Lampiranl. Ringkasan Pengkajian Keamanan Pangan Jagung PRG Event59122

I. Pendahuluan

Jagung PRG event 59122 merupakan jagung produk rekayasa genetik dariPT. Dupont Indonesia yang mengandung tiga gen sisipan yaltu cry34Ab1.cry35Ab1, dan pat. Gen cry34Ab1 dan cry35Ab1 memberikan sifat ketahananterhadap hama ordo Coleoptera tennasuk dl dalamnya Western com rootworm(WCR, Diabmbca virgifera virgifera). Gen pat memberikan sifat toleran teittadapsenyawa L-fosfinotrisin (L-PPT) yang merupakan bahan aktif dalam herbisidaammonium glufosinat.

Jagung PRG event 59122 telah memperoleh sertifikat aman pangan di 14 negarayaitu Amerika Serikat (2004), Australia (2005), Jepang (2005), Kanada (2005),Korea (2005), Taiwan (2005), Meksiko (2005), Cina (2006), Fllipina (2006), UniEropa (2007), Singapura (2010), Afrika Selatan (2011), Kolombia (2011), danMalaysia (2016).

Jagung PRG event 59122 telah memperoleh sertifikat pakan di 7 negara yaituTaiwan (2006), Korea (2005), Kolombia (2010), Malaysia (2016), Singapura (2010),Uni Eropa (2007), dan Filipina (2006). Sertifikat aman lingkungan di 2 negara yaKuAmerika Serikat (2005) dan Kanada (2005).

Pengkajian keamanan pangan jagung PRG event 59122 dilakukan berdasarkanPeraturan Badan Pengawas Obat dan Makanan Nomor 6 Tahun 2018 tentangPengawasan Pangan Produk Rekayasa Genetik dan surat penugasan Ketua KKHPRG kepada Wakil Ketua Bidang Keamanan Pangan KKH PRG Nomor B-05/KKHPRG/01/2018 tanggal 18 Januari 2018 perihal Penugasan Pengkajian KeamananPangan Produk Rekayasa Genetik (PRG) Komoditas Jagung PRG event 59122.

Tim Teknis Keamanan Hayati telah melakukan pengkajian keamanan panganjagung PRG evenf 59122 berdasarkan informasi genetik dan informasi keamananpangan yang terdiri atas kesepadanan substansial, alergenisitas, dan toksisitassebagaimana diuraikan di bawah ini.

II. Informasi Genetik

11.1 Elemen Genetik

Jagung PRG event 59122 mengandung tiga gen sisipan, yaitu:• Gen cry34Ab1 yang dikendalikan oleh promoter ubiquitin gene 1 (ubiZMI)

yang juga mengandung 5' untranslated region (UTR) dan intron sertaterminator dari gen proteinase inhibitor il (pinll). Gen cry34Ab1memproduksi protein Cry34Ab1, yang memberikan sifat ketahananterhadap serangga hama dari ordo Coleoptera (Christensen et ai., 1992;An etai, 1989).

• Gen cry35Ab1 yang dikendalikan oleh promoter peroksidase gandum danterminator pinll. Gen cry35Ab1 memproduksl protein Cry35Ab1, yangmemberikan sifat ketahanan terhadap serangga hama dari ordo Coleoptera(Hertig etal., 1991; An etal., 1989).

• Gen pat yang dikendalikan oleh promoter 35S dan terminator 35S. Gen patteiah dioptimasi untuk mengekspresikan enzim fosfinotrisinasetiltransferase (PAT) pada tanaman, yang dapat memberikan sifattoleran terhadap senyawa L-fosfinotrisin (L-PPT) yang merupakan bahanaktif daiam herbisida ammonium glufosinat (Wohlleben et ai, 1988; Guilleyetal., 1982).

11.2 Sumber Elemen Genetik

Sumber gen sisipan pada jagung PRG event 59122, yaitu gen cry34Ab1 dancry35Ab1 berasal dari bakteri Bacillus thuringlensis (Ellis et ai, 2002; Herman,2002; Moellenbeck et ai, 2001) dan gen pat berasal dari Streptomycesviridoctimmogenes (Wohlleben et ai, 1988). Promoter ubiZMI berasal daritanaman jagung (Zea mays) (Christensen et ai, 1992) dan terminator pinll berasaldari tanaman kentang {Solanum tuberosum) (An et ai, 1989). Promoterperoksidase berasal dari tanaman gandum (Triticum aesHvum) (Hertig et ai,1991). Promoter 35S dan terminator 35S berasal dari cauliflower mosaic virus(CaMV) (Guilley et ai, 1982).

11.3 Sistem Transfbrmasi

Jagung PRG event 59122 dirakit melalui transformasi menggunakanAgrobacterium tumefaciens strain LBA4404 yang mengandung plasmidPHP17662. Embrio jagung yang belum matang diko-kultivasi denganAgrobacterium pada media kultur padat, lalu embrio ditransfer ke kuKur mediabaru yang mengandung antibiotik dan herbisida ammonium glufosinat. Kalustransgenik kemudian diregenerasi dari jaringan embiogenik dan dipindahkan kerumah kaca (Zhao et ai, 2001). Sampel daun diambil untuk dianalisis secara

molekular untuk mengidentifikasi adanya transgen melalui polymerase chainreaction (PGR) dan untuk mengonfirmasi protein yang terekspresi denganmenggunakan teknik enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Bioassaydilakukan dengan infestasi com rootwonn (CRW). Tanaman yang memberikanhasil positif disilangkan dengan galur inbred. Sejumlah galur dievaluasi dilapangan sehingga mendapatkan galur yang merupakan tanaman jagung PRGevent 59122, yang dipilih berdasarkan kesesuaian karakteristik agronomis danketahanan yang baik terhadap com rootworm.

11.4 Stabilltas Genetik

Karakteristik molekular jagung PRG event 59122 diuji dengan menghitung jumlahkopi, integritas, dan stabilltas genetik dari kaset gen terintroduksi (Locke dan Igo,2003; Weber dan Igo, 2003; Cressman et ai, 2004). Hasil yang konsistenditunjukkan oleh satu lokus insersi T-DNA PHP17682 dan stabilltas insersi dari

pengujian dari generasi ke generasi. Selain itu, semua tanaman diuji denganmenggunakan immunoassay lateral flow Cry34Abl untuk membuktikankeberadaan protein Cry34Ab1. Hasil dari immunoassay protein Cry34Ab1dibandingkan dengan hasil pengamatan fenotipik. Dalam pengujian setiaptanaman yang memiliki fenotip positif (ketahanan) temyata juga memiliki hasilpositif untuk keberadaan protein Cry34Ab1, sebaliknya untuk tanaman denganfenotipe negatif temyata Juga memiliki hasil negatif untuk keberadaan proteinCry34Ab1. Hasil analisis statistik dari segregasi fenotip menunjukkan bahwafenotip toleran herbisida Jagung PRG event 59122 tersegregasi sesuai denganpewarisan hukum Mendel. Analisis statistik chi-square dilakukan pada data fenotipuntuk menentukan apakah rasio pemisahan yang diamati untuk setiap generasikonsisten dengan rasio pemisahan yang diharapkan jika terdapat insersi dalamsatu lokus yaitu 1:1 (generasi BC1) atau 3:1 (generasi T1S1, T1S2, dan BC2S1).Hasil ini menunjukkan bahwa Jagung PRG event 59122 yang telah terinsersi DNAdan menghasilkan fenotip toleran herbisida dapat terpisah sesuai denganpewarisan hukum Mendel dan stabil di seluruh generasi, hal ini Juga menunjukkanbahwa satu kopi transgen telah terinsersi ke dalam Jagung PRG event 59122.

Analisis Southern Blot menggunakan probe gen spc, tet, dan virG, bersamaandengan probe backbone RB dan LB menunjukkan tidak ada sinyal hibridisasi yangteramati pada seluruh sampel Jagung PRG event 59122. Hal ini mengindikasikanbahwa Jagung PRG event 59122 tidak mengandung fragmen backbone plasmidtransformasi PHP17662 (Locke etai, 2004).

Berdasarkan hasil kajian informasi genetik dapat disimpulkan bahwa:

1. Jagung PRG event 59122 mengandung tiga gen sisipan yaKu gen cry34Ab1,cry35Ab1 dan pat yang berada pada satu lokus T-DNA dan terintegrasi satu kopipada genom Jagung.

2. Gen cry34Ab1, cry35Ab1 dan pat pada Jagung PRG event 59122 tetap stabilpada seluruh generasi dan diwariskan mengikuti hukum pewarisan Mendel.

3. Jagung PRG event 59122 tidak mengandung fragmen backbone plasmidtransformasi PHP17662.

III. informasi Keamanan Pangan

iii.1 Kesepadanan Substansiai

Bahan yang digunakan untuk uji kesepadanan substansiai adalah Jagung PRGevent 59122 dan Jagung non-PRG konvensional sebagai kontrol. Jagung d'rtanampada musim tanam tahun 2004 dalam rancangan randomized complete block di tujuhlokasi penanaman, lima lokasi di Amerika Serikat, yaitu di Richland, lA; Bagley, lA;Rochelle, IL, Carlyle, IL; Noblesville, IL; dan dua lokasi penanaman di Kanada, yaitudi Branchton, Ontario dan Thomdale, Ontario. Setelah dipanen, biji dan tanaman

Jagung dikirim untuk analisis komposisi ke EPL Bio-Analytical Services, Inc.,

Harristown, IL 62537, Amerika Serikat, yang sudah menerapkan good laboratorypractices (GLP).

Komposisi biji jagung dianalisis untuk kadar proksimat (protein, lemak, abu, airdan karbohidrat by-drfference)-, serat kasar. acid detergent fiber (ADF) dan neutraldetergent fiber (NDF); mineral (kalsium, kalium, tembaga, magnesium, mangan,natrium, besi, fosfor, dan seng); profil asam amino (alanin, arginin, asam aspartat,sistin, asam glutamat, giisin, histidin, isoleusin, leusin, lisin, metionin, fenilalanin,proiin, serin, treonin, triptofan, tirosin, dan valin); profil asam lemak (palmitat,stearat, oleat, linoleat, dan linolenat); vitamin (P-karoten, B1, asam folat, a-

tokoferol, y-tokoferol, 5-tokoferol, dan total tokoferol); metabolit sekunder (inositol,p-asam kumarat, asam ferulat); dan zat anti gizi (asam fitat, rafinosa, dan inhibitortripsin). Komposisi tanaman jagung dianalisis untuk kadar proksimat (protein,lemak, abu, air, dan karbohidrat by-difference)] mineral (kalsium dan fosfor); danserat yaitu serat kasar, ADF, dan NDF.

Hasil analisis komposisi biji Jagung dan tanaman jagung menunjukkan tidak adaperbedaan yang nyata antara jagung PRG event 59122 dan jagung non-PRG danmasuk ke dalam kisaran komposisi jagung komersial pada umumnya.

Berdasarkan hasil pengkajian kesepadanan substansial dapat disimpulkan bahwajagung PRG evenf 59122 sepadan secara substansial dengan jagung non PRG.

III.2 Alergenisftas

Pengkajian alergenisitas terhadap protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 dan PAT yangdiekspresikan pada jagung PRG event 59122 dilakukan melalui analisis

bioinformatika, analisis konsentrasi protein, dan pengujian stabilitas protein yang

meliputi stabilitas cema dan stabilitas panas. Pengujian alergenisitas dilakukan dilaboratorium yang telah menerapkan GLP.

Iil.2.1 Analisis Bioinformatika

Analisis kemiripan sekuen protein Cry34Ab1 dan Cry35Ab1 dengan sekuenprotein alergen dilakukan dengan menggunakan database protein alergenCOMPARE {COMprehensive Protein Allergen Resource) versi 2018 denganperangkat FASTA, serta pencarian kesamaan sekuen delapan atau lebih asamamino dengan sekuen protein dalam database dengan menggunakan bahasaprogram Peii yang dikembangkan oleh DuPont-Pioneer(runLinearEpitopeScreen.pl) (Mirsky dan Leathers, 2018).

Evaluasi kemiripan sekuen protein PAT dengan protein alergen dilakukan denganmenggunakan database protein alergen yang diperoleh dari Food AllergyResearch and Resource Program (FARRP) AllergenOnline Database versi 2014dengan perangkat FASTA, serta pencarian kesamaan sekuen delapan atau lebihasam amino dengan sekuen protein dalam database (Krauss, 2014).

Hasil analisis menunjukkan bahwa tidak ada kemiripan sekuen asam amino yangrelevan secara biologis (35% atau lebih kesamaan asam amino dl dalam sekuenyang mengandung 80 asam amino) antara protein Cry34Ab1, CrySSAbl dan PATdengan sekuen asam amino protein alergen. Seiain itu, tidak ada kesamaandelapan asam amino atau lebih pada protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 dan PATdengan protein alergen dalam database (Mirsky dan Leathers, 2016; Krauss,2014).

iil.2.2 Analisis Konsentrasi Protein Cry34Ab1, CrySSAbl dan PAT

Konsentrasi protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 dan PAT pada jaringan jagung PRGevent 59122 ditentukan menggunakan metode ELISA (Pauli et ai, 2015a).Konsentrasi protein di dalam biji jagung PRG event 59122 ditemukan masing-masing sebesar 41,2 pg/g berat kering untuk protein Cry34Ab1; 2,27 pg/g beratkering untuk protein Cry35Ab1, dan 0,0743 pg/g berat kering untuk protein PAT.

Kandungan protein Cry34Ab1, Cry35Ab1, dan PAT hanya merupakan sebagiankecil, masing-masing sebesar 0,037%; 0,0021%, dan 0,000067% dari protein totaldalam biji jagung PRG event 59122 (Pauli etal., 2015a; 2015b).

IIL2.3 Analisis StabilKas Protein

Protein Cry34Ab1 dan Cry35Ab1 dihasilkan dalam jumlah yang sedikit olehtanaman jagung PRG event 59122, sehingga untuk kepeiiuan pengujian stabilitasprotein digunakan protein yang diproduksi pada bakteri Pseudonronas fluorescens.Kesetaraan protein Cry34Ab1 dan Cry35Ab1 yang diekspresikan di dalamtanaman jagung PRG event 59122 dengan yang dihasilkan oleh bakteri

P. fluorescens diuji dengan menggunakan metode SDS-PAGE, Western blot,

ELISA, analisis sekuen N-terminal, analisis glikosilasi, aktivitas insektisidal, dananalisis pemetaan massa peptida dengan spektroskopi massa MALDI-TOF MS.

Hasil analisis menunjukkan bahwa protein Cry34Ab1 dan Cry35Ab1 yangdihasilkan oleh bakteri P. fluorescens ekivaien dengan protein Cry34Ab1 dan

Cry35Ab1 yang dihasilkan oleh jagung PRG event 59122 (Gao et a/., 2000;Schafer et a/., 2003).

Protein PAT juga dihasilkan dalam jumlah yang sedikit oleh tanaman jagung PRGevent 59122, sehingga untuk kepeiiuan pengujian stabilitas protein digunakan

protein yang diproduksi pada bakteri Esctierichia coll. Kesetaraan protein PATyang diekspresikan di dalam tanaman jagung PRG event 59122 dengan yangdihasilkan oleh bakteri E. coll diuji dengan menggunakan metode SDS-PAGE,

Western blot, ELISA, analisis sekuen N-terminal, analisis glikosilasi, dan aktivitas

enzimatik. Hasil analisis menunjukkan bahwa protein PAT yang dihasilkan olehbakteri E. coll ekivaien dengan protein PAT yang dihasilkan oleh jagung PRGevent 59122 (Koijagin, 2000; Schafer dan Collins, 2003, H^rouet etal., 2005).

111.2.3.1 Analisis Stabilitas Cema Protein

Analisis stabilitas cema protein Cry34Ab1 dan Cry35Ab1 dllakukan melalul ujldaya cema menggunakan cairan lambung simulasi {Simulated Gastric Fluld-SGf)dalam rentang waktu 60 menit pada suhu 37°C. Hasil hldrollsls protein dievaluasidengan menggunakan metode SDS PAGE dan Westem blot (Herman et al2003).

Hasil SDS-PAGE dan Westem blot menunjukkan bahwa pita protein utuhCry34Ab1 maslh terdeteksl setelah InkubasI selama 15 menit, namun tidakterdeteksi lagi setelah inkubasi selama 20 menit dalam SGF. Ujl SGF terhadapprotein Cry34Ab1 tersebut menggunakan batas deteksi sebesar 0,54% darikonsentrasi awal protein ujl. Apabila dibandingkan dengan pengujian proteininsektisidal lainnya dengan SGF yang menggunakan batas deteksi sebesar 10%dari konsentrasi awal protein uji, dapat diperkirakan bahwa protein utuh Cry34Ab1dapat terhidrolisis setelah 6,8 menit (Herman et al., 2003).

Evaluasi dengan SDS-PAGE dan Westem blot menunjukkan bahwa setelahinkubasi selama 1 menit dalam SGF dengan menggunakan pepsin pada pH 1,2dan suhu 37°C, tidak terdeteksi adanya pita protein utuh Cry35Ab1, namunterdeteksi adanya pita fnagmen-fragmen protein Cry35Ab1 yang masing-masingberukuran 40 dan 15 kDa. Pita fragmen-fragmen tersebut tidak terdeteksi lagisetelah inkubasi selama 5 menit dalam SGF (Herman et al., 2003).

Analisis stabilitas protein PAT dilakukan melalui uji daya cerna menggunakan SGFdan cairan usus simulasi {Simulated Intestinal Fluld-SIF) dalam rentang waktu 60menit pada suhu 37°C. Hasil hidrolisis protein dievaluasi dengan menggunakanmetode SDS PAGE dan Westem blot (H6rouet et al., 2005). Evaluasi denganSDS-PAGE dan Westem blot menunjukkan bahwa setelah inkubasi selamakurang dari 1 menit dalam SGF, tidak terdeteksi adanya protein PAT maupunfragmen-fragmennya. Demikian pula setelah inkubasi selama 5 menit dalam SIF,tidak terdeteksi adanya pita protein utuh PAT maupun fragmen-fragmennyaberdasarkan evaluasi dengan Westem blot.

111.2.3.2 Analisis Stabiiitas Panes Protein

Protein Cry34Ab1 dan Cry35Ab1 yang diproduksi oleh P. fluorescens digunakanuntuk pengujian stabilitas panas protein. Evaluasi pengaruh pemanasan terhadapaktivitas insektisidal dilakukan dengan menggunakan campuran protein Cry34Ab1dan Cry35Ab1 dengan rasio 1:1 yang diinkubasi selama 30 menit pada suhu 4''C(kontrol), OO^C, 75'C, dan 90®C. Sampel tersebut kemudian diberikan kepada larvadari Southern com rootwonv {DIabrotIca undeclmpuntata howardi) sebagai bagiandari pakan (Herman, 2000). Pengujian serupa juga dilakukan menggunakansampel yang terdiri atas campuran protein Cry34Ab1 dan Cry35Ab1 yang telahmendapatkan perlakuan pemanasan dan ke dalamnya ditambahkan proteinCry34Ab1 atau Cry35Ab1 tanpa peiiakuan pemanasan (Herman, 2002). Pengujiantersebut memberikan kemungkinan untuk mengevaluasi stabilitas panas tiap

protein dalam campuran protein Cry34Abl dan Cry35Ab1, karena kedua proteintersebut diperlukan untuk mencapai aktivitas insektisidal maksimum.

Hasil evaluasi menunjukkan bahwa campuran dua protein Cry34Ab1 danCry35Ab1 kehilangan aktivitas insektisidalnya setelah pemanasan selama 30menit pada suhu 60"C atau lebih (Herman, 2000; 2002). Protein Cry35Ab1kehiiangan aktivitasnya setelah pemanasan selama 30 menit pada suhu OO'^C ataulebih, sedangkan protein Cry34Ab1 menunjukkan aktivitas insektisidai yang lebihrendah seteiah pemanasan pada suhu 60®C dan 76®C, serta kehilanganaktivitasnya setelah pemanasan pada suhu 90"C selama 30 menit (Herman, 2002;Herman dan Hunst, 2002).

Analisis efek pemanasan terhadap stabilitas protein PAT yang diproduksi oleh £.coli dilakukan melalui evaluasi dengan SDS-PAGE. Hasil evaluasi menunjukkanbahwa setelah pemanasan pada suhu 90°C selama 60 menit, pita protein PATtetap terdeteksi, yang menunjukkan bahwa bahwa protein PAT tidak terdegradasiatau tidak terjadi perubahan migrasi protein pada SDS-PAGE. Namun demikian,studi bioinformatika menunjukkan bahwa tidak terdapat kemiripan sekuen asamamino yang relevan secara biologis antara protein PAT dengan protein alergen(H6rouet et al., 2005).

Berdasarkan pengkajian alergenisitas, dapat disimpulkan bahwa protein Cry34Ab1,Cry35Ab1, dan PAT tidak menunjukkan adanya potensi menimbulkan alergi.

III.3 Uji Toksis'rtas

Pengkajian toksisitas terhadap protein Cry34Ab1, Cry35Ab1, dan PAT yang

diekspresikan pada jagung PRG event 59122 dilakukan melalui analisisbioinformatika dan toksisitas oral akut yang dilakukan di laboratorium yang

menerapkan GLP.

III.3.1 Analisis Bioinfomatika

Analisis kemiripan sekuen protein Cry34Ab1, Cry35Ab1, dan PAT dengan sekuenprotein toksin diiakukan dengan BLASTP menggunakan DuPont Pioneer ToxinDatabase yang dikembangkan berbasis pada database sekuen protein yang

terdapat dalam UniProtKB/Swiss-Prot (https.7/www. uniprot.org/). DuPont Pioneer

Toxin Database tersebut disusun dengan mengumpulkan seluruh sekuen protein

dalam UniProtKB/Swiss-Prot yang difiKer dengan menggunakan kata kund yangmengindikasikan toksisitas atau efek buruk bagi kesehatan lainnya seperti toksin,hemagglutinin, vasoaktif dan lain sebagainya (Mirsky dan Challender, 2019; Mirskydan Sitzmann, 2019). Hasil analisis menunjukkan bahwa tidak terdapat kemiripan

sekuen asam amino antara protein Cry34Ab1, Cry35Ab1, dan PAT dengan sekuenasam amino protein toksin dalam DuPont Pioneer Toxin Database (Mirsky danChallender, 2019 ; Mirsky dan Sitzmann, 2019).

Ili.3.2 UJi Toksisitas Akut Protein Cry34Ab1

Pengujian toksisitas oral akut telah dilakukan terhadap protein Cry34Ab1 dan telahdilaporkan (Brooks dan DeWildt, 2000b). Jumiah protein Cry34Ab1 yangdihasilkan oleh jagung PRG event 59122 sangat sedikit, maka untuk keperluanpengujian, digunakan protein Cry34Ab1 yang diproduksi oleh P. fluorescens.Ekivalensi protein Cry34Ab1 yang dihasilkan oleh tanaman jagung PRG event59122 dengan yang dihasilkan oleh bakteri P. fluorescens, telah diuji dandilaporkan, dan disimpulkan bahwa kedua macam protein tersebut ekivalen secarabiologi dan biokimia (Schafer et ai, 2003; Gao et ai, 2000; dan Gao et al.. 2004).Studi tersebut mendukung penggunaan protein Cry34Ab1 yang dihasilkan olehbakteri P. fluorescens dalam pengujian toksisitas secara in vivo.

Tujuan pengujian adalah untuk melakukan uji toksisitas akut terhadap proteinCry34Ab1 yang diproduksi oleh P. fluorescens, dengan kemumian sebesar 54%pada mencit jantan dengan cara cekokan tunggal.

Hewan percobaan yang digunakan adalah mencit jantan strain GDI, berumursekitar 9 minggu sewaktu dimulainya pengujian, dengan berat badan sekitar36-37 g, yang berasal dari Charles River Laboratories Inc, Portage, Ml. Mencitditempatkan dalam kandang secara individual, setelah diaklimatisasi selama 1minggu. Kandang ditempatkan dalam ruangan bersuhu 22 ±3°C dan kelembabannisbi 40-72%, dengan pencahayaan selama 12 jam terang 12 jam gelap. Ransumyang digunakan yaitu pelet Purina Certified Rodent LabDiet #5002 dari PurinaMills, Inc., St. Louis, MO dan diberikan secara ad libitum. Air minum juga diberikansecara ad libitum.

Sebanyak 5 ekor mencit jantan diberi cekokan larutan protein Cry34Ab1, dengandosis sebesar 2700 mg/kg SB. Protein ditambahkan ke dalam suspensimetilselulosa 0,5% untuk mendapatkan konsentrasi akhir sebesar 20%.Pemberian bahan uji hanya dilakukan sekali, yaitu pada hari ke 1. Pengujiandilakukan selama 14 hari. Pengamatan dilakukan setiap hari sejak hari ke-1(sesaat setelah pemberian bahan uji) hingga hari ke-14. Mencit dipuasakan 1 jam

sebelum pemberian bahan uji dan segera diberi ransum setelah perlakuan.

Pemeriksaan klinis secara detil {detailed ciincai obsen/ation-DCO) dilakukansebelum pemberian bahan uji dan setiap hari selama pengujian. Penimbanganberat badan dilakukan pada: 1) sebelum perlakuan (pada masa akiimatisasi), 2)hari ke-1 pemberian bahan uji, dan 3) hari ke- 2, 8, dan 15 pada masa pengujian.Pada akhir pengujian, semua mencit dianestesi dengan cara inhalasimenggunakan gas karbondioksida dan dieutanasi secara dekapitasi, sertaselanjutnya dilakukan nekropsi lengkap.

Hasil pengujian menunjukkan bahwa: (1) tidak terdapat mencit yang mati selamapengujian berlangsung, (2) tidak ditemukan adanya kelainan klinis yangdiakibatkan oleh pemberian bahan uji, dan (3) tidak ada efek negatif (lesi nekrosis)yang diakibatkan oleh pemberian bahan uji.

10

Berdasarkan pengujian tersebut disimpulkan bahwa tidak terdapat efek toksikpada mencit akibat pemberian protein Cry34Ab1 hingga 2700 mg/kg SB.

III.3.3 UJi Toksisitas Akut Protein Cry35Ab1

Pengujian toksisitas oral akut telati dilakukan terhadap protein Cry35Ab1 dan telahdllaporkan (Brooks & DeWildt 2000c). Jumlah protein Cry35Ab1 yang dihasilkanoieh Jagung PRG event 59122 sangat sediklt, maka untuk keperluan pengujian,digunakan protein Cry35Ab1 yang diproduksl oieh P. fluorescens. EkIvalensIprotein CrySSAbI yang dihasilkan oieh tanaman jagung PRG ei/enf 59122 denganyang dihasilkan oieh bakterl P. fluorescens. telah diuji dan dllaporkan, dandisimpulkan bahwa kedua protein tersebut ekivalen secara biologi dan bloklmla(Schafer et ai, 2003; Gao ef a/„ 2000; dan Gao et al., 2004). StudI tersebutmendukung penggunaan protein Cry35Ab1 yang dihasilkan oieh bakterlP. fluorescens dalam pengujian toksisitas secara in vivo.

Tujuan pengujian adalah untuk melakukan ujl toksisitas akut terhadap proteinCry35Ab1 yang diproduksl oieh P. fluorescens, dengan kemurnlan sebesar 37%pada mencit jantan dengan cara cekokan tunggal.

Hewan percobaan yang digunakan adalah mencit jantan strain CD1, berumursekitar 9 minggu sewaktu dimuialnya pengujian, dengan berat badan sekltar32-36 g, yang berasal darl Charles River Laboratories Inc, Portage, Ml. Mencitditempatkan daiam kandang secara individual, setelah diaklimatisasi selama 1minggu. Kandang ditempatkan dalam ruangan bersuhu 22 ±3'C dan kelembabannisbl 40-70%, dengan pencahayaan selama 12 jam terang 12 jam gelap. Ransumyang digunakan yaltu pelet Purlna Certified Rodent LabDIet #5002 darl PurinaMills, Inc., St. Louis, MO dan dlberikan secara ad libitum. Air minum juga diberlkansecara ad iibitum.

Sebanyak 5 ekor mencit jantan diberi cekokan larutan protein Cry35Ab1, dengandosis sebesar 1850 mg/kg BB. Protein ditambahkan ke daiam suspensimetliselulosa 0,5% untuk mendapatkan konsentrasi akhir sebesar 20%.Pemberian bahan ujl hanya dilakukan sekaii, yaltu pada hari ke 1. Pengujiandilakukan selama 14 hari. Pengamatan dilakukan setlap harl sejak hari ke-1(sesaat setelah pemberian bahan ujl) hingga harl ke-14. Mencit dipuasakan 1 jamsebelum pemberian bahan ujl, dan segera diberl ransum setelah perlakuan.

Pemeriksaan kllnis secara detii {detaiied clinical observation-DCO) dilakukansebelum pemberian bahan ujl dan setlap hari selama pengujian. Penimbanganberat badan dilakukan pada; 1) sebelum perlakuan (pada masa akiimatlsasi),2) hari ke-1 pemberian bahan ujl, dan 3) harl ke- 2, 8, dan 15 pada masapengujian. Pada akhIr pengujian, semua mencit dianestesi dengan cara InhalasImenggunakan gas karbondiokslda dan dieutanasi secara dekapitasi, sertaselanjutnya dilakukan nekropsi lengkap.

11

Hasil pengujian menunjukkan bahwa: (1) tidak terdapat mencit yang mati selamapengujian berlangsung, (2) tidak ditemukan adanya keialnan kllnis yangdiaklbatkan oleh pemberian bahan uji, dan (3) tidak ada efek negatif (lesi nekrosis)yang diaklbatkan oleh pemberian bahan uji.

Berdasarkan pengujian tersebut disimpulkan bahwa tidak terdapat efek toksikpada mencit akibat pemberian protein Cry35Ab1 sebanyak 1850 mg/kg 88.

III.3.4 UJI Toksisitas Akut Campuran Protein Cry34Ab1 dan Cry35Ab1

Pengujian toksisitas oral akut telah dilakukan terhadap campuran proteinCry34Ab1 dan Cry35Ab1 dan telah dilaporkan (Juberg et al., 2009). Tujuanpengujian adalah untuk melakukan uji toksisitas akut terhadap campuran proteinCry34Ab1 (kemurnian 54%) dan Cry35Ab1 (kemumian 37%) yang diproduksi olehP. fluorescens dengan perbandingan 1:4,6 (atau setara dengan 1:3 kadarproteinnya), pada mencit jantan dan betina dengan cara cekokan tunggal.

Hewan percobaan yang digunakan adalah mencit jantan dan betina strain CD1,berumur sekitar 9 minggu sewaktu dimulainya pengujian, dengan berat badansekitar 23-35 g, yang berasal dari Charles River Laboratories Inc, Portage, Ml.Mencit ditempatkan dalam kandang secara individual, seteiah diaklimatisasiselama 1 minggu. Kandang ditempatkan dalam ruangan bersuhu 22 ±3°C dankeiembaban nisbi 40-72%, dengan pencahayaan selama 12 jam terang 12 jamgelap. Ransum yang digunakan yaitu pelet Purlna Certified Rodent LabDiet #5002daii Purina Mills, Inc., St. Louis, MO dan diberikan secara ad libitum. Air minumjuga diberikan secara ad libitum.

Sebanyak 5 ekor mencit jantan dan 5 ekor mencit betina diberi cekokan larutanprotein campuran, dengan dosis protein murni sebesar 2000 mg/kg 88 (1:3).Protein ditambahkan ke dalam suspensi metilselulosa 0,5% untuk mendapatkankonsentrasi akhir sebesar 20%. Pemberian bahan uji hanya dilakukan sekali, yaltupada hari ke 1. Pengujian dilakukan selama 14 hari. Pengamatan dilakukan setiaphari sejak hari ke-1 (sesaat seteiah pemberian bahan uji) hingga hari ke-14. Mencitdipuasakan 1 jam sebelum pemberian bahan uji, dan segera diberi ransum seteiahperlakuan.

Pemeriksaan klinis secara detil (detailed clinical observatlon-DCO) dilakukansebelum pemberian bahan uji dan setiap hari selama pengujian. Penimbanganberat badan dilakukan pada: 1) sebelum perlakuan (pada masa akiimatisasi), 2)hari ke-1 pemberian bahan uji, dan 3) hari ke- 2, 8, dan 15 pada masa pengujian.Pada akhir pengujian, semua mencit dianestesi dengan cara inhalasimenggunakan gas karbondioksida dan dieutanasi secara dekapitasi, sertaselanjutnya dilakukan nekropsi lengkap.

Hasil pengujian menunjukkan bahwa: (1) tidak terdapat mencit yang mati selamapengujian berlangsung, (2) tidak ditemukan adanya kelainan kllnis yang

12

diakibatkan oleh pemberian bahan uji. dan (3) tidak ada efek negatif (lesi nekrosis)yang diakibatkan oleh pemberian bahan uji.

Berdasarkan pengujian tersebut disimpulkan bahwa tidak terdapat efek toksikpada mencit akibat pemberian campuran protein Cry34Ab1 dan Cry35Ab1 f1-3)sebanyak 2000 mg/kg SB.

IM.3.5 Uji Toksisitas Akut Protein PAT

Pengujian toksisitas oral akut telah dilakukan terhadap protein PAT dan telahdilaporkan (Brooks, 2000). Jumlah protein PAT yang dihasilkan oleh jagung PRGevenf 59122 sangat sedikit, maka untuk keperluan pengujian, digunakan proteinPAT yang diproduksi oleh £ coli. Ekivalensi protein PAT yang dihasilkan olehtanaman Jagung PRG event 59122 dengan yang dihasilkan oleh bakteri £ coli,telah diuji dan dilaporkan, dan disimpulkan bahwa protein tersebut ekivalen secarabiologi dan biokimia (Schafer dan Collins, 2003). Studi tersebut mendukungpenggunaan protein PAT yang dihasilkan oleh bakteri £ coll dalam pengujiantoksisitas secara In vivo.

Tujuan pengujian adalah untuk melakukan uji toksisitas akut terhadap protein PATyang diproduksi oleh £ coll, dengan kemumian sebesar 84% pada mencit Jantandan betina dengan cara cekokan tunggal.

Hewan percobaan yang digunakan adalah mencit Jantan strain GDI, berumursekitar 9 minggu sewaktu dimulainya pengujian, dengan berat badan sekitar 29,4-32,1 g, yang berasal dari Charles River Laboratories Inc, Portage, Ml. Mencitditempatkan dalam kandang secara individual, setelah diaklimatisasi selama 1rninggu. Kandang ditempatkan dalam ruangan bersuhu 22 ±3°C dan kelembabannisbi 40-70%, dengan pencahayaan selama 12 Jam terang 12 Jam gelap. Ransumyang digunakan yaitu pelet Purina Certified Rodent LabDiet #5002 dari PurinaMilis, Inc., St. Louis, MO dan diberikan secara ad libitum. Air minum Juga diberikansecara ad libitum.

Sebanyak 5 ekor mencit Jantan diberi cekokan larutan protein PAT dengan dosissebesar 5000 mg/kg BB. Protein ditambahkan ke dalam suspensi metilselulosa0.5% untuk mendapatkan konsentrasi akhir sebesar 25%. Pemberian bahan ujidosis tunggai namun dibagi dalam 2 tahap pada hari ke-1 karena besamya volumecekokan (lebih dari 2 ml/100 g BB). Pengujian dilakukan selama 14 harl.Pengamatan dilakukan setiap hari sejak hari ke-1 (sesaat setelah pemberianbahan uji) hingga hari ke-14. Mencit dipuasakan 1 Jam sebelum pemberian bahanuji, dan segera diberi ransum setelah periakuan.

Pemeriksaan klinis secara detil (detailed clinical observation-DCO) dilakukansebelum pemberian bahan uji dan setiap hari seiama pengujian. Penimbanganberat badan diiakukan pada: 1) sebelum periakuan (pada masa akiimatisasi),2) hari ke-1 pemberian bahan uji, dan 3) hari ke-2, 8, dan 15 pada masapengujian. Pada akhir pengujian, semua mencit dianestesi dengan cara inhalasi

13

menggunakan uap metoksifuran dan dieutanasi secara dekapitasi, sertaselanjutnya dilakukan nekropsi lengkap.

Hasil pengujian menunjukkan bahwa: (1) tidak terdapat mencit yang mati selamapengujian berlangsung. (2) tidak ditemukan adanya kelalnan klinis yangdiaklbatkan oleh pemberian bahan ujl, dan (3) tidak ada efek negatif (lesi nekrosis)yang diakibatkan oleh pemberian bahan uji.

Berdasarkan pengujian tersebut disimpulkan bahwa tidak terdapat efek toksikpada mencit akibat pemberian protein PAT sebanyak 5000 mg/kg 88.

III.3.6 Uji Toksisltas Subkronik Jagung PRG Event 69122

Pengujian toksisitas subkronik jagung PRG event 59122 telah dilakukan dandipublikasikan oleh He et at. (2008). Pada studi ini, tepung dibuat dari biji jagungPRG event 59122 atau jagung nearisogenic (091) sebagai kontrol, masing-masingdigunakan pada 2 taraf konsentrasi (yaitu 50% dan 70% (b/b) dalam ransum yangdiberikan kepada tikus selama 90 hari sesuai Ctiinese toxicology guidelines(G815193.13-2003). Ransum komersial AIN93G digunakan sebagai kontrol negatif.

Jagung PRG event 59122 dan 091 disuplai oleh Pioneer Hi-bread International, Inc.(Johnston, lA, USA; a DuPont company). Biji jagung dipipil, dibersihkan dan digilingsehlngga didapat tepung jagung dengan diameter 650-750 pm. Analisis proksimattepung jagung dilakukan untuk keperluan formulasi ransum. Komposisi ransumdibuat sedemikian rupa sehingga menyerupal komposisi ransum AIN93G (totalenergy 3766 kal/kg; kadar air 66.0 g/kg; total lemak 70.0 g/kg; total KH 643.7 g/kg-total protein 176.6 g/kg: total abu 41.7 g/kg).

Sebanyak 100 tikus Sprague-Dawley jantan dan betina diperoleh dari ExperimentalAnimal Center of Peking (Beijing, China). Tikus berumur sekitar 4 minggu denganrata-rata berat badan 40-60 g ketika tiba. Setelah diaklimatisasi selama 5 hari, tikusdibagi ke dalam 5 grup secara acak sehingga setiap grup terdiri dari 10 jantan dan10 betina. Tikus perlakuan diberi ransum dengan konsentrasi 50% atau 70% (b/b)tepung jagung PRG eirenf 59122 maupun tepung jagung kontrol 091. Kelompokkontrol negarif diberi ransum AIN93G yang mengandung 43.3% tepung jagung.Semua tikus dikandangkan secara individual dan diberi air minum dan ransumsecara ad iibitum. Suhu kandang 21-23"'C dan kelembapan nisbi 40-60% denganpencahayaan 12 jam terang 12 jam gelap.

Setiap hari, diamati mortalitas dan tanda-tanda toksisitas tikus. Berat badanditimbang 2 kali dalam 1 minggu dan konsumsi ransum dihitung 1 kali seminggu. Diakhir pengamatan, dilakukan penghitungan berat badan total, utilisasi ransum(total kenaikan berat badan/jumlah ransum yg dikonsumsi), pemeriksaanhematologi dan kimia serum, pemeriksaan organ dalam serta pemeriksaanhistopatologi.

14

Hasil studi menunjukkan bahwa: 1) semua tikus terlihat sehat dan tidak ada tikusyang mati karena perlakuan yang diberikan; 2) tidak ada perbedaan yang signlflkandalam hal berat badan akhir dan utillsasi ransum antara tikus grup 59122 dengantikus grup kontrol 091 pada taraf konsentrasi jagung yang sama; 3) tidak adaperbedaan nilai parameter hematologi yang diakibatkan oieh konsumsi ransumjagung PRG event 59122; 4) tidak ada Indikasi efek negatif terhadap kimla serumyang diakibatkan oieh konsumsi ransum jagung PRG event 59122; 5) tidak adaindikasi efek negatif pada organ dalam tikus yang diakibatkan oieh konsumsiransum jagung 59122; dan 6) pengujian histopatoiogi menunjukkan tidak ada efeknegatif (iesi nekrosis) akibat ransum yang diberikan.

Berdasarkan uji subkronik menunjukkan bahwa jagung PRG event 59122 bersifattidak toksik.

Berdasarkan pengkajian toksisitas dapat disimpulkan bahwa protein Cry34Ab1,Cry35Ab1, dan pat termasuk kedaiam bahan yang tidak toksik sampai dosis masing-masing sebesar 1850 mg/kg BB. 2000 mg/kg BB, dan 5000 mg/kg BB.

IV. Kesimpuian

Berdasarkan hasii pengkajian tentang informasi genetik, kesepadanan substansial,aiergenisitas, dan toksisitas disimpulkan hal-hal sebagai berikut;

1. Jagung PRG event 59122 mengandung satu kopi sisipan gen cry34Ab1,cry35Ab1 dan pat yang stabii pada seluruh generasi, diwariskan mengikutihukum pewarisan Mendel, dan tidak mengandung fragmen backboneplasmid transformasi PHP17662.

2. Jagung PRG event 59122 sepadan secara substansial dengan jagung nonPRG; tidak berpotensi menimbuikan alergi; dan termasuk ke daiam bahanyang bersifat tidak toksik.

3. TTKH meniiai bahwa jagung PRG event 59122 yang diajukan adalah amanuntuk dikonsumsi sebagai bahan pangan.

4. Apabiia kemudian ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuaidengan data keamanan pangan yang diperoleh hingga saat ini, maka statuskeamanan pangan jagung PRG event 59122 periu dikaji ulang.

Apabiia seteiah ditetapkan aman pangan. kemudian jagung PRG event59122 terbukti menimbuikan dampak negatif terhadap kesehatan manusiamaka pemohon wajib meiakukan tindakan pengendalian danpenanggulangan, serta menarik jagung PRG event 59122 dari peredaran.

Jagung PRG event 59122 tidak boleh digunakan sebagai pakan sampaimemperoleh sertifikat aman pakan.

15

7. Jagung PRG event 59122 tidak boleh dibudidayakan sampai ditetapkanaman lingkungan.

V. DaftarAcuan

An, G., Mitra, A., Choi, H.K., Costa, M.A., An, K., Thomburg, R.W., dan Ryan, CA1989. Functional Analysis of the 3' Control Region of the Potato Wound-Inducible Proteinase Inhibitor li Gene. The Plant Cell, Vol. 1,115-122.

Brooks, K.J. 2000. PATIVIicrobiai Protein (PL) Acute Oral Toxtolty Study In CD-IMice. The Dow Chemicai Company Study No. 991249. Dow AgroSciencesLLC, 9330 Zionsvllle Road. Indianapolis, IN 46268, USA. Report Compietedon January 26, 2000.

Brooks, K.J. dan DeWildt, P.M. 2000b. PS149B1 14 KDA Protein : Acute OralToxicity Study In CD-I Mice. The Dow Chemical Company Study No. 001130.Dow AgroSciences LLC, 9330 Zionsvilie Road, Indianapolis, IN 46268, USA.Report Completed on October 10, 2000.

Brooks, K.J. dan DeWildt, P.M. 2000c. PS149B1 44 KDA Protein : Acute OralToxicity Study In CD-I Mice. The Dow Chemical Company Study No. 001129.Dow AgroSciences LLC, 9330 Zionsvilie Road, Indianapolis, IN 46268, USA.Report Completed on October 10, 2000.

Christensen. A.H., Sharrock, R.A., dan Quail, P.M. 1992. Maize PolyublqultinGenes: Structure, Thermal Perturbation of Expression and Transcript Splicing,and Promoter Activity Foiiowing Transfer to Protopiast by Electroporation.Plant Moleculat Biology 18; 675-689.

Cressman, R.F., Luckring, A.K., Sanders, C.D., Hunt, S.I.. Locke, M.E. 2004.Insert and Border Sequence Characterization ofB.t. Cry34/35Ab1 Event DAS-59122-7. Pioneer Hi-Bred international. Inc., Study No. PHI-2002-037

Ellis, R.T.. Stockhoif, B.A., Stamp, L., Schnepf, H.E., Schwab, G.E., Knuth, M.,Russel, J., Cardineau, G.A., dan Narva, K.E., 2002. Novei Baciliusthunngiensis Binary insectisidal Crystal Proteins Active on Westem ComRootwonn, Diabrotica virgifera virgifera LeConte. Applied and EnvironmentalMicrobiology, Voi.68, No.3:1137-1145.

Gao Y., Herman, R.A., Gilbert, J.R. dan Patterson, V.L. 2000. Equivaiency ofMicrobiai- and Maize-Expressed PS149BI Proteins. Dow AgroSciences LLCStudy No. 000367. Dow AgroSciences LLC, 9330 Zionsvilie Road,Indianapolis, IN 46268-1054, USA. Report Completed on October 3, 2000.

Gao, v., Schafer, B.W., Collins, R.A., Herman, R.A., Xu, X., Gilbert, J.R., Ni, W.,Langer, V.L., dan Tagiiani, L.A. 2004. Characterization of Cry34Ab1 adnCry35Ab1 Insectlcldal Crystal Proteins Expressed in Transgenic Com Piants

16

and Pseudomonas flourescens. Journal of Agricultural and Food Chemistry53,8057-8065.

Guiley, H., Dudley, R.K., Jonard, G.. BalSzs, E., dan Richards, K.E. 1982.Transcription of Cauliflower Mosaic Virus DNA: Detection of Promoter

Sequences, and Characten'zation of Transcn'pts. Cell Vol. 30,763 - 771.

He, X.Y., Huang, K.L., Li., X., Qin, W., Delaney, B., Luo, Y.B. 2008. Comparison ofGrain from Com Rootworm Resistant Transgenic DAS-59122-7 filaize withNon-Transgenic Maize Grain in A 90-Day Feeding Study in Sprague-DawieyRats. Food and Chemical Toxicology 46 (2008) 1994-2002.

Herman, R.A. 2000. Thermoiabiiity of PS149B1 Binary Deita-Endotoxin. DowAgroSciences LLC Study No. 001041. Dow AgroSciences LLC, 9330Zionsville Road, Indianapolis, IN 46268-1054, USA. Report Completed onNovember 16, 2000.

Herman, R.A. 2002. Heat Lability of individual Proteins of the PS149Bi Binary iCP.Dow AgroSciences LLC Study No. 010144. Dow AgroSciences LLC, 9330Zionsville Road, Indianapolis. IN 46268-1054, USA. Report Completed onJanuary 07, 2002.

Herman, R.A. dan Hunst. P.L. 2002. Summary of Heat Lability Studies withCry34Ab1/Cry3SAb1. Dow AgroSciences LLC Study No.GH-C 5603. DowAgroSciences LLC, 9330 Zionsville Road, Indianapolis, IN 46268-1054, USA.

Herman, R.A., Schafer, B.W., Korjagin, V.A. dan Ernest, A.D. 2003. RapidDigestion of Cry34Ab1 and Cry35Ab1 In Simulated Gastric Fluid. Journal ofAgricultural and Food Chemistry 51; 6823-6827

H6rouet, C., Esdaile, D. J.. Mallyon, B. A., Debruyne, E., Schuiz, A.. Currier, T.,Hendrickx, K., van der Klis, R.-J., dan Rouan, D. 2005. Safety evaluation ofthe phosphinothricin acetyltransferase proteins encoded by the pat and barsequences that confer tolerance to glufosinate ammonium herbicide intransgenic plants. Regui. Toxicoi. Pharmacol. 41:134-149

Hertig, C., Rebmann, G., Bull, J., Mauch, F., dan Dudler, R. 1991. Sequence andnssue-specific Expression of Putative Peroxidase Gene from Wheat (TriticumaestivumL). Plant Molecular Biology 16:171-174.

Juberg, D.R., Herman, R.A., Thomas, J., Brooks, K.J., dan Delaney, B. 2009.Acute and Repeated Dose (28 Day) Mouse Oral Toxicity Studies withCry34ab1 and Cry35ab1 Bt Proteins Used in Coieopteran Resistant DAS-59122-7 Com. Regulatory Toxicology and Pharmacology 54(2009); 154-163.

Koijagiri, V.A. 2000. Characterization of Pseudomonas Produced and TransgenicMaize Expressed Phosphinothricin Acetyltransferase (PAT) Protein. DowAgroSc/ences LLC Study No. 000369. Dow AgroSciences LLC, 9330Zionsville Road, Indianapolis, IN 46268-1054, USA. Report Completed onSeptember26, 2000.

17

Krauss, A. 2014. Comparison of the Amino Acid Sequence Identity between thePAT Protein and Known and Putative Protein Allergens (>35% Identity over^80 Ammo Acids and 8 AmIno Acid Exact Match as Search Criteria). PioneerHl-Bred Intematlonal Inc. Study No. PHI-2008-238/074. DuPont AgriculturalBiotechnology, DuPont Experimental Station, Wilmington, Delaware 19880,USA. Report Completed on April 14, 2014.

Locke, M.E. and Igo, E. 2003. Characterization od DNA Inserted Into TransgenicCom Events DAS-45216-6 and DAS-59122-7. Pioneer Hi-Bred International,Inc., Study No. PHI-2002-038

Locke, M.E., Weber, N., Igo E., Dietrich N., Cressman R.F., Luckring A.K.,Sanders C.D., Hunt S.L., and Coats I. 2004. Summary of rrmlecularcharacterization for com rootworm-protected com event DAS-59122-7.Summary Report-2004-001. Pioneer Hi-Bred International Inc.

Mirsky, H dan Leathers, J. 2018. Comparison of the Ammo Acid Sequences of theCry34Ab1 and Cry35Ab1 Proteins to Known and Putative Protein Allergens.Pioneer Hl-Bred Intematlonal Inc. Study No. PHI-2018-041/201. DuPontAgricultural Biotechnology R&D. 8325 NW 62"", Johnston, lA 50141, USA.Report Completed on March 29. 2018.

Mirsky, H dan Challender, M. 2019. Comparison of the Cry34Ab1 and Cry35Ab1Protein Sequences to the Protein Sequences In the DuPont Pbneer ToxinDatabase. Pioneer Hl-Bred Intematlonal Inc. Study No. PHI-2019-036/211.DuPont Agricultural Biotechnology R&D, 8325 NW 62"", Johnston, lA 50141,USA. Report Completed on March 6, 2019.

Mirsky, H dan SItzmann, B. 2019. Comparison of the PAT Protein Sequence to theProtein Sequences In the DuPont Pioneer Toxin Database. Pioneer Hl-BredIntematlonal Inc. Study No. PHI-2019-041/211. DuPont AgriculturalBiotechnology R&D, 8325 NW 62"", Johnston, lA 50141, USA. ReportCompleted on March 6, 2019.

Moellenbeck, D.J., Peters, M.L., Bing, J.W., Rouse, J.R., HIggins, L.S., Sims, L.,Nevshemal, T., Marshall, L., Ellis, R.T., Bystrak, P.O., Lang, B.A., Stewart,J.L., Kouba, K., Sondag, V., Gustafson, V., Nour, K., Xu, D., Swenson, J.,Zhang, J., Czapla, T., Schwab, G., Jayne, S., Stockhoff, B.A., Narva, K.,Schnepf, H.E., Stelman, S.J., Poutre, C., Koziel, M., Duck, N. 2001.Insectlcldal Proteins from Bacillus thuringlensis Protect Com from ComRootworms. Nature Biotechnology 19:668-672

Pauli, B., Schmidt, J. dan Suit, T. 2015a. Expressed Trait Protein Concentration ofa Maize Une Containing Event DAS-59122-7: U.S. and Canada Test SitesPioneer Hl-Bred International Inc. Study No. PHI-2004-022/702. Pioneer Hi-Bred International, Inc. 7250 NW 62nd Avenue Johnston, lA 50131, USAReport Completed on March 3. 2015.

Pauli, B., Maxwell, 0. Huang, E. dan Suit, T. 2015b. Nutrient Composition of aMaize Line Containing Event DAS-59122-7: U.S. and Canada Test Sites.Pioneer Hl-Bred Intematlonal Inc. Study No. PHI-2004-022/700. EPL Bio

18

Analytical Services 9095 West Harristown Boulevard, Niantic, IL 62551. USA.Report Completed on February 27, 2015.

Scliafer, B.W. dan Collins, R.A., 2003. Characterization of PhosphinothricinAcetyltrasnferase (PAT) Derived from Transgenic Maize Event E4497.59.1.22(DAS-59122-7). Dow AgroSciences LLC Study No. 030027. DowAgroSciences LLC, 9330 Zionsville Road, Indianapolis, IN 46268-1054, USA.Report Completed on June 13, 2003.

Schafer, B.W., Collins, R.A., Sctiwedler, D.A., Xu, X.U. 2003. Characterization ofCry34Ab1 and Cry35Ab1 Proteins Derived from Transgenic Maize EventE4497.59.1.22 (DAS-59122-7). Dow AgroSciences LLC Study No. 030033.Dow AgroSciences LLC, 9330 Zionsville Road, Indianapolis, IN 46268-1054,USA. Report Completed on July 17, 2003.

Weber, N., and Igo, E. 2003. Characterization of Transgenic Com Event DAS-59122-7 to Investigate the Genetic Equivalence of the Inserted DNA within aSingle Generation. Pioneer Hi-Bred International, Inc., Study No. PHI-2003-012

Wohlleben, W., Arnold, W., Broer, I., Hiiiemann, D., Strauch, E., dan Puhler, A.1988. Nucleotide Sequence of The Phospinothricin N-acetyltransferase genefrom Streptomyces viridochronmgenes Tu494 and Its Expression in Nicotianatabacum. Gene. 70 (1988) 25-37.

Zhao, Z-Y., Gu, W., Cal, T., Tagliani, L., Hondred, D., Bond, D., et al. (2001). Highthroughput genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens inmaize. Mol. Breed. 8,323-333. doi: 10.1023/A:1015243600325

19