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LA TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN REVERSA EN LÍNEA PARA EL DIAGNÓSTICO DE BABESIA Y THEILERIA EN MEDICINA VETERINARIA
REVISIÓN NARRATIVA
CLAUDIA FERNANDA MEDINA LOMBANA CÓDIGO: 70410066
UNIVESIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
PROYECTO TRABAJO DE GRADO BOGOTÁ D.C. 2009
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LA TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN REVERSA EN LÍNEA PARA EL DIAGNÓSTICO DE BABESIA Y THEILERIA EN MEDICINA VETERINARIA
REVISIÓN NARRATIVA
Claudia Fernanda Medina Lombana
código: 70410066
Trabajo de grado para optar el título de
Médico Veterinario Zootecnista
Director:
Dr. Jorge Alexander León
Profesor Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales
M.V. Esp.
UNIVESIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
PROYECTO TRABAJO DE GRADO BOGOTÁ D.C. 2009
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Nota de aceptación: ___________________________ ___________________________ ___________________________ ___________________________ ___________________________ ___________________________
Dra. Sandra Stella Ujueta Decana facultad MVZ
____________________________ Jurado
Dr. Mairo Urbina Vicedecano facultad MV
_____________________________ Jurado
Dr. Jorge Alexander León G. Docente facultad MVZ
Director
Bogotá D.C, Octubre de 2009
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DEDICATORIA
A mis padres, quienes con su irremplazable afecto e interminable
colaboración, fabrican los escalones que me facilitan alcanzar todas las metas propuestas en mi vida. A todos aquellos que me han acompañado en el proceso de formación personal y académica.
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AGRADECIMIENTOS
Un agradecimiento muy especial al Dr. Jorge Alexander León, ya que sin su apoyo y orientación como director no hubiera sido posible la realización de este trabajo; y también, porque su entusiasmo despertó en mi el espíritu de la investigación.
Al Dr. Yimmy Vargas del Instituto de Genética de la Universidad Nacional, quien con sus conocimientos y enseñanza, fortaleció mi afinidad por la ciencia de la Biología Molecular e instauró en mí la necesidad de aprender de ella cada día más.
Agradezco a los jurados, ya que sus observaciones y recomendaciones, hacen que esta revisión sea un trabajo de excelente calidad y pueda cumplir con el objetivo de ser una herramienta útil para el campo de la Medicina Veterinaria.
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CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCIÓN 13
1. OBJETIVOS 15
1.1. OBJETIVO GENERAL 15
1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 15
2. MARCO TEORICO 16
2.1 HEMOPARASITOS 16
2.1.2 Babesia y Theileria 16
2.1.2 Biología y taxonomía de Babesia y Theileria 17
2.1.3 Babesiosis bovina y piroplasmosis equina 18
2.1.4 Diagnóstico de hemoparasitos 19
2.1.5 Técnicas más utilizadas para el diagnóstico de hemoparasitos 20
2.1.5.1 Extendido de sangre 20
2.1.5.2 Pruebas serológicas 20
2.1.5.3 Pruebas de biología molecular 21
2.2 HISTORIA Y DESARROLLO DE LA TECNICA DE HIBRIDACION REVRESA
EN LINEA (RLB) 21
2.3 FUNDAMENTO DE LA RLB 22
2.3.1 Procedimiento de la técnica 23
2.4 VENTAJAS DEL USO DE LA RLB 23
3. METODOLOGIA 25
3.1 TIPO DE ESTUDIO 25
3.2 POBLACION OBJETIVO DE LA REVISIÓN 25
3.3 CRITERIOS DE BUSQUEDA 25
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3.4 FUENTES 25
3.5 DESCRIPTORES DE BUSQUEDA 26 3.6 SELECCIÓN DE LA INFORMACIÓN 26
3.7 ORGANIZACIÓN DE LA INFORMACIÓN 26
3.8 REDACCIÓN DE LA REVISIÓN 28
4. RESULTADOS 29
4.1 DESCRIPCIÓN DE LOS ARTICULOS ANALIZADOS 29
4.2 USO DE LA RLB PARA EL DIAGNÓSTICO DE HEMOPARÁSITOS (BABESIA Y THEILERIA) EN SANGRE DE BOVINOS 33 4.3 CEBADORES UTILIZADOS Y DISEÑO DE SONDAS 38 4.4 ESPECIFICIDAD DE LA TECNICA DE RLB 40 4.5 SENSIBILIDAD DE LA TECNICA DE RLB 41 5. DISCUSIÓN 43 6. CONSLUSIONES Y RECOMENDACIONES 45 7. BIBLIOGRAFIA 46
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LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Descriptores de búsqueda 26 Tabla 2. Estructura de la Tabla para síntesis de estudios de la Primera selección. 27 Tabla 3. Estructura de la tabla para síntesis de los estudios Finalmente seleccionados. 28 Tabla 4. Región de estudio de los 20 artículos analizados. 31 Tabla 5. Institutos que desarrollaron los estudios seleccionados 32 Tabla 6. Análisis comparado de los 20 estudios sobre el uso de la RLB en las diferentes especies animales 33 Tabla 7. Análisis comparado de los 11 estudios sobre el uso de la RLB en sangre de bovinos 36 Tabla 8. Cebadores utilizados para la amplificación del gen V4 rRNA 18s. 38 Tabla 9.Cebadores utilizados en los estudios para amplificar la región V4 39 Tabla10.Sondas utilizadas para la técnica de RLB en los estudios 40
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LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Ciclo biológico de Babesia sp. 17 Figura 2. Representación esquemática de la RLB 23 Figura 3. Estructura del mapa conceptual 27 Figura 4. Porcentaje de los estudios seleccionados que fueron realizados en las diferentes especies animales 29 Figura 5. Porcentaje de los estudios seleccionados según el continente 30
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GLOSARIO
Apicomplexa: Grupo de protistas caracterizados por la presencia de un orgánulo único denominado complejo apical.
Babesia: protozoo del filo apicomplexa; parasito intracelular, que produce la enfermedad conocida como babesiosis en animales y seres humanos.
Biología molecular: Disciplina de la bioquímica que estudia la estructura, función y composición de las moléculas biológicamente importantes; como el ADN y ARN. Cebadores: Iniciadores de la PCR, también denominados primers, son oligonucleótidos sintéticos que hibridan con la región complementaria al ADN molde, que se desea amplificar y propician el inicio de la reacción de elongación por la Taq ADN polimerasa. Clamidias: Género de bacterias gramnegativas pertenecientes a la familia Chlamydiaceae, orden Chlamydiales, filo Chlamydiae.
Endémico: Enfermedad que se presenta sistemáticamente, de manera regular, y sin variaciones apreciables de población afectada dentro de un segmento demográfico.
Especificidad: Probabilidad de una prueba diagnóstica de definir en forma correcta a un individuo sano, es decir, la probabilidad de que un sujeto verdaderamente sano obtenga un resultado negativo en una prueba diagnóstica. Otra forma de definir la especificidad es la capacidad para detectar a los individuos sanos.
Extendido de sangre: Frotis sanguíneo, realizado para la observación directa al microscopio.
GenBank: Base de datos de secuencias genéticas del NIH (National Institutes of Health de Estados Unidos), es una colección de disponibilidad pública de secuencias de ADN. Es parte de International Nucleotide Sequence Database Collaboration, que está integrada por la base de datos de ADN de Japón (DNA DataBank of Japan (DDBJ)), El Laboratorio Europeo de Biología Molecular (European Molecular Biology Laboratory (EMBL)), y el GenBank en el National Center for Biotechnology Information.
Genotipo: Constitución genética de un organismo, Conjunto de los alelos de un individuo en uno, varios o todos sus loci.
Hemoglobinuria: Orina con residuos de hemoglobina.
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Hemoparásitos: Parásitos que se alojan en la sangre del hospedero.
Hibridación: Unión complementaria del ADN y el ARN.
Intraeritrocitarios: Organismos que viven dentro de los eritrocitos o glóbulos rojos.
Mycoplasmas: Género de bacterias que carecen de pared celular. Pertenece a la clase Mollicutes, que incluye bacterias que tienen genomas pequeños.
PCR: Polimerase Chain Reaction (Reacción en Cadena de la Polimerasa). Técnica de Biología Molecular descrita en 1986 por Kary Mullis; cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN en particular partiendo de un mínimo.
Protozoarios: Pertenecen al reino protista, son eucariotas y heterótrofos, existen aproximadamente 45.000 especies descritas.
Quimioluminiscencia: Reacción química que produce luz
Revisión sistemática: Resumen de evidencias, habitualmente realizada por un experto o panel de expertos en un tema determinado, que utiliza un riguroso proceso para minimizar los sesgos. Identifica, evalúa y sintetiza estudios para contestar a una pregunta clínica específica o extraer conclusiones sobre los datos recopilados.
Ricketssias: Género de bacterias que pertenecen a la familia Rickettsiaceae. Son parásitos intracelulares obligados, muy pequeñas, Gram-negativas y no forman esporas.
RLB: Reverse Line Blot (Hibridación Reversa en Línea). Técnica de biología molecular que se basa en el trabajo conjunto de la hibridación y la PCR; puesto que la esencia de la técnica es la hibridación de los productos de la PCR, con unas sondas (oligonucleótidos) inmovilizadas en una membrana, que posteriormente será visualizada mediante quimioluminiscencia.
Sensibilidad: Probabilidad de una prueba diagnóstica para clasificar correctamente a un individuo enfermo, es decir, la probabilidad de que para un sujeto enfermo se obtenga en una prueba diagnóstica un resultado positivo. La sensibilidad es, por lo tanto, la capacidad del test para detectar la enfermedad.
Theileria: Genero de parasito protozoario, perteneciente al filo apicomplexa; causante de la enfermedad conocida como theileriosis.
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INTRODUCCIÓN
Dentro de los parásitos de interés veterinario, los hemoparásitos agrupan una gran cantidad de agentes etiológicos causantes de enfermedades de gran trascendencia para la salud animal y salud pública mundialmente (Vivas et al, 2000), además generan continuamente pérdidas económicas importantes en diferentes tipos de producción animal; llegando incluso a ser impedimentos para el comercio internacional. Es por esto que son considerados un problema y deben ser detectados de forma rápida y eficiente para realizar un tratamiento oportuno. De aquí la importancia de los diversos métodos de diagnóstico existentes para los hemoparásitos; como el examen microscópico de extendidos sanguíneos y algunas pruebas serológicas como: Fijación de Complemento (FC), Inmunofluorescencia Indirecta de Anticuerpos (IFAT) y el Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA). Estos métodos serológicos se han empleado para el diagnóstico de infecciones clínicas y subclínicas en estudios epidemiológicos, pero han sido comunes los resultados falsos positivos y falsos negativos, pues las respuestas varían según el nivel de anticuerpos en la sangre del hospedero al momento de extraer la muestra (Vargas et al, 2004); esto ha afectado en gran medida realizar un diagnóstico certero y mejorar el diseño de programas de prevención, control y erradicación. Por lo tanto, se hace necesaria la utilización de métodos altamente sensibles y específicos (Altay et al, 2008), para garantizar un diagnóstico. En este contexto, las herramientas de la biología molecular han sido aplicadas al conocimiento de la patogénesis, susceptibilidad, diagnóstico y más recientemente al tratamiento de enfermedades, como las producidas por hemoparásitos. (Prichard et al, 2001) Es por esto que recientemente se han realizado estudios y desarrollado grandes avances en el diagnóstico basado en las técnicas de biología molecular. La secuenciación del genoma de múltiples parásitos está permitiendo grandes avances en el estudio de la biología y taxonomía de los parásitos (Allsopp et al, 2006), mejorando drásticamente el diagnóstico y control de los mismos. Los métodos moleculares pueden ser usados para identificar genotipos no típicos o variantes genéticas de parásitos cuando hay especies morfológicamente similares y no pueden ser distinguidas en extendidos de sangre (Birkenheue et al, 2004), como es el caso de Babesia y Theileria, los
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cuales son los hemoparásitos de mayor abundancia en las especies bovina y equina (Hunfeld et al, 2008). Técnicas para la detección de estos hemoparásitos han sido desarrolladas por separado para cada género y especie infectante; basadas principalmente en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), técnica altamente sensible. Aun así, es mucho más práctico desarrollar una prueba de tipo universal que permita detectar simultáneamente y diferenciar los hemoparásitos que puedan estar presentes en sangre de los animales (Gubbels et al, 1999). Una respuesta a este tipo de necesidad es la técnica de Hibridación Reversa en Línea o mejor conocida como RLB que son las siglas de su nombre en inglés (Reverse Line Blot), la cual se ha desarrollado para la identificación simultanea y diferenciación de diferentes especies de hemoparásitos incluyendo Babesia y Theileria (Altay et al, 2008). La RLB es una efectiva y practica herramienta, con la cual es posible detectar parásitos presentes en sangre, así se encuentren en números extremadamente bajos, por lo que podría ser considerada una herramienta útil al momento de diagnosticar animales con infecciones subclínicas (Nagore et al, 2004). Atendiendo al desarrollo que ha venido teniendo esta tecnología y el impacto de los hemoparásitos en la industria ganadera tanto a nivel mundial como local, este trabajo pretende además de resaltar dicho impacto, establecer la importancia de las técnicas de diagnóstico moleculares, haciendo énfasis en las de mayor utilidad para la realización de estudios epidemiológicos, como la RLB; puesto que estas pueden proveer datos de importancia para diseñar estrategias de control y tratamiento. De esta forma, se realizó una revisión narrativa de los estudios más relevantes sobre el uso de la técnica de Hibridación Reversa en Línea para el diagnóstico de hemoparasitos; principalmente Babesia y Theileria, en las diferentes especies animales, enfatizando en bovinos; se tomaron los estudios más importantes de los últimos 10 años (1999-2009); luego, mediante un análisis de los resultados y las discusiones generadas por estos, se establecieron conclusiones que pueden aportan información de interés al momento de implementar esta técnica como herramienta para el diagnóstico de hemoparásitos.
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1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL:
Realizar una revisión narrativa de los estudios más relevantes sobre el uso de la técnica de Hibridación Reversa en Línea (RLB) para el diagnóstico de Babesia y Theileria en medicina veterinaria.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 1. Describir aspectos relevantes sobre los hemoparásitos (Babesia y
Theileria), la enfermedad que generan y los métodos de diagnóstico.
2. Proporcionar información sobre los fundamentos de la técnica de
diagnóstico RLB y sus ventajas de uso.
3. Evaluar y dar a conocer la evidencia disponible del uso de la técnica de RLB en el diagnóstico de hemoparásitos en medicina veterinaria, principalmente para la detección de especies de Babesia y Theileria en sangre de bovinos; con el fin de proveer información de utilidad para estudios que se realicen posteriormente en Colombia.
4. Comparar, caracterizar y analizar la sensibilidad y especificidad de la técnica en diferentes estudios.
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2. MARCO TEORICO
2.1 HEMOPARASITOS Los animales domésticos están expuestos a diferentes microorganismos tales como bacterias, virus, Ricketssias, Mycoplasmas, Clamidias, hongos y protozoarios (Vivas et al, 2000). Dentro de estos agentes, los que actúan como hemoparásitos son importantes por generar enfermedades significativas para la salud animal y que suponen gran riesgo para la salud humana a nivel mundial. Entre los hemoparásitos que más afectan las especies bovina y equina, se tienen a Babesia y Theileria. (Hunfeld et al, 2008) 2.1.1 Babesia y Theileria Hacia el final del siglo XIX se reconoció que muchos organismos intraeritrocitarios causaban enfermedades en el ganado; tales como los protozoos Babesia y Theileria que son responsables de la mayoría de las enfermedades hemoparasitarias en ganado. Estos dos géneros son eucariotas pertenecientes al filo apicomplexa con un gran potencial de distribución por todo el mundo, asociado a la supervivencia de sus vectores. Al ser observados directamente al microscopio en extendidos de sangre de hospedadores infectados, resalta una característica común y es la apariencia en forma de pera; esta observación dio lugar a la denominación de “piroplasmas” del latín pirum=pera, (Allsop et al, 2006). La primera descripción de un piroplasma fue publicada por Babes en 1888 en sangre de ganado infectado de un microorganismo al que denomino Haemotococcus bovis, renombrado como Babesia bovis en 1893, el cual fue asociado con hemoglobinuria o fiebre del agua roja. La Theileria parva y T. anulata fueron descritas años después por Koch en 1898 (Allsop et al, 2006) y se asociaron con otra enfermedad conocida como “piroplasmosis tropical”. Otra enfermedad compleja mostrada en equinos conocida como fiebre biliar, fue considerada también según Koch causada por dos organismos patógenos ahora conocidos como Babesia caballi y Theileria equi (antes conocida como Babesia Equi), (Allsop et al, 2006).
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2.1.2 Biología y taxonomía de Babesia y Theileria
Los Protozoarios apicomplexos incluyendo genero Babesia y su pariente cercano Theileria generalmente pasan por tres etapas de reproducción: gametogonia que corresponde a la fusión de gametos dentro de la garrapata; esporogonia que se refiere a la reproducción asexual en glándulas salivales; y merogonia que corresponde a la reproducción asexual en el hospedador vertebrado. (Figura 1). (Hunfeld et al, 2008). Figura 1. Ciclo biológico de Babesia sp.
(SZ: esporozoito, T: trofozoito, M: merozoito, G: gametocitos, Sk: Strahlenkörper, Z:
cigotos, K: kineto, E: huevos, Sg: glandula salival, St: esporoblasto. (Hunfeld K. P. et al, 2008).Fuente: (Hunfeld K.P. et al, 2008)
No obstante estos dos géneros de hemoparasitos poseen algunas diferencias en cuanto a su forma de transmisión y cinética tanto dentro de los vectores como de los hospedadores, las cuales se detallan a continuación. Desarrollo en la garrapata. La garrapata se infecta cuando ingiere células sanguíneas que contienen piroplasmas, se ha considerado que probablemente estos se encuentren en sus etapas tempranas; dentro de la garrapata desarrollan gametos femeninos o macrogametos y masculinos o microgametos, los que se fusionan y forman cigotos motiles (ookinetos)
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(Melhorn y schein, 1984; citado por Uielenberg, 2006), a partir de este punto se diferencian las siguientes fases de desarrollo entre Babesia y Theileria. Los ookinetos de Babesia invaden numerosos órganos de la garrapata, incluyendo glándulas salivales y ovarios; de esta forma la infección pasa a través del ovario al huevo y así a la siguiente generación, esta transmisión es llamada transovarica, la garrapata también se infecta al tener contacto con un hospedador infectado. En cambio los cigotos de Theileria no invaden los ovarios y por tanto no se transmiten transovaricamente, pero invaden la hemolinfa de la garrapata, hasta llegar a las glándulas salivales; allí maduraran a esporogonias y cuando la garrapata ataque a un nuevo hospedador, este se infectara por la inoculación de esporozoitos junto con la saliva; para que otro vector se infecte se requiere que ataque a este mismo hospedador, dicha transmisión es conocida como transestadial, (Uilenberg, 2006). Desarrollo en el hospedador vertebrado. Los esporozoitos inoculados dentro del hospedador junto con la saliva del vector, van directamente a infectar las células sanguíneas principalmente, donde se produce su multiplicación la cual generalmente resulta en dos o hasta cuatro células hijas conocidas como merozoitos, los cuales por distintos mecanismos provocan la lisis de las células infectadas e invaden nuevas células para continuar su multiplicación hasta la muerte del hospedador o hasta que el sistema inmune ponga fin a la propagación del parasito, (Uilenberg, 2006; Homer et al, 2000). La diferencia entre Babesia y Theileria radica en que la Babesia infecta directamente los glóbulos rojos, mientras que los esporozoitos de Theileria penetran en los linfocitos, donde se desarrollan a esquizontes. Posteriormente el merozoito sale del linfocito y entra a la célula roja donde madura y se multiplica formando tétradas, algunas veces formando lo que se conoce como la “Cruz de Malta”, (Melhorn et al, 1993 citado por Homer et al, 2000). 2.1.3 Babesiosis bovina y piroplasmosis equina La Babesiosis y la piroplasmosis son las enfermedades causadas por parásitos protozoarios del género Babesia y Theileria; estos infectan y causan enfermedad a múltiples mamíferos; incluyendo bovinos y equinos. La Babesiosis bovina es causada principalmente por B bigemina, B. bovis y B divergens, generalmente, la B. bovis es mas patógena que la B. bigemina y B divergens; el vector principal son las garrapatas del genero Rhipicephalus
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(Boophilus) microplus, que se encuentran ampliamente distribuidas en los trópicos y subtropicos; otros vectores importantes incluyen: Ixodes ricinus, Haemaphysalis sp y Rhipicephalus spp. (Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), 2004) Las infecciones se caracterizan por fiebre alta, hemoglobinuria, anemia, anorexia, y algunas veces signos nerviosos como el resultado del secuestro de eritrocitos infectados en los capilares cerebrales, (OIE, 2004). La piroplasmosis equina es causada por T. equi y B. caballi. Aproximadamente 14 especies de garrapatas del genero Dermacentor sp, Rhipicephalus sp. y Hyalomma sp., son capaces de transmitir los dos parásitos. Los signos clínicos son variables y no específicos; en casos hiperagudos los animales pueden encontrarse muertos o agonizando, sin embargo, generalmente la piroplasmosis se presenta en su forma aguda, en la cual se observa fiebre que puede exceder los 40°C, depresión, inapetencia, membranas mucosas ictéricas, disnea, aumento en frecuencia cardiaca y respiratoria, adicionalmente pueden encontrarse otros signos como; hemorragias petequiales, edemas, incoordinación y cólico. La destrucción intravascular masiva de eritrocitos parasitados puede resultar en hemoglobinuria. Los signos subagudos son menos severos y la infección crónica resulta en variables presentaciones clínicas con signos como: inapetencia, pérdida de peso, fiebre transitoria, intolerancia al ejercicio y anemia entre otras, (Zobba et al, 2008). 2.1.4 Diagnóstico de hemoparásitos Las enfermedades hemoparasitarias como la piroplasmosis son consideradas endémicas en varias regiones del mundo, que incluyen: Europa, África, Asia y América (Bhoora et al, 2009). Por lo tanto, el diagnóstico de esos agentes patógenos se convierte en un asunto estratégico para estas regiones y por ende debe ser muy eficiente y realizado mediante pruebas que además de ser efectivas sean de bajo costo, ya que la mayoría de los países afectados poseen bajos recursos o destinan muy pocos para el mejoramiento de sus producciones agropecuarias. Actualmente existen diversas técnicas que son implementadas para el diagnóstico de hemoparásitos, estas pueden ser de tipo directo o indirecto; las técnicas de diagnóstico directo se basan principalmente en la observación del hemoparásito, tales como: el examen por microscopía de extendidos de sangre o los cultivos in vitro. Por otro lado, las técnicas de tipo
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indirecto buscan identificar la presencia del hemoparásito a través de la respuesta inmune frente a los mismos. Asimismo, los avances de la biología molecular han generado herramientas de utilidad para el diagnóstico de hemoparásitos, reportando buenos resultados en la realización de estudios epidemiológicos, (Sparagano et al, 2000; Georges et al, 2001; Salih et al, 2007). 2.1.5 Técnicas más utilizadas para el diagnóstico de hemoparásitos: 2.1.5.1 Extendido de sangre Esta es la prueba tradicional para el diagnóstico de hemoparásitos (OIE, 2004), puesto que es fácil de realizar y de bajo costo, pero poco confiable, ya que por lo general registran cierta proporción de falsos negativos, dependiente de la cantidad de parásitos en la sangre, que en algunas infecciones puede ser baja o fluctuante. Este es un método de baja sensibilidad para el diagnóstico, y poco confiable para diferenciar entre parásitos, (Asgarali et al, 2007). El diagnóstico se basa en identificar la presencia de los hemoparásitos en las células sanguíneas y en la identificación del género y especie del mismo, según su morfología y el daño que se observe en las células, para esto se requiere de cierta experticia. 2.1.5.2 Pruebas serológicas
Actualmente hay disponibles pruebas, como la Fijación del Complemento, Inmunofluorescencia Indirecta de Anticuerpos y los Ensayos Ligados a Enzimas; las cuales están aceptadas para el comercio internacional de animales; pero, sus resultados varían según el nivel de anticuerpos en la sangre del hospedero al momento de extraer la muestra. (Vargas et al, 2004). Las pruebas serológicas se han empleado para el diagnóstico de infecciones agudas y subclínicas, y en estudios epidemiológicos, pero es frecuente tener resultados falsos positivos y falsos negativos, debido a reacciones cruzadas o a respuestas inmunoespecificas. (Altay et al, 2008) Aunque las técnicas de referencia citadas por USDA (United State Departament of Agriculture) y la OIE, son la FC y la IFAT, para el diagnóstico de las infecciones por hemoparásitos (Theileria y Babesia), estas no permiten
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la diferenciación entre las especies y no descartan falsos negativos. (Vargas et al, 2004) 2.1.5.3 Pruebas de biología molecular Los avances en las técnicas de biología molecular han dado lugar a mejorar la detección, identificación y caracterización genética de muchos hemoparásitos. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), es una de las más utilizadas y se ha aplicado para la detección de diferentes especies de Babesia y Theileria, y ha demostrado tener mayor sensibilidad y especificidad comparada con los ensayos serológicos, (Bhoora et al, 2009). La PCR ofrece una plataforma ideal para el desarrollo de una gran variedad de pruebas moleculares para la identificación y cuantificación de los agentes infecciosos de interés clínico (Costa, 2004); como la PCR a tiempo real, la PCR anidada (Battsetseg et al, 2001), la PCR-RLB (Reverse Line Blot) (Gubbels et al, 1999), la PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphism) (Heidarpour et al, 2009) y PCR- minisatelites (Oura et al, 2004). De otro lado, se han desarrollado técnicas como la amplificación isotérmica en circuito (LAMP) (Alhassan et al, 2007). En conclusión las técnicas moleculares se han desarrollado ampliamente, gracias a la mejor sensibilidad y especificidad para la detección de agentes como los hemoparásitos y por ende se han convertido en una herramienta esencial para el apoyo en el diagnóstico.
2.2 HISTORIA Y DESARROLLO DE LA TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN REVERSA EN LÍNEA (RLB)
La RLB fue desarrollada en un principio para la identificación de serotipos de Streptococcus, por Kaufhold et al (1994); luego fue utilizada para la diferenciación de cepas de Mycobacterium tuberculosis por Kamerbeek et al (1997); la primera aplicación para la detección y diferenciación de patógenos encontrados en garrapatas, fue para Borrelia por Rijpkema et al (1995) y posteriormente fue combinada para detectar Erlichia, (Gubbels et al, 1999; Isogen Life Science, 2004. Gubbels et al (1999), desarrollaron la técnica para la detección y diferenciación de diferentes especies de Babesia y Theileria en sangre bovina. Esta técnica se desarrollo con el fin de poder detectar y diferenciar
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simultáneamente varios parásitos que pudieran encontrarse en la sangre de ganado infectado. Se ha utilizado para la caracterización de Babesia divergens en casos humanos, incluso nuevas especies de Babesia y Theileria se han descubierto, a través de su aplicación, (Isogen Life Science, 2004; Nijhof et al, 2003). La técnica de RLB ha sido utilizada para la detección y caracterización de diferentes especies de Babesia y Theileria en caballos (Nagore et al, 2004; Bhoora et al, 2009), ovejas (Nagore et al, 2004; Qingli Niu et al, 2009), bovinos (Brigido et al, 2004), felinos salvajes (Boosman et al, 2007), jirafas y antílopes (Oosthuizen et al, 2009); e incluso se ha desarrollado para la detección e identificación de piroplasmas en garrapatas (sparagano et al, 2000). Estas aplicaciones han convertido a la RLB en una herramienta molecular para el diagnóstico, ampliamente utilizada en estudios epidemiológicos en todo el mundo. 2.3 FUNDAMENTO DE LA RLB
Esta técnica está basada en el trabajo conjunto de la hibridación y la PCR; puesto que la esencia de la técnica es la hibridación de los productos de la PCR, con sondas inmovilizadas en una membrana, con un respectivo orden de identificación, lo que permite analizar múltiples muestras y realizar una detección simultánea de múltiples agentes patógenos, (Gubbels et al, 1999). Después de la hibridación de sondas y productos de PCR, se realiza la visualización de la reacción; esta se basa en quimioluminiscencia; para la cual se requiere que el producto del PCR se encuentre biotinizado; la biotina marcara el lugar donde el producto del PCR se haya hibridado a la sonda, posteriormente se detectará mediante la adición de un conjugado de peroxidasa-streptavidina que reaccionará con la biotina, generando una luz azul, que puede ser captada por una película de rayos-x, (Isogen Life Science, 2004). Un aspecto importante de esta técnica es la región amplificada que se detectará pues esta debe reunir las condiciones de ser altamente conservada y poseer segmentos altamente variables, lo cual le permitirá tener una buena sensibilidad. Por ejemplo, para la detección de Babesia y Theileria se utiliza la región hipervariable V4 del gen RNA ribosomal de la subunidad 18s, para ser amplificada, debido a que este gen contiene regiones altamente
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conservadas y regiones variables; las regiones conservadas proveen una ventaja practica para el diseño de cebadores, y las regiones variables para el diseño de sondas altamente especificas. (Allsop, et al, 2006), de esta forma se han diseñado oligonucleótidos (sondas) de regiones especificas del gen, para detectar y diferenciar variedad de especies, (Gubbels et al, 1999). 2.3.1 Procedimiento de la técnica. Se realiza la extracción de ADN del paciente, el cual es sometido a PCR bajo los cebadores establecidos; posteriormente las sondas especie-especificas diseñadas o tomadas del GenBank, se colocan en forma lineal usando un minibloter y son unidas covalentemente a la membrana. Los productos de la PCR biotinizado, son aplicados a la membrana también usando el minibloter, en dirección perpendicular a las sondas; luego tomara lugar la hibridación (sonda-producto PCR), que podrá ser visualizada mediante la reacción de quimioluminiscencia que es registrada en una película de Rayos X. (Isogen Life Science, 2004; Manual Reverse Line Blot Hibridisation, 2004; Gubbels et al, 1999) Figura 2. Representación esquemática de la RLB
Fuente: Isogen Life Science, 2004
2.4 VENTAJAS DEL USO DE LA RLB
Dentro de las ventajas de uso de esta técnica esta el poder realizar la detección y diferenciación simultanea de diferentes especies de parásitos, haciendo posible una reducción en el costo del diagnóstico, porque múltiples patógenos pueden ser detectados en una misma prueba, (Gubbels, et al, 1999; Sparagano et al, 2000, Georges et al, 2001).
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La técnica de RLB puede ser usada para detectar la presencia del patógeno tanto en el hospedador como en el vector (Sparagano et al, 1999) y puede ser considerada como una herramienta para el diagnóstico de infecciones por piroplasmas no solo en animales que muestren signos clínicos sino también en aquellos aparentemente sanos con potencial de una infección subclinica; esto es poco probable con el uso de técnicas como extendidos de sangre y las pruebas serológicas. De esta forma, con la RLB es posible detectar animales transmisores más eficientemente y proveer información útil para estudiar la epidemiologia y diversidad de piroplasmas en distintas regiones, (Nagore et al, 2004). La RLB posee ciertas ventajas sobre otras técnicas de diagnóstico utilizadas; es una técnica rápida; solo se requiere el tiempo necesario para realizar la extracción de ADN (máximo 2 horas), la PCR (15-20 minutos máximo) y posteriormente realizar la hibridación de las sondas con el producto de la PCR (máximo 3 horas); es práctica, puesto que en un solo test se analizan múltiples muestras y no se convierte en una técnica dispendiosa en la cual se deba realizar el procedimiento para cada muestra, como por ejemplo para los extendidos de sangre; para realizarla se requiere disponer de un laboratorio que contenga mínimo equipos como; un termociclador, centrifugas, incubadora, pipetas y un miniblotter. El personal encargado de realizarla solo requiere seguir cada paso al pie de la letra como se indica en el manual de operación o protocolo estandarizado; teniendo muy en cuenta los puntos claves, para evitar los resultados erróneos. Por todo esto, el método de RLB se ha convertido en una efectiva y práctica herramienta en cuanto a su uso, con la cual es posible detectar hemoparásitos aun cuando el hospedador posea niveles de parasitemia extremadamente bajos y simultáneamente identificar especies de Theileria y Babesia usando sondas de oligonucleótidos específicas, (Altay et al, 2008).
24
3. METODOLOGÍA 3.1 TIPO DE ESTUDIO Revisión de literatura; realizada a través de una estrategia organizada y coherente de búsqueda, selección y análisis de la información que facilito la redacción de una síntesis critica a partir de los estudios encontrados. 3.2 POBLACION OBJETIVO DE LA REVISION La población objeto de la revisión son los artículos que hayan desarrollado la técnica de Hibridación Reversa en Línea para el diagnóstico de hemoparasitos en medicina veterinaria; de los últimos 10 años (1999-2009). 3.3 CRITERIOS DE BUSQUEDA Para la búsqueda de las publicaciones se tendrán en cuenta los siguientes criterios de inclusión y exclusión. Criterios de inclusión:
Publicados en los últimos 10 años
Estudios veterinarios
Babesia y Theileria
Reportes de caso
Estudios epidemiológicos
Ingles y español Dentro de la búsqueda se priorizaron estudios que establecían datos de sensibilidad y especificidad de la técnica. Criterios de Exclusión: Se excluyeron artículos no relacionados con el tema en estudio; además de aquellos que no se encontraron disponibles en la base de datos. No se incluyeron literatura no indexada, ni editoriales. 3.4 FUENTES A continuación se enumeran las bases de datos de literatura científica en salud indexada nacional e internacional que se utilizaron en la búsqueda de referencias.
25
Bases de datos internacionales: Medline: Base de datos de literatura biomédica internacional de la Biblioteca Nacional Médica de los Estados Unidos Science Direct: acceso al texto completo, sumarios y resúmenes de 1707 revistas de las editoriales Elsevier, Pergamon, Excerpta40 Medica y North Holland. Además ofrece los sumarios y resúmenes de un total de 2900 revistas de un producto adicional de Elsevier denominado ScienceDirect Research Database. Estas revistas han sido seleccionadas de otras bases de datos producidas por Elsevier como Beilstein (química orgánica), Compendex (ingeniería), Embase (biomedicina) y Geobase (ciencias de la Tierra y medio ambiente). Springer Link: Colección de 1345 revistas digitales con cobertura en arquitectura, economía, medicina, física y química, matemáticas, ingeniería, informática, medio ambiente, humanidades, astronomía, biomedicina, ciencia de vida, medicina clínica y humanidades. 3.5 DESCRIPTORES DE BUSQUEDA Se utilizaron descriptores como: Babesia, Theileria, Molecular Detection, PCR, Reverse Line Blot; también en el buscador Google académico, utilizando como palabras claves: haemoparasites, RLB. Los registros encontrados oscilaron entre 30 y 60, tras la combinación de las diferentes palabras claves. Tabla 1. Descriptores de búsqueda
código Termino de búsqueda Combinación de términos
Ítem
1 Babesia 1-2, 1-2-3 Agente etiológico 2 Theileria 2-1, 2-1-3
3 Haemoparasites 3, 3-2-1, 3-1-2
4 Molecular detection 4-3, 4-1-2, 4 Técnica de diagnóstico
5 Reverse Line Blot 5-4-3,5-1-2, 5
6 PCR 6-4-3,6-1-2,6-5-3
7 RLB 7-4,7-4-3, 7-1-3
26
3.6 SELECCIÓN DE LA INFORMACIÓN Se seleccionaron los estudios que cumplían con los criterios de inclusión y que fueron realizados en regiones endémicas, entendidas como tales las regiones tropicales o subtropicales en donde se ha reportado la enfermedad con frecuencias altas (prevalencia e incidencia), también se enfatizo en los estudios que utilizaron sangre de bovinos como muestra analizada. 3.7 ORGANIZACIÓN DE LA INFORMACIÓN
La información obtenida fue organizada siguiendo una guía, que se desarrolló en forma de mapa conceptual (figura 3), elaborado con un orden lógico; donde se fue introduciendo la información secuencialmente. La información relevante encontrada se fue colocando en cada ítem del mapa conceptual, de esta forma se combino la información de diferentes fuentes, para facilitar posteriormente la redacción de la revisión. Figura 3. Estructura del mapa conceptual Para complementar el mapa, se elaboraron dos tablas de análisis (tabla 1 y 2), donde se incluyo la información esencial procedente de cada estudio, para cumplir con el objetivo de comparación. Estas tablas ayudaron a
Conclusiones
Recomendaciones
Revisión sobre el
uso de RLB para el
diagnóstico de
hemoparasitos
Marco teórico
(Babesia y Theileria)
(Historia y desarrollo de la RLB)
(Fundamento de la RLB)
(Ventajas del uso de la RLB)
Resultados, discusión y
conclusión
(sensibilidad y especificidad)
Fuentes
bibliográficas
Fuentes
bibliográficas
27
identificar los hallazgos comunes entre los diferentes estudios y a comparar y contrastar los resultados. Tabla 2. Estructura de la Tabla para síntesis de estudios de la primera selección
N° Autor y año
Pal. claves Región
Esp. animal
Tipo de muestra
Uso
Tabla 3. Estructura de la tabla para síntesis de los estudios finalmente seleccionados
3.8 REDACCIÓN DE LA REVISIÓN
Finalmente luego de haber hecho una síntesis de la información recolectada, se procedió a hacer la redacción con los datos más relevantes para cumplir con los objetivos propuestos; esta se realizó siguiendo el orden establecido en el mapa conceptual (Figura 3).
Autor y año Titulo Tipo de muestra
Resultados
Sensibilidad Especificidad
28
4 RESULTADOS
4.1. DESCRIPCIÓN DE LOS ARTICULOS ANALIZADOS. La RLB ha sido aplicada en diferentes tipos de estudios para el diagnóstico de hemoparásitos en medicina veterinaria, principalmente para determinar prevalencia de esta enfermedad y la utilidad de la técnica. Veinte artículos fueron seleccionados inicialmente, según los criterios establecidos en la metodología; de estos, 11(55%) fueron realizados en bovinos, 4(20%) en animales silvestres, 3(15%) en ovejas y cabras y 2(10%) en equinos (Figura 4). Figura 4. Porcentaje de los estudios seleccionados que fueron realizados en las diferentes especies animales
Estos datos indican que la especie más utilizada para el estudio de los hemoparásitos, utilizando esta técnica, ha sido la bovina y en proporciones más bajas las restantes especies; situación probablemente asociada al impacto económico de la infección en esta especie y la necesidad de disponer de herramientas de diagnóstico agiles y precisas.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
bovinos an silvestres ovejas ycabras
equinos
% De estudios realizados en diferentes especies
% de estudios realizados endiferentes especies
29
Todos los autores utilizaron sangre como muestra analizada, aunque algunos recurrieron también a tejidos como bazo y encéfalo; estos, fueron principalmente los estudios que se desarrollaron en animales clínicamente enfermos y a los que se les hizo necropsia, como fueron los trabajos realizados en especies silvestres (Oosthuizen et al, 2009; Nihjof et al, 2003); otros recolectaron y utilizaron garrapatas, para complementar los estudios epidemiológicos, (Georges et al 2001; Sparagano et al, 2000; Bekker et al, 2002 y M´ghirbi et al, 2008). Los estudios se realizaron principalmente en regiones endémicas de África (Uganda, Swazilandia, Namibia, Tunisia, Sudan, Sudáfrica, y Mozambique), algunas regiones de España (Toledo, Cádiz, Basque Country y Norte de España), Italia (Sicilia), China y Turquía (Kayseri, Tokat, Amasya, Gumushane, Giresun, Trabzon). (figura 5 y tabla 4), tan solo se reportó uno realizado en América (Argentina); esto se debe a que los estudios se desarrollaron principalmente en regiones con reporte de brotes de enfermedades transmitidas por garrapatas, que han generado importantes pérdidas económicas, como es el caso de la Fiebre de la Costa Este en África. Figura 5. Porcentaje de los estudios seleccionados según el continente
30
Tabla 4. Región de estudio de los 20 artículos analizados.
La mayoría de estos estudios fueron desarrollados por instituciones como: la Universidad de Utrecht en los Países Bajos, la Universidad de Pretoria en Sudáfrica, el Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER), y el Instituto Zooprofiláctico Experimental de Sicilia; dirigidos bajo las facultades de medicina veterinaria y los departamentos de parasitología y enfermedades tropicales. (Tabla 5)
31
Tabla 5. Institutos que desarrollaron los estudios seleccionados AUTOR ESTUDIO REALIZADO POR:
Gubbels et al, 1999 Universidad Utrecht (Utrecht- Países bajos), (Facultad de medicina
veterinaria, departamento de parasitología y medicina veterinaria tropical) Instituto Nacional de Salud Pública y Medio Ambiente (Netherlands) (laboratorio de investigación para las enfermedades
infecciosas), Universidad de Granada (Granada-España) (facultad de
farmacología, departamento de parasitología)
Sparagano et al, 2000 Universidad Heriot-Watt (Edimburgo)(departamento de ciencias
biológicas), Universidad Utrecht (Utrecht- Países bajos), (facultad de medicina
veterinaria, división de parasitología y medicina veterinaria tropical), Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia. (Sicilia)
Georges et al, 2001 Universidad Utrecht (Utrecht- Países bajos) (facultad de medicina
veterinaria, división de parasitología y medicina veterinaria tropical), Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia, Universidad Heriot-Watt (Edimburgo) (departamento de ciencias biológicas), Universidad de Newcastle (New Castle-Inglaterra)(departamento de agricultura)
Nagore et al, 2004 Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER)(Berreaga-España)(departamento de salud animal)
Oura et al, 2004 Universidad Makerere (Uganda-Africa))(facultad de medicina
veterinaria, departamento de microbiología y parasitología), Escuela Veterinaria Glasgow (Glasgow-Escocia)((departamento de
parasitología veterinaria), International Livestock Research Institute Kenya.(Kenia)
Brigido et al, 2004 Universidad Nova de Lisboa (Lisboa-Portugal)(instituto de higiene y
medicina tropical, unidad de virología, centro de malaria y otras
enfermedades tropicales), Polo Universitario Alto da Ajuda (Lisboa-Portugal)( facultad de
medicina veterinaria)
Altay et al, 2008 Universidad de Firat (Elazig-Turkia) (facultad de medicina veterinaria,
departamento de parasitología)
Bhoora et al, 2009 Universidad de Pretoria (Sudafrica)(facultad de ciencia veterinaria,
centro de investigación equina, departamento de veterinaria enfermedades
tropicales), Universidad Utrecht (Utrecht- Países bajos) (facultad de medicina
veterinaria ,departamento de enfermedades infecciosas e inmunología, centro Utrecht para las enfermedades transmitidas por garrapatas), Agricultural Research Council - Onderstepoort Veterinary Instituto
Oostuhizen et al, 2008 Universidad de Pretoria (Sudafrica) (facultad de ciencia veterinaria,
departamento veterinario de enfermedades tropicales), Agricultural Research Council - Onderstepoort Veterinary Institute
Oosthuizen et al, 2009 Universidad de Pretoria (Sudafrica) (facultad de ciencia veterinaria,
departamento veterinario de enfermedades tropicales) Nagore et al, 2004 Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (España)
(departamento de salud animal). Nijhof et al, 2003 Universidad Utrecht (Utrecht- Países bajos),
Universidad de Pretoria (Sudafrica), Ministerio Del Agua Y Desarrollo De La Ganadería (Arusha-Tanzania)(centro de investigación veterinaria), Sociedad Zoológica de Frankfurt (Tanzania)
32
Pethrigh et al, 2008 INTA, Buenos Aires
Bekker et al, 2002 Universidad Utrecht (Utrecht-Paises bajos)(división de bacteriología
y de parasitología y medicna veterinaria tropical), Universidad de Pretoria (Sudafrica) (departamento veterinario de
enfermedades tropicales)
Quingli Niu et al, 2009 Lanzhou Veterinary Research Institute, laboratorio de veterinaria parasitología, China.
Boosman et al, 2007 Universidad de Pretoria (Sudafrica)(departamento de veterinaria
enfermedades tropicales)
Salih et al, 2007 Research Center Borstel (Borstel-Alemania)( división de veterinaria
infección biología e inmunología), Al Amarat (Sudan)(central de laboratorios de investigación veterinaria)
San Martin et al, 2006 Instituto Vasco de investigación y desarrollo agrario NEIKER (departamento de salud animal).(España)
M’Ghirbi et al, 2008 Instituto Pasteur de Tunisia, NEIKER
Ica et al, 2006 Universidad Erciyes (Turkia) (facultad de medicina veterinaria,
departamento de parasitología).
4.2 USO DE LA RLB PARA EL DIAGNÓSTICO DE HEMOPARÁSITOS (BABESIA Y THEILERIA) EN SANGRE DE BOVINOS Esta revisión enfatizó en los trabajos que analizaron sangre de bovinos en búsqueda de Babesia y Theileria, y que establecían sensibilidad y especificidad de la técnica, como se mencionó en la metodología; de los 20 artículos, 11 fueron finalmente seleccionados y posteriormente analizados. (Tabla 6 y 7) Tabla 6. Análisis comparado de los 20 estudios sobre el uso de la RLB en las diferentes especies animales
N Autor y año Pal. claves Esp.
Animal
Tipo de
muestra
Uso
1 Gubbels et
al 1999
Bovinos Muestras de sangre
De Animales
experimentalmente
infectados
Uso de RLB para detección de diferentes especies de Babesia y
Theileria en ganado
2 Sparagano
et al, 2000
Bovinos Muestras de sangre y garrapatas
Uso de RLB para diagnóstico de especies de theileria y babesia de
Ganado en Italia
33
N Autor y año Pal. claves Esp.
Animal
Tipo de
muestra
Uso
3 Georges et al, 2001
Cattle; Epidemiology; Ticks; Reverse line blot; Sicily;
Tick-borne diseases; PCR
Bovinos Muestras de sangre y garrapatas
Se utilizo la técnica de RLB para determinar la
prevalencia de hemoparásitos en Sicilia
4 Nagore et al,
2004
Theileria equi; Babesia caballi;
Equine piroplasmosis;
PCR; RLB; Tick-borne diseases
Equinos
muestras de sangre
de caballos de carreras
examinación hematológica y microscópica
uso de RLB para la
detección e identificación de especies de Theileria
y Babesia
5 Oura et al, 2004
Theileria parva; Carrier;
Diagnosis; Reverse line blot
Bovinos Muestras de sangre
de ganado, nativo,
cruzado y exotico
Aplicación de la técnica de RLB para la detección de
hemoparásitos. Comparación de la
sensibilidad de RLB y PCR de secuencias de
minisatelites.
6 Brigido et al, 2004
Bovine Mirandesa
breed; RLB; Phylogenetic
analysis
Bovinos muestras de sangre de ganado adulto de
raza mirandesa
*análisis microscópico *PCR según Gubbels * amplificaicon de un
fragmento de la región V4, según Gubbels
7 Altay et al, 2008
Theileria, Babesia,PCR Reverse line blot; Cattle
Turkey
Bovinos Muestreo de sangre Ganado
aparentemente sano
Detección de babesia y theileria basada en la
amplificación por PCR y RLB.
Los resultados de la RLB fueron comparados con
los extendidos de sangre
8 Bhoora et al, 2009
Theileria equi Babesia caballi
Reverse line blot hybridization
18S rRNA gene
Equinos Muestra de sangre
Explorar los niveles de hetereogeneidad genética entre las
especies de T y B en sur Africa
9 Oosthuizen et al, 2008
Antilopes Muestras de sangre
Uso del kit TDB-RLB, para la identificación de una nueva especie de
Babesia
10 Oosthuizen et al, 2009
Theileria Babesia Giraffe,
Roan, antelope Reverse Line
Blot hybridization
assay, 18S rRNA gene,
Phylogenetic analysis
Jirafa, antílope
Muestras de sangre,
bazo
Uso del RLB para identificar los parasitos con secuencias del gen 18s, análisis y relación filogenética con otros
piroplasmas identificados en otros
rumiantes salvajes
34
N Autor y año Pal. claves Esp.
Animal
Tipo de
muestra
Uso
11 Nagore et al,2004
Theileria; Babesia; Ovine piroplasmosis; PCR; Reverse line blot; Tick-
borne diseases
ovejas Muestras de sangre
Uso de RLB, para conocer la diversidad y heterogenidad genetica
de T y B en ovejas
12 Nijhof et al, 2003
Rinocerontes negros
Muestras de sangre y tejidos de
bazo y encéfalo
Uso de PCR y RLB para la identificación del
agente causal de los casos fatales.
13 Petrigh et al,
2008
Babesia bigemina
Polymerase chain reaction
reverse line blot hybridization
Bovinos
Muestras de sangre
Uso del kit RLBH (TBD-RLB) para la deteccion
de Babesia bigemina en muestras de sangre
14
Bekker et al,
2002
Erlichia sp. Anaplasma sp, Amblyomma varegatum,
simultaneum detection, heartwater
Cabras y ovejas
Muestras de sangre
y garrapatas
Se utilizo la RLB para detectar y diferenciar
especies de Anaplasma y Erlichia conocidas que ocurren en rumiantes en
los subtropicos
15 Qingli Niu et al, 2009
ovejas Muestras de sangre
Uso de RLB para detectar y diferenciar
especies de theileria y babesia de importancia en pequeños rumiantes
en china PCR,RLB,ELISA
16 Boosman et al, 2007
Babesia felis; Babesia leo;
Reverse line blot
Felinos salvajes Y gatos
Muestras de sangre
Se utiliza la RLB para identificar la prevalencia
de B felis y B leo en varias especies de
felinos. PCR,RLB
17 Salih et al, 2007
bovinos Muestras de sangre
Se realizó un estudio epidemiológico, en
ganado durante 3 meses 2005, se realizo
extendido de sangre, PCR, RLB.
18 Sanmartin et al, 2006
Bovinos Muestras de sangre
Se realizo la tecnica de RLB microarrays para
determinar la presencia y la identidad de los
prioplasmas en muestras de sangre con sospecha
de piroplasmosis. Examinación
microscópica, RLB
19 M’ghirbi et al, 2008
bovinos Muestras de sangre, garrapatas
Se realizo para detectar e identificar infección por piroplasmas en ganado en 3 regiones, basado en microscopia, PCR,
RLB
35
Tabla 7. Análisis comparado de los 11 estudios sobre el uso de la RLB en sangre de bovinos
20 Ica et al, 2006
Theileria, Babesia, cattle
RLB, blood smears
bovinos Muestras de sangre
Se realizo este estudio para detectar la
prevalencia de especies de Babesia y Theileria
por examinación microscópica, y RLB
Autor y año Titulo Tipo de muestra Resultados
Sensibilidad especificidad
Gubbels et al
1999
Simultaneous Detection of
Bovine Theileria and
Babesia Species by
Reverse Line Blot
Hybridization
Muestreo de sangre de ganado:
Animales experimentalmente infectados con cepas de diferentes países. Ganado de España: 28 Toledo 17 Cádiz
10-6 %
3p/µl
(0.000001%)
100%
No reacciones cruzadas
Sparagano et
al, 2000
Integrated Molecular
Diagnosis of Theileria
and Babesia
Species of Cattle in Italy
Muestreo de sangre y garrapatas de vacas,
en la isla sicilia 6 granjas en abril y 4
en noviembre
Mas sensible que PCR
100%
No reacciones cruzadas
Georges et al,
2001
Detection of haemoparasites in cattle by
reverse line blot
hybridisation with a note on
the distribution of ticks in Sicily
Se obtuvieron 187 muestras de sangre en
granjas donde se reportaron brotes. 15 en abril-nov/98
12 en junio-ag-nov/99 Tambien recolectaron
garrapatas
La RLB es mucho más sensible que los extendidos de sangre, el # de muestras + fueron hasta 2 veces más altas que las detectadas con los métodos tradicionales
No se reportan reacciones cruzadas
Oura et al, 2004
Application of a reverse line blot
assay to the study
of haemoparasite
s in cattle in Uganda
Muestras de sangre Uganda:
1. 44 nativo 2. 48 cruce 3. 11 exotico
(infe. aguda) 4. 28 cruce(infe.
aguda)
4.4 ×10-5 a 1.4 ×10-5% 1–2 parasites/µl (T parva)
No se midio para RLB. No se reportaron reacciones cruzadas
Brigido et al, 2004
Molecular and phylogenetic
characterization of
Theileria spp. parasites in
116 muestras de sangre de ganado adulto de raza mirandesa
Tanto en el PCR como en la RLB solo 3/116 animales resultaron positivos
36
autochthonous bovines
(Mirandesa breed) in Portugal
Autor y año Titulo Tipo de muestra Resultados
Sensibilidad Especificidad
Salih et al, 2006
Epidemiological studies on tick-borne diseases
of cattle in Central Equatoria
State, Southern Sudan
Muestreo de sangre 600 muestras de
ganado nativo aparentemente sano de
diferentes edades
La RLB es una técnica altamente sensible, el ADN parasitario fue detectado aun sin confirmación por PCR o microscopia
Altamente especifico
San martin et al, 2006
Molecular diagnosis of Theileria and
Babesia species
infecting cattle in Northern Spain using
reverse line blot macroarrays
Muestreo de sangre 263 muestras tomadas de 79 granjas
La técnica de RLB demostró la infección en 54% de las muestras, de las cuales solo 28.8% fueron postivas por microscopia
Altamente especifico
Ica et al, 2007
Parasitological and Molecular Prevalence of
Bovine Theileria and
Babesia Species in the
Vicinity of Kayseri
Muestreo de sangre, 337 muestras de sangre
La técnica de RLB fue más sensible para la deteccion de Babesia y Theileria que la microscopia (66 vs 61)
M´Ghirbi et al, 2008
A molecular survey of
Theileria and Babesia parasites
in cattle, with a note on the
distribution of ticks in Tunisia
Muestreo de sangre 278 muestras y 7 garrapatas
Altamente sensible, 3 parasitos por microlitro como reporta Gubbels.
Altamente especifico
Altay et al, 2008
Molecular detection of
Theileria and Babesia
infections in cattle
Muestreo de sangre de Ganado aparentemente sano East Black Sea Region of turkey 389 muestras en 6 provincias
Altamente sensible
100% especifico No reacciones cruzadas
Petrigh et al, 2008
Improved molecular tools for detection of
Babesia bigemina
Se obtuvo AND de cultivos de eritrocitos infectados con Babesia sp, y de animales experimentalmente infectados con Anaplasma sp.
Altamente sensible
No reacciones curzadas
37
Algunas de las características que fueron analizadas en los trabajos fueron: el tipo de cebadores empleados para amplificar el ADN de los protozoos buscados; y asimismo, el diseño de las sondas de detección utilizadas y los datos de sensibilidad y especificidad encontrados. 4.3 CEBADORES UTILIZADOS Y DISEÑO DE SONDAS En cuanto al tipo de cebadores utilizados, se evidenció que la gran mayoría de los estudios empleó los cebadores propuestos por Gubbels et al (1999); trabajo que se considera como uno de los pioneros en el desarrollo de la técnica para la identificación simultanea de diferentes especies de Theileria y Babesia en sangre de bovinos, y en el cual se manejo un set de cebadores para la amplificación de la región hipervariable V4 del gen RNA ribosomal de la subunidad 18s para todas las especies de Babesia y Theileria; estos amplificaban 460-520 pares de bases de un fragmento de la secuencia de la región V4; y en base a esta, posteriormente se diseñaron oligonucleótidos especie-específicos como sondas. No obstante, en el 2001 Georges realizó unos cambios en estos cebadores y los adaptó para amplificar una secuencia más corta (390-430pb del gen). (Tabla 8 y 9.) Tabla 8. Cebadores utilizados para la amplificación del gen V4 rRNA 18s
En solo un trabajo se desarrolló la amplificación de una secuencia diferente a la región V4 del gen 18s; conocida como Rap-1ª (Petrigh et al, 2008), utilizando como cebadores: Bbi400F: 5´-AGCTTGCTTTCACAACTCGCC-3’ y Bbi-400R: 5’-TTGGTGCTTTGACCGACGACAT-3’ para Babesia bigemina y también incluyeron una nueva sonda: Bbi CA: 5’-TCTTTTCGCTGGCTTTTTTTTTA-3’, también para B. bigemina. El trabajo lo desarrollaron utilizando un kit comercial conocido como RLBH kit (TBD-RLB Kit; ISOGEN, Maarssen, the Netherlands), en el cual las sondas ya se encuentran unidas a la membrana sin embargo todo el procedimiento se realizo acorde con lo propuesto por Gubbels et al (1999).
Cebadores utilizados para la amplificación del gen V4 rRNA 18s
RLB-F (5’-GAGGTAGTGACAAGAAATAACAATA-3’) Gubbels,1999
RLB-R (biotin-5’-TCTTCGATCCCCTAACTTTC-3’)
RLB-F2 (5’-GACACAGGGAGGTAGTGACAAG-3’) Adaptación de Georges, 2001
RLB-R2 (biotin-5’-CTAAGAATTTCACCTCTGACAGT-3’)
38
Tabla 9. Cebadores utilizados en los estudios para amplificar la región V4
La amplificación de la secuencia V4 del gen 18s, fue efectiva en todos los estudios y resulto 100% específica para Theileria y Babesia, como lo establecieron Allsop et al (2006). En el estudio de Petrigh et al (2008), también se obtuvo gran especificidad, debido a que realizaron la amplificación de un producto especifico de aislados de B. bigemina, utilizando las regiones conservadas del 5 gen parálogo Rap-1a. Los estudios que tomaron como base a la región V4, diseñaron sondas genero-especificas y subsecuentemente especie-especificas, para realizar la hibridación. (Tabla 10)
Estudio Analizado
Primer Utilizado
RLB-F RLB-R RLB-F2 RLB-R2
Gubbels et al, 1999 X
X
Sparagano et al,2000
X
X
Georges et al, 2001 X
X
Oura et al, 2004
X
X
Brigido et al, 2004 X
X
Salih et al, 2006 X
X
Sanmartin et al, 2006
X
X
Ica et al, 2007
X
X
Altay et al, 2008 X
X
M´ghirbi et al, 2008 X
X
39
Tabla 9. Sondas utilizadas para la técnica de RLB en los estudios
Sonda. (T. annulata. Ref. Georges, 2001) Sonda. (T. annulata. ref. Gubbels, 1999)
4.4 ESPECIFICIDAD DE LA TÉCNICA RLB En 10 artículos analizados se utilizó la sonda que detecta genero Babesia y Theileria (catchall), diseñada por Gubbels et al (1999); esta demostró ser altamente especifica, y no se reportaron reacciones cruzadas en ninguno de los estudios con otro tipo de parásitos como Anaplasma Marginale, A.
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Centrale, Tripanosoma vivax, Erlichia canis, entre otros, (Sparagano et al, 2001). Se implementaron las sondas especie-especificas reportadas en la tabla 8, los autores solo difirieron en las sondas para Theileria sp y T annulata; Oura et al (2004) y Salih et al (2007), usaron la sonda Theileria. sp (bufalo) (CAG ACG GAG TTT ACT TTG T), mientras que Sanmartin et al (2006) y M´ghirbi et al (2008) utilizaron (Theileria. sp.(GTTGAATTTCTGCT(A/G)CAT(C/T)GC); Gubbels et al (1999) y Sparagano et al (2000) utilizaron la sonda diseñada por Gubbels (T annulata (ATTGCTTGTGTCCCTCTG)), mientras que el resto de los autores se basaron en la sonda establecida por Georges et al (2001) (T. annulata (CCTCTGGGGTCTGTGCA)). En ninguno de los casos se generó alguna reacción cruzada, cada sonda hibrido con su respectiva secuencia de ADN parasitario encontrado en la muestra. Petrigh et al (2008); desarrollaron el estudio solo para determinar Babesia bigemina, por lo que no utilizaron otro tipo de sondas; y las muestras obtenidas fueron tomadas de aislados con el hemoparásito y de animales infectados experimentalmente; aun así no se reporto reacción cruzada con otro agente. 4.5 SENSIBILIDAD DE LA TÉCNICA RLB Cuando se desarrolló la técnica en un comienzo para el diagnóstico de Babesia y Theileria; por Gubbels et al (1999), se evaluó la sensibilidad; con una muestra de sangre de un animal con un nivel de parasitemia (T. Annulata) conocido, serialmente diluido con sangre de un animal no infectado y se determino que era del 1×10-6% (0.000001%), correspondiendo a 3 parásitos por microlitro de sangre; Pero en el estudio realizado por Oura et al, (2004), la sensibilidad encontrada para T. parva, fue ligeramente más alta, se determino de 4.4×10-5% a 1.4×10-5%, lo que equivale a 1-2 parásitos por microlitro de sangre. Para la determinación con especies de Babesia, se observó que la técnica de RLB es menos sensible, cuando los picos de parasitemia puedan estar por encima de 10-6; según los investigadores, la parasitemia de Babesia fluctúa y algunas veces se escapa a la detección por esta técnica, (Gubbels et al, 1999; Altay et al, 2008). Sin embargo, la RLB demostró ser mucho más sensible que los métodos tradicionales utilizados para el diagnóstico (Sanmartin et al, 2006; Ica et al,
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2007; Georges et al, 2001; M’ghirbi et al, 2008); por ejemplo, Georges et al, 2001, encontró que de 69 extendidos de sangre que tomaron en junio, el 46% fue positivo por microscopia y con la técnica de RLB el 89%; en el estudio de Quingli Niu et al (2009), también se encontró que la técnica RLB fue más sensible que la PCR y ELISA. Igualmente, se demostró que la técnica de RLB detecta ADN parasitario aun sin confirmación o resultado negativo por PCR o microscopia; como en el estudio de Sparagano et al, (2000), en el que dos muestras resultaron negativas por PCR, pero arrojaron un resultado positivo mediante la RLB. En el estudio de Petrigh et al, (2008); el kit no detectó el aislado de B.bigemina de origen Argentino, un estudio posterior revelo el polimorfismo encontrado en el gen 18s rRNA entre la B bigemina argentina con la sonda especifica de la membrana, por lo que diseñaron una nueva sonda (Bbi CA), esta fue eficiente para detectar todos los aislados de B bigemina y no se detectaron reacciones cruzadas.
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5. DISCUSIÓN De todos los artículos que fueron encontrados para desarrollar la revisión, la mayoría realizaron el estudio para detectar Babesia y Theileria en sangre de bovinos; esto puede asociarse principalmente, al impacto que ha generado el problema de las hemoparasitosis en las producciones bovinas en todo el mundo; los estudios se realizaron también, principalmente para evaluar epidemiologia de la babesiosis y theileriosis en las diferentes regiones, para lo que la técnica resulto ser muy practica y eficiente, ya que con esta es posible evaluar muestras de poblaciones numerosas. Los estudios que fueron seleccionados para la revisión, fueron realizados por autores pertenecientes a grupos de investigación de grandes universidades de renombre principalmente de Europa y África; esto puede deberse a que estos institutos han venido desarrollando grandes avances en el área de parasitología y enfermedades tropicales, actualmente se han maximizado los estudios en esta área en las facultades de Medicina Veterinaria en casi todo el mundo. En cuanto a la técnica de Hibridación Reversa en Línea, se determino finalmente que es altamente especifica, debido a que todos los resultados del PCR positivos, mostraron reacciones positivas con su correspondiente sonda general y específica, a excepción de algunas especies de Babesia que no emitieron señal con las sondas especificas utilizadas, como en el estudio de Altay et al (2008); esta situación indica la presencia de un nuevo genotipo o de uno ya conocido, pero que no se incluyo en el estudio; se obtuvieron resultados similares en los estudios realizados en especies salvajes de Oosthuizen et al (2008) y en caballos de Sudáfrica por Bhoora et al (2009). La técnica demostró además, ser efectiva para la detección de varios agentes en una misma muestra; por ejemplo, Salih et al (2007), reporto que de 600 muestras analizadas 406(67.7%) representaban infecciones mixtas y Sparagano et al (2000), determino que la RLB es una herramienta útil para demostrar la coinfección de especies de Babesia y Theileria en bovinos, pero también en equinos como lo menciona Nagore et al (2004); las infecciones mixtas fueron un resultado común en la mayoría de los estudios, (Salih et al, 2007; Ica et al, 2007; Sparagano et al, 2000). En cuanto a la sensibilidad se concluyo que la técnica de RLB no es igual de sensible cuando es aplicada a diferentes patógenos y sugiere que debe ser determinada para cada hemoparásito. (Oura et al, 2004); como se realizo, en el estudio en China de Quingli Niu et al (2009), realizado en sangre de ovejas; en donde la sensibilidad fue diferente para cada agente asi: (10−6% (Babesia motasi), 10−3% (Babesia sp. Kashi), 10−8% (T. luwenshuni), 10−8% (T. uilenbergi).
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La técnica demostró también ser más efectiva que el solo PCR o la microscopia, debido a que se obtuvieron resultados positivos donde la PCR y la examinación microscópica habían generado un resultado negativo; Salih et al, (2007), sugieren que esto se debe a la presencia de parásitos viables en niveles muy bajos en la muestra, lo que confirma la utilidad de esta técnica para la detección de parásitos en animales aparentemente sanos o con infección subclinica, esto se demostró también en el trabajo de Nagore et al, (2004), en donde, se recolecto 181 muestras de sangre de caballos clínicamente sanos con exposición a garrapatas, de estas 92 resultaron positivas mediante RLB, pero la examinación microscópica resulto negativa para todas las muestras. También fue posible determinar a través del uso de la técnica en el estudio realizado por Petrigh et al (2008), que las especies de Babesia y Theileria pueden tener polimorfismos según la región del mundo en la cual sobreviven; en este estudio utilizaron un kit de RLB que fue comercialmente disponible durante un tiempo, pero la sonda incluida en este no detecto la B. bigemina de origen Argentino. Actualmente no es disponible este kit, probablemente esto se asocia al inconveniente generado por el polimorfismo presente entre las especies de hemoparásitos, lo que dificulta el diseño de sondas universales.
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6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
La técnica de RLB es una herramienta útil para el diagnóstico de hemoparásitos en muestras de sangre en medicina veterinaria; con esta técnica se hace práctico y menos costoso realizar estudios epidemiológicos de enfermedades transmitidas por garrapatas, puesto que es posible detectar y diferenciar múltiples agentes en una sola prueba, esto la convierte en una técnica de gran utilidad para las regiones endémicas, por representar mayor beneficio a nivel poblacional. Esta tecnología aporta en cierta medida para disminuir el impacto de los hemoparasitos, ya que con su utilización se logran diagnósticos más certeros para poder realizar tratamientos oportunos y eficientes. La RLB es altamente sensible en general, pero debe ser determinada para cada hemoparásito, ya que los picos de parasitemia fluctúan y pueden escapar a la detección por esta técnica; no obstante, resulto ser mucho más sensible que los métodos tradicionales de diagnóstico y detecta niveles extremadamente bajos de parasitemia (1-3 parásitos/µl sangre), lo que posibilita la detección de animales con infecciones subclínicas; esto la hace una herramienta de gran utilidad para evitar el transporte de animales que puedan ser transmisores de la enfermedad a lugares no endémicos. La amplificación de la región V4 del gen 18s RNA ribosomal, resulto ser especifica en todos los casos, como fue descrito por Allsop et al (2006), este descubrimiento ofrece una gran oportunidad para realizar estudios importantes sobre la biología, taxonomía y detección de especies de Babesia y Theileria. La técnica es 100% específica, puesto que se implementan oligonucleótidos diseñados de forma genero-especifica y especie-especifica, de modo que no se han reportado reacciones cruzadas entre agentes en ninguno de los estudios analizados. Se demostró además que la técnica puede ser considerada como una herramienta útil para detectar y conocer nuevas especies o variantes genéticas de hemoparásitos. (Altay et al, 2008, Bhoora et al, 2009; Oosthuizen et al, 2008 y 2009) Las especies de Babesia y Theileria, como se expuso en el estudio realizado por Petrigh et al, 2008, pueden tener polimorfismos según la región del mundo en el cual se desarrollan, esto también fue determinado con el uso de la técnica de RLB
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