Vetenskapens hus

KriminalteknologiKriminalteknologi medmed

PYROSEKVENSERINGPYROSEKVENSERING

Vetenskapens hus

KriminalteknologiKriminalteknologi

Tidigare metoderAnalys av: blodgrupp, serumproteiner och enzymer

− Färska och tillräckligt stora blodspår krävs

−Endast uteslutning Ej identifiering

DNA-metoderAnalys av: de flesta biologiska spår såsom blod, saliv, sperma, hårstrån och hud

+Ersatt traditionella metoder (from 1994)

+Gamla och små spår kan användas

+Mycket specifik Identifierar

−Spår från fel person?

Vetenskapens hus

DNADNADeoxyribonucleic AcidDeoxyribonucleic Acid

• DNA – kroppens recept – kodar för gener (ca 22 000 st)

• Socker, fosfat och fyra baser; A (Adenin) T (Tymin) C (Cytosin) G (Guanin)

• Baserna binder (A=T och C≡G) bildar DNA-kod (ex ACTTG)

• Människans DNA 2 meter (3 000 000 000 baspar) / cell!

Vetenskapens hus

DNADNA• I varje cellkärna och i

mitokondrierna

• Hälften av kärn-DNAt från varje förälder

• Alla cellers DNA hos en person är identiska

• Varierar ej med tiden

• Unikt hos varje individ

Vetenskapens hus

STR - STR - MetodMetod

DNA DNA CSI?CSI?

Hitta och säkerställa spår!

Vetenskapens hus

AATG

Uppsättning från 1 individ

STRSTRShort Tandem RepeatsShort Tandem Repeats

• Standardmetod kriminal

• DNA från minst 100 celler

• STR-områden = repetitioner om 4 baser (ex AATG AATG AATG) + kön

• Nonsens-DNA

• 1/1 000 000 undersöks 10 specifika områden

• Skillnad i antal upprepningar

• Dubbel uppsättning (från mamma och pappa)

Vetenskapens hus

1 chans på 1 miljon att 2 obesläktade personer har samma DNA-profil

1. Kopiering PCR

2. Separering efter storlek elekrofores

3. Utläsning DNA-profil

Vetenskapens hus

DNA-registerDNA-register

• Svenska register upprättades 1999

• Används för att lösa / koppla samman ouppklarade brott

• Innehåller DNA-profiler (STR) brottsplatsspår fällda gärningsmän

• Endast nonsens-DNA

• Register med hela befolkningen?

Vetenskapens hus

FramtidFramtid• Snabbare analyser

• Skadat / gammalt DNA

• Små mängder DNA

• Automatisering, microchips

• På-plats-labb

• Få ut info från DNA: längd, ögon- & hårfärg

• Internationellt samarbete

Vetenskapens hus

• DNA från mitokondrierna (energistationer i cellen)

• Ärvs från mamman

• Tåligare, kortare och mindre variation i baserna

• I varje cell finns flera mitokondrier mer mtDNA än kärnDNA i varje cell färre celler krävs

• Mord, identifiering av lik, komplement till STR. Små och gamla spår.

Mitokondrie-DNA (mtDNA)Mitokondrie-DNA (mtDNA)

Vetenskapens hus

PyrosekvenseringPyrosekvensering

mtDNA analyseras med hjälp av…

Vetenskapens hus

1. Utvinning av DNA från biologiskt spår

2. PCR för att öka mängden DNA vi vill sekvensera

3. Förbehandla provet och sätta till sekvenseringsprimers (idag!)

4. Syntetisera DNA med hjälp av Pyrosekvensering (idag!)

Vid förbehandling av provet separeras de två DNA – strängarna.

Vetenskapens hus

1. Nedbrytning SDS bryter ned

cellmembran.Proteinas K bryter ned proteiner bundna till DNA.

2. Rening Kolonn binder DNA.Cellrester tvättas bort.

3. Eluering DNA sköljs ur kolonn.Rent DNA i provröret!

1. Extraktion & Rening1. Extraktion & Rening

Vetenskapens hus

Masskopiering av DNA

Syntes av DNA i cykel:1. Denaturering: Separation av

DNA strängar (95°C)

2. Hybridisering: Primer fästs (~50°C)

3. Elongering: Komplementär sträng syntetiseras (70°C)

Biotin sätts fast på DNA mha Primer

2. Polymerase Chain Reaction 2. Polymerase Chain Reaction (PCR)(PCR)

Vetenskapens hus

Magneter kopplas till den ena DNA-strängen

3. Provberedning3. Provberedning

A C A A T T G C G G AStrepatividin

S

SSS

S

S

S

S S S

ST G T T A A C G C C T

G C C TBiotin

NaOH

A C A A T T G C G G A

T G T T A A C G C C T

Biotin

A C A A T T G C G G A

T G T T A A C G C C T

Biotin

G C C T

G C C T

G C C T

DNA-strängarna separeras med NaOH Sekvenseringsprimers tillsätts

Vetenskapens hus

Magnet

VätskaVätskaPCR skräpDNA fragment utan biotinNukleotiderEnzym

NaOHDNA sträng utan biotin

Obundna sekvenseringprimers

Vetenskapens hus

4. Pyrosekvensering4. Pyrosekvensering

Vetenskapens hus

Vetenskapens hus

PPPPii

Enzym Ursprung

1 Polymeras Bakterie

2 Sulfyrulas Jäst

3 Luciferas Eldfluga

4 Apyros Potatis

Vetenskapens hus

Vetenskapens hus

Vetenskapens hus

Dagens uppgift:Dagens uppgift:

Sekvensera (ta fram ordningen på baserna) DNA från ert hår!