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La sélection du TOP ovule
XIIème journées Liégeoise de Gynécologie Obstétrique
Nathalie Lédée
Connaitre le potentiel d’implantation de(s) embryons que l’on va transférer est crucial
Pour augmenter les taux de succès en FIV-ICSI tout en réduisant les risques de grossesse multiple
- Pour promouvoir la politique du transfert unique d’embryon
-Pour diminuer la mortalité et morbidité maternelle et foetale associée au technique d’assistance médicale à la procréation
L’analyse de la morphologie de l’embryon pre-implantatoire est importante, mais en général insuffisamment informative (Guerif, et al. 2007).
Il n’EXISTE PAS actuellement de marqueur morphologique de l qualité ovocytaire individuelle. La fonction ovarienne est explorée en terme de reserve ovarienne globale
5% des ovocytes collectés aboutiront à la naissance d’un enfant
De nouvelles perspectives emergeantes tentent de définir la
qualité ovocytaire et embryonnaire
Granulosa cells
Embryos conditioned Culture MediaFollicular fluids
Feuerstein et al, 2007Assou et al, 2008Hamel et al, 2008
Katz-Jaffe et al, 2006Dominguez et al, 2008Tabiasco et al, 2009
Seli, 2007-2008Scott, 2008
Cytokines and chemokines dans le liquide folliculaire
Randomised population ICSI randomisée
(n=71) puis (112)
Ponction d’ovocyte: follicule par follicule
530 (puis 953) individual follicular fluids with mature oocytes
selection retrospective des liquides folliculaires individuels pour lesquels un embryon avait été obtenu par fecondation in vitro et
transféré
Echantillons anonymes ont analysés en aveugleDeterminer leur concentration de cytokines/ chemokine contents
EMBIC plaform (bead-based multiplex sandwich immunoassay - MP piccinni, Florence)
Taux d’implantation et de naissance Staging de l’embryon J2
Est-ce que des biomarqueurs immunologiques seraient informatifs de la
compétence ovocytaire ?
Cytokines /chemokines/ facteurs de croissance
IL-1beta, IL-1Ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IFN-alpha, TNF-alpha, G-CSF, GM-CSF, VEGF, PDGF, FGF, IP-10, MCP-1, RANTES, eotaxin, MIP-1-alpha, and MIP-1-beta, LIF
Methode Luminex (Elisa en multiplex sur microbilles): Université de Florence par MP Piccini
Un seul facteur folliculaire est apte à distinguer les embryons qui aboutiront à une naissance de ceux ayant échoué :
le Granulocyte Colony Stimulating factor (G-CSF ou CSF-3)
• Les embryons qui ont abouti à une naissance avait un taux de G-CSF dans leur liquide folliculaire superieur à ceux n’ayant pas abouti à une grossesse dans 84% des cas.
• Définir la sensibilité et specificité optimale du test.
Area under curve for FF-G-CSF as a predicting factor of delivery
0 20 40 60 80 100
100
80
60
40
20
0
100-Specificity
Sens
itivity
AuROC: 0.84 [0.75-0.90] (p=0.0001)
L édée et al, Human reprod, 2008
Implantation and delivery rates as a function of the follicular fluid G-CSF concentrations in individual FF
From the AUC-ROC curve
• Le seuil Bas
La specificité la plus haute à prévoir l’échec
• Le seuil haut
La sensibilité la plus haute pour prévoir le succés
G-CSF concentrations
(Luminex Biorad)
Number of embryos
concerned
Mean implantation
rate
Mean delivery
rate
Low G-CSF
(<20 pg/ml)
45 9% 6%
Intermediate G-CSF
(Between 20 to 24
pg/ml)
62 18%* 15.6%*
High G-CSF
(>24 pg/m)l
25 44% ** 44%**
*p=0.0005 and 0.001 between intermediate and low G-CSF for implantation and delivery
rates
** p<0.0001 between high and low G-CSF for both implantation and delivery rates
Lédée et al, HR, 2008
La variation de concentrations de G-CSF dans une même cohorte
Variation of individual FF-GCSF concentrations in a cohort of embryos
6
4
2
0
-2
-4
-6
-8
-10
patient identification
[G-C
SF]p
oole
d- [G
-CSF
]indi
vidu
al
A B C D E F G H I J
EMBRYO CHOICE
Comparaison de plusieurs méthodes de dosagesLuminex R&D, Luminex Biorad, Elisa R&D
G_CSF Luminex BioradG_CSF luminex R&DG-CSF R&D Elisa
0 20 40 60 80 100
100
80
60
40
20
0
100-Specificity
Sens
itivi
ty
Biorad Luminex technology AuROC curve: 0.82 [0.73-0.89] (p=0.0001): Excellent discrimination R&D System Luminex at 0.73 [0.65-0.79] and significant (p=0.002): Acceptable discriminationG-CSF ELISA, AuROC=0.60, p=0.19: No discrimination
Comparaison des taux de naissance en fonction du taux de G-CSF folliculaire évalué par trois méthodes
differentes.
Luminex R&D Luminex Biorad ELISA
FF G-CSF (pg/ml) <24.9 >24.9 <20.54 >20.54 <149 >149
Number of embryos 143 55 86 60 138 62
delivery rates 12% 22.3% 10.6 % 24.2 % 14.3% 19.8%
P value 0.035 0.008 0.30
Lédée et al, submitted, 2009
Impact of hyperstimulation
CAT RESPONSEABC
variations of follicular G-CSF in function of the ovarian response to the ovarian stimulation
25
20
15
10
5
0
G-CSF Elisa/10 G-CSF rd luminex G-CSF biorad
*
A oestradiol <1500 pg/ml B- 1500<oestradiol<3000 C- oestradiol>3000 pg/ml
*
Les cycles de FIV/ICSI en cycle natural modifié comme modèle experimental pour
explorer l’environnement de l’ovocyte
• Tracabilité du follicule à la naissance est parfaite (1 ovocyte- 1 liquide folliculaire- 1 embryon- 1 enfant)
Etude rétrospective en aveugle des liquides folliculaires des follicules dominants- Collaboration avec R. Frydman
• Inclusion: les premières 83 tentatives de FIV/ICSI en cycle naturel modifié
• Méthode: Multiplex bead-based Assay (Biorad)IL-1beta, IL-1Ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IFN-alpha, TNF-alpha, G-CSF, GM-CSF, VEGF, PDGF, FGF, IP-10, MCP-1, RANTES, eotaxin, MIP-1-alpha, and MIP-1-beta, LIF
Protocole: cycle naturel modifié
• Monitoring des patientes
• Administration of GnRH antagonist (Cetrotide) 0.5 (0.25x2/day) + Gonadotrophins 150 IU/day quand la taille du follicule >13 mm
• Administration of hCG 5000 IU pour la maturation finale
≥13mm
D 1
GonadoT150 IU/d Cetro 0.25/d
≥16mm
HCG 5000IU
OR TEchoHD
Rongières-Bertrand C., Frydman R. et al, Hum Reprod, 1999Castelo Branco A., Frydman R. et al, Fertil Steril, 2005Mendez-Lozano D., Frydman R. et al, RBM Online 2008
Caractéristiques des patientes
Pregnant group
Birth Abortion
Nopregnancy
No oocyte collected
No embryotransferred
Number of patients
19 6 29 10 19
Mean Age (Years)
33 34 33.8 33.7 34.3
Mean number of previous conventional attempt
2.5 2 3 2.4 2.5
% of TOP transferred
78% 66% 58% - -
Follicular GCSF
0 20 40 60 80 100
100
80
60
40
20
0
100-Specificity
Se
nsi
tivity
Follicular IL_17
0 20 40 60 80 100
100
80
60
40
20
0
100-Specificity
Se
nsi
tivity
Follicular IL_7
0 20 40 60 80 100
100
80
60
40
20
0
100-Specificity
Sen
sitiv
ity
Sensitivity 89.5 %Specificity 54.3 %For FF G-CSF >12.08 pg/ml
Sensitivity 89.5 %Specificity 60.9 %For IL-17 > 0 pg/ml
Sensitivity 63%Specificity 84%For IL-7 >32.3 pg/ml
A- B-
C-
G-CSF AuROC: 0.78 IL-17 AuROC: 0.77
IL-7 AuROC: 0.75
Trois proteines predictive de l’issue: Naissance par ponctionG-CSF (a), and Interleukin-17 (b) and -7 (c)
G-CSF, IL-7 et -17 et potentialité de naissance
Number of
Samples
OPU/ ET
Pregnancy/OPU Pregnancy/ET Birth/OPU Birth/ET
G-CSF
HIGH 46/33 39% (18/46) * 56%(18/33) * 37%(17/46) ** 51.5(17/33) % **
LOW 37/21 18.9%(7/37) 33%(7/21) 5.4%(2/37) 9.5%(2/21)
IL-7
HIGH 23/17 56%(13/23) *** 76%(13/17) ** 52%(12/23) *** 70.6%(12/17)***
LOW 60/36 20%(12/60) 33%(12/36) 11.6%(7/60) 19%(7/36)
IL-17
HIGH 39/27 41%(16/39)* 59%(16/27) 38.4%(15/39)*** 55%(15/27) ***
LOW 44/27 20%(9/44) 33%(9/26) 9%(4/44) 14.8%(4/27)
1
*** p<0.001, ** 0.01<p<0.001,* 0.05<p<0.01 2
Lédée et al, submitted
Combinaison du G-CSF et de l’interleukine-7 pour predire la naissance
G-CSF and IL-7 combinaison Pregnancy
/OPU
Pregnancy
/ET
Birth/OPU Birth/ET
G-CSF
HIGH
IL-7 HIGH
54%(12/22)*
75%(12/21)*
50% (11/22) ***
68% (11/16)***
IL-7 LOW 25% (6/24) 35% (6/17) 25% (6/24) 35.3% (6/17)
G-CSF
LOW
IL-7 HIGH
50% (1/2)
100% (1/1)
50% (1/2)
100%(1/1)
IL-7 LOW
17% (6/35)
30% (6/20)
2.8% (1/36)
5% (1/20)
1
Correlation between G-CSF, interleukin -7 and -17
Cytokines, facteurs de croissance et les chemokines dans le fluide folliculair et la morphologie de
l’embryon correspondant
Aucun des facteurs n’étaient apte a discriminer les
embryons TOP des non TOP
TOP quality embryo, D3
TOP quality embryo, D2
no TOP Embryos, D2
Le mécanisme par lequel le G-CSF agit est inconnuLe mécanisme par lequel le G-CSF agit est inconnu
• La proteine et le recepteur sont présent dans l’ ovaire - granulosa cells (Salmassi, et al. 2004) / secretion en phase folliculaire pré-ovulatoire
• Après la sécretion devient active dans l’endomètre en phase lutéale/placenta avec une augmentation dans le serum si une grossesse survient (Yanagi, 2002- Salmassi et al, 2005)
• Le G-CSF est connu comme une molecule augmentant la tolérance immunitaire avant greffe(T reg cells and dendritic cells recruitment, IL-10 secretion, regulation of complement, control of Th-1 cytokines)Isi l’on considère la grossesse comme une semi-allogreffe, la question d’une tolerance maternelle locale et programmée devient essentielle
• G-CSF en injection SC a été montré comme une veritable alternative de traitement dans le cadre des fausses couches à répétition dans un essai randomisée placebo versus G-CSF en simple aveugle (Scarpellini, 2009)
Pour ConclurePour Conclure• Témoins non invasif de la compétence ovocytaire dans
le liquide folliculaire existent
• Ces résultats ont besoin d’être confirmé par des études prospectives, multicentriques, randomisées.
• Si tel est le cas: outil formidable non invasif pour définir la compétence ovocytaire, définir quel femme requiert une hyperstimulation et appliquer une politique de transfert guidée et adaptée a chaque patiente
EMBICEMBICCollaborative Study supported by the European network EMBIC (Embryo Implantation Control)
Nathalie Lédée
Gérard Chaouat Sophie Perrier d’hauteriveMarie Petit Barat Carine munautSylvie dubanchet Francis Frankennes Jean Michel Foidart
Marie pierre Piccinni René Frydman Letizia Lombardelli Agnessia Osipova Joelle Taieb
