démontré que le SOF possède la capacité d’interagir avec les
apolipoprotéines A-I et A-II. L’interaction du SOF avec les apolipoprotéines des
vésicules HDL perturbe la structure des HDL ce qui pourrait diminuer leur action anti-
inflammatoire contribuant ainsi à l’établissement de la pathogenèse des streptocoques
(26, 61, 67, 140).
D’autres études ont fait état de l’amélioration de la capacité d’un pathogène à
créer une infection grâce à son interaction avec une apolipoprotéine. Par exemple, une
étude effectuée sur le virus de l’hépatite C (VHC) a démontré que les virions infectieux
possédaient la capacité de lier l’apolipoprotéine E et que cette liaison leur permettait
d’augmenter leur aptitude à infecter les cellules-hôte et à y promouvoir la production de
virus. Chez le VHC, un nombre important d’évidences démontrent que les virions
infectieux sont contenus dans les particules LVP (lipo-viro-particles) de densité variable
pouvant être séparées sur gradient de sucrose. Des études portant sur les LVP ont
démontré par immunobuvardage et immunoprécipitation que les particules de faible
densité contiennent des virions infectieux ainsi que l’apolipoprotéine E. Des études
complémentaires ont illustré la capacité d’anticorps α-apolipoprotéine E à neutraliser
l’infectivité des particules du virus de l’hépatite C. De plus, il a été établi que
l’inactivation du gène de l’apolipoprotéine E supprime l’assemblage des virions du virus
de l’hépatite C. Ces phénomènes suggèrent un rôle primordial de l’apolipoprotéine E
dans le processus d’infection par les particules LPV. Une étude récente a établi, par
double-hybride et co-immunoprécipitation, que l’apolipoprotéine E interagit avec la
protéine NS5A (nonstructural protein 5A; NS5A) du virus de l’hépatite C favorisant la
production et l’assemblage des virions. Il a été démontré que les virions du virus de
78
l’hépatite C et l’apolipoprotéine E se lient au récepteur des LDL (LDL-R). La variation
du génotype de l’apolipoprotéine E entraine des modifications dans la capacité à lier le
LDL-R ainsi que des modifications dans le cours des infections à l’hépatite C. Il est
donc logique de formuler une hypothèse selon laquelle l’apolipoprotéine E, ainsi que son
génotype, aurais un effet direct sur la pathogénicité du virus de l’hépatite C (10, 19, 76,
87). Cependant, il est à noter que plus d’un récepteur peut être à l’origine de la capacité
du virus de l’hépatite C à infecter les cellules. Il est donc difficile de s’assurer que seule
la liaison de l’apolipoprotéine E au LDL-R est impliqué lors de l’infection au virus de
l’hépatite C.
La capacité d’un pathogène à créer une infection est également largement
influencée par les différents génotypes d’apolipoprotéines présents chez les divers hôtes
d’une même espèce. En effet, citons l’exemple de la relation qui existe entre la présence
d’une allèle de l’apolipoprotéine E, nommé epsilon4 (apolipoprotéine E4) et la
pathogenèse de Chlamydophila pneumoniae. Cette étude a décrit l’effet des variants du
génotype de l’apolipoprotéine sur la capacité d’adhérence des corps élémentaires de C.
pneumoniae sur des cellules du cerveau. Il a été établi que la présence de
l’apolipoprotéine E4 permet d’améliorer significativement d’adhérence des corps
élémentaires de cette bactérie aux cellules (59).
Dans certains cas, l’interaction de l’apolipoprotéine avec un pathogène est
utilisée par l’organisme infecté comme un moyen de défense. Staphylococcus aureus est
un pathogène possédant la capacité de coloniser et d’envahir l’organisme qu’il infecte.
La régulation du passage de l’état d’adhésion et de colonisation à l’état d’invasion est
effectuée par son système de quorum-sensing Agr. L’opéron agr est présent chez la
majorité des isolats cliniques de S. aureus. Ce groupe de gène codent pour le système de
quorum-sensing qui est régulé par les promoteurs P2 et P3 dont le premier code pour
l’AIP (autoinducing cyclic thiolactone peptide) ainsi qu’un régulateur à deux
composantes tandis que le deuxième génère, en réponse à l’AIP, le transcrit ARNIII qui
constitue l’effecteur de l’opéron. Il a été démontré par résonance plasmonique de surface
(surface plasmon resonance, SPR) que l’apolipoprotéine B contenue dans les vésicules
LDL et VLDL possède la capacité de lier l’AIP. La liaison de l’AIP par
l’apolipoprotéine B empêche la transcription de l’opéron agr empêchant de ce fait le
79
passage en mode d’invasion. En effet, il a été démontré par RT-PCR quantitatif que la
présence de vésicules VLDL et LDL empêchait la signalisation du système agr. De plus,
le traitement des vésicules VLDL ou de l’apolipoprotéine B par des anticorps α-
apolipoprotéine B restaurait la capacité de l’AIP à se lier et à induire la production du
transcrit ARNIII de l’opéron agr (115, 131).
Finalement, il est intéressant de mentionner les effets importants engendrés par
l’action de l’apolipoprotéine A-I répertoriées par diverses études sur cette protéine.
Notons tout d’abord qu’une étude effectuée par Khovidhunkit et al a démontré que
l’incubation d’apolipoprotéine A-I purifiée d’origine humaine en présence d’E. coli
diminue sa croissance in vitro (186). D’autres études ont démontrées que l’utilisation de
peptides mimétiques de l’apolipoprotéine A-I pouvait améliorer la survie de rats
subissant une septicémie ou un choc toxique puisque ces peptides auraient la capacité de
promouvoir la formation de vésicules de type HDL. Il est connu que les vésicules HDL
et l’apolipoprotéine A-I possèdent la capacité de lier le lipopolysaccharide ce qui permet
de neutraliser l’activité toxique du lipopolysaccharide augmentant de ce fait même le
taux de survie lors d’une septicémie (23, 186). De plus, depuis quelques années, une
attention particulière a été portée à l’utilisation de l’apolipoprotéine A-I ainsi qu’aux
peptides mimétiques de l’apolipoprotéine A-I en tant que molécule thérapeutique. En
effet, plusieurs études passées et présentes ont évalué la capacité d’administrer ces
protéines pour le traitement de diverses maladies (178). Par exemple, une étude
effectuée en 2002 a démontré que l’administration orale d’un peptide synthétique
mimant l’apolipoprotéine A-I permettait de réduire dramatiquement l’athériosclérose
chez la souris via un mécanisme impliquant le transport inversé du cholestérol ainsi que
le retrait des molécules requises pour l’oxydation des LDL. Il est connu que l’oxydation
des LDL peut entraîner l’inflammation des artères et augmenter les risques
d’athérosclérose (114). Il est donc avantageux de tenter de développer une thérapie
utilisant les bienfaits de l’apolipoprotéine A-I afin de traiter certaines maladies d’origine
bactérienne tout en permettant de gagner un bénéfice supplémentaire grâce aux
nombreux bienfaits attribués à l’apolipoprotéine A-I. Actuellement, de nombreuses
80
recherches sont en cours afin de développer divers traitements utilisant l’apolipoprotéine
A-I (69, 79, 102, 114, 124, 164, 178, 186).
Plusieurs hypothèses peuvent être envisagées afin d’identifier l’avantage de
l’interaction entre la protéine AIDA-I et l’apolipoprotéine A-I. L’interaction entre
l’apolipoprotéine A-I et AIDA-I doit être caractérisée en détail afin d’obtenir un aperçu
de l’avantage conféré par cette association. Cependant, comment pourrions nous définir
spécifiquement l’interaction entre AIDA-I et l’apolipoprotéine A-I? L’étude de
l’interaction au niveau strictement protéique ainsi qu’au niveau de l’ensemble de la
pathogenèse pourrait nous renseigner sur le dessein d’une telle interaction. Au niveau
strictement protéique, il serait intéressant de déterminer les résidus impliqués lors de la
liaison AIDA-I - apolipoprotéine A-I afin de mieux comprendre et visualiser
l’association entre les deux protéines. L’identification du motif ainsi que des résidus
importants pour l’interaction entre les deux protéines pourrait permettre d’identifier
d’autres récepteurs potentiels. Au niveau de la pathogenèse, l’étude des conséquences
engendrées par l’interaction permettrait de répondre à la question primordiale suivante :
l’interaction AIDA-I – apolipoprotéine A-I est-elle bénéfique pour la bactérie ou pour
l’hôte infecté? Il a été préalablement exposé que certains pathogènes possèdent la
capacité d’utiliser diverses apolipoprotéines afin de leur permettre soit d’échapper au
système immunitaire de l’hôte soit d’augmenter leur niveau de pathogénicité. Il a été
également avancé que l’hôte possède la capacité de promouvoir l’interaction entre une
apolipoprotéine et un pathogène afin de se protéger contre l’infection par ce dernier.
L’étude de l’implication de cette interaction lors des phénomènes d’adhésion et/ou
d’invasion de la bactérie sur les cellules-hôtes permettrait d’apporter quelques réponses.
En effet, l’étude de l’adhésion bactérienne sur des lignées cellulaires épithéliales en
présence et en absence d’apolipoprotéine A-I permettrait de déterminer si l’interaction
avec l’apolipoprotéine A-I permet d’augmenter ou de diminuer la pathogenèse grâce à
l’observation d’une variation au niveau des phénotypes d’adhésion et/ou d’invasion de la
bactérie. De plus, l’étude de la capacité des macrophages à reconnaître et à absorber les
E. coli présentant AIDA-I lié ou non à l’apolipoprotéine A-I ainsi que l’analyse de la
sécrétion des cytokines par les macrophages pourrait faire, en partie, la lumière sur
81
l’implication de cette interaction au niveau du système immunitaire inné. Finalement, si
l’interaction est bénéfique pour l’hôte infecté, il serait intéressant de déterminer le
mécanisme exact par lequel l’apolipoprotéine A-I reconnaît le pathogène et quel est le
bénéfice retiré de cette interaction par l’hôte.
82
CONCLUSION
83
L’objectif général du projet de recherche consistait à approfondir les
connaissances sur l’AT AIDA-I, plus particulièrement à ce qui a trait à son implication
dans les fonctions d’adhésion et d’invasion de la cellule-hôte engagés par cet AT. Les
connaissances acquises lors du projet peuvent être divisées en deux sous-sections
majeures, soit la recherche d’un récepteur pour les fonctions d’adhésion et d’invasion
ainsi que l’analyse de la survie intracellulaire des bactéries après l’invasion causée par
AIDA-I.
L’adhésion, en tant qu’étape initiale de l’infection, est perçue comme très
importante lors du développement de la pathogenèse. Des études préalables réalisées par
Laarmann et Schmidt ainsi que par Fang et al. ont investigué et identifié différentes
protéines en tant que récepteurs potentiels pour AIDA-I (45, 90). Cependant, ces deux
études n’ont pas caractérisé l’interaction entre AIDA-I et le récepteur potentiel purifié.
De plus, ces études n’ont pas investigué en profondeur l’importance de l’interaction
AIDA-I / récepteur potentiel lors des processus d’adhésion, d’invasion,
d’autoaggrégation ou de formation de biofilm. Notre étude sur la recherche d’un
récepteur potentiel dans le sérum porcin a permis d’isoler et d’identifier
l’apolipoprotéine A-I grâce à deux méthodes distinctes : la chromatographie d’affinité et
le fractionnement. L’interaction entre l’apolipoprotéine A-I humaine et AIDA-I à partir
de protéines purifiées a été démontrée par ELISA. L’interaction a également été
démontrée lors du processus d’adhésion grâce à la microscopie à fluorescence, puisque
les bactéries adhérées via AIDA-I colocalisent avec l’apolipoprotéine A-I à la surface
des cellules épithéliales Hep-2 en culture. Ces découvertes permettent d’établir la
présence d’une relation entre l’apolipoprotéine A-I et AIDA-I soit lors d’une ou
plusieurs fonctions causées par AIDA-I ou bien lors du processus entamé par l’hôte pour
se défense contre le pathogène.
L’étude du phénotype d’invasion causée par l’AT AIDA-I permet d’établir que
cet AT possède la capacité de promouvoir l’invasion de cellules épithéliales en culture
mais que sa présence unique n’est pas suffisante pour promouvoir la survie
intracellulaire des bactéries. L’étude de l’invasion et de la survie intracellulaire de la
souche sauvage 2787 laisse sous-entendre que celle-ci possèdent des facteurs de
84
virulence, autres que l’autotransporteur AIDA-I, qui jouent un rôle primordial lors de la
survie intracellulaire.
Les études rapportées dans ce mémoire impliquent les phénotypes d’adhésion et
d’invasion causés par l’AT AIDA-I. L’énigme entourant l’utilité et le dessin d’une
interaction entre l’autotransporteur AIDA-I et l’apolipoprotéine A-I incite à poursuivre
les recherches dans ce domaine. Également, la capacité de la souche sauvage 2787 à
survivre à l’intérieur des cellules-hôtes contrairement à la souche de laboratoire C600
n’exprimant qu’AIDA-I comme facteur de virulence, laisse place à de beaux projets
portant, entre-autre, sur l’identification du ou des gène(s) procurant ce phénotype à la
bactérie.
85
BIBLIOGRAPHIE
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99
ANNEXE 1
100
INTRODUCTION
Les producteurs de l’industrie porcine dépensent chaque année des sommes
faramineuses afin de contrer les maladies qui affectent leur cheptel. Deux de ces
maladies, la diarrhée post-sevrage et la maladie de l’œdème, affectent les porcelets
principalement lors des deux semaines suivant leur sevrage. Le sevrage est une étape de
la croissance du porcelet qui engendre un stress alimentaire et comportemental important
qui peut provoquer l’affaiblissement des défenses immunitaires. La maladie de l’oedème
est principalement causée par les E. coli qui adhèrent au petit intestin via le fimbriae F18
et qui expriment la Shiga-toxine 2e (Stx2e) (73, 112, 172). La diarrhée post-sevrage est
principalement causée par les E. coli qui adhèrent au jéjunum et à l’iléum grâce à divers
facteurs d’attachement (ex. F4, F18) et qui expriment une ou plusieurs entérotoxines
(STa, STb, LT, EAST1) (36, 56, 65, 66, 68, 118, 160, 179). Plusieurs études ont établi la
prévalence des facteurs de virulence dans les E. coli isolées des porcelets affectés par la
maladie de l’œdème ou la diarrhée post-sevrage. L’un des facteurs de virulence étudié
est l’adhésine impliquée dans l’adhérence diffuse (AIDA-I). L’étude de la prévalence de
cette adhésine chez les porcelets atteints de la maladie de l’oedème ou de la diarrhée
post-sevrage est intéressante puisqu’une étude a démontré qu’AIDA-I, usuellement en
association avec la toxine bactérienne STb, est un facteur de virulence contribuant de
façon importante au développement d’une diarrhée sévère chez les porcelets (135). Une
étude réalisée par Zhang et al. en 2007 aux États-Unis, a établi que 26.9% des isolats de
E. coli de porcs présentant une diarrhée post-sevrage possédaient les gènes codant pour
l’adhésine AIDA-I (185). D’autres études effectuées sur les cas de diarrhée post-sevrage
et maladie de l’oedème à travers le monde ont démontré une présence variable pour
l’adhésine AIDA-I (12, 65, 68, 78, 116, 118, 145, 187).
La capacité d’envahir les cellules épithéliales offre aux pathogènes la possibilité
d’établir une niche intracellulaire qui les protège contre les attaques du milieu extérieur
et qui leur permet de persister à l’intérieur de l’hôte d’où elles peuvent redémarrer le
processus d’infection rapidement (29, 85). Les bactéries pathogènes ont développé
plusieurs stratégies leur permettant d’envahir les cellules. L’invasion peut être effectuée
101
via deux mécanismes : l’endocytose induite et l’invasion active. L’invasion par
endocytose induite a lieu lorsque la bactérie injecte des effecteurs dans une cellule-hôte
afin de stimuler son invasion à l’intérieur de cellules non-phagocytaires. Lors de ce type
d’invasion, la bactérie et la cellule-hôte sont actives. L’invasion active, contrairement au
mécanisme précédent, consiste en l’invasion de la cellule-hôte sans déclencher de
mouvements contractiles de la cellule-hôte. Ainsi, seule la bactérie est active lors de ce
processus d’invasion (132, 142). Certains membres du groupe des AT confèrent le
phénotype d’invasion aux bactéries qui les expriment.
La présente étude investigue la capacité de l’adhésine AIDA-I à induire
l’invasion des bactéries à l’intérieur des cellules épithéliales Hep-2 en culture et examine
également l’évolution de la survie intracellulaire de ces bactéries. L’analyse des résultats
démontre que l’adhésine AIDA-I induit l’invasion des cellules épithéliales en culture
sans toutefois permettre la survie des bactéries à l’intérieur de la cellule.
MATÉRIEL ET MÉTHODE
Souches bactériennes et plasmides. Au cours de cette étude, la souche Escherichia coli
K12 C600 (thr-1, leuB6, thi-1, lacY1, supE44, rfbD1, fhuA21; obtenue de New England
Biolabs) a été utilisée. Le plasmide pAg contenant l’opéron aidA (aah et aidA) sous le
contrôle du promoteur ptrc, un promoteur inductible à l’isopropyl-β-D-
thiogalactopyranoside (IPTG), comme décri précédemment, a été utilsé (21). pAg
permet l’expression d’AIDA-I glycosylée. La souche E. coli 2787 (12) (souche de cas
clinique de porc, virotype O126 :H27; exprimant AIDA-I) a été généreusement offerte
par le Dr John Morris Fairbrother (Laboratoire de référence E. coli, Faculté de médecine
vétérinaire, Université de Montréal).
Test d’invasion et cinétique d’invasion. Le test d’invasion est adapté du test de Benz
and Schmidt en 1989 (12). Brièvement, les cellules Hep-2 sont cultivées dans du DMEM
sans antibiotique jusqu’à confluence. Les souches d’E. coli C600 contenant les
102
plasmides pTRC99a ou pAg ou la souche E. coli 2787 sont incubées à 30oC pendant 16
à 18 heures croissent toute la nuit à 30oC dans du LB contenant de l’ampicilline. Les
cellules sont incubées avec 106 bactéries dans le milieu de culture à 37oC pour 3 heures.
Après lavages avec du DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline), les cellules Hep-2
et les bactéries sont incubées dans du DMEM contenant de la gentamicine à 37oC pour 2
heures (Test standard (S)) ou plus (3 heures, 5 heures, 8 heures, 20 heures). Après 3
nombre lavages avec du DPBS, les cellules sont lysées par l’ajout de Triton X-100 (1%)
pendant 10 minutes, reprises dans du LB puis étalé sur gélose pour le décompte en unité
formatrice de colonie. Un contrôle négatif d’invasion est obtenu par le traitement des
cellules 30 min avant l’infection avec la cythocalasine D à 0.1 µg/ml.
RÉSULTATS ET DISCUSSION
Les bactéries K-12 exprimant AIDA-I envahissent les cellules épithéliales Hep-2. Le
rôle exact de l’adhésine AIDA-I lors du processus d’invasion des cellules n’a pas été
défini précisément. Afin d’étudier ce phénomène, la souche E. coli K-12 C600
n’exprimant que l’adhésine AIDA-I comme facteur de virulence a été utilisée afin
d’infecter des cellules épithéliales Hep-2 en culture. Le nombre important d’unité
formatrice de colonies (UFC) d’E. coli C600 exprimant AIDA-I obtenu suite au
traitement à la gentamicine indique que ces dernière possèdent la capacité d’envahir les
cellules épithéliales Hep-2. Le très bas nombre d’UFC obtenu après traitement à la
gentamicine pour la souche E. coli C600 possédant le vecteur vide pTRC99a suggère
que cette souche n’as pas la capacité d’envahir les cellules Hep-2 (Figure 1). Le contrôle
négatif pour le test d’invasion est obtenu par l’association entre le traitement des cellules
à la cythocalasine D et le traitement à la gentamicine. La cytochalasine D est un
composé toxique qui inhibe la polymérisation de l’actine des cellules hôte ce qui bloque
l’invasion par les bactéries. La gentamicine élimine alors les bactéries demeurées à
l’extérieur des cellules ce qui représente un contrôle négatif d’invasion des cellules.
103
Les bactéries K-12 exprimant AIDA-I ne survivent pas à l’intérieur des cellules
Hep-2. L’expérience précédente a permis de démontrer l’aptitude de l’adhésine AIDA-I
à promouvoir l’invasion de la bactérie dans la cellule épithéliale. Cependant, il serait
intéressant de déterminer si l’expression d’AIDA-I permet la survie subséquente des
bactéries à l’intérieur de la cellule. Afin d’éclaircir ce point, une cinétique d’invasion a
été effectuée afin de déterminer la survie des bactéries à 1 heure, 3 heures, 6 heures et 18
heures après le test standard (S). L’analyse de la survie des E. coli exprimant AIDA-I
démontre une baisse rapide et soutenue du nombre de bactéries vivantes à l’intérieur des
cellules. En effet, après 1 heure, le nombre de bactéries vivantes (UFC) à l’intérieur des
cellules chute de façon importante pour finalement atteindre leur plus bas niveau après
18 heures où le nombre d’UFC récupérées se situe à environ 4% du nombre d’UFC
récupéré lors du test standard.
E. coli 2787 envahit et survit à l’intérieur des cellules épithéliales Hep-2. La
moyenne du nombre d’UFC obtenu à la suite du test d’invasion avec la souche 2787 est
nettement supérieure à celle obtenue pour l’invasion d’E. coli K-12 exprimant AIDA-I
(environ 10X plus élevé; Figure 2). Le contrôle négatif démontre que les bactéries 2787
sont incapables de pénétrer à l’intérieur des cellules dont les remaniements d’actine sont
bloqués et sont tuées par la gentamicine. Lorsque la souche E. coli 2787 pénètre les
cellules, celle-ci semble capable de survivre à l’intérieur des cellules puisque le nombre
d’UFC récupéré demeure relativement stable tout au long de la cinétique d’invasion.
Cependant, cette observation peut être le résultat de deux phénomènes distincts : soit les
bactéries envahissent les cellules épithéliales et demeurent à l’intérieur de celles-ci en
état de latence ou soit la majorité des bactéries qui envahissent les cellules épithéliales
meurent tandis que quelques bactéries réussissent à survivre et à se multiplier à
l’intérieur des cellules épithéliales. Actuellement, il n’est pas possible de distinguer ces
deux phénomènes. Une expérience de microscopie de fluorescence utilisant un colorant
pour distinguer les bactéries vivantes et mortes (live/dead) lors d’une cinétique
d’invasion de 2787 permettrait de discerner les deux phénomènes. De plus, il serait
intéressant de déterminer quels sont les facteurs de virulence présents chez la souche
sauvage 2787 qui lui permettent de survivre dans les cellules-hôtes.
104
CONCLUSION
L’adhésine AIDA-I permet l’invasion des cellules Hep-2 en culture. Cependant,
l’incapacité de la souche de laboratoire exprimant AIDA-I à survivre à l’intérieur des
cellules épithéliales Hep-2 démontre que la présence unique de l’AT AIDA-I ne permet
pas à celle-ci de survivre à l’intérieur de la cellule. Contrairement à cette dernière, la
survie de la souche sauvage 2787 à l’intérieur des cellules nous indique que cette
dernière possède d’autres facteurs de virulence lui permettant de survivre à l’intérieur
des cellules. Il n’est pas déterminé si ces dernières subissent un fort taux de mortalité
suivi d’une croissance intracellulaire des survivantes ou si celles-ci entrent en dormance
après l’invasion des cellules.
105
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108
- + - + + + + +
0
100
200
300
400
CD S +1h +3h +18h+6h AIDA-I
C600
CFU
Figure 1. : Cinétique d’invasion et survie intracellulaire de la souche E. coli K-12
C600 exprimant AIDA-I.
La capacité d’invasion et de survie à l’intérieur des cellules Hep-2 des souches E. coli
C600 exprimant ou non AIDA-I a été testée. Un contrôle négatif à la cytochalasine D
(CD) a été effectué. Le test standard d’invasion (S) ainsi que des tests prolongés d’une
heure (3h), de trois heures (5h), de six heures (8h) et de dix-huit heures (20h) ont été
effectués.
3h 5h 8h 20h
109
2787 2787 2787 2787 2787 27870
2000
4000
6000
CD S +1h +3h +18h+6h
CFU
Figure 2. : Cinétique d’invasion et survie intracellulaire de la souche E. coli
sauvage 2787 exprimant AIDA-I.
La capacité d’invasion et de survie à l’intérieur des cellules Hep-2 de la souche
pathogène E. coli 2787 exprimant AIDA-I a été testée. Un contrôle négatif des cellules
Hep-2 traitées à la cytochalasine D (CD) a été effectué. Le test standard d’invasion (S)
ainsi que des tests prolongés d’une heure (3h), de trois heures (5h), de six heures (8h) et
de dix-huit heures (20h) ont été effectués.
3h 5h 8h 20h
110
