KULTUR KALUS TUMBUHAN KACANG HIJAU, DAUN KEMANGI, DAN DAUN BINAHONG DENGAN ZAT PENGATUR 2,4DFiled under: Laporan Praktikum Tempoe Kuliah dulu Leave a comment December 8, 2011I. TUJUANMenumbuhkan kultur kalus tumbuhan kacang hjau, kemangi dan binahong pada media yang sesuaiII. DASAR TEORIKultur kalus tanaman adalah teknik budidaya kalus tanaman dalam suatu lingkungan yang terkendali dan dalam keadaan aseptik atau bebas mikroorganisme. Sel-sel penyusun kalus adalah sel-sel parenkim yang mempunyai ikatan renggang dengan sel-sel lainya. Kalus terbentuk pada tanamn yang mengalami pelukaan dan dapat pula terbentuk akibat tanaman mengalami stress.Kemampuan bagian tanamn untuk membentuk kalus tergantung pada:1. Umur fisiologi bahan tanm waktu diisolasi, untuk pengambilan bahan tanam dari umur fisiologi juvenil lebih baik dibanding umur fisiologi yang mendekati mature.2. Musim pada waktu bahan tanam diisolasi3. Bagian tanaman yang digunakan sebagi eksplan4. Jenis tanaman5. Faktor LuarAda beberapa tuuan yang bisa dicapai dengan menguasai kultur kalus misalnya:1. Dapat menjamin kesinambungan kerja kultur2. Dapat menjadi sarana bank plasma nutfah yang efisien.Sterilisasi EksplanEksplan dicuci lebih dahulu sambil digosok agar debu dan kotoron yang melekat pada daun hilang. Sterlisasi dilakukan dengan larutan bayclean dalam air atau bisa menggunakan larutan sublimat. Sabun cair diguanakan sebagai larutan pembasah (wetting agent ) karena lapisan daun mengandung stomata. Adanya wetting agent, memudahkan strilisasi masuk dan kontak dengan daun . Lalu daun dibilas dengan aquades steril untuk menghilangkan sterilant-sterilant yang menganggu pertumbuhan sterilant.Kacang hijauKacang hijau (Vigna radiatus L.) mempunyai nama lain, yaitu mungo, mungbean, green-grain, golden grawn. Tanaman ini berasal dari India yang menyebar ke Indonesia dan dapat tumbuh dengan baik di Jawa, Madura, Nusa Tenggara, Maluku, dan Sulawesi Selatan.KandunganKimiaKacang hijau mempunyai nilai gizi yang cukup baik, mengandung vitamin B1 cukup tinggi (150-400 i.u.) dan vitamin A (9 i.u.}. Kacang hijau yang sudah menjadi kecambah kaya kandungan vitamin E (tokoferol) yang penting sebagai anti oksidan, dalam mencegah penuaan dini, dan anti sterilitas. Kandungan protein kacang hijau mencapai 24%, dengan kandungan asam amino esensiai seperti isoleusin, leusin, lisin, metionin, fenilalanin, treonin, triptofan, dan valin. Kacang hijau mengandung karbohidrat sekitar 58%. Pemanfaatan sifat fungsional dari patinya dapat dibuat sebagai tepung bahan berbagai bentuk makanan bayi sampai orang dewasa. Pati kacang hijau terdiri dari amilosa 28,8%, dan amilopektin 71,2%. Kacang hijau banyak diberikan sebagai obat kepada penderita penyakit beri-beri, karena mengandung vitamin B1 yang tinggi..Klasifikasi botani tanaman kacang hijau adalah sebagai berikut:Divisi : SpermatophytaSub divisi : AngiospermaeKelas : DicotyledonaeKeluarga : Leguminoceae (Fabaceae)Genus : VignaSpesies : Vigna radiatusDeskripsi tanamanKacang hijau merupakan tanaman sayur semusim berupa semak yang tumbuh tegak. Tanaman kacang hijau ini diduga berasal dari India, kemudian kacang hijau menyebar ke berbagai negara Asia tropis termasuk ke Indonesia di awal abad ke-17. Tanaman kacang hijau adalah tanaman semusim berumur pendek (60 hari). Panen kacang hijau dilakukan beberapa kali dan berakhir pada hari ke 80-100 setelah tanam.KemangiKemangi (Ocimum basilicum L. forma citratum Back) secara luas dikenal masyarakat sebagai makann mentah (lalapan) selain sebagai peluruh dan pelancar ASI, penurun panas dan memperbaiki pencernaan (Syamsuhidayat dan Hutapea, 1993)KlasifikasiDivisi : SpermatophytaSubdivisi : AngiospermaeKelas : DicotyledonaeSub kelas : SympetalaeBangsa : SolanalesSuku : LamiaceaeMarga ; OcimumJenis : Ocimum basilicum L. forama citratum Back(Van Steenis 1975 )Nama daerahKemangi di Indonesia dikenal dengan berbagai naman, yaitu lampes di Sunda, Kemangi di Jawa dan Madura, uku-uku di Bali, lufe-lufe di Ternate (Heyne, 1987)Deskripsi TanamanHerba tegak, sangat harum, tinggi 0,5-0,6 meter. Batang berwarna hijau, tangkai daun 0,5-2,0 cm, halaian daun bulat telur, elips, atau emamnjang dengan ujung runcing. Berbintik-bintik serupa kelenjar, pada sebelah menyebelah ibi cabang. Tulang cabang 3-6, Bunga berupa karangn semu jumlah 6, daun pelindung elips atau bualt telur panjang 0,5-1 cm, Kelopak sisi luar berambut, sisi dalam bagian bawah dalam tabung berambut rapat. Mahkota berbibir dua, dari luar berambut, bibir atas bertaju 4, bibir bawah rata. Tangkai kelopak buah tegak dan tertekan pada sumbu dari karangan bunga. Buah keras, coklat tua, gundul, dan waktu dibasahi membengkak sekali. Tanamn ini memeiliki mahkota bunga putih dan berbau sekali (Van steenis, 1975 )PenyebaranKemangi tumbuh di tepi jalan dan di tepi ladang, di sawh kering, dan dalam hutan jati. Kemangi seringkali disemaikan di kebun-kebun. Kemangi terdapat di seluruh Jawa dan dataran rendah hingga kurang lebih 450 m di atas permuakaan air laut ( Heyne, 1987)KhasiatMenurut Hutapea dan Syamsuhidayat (1991), daun kemangi berkahsiat sebagai peluruh air susu ibu, sebagai obat penurun pans, obat sariawan dan obat mual. Selain itu juga dapat digunakan untuk obat diare, penghalang bau keringat, bau nafas, dan bau mulut ( Anonim, 1999 )Kandungan KimiaDaun kemangi segar mengandung minyak atsiri sebagai berikut; 1,8 cineole, p-Coumaric acid, p-cymena, limonene, linalool, Methilchaviol, Methyl cinnamate, Myrcene, -pinene, -pinene, safrole, dan terpinene. Kandungan minyak atsiri paling utama adalah linalool dan Methylcaviol (anonim, 2001). Menurut Hutapea dan Syamsuhidayat (1991) daun kemangi selain mengandung minyak atsiri juga menagndung flavonoid, saponin, dan taninBinahongDeskripsi tanamn;Terna menahun, tumbuh menjalar pada tanamn lain atau pagar. Daun berbentuk bulat jantung, dengan pangkal membulat dan ujung meruncing, daun berdaging, tidak terlau tebak, permukaan mengkilat, tulang daun menyirip, bersulur, mempunyai umbi pada ketiak daun atau disebut juga dengan kormus. Taksonomi tanaman ini belum jelas, namun dimungkinkan tanamn ini termasuk famili RubiaceaeSubkultur.Pertumbuhan kalus dalam tempat yang tertutup lama kelamaaan dapat mengakumaulasi metabolit toksik serta dapat menyebabkan pengeringan dalam media.Waktu untuk melakukan subkultur tergantung dari kecepatan pembentukan kalus, bila kalus yang terbetuk besar maka dapat dipotong-potong menjadi potongan inokulum ( george & Hellington, ). Frekuensi subkultur bervariasi tiap spesies dan kondisi pertumbuhan. Kalus yang dipindahkan jangan terlalu kecil karena akan menghambat pertumbuhannya agar tidak mati.diameter 5-10mm brt 20-100 mg (Dodds). Alasan pengadaan subkultur1. Pertumbuhan kalus yang cepat dan memenuhi botol2. Kultur perlu diperbanyak lebih lanjut, dengan alasan perbanyakan.3. Terjadi browning, terutama pada awal isisasi, akibat senyawa fenolik yang keluar dari irisan4. Media tumbuh mengering, agar-agar menciut5. Nutrisi dalam media habis, kalusn menunjukkan gejala defisiensi6. Kultur membutuhkan media yang sussnanya baru agar diferensiasinya dapat berjalan lebih lanjut7. Kultur menunjukkan gejala fiitrous, daun batang lunak agak transparan karena kekurangan lignin, oleh karena itu perlu dipindahkan dalam media lain dengan kadar sitokinin yang rendah. .III. ALAT DAN BAHANAlat :1. Aseptik case2. petri steril3. gagang skapel steril4. pisau steril5. pinset steril6. lampu spiritus7. erlenmeyer8. pot kulturBahan :1. Biji kacang hiaju2. Daun kemangi3. Daun Binahong4. Media Steril5. Air steril6. larutan alkohol 70%7. Sublimat1. BaycleanIV. CARA KERJAKultur Kalus Tumbuhan Kacang HijauSiapkan eksplan ( Batang, kepala kecambah, daun ) biji kacang hijau yang telah dikecambahkan Siapkan media sterilTanam eksplan secara aseptik pada media 2,4 D dengan posisi yang berbedaDiberi pelabelanSimpan dalam InkubatorAmati Pertumbuhan yang terjadiKultur Kalus Daun KemangiDaun Kemangi disortasi, dicuci pada air mengalirDaun dicuci dengan air sabun lalu dibilasDaun lalu dimasukkan dalam campuran air dan Bayclean (4:1) digojog selama 15 menitDaun Dibilas tiga kali memakai aquades (3, 5, 7)Siapakan kotak aseptikEksplan yang telah disterilkan, dipotoang bagian tepinyaPermukaan daun digores atau dilukai, untuk memacu pertumbuhanMasukkan eksplan pada media MS 2,4 DSimpan dalam InkubatorAmati pertumbuhan yang terjadiKultur Kalus Daun BinahongDaun Kemangi disortasi, dicuci pada air mengalirDaun dicuci dengan air sabun lalu dibilasDaun lalu dimasukkan dalam campuran air dan Sublimat 6 mg (0,3%) digojog selama 7 menitDaun Dibilas tiga kali memakai aquades (3, 5, 7)Siapakan kotak aseptikEksplan yang telah disterilkan, dipotoang bagian tepinyaPermukaan daun digores atau dilukai, untuk memacu pertumbuhanMasukkan eksplan pada media MS 2,4 DSimpan dalam InkubatorAmati pertumbuhan yang terjadi Subkultur Kalus KemangiSiapkan kotak aseptikAmbil kalus kemangi dari potPilih kallus yang masih bagus, tidak terkontaminan, dan tidak browningPisahkan kalus dari media dan potongan eksplantKalus dipotong-potong menjadi bagian kecilTimabang ppot media yang kosongMasukkan potongan kalus tersebut ke media MS 2,4 yang baruTimbang pot media yang telah diisi kalusSimpan dalam inkubatorAmati pertumbuhan yang terjadiV. HASIL PERCOBAANKultur Kalus Kacang Hijau ; total = 9 potKeterangan12 Okt 06hari-ke 213Okt 06hari ke314 okt 06hari ke 416 okt 06hari ke 61 nov 06hari ke2121 nov 06hari ke 42

BatangBerdiri1kontamkontamkontamKontamkontamKontam

BatangTidur2Semua tdak ada responAda semacam kumpulan lendir di ujung batangTumbuh kalus dan akarKalus membesar akar memanjang, banyak serabut di tengahKalus bertambah besarWaran kalus cokalt tua

KepalaKecambah4Batang memanjang, tumbuh daunSama seperti sebelumnyaPangkal tumbuh akatAkar memanjang, daun membesarTumbuh kalus di ujung, waran cokaltDaun bewarna cokalt

Daun2Tidak ada responPangakal daun memanjangTumbuh kalus di ujungBatang memanjang, tumbuh akarSama aeperti sblumnyaDaun mulai membusuk

Kultur Kalus Daun Kemangi ( Total 10 pot )KeteranganHari ke 2Hari ke 3Hari ke 6Hari ke 7

Jmlh mati-331

Jmlah tmbuh--43

Trbntk kalus--43

Kontaninasi-331

Tanda-tanda-Daun menghitamTumbuh benjolan putih di tepian lukaTepi daun melengkung, kalus membesar

Jmlh pot sisa10743

Kultur Kalus Daun Binahong ( Total = 9 pot)KeteranganHari ke 2Hari ke 3Hari ke 7

Jmlh mati-1-

Jmlah tmbuh--7

Trbntk kalus--7

Kontaninasi-11

Tanda-tanda-Daun menghitamAda gumpalan putih tipis di sepanjang tepi daun

Jmlh pot sisa987

SubkulturHasil Subkultur dari Kalus daun Kemangi selama 14 hariHasil sub kultur dipanen pada hari ke-15Kalus basah dikeringkan selama 2 hariBerat Alum foil kosongBerat kalus basah + Alumunium foilBerat kalus kering + Alumunium foil

378,7 mg1325,1 mg460 mg

Berat kalus basah = 1325,1 mg 378,7 = 947,3 mg% Bbot penyusutan kalus = 1325,1mg 378,7 mg x 100% = 91,42% 1325,1mgVI. PEMBAHASANPada praktikum ini dilakukan kultur kalus dari tanaman kecambah kacang hijau, daun kemangi, dan daun binahong. Subkultur dilakukan pada kalus kemangi media yang digunakan dalam penelitian ini adalah Media MS ( Murashige skoog ). Media MS dipakai secara luas dalam kultur jaringan tanamanHal ini mengacu pada penelitian Dalay (1998) yang berhasil menumbuhkan kalus dari tanaman selasih ( Ocimum basilicum L. Forma Violaceum ) menggunakan media MS. Kemangi dan Selasih merupakan spesies yang sama, jadi dengan menggunakan media yang sama diharapkan hasil yang tidak jauh berbeda. Media MS ini memiliki kandungan mineral dan nitrogen yang tinggi dalam bentuk amonium ( Gamborg dan Shyluk, 1981). Kadar Ammonium yang tinggi ini diperlukan untuk regenerasi. Kandungan garam mineral yang tinggi layak untuk memenuhi kebutuhan sel tanaman dalam kultur.Pertumbuhan dan perkembangan kalus dipengaruhi oleh penambahan zat pengatur tumbuh. Zat pengatur akan berinteraksi dengan hormon endogen dan menentukan keberhasilan induksi kalus serta differensiasnya. Zat pengatur yang ditambahkan dalam media MS ini adalah 2,4 D. Zat pengatur ini termasuk golongan hormon auksin yang stabil dan kuat. Menurut Witherell (1984) 2,4 D merupakan auksin sintesis yang cenderung menyebabkan pertumbuhann kalus.Kultur Kalus Herba kacang Hijau Sebelum dilakukan kultur kalus herba kacang hijau, dilakukan perkecambahan biji terlebih dahulu dalam media steril. Perkecambahan ini bertujuan untuk mendapatkan eksplan yang masih juvenil dan terjaga sterilitasnya. Pada perkecambahn biji, akan didapatkan tanaman yang muda. Tanamn muda ini bersifat merismatik. Tanamn muda ini akan cepat membentuk kalus. Kecambah steril merupakan sumber eksplan yang baik karena sel-selnya masih muda dan memiliki daya tumbuh tinggi. Pembuatan kecambah sterilsering dilakukan untuk digunakan sebagai eksplan kultur kalus. Pada penumbuhan kecambah, selain menggunakan air pada cawan petri, juga dapat digunakan media MS tanpa penambahan fitohormon. Sebelum ditanam, biji kecambah disortasi dahulu dengan merendamnya dengan air, biji dipilih yang benar-benar tenggelam. Jika biji mengapung atau melayang, itu pertanda biji telah rusak dan tidak ada isinya. Hal ini penting diperhatikan, mengingat keberhasilan kultur jaringan tergantung juga denag pemilihan eksplan yang baik. Karena penanaman dalam keadaan aseptik, maka biji kacang hijau disterilkan terlebih dahulu dengan alkohol 70%, gojog selama 2 menit, alkohol dibuang. Biji disterilisasi lagi dengan larutan Natrium hipoklorit dan digojog selama 20% . Setelah disterilkan biji diletakkan di media padat, jumlah biji yang ditanam tidak terlalu banyak karena dikhawatirkan penyerapan nutrisi kurang maksimal karena terjadinya kompetisi antar individu. Hasil yang didapatkan biji tumbuh menjadi kecambah dalm waktu yang relatif singkat, yaitu pada hari ke 2 sudah mulai berkecambah, pada hari berikutnya mulai berkembang dan pada hari ke 6 organ tanaman sudah mulai lengkap; yaitu terdiri dari daun, batang dan akar. Pertumbuhan yang cepat ini disebabkan oleh biji sudah mempunyai kandung lembaga yang menyimpan cadangan makanan, dan dalm biji tersebut sudah terdapat hormon pertumbuhan endogen dari biji itu sendiri. Jadi tanpa penambahan hormon dari luar, sudah dapat tumbuh secara wajar dan optimal. Dari tumbuhan kecambah yang steril ini, dapat dijadikan eksplan. Eksplan ini sudah dalam keadaan steril, jadi tidak perlu dilakukan sterilisasi eksplan. Eksplan diambil dari media dalam kotak aseptik, lalu ditanam dengan berbagai variasi penanamn, yaitu variasi organ yang ditanam, dan letak penanaman. Eksplan ini berusia sangat muda ( 7 hari). Jadi sel-sel yang menyusun eksplan ini masih bersifat merismatik. Karena masih bersifat merismatik, tidak perlu adanya proses meristemoid, dengan pelukaan. Tetapi pelukaan perlu dilakukan untuk menginduksi pertumbuhan kalus dengan cepat.Organ yang ditanam dalam media MS 2,4 D terdiri dari batang, kepala kecambah, dan daun. Sedangkan batang masih dimodifikasi lagi dengan letak penanaman yaitu secar vertikal dan horisontal. Penanaman secara horisontal berarti seluruh bagian batang kontak dengan media, sedangkan penanamn secar vertikal bagian yang kontak dengan media adalh ujung bawah batang. Variasi penanamn ini bertujuan untuk mengetahui tingkat potensi pertumbuhan kalus pada masing-masing organ tanman kecambah. Sedangkan variasi peletakan eksplan pada media bertujuan untuk mengetahui bagaimana tingkat pertumbuhan kalus dalam hubunganya keefektifan penyerapan nutrisi dari media.Dari hasil yang diperoleh tingkat kecepatan pertumbuhan kalus dari masing-masing organ adalah sebagai berikut :Organ yang ditanamKalus tumbuh pada hari ke-

Batang ( Horisontal)3

Batang ( vertikal )Kontam

Kepala kecambah21

Daun4

Dari data diatas pertumbuhan kalus yang paling cepat adalah batangdengan posisi penanman horisontal. Hal itu disebabkan oleh adanya pelukaan di sepanjang batang, dan di sepanjang batang tersebut kontak dengan media. Kalus tumbuh pertama kali di bagian ujung batang. Ujung batang tersebut merupakan bekas irisan dan di ujung, kalus dapat tumbuh lebih leluasa. Pertumbuhan kalus disertai dengan pertumbuhan akar. Semakin hari kalus bertambah besar dan akar bertambah banyak dan panjang. Fenomena ini disebut dengan root like callus, dimana kalus terbentuk seperti akar. Hal itu mungkin disebabkan oleh kadar auksin dalam media yang terlalu tinggi, dimana auksin tersebut dalam kultur memacu pemanjangan sel, sehingga seolah-olah terbentuk akar. Selain itu eksplan itu sendiri mempunyai hormon auksin endogen sendir, sehingga dengan hormon auksin eksogenus ( 2,4 D) maka differensiasi kalus cenderung terbentuk akar. Pada hari ke-42 kalus berwarna kecoklatan. Fenomena ini disebut dengan browning. Browning ini disebabkan oleh terakumulasinya senyawa fenolik yang dihasilkan oleh kalus. Senyawa tersebut teroksidasi, sehingga kalus berubah warna menjadi gelap.Sedangkan batang dengan penanaman vertikal mengalami kontaminasi. Kemungkinan kontaminasi ini bukan berasal dari eksplan karena eksplan dalam keadaan steril, kontaminasi mungkin dari media atau pada proses pengerjaanyaPada organ daun, kalus tumbuh pada hari ke-4. Kalus tumbuh di ujung potongan daun. Hal itu wajar karena tempat tersebut adalah bekas irisan (pelukaan) sehingga memacu proses pertumbuhan kalus. Selain tumbuh kalus, ujung daun juga memanjang, dan tumbuh akar. Ujung daun memanjang menjadi batang disebabkan karena ujung daun tersebut masih bersifat merismatik. Dengan adanya media yang sesuai, sel-sel akan membelah dan membesar sehingga ujung daun memanjang, seolah-olah tumbuh batang. Pada hari ke 42, sebagian daun tampak membusuk, hal tersebut sel-sel yang ada pada daun sudah mati. Hal itu mungkin disebabkan oleh nutrisi dalam media yang mulai habis, atau terakumulasinya metabolit toksik.Pada penanman kepala kecambah, kalus tumbuh pada hari ke 21. Tidak seperti organ lainnya, pertumbuhan eksplan ini tidak didahului oleh pertumbuhan kalus, tapi pertumbuhan batang, daun dan akar. Pada hari ke-3 batang ujung kepala memanjang, dan daun mulai keluar dari lembaga bijinya. Setelah itu, diikuti oleh pertumbuhan akar pada ujung kepala kecambah. Organ-organ tersebut terus memanjang. Pada akhirnya pada hari ke 21 tumbuh kalus di ujung. Dan pada hari ke 42, kalus berwarna coklat dan warna daun menjadi gelap.Pertumbuhan Kalus kemangi Eksplan dalam kultur kalus ini adalh adalah potongan daun kemangi. Pemilihan letak daun berdasarkan pertimbangan, bila daun terlaulu muda daun ke 1 dan ke 2 , sangat rentan terhadap sterilan. Sedangkan daun yang terlalu tua sering terjadi pengeluaran senyawa fenol, dan sukar dilakukan proses differensiasi melalui pelukaan. Senyawa ini mengikat senyawa oksida dari udara luar menjadi senyawa fenolat yang meneyebabkan eksplan berwarna coklat dan kemudian akan mati (Hendrayono & Wijayanti,1994).Karena daun kemangi diambil dari lingkungan luar, maka sebelum penanaman, dilakukan sterilisasi terlebih dahulu. Lapisan daun yang terluar biasanya terinfeksi spora dan sel-sel mikroba, sebelum diatanam daun distrerilkan terlebih dahulu. Daun kemangi dicuci lebih dahulu sambil digosok agar debu dan kotoron yang melekat pada daun hilang. Sterlisasi dilakukan dengan larutan bayclean dalam air. Sabun cair diguanakan sebagai larutan pembasah (wetting agent ) karena lapisan daun kemangi mengandung stomata. Adanya wetting agent, memudahkan strilisasi masuk dan kontak dengan daun . Lalu daun dibilas dengan aquades steril untuk menghilangkan sterilant-sterilant yang menganggu pertumbuhan sterilant.Daun yang sudah disterilkan dipotong dengan ukurann tertentu. Ukuran potongan daun mempengaruhi jumlah cemaran dan kontaminan yang terperangkap dalam jaringan Eksplan yang besar kemungkinan akan mengandung cemaran yang lebih banyak Eksplan yang besar dapat tumbuh lebih baik daripada eksplan yang berukuran kecil, karena penyerapan nutrisi dan aerasi gas yang baik ( Hendrayono & Wijayanti , 1994). Oleh karena itu dicari eksplan dengan ukuran eksplan yang optimal dan efektif. Dalam praktikum ini ukuran eksplan hanya perkiraan saja, tergantung pada ukuran pot yang digunakan.Eksplan yang sudah siap ditanam, dilukai atau digores melintang denagn tulang daun. Penggoresan ekasplan ini untuk mempercepat pertumbuhan kalus, karena secara alamiah kalus terbentuk dalam keadaan stress ( Santosa, ). Kalus akan terbentuk pada goresan ini. Goresan jangan terlalu banyak agar eksplan tidak mati. Eksplan diletakkan di media denga sedikit penekanan agar seluruh bagian eksplan dapat kontak dengan media sehingga penyerapan eksplan dapat maksimal. Penanman eksplan janga sampai tenggelam karena akan menggangu aerasi dan dapat menimbulkan kesulitan saat pengambilan kalus waktu sub kultur. Sesuadah ditanam diinkubasi suhu 22-28oC. Pengerjaan eksplan dilakukan secara aseptik baik sebelum penanaman maupun sesudah penanamn. Mulut botol pot, pinset, skapel, dilewatkan dalam api spiritus sebelumnya digunakan agar meminimalisir kontaminasi.Dari hasil praktikum didapatkan pertumbuhan kalus daun kemangi muncul pada hari ke 6. Dari 10 pot yang dikulturkan, ada 3 pot yang tumbuh kalus dan 7 sisanya terkontaminasi, tiga diantarnya daun menghitam, yang berarti daun sudah rusak (selnya mati). Pada hari ke 6 tumbuh benjolan putih di tepian luka (goresan). Pada hari ke 7 tepi daun mulai melengkung dan gumpalan putih muali membesar, itu merupakan pertanda pertumbuhan kalus.Kultur Kalus binahong Secara garis besar, cara kerja kultur kalus daun binahong sama seperti kultur kalus kemangi. Perbedaanya namun terletak pada jenis sterilant dan lama penggojogan dengan sterilant. Strerilant yang digunakan adalh larutan sublimat 0,3%, sedangkan dalan kultur kalus daun kemangi menggunakan larutan bayclean 25%. Pada kultur kalus binahong ini, lama penggojokan dengan sterilant selama 7 menit, lebih singkat daripada kultur kalus kemangi. Hal itu disebabkan sifat larutan sublimat yang begitu korosif. Penggunaan bahan ini harus hati-hati karena bersifat racun, maka dari itu sterilisasi menggunakan Raksa (II) klorida (larutan sublimat) waktunya lebih pendek. Bila sterilisasi terlalu lama dapat menyebabkan kerusakan pada eksplan ( berwarna cokalt) sehingga eksplan tersebut tidak akan menjadi kalus. Dari hasil praktikum didapatkan pertumbuhan kalus setelah hari ke 7. Dari total 9 pot, hanya 2 pot yang terkontaminasi, sedangkan 7 pot lainnya tumbuh kalus, walaupun hanya ada gumpalan putih tipis di sepanjang tepi. Didalam pengamatan, potongan daun tampak berwarna gelap, hanya beberapa saja yang berwarna hijau segar. Hal ini akibat pengaruh dari sterilant yang digunakan.Evaluasi waktu inisiasi kalus pada masing-masing tumbuhan, dengan media yang samaNoBagian tumbuhanKalus tumbuh pada hari ke-

1Batang kacang hijau2

2Daun kacang hijau3

3Daun kemangi6

4Daun binahong7

5Kepala kacang hijau21

Dari data di atas, pembentukan kalus yang tercepat adalah batang kacang hijau, hal ini wajar karena sel penyusun dari organ tersebut terdiri atas sel muda (merismatik) sehingga memiliki daya tumbuh tinggi, sehingga cepat terbentuk kalus. Begitu juga dengan daun kacang hijau. Pembentukan kalus daun kemangi lebih cepat daripada daun binahong. Hal ini mungkin disebabkan oleh faktor dalam daunnya sendiri, misalnya ketebalan daun, jumlah hormon endogen, permukaan daun yang sulit menyerap nutrisi dari media. Atau faktor dari jenis sterilant. Sterilisasi daun binahong menggunakan sublimat yang cenderung merusak jaringan daun, sehingga daun berwarna coklat ( sel mati ), dengan keadaan begitu pertumbuhan kalus terhambat. Selain itu karena proses pengerjaannya, misalnya banyaknya luaka yang digoreskan, potongan ukuran daun, dan pemilihan eksplan daun. Pembentukan kalus yang paling lama adalah kepala kecambah dari kacang hijau. Walaupun sama-sama penyusunanya adalah sel-sel meristem, namun eksplan tersebut mempunyai kecenderungan untuk membentuk atau memperbesar organ tumbuhan terlebih dahulu. Karena eksplan tersebut berasal dari bakal biji (kandung lembaga) kacang hijau, jadi eksplan tersebut cenderung meneruskan pertumbuhan kecambah seperti normalnya perkecambahan (membentuk daun dan akar, memperpanjang batang.Evaluasi keberhasilan pembentukan kalus dalam kaitanya dengan SterilisasiJenis eksplan tumbuhanJenis senyawa sterilantLama penggojokan% pot yang terkontaminasi

Kecambah kacang hijauEksplan steril-1/9 x 100% = 11,1%

Daun kemangiLarutan Bayclean 25%15 menit7/10 x 100%= 70%

Daun BinahongLarutan sublimat 0,3%7 menit1/9100% = 11,1%

Dari data diatas hasil kultur kalus yang menghasilkan sedikit kontaminasi adalah kultur kalus yang menggunakan eksplan steril dan eksplan yang disterilisasi dengan larutan sublimat 0,3%. Tentunya diantara keduanya ada perbedaan, kultur dengan eksplan steril hasil pertumbuhan kalus lebih cepat dan bagus, sedangkan pada eksplan yang disterilkan dengan sublimat 0,3% pertumbuhan kalus sangat lambat dan hasilnya tidak sebagus kalus kacang hijau dan kemangi. Hal itu disebabkan larutan sublimat merusak jaringan daun, ( terlihat dari bercak hitam pada potongan daun). Sedangkan senyawa larutan bayclean (Natrium hipoklorit) menghasilkan kultur kemangi yang terbanyak kontaminasinya. Tetapi larutan ini tidak merusak jaringan daun (eksplan), hal ini dapat dilihat dari warna daun yang hijau terang, tidak ada bercak hitam. Lagipula kalus yang dihasilkan cepat& cukup bagus (merata di setiap goresan). Bagus atau tidaknya kalus yang dihasilkan, bukan hanya ditentukan jenis sterilant saja, namun tidak lepas dari pengaruh faktor intern eksplan itu sendiri ( misalnya; bentuk anatomi daun, morfologi daun, dan hormon endogen lainya) dan proses pengerjaan dalam kultur.Evaluasi warna kalusKalus pda kacang hijau, kemangi dan binahong berwarna putih sampai ptih agak coklat. Warna kalus tersebut relatif sama. Pada eksplan daun, warna kalus ada yang hijau, tapi sedikit pada bagian dalm kalus, yang diduga masih membawa sifat asli eksplan. Tidak hijaunya kalus diduga disebabkan oleh hilangnya polarisasi yang tentunya jika masih ada dapat mendorong lebih banyak dibentuknya klorofil. Wanan coklat pada kalus mungkin disebabkan terjadinya browning.KontaminasiJamur dan bakteri yang menkontaminasi pot kultur kalus kacang hijau, kemangi dan binahong relatif sama. Jamur tersebut dalam bentuk kapang berwarna putih bersih seperti kapas lembut yang tumbuh media dan menempel di eksplan. Disamping itu ada juga jamur yang berbentuk bercak lendir putih maupun lendir hitam yang tumbuh di media. Kontaminasi ini mungkin disebabkan oleh; sterilisasi yang kurang berhasil saat pengerjaan dan proses pengkulturan yang kurang aseptis.SubkulturSubkultur dapat dilakukan pada ketiga jenis kalus diatas. Namun dalam praktikum ini, subkultur yang dilakukan adalah pada kalus kemangi. Hal itu disebabkan karena kalus dari kemangi bebas kontaminan, kalusnya berwarna putih, dan dihasilkan kalus yang banyak. Sedangkan pada kalus kacang hijau, keadaan kalusnya sudah mengalami browning (pencoklatan). Dimungkinkan kalus ini sudah sampai pada tahap stasioner, karena terjadi akumulasi metabolit sekunder atau toksik (senyawa fenol). Sedangkan pada kalus yang dihasilkan oleh daun binahong amatlah sedikit, hanya gumpalan putih tipis pada tepi daun. Kalau kalus ini disubkultur, dikhawatirkan kalus tersebut akan mati atau tidak dapat bertahan hidup, karena kalus yang terbentuk kecil. Kalus tersebut diperkirakan berada fase lag, dimana kalus tersebut masih dalam penyesuaian (adaptasi), jadi bila ia dipisahkan dari eksplan, dikhawatirkan kalus tersebut belum dapat mandiri dalam melakukan metabolismenya, masih tergantung pada eksplan. Intinya subkultur bagus dilakukan saat kalus berada pada fase eksponensial, dimana selsel kalus berproliferasi dan sudah dapat melakukan metabolismenya sendiri. Kalus yang diperkirakan sudah pada tahap tersebut adalah Kalus daun kemangi.. Kalus yang akan dipindahkan harus terbebas dar media dan eksplan. Jika kalus terlalu besar, maka kalus perlu dipotong-potong. Kalus yang dipindahkan jangan terlalu kecil karena akan menghambat pertumbuhannya agar tidak mati. Kalus yang akan dikulturkan sebaiknya mempunyai diameter 5-10mm berat 20-100 mg (Dodds, 1982). Kalus dipindah ke media yang baru dengan komposisi yang sama. Kalus yang dipindah ke media baru, nanti akan terus berkembang, sel-sel kalus akan berproliferasi. Kalus akan melakukan aktivitasnya dalm hal biosintesis metabolit primer maupun metabolit sekunder. Subkultur dilakukan satu kali dan selama 14 hari. Pada hari ke 15 kalus dipanen. Hasil yang didapatkan adalah berat kalus basah = 947,3 mg. Setelah dikeringkan kalus mengalami penyusutan berat yang drastis, yaitu sekitar 91, 42%. Hal itu menunjukkan komposisi terbesar dari kalus adalah air. Diman kalus tersebut banyan menyerap air dari media. Selam sub kultur, kalus tidak mengalami differensiasi sel, kalus masih dalam keadaan kompak Kuantifikasi pertumbuhan kalus pada praktikum ini, hanya berat basah dan berat kering saja. Sedangkan cell count, Packed Cell volume dan Mitotic Indec tidak dilakukan.VII. KESIMPULAN1. Media yang digunakan dalam kultur kalus ini adalah media Murasige-Skoog, dengan penambahn zat pengatur tumbuh 2,4 D2. Pertumbuhan kalus yang paling cepat adalah pada eksplan batang kacang hijau, yaitu hari ke 23. Kalus kemangi terbentuk pada hari ke 6, kalus binahong terbentuk pada hari ke 74. Kalus yang disubkultur adalah kalus kemangi5. Subkultur dilakukan satu kali dan dipanen setelah 14 hari6. Barat kalus basah yang didapatkan adalh 947,3 mg7. Penyusutan berat kalus kering adalh sebesar 91,42% ____________________________________________________*Dokumentasi Laporan Praktikum Kultur Jaringan Tanaman, tertanggal 30 Desember 2006