PENGUNDUHAN & PENGUNDUHAN & PEMURNIANPEMURNIAN

PRODUK BIOPROSES PRODUK BIOPROSES

GIYARTOGIYARTO

PS TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN PS TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

UNEJUNEJ20142014

LEARNING OUTCOME

Mampu menerapkan prinsip dan teknik pengunduhan

dan pemurnian produk bioproses

POKOKPOKOK BAHASAN BAHASAN• Pendahuluan• Pengunduhan Produk Bioproses

– Separasi Mekanis– Disrupsi Sel– Separasi Sistem Keseimbangan

• Pemurnian Produk Bioproses– Teknik Kromatografi (Adsorpsi, Ion- Exchange, Filtrasi Gel,

dan Afinitas)– Ultrafiltrasi– Kristalisasi– Pengeringan

PPENDAHULUANENDAHULUAN• Komponen penting dalam bioproses :

– Formulasi Media– Sterilisasi Media– Produksi Starter– Pemeliharaan Pertumbuhan Mikroba dan Pembentukan Produk– Pengunduhan dan Pemurnian Produk– Penanganan Limbah

• Produk bioproses: biomasa, enzim, metabolit, dan produk transformasi

• Lingkup industri bioproses : bahan kimia, bahan pangan, medis, dsb

Perlakuan pendahuluan MEDIUM Pengaturan pH Formulasi STERILISASI PREPARASI INOKULUM AERASI dan AGITASI

PENGENDALIAN PROSES FERMENTASI

PEMISAHAN SEL Biomasa Cairan bebas sel ISOLASI PRODUK Limbah

PEMURNIAN

PRODUK

SKEMA DIAGRAM ALIR BIOPROSES

PENGUNDUHAN DAN PEMURNIAN

• Cairan fermentasi : mengandung berbagai subtansi : sel, komponen medium, dan senyawa metabolit, sehingga harus dipisahkan.

• Cara pengunduhan & pemurnian produk bioproses sangat bervariasi dari yang sederhana hingga yang sangat rumit ........ menentukan cost production

• Cost yang diperlukan untuk tahap ini ± 60% (dr total)

Faktor Pengunduhan dan Pemurnian Produk

Bioproses• Lokasi produk (intra atau ekstra -seluler)

• Sistem fermentasi (SSF atau SmF)

• Karakteristik produk (fisiko kimia)

• Jumlah/kadar produk

• Kandungan substansi selain produk (produk samping)

• Bentuk produk yang diinginkan

• Persyaratan kemurnian produk

• Nilai ekonomi produk

UPAYA PENINGKATAN EFISIENSI PENGUNDUHAN

• Penggunaan strain mikroba bersifat flokulan

• Modifikasi kondisi fermentasi yang mampu menurunkan produk metabolit kontaminan

• Akurasi waktu pengunduhan

• Kontrol pH dan suhu pasca pengunduhan

• Penggunaan agen flokulan (immobil)

• Penggunaan enzim perusak dinding sel

HASIL BIOPROSES

LIQUID SOLID

SEPARASI MEKANIS

DIS RUPSI

FILTRAT (EKSTRASELULER)

SEL (INTRASELULER)

SEPARASI SISTEM KESETIMBANGAN

PURIFIKASI

KRISTALISASI

PENGERINGAN

METABOLIT PRI MER

METABOLIT SEKUNDER

PRODUK TRA NSFORMASI

ENZIM

PROTEIN

STEROID

NUKLEOTIDA

Keju, Tape, Tempe

PENGUNDUHAN DAN PEMURNIAN

SEPARASI MEKANIS• Pemisahan sel dan bahan padat lain dari cairan

fermentasi dilakukan dengan cara:

• PengapunganPengapungan

• SedimentasiSedimentasi

• SentrifugasiSentrifugasi

• Filtrasi Filtrasi

• Pemilihan cara tergantung jenis produk ekstra atau intraseluler.

• Sering digunakan: filter aids, agensia flokulan, pemanasan.

PENGAPUNGAN

• Prinsip: pemisahan didasarkan perbedaan aktivitas permukaan dari substansi

• Substansi : sel, makro molekul, koloidal akan ditarik ke permukaan oleh gelembung gas yang diintroduk-si dari bawah; lalu dipisahkan melalui overflow.

• Sering menggunakan surfaktan (surface active agents) : asam lemak, amina & senyawa amonium

• Variabel yg dipertimbangkan : pH, kecepatan gas, konsentrasi surfaktan.

PRESIPITASI

• Prinsip: produk bioproses diikat dengan senyawa pembentuk senyawa kompleks atau garam tak larut atau pelarut organik, shg kotoran bisa dipisahkan

• Isolasi teramisin dengan senyawa amonium rantai panjang lalu dilakukan filtrasi

• Presipitasi protein dgn dekstran dan polietilen glikol

• Presipitasi dekstran dgn pelarut organik (metanol, etanol, atau aseton)

SEDIMENTASI• Prinsip: pemisahan berdasarkan gaya gravitasi• Stoke Law: kecepatan sedimentasi partikel bulat yang

tersuspensi dalam cairan proporsional dengan kuadrat diameter

v = D2 g (ρp – ρf) / 18 u

v = kecepatan sedimentasi (m/det)

D = diameter partikel mikroba (m)

g = gaya gravitasi (m/det2)

ρp = densitas partikel mikroba (kg/m3)

ρf = densitas liquid (kg/m3)

u = viskositas liquid (Ns/m2) .

SENTRIFUGASI

• Prinsip: pemisahan berdasarkan gaya sentrifugasi

• Sentrifugasi sering digunakan sbg pengganti filtrasi:– Cara filtrasi sulit dan lambat– Sel atau padatan tersuspensi harus bebas filter aids

– Diperlukan separasi kontinyu dengan higienis tinggi.

• Lebih cocok utk separasi semi-kontinyu & kontinyu

• Kecepatan pemisahan sentrifugasi :

v = D2 N2 r (ρp – ρf) / 1640 u

N = kecepatan rotasi ; r = jari-jari efektif pemisahan

AGREGASI & FLOKULASI SEL

• Agregasi : pemisahan berdasarkan besar ukuran sel

• Flokulasi : pemisahan menggunakan agen flokulan

• Agensia flokulan untuk bakteri, khamir, algae:

• Alum, garam kalsium, ferri

• Asam tannat, titanium, tetra klorida,

• Senyawa amonium, alkil-amina,

• Asam fosforat .

TIPE SENTRIFUSE• Tipe : Disc Bowl dan Tubular Bowl

Disc BowlDisc Bowl Tubular BowlTubular Bowl

Padatan keluar secara otomatis melalui lubang dekat rotor dan Pembersihan cukup sulit

Pengeluaran padatan mudah dan mudah dibersihkan

Lebih cocok untuk cairan dengan bahan padat kurang dari 10%

Cocok untuk pemisahan partikel berukuran 0,1 – 200 Um, dgn bahan padatan lebih dari 10%

Gaya sentrifugal kurang besar Gaya sentrifugasi besar

Kapasitas besar Kapasitas rendah dan mudah kehilangan efisiensi

SKEMA SENTRIFUSE

FILTRASI

• Prinsip : memisahkan partikel dari cairannya menggunakan medium porous (filter)

• Faktor yang harus diperhatikan:• Viskositas dan densitas filtrat• Sifat partikel (bentuk, ukuran, distribusi)• Rasio solid-liquid• Produk yang dikehendaki (padatan atau cairan)• Sistem produksi (batch atau kontinyu)• Skala produkisi (kecil atau besar)• Kondisi (aseptis atau non aseptis)• Tekanan (perlu atau tidak)

FILTRASI ..........lanjutan

• Filtrasi bisa terjadi jika ada gaya yg dikenakan pada sistem, yaitu perbedaan tekanan inlet dan outlet

• Harus dilakukan dg: gravitasi, pengisapan (vacuum filtration), dan penekanan (pressure filtration)

• Resistensi filtrasi terjadi oleh filter dan cake yang terbentuk............. Kecepatan filtrasi

• Alat bantu dalam filtrasi : filter aids dan filter.– Filter aids tidak disarankan untuk produksi biomassa– Filter batch : plate-frame filter dan pressure-leaf filter– Filter kontinyu : rotary vacuum filter

MEKANISME FILTER AIDS

BENTUK FILTER AIDS

DISRUPSI SEL

• Produk intraseluler harus dikeluarkan dari sel mikroba dengan cara disrupsi

• Disrupsi harus menjamin tidak terjadi kerusakan produk (denaturasi; hidrolisis, dll)

• Metode disrupsi yang banyak dipakai:

– Fisiko-mekanis : liquid shear, solid shear, abrassive agitation, freeze-thawing

– Khemis : deterjen, shock osmosa, perlakuan alkali, ensima.

HO

MO

GEN

ISE

R

LIQUID SHEAR

• Prinsip: homogenizer bertekanan tinggi mampu menghancurkan sel mikroba secara efektif

• Bila suspensi dalam alat diberi tekanan tinggi, lalu diturunkan secara mendadak maka akan terjadi penghacuran sel.

• Contoh: untuk menghancurkan sel yeast : digunakan tekanan 550 kg/cm2 (Hetherington, 1971)

SOLID SHEAR

• Prinsip: ekstrusi sel mikroba beku (-25oC) bertekanan

• Alat: Hughes press atau X-press

• Penghancuran sel terjadi sbg akibat dari kombinasi liquid shear dan adanya kristal es

• Contoh:

– Semi kontinyu X-press suhu -35oC dan -20oC untuk menghancurkan S.cerevisiae dg kecepatan 10 kg/jam dengan 90% sel hancur (Magnusson & Enebo, 1976)

ABRASIV AGITASI• Penghancuran mekanis dengan disintegrator

• Suhu disintegrator bisa mencapai 35oC, tapi untuk jenis enzim tertentu masih tak berbeda dengan teknik yg lain

FREEZING - THAWING• Pembekuan & pencairan pasta sel mengakibatkan cairan

sel membeku lalu mencair lagi dapat menghancurkan sel

• Proses ini lambat dan hanya terbatas pada substansi seluler saja, dan biasanya dikombinasi dengan cara lain.

• Contoh: pemisahan enzim β-galaktosidase dari sel S.cerevisiae (Henig dan Kula, 1976)

METODE KHEMIS - DETERJEN

• Prinsip: merusak lipoprotein sel membran mikroba dan membebaskan komponen intraseluler

• Senyawa deterjen : ammonium, Tween

• Kelemahan : sifat mendenaturasi dari deterjen mengakibatkan beberapa protein rusak sehingga perlu pemisahan lebih dulu

• Contoh : – Pengambilan pullulanase dari sel Klebsiella pneumonia. – Sel disuspensikan dlm buffer 7 ditambah Na-kholat 1%.– Campuran diaduk 1 jam agar enzim terlarut semua

OSMOTIC SHOCK

• Perubahan mendadak konsentrasi garam dapat menghancurkan sel tipe tertentu

PERLAKUAN ALKALI

• Senyawa alkali mampu menghidrolisis dinding sel

• Contoh isolasi enzim asparaginase

PERLAKUAN ENZIMATIS• Lisosim dan ekstrak enzim leukosit dari Streptomyces,

Penicilium, Trichoderma, bisa menghidrolisis sel

SEPARASI SISTEM KESETIMBANGAN

1.Ekstraksi Liquid-Liquid

2.Destilasi

EKSTRAKSI LIQUID-LIQUID

• Prinsip: memisahkan komponen dari campurannya dengan pelarutnya

• Syarat ideal bisa dihasilkan produk yang maksimal dalam volume pelarut sekecil-kecilnya

• Pedoman : like dissolved like (polaritas molekul)

– Pelarut senyawa non polar = liquid berpolaritas rendah (0).

– Pelarut senyawa polar = liquid berpolaritas tinggi

DERAJAT EKSTRAKSI

• Pemilihan solvent dipengaruhi oleh koefiisien distribusi partisi (K).

K = (Kons. solut dlm ekstrak) : (Kons. solut dlm rafinat)

– K tinggi : ekstraksi sempurna; cukup single stage extraction– K rendah : ekstraksi sulit; perlu multistages extractions .

METODE EKSTRAKSI

• Counter-Current Extraction : tipe sentrifugasi umum• Contoh pemakaian pada ekstraksi Penisilin G

– Antibiotik ini dalam air (netral) akan terionkan, namun dalam kondisi asam tidak terjadi ionisasi, shg mudah larut dalam pelarut organik

DISTILASI

• Prinsip: pemisahan menurut perbedaan titik didih

• Tahapan distilasi :

– Evaporasi campuran

– Pemisahan vapor-liquid dalam kolom ( senyawa TD rendah terpisah dengan senyawa TD tinggi)

– Kondensasi uap untuk mendapatkan distilat

PEMURNIAN PRODUK BIOPROSES

• Untuk isolasi dan pemurnian produk metabolit banyak digunakan teknik kromatografi

• Teknik kromatografi dikelompokkan menjadi:

• Kromatografi adsorpsi

• Ion- Exchange

• Filtrasi gel

• Afinitas

KROMATOGRAFI ADSORPSI

• Prinsip: pengikatan solut pada fase solid (absorben) oleh gaya Van der Walls

• Contoh absorben : C aktif, Al-oksida, Al-hidroksida, Mg-oksida, silika gel atau resin makroporous

FILTRASI GELFILTRASI GEL

• Pemisahan bahan berdasarkan perbedaan besar/ ukuran molekul dengan prinsip difusi pada pori-pori

ION EXCHANGE

• Prinsip : terjadi perubahan ion yang reversibel antara fase cair dengan fase padat yang tidak diikuti dengan perubahan radikal dalam struktur padat

• Contoh pemurnian streptomisin

R – COO’NaR – COO’Na++ + Streptomisin R – COO’streptomisin + Streptomisin R – COO’streptomisin++ + NaOH + NaOH

R – COO’StreptomisinR – COO’Streptomisin++ + HCl R – COOH + streptomisin + HCl R – COOH + streptomisin++ + Cl + Cl--

R – COOH + NaOH R – COO’NaR – COOH + NaOH R – COO’Na++ + H + H22OO

AFINITAS

• Prinsip: pemurnian berdasarkan fungsi dan struktur khemis suatu senyawa biologis.

• Teknik ini bergantung pada interaksi antara senyawa biologis dan pasangannya, misal enzim-substrat; enzim-inhibitor, dsb

• Molekul yang dimurnikan secara spesifik diadsorpsi oleh ligan yang diimobilisasikan pada matriks.

ULTRAFILTRASI

• Prinsip: filtrasi solut dengan filter berpori sangat kecil

• Senyawa dengan BM kurang dari 500 Da yang dapat lolos filtrasi, shg senyawa seperti protein, enzim, hormon dan virus dapat tersaring

KRISTALISASI

• Prinsip: mengubah produk menjadi bentuk kristal

• Aplikasi pd produksi asam organik dan asam amino

• Contoh :

– Produksi asam sitrat• Cairan fermentasi ditambah Ca-hidroksida shg terbentuk

Ca-sitrat

• Kristal Ca-sitrat difiltrasi dan direaksikan dg sulfat tak larut

• Larutan Asam sitrat dibebaskan lalu dikristalkan

• Asam glutamat dan lisin dikristalkan dg cara ini

PENGERINGAN

• Prinsip: menguapkan liquid dari sistem solid-liquid

• Keuntungan: – Biaya transport lebih rendah

– Bahan mudah ditangani dan dikemas

– Tidak perlu fasilitas penyimpanan khusus.

• Jenis pengering:– Spray drier (banyak digunakan untuk material biologis)

– Drum drier (produk yang tahan (stabil) terhadap panas).

CONTOH PENGUNDUHAN DAN CONTOH PENGUNDUHAN DAN PEMURNIAN ANTIBIOTIK PEMURNIAN ANTIBIOTIK

PENISILINPENISILIN

Pendinginan pada Suhu 5 – 10oC

Pemisahan miselia P. Chrysogenum dengan rotary vacuum

Pengasaman filtrat pada pH 2 – 2,5 dengan H2SO4

Pemanenan Cairan Fermentasi

Ekstraksi penisilin dari filtrat dalam butil asetat menggunakan ekstraktor Counter-current sentrifugal

Ekstraksi penisilin dari butil asetat dalam buffer pH 7 menggunakan ekstraktor Counter-current sentrifugal

Pengasaman fraksi cairan pada pH 2 – 2,5 dengan H2SO4

dan diekstrak kembali dalam butil asetat segar

Penambahan K-asetat pada pelarut dalam tangki kristalisasi untuk memisahkan penisilin sebagai garam K

Rekoveri kristal dalam filter sentrifuse

Pengolahan lanjut Garam Penisilin

TUGASTUGAS • Dari artikel yang ditugaskan oleh Dr. Jayus,

identifikasi dan tuliskan:

1. Metode sterilisasi yang digunakan

2. Jenis produk yang dihasilkan

3. Metode pengunduhan produk yang digunakan

4. Metode pemurnian produk yang digunakan

• Setelah diidentifikasi dari semua artikel dalam kelompok Saudara pilih satu artikel yang akan dijadikan bahan presentasi kelompok.

• Tugas dipresentasikan dan dikumpulkan pada pertemuan berikutnya.

BAHAN RENUNGANBAHAN RENUNGAN

Cara yang nyata untuk membedakan seseorang

adalah layanan yang diberikan

Ada dua kenikmatan yang sering dilalaikan oleh

kebanyakan orang yaitu kesehatan dan waktu

senggang.