Klinička biokemija - Propisi

Klinika biokemija Propisi

1

R U T I N S K I P R E G L E D M O K R A E

Za ispitivanje se uzima prva jutarnja, svjea mokraa uzeta nakon nonog sna, toalete vanjskog spolovila, prije doruka i drugih aktivnosti, koja se zadravala u mokranom mjehuru najmanje 4 sata a najvie 8 sati. Uzima se u spremnike sa irokim grlom i poklopcem koji slue za sakupljanje i prijenos uzoraka. Ako je uzorak pohranjen na 20C mora se obraditi unutar 30 minuta. Pohrana na +4C dozvoljava obradu unutar 4 sata.

U svakodnevnom radu , rutinski pregled mokrae sastoji se od: fizikalnih mjerenja

i z g l e d b o j a m i r i s s p e c i f i n a t e i n a r e a k c i j a - pH v o l u m e n

kemijskog ispitivanja sastava mokrae testnom trakom p r o t e i n a k r v n o g p i g m e n t a g l u k o z e i r e d u k t i v n i h t v a r i k e t o n s k i h s p o j e v a u r o b i l i n o g e n a b i l i r u b i n a n i t r i t a

mikroskopskog pregleda supravitalno obojenog ili nativnog m o k r a n o g s e d i m e n t a

U sluaju pozitivnih nalaza neki sastojci se odreuju kvantitativno: p r o t e i n i (pirogalol, biuret) g l u k o z a (enzimski)

Rezultati rutinskog pregleda upotpunjuju se specifinim pretragama: i z g l e d (mikroorganizmi) b o j a (homogentizinska kiselina, melanogen, porfirini, lijekovi) m i r i s (amonijak, sumporovodik) p r o t e i n i (paraproteini, elektroforeza proteina) k r v n i p i g m e n t (lijekovi) r e d u k t i v n i s p o j e v i (laktoza, galaktoza, pentoze, melanogen, kromatografija eera, homogentizinska kiselina, lijekovi) k e t o n s k i s p o j e v i (melanogen, lijekovi) b i l i r u b i n (une kiseline) u r o b i l i n o g e n (urobilin) s e d i m e n t (aminokiseline, mikroorganizmi, lijekovi)


2

IZGLED, BOJA I MIRIS

Svjea mokraa je bistra, ukasto smee boje, bez neugodnog mirisa.

SPECIFINA TEINA MOKRAE (relativna volumna masa)

Specifina teina mokrae odreuje se pomou areometra, urometra, koji je graduiran za podruje od 1.000 do 1.060 i temperaturu od 15C. Mokraa se ulijeva u prikladni cilindar, pjena ukloni filter papirom i urometar uroni da slobodno pliva. Oita se brojka na donjem rubu meniskusa. Ako temperatura mokrae nije 15C, potrebno je korigirati izmjerenu specifinu teinu. Za 3C ispod 15C treba oitanom rezultatu oduzeti 0.001, a za svaka 3C iznad 15C treba dodati 0.00l. Korekcije su potrebne i u sluajevima kada su u mokrai prisutni glukoza ili proteini. Za 1 g % proteina oduzima se 0.003, a za 1 g % (55 mmol/L) glukoze oduzima se 0.004.

Primjer: Oitana specifina teina ispitivane mokrae je 1.020, temperatura mokrae je 21C i odreeno je 3 % glukoze. Za 6C iznad 15C treba dodati 0.002, a za 3 g % glukoze treba oduzeti 0.012, pa korigirana specifina teina iznosi 1.010. Mokraa zdravih osoba ima u veini sluajeva specifinu teinu od 1.015 do 1.025, a krajnje granice su izmeu 1.002 i 1.035.

REAKCIJA (pH) MOKRAE

Reakcija mokrae zdravih osoba kree se od 4.8 do 7.4; a najee je slabo kisela (oko 6.0).

Razni proizvoai proizvode trake impregnirane s indikatorom. Pomou ovih test traka moe se vrlo jednostavno i priblino odrediti pH mokrae. Traka s indikatorom uroni se u mokrau a nastala boja usporedi sa priloenom skalom. Reagens papir polja za odreivanje pH na traci sadrava smjesu metilnog crvenila i bromtimol plavila. Tako se u podruju od pH 5-9 dobivaju razliite boje od naranaste-zelene-plave. Stajanjem mokraa postaje alkalna stoga pH vrijednost odstajale mokrae nema dijagnostiku vrijednost. Rezultat na traci se oitava odmah. Sumnja na infekciju mokranih organa postavlja se ako je pH mokrae stalno od 7 do 8.


3

VOLUMEN MOKRAE

Pri rutinskom pregledu obino se ne mjeri volumen. Ako se mokraa koristi za ispitivanje izluivanja pojedinih sastojaka tijekom 24 sata, tada se i jutarnjem uzorku mjeri volumen. Referentne vrijednosti 24-satnog volumena mokrae:

Odrasli 800 do 2.000 ml Djeca oko 10 g 700 do 1.500 ml Djeca oko 5 g 500 do 1.000 ml Djeca oko 1 g 300 do 600 ml Dojenad s 6 mj 250 do 500 ml Dojenad oko 1 mj 150 do 400 ml

Volumen mokrae ovisi o koliini primljene vode i hrane, intenzitetu metabolikih procesa, fizikoj aktivnosti i vodi, koja se izluuje znojenjem, fecesom i dahom. Odrasli ovjek izlui tokom 24 sata 800 do 1500 ml a krajnje granice se kreu izmeu 500 do 2000 ml. Kod izvjesnih patolokih stanja izluuju se poveane koliine mokrae. P o l i u r i j a je popratna pojava loe lijeene eerne bolesti, kada se izluuje 3 do 4 L mokrae dnevno. Znatno vee koliine izluuju osobe s nedostatkom antidiuretskog hormona (diabetes insipidus). Izluivanje manje koliine mokrae, o l i g u r i j a, a posebno prestanak izluivanja, a n u r i j a, su popratne pojave oteenja i funkcionalnog zastajenja bubrega.

K E M I J S K E P R E T R A G E M O K R A E

Kemijskim pretragama se dokazuje i ispituje da li mokraa sadri sastojke kojih u mokrai zdravih osoba nema ili su prisutne u tako malim koliinama i koncentracijama, da ih se ne moe dokazati uobiajenim reakcijama. Tako se ispituje prisutnost proteina, krvnog pigmenta, eera, ketonskih spojeva, bilirubina, nitrata. Za neke spojeve, kojih ima i u mokrai zdravih osoba (urobilinogen), ispituje se da li ih ima vie ili manje nego normalno. Kemijske pretrage se vre pomou testnih traka i rijetko klasinim kemijskim postupcima u epruveti. Klasini postupci trae vlastitu pripravu manjih ili veih koliina reagensa uz veliki utroak radnog vremena za vaganje, otapanje, filtriranje i odravanje stalnosti reakcijskih otopina. Pri tom se troi mnogo kemikalija, vrlo mnogo laboratorijskog posua i pribora. Na ishod reakcije s testnim trakama utjeu razni faktori. Najvie neprilika moe izazvati vlaga, a manje svjetlo i toplina. Zbog toga treba trake uvati u dobro zatvorenim posudama na suhom i od svjetla zatienom mjestu.

Testne trake raznih proizvoaa izraene su u obliku uskih traka od celuloze i prozirne plastike. Na plastinom nosau veliine 8 x 0.5 cm nalazi se jedna ili vie kvadratia od celuloznog materijala, koji su impregnirani odgovarajuim reagensima.


4

Reagensi na testnim trakama obino su isti ili kemijski vrlo slini onima, koji su se koristili u klasinim reakcijama u epruveti. Ipak, neki od njih su znatno osjetljiviji i mnogo specifiniji. Pretrage se izvode uranjanjem trake u ispitivani uzorak mokrae i nakon odreenog vremena (10, 20, 30 ili 60 sekunda) promatra se, da li je dolo do promjene boje. Intenzitet te boje usporeuje s priloenom skalom (vizualno oitavanje) ili .se rezultat oitava instrumentalno prema naelu refleksne fotometrije.

Testne trake za pretragu mokrae omoguuju jednostavnim postupkom brzo i pouzdano dobivanje podataka o patolokom nalazu u mokrai.

Zbog toga je rutinska pretraga mokrae testnim trakama u ambulanti i u bolnici prvi korak na putu postavljanja dijagnoze, koja e se kasnije potvrditi detaljnim klinikim pregledom i sloenijim kvantitativnim laboratorijskim pretragama. Testne trake su vrlo pogodne i za sistematske preglede, za rano otkrivanje bolesti te za epidemioloke studije. Polja na testnoj traci sastoje se od reagens papira koji se nalazi iznad papira za upijanje. Tanka najlonska mreica napeta je preko ta dva sloja i tako privruje test polja na bijelu foliju; ujedno ih zatiuje od dodira i oneienja, a uz to osigurava brzo i ravnomjerno prodiranje mokrae ime se postie homogena obojenost polja. Sloj za upijanje uklanja suvinu mokrau i time spreava lane rezultate. Test polje veliine 6 x 6 mm omoguuje lako i tono oitavanje rezultata jer su na njemu vidljive i najmanje promjene boje (Slika 3.2)

Slika 1. Graa testne trake

Pretraga mokrae testnom trakama vrlo je jednostavna (Slika 2) 1. uranjanje u mokrau 2. odstranjivanje suvinog mokrae 3. oitavanje nakon 30 do 60 sekundi


5

Slika 2. Pretraga mokrae testnom trakom

Suvina mokrae se jednostavno otrese. Upotreba enzima i drugih novih metoda temelj je specifinog dokazivanja patolokih promjena mokrae. Vaan kriterij u procjeni testnih traka za mokrau je stupanj osjetljivosti reakcije. Pod tim se razumijeva ona koncentracija traene tvari kod koje je u najmanje 90 od 100 razliitih uzoraka nalaz pozitivan. Granica je osjetljivosti pojedinih testova praktiki takva da i vrlo male promjene u sastavu mokrae izazivaju promjenu boje. Testne trake su u aluminijskoj tubi zatvorenoj specijalnim epom u kome je sredstvo za upijanje vlage iz zraka. Uz propisano uvanje (od +4oC do 30oC) i pravilnu upotrebu (nakon vaenja trake tubu treba odmah zatvoriti) rok je valjanosti testnih traka pouzdan do datuma otisnutog na pakovanju. Testne trake za mokrau mogu se upotrijebiti za:

rutinske pretrage kontrola za vrijeme terapije i kontrolu zbog mogunosti recidiva samokontrolu sistematske preglede

Za dnevne rutinske preglede mokrae u bolnici, ambulantnoj praksi ili uz krevet bolesnika najracionalnije je odreivanje kompletnog kemijskog statusa mokrae pomou univerzalne testne trake koja obuhvaa slijedee parametre:

nitrite pH glukozu ketonska tijela urobilinogen proteine bilirubin krv leukociti

Jednom testnom trakom mogue je otkriti rane simptome triju velikih grupa bolesti: poremeaje metabolizma ugljikohidrata bolesti bubrega i urogenitalnog trakta hemolitike bolesti i bolesti jetre. Za kontrolu tokom terapije prikladne su specijalne test trake za odreenu

indikaciju. U mokrai dijabetiara valja izvriti pretrage na glukozu i ketonska tijela. Tim se testom mogu otkriti promjene u stanju metabolizma ili pogreke u dijeti. U mokrai bolesnika s bolesti bubrega i urogenitalnog trakta znaajne su pretrage


6

mokrae na nitrite, pH, proteine i krv. Dokazivanje unih boja, urobilinogena i bilirubina, u mokrai omoguuje ciljani pregled u bolesti jetre. Specijalne testne trake upotrebljavaju se za opi pregled (prosijavanje) u sistematskim pregledima za ope i ciljani pregled u epidemiolokim istraivanjima rano otkrivanje odreenih patolokih stanja za vrijeme odreivanja individualne doze antidijabetika za kontrolu terapije

Tablica 1. Mogue jedinice oznaene na spremnicima testnih traka

Parametar Konvencionalne jedinice

SI Arbitrarne jedinice

glukoza

mg/dl

mmol/L

neg/0 1/+

2/++ 3/+++

4/++++

bilirubin

mg/dl

mol/L

neg/0 1/+

2/++ 3/+++

4/++++

ketonski spojevi

mg/dl

mmol/L

neg/0 1/+

2/++ 3/+++

4/++++

eritrociti/hemoglobin

Erc/L

Erc x 106/L

neg/0 1/+

2/++ 3/+++

4/++++

proteini

mg/dl

g/L

neg/0 1/+

2/++ 3/+++

4/++++

urobilinogen

mg/dl

mmol/L

neg/0 1/+

2/++ 3/+++

4/++++

nitriti

neg/poz

neg/poz

neg/poz

leukocitna esteraza

Lkc/L

Lkc x 106 /L

neg/0 1/+

2/++ 3/+++

4/++++


7

DOKAZIVANJE PROTEINA U MOKRAI

a) Dokazivanje s indikatorskom testnom trakom

Reagens papir polja za odreivanje proteina sadri smjesu pufera i indikatora (3,3,5,5-tetraklorfenol-3,4,5,6-tetrabrom-sulfoftalein) koji uz stalni pH mokrae mijenja boju u prisutnosti proteina od ute-svjetlozelene-zelene. Posebno je osjetljiv na albumine dok nije naroito osjetljiv na ostale proteine (globulini, Bence-Jones protein).

P o s t u p a k Traka se uroni u svjeu mokrau i promjena boje odmah usporedi s priloenom skalom na kutiji. Lano pozitivni rezultat javlja se u jako alkalnoj mokrai (pH oko 9), ako su prisutne kvarterne amonijeve soli (dezinficijensi), te niz lijekova i njihovih metabolita (kinina, kinidini, fenazopiridini, trimetoprim). Uvjerljivu obojenost test trake daju ve koncentracije od 6 mg/100 ml albumina u mokrai. Test za proteine je jednako osjetljiv kao test kuhanjem s acetatnim puferom. Izvori pogreaka su infuzije polivinil pirolidona ili ostaci dezinfekcijskih sredstava koji sadre kvarterne amonij baze ili klorheksidin te uzimanje lijekova. Granica osjetljivosti metode: 0.02 - 0.46 g/L

b) Dokazivanje sa sulfosalicilnom kiselinom

eto se koristi reakcija sa 20%-tnom sulfosalicilnom kiselinom, koja raskida hidratacijski omota oko proteinskih molekula, oslobaa polarne skupine i kemijski se za njih vee. U reakciji se povezuju ogoljele molekule u aglomerate, koji se zapaaju kao zamuenje ili talog. Reakcija sa sulfosalicilnom kiselinom je vrlo osjetljiva i njen pozitivni ishod se mora potvrditi i drugim reakcijama.

R e a g e n c i j e Sulfosalicilna kiseliina, 0.80 mol/L (200 g/L)

P o s t u p a k U epruvetu se ulije oko 5 ml bistre slabo kisele mokrae i dokapa najvie 10 kapi sulfosalicilne kiseline. Ako su u mokrai prisutni proteini u mjerljivim koliinama (iznad 100 mg/L), svaka kap reagensa izazvat e oblai zamuenja ili ak stvaranje taloga. Reakcija sa sulfosalicilnom kiselinom je vrlo osjetljiva, pa se djelomino pozitivni rezultat, opalescencija, dobiva uz fizioloku koncentraciju proteina u mokrai (oko 20 mg/L). Zbog toga je negativni rezultat reakcije sa sulfosalicilnom kiselinom siguran podatak da u ispitivanoj mokrai nema proteina. Ako je rezultat reakcije pozitivan, treba ga provjeriti drugim reakcijama.


8

Lano pozitivni rezultat pri dokazivanju proteina sa sulfosalicilnom kiselinom mogu izazvati velike koliine mokrane kiseline, metaboliti organskih kontrastnih sredstava za rendgensko snimanje, tolbutamid, neki sulfonamidi.

c) Dokazivanje kuhanjem

esto se izvodi reakcija kuhanja. Poveanjem temperature dolazi do raskidanja hidratacijskog omotaa, proteinske molekule se denaturiraju i povezuju u aglomerate, to se zamjeuje kao zamuenje. Ova reakcija se mora provoditi u kiseloj sredini (pH oko 5), jer se u alkalnom mediju taloe tercijarni fosfati i karbonati.

R e a g e n c i j e Octena kiselina, 0.83 mol/L (50 g/L)

P o s t u p a k U epruvetu se ulije 10 do 15 ml bistre mokrae i gornji dio tekuine zagrije do vrenja direktnim plamenom. Ako ima proteina, zamutit e se zagrijani dio tekuine i jasno e se uoiti razlika izmeu zamuenog vrueg i bistrog hladnog sloja. Mokraa mora biti slabo kisela (pH oko 5), jer se iz alkalne mokrae izluuju uz grijanje tercijarni fosfati i karbonati kalcija i magnezija. Ako je prilikom ispitivanja dolo do zamuenja, oprezno se kapne 1 do 2 kapi octene kiseline i pri tom se fosfati i karbonati otope, a istovremeno pojaa mute istaloenih proteina.

DOKAZIVANJE ERITROCITA I HEMOGLOBINA U MOKRAI

Dokazivanje eritrocita najsigurnije se vri pregledom sedimenta svjee, slabo kisele mokrae. Stajanjem dolazi do morfolokih promjena. Eritrociti se mogu smeurati i skupiti u hipertoninoj ili nabubriti i lizirati u hipotoninoj mokrai. Kemijske reakcije za dokazivanje hemoglobina temelje se na njegovom pseudoperoksidaznom djelovanju, jer hemoglobin posjeduje svojstvo oksidacije kromogenih spojeva (aromatskih amina i polifenola) u prisutnosti vodik peroksida. Za kemijski nain dokazivanja hemoglobina potrebno je mokrau prethodno promijeati, da se eritrociti ravnomjerno raspodjele i zatim prokuhati radi inaktiviranja pravih peroksidaza iz eventualno prisutnih leukoocita.

a) Dokazivanje pomou testne trake

Test se temelji na pseudoperoksidativnom djelovanju hemoglobina odnosno mioglobina, koji kataliziraju oksidaciju indikatora s organskim peroksidom (2,5-dimetiheksan-2,5-dihidroperoksid) u plavo-zeleni kromogen koji na utom polju izaziva sve prijelaze ute boje prema zelenom. Dodatkom aktivatora poveana je osjetljivost reakcije. Intaktni eritrociti se hemoliziraju a osloboeni hemoglobin uzrokuje nastajanje boje oko eritrocita stvarajui uoljive zelene toke.


9

P o s t u p a k Testna traka se uroni u ispitivanu mokrau i nakon 30 sekundi usporeuje promjena boje s priloenom skalom. Osjetljivost reakcije je 5 eritrocita/Lmokrae. Osjetljivost reakcije se protee gotovo do normalnog podruja (0-3 eritrocita/L). Ako je prisutno dosta eritrocita, polje na traci moe jednolino poprimiti zelenu boju kao u sluaju hemoglobinurije pa je pretragu potrebno ponoviti nakon razrijeivanja mokrae. Reakcija je specifina za hemoglobin i mioglobin. Lano pozitivnu reakciju uvjetuje prisustvo jakih oksidansa koji neposredno oksidiraju aromatski amin, dok lano negativni rezultat moe izazvati vea koliina askorbinske kiseline.

b) Reakcija s aminopirinom

N a e l o Hemoglobin uz pomo vodik peroksida oksidira aminopirin na ljubiasto obojeni spoj (rubazonska kiselina).

R e a g e n c i j e 1. Octena kiselina, glacijalna 2. Aminopirin u 96%-tnom etanolu, 60 g/L 3. 10%-tna otopina vodik peroksida

P o s t u p a k 3 ml mokrae zakiseli se s 2 do 3 kapi koncentrirane octene kiseline, prokuha i ohladi, a zatim nadsloji s 3 ml otopine aminopirina. Dokapanjem nekoliko kapi svjee pripravljene l0%-tne otopine vodik peroksida stvara se ljubiasto crveni prsten u dodirnoj zoni, ako je prisutan krvni pigment. Peroksidaze iz leukocita mogu uzrokovati lano pozitivnu reakciju.

DOKAZIVANJE EERA U MOKRAI

a) Dokazivanje testnom trakom

N a e l o Dio testne trake impregniran je puferiranom smjesom glukoza oksidaze, peroksidaze i aromatskog amina (tolidin, ABTS-diamonijeva sol 2,2-azino-di/3-etil-benzotiazolin/sulfonska kiselina). Katalitikim djelovanjem glukoza oksidaze pregrauje se glukoza u glukonolakton uz stvaranje vodik peroksida, koji s peroksidazom prevodi aromatski amin u obojeni oksidirani produkt.

P o s t u p a k Testna traka se uroni u ispitivanu mokrau i nakon 30 sekundi usporeuje promjena boje s priloenom skalom.


10

Slabu ali zamjetljivu promjenu boje (svijetlo zeleno) izaziva 0.7 mmol glukoze/L mokrae. Lano pozitivni rezultat izazivaju oksidansi (hipoklorit, klor, jod), koji mogu direktno oksidirati aromatski amin. Enzimsko odreivanje glukoze u mokrai ometa askorbinska kiselina.

DOKAZIVANJE KETONSKIH SPOJEVA U MOKRAI


N a e l o Dio trake impregniran je s natrij nitroprusidom i puferom. Acetoctena kiselina i aceton reagiraju s natrij nitroprusidom i glicinom u alkalnom mediju dajui ljubiasto obojeni spoj. -hidroksimaslana kiselina ne reagira.

P o s t u p a k Testna traka se uroni u ispitivanu mokrau i nakon 15 sekundi usporeuje promjena boje s priloenom skalom. Granica osjetljivosti testne trake je 0.15-1.0 mmol/L acetoctene kiseline odnosno 7-12 mmol/L acetona u mokrai. Pozitivni rezultat za ketonske spojeve s test trakama i tabletama daju isti lijekovi kao i kod kemijskih reakcija.

DOKAZIVANJE BILIRUBINA U MOKRAI


Dio trake impregniran je mjeavinom pufera i stabilne diazonij soli (2,6-diklor-benzoldiazonijumfluoroborat) koja s bilirubinom u kiselom stvara crvenoljubiastu azo-boju.

P o s t u p a k Testna traka se uroni u ispitivanu mokrau i nakon 20 sekundi usporeuje promjena boje sa priloenom skalom. Granica osjetljivosti je 3.5 -14 mol bilirubina/L. Lano pozitivni rezultat daju lijekovi koji su crveno obojeni u kiselom mediju (fenazopiridini). Lano negativni rezultat daju nitriti i askorbinska kiselina. Dokazivanje bilirubina mora se vriti u svjeoj mokrai jer stajanjem na zraku bilirubin oksidira.

DOKAZIVANJE UROBILINOGENA U MOKRAI

a) Ispitivanje s testnom trakom


11

Dio trake impregniran je s stabilnom diazonijevom soli (p-metoksibenzendiazonijum fluoroborat) koja s urobilinogenom daje u kiselom crvenu azoboju.

P o s t u p a k Testna traka se uroni u ispitivanu mokrau i nakon 10 sekundi usporeuje promjena boje sa priloenom skalom. Granica osjetljivosti je oko 1.7 - 17mol/L. Reakcija je specifina za urobilinogen. Ne reagiraju ostale diazo pozitivne tvari kao u reakciji po Ehrlichu (indikan, porfobilinogen sulfonamidi i druge). Lano pozitivni rezultat daju razni lijekovi i metaboliti (fenazopiridin, neki sulfonamidi, aminosalicilna kiselina, antipirin, BSP).

DOKAZIVANJE NITRITA U MOKRAI

a) Dokazivanje s testnom trakom

N a e l o U kiseloj otopini sulfanilna kiselina i nitriti nastali djelovanjem bakterija stvaraju diazobenzen-sulfonsku kiselinu, koja reagira s alfa-naftilaminom stvarajui crveno obojeni azo-spoj.

P o s t u p a k Traka se uroni u sasvim svjeu mokrau i nakon 30 sekundi usporeuje promjena boje s priloenom skalom. Granica osjetljivosti trake je 3 - 17 mol/L nitrita u mokrai. Lano pozitivni rezultat daju biljne boje (cikla) ili lijekovi (piridazol).

PRETRAGA MOKRANOG SEDIMENTA

Jednostavni rutinski pregled mokrae zavrava vanim mikroskopskim pregledom sedimenta. Ova pretraga je naroito vrijedna u sluajevima, kada su u mokrai dokazani proteini ili hemoglobin, jer se prema sastavu sedimenta mogu donijeti zakljuci o mjestu i vrsti oboljenja mokranih organa. Iz svake, pa i najbistrije, mokrae taloi se stajanjem neto sedimenta. Normalno se sediment mokrae sastoji od razliitih teko topivih tvari, staninih elemenata, i raznih primjesa. Sastojci sedimenta dijele se na dvije skupine, na organizirani i neorganizirani dio sedimenta.

N e o r g a n i z i r a n i dio sedimenta ine kristali teko topivih spojeva, ponajee mokrane kiseline, kalcijevog oksalata, raznih fosfata, amorfni urati i fosfati, te rijee kristali teko topivih aminokiselina, prirodnih spojeva, te lijekova i njihovih metabolita.


12

O r g a n i z i r a n i dio sedimenta sainjavaju eritrociti, leukociti, epitelne stanice, mikroorganizmi, paraziti i njihova jajaca, spermiji i dijagnostiki neobino vani cilindri. Ponekad se nailazi na sluajne primjese (dlaice, vlakanca, kapljice masti, zrnca kroba i dr.).

Za pregled sedimenta preporuuje se uzeti svjea jutarnja, najkoncentriranija mokraa. Mokraa mora biti slabo kisela (pH nii od 6), a specifina teina vea od 1.010. 5-12 ml promijeane mokrae ulije se u centrifugirku i centrifugira 5 minuta uz manji broj okretaja (400 x g) (do 1500 u minuti), da se ne unite krhki elementi. Bistra mokraa iznad taloga se najveim dijelom odlije, a uz sediment ostaje 20-ti dio poetnog volumena mokrae (npr. ukupni volumen mokrae 10 mL - volumen sedimentamokrae 0.5 mL) (bistra mokraa slui za ispitivanje prisutnosti proteina).

Danas je preporuka svjee pripremljeni sediment bojati vodenim otopinama boja kako bi se postigla dobra vidljivost staninih struktura. Za takovo bojanje mogu se koristiti slijedee boje: Steinheimerova boja koja sadri Alcian plavilo i pironin B ili Toluidinsko plavilo O.

Od tako pripremljenog sedimenta mokrae uzima se uvijek isti volumen (10-12 l) i nanosi na predmetno stakalce te pokrije pokrovnicom uvijek iste povrine (npr. 18 x 18) i promatra pod mikroskopom:

pod malim poveanjem objektiva - za grubu procjenu sadraja sedimenta pregledava se cijeli preparat, ukljuujui i rubove pokrovnice

pod velikim poveanjem objektiva - za kvantificiranje prisutnih elemenata u paljivo pretraenih 20 vidnih polja

Obilati talozi urata, amorfnih fosfata ili karbonata smetaju pri pregledu sedimenta, pa ih treba ukloniti. Crvenkasti uratni talog lako se otapa zagrijavanjem na 37C. Mokraa se zagrije na 40C, centrifugira i dekantira od sedimenta, dok je jo topao. Gusti amorfni talog od kalcij i magnezij fosfata otapa se dodatkom 10%-tne octene kiseline do pH 5.

Najuobiajenije je izraavanje staninih elemenata po vidnom polju velikog poveanja (x400), a preporuka je je izraavanje staninih elemenata u SI sustavu (stanini element x 106/L) U sedimentu mokrae zdravog ovjeka normalno se nalaze kristali mokrane kiseline, kalcij oksalata i ponekad fosfata, ako je mokraa alkalna. Uz to se nailazi na sluzne niti, poneku ploastu epitelnu stanicu i naroito kod ena, poneki leukocit. Ako se pregled sedimenta ne moe izvriti u svjeoj mokrai, ako su u sedimentu naeni rijei ili ak nedovoljno jasni elementi, sediment treba konzervirati i pretragu ponoviti u drugo vrijeme ili drugom laboratoriju. Kao konzervans se dodaje 1 ml 40%-tnog formalina u 10 ml mokrae.


13

ODREIVANJE KONCENTRACIJE NATRIJA I KALIJA PLAMENIM FOTOMETROM

N a e l o Razrijeeni uzorak seruma (ili mokrae) raspri se u plamenu smjese propana, butana ili gradskog plina i zraka. Natrij i kalij karakteristino oboje plamen - natrij uto, a kalij ljubiasto. Svjetlosna energija koju emitiraju u plamenu pobueni ioni tih elemenata prolazi kroz odgovarajui filtar i prevodi se u fotostanici (fotoelement, fotoumnoiva) u elektrinu energiju koja se opaa pomou galvanometra. Intenzivnost emitiranog svjetla razmjerna je koncentraciji natrija odnosno kalija u ispitivanoj otopini. Kako intenzivnost emitiranog svjetla, osim same koncentracije iona, ovisi jo i o nekim drugim faktorima, prije svega o jaini plina i dovodu zraka (natrij i kalij potrebna temperatura iznosi 1900C, to se istodobno pod istim uvjetima mjere i otopine poznatih koncentracija natrija i kalija (standardi).

R e a g e n c i j e 1. Standardna otopina za odreivanje natrija i kalija u serumu, natrij 140 mmol/L, kalij 5 mmol/L 2. Standardna otopina za odreivanje natrija i kalija u mokrai, natrij 100 mmol/L, kalij 5 mmol/L 3. Nulta otopina. U plastinu bocu od razrijeivaa stavi se 5 ml koncentriranog aspiracijskog standarda i dopuni do 500 ml redestiliranom vodom. Tako pripremljena otopina sadri 3 mmol/L LiCl. Ova otopina slui za podeavanje nule i kao unutarnji standard instrumenta. Otopina je stabilna 3 dana.

P o s t u p a k A. Ukljuivanje plamenog fotometra RADIOMETAR FLM 3 1. otvoriti ventil za dovod propana 2. ukljuiti kompresor za zrak 3. ukljuiti glavni prekida (POWER) Upale se diode za plin, zrak i plamen. Plameni fotometar je spreman za rad.

B. Kalibracija Na/K kanala 1. Okrenuti sklopku na odgovarajuu oznaku (Na, K, Li) prema tome to se hoe mjeriti. 2. Mjerenje se vri u posebnim aicama. Pritisnuti prekida razrijeivaa. (slijedi faza uzimanja uzorka u ovom sluaju zraka, ponovno pritisnuti prekida razrijeivaa (slijedi izbacivanje otopine za razrijeivanje). Podizanjem prekidaa na kojem se nalazi nulta otopina ispod rasprivaa zapoinje mjerenje, potrebno je podesiti za Na:000 a za K:0.0 3. Kalibracija uz pomo stnadardne otopine za natrij i kalij u serumu (140 i 5 mmol/L). Pritiskom na prekida razrijeivaa uzima se 50 l standarda (1), uz ponovljenu aktivaciju prekidaa izbaci se razrijeeni standard (1:200) u istu aicu. Staviti raspriva u aicu sa standardom i kalibrirati instrument, (namjestiti na


14

digitalnom mjerilu 140 za natrij i 5.0 za kalij). Sada je aparat spreman za mjerenje uzoraka.

C. Mjerenje natrija i kalija u serumu Razrijeeni uzorak (1:200) staviti pod raspriva i oitati na digitalnom mjerilu izmjerenu koncentraciju. Stabilne vrijednosti se dobivaju za 5 do 7 sekundi. Kako plameni fotometar radi uz unutarnji standard (Litij, 3 mmol/L), tokom rada nije potrebno provjeravati nulu.

D. Iskljuivanje instrumenta Nakon zavrenog mjerenja, instrument ispirati 10 minuta s destiliranom vodom. Zatvoriti dovod plina, iskljuiti kompresor i pritisnuti glavni prekida (POWER).

N a p o m e n a Vie faktora utjee na tonost mjerenja plamenom fotometrijom: Za razliku od izvora svjetlosti kod fotometra (lampa), ovdje je izvor svjetla plamen, a njegova stabilnost i intenzivnost ovise o jednolinom dotoku i tlaku plina i zraka. Zato je bolje raditi s plinom iz boce (propanom ili butanom) nego s gradskim plinom. istoa plina je takoer vana. Kompresor za zrak mora jednolino opskrbljivati aparat zrakom, pa se zato kompresor mora odravati u besprijekornom stanju. Moderniji aparati stoga rade uz upotrebu internog standarda. Kao interni standard koriste se litijeve soli. Litijeva sol dodaje se standardima i probama. Promjene u stabilnosti automatski se izravnavaju, ime se poveava preciznost mjerenja. Plamenik i raspriva moraju biti uvijek isti, da bi se osigurao jednolian protok otopine. U rasprivau se s vremenom istaloe proteini koji mogu smanjiti prohodnost, i time protok probe, ili ga potpuno zaepiti. Zato se raspriva mora povremeno istiti tankom icom. Iz istog razloga se probe i standardi razrijeuju otopinom koja sadri deterent slobodan od iona (npr. Exstran), jer to pogoduje jednolinom dotoku otopina u plamen i stvara jednoline i male kapljice prilikom rasprivanja tekuine koja se mjeri. Stupanj razrijeenja probe ovisi o svojstvima aparata i koncentraciji elektrolita u otopini koja se mjeri. Razrijediti treba toliko da se dobije optimalna osjetljivost i tonost instrumenta. Zato se valja dosljedno drati uputa proizvoaa aparata. Razrijeivanjem se smanjuje koncentracija proteina u tekuini i viskoznost, a to pogoduje jednolinom protoku u rasprivau. Zbog blizine spektralnih linija natrija i kalija, ovi kationi smetaju jedan drugom prilikom mjerenja. Zato, da bi se ta greka svela na to manju mjeru, a kako se mjerenje izvodi usporeivanjem intenzivnosti emisije svjetla probe sa standardima, dobro je da i standardi sadre oba kationa.

L i t e r a t u r a Propisi tvrtke Radiometar


15

ODREIVANJE KALCIJA U SERUMU metoda s o-k r e z o l f t a l e i n o m

N a e l o O-krezolftalein komplekson s kalcijem u alkalnom daje ljubiasto obojeni helatni kompleks iji je intenzitet proporcionalan s koncentracijom kalcija u uzorku.

R e a g e n c i j e

Priprema i stabilnost otopine reagensa Radni reagens: Prema broju odreivanja pomijeati pufer i kolor reagens u odnosu 1+1. Stabilnost: 8 sati na 20-25C.

R1 Kolor reagens o-krezolftalein 8-hidroksikinolin polivinilpirolidin

R2 Pufer 2-amino-1-metilpropanol

R3 standard Kalcij

R4 EDTA

0.16 mmol/L 6.90 mmol/L 0.07 mmol/L

260 mmol/L

2.50 mmol/L

150 mmol/L

P o s t u p a k Slijepa Standard Proba proba reagensa ml ml ml

H20 0.020 - - Uzorak - - 0.020 Standard - 0.020 - Radni reagens 1.0 1.0 1.0

Promijeati. Izmjeriti absorbancije standarda i proba prema slijepoj probi reagensa na 575 nm (540-600 nm)..

R a u n Serum Aprobe ------------ x 2.5 = mmol kalcija/L Astandarda


16

N a p o m e n a Uzorak za analizu je nehemolizirani serum, Li-heparinat plazma ili mokraa. Boja je stabilna 50 minuta. Linearnost metode je do 3.4 mmol/L. Iznad ove vrijednosti uzorak treba razrijediti s fiziolokom otopinom (0.9% NaCl) u odnosu 1+1, ponoviti odreivanje a rezultat pomnoiti sa 2. Antikoagulancije EDTA, citrat i oksalat se ne smiju upotrebljavati. Izbjegavati stazu i kontraminaciju s tkivnom tekuinom. Po mogunosti ispitanik treba leati 15 minuta i u tom poloaju izvaditi krv (inae 10% vie vrijednosti). Koncentracija kalcija u serumu se ne mijenja 8 sati na 20-25C, 10 dana u hladnjaku, 12 mjeseci na -20C. 24-satna mokraa: U posudu za sakupljanje mokrae stavi se 10 ml 6 M HCL. Skupljena mokraa u toku 24 sata, dobro se promijea, odfiltrira, uzme 10-12 ml za analizu, razrijedii s fiziolokom otopinom (0.9% NaCl) ili destiliranom vodom u odnosu 1+2, a rezultat pomnoiti s 3. Kalcij je esto prisutan u mnogim materijalima pa se preporuuje testiranje plastinih ili staklenih epruveta i kiveta. Sav pribor se treba prati razrijeenom HCl (1:4), te isprati s redestiliranom ili deioniziranom vodom. Za serume koji sadre 2 g/L hemoglobina, >300 mol/L bilirubina ili su jako lipemini nakon odreivanja dodati u slijepu probu i probe po 1 kap EDTA, te nakon 5 minuta ponovo oitati absorbancije.

L i t e r a t u r a Sarkar R, Chandan UPC. Anal Biochem 1967; 20: 155.


17

ODREIVANJE UKUPNIH PROTEINA U SERUMU b i u r e t m e t o d a

N a e l o Proteini i peptidi reagiraju s bakrenim ionima u alkalnom mediju stvarajui ljubiasto obojeni produkt. Intenzitet boje je proporcionalan s brojem peptidnih vezova odnosno s koncentracijom proteina u ispitivanom uzorku.

R e a g e n c i j e 1. Biuret reagens 45 g kalij natrij tartarata otopi se u 200 ml 0.2 mol/L NaOH, zatim se otapa 5 g CuSO4

x 5H2O i konano 5 g KI, te dopuni luinom na 1 L. Tartarat stabilizira reagens, a jodid spreava spontanu redukciju bakra. Reagens se sprema u tamnoj boci koja je iznutra parafinirana i dobro zaepljena gumenim epom. Upotrebljiv je 2 do 3 mjeseca. Kada se zamuti uz dodatak seruma reagens je neupotrebljiv. 2. Natrij hidroksid, 0.20 mol/L (8 g/L) 8 g NaOH otapa se u 1 L destilirane vode 3. Natrij klorid, 0.154 mol/L (9 g/L) 4. Standardna otopina proteina, 70 g/L 7 g albumina otopi se u 100 ml 0.02 mol/L kalij klorida (KCl, Mr 74.56) iji je pH podeen na 6.5-6.8 natrij bikarbonatom. Pod sterilnim uvjetima otopina je na +4C stabilna nekoliko mjeseci. Najbolje je otopinu razdijeliti u ampule koje slue samo za dnevnu upotrebu.

P o s t u p a k Slijepa Proba Standard ml ml ml

NaCl (3) 5.0 4.8 4.8 Serum - 0.2 - Standard (4) - - 0.2 Biuret reagens (1) 5.0 5.0 5.0 Pomijea se i fotometrira 30-90 minuta nakon dodavanja biuret reagensa na 546 nm ili uz zeleni filter s maksimumom propustljivosti od 546 do 565 nm.

R a u n

Aprobe -------------- x koncentracija standarda = g proteina/L seruma. Astandarda

Ako se usporedo ne radi standard rezultati se oitavaju iz badarnog dijagrama, koji se izrauje na slijedei nain: U mijeanom serumu odredi se ukupni i neproteinski duik mikrokjeldahl postupkom i izrauna koncentracija proteina prema formuli (UN - NPN) x 6.25 = g proteina/L.


18

Serum s poznatom koncentracijom proteina razrijedi se s fiziolokom otopinom 10 puta. Za analizu se uzima 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 i 2.5 ml razrijeenog seruma, dopunjava se fiziolokom otopinom do 5.0 ml i dodaje 5.0 ml biuret reagensa, a nakon 30 minuta izmjere se absorbancije.

Primjer: UN = 12.0 g/L NPN = 0.45 g/L (12.0 - 0.45) x 6.25 = 72 g proteina/L.

volumen razrijeenog seruma, ml

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

g proteina u uzetom volumenu 0.0036 0.0072 0.0108 0.0144 0.018

odgovara koncentraciji proteina u g/L ()

18

36

54

72

90

absorbancija 0.075 0.16 0.26 0.32 0.40

() koliine proteina treba mnoiti sa 5000, jer se u postupku uzima 0.2 ml seruma, a rezultat se izraava na 1 L.

N a p o m e n a Odreivanje proteina pomou jednostavnog biuret reagensa oteano je u lipeminim serumima. U svrhu izbjegavanja greaka dodaje se ureja i mijea matina otopina biureta s otopinom za razrjeivanje. Takva otopina biureta je nestabilnija i treba je pripravljati svaki tjedan. Jedan od provjerenih je biuret reagens prema Richterichu, 1971. a) Matina otopina kalij natrij tartarata 159 mmol/L, bakar(II) sulfata 60 mmol/L, kalij jodida 30 mmol/L i natrij hidroksida 200 mmol/L 4.5 g kalij natrij tartarata otopi se u 40 ml 0.2 M natrij hidroksida. Zatim se otapa 1.5 g CuSO4

x 5H2O, te 0.5 g KJ i nadopuni s NaOH na 100 ml. uva se u tamnoj boci na sobnoj temperaturi. b) Otopina za razrijeivanje: kalij jodid, 30 mmol/L i natrij hidroksid, 200 mmol/L 5 g KJ otopi se u 1000 ml 0.2 mol/L NaOH. Dri se na sobnoj temperaturi. c) Konani biuret reagens: kalij natrij tartarat 31.8 mmol/L, bakar(II) sulfat 12 mmol/L, natrij hidroksid 200 mmol/L, kalij jodid 30 mmol/L i ureja 6 mol/L 180 g ureje stavlja se u smjesu od 100 ml matine otopine (a) i 250 ml otopine za razrijeivanje (b) i konano nadopuni otopinom za razrijeivanje na 500 ml. Dri se na sobnoj temperaturi a stabilan je 7 dana.

L i t e r a t u r a Wolfson WA., Cohn C., Calvary E., Ichiba F.: Am.J.Clin.Path., 18, 723 (1948) Richterich P.: Klinische Chemie, III izd., Karger, Basel, 1971. str. 305


19

RAZDVAJANJE PROTEINA SERUMA e l e k t r o f o r e z o m n a c e l o g e l t r a k a m a

N a e l o Putovanje nabijenih estica u elektrinom polju naziva se eklektroforeza. Brzina putovanja ovisi o naboju estica. Da bi se naboj odrao konstantnim, potrebno je da se tijekom elektroforeze odrava stalnost sredine u kojoj se ona odvija. To se postie tako da elektroforeza tee u puferu odreenog pH, ionske jakosti i vodljivosti. Proteini su amfoterni jer naboj aminokiselina zavisi od pH sredine. Nanoenjem seruma na vlanu celogel traku, elektroforetski se razdvajaju proteinske skupine, bojaju, suviak boje ukloni a obojene zone izreu, boja eluira i absorbancije mjere fotometrijski. ee se traka uini providnom i kvantitativno mjerenje izvri direktno denzitometrijski.

R e a g e n c i j e i p r i b o r 1. Veronal pufer, 40 mmol/L, pH 9.2 8.24 g natrij dietilbarbiturata (C8H11N2O2Na) (Mr 206) otopi se u 1 L 2. Otopina za bojanje, Ponceau S, 5 g/L 0.5 g boje Ponceau S otopi se u 100 ml 0.3 mol/L trikloroctene kiseline CCl3COOH (Mr 163) 3. Otopina za odbojavanje 5 ml glacijalne octene kiseline razrijedi se na 100 ml 4. Otopina za otapanje celogela, octena kiselina, 80 % (v/v) 5. Otopina za postizavanje prozirnosti traka Pomijea se 86 ml metanola, 14 ml octene kiseline i 0.1 ml glicerola 6. Celogel trake veliine 2.5 x 14 ili 2.5 x 17 cm Trake se moraju uvati u zatvorenom paketu, a otvoreno pakovanje se mora drati u vertikalnom poloaju. Ako se trake upotrebe u roku 7 dana, potrebno je dodati vodu, a ako se koriste due od 15 dana, trake se stavljaju u pokrivenu posudu s 30 %-tnim (v/v) metanolom. Prosuene trake gube karakteristiku gela.

P o s t u p a k Pufer se ulije u kadicu za elektroforezu i nivo tekuine izjednai. Celogel trake se stavljaju u pufer najmanje 10 minuta, a najdulje preko noi. Suviak tekuine uklanja se stavljanjem traka izmeu dva filter papira, ali traka se ne smije pritiskati. Trake se stavljaju na most kade za elektroforezu i to tako da penetrantna strana traka bude okrenuta na gore. Slobodne krajeve traka treba prekriti filter papirom. Trake moraju biti napete i postupak nanoenja treba izvoditi to bre da bi se izbjeglo prosuivanje traka. Normalna elektroforeza vri se na trakama veliine 2.5 x 17 cm, koje su razapete na mostu od 11 cm. Nanaa se 3 do 4 l seruma 1.5 cm od katodnog kraja. Ukljui se struja, podesi napon od 200 V, stavi pokrov na kadu i elektroforetsko razdvajanje provodi 75 minuta. Uz navedene uvjete proteini se pomaknu maksimalno 6 cm i dobivaju se frakcije albumina, alfa-1, alfa-2, beta- i gama-globulina. Ponekad se beta-globulinska frakcija razdvaja u dvije polufrakcije.


20

Po zavretku elektroforetskog razdvajanja trake se oznae brojevima pomou pera umoenog u razrijeeni serum. Trake se stavljaju 5 minuta u otopinu boje, zatim se suviak boje odstranjuje trokratnim stavljanjem u razrijeenu otopinu octene kiseline. Obojene frakcije mogu se izrezati i staviti u 5 epruveta. U svaku se dodaje smjesa za otapanje celogela, 80%-tna octena kiselina i to 3 ml za globulinske frakcije i 6 ml za albuminsku frakciju. Absorbancija svjetla otopina proteinskih frakcija mjeri se prema eluatu dijela trake bez proteina na 520 nm. Na temelju oitanih absorbancija izraunavaju se relativni postoci proteinskih frakcija. Mjerenje relativnih postotaka proteinskih frakcija moe se vriti i na trakama koje su uinjene transparentnima. Trake se nakon bojanja proteina i uklanjanja suvika boje stavljaju u metanol, da se izvri dehidratacija. Nakon samo 30 sekunda odlije se metanol i doda otopina za postizanje prozirnosti traka, a nakon jedne minute trake se stavljaju na staklenu plou i suviak tekuine ukloni filter papirom. Trake se zagriju na 50 do 60C kroz 5 minuta i postaju sasvim prozirne. Preokrenuta staklena ploa se stavi na komad bijelog papira, hladi se oko 20 minuta i zatim se trake skidaju i stavljaju u plastini ili papirnati omot. Prozirne trake mogu posluiti za denzitometrijsko odreivanje relativnih postotaka proteinskih frakcija.

ODREIVANJE UREJE U SERUMU I MOKRAI Metoda s u r e a z o m i Berthelot-reakcijom

(f e n o l i h i p o k l o r i t)

N a e l o Djelovanjem ureaze razgrauje se ureja na ugljini dioksid i amonijak, koji u reakciji s fenolom i hipokloritom u prisutnosti nitroprusida stvara plavo obojeni indofenolni spoj, koji se mjeri na 540 nm.

R e a g e n c i j e 1. Fosfatni pufer, 0.10 mol/L, pH 7.4 a) otopina natrij hidrogen fosfata, 0.1 mol/L 14.2 g Na2HPO4 ili 17.8 g Na2HPO4 x 2H2O otopi se u 1L destilirane vode b) otopina kalij hidrogen fosfata, 0.10 mol/L 13.6 g KH2PO4 otopi se u 1 L destilirane vode c) fosfatni pufer, 0.l0 mol/L, pH 7.4 pripravlja se mijeanjem 808 ml otopine natrij hidrogen fosfata (a) i 192 ml otopine kalij hidrogen fosfata (b) 2. Puferirana otopina ureaze 100 mg kupovne ureaze razmuti se u 100 ml pufera, pH 7.4 (1c), filtrira se, konzervira s nekoliko kapi kloroforma, te uva na +4C. Otopinu ureaze moe se pripremiti suspendiranjem 200 mg bezmasnog sojinog brana u 100 ml pufera. Razriba se u tarioniku i profiltrira nakon 20 minuta. 3. Standardna otopina ureje, 5 mmol/L (300 mg/ml) 4. Koncentrirani fenolni reagens, fenol 540 mmol/L, nitroprusid 0.85 mmol/l


21

50 g fenola (bezbojnog) i 0.25 g nitroprusida Na2Fe(CN)5NO x 2H2O otopi se u 1 L destilirane vode (pazite - fenol stvara opekotine ako doe u doticaj sa koom). 5. Koncentrirani hipokloritni reagens: natrij hipoklorit NaOCl, 28 mmol/L u natrij hidroksidu, 625 mmol/L 2.1 g NaOCl i 25 g NaOH otopi se u destiliranoj vodi i nadopuni do 1 L 6. Razrijeeni fenolni reagens, 106 mmol/L 100 ml koncentrirane otopine fenola razrijedi se do 500 ml sa destiliranom vodom 7. Razrijeeni hipoklorit reagens - 5.6 mmol/L 100 ml koncentriranog reagensa razrijedi se do 500 ml sa destiliranom vodom

P o s t u p a k Slijepa Standard Proba ml ml ml

Ureaza (2) 0.10 0.10 0.10 Standard (3) - 0.20 - Serum ili mokraa (1:100) - - 0.20

Pomijea se, inkubira 15 minuta na 37C, a nakon toga dodaje

Otopina fenola (6) 5.0 5.0 5.0 Otopina hipoklorita (7) 5.0 5.0 5.0

Promijea se i ostavi 20 minuta na 37C ili 30 minuta na 25C. Apsorbancija slijepe, probe i standarda oita se prema vodi na 540 nm ili uz zeleni filter.

R a u n Aprobe - Aslijepe ----------------------------- x 5 = mmol/L seruma

Astandarda - Aslijepe

Aprobe - Aslijepe ------------------------------ x 0.5 = mol/L mokrae Astandarda - Aslijepe

ili se prerauna na 24-satni volumen mokrae

N a p o m e n a Nove modifikacije postupka koriste salicilat umjesto fenola, reakcija se provodi kod sobne temperature, a osjetljivost reakcije je bitno poveana. Aminofenol, asparagin i hemoliza daju lano vee rezultate, a klorpromazin i inhibitori ureaze (fluoridi, spojevi ive, timol) lano smanjene rezultate.

L i t e r a t u r a Fawcett JK, Scott JE. J Clin Path 1960; 13: 156.


22

ODREIVANJE UREJE U SERUMU I MOKRAI u r e a z a - GLDH

N a e l o Djelovanjem ureaze razgrauje se ureja na ugljik dioksid i amonijak, koji u reakciji s -ketoglutaratom i reduciranim koenzimom (NADH) djelovanjem glutamat dehidrogenaze stvara glutamat i oksidirani oblik koenzima. Pad absorbancije reduciranog koenzima na 340 nm proporcionalan je koncentraciji ureje u uzorku.

Ureja + H2O Ureaza 2NH3 + CO2 NH3+-ketoglutarat+NADH GLDH Glutamat + NAD

+

R e a g e n c i j e

R1 Reagens Tris pufer pH 8.5 0.1 (20C) -ketoglutarat NADH Ureaza GLDH

R2 Standard Ureja

70 mmol/L 5.2 mmol/L >0.14 mmol/L > 5600 U/L > 400 U/L

17.81 mmol/L

Priprema otopine reagensa i stabilnost Sadraj boice reagensa (TR-1055) otopiti u 20 ml destilirane vode. Otopljeni reagens stabilan 90 dana na2 8 C.

P o s t u p a k Proba Standard ml ml

Reagens 2.0 2.0 Uzorak 0.02 - Standard - 0.02

Promijeati. Na 340 nm izmjeriti A1 nakon 30 sekundi i A2 nakon 90 sekundi od poetka reakcije. O-instrumenta: destilirana voda Izraunati A / min = A1 A2


23

R a u n Serum (plazma)

A / min uzorka --------------------------- x 17.81= mmol ureje / L A / min standarda

N a p o m e n a Uzorak za analizu moe biti nehemolizirani serum, plazma (sa EDTA ili Natrij heparinom), ili mokraa razrijeena 1+20 sa vodom. Linearnost metode je do 40 mmol/L. Iznad ove vrijednosti uzorak treba razrijediti s destiliranom vodom koja ne sadri amonijeve ione i ponoviti analizu. Rezultat mnoiti s faktorom razrijeenja. Mora se izbjegavati zagaenje s amonijakom i amonij ionima. Fluorid je poznati inhibitor ureaze te smanjuje brzinu reakcije a prisutnost amonij iona u antikoagulancijama (naprimjer amonij heparin) uzrokuje lano poviene vrijednosti.

L i t e r a t u r a Talke H, Schubert GE. Klin Wochenschr. 1965; 43: 17. Fearon WR. Biochem 1931; 331: 802. Fawcett JK, Scott JE. J Clin Path 1960; 13: 156. Westgard JO, Hunt MR. Clin Chem 1973; 19: 49.

ODREIVANJE KREATININA U SERUMU I MOKRAI d i r e k t n a m e t o d a

N a e l o Serum (ili razrijeena mokraa 1:50) deproteinizira se trikloroctenom kiselinom. Kreatinin s alkalnom otopinom pikrata stvara kompleks naranaste boje, koji se mjeri na 546 nm.

R e a g e n c i j e 1. Trikloroctena kiselina, 3.0 mol/L 490 g trikloroctene kiseline CCl3COOH (Mr 163) otopi se u 1 L destilirane vode 2. Pikrinska kiselina, 40 mmol/L 9.3 g pikrinske kiseline, trinitrofenola (Mr 229) otopi se u 500 ml destilirane vode uz zagrijavanje do 80C. Otopina se ohladi i nadopuni destiliranom na 1 L 3. Natrij hidroksid, 4.1 mol/L 164 g NaOH otopi se u 1 L destilirane vode 4. Matini standard kreatinina, 10 mmol/L 113 mg kreatinina (Mr 113) otopi se u 100 ml 0.1 mol/L HCl 5. Radni standard kreatinina, 100 mol/L 1.0 ml matinog standarda (4) razrijedi se s 0.1 mol/L HCl na 100 ml


24

P o s t u p a k Proba Standard Slijepa ml ml ml

Serum (ili mokraa 1:50) 2.0 - - Radni standard (5) - 1.0 - Destilirana voda 2.0 1.0 2.0 Trikloroctena kiselina (1) 2.0 1.0 1.0

Promijea se i proba centrifugira 10 minuta na 3000 okretaja/minuta. U daljnji postupak uzima se ukupni sadraj u epruvetama za standard i slijepu, te alikvot bistre tekuine - probe

Bistra tekuina (proba) 3.0 - - Pikrinska kiselina (2) 1.0 1.0 1.0 Natrij hidroksid (3) 1.0 1.0 1.0

Promijea se i nakon 15 minuta mjeri absorbancija probe i standarda prema slijepoj na 546 nm ili uz zeleni filter (530 do 550 nm).

R a u n Serum

Aprobe ------------ x 100 = mol kreatinina/L Astandarda

Mokraa Aprobe 100 -------------- x ---------- x 50 = mmol/L mokrae Astandarda 1000

Rezultat se prerauna na 24-satni volumen mokrae.

N a p o m e n a Pri odreivanju kreatinina direktnim postupkom s pikratom u alkalnoj sredini reagiraju mnogi prirodni supstrati (glukoza, fruktoza, proteini, hemoglobin), lijekovi i njihovi metaboliti (PSP, BSP, askorbinska kiselina), a naroito intenzivno acetoacetat i aceton. Zbog toga postoji mnogo modifikacija reakcije s pikratom u kojima se kreatinin adsorbira na aluminij silikat (tonzil, Lloydov reagens, Fullerova zemlja) ili ionske izmjenjivae. Zadnjih godina razvijene su i kinetike metode za koje je vano to to ostali kromogeni sporije reagiraju s alkalnim pikratom od kreatinina, pa se mjeri poetna brzina razvijanja boje. Potpuno enzimske metode odreivanja kreatinina su specifine, ali vrlo skupe.

L i t e r a t u r a Modifikacija postupka Owen JA et al. Biochem J 1954; 58: 426.


25

ODREIVANJE UKUPNOG BILIRUBINA U SERUMU m e t o d a Jendrassik-Grof

N a e l o Nakon dodatka puferirane otopine akceleratora, konjugirani i nekonjugirani bilirubin reagiraju s diazo reagensom (sulfanilna kiselina i natrij nitrit) stvarajui azoboju. Dodatkom askorbinske kiseline razgradi se preostali reagens a s alkalnom otopinom tartarata (Fehlingova otopina), crvena boja azobilirubina prelazi u plavu boju, koja se mjeri na 600 nm.

R e a g e n c i j e 1. Otopina akceleratora Kofein 260 mmol/L, natrij acetat 914 mmol/L, natrij benzoat 520 mmol/L i EDTA 2.69 mmol/L 7.5 g natrij benzoata otopi se u priblino 80 ml destilirane vode, zagrije na 60C, te doda 5.0 g kofeina, 7.5 g bezvodnog natrij acetata ili 12.5 g CH3COONa x 3H2O i 0.1 g Na2EDTA x 2H2O. Bistra otopina ohladi se na sobnu temperaturu i dopuni destiliranom vodom do 100 ml 1.a) Jo bolji akcelerator je: Difilin 194 mmol/L, natrij acetat 914 mmol/L i EDTA 2.69 mmol/L 5.0 g difilina (2,2,,3,-dihidroksipropil teofilina), 7.5 g bezvodnog natrij acetata i 0.1 g Na2EDTA x 2H2O otopi se u priblino 80 ml destilirane vode i zagrije na 50C. Otopina se ohladi na sobnu temperaturu i dopuni destilirantom vodom do 100 ml.

2. Diazo reagens Otopina A - sulfanilna kiselina, 29 mmol/L 5 g sulfanilne kiseline (anilin-p-sulfonska kiselina) (Mr 173) otopi se u 800 ml destilirane vode uz dodatak 15 ml koncentrirane HCl i zagrije do 60C. Otopina se ohladi na sobnu temperaturu i dopuni destiliranom vodom do 1 L. Otopina B - natrij nitrat, 72 mmol/L 0.5 g NaNO2 otopi se u 100 ml destilirane vode. Otopina je stabilna 14 dana u tamnoj boci na +4C.

Konani diazo reagens Pomijea se 10 ml otopine A - sulfanilna kiselina s 0.25 ml otopine B - natrij nitrit. Reagens je stabilan 30 minuta. 3. Askorbinska kiselina, 227 mmol/L 0.4 g askorbinske kiseline otopi se u 10 ml destilirane vode. Priprema se svaki dan svjea otopina. 4. Fehlingova otopina, kalij natrij tartarat, 1.24 mol/L, NaOH 2.5 mmol/L. 350 g kalij natrij tartarata x 4H2O i 100 g NaOH otopi se u 1 L destilirane vode.


26

P o s t u p a k Proba Slijepa ml ml

Serum 1.0 1.0 Askorbinska kiselina - 0.1 Akcelerator (1) 2.0 2.0 Konani diazo reagens (2) 0.5 0.5

Promijea se i nakon 10 minuta dodaje

Askorbinska kiselina (3) 0.1 - Fehlingov reagens (4) 1.5 1.5

Promijea se i mjeri absorbancija probe i slijepe prema destiliranoj vodi na 600 nm ili uz crveni filter u kiveti s debljinom sloja 10 mm. Rezultat se oita iz badarnog dijagrama ili se istovremeno vri postupak sa standardnim serumom.

ODREIVANJE KONJUGIRANOG BILIRUBINA m e t o d a Jendrassik-Grof

N a e l o Konjugirani bilirubin reagira s diazo reagensom (sulfanilna kiselina i natrij nitrit) bez dodataka akceleratora, stvarajui azoboju. Reakcija se prekida s askorbinskom kiselinom, a uz alkalnu otopinu tartarata crvena boja azobilirubina prelazi u plavu boju koja se mjeri na 600 nm. R e a g e n c i j e Iste kao za odreivanje ukupnog bilirubina P o s t u p a k Proba Slijepa ml ml

Serum 1.0 1.0 Askorbinska kiselina - 0.1 Akcelerator (1) - 2.0 Konani diazo reagens (2) 0.5 0.5 Promijea se, i nakon 10 minuta dodaje Askorbinska kiselina (3) 0.1 - Akcelerator (1) 2.0 - Fehlingova otopina (4) 1.5 1.5 Promijea se i mjeri absorbancija probe i slijepe prema destiliranoj vodi na 600 nm ili uz crveni filter. N a p o m e n a


27

Odreivanje bilirubina vri se u svjeem serumu, jer svjetlo, a posebno suneve zrake razgrauju bilirubin. U pravilu serum se razrijeuje s fiziolokom otopinom u omjeru 1:10. Lano vii rezultat daju tirozin, histidin, askorbinska kiselina, aminofenol, rifampicin, DOPA i metil-DOPA. Sniene vrijednosti javljaju se pri jakoj hemolizi.

L i t e r a t u r a Michaelssonova modifikacija metode Jendrassik L. Grof P. Biochem J 1938; 297: 81. razraena u Verley H, Gowenlock AH, Bell M. Practical Clinical Biochemistry, vol.1, W.Hainmann Medical Books LTD, London, 1980, str. 1022.


28

ODREIVANJE GLUKOZE U SERUMU enzimska metoda s g l u k o z a

o k s i d a z o m i p e r o k s i d a z o m

N a e l o Glukoza se katalitikim djelovanjem glukoza oksidaze (GOD) oksidira u glukonsku kiselinu i pri tom nastaje vodikov peroksid, koji reagira s kromogenom tvari (aromatskim aminom) u prisutnosti peroksidaze (POD) stvarajui obojeni produkt. Intenzitet boje mjeri se fotometrijski.

Glukoza + O2

+ H2O GOD glukonska kiselina +H2O2

2H2O2 + fenol + 4-aminoantipirin POD kinonimin + 4H2O

R e a g e n c i j e R1 Reagens 4-aminoantipirin Glukoza oksidaza (GOD) Peroksidaza (POD)

R2 Pufer Fosfatni pufer pH 7.4 0.05 Fenol

R3 Standard

Dodatni reagens

0.40 mmol/L >300 kat/L > 17 kat/L

100 mmol/L 10 mmol/L

5.56 mmol/L

0.4 mmol/L uranilacetat ili 0.33 mol/L perklorna kiselina

Priprema i stabilnost otopina Sadraj boice reagensa (TR-2000 otopiti u 250 ml pufera, TR-2001 otopiti u 500 ml pufera, TR-2002 otopiti u 1000 ml pufera) otopiti u puferu i sadraj vratiti u boicu pufera. Stabilnost: 4 tjedna na 2-8C, 2 tjedna na 20-25C. uvati na tamnom mjestu.

P o s t u p a k Standard Probe ml ml

Standard 0.01 - Serum - 0.01 Otopina reagensa 1.0 1.0

Promijea se i inkubira 30 minuta na 20-25C, 25 minuta na 30C ili 15 minuta na 37C. Oitaju se absorbancije standarda i proba prema slijepoj reagensa na 500 nm (492-550 nm).


29

R a u n Aprobe ------------ x koncentracija standarda = mmol glukoze/L Astandarda

N a p o m e n a Uzorak za analizu moe biti kapilarna krv, serum, heparinizirana plazma, likvor. Linearnost metode je do 27.8 mmol/L. Iznad ove vrijednosti, uzorak se mora razrijedi destiliranom vodom u odnosu 1+2 (0.1 ml uzorka + 0.2 ml destilirane vode) ponoviti odreivanje a rezultat mnoiti sa 3. Glukoza je u serumu i plazmi stabilna 8 sati na 20-25C ili 3 dana na 2-8C. Kod koritenja kapilarne krvi za inhibiciju glikolize upotrebljava se natrij ili kalij fluorid. Glukoza je u takvom uzorku stabilna 1 dan na 20-25C ili 7 dana na 2-8C (ako se uva u zatvorenoj epruveti). Glukoza je u nadsloju (kapilarna krv s uranil acetatom) stabilna 3 dana na 2-8C u zatvorenoj epruveti. Mokrana kiselina, askorbinska kiselina, glutation, antikoagulancije, bilirubin i kreatinin u fiziolokim koncentracijama ne utjeu na test. Otopina reagensa sadri natrij azid.

L i t e r a t u r a: Trinder P. Ann Clin Biochem 1969; 6: 24.


30

ODREIVANJE KOLESTEROLA U SERUMU e n z i m s k a CHOD-PAP metoda

N a e l o Kolesterol esteri se djelovanjem kolesterol esteraze hidroliziraju, a ukupni kolesterol oksidira uz kolesterol oksidazu u kolestenon i vodik peroksid koji s aminofenazonom i fenolom u prisustvu peroksidaze (POD) stvara obojeni fenazonkinonimin koji se mjeri na 500 nm.

kolesterol-esteri+H2O kolesterol esteraza kolesterol + masna kiselina kolesterol+O2 kolesterol oksidaza 4- kolestenon + H2O2 2 H2O2 + 4-aminoantipirin + HBA POD kinonimin + 4 H2O

HBA hidroksibenzojeva kiselina

R e a g e n c i j e

R1 Reagens Kolesterol esteraza (KE) Kolesterol oksidaza (KO) Peroksidaza (POD) 4-aminoantipirin HBA Pufer, pH 6.7 0.1 (20C)

R2 Standard

>500 U/L >200 U/L >300 U/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 50 mmol/L

5.17 mmol/L Priprema otopine reagenasa i stabilnost Sadraj boice reagensa TR-1032 otopiti u 20 ml destilirane vode, TR-1033 otopiti u 100 ml destilirane vode. Stabilnost je 14 dana na 2-8C, 2 dana na 20-25C.

P o s t u p a k Slijepa Standard Proba reagensa ml ml ml

Standard - 0.010 - Serum - - 0.010 Otopina reagensa 1.0 1.0 1.0

Promijea se i inkubira 15 minuta na 25C, 10 minuta na 30C ili 5 minuta na 37C. Izmjeri absorbancije proba (Ap) i standarda (As) prema slijepoj reagensa na 500 nm (500-550 nm).

R a u n Aprobe ------------ x 5.17 = mmol kolesterola/L Astandarda


31

N a p o m e n a Uzorak za analizu moe biti serum, heparinizirana ili EDTA plazma.

Kolesterol je u uzorku stabilan 6 dana na 20-25C ili na 2-8C (6 mjeseci ako se zamrzne). Stabilnost boje je 20 minuta. Linearnost metode je do 20 mmol/L. Ako je apsorbancija slijepe probe > 0.200, reagens moe biti zagaen. Standardi kolesterola ili kalibratori koji sadre tvari kao to su octena kiselina, deterdenti ili surfaktanti mogu inhibirati enzime u reagensu i ne mogu se koristiti.

L i t e r a t u r a: Allain CC, Poom L,.Chan SG, Richmond W, Pu F. Clin Chem.1974; 20: 470.


32

ODREIVANJE KATALITIKE KONCENTRACIJE ALANIN AMINOTRANSFERAZE (ALT) Metoda kontinuiranog mjerenja

Modifikacija metode po Karmenu

N a e l o L-alanin + -ketoglutarat ALT piruvat + L-glutamat

Piruvat + NADH + H+ LDH laktat + NAD+

R e a g e n c i j e

R1 reagens -ketoglutarat L-alanin Reducirani nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH2) Laktat dehidrogenaza (LDH) Etilendiamin tetraoctena kiselina (EDTA) Pufer (pH 7.4 0.1) Tris-(hidroksimetil) aminometan

12 mmol/L 400 mmol/L

0.15 mmol/L 33.3 kat/L

5 mmol/L 80 mmol/L

P o s t u p a k Proba ml

Otopina reagensa 2.0 (ugrijana na 30C ili 37C) Serum (ili plazma) 0.2

Promijeati, inkubirati 90 sekundi na 30C ili 37C. Oitati absorbanciju probe prema destiliranoj vodi nakon 1,2,3 minute. Izraunati A/minuta.

R a u n ALT (U/L) = A/minuta x 1746

N a p o m e n a Nehemolizirani serum ili plazma su najei uzorci za odreivanje katalitike koncentracije ALT. Katalitika koncentracija ALT u serumu stabilna je tjedan dana na 2-8C. Fluoridi, EDTA i heparin u uobiajenim koncentracijama ne utjee na analizu. Linearnost metode je do 350 U/L. Iznad ove vrijednosti potrebno je uzorak razrijediti s fiziolokom otopinom (0.9% NaCl) i to uzeti u obzir kod rauna. Young i suradnici objavili su popis lijekova i drugih tvari koje utjeu na ALT u cirkulaciji i koje smetaju mjerenju katalitike koncentracije ovog enzima.


33

L i t e r a t u r a Kamen A. J Clin Investigation 1955; 34: 131. Committee on Enzymes, Scandinavian Society for Clinical Chemistry and Clinical Physiology: Scand J Clin Lab Invest. 1974; 33: 291. International Federation of Clinical Chemistry, Committee on Standards, Special Report: Clin Chem 1977; 23: 887. Young DS, Pestaner LC, Gibberman V. Clin Chem 1975; 21:


34

ODREIVANJE KATALITIKE KONCENTRACIJE ASPARTAT AMINOTRANSFERAZE (AST)

Metoda kontinuiranog mjerenja Modifikacija metode po Karmenu

N a e l o L-aspartat + -ketoglutarat AST oksalacetat + L-glutamat

oksalacetat + NADH+ + H+ MDH malat + NAD+

R e a g e n c i j e

R1 reagens -ketoglutarat L-aspartat Reducirani nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH2) Malat dehidrogenaza (MDH) Laktat dehidrogenaza (LDH) Etilendiamin tetraoctena kiselina (EDTA) Pufer (pH 7.7 0.1) Tris-(hidroksimetil) aminometan

12 mmol/L 200 mmol/L 0.15 mmol/L 10 kat/L 22 kat/L 5 mmol/L

80 mmol/L

P o s t u p a k Proba ml

Otopina reagensa 2.0 (ugrijana na 30C ili na 37C) Serum (ili plazma) 0.2

Promijeati, inkubirati 90 sekundi (na 30C ili 37C). Oitati absorbanciju probe prema destiliranoj vodi nakon 1,2,3 minute na 340 nm (334 nm; 356 nm). Izraunati A/minuta.

R a u n AST (U/L) = A/minuta x 1746

N a p o m e n a Nehemolizirani serum (katalitika koncentracija AST u serumu stabilna je tjedan dana na 2-8C) ili plazma (fluoridi, EDTA i heparin u uobiajenim koncentracijama ne utjee na analizu) su pogodni uzorci. Linearnost metode je do 350 U/L. Iznad ove vrijednosti potrebno je uzorak razrijediti s fiziolokom otopinom (0.9% NaCl) i to uzeti u obzir kod rauna. Young i suradnici su objavili popis lijekova i drugih tvari koje utjeu na AST u cirkulaciji i koje smetaju mjerenju katalitike koncentracije enzima.


35

L i t e r a t u r a Karmen AJ. Clin Investigation 1955; 34: 131. Committee on Enzymes, Scandinavian Society for Clinical Chemistry and Clinical Physiology: Scand J Clin Lab Invest 1974; 33: 291. International Federation of Clinical Chemistry, Committee on Standards, Special Report: Clin Chem 1977; 23: 887. Young DS, Prestaner LC, Gibberman V. Clin Chem 1975; 21:


36

ODREIVANJE KATALITIKE KONCENTRACIJE ALKALNE FOSFATAZE (ALP)

Metoda jedne toke

N a e l o Alkalna fosfataza u prisutnosti magnezijevih iona djeluje na p-nitrofenilfosfat pri pH 10.2 i temperaturi reakcijske smjese od 30C stvarajui p-nitrofenol. Intenzitet ukastog obojenja je proporcionalan koncentraciji osloboenog produkta odnosno aktivnosti alkalne fosfataze i mjeri se na 405 nm.

R e a g e n c i j e 1. Puferirani supstrat p-nitrofenilfosfat, 4.0 mmol/L, amino metil propanol 840 mmol/L, magnezij sulfat 0.5 mmol/L 1.052 g dinatrij p-nitrofenilfosfata C6H4NO2PNa2 (Mr 263.1) i 123.3 mg magnezij sulfata MgSO4 x 7H2O (Mr 246.5) se otopi u destiliranoj vodi, doda 74.9 ml 2-amino-2-metilpropanola (Mr 89.1), podesi pH 10.2 i nadopuni destiliranom vodom na 1 L. Reagens je postojan 2 mjeseca uz uvanje u hladioniku. 2. Natrij hidroksid, 50 mmol/L (2 g/L) 2 g NaOH se otopi i nadopuni destiliranom vodom do 1 L. 3. Matini standard p-nitrofenola 0.36 mmol/L (50 mg/L) 5.0 mg p-nitrofenola (Mr 139) se otopi u 50 mmol/L NaOH i dopuni s NaOH u odmjernoj tikvici na 100 ml. 4. Radni standard p-nitrofenola, 45 mol/L 2.5 ml matinog standarda (3) razrijedi se s 50 mmol/L NaOH na 20 ml. Radni standard pripravlja se svakodnevno.

P o s t u p a k Proba Slijepa ml ml

Puferirani supstrat (1) 1.0 1.0

Predinkubira se u vodenoj kupelji na 30C tijekom 5 minuta i zatim doda

Serum 0.050 -

Dri se 30 minuta na 30C i zatim prekida inkubacija dodatkom

NaOH (2) 10.0 10.0 Serum - 0.050

Mjeri se absorbancija probe prema slijepoj na 405 nm.

Rezultat se izraunava iz badarnog dijagrama koji se pripravlja mijeanjem razliitih volumena radnog standarda p-nitrofenola s otopinom natrij hidroksida (2).


37

ml radnog standarda 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 ml NaOH (2) 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 odgovara katalitikoj 60 120 180 240 300 koncentraciji ALP-U/L

U epruvetu se stavi s 1.0 ml radnog standarda koji sadri 4.5 x 10-2 mol p-nitrofenola u volumenu od 5.5 ml. Ako se ta koliina p-nitrofenola stvori tokom 30 minuta, tada je katalitika koncentracija alkalne fosfataze u 50 l ispitivanog uzorka koji je konano razrijeen na 11.0 ml slijedei:

11.0 1 1000 ------- x 4.5 x 10

-2 mol x ------- x ------------ = 60 mol/minuta/L = 60 U/L

5.5 30 0.05

L i t e r a t u r a Modifikacija postupka s gotovim reagencijama i postupka koji preporua Britanska asocijacija klinikih biokemiara, 1980.

Documents

Klinička biokemija - Propisi