La terza dimensione nella depurazione La terza dimensione nella depurazione

extracorporeaextracorporea

XXIV Corso Nazionale di Aggiornamento

Giuseppe Palladino

Scientific Affairs Manager Bellco

XXIV Corso Nazionale di Aggiornamento, Riccione 12 Aprile 2015

Quali tossine uremiche dovrebbero essere rimosse?

Tossine UremicheTossine Uremiche

Piccole Molecole Peptidi e proteine a basso PM Tossine legate alle proteine• Indoxyl-solfato• Acido Ippurico (179)• Spermina(203)• Spermidina (145)• Putrescine (88)• p-cresolo (108)

albumina(66 k)

fattore Ba

endotelina(4,3 k)

ß2-microglobulina

Peptidi - AGE

leptina

(16 k)

interleuchine(21-26 k)

Tossine Uremiche

3,51 3,8 4,3 9,4 11,8 15 17,5 20 24 33 661,4

Peso Molecolare (kDa)

ß-endorfina(3,5 k)

fattore Ba(33 k)

Interleuchina-1(17,5 k)

calcitonina(3,8 k)

ß2-microglobulina(11,8 k)

Fattore D(24 k)

PTH(9,4 k)

angiogenina(14 k)

TNFα

(45 k)

Creatinina (113)Fosfati (96)Urea (60)Omocisteina (135)

Adattato da: Vanholder R et al, Kidney International (2003), 63; 1934-1943 4

water soluble

Protein bound

Middle molecules

Normal and Pathologic Concentrations of Uremic Toxins

46%

25%

28%

Duranton F et al. J Am Soc Nephrol 23: 1258–1270, 2012

Tipologia di “passaggio” dei soluti: diffusione

Fattore limitante: permeabilità diffusiva (Ko)

Soluti a piccolo peso ���

Soluti a medio-alto peso Soluti a medio-alto peso �

Selettività di rimozione in base al peso

molecolare

Piccole molecole

Medie molecole

Tossine legate alle proteine

Parte libera delle tossine legate alle proteine

Tipologia di “passaggio” dei soluti: convezione

Fattore limitante: permeabilità idraulica (Kuf)

Soluti a piccolo peso ��

Soluti a medio-alto peso ��Soluti a medio-alto peso

Nessuna selettività in base al peso molecolare

fino al cut-off della membrana

Piccole molecole

Medie molecole

Tossine legate alle proteine

Parte libera delle tossine legate alle proteine

Fattore limitante: emo-compatibilità dei sistemi

Rimozione più o meno selettiva, si evita la perdita di

nutrienti

Rimozione di tossine non dializzabili

La “terza dimensione”: adsorbimento

Rimozione di tossine non dializzabili

Possibilità di aumento della permeabilità della membrana

dialitica

Perché i sorbenti?

• Capacità di rimuovere specifiche tossine o classi di tossine

• es. β2 Microglobulina, citochine (sepsi)…

• Incrementare la rimozione di soluti oltre il trasporto convettivo/diffusivo

• es. tossine legate alle proteine

• Possibilità di uso orale

• per pazienti in CKD non ancora in dialisi (AST-120)

• Capacità di purificare il dializzato (riduzione acqua necessaria)

• es. Sistema REDY e successive modifiche

Vantaggi

• Permettono di rimuovere un particolare soluto e nello stesso tempo

evitano la perdita di altri

• Sorbenti altamente specifici permettono di rimuovere soluti specifici

• Rimozione non selettiva

• Sorbenti a bassa selettività possono rimuovere differenti soluti contemporaneamente• Sorbenti a bassa selettività possono rimuovere differenti soluti contemporaneamente

• Possono essere usati per il trattamento di avvelenamenti o per la rimozioni di tossine

del fegato

• Rimozione di tossine non dializzabili (o difficilmente dializzabili)

• L’adsorbimento di soluti permette la diffusione di altri e la liberazione di tossine

legate alle proteine

Animals / in vitro

Depurazione dell’urea

Emolisi

Severi effetti collaterali

Muirhead EE, Reid AFResin artificial kidney

J Lab Clin Med 1948; 33: 841-4

Amberlite IR-100 H

(Cation / anion exchange resin)

Scopo Effetti collaterali

L’uso dei sorbenti in sistemi di purificazione del sangue è

arte nota…

Avvelenamenti

(Pentobarbital)

Problemi con gli elettroliti

Emolisi

Reazioni febbrili

Schreiner GEThe role of hemodialysis (artificial kidney) in acute

poisoning

AMA Arch Intern Med 1958; 102 (6): 896 - 913

Lactate anion exchange resin

Shaldon S et al.

Sorbent regeneration of ultrafiltrate as a long-term

treatment of end-stage renal failure

Artif Organs 1978; 4: 343-7

Urease cartridge, zirconium phosphate (Redy ®)

Rigenerazione del dialisato

(HD) o uf (HF)

Problemi con gli elettroliti

Rilascio di alluminio

Che cos’è la cromatografia?

� Insieme di tecniche atte a separare una miscela

nei suoi componenti, per permetterne il

riconoscimento qualitativo e quantitativoriconoscimento qualitativo e quantitativo

� Basate sulla distribuzione differenziale dei vari

componenti il sorbente e l’eluente che fluisce in

continuo attraverso la fase fissa

Alcune definizioni

�Sorbente: Materiale poroso con elevata area

superficiale in grado di adsorbire differenti soluti

mediante forze intermolecolari

Eluente

Fase stazionaria

mediante forze intermolecolari

�Eluente (fase mobile): il vettore che provoca il

trasporto dei soluti all’interno della colonna

�Eluato: fase mobile contenente i soluti che

fuoriescono dalla colonna

Eluato

Come lavorano i sorbenti?

• Adsorbimento: adesione di una molecola alla superfice

• Generalmente è reversibile => equilibrio chimico

• Elevata concentrazione in soluzione => maggiore soluto legato

• Diversi meccanismi di legame:

• Forze di Van der Waals

• Legami a idrogeno

• Forze elettrostatiche

• Legami covalenti (molto rari)

Caratteristiche strutturali

• Elevate aree superficiali, diverse dimensioni dei granuli

• Aree superficiali tipiche vanno dai 300 – 800 m2/g

• Più piccole sono le particelle maggiore è la resistenza al flusso (aumento

pressioni)

pore diameter

Stephan Harm et al Blood Purif 2016;41:55–63

BEAD diameter

pore diameter

Fase mobile e fase stazionaria

� Sono scelte in modo che i componenti della miscela da separare si

distribuiscano tra le due fasi

� Quelli più affini alla fase stazionaria passeranno più tempo in questa

fase, quindi si sposteranno più lentamente attraverso il sistema

� Quelli più affini alla fase mobile si sposteranno invece più velocemente

Equilibrio e Ripartizione

La migrazione dei soluti è legata alla diversa affinità dei componenti per il sorbente e la

loro solubilità nel solvente

� La natura chimica delle sostanze da separare

� Tipo e la natura del solvente

� Tipo e la natura del sorbente

Tanto più kD è alta, tanto più il soluto trascorre tempo nella fase stazionaria e migra lentamente.

Am

As

Flusso fase mobile

kD(A) < k

D(B)

A B

A B

Teoria Cinetica: fattori influenzanti gli equilibri

� Velocità di flusso

� Percorsi multipli o alla diffusione vorticosa (A)

� Resistenza al trasferimento di massa (C)

Equazione di van DeemterEquazione di van Deemter Valore minimo di H

(max efficienza) per

valori bassi di μ.

J.J. van Deemter et al. Chem Eng Sci; 1956, 5 (6): 271-289

I meccanismi della separazione

E’ possibile suddividerli in base ai tipi di interazione tra le due fasi

� Adsorbimento

� Ripartizione

� Scambio ionico

� Esclusione

� Affinità

La fase stazionaria interagisce con i componenti da separare in maniera diversa con

l’effetto di diversificare la loro velocità e quindi il tempo di transito

Adsorbimento

• Fase stazionaria: granuli (o polvere stesa su un supporto)

• Possibilità di siti attivi sulla superficie che possono stabilire legami deboli con le

molecole della miscela da separare.

• Fase mobile: Può essere un gas o un liquido• Fase mobile: Può essere un gas o un liquido

Uso: utilizzata per separare sostanze neutre polari o

non polari, di natura organica o inorganica

Soluti adsorbiti sulla superfice della fase

fissa

Soluti disciolti nella fase mobile

Ripartizione

• Fase stazionaria: un liquido che impregna la superficie di un solido inerte. Le molecole da

separare sono solubili nel liquido

� Immiscibilità tra fase stazionaria e fase mobile

• Fase mobile: Può essere un gas o un liquido

• Durante l’eluizione le molecole si ripartiscono tra le due fasi secondo la diversa solubilità • Durante l’eluizione le molecole si ripartiscono tra le due fasi secondo la diversa solubilità

di ognuna

• Uso: separazione di sostanze organiche

• Si distingue in:

� fase normale: fase stazionaria più polare della fase mobile

� fase inversa: fase stazionaria meno polare della fase mobile. Fase fissa

Soluti disciolti

nella fase mobile

Soluti adsorbiti sulla

superfice della fase fissa

Scambio ionico

Fase stazionaria: polimero inerte contenente siti attivi ionizzati o

ionizzabili

Meccanismo di separazione: competizione per i siti di scambio tra gli ioni

presenti nella fase mobile e quelli presenti nel campione.

Uso: impiegata per la separazione

di sostanze ioniche o ionizzabili

Esclusione dimensionale

Fase stazionaria: solido poroso o un gel.

Meccanismo di separazione: i soluti si separano se hanno dimensioni compatibili con i pori del sorbente. Le molecole più grandi sono escluse ed escono per prima

Si parla di cromatografia di esclusione dimensionaleSi parla di cromatografia di esclusione dimensionale

(SEC)

• Gel permeazione per la separazione di sostanze

insolubili in acqua

• Gel filtrazione per la separazione di sostanze

solubili in acqua

Uso: separazione di molecole di grandi dimensioni

Affinità

Fase stazionaria: matrice solida con siti di legame specifici

Meccanismo di separazione: reazioni di tipo biochimico, reversibili e molto specifiche

Molecola A

Uso: separazione di molecole di

interesse prevalentemente biochimico

Ligando specifico per A

Altre molecole

non affini al

ligando

Idrofobicità - Idrofilicità

Sito polare Sito non polare

Siti polari sull’esterno in grado

di formare legami H con l’acqua

Regione interna idrofobica

siti di catena non polari

Come funziona le resine?

micro 1. Interfase

2. Intrafase

3. Sottile film superficiale

nano

4. Molecole grandi si legano

alla superficie

5. Quelle piccole diffondono

all’interno

6. Adsorbimento o Eluizione

L’idrofobicità o l’idrofilicità delle proteine gioca un ruolo importante nelle separazioni

Terapie adsorbitive: applicazioni biologiche

RitenzioneReinfusione

AlbuminaIgG

tempo

Tossine

Tossine

Effetto della velocità lineare

Flusso, ml/min Velocità lineare, cm/h

r= 2 r=4 r=6

30 143 36 1630 143 36 16

50 238 60 27

60 286 72 32

80 381 96 42

100 476 120 53

120 571 143 64

180 857 215 96

300 1429 359 159

r

Differenze nelle velocità lineari (r= 2 cm)

Situazione Ideale

Situazione reale

0 50 100 150 200 250 300 350

0

25

50

75

100

Ad

so

rbim

en

to (

%)

Velocità lineare, cm/h

Emo-perfusione

0 50 100 150 200 250 300 350

0

500

1000

1500

Flusso, ml/min

Velo

cit

à l

ineare

, cm

/h

Uf - Plasma perfusione

0 50 100 150 200 250 300 350

0

500

1000

1500

Flusso, ml/min

Velo

cit

à l

ineare

, cm

/h

Emo-perfusione vs Plasma/ultrafiltrato perfusione

Qb=180 ml/min

Quf ~ 30-50 ml/min

Flow rate

Qb=180-300 ml/minFlow rate

Quf ~ 30-50 ml/min

• Volume di sangue trattato maggiore

• Fouling Superfice

• Velocità lineare elevata

• Attivazione cellulare

• Adsorbimento Limitato

• Tempo di contatto maggiore tra resina e

plasma

• Maggiore diffusione e adsorbimento

• Migliore adsorbimento

Conclusioni

� L’uso di terapie extracorporee adsorbitive è in costante

aumento

� L’adsorbimento è governato dalle leggi delle cromatografia� L’adsorbimento è governato dalle leggi delle cromatografia

� La velocità lineare è un fattore differenziante

� La plasma/uf perfusione è preferibile all’emo perfusione

giuseppe.palladino@bellco.net