Univerzitet u Niu Prirodnomatematiki fakultet

Odsek za hemiju

Ivana Rai Mii

Kinetikospektrofotometrijsko odreivanje pojedinih

komponenata u farmaceutskim preparatima

Doktorska disertacija

Ni, 2011.

PRIRODNO-MATEMATIKI FAKULTET NI

KLJUNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA Redni broj, RBR:

Identifikacioni broj, IBR:

Tip dokumentacije, TD: monografska

Tip zapisa, TZ: tekstualni Vrsta rada, VR: Doktorska disertacija

Autor, AU: Ivana Rai Mii

Mentor, MN: Dr Gordana Mileti Naslov rada, NR: Kinetiko-spektrofotometrijsko odreivanje pojedinih komponenata u

farmaceutskim preparatima

Jezik publikacije, JP: srpski

Jezik izvoda, JI: srpski i engleski

Zemlja publikovanja, ZP: Srbija Ue geografsko podruje, UGP: Srbija

Godina, GO: 2011.

Izdava, IZ: autorski reprint

Mesto i adresa, MA: Ni,Viegradska 33

Fiziki opis rada, FO: (poglavlja/ strana/ citata/ tabela/ slika/ grafika/ priloga)

7 poglavlja,198 strana, 157 citata, 39 tabela, 95 slika

Nauna oblast, NO: hemija

Nauna disciplina, ND: analitika hemija

Predmetna odrednica/Kljune rei, PO: urea, streptomicin, neomicin, ampicilin, natrijum-salicilat, histidin, farmaceutski preparati, kinetika-spektrofotometrija, HPLC, mikrobioloka disk-difuziona metoda

UDK 543.23 + 535.243 : 615.45 uva se, U: biblioteka

Vana napomena, VN: Disertacija je raena u laboratorijama PMF-a Univerziteta u Niu

Izvod, IZ: U ovom radu su predloene nove kinetiko-spektrofotometrijske metode za odreivanje uree, streptomicina, neomicina, ampicilina, natrijum-salicilata i histidina, a na osnovu: uticaja streptomicina i neomicina na kinetiku reakcija modifikovane Berthelot-ove metode za odreivanje uree, karakteristika kinetike procesa formiranja kompleksa ampicilina sa Ni(II) jonima u baznoj sredini i uticaja histidina na ovu reakciju, kao i karakteristike degradacije kompleksa Fe(III)-salicilata sa Fenton-ovim reagensom. Razraene metode su primenjene na realne uzorke odreivanjem navedenih supstanci u farmaceutskim preparatima.

Datum prihvatanja teme, DP: 07.07.2010. Nastavno-nauno Vee Fakulteta 12.07.2010. Nauno-struno Vee Univerziteta

Datum odbrane, DO:

lanovi komisije, KO: Predsednik: lan: lan,mentor:

Obrazac Q4.09.13 - Izdanje 1

PRIRODNO-MATEMATIKI FAKULTET NI

KEY WORDS DOCUMENTATION Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: Monograph

Type of record, TR: Textual Contents code, CC: PhD dissertation

Author, AU: Ivana Rai Mii

Mentor, MN: Gordana Mileti, PhD Title, TI: Kinetic-spectrophotometric determination of some components in

pharmaceutical preparations

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: Serbian and English

Country of publication, CP: Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2011.

Publisher, PB: Authors reprint

Publication place, PP: Ni, Viegradska 33 Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

7 chapters, 198 pages, 157 references, 39 tables, 95 pictures

Scientific field, SF: Chemistry

Scientific discipline, SD: Analytical Chemistry Subject/Key words, S/KW: Urea, streptomycin, neomycin, ampicillin, sodium-salicylate, histidine,

pharmaceuticals, kinetic-spectrophotometry, HPLC, microbiological disc-diffusion method.

UC 543.23 + 535.243 : 615.45

Holding data, HD: Library

Note, N: The dissertation work was done at PMF, University of Ni laboratoriesAbstract, AB: New kinetic-spectrophotometric methods have been developed for the

determination of urea, streptomycin, neomycin, ampicillin, sodium-salicylate and histidine, based on: the effect of streptomycin and neomycin on the reaction kinetics in the modified Berthelot method for the determination of urea, characteristics of the kinetic processes in formation of complex between nickel (II) ion and ampicillin and histidin impact on this reaction, as well as the characteristic of Fe(III)-salicylate complex degradation by Fenton reagent. Application of proposed methods was examined on real samples by determining mentioned components in pharmaceuticals.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 07.07.2010. Faculty Academic Board 12.07.2010. University Academic Board

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President:

Member:

Member, Mentor:

Obrazac Q4.09.13 - Izdanje 1

Mojoj majci, koleginici i najboljem prijatelju hvala na bezuslovnoj ljubavi, portvovanosti i dragocenim savetima.

Ova doktorska disertacija uraena je u laboratorijama Odseka za hemiju Prirodno-matematikog fakulteta Univerziteta u Niu, kao sastavni deo nauno-istraivakih projekata (1211 i 142015) koje je finansiralo Ministarstvo za nauku i tehnoloki razvoj Republike Srbije.

Izradom disertacije rukovodila je dr Gordana Mileti, redovni profesor Prirodno-matematikog fakulteta Univerziteta u Niu, koja me je uvela u oblast hemijske analize primenom kinetikospektrofotometrijskih metoda. Zahvaljujem joj na podrci, razumevanju i vremenu koje mi je posvetila. Hvala joj na savetima, primedbama i predlozima, koji su mi pomogli pri kreiranju istraivanja, organizaciji eksperimenta i prezentaciji rezultata ovog rada. Zahvaljujem dr Sneani Miti, redovnom profesoru Prirodno-matematikog fakulteta Univerziteta u Niu, koja mi je pomogla korisnim sugestijama i savetima u toku razrade i primene predloenih metoda hemijske analize, kao i u prikazu rezultata. Posebno joj zahvaljujem na ukazanom poverenju, da ovo istraivanje realizujem u okviru navedenih projekata kojima je rukovodila. Takoe se zahvaljujem dr Slavici Sunari, docentu Medicinskog fakulteta Univerziteta u Niu, koja se rado prihvatila ocene ovog rada. Zahvaljujem dr Danijeli Kosti, vanrednom profesoru Prirodno-matematikog fakulteta Univerziteta u Niu, na pomoi i saradnji, posebno u poetnom periodu mog istraivakog rada. Nastavno-istraivakom timu Katedre za Analitiku i Fiziku hemiju Prirodno-matematikog fakulteta Univerziteta u Niu zahvaljujem na saradnji tokom proteklih godina, kao i kolegama sa katedre za Organsku hemiju i biohemiju.

Srdano zahvaljujem mr Nini Lazarevi, viem lektoru Departmana za anglistiku Filozofskog fakulteta Univerziteta u Niu i Aleksandri Stanojev na editovanju engleskih prevoda publikovanih delova ove disertacije, kao i Vladimiru Adamoviu, dipl. in. arh. na pomoi u tehnikoj obradi ilustrovanih eksperimentalnih rezultata. Beskrajno zahvaljujem suprugu na podrci i razumevanju.

SADRAJ

UVOD ............................................................................................................................................ 15

1. TEORIJSKI DEO .................................................................................................................. 21

1.1. Farmaceutski preparati .............................................................................................. 21

1.1.1. Urea ......................................................................................................................... 24

1.1.1.1. Metode za odreivanje uree ........................................................................... 25

1.1.1.1.1. Kinetikospektrofotometrijska (enzimska) metoda .............................. 27

1.1.2. Streptomicin ............................................................................................................ 30

1.1.2.1. Metode za odreivanje streptomicina ............................................................ 31

1.1.3. Neomicin ................................................................................................................. 33

1.1.3.1. Metode za odreivanje neomicina ................................................................. 34

1.1.3.1.1. Mikrobioloka metoda ............................................................................ 35

1.1.4. Natrijum salicilat ..................................................................................................... 37

1.1.4.1. Metode za odreivanje natrijum salicilata ..................................................... 37

1.1.4.1.1. Osnovi Fenton-ove reakcije .................................................................... 39

1.1.5. Ampicilin ................................................................................................................. 40

1.1.5.1. Metode za odreivanje ampicilina ................................................................. 41

1.1.6. Histidin .................................................................................................................... 43

1.1.6.1. Metode za odreivanje histidina .................................................................... 44

1.2. Kinetike metode analize .......................................................................................... 46

1.2.1. Kinetika hemijskih reakcija ..................................................................................... 46

1.2.2. Faktori koji utiu na brzinu hemijske reakcije ........................................................ 48

1.2.2.1. Uticaj temperature .......................................................................................... 48

1.2.2.2. Uticaj koncentracije reaktanata ...................................................................... 49

1.2.2.3. Uticaj rastvaraa............................................................................................. 49

1.2.2.4. Uticaj katalizatora .......................................................................................... 50

1.2.2.4.1. Biokatalizatori (enzimi) .......................................................................... 51

1.2.2.5. Uticaj aktivatora ............................................................................................. 58

1.2.3. Klasifikacija kinetikih metoda analize ................................................................... 59

1.2.4. Primena kinetikih metoda analize za odreivanje katalizatora .............................. 60

1.2.4.1. Diferencijalne metode .................................................................................... 61

1.2.4.2. Integralne metode........................................................................................... 64

1.2.5. Karakteristike kinetikih metoda analize ................................................................ 67

1.3. Hromatografija visoke efikasnosti (HPLC) ............................................................... 74

1.4. Regresiona i korelaciona analiza ............................................................................... 77

1.4.1. Regresiona analiza ................................................................................................... 77

1.4.2. Korelaciona analiza ................................................................................................. 79

2. EKSPERIMENTALNI DEO ................................................................................................. 81

2.1. Program i metodika rada ............................................................................................... 81

2.2. Eksperimentalni postupak ............................................................................................. 81

2.2.1. Aparati ..................................................................................................................... 81

2.2.2. Reagensi .................................................................................................................. 82

2.3. Eksperimentalni postupak ............................................................................................. 84

2.3.1. Kinetikospektrofotometrijska metoda za odreivanje brzine indikatorske reakcije

................................................................................................................................. 84

2.3.2. Procedura za reakcioni sistem R3-urea-ureaza-R4................................................... 85

2.3.3. Procedura za reakcioni sistem R3-urea-streptomicin-ureaza-R4 .............................. 86

2.3.4. Procedura za reakcioni sistem R3-urea-neomicin-ureaza-R4 ................................... 87

2.3.5. Procedura za reakcioni sistem Na-salicilat-vodonik peroksid-Fe(II)...................... 88

2.3.6. Procedura za reakcioni sistem ampicilin-Ni(II)....................................................... 89

2.3.7. Procedura za reakcioni sistem ampicilin-histidin-Ni(II) ......................................... 91

3. REZULTATI I DISKUSIJA .................................................................................................. 93

3.1. Kinetikospektrofotometrijsko odreivanje uree ........................................................ 93

3.1.1. Odreivanje optimalnih uslova odigravanja reakcije .............................................. 97

3.1.2. Validacija kinetikospektrofotometrijske metode za odreivanje uree ............... 101

3.1.3. Primena kinetikospektrofotometrijske metode za odreivanje uree .................. 104

3.2. Kinetikospektrofotometrijsko odreivanje streptomicina ....................................... 105

3.2.1. Odreivanje optimalnih uslova odigravanja reakcije ............................................ 108

3.2.2. Validacija kinetikospektrofotometrijske metode za odreivanje streptomicina 113

3.2.3. Primena kinetikospektrofotometrijske metode za odreivanje streptomicina ... 115

3.3. Kinetikospektrofotometrijsko odreivanje neomicina ............................................. 118

3.3.1. Odreivanje optimalnih uslova odigravanja reakcije ............................................ 122

3.3.2. Validacija kinetikospektrofotometrijske metode za odreivanje neomicina ..... 127

3.3.3. Primena kinetiko-spektrofotometrijske metode za odreivanje neomicina ......... 131

3.4. Kinetikospektrofotometrijsko odreivanje Na-salicilata ......................................... 133

3.4.1. Odreivanje optimalnih uslova odigravanja reakcije ............................................ 134

3.4.2. Validacija kinetiko-spektrofotometrijske metode za odreivanje Na-salicilata .. 138

3.4.3. Termodinamike karakteristike sistema ................................................................ 141

3.4.4. Primena kinetikospektrofotometrijske metode za odreivanje Na-salicilata .... 144

3.5. Kinetikospektrofotometrijsko odreivanje ampicilina ............................................ 146

3.5.1. Odreivanje optimalnih uslova odigravanja reakcije ............................................ 147

3.5.2. Validacija analitike metode za odreivanje ampicilina ....................................... 150

3.5.3. Termodinamike karakteristike sistema ................................................................ 152

3.5.4. Primena kinetikospektrofotometrijske metode za odreivanje ampicilina ........ 155

3.6. Kinetikospektrofotometrijsko odreivanje histidina ............................................... 158

3.6.1. Odreivanje optimalnih uslova odigravanja reakcije ............................................ 159

3.6.2. Validacija analitike metode za odreivanje histidina .......................................... 162

3.6.3. Termodinamike karakteristike sistema ................................................................ 166

IZVOD ......................................................................................................................................... 169

SUMMARY ................................................................................................................................ 175

LITERATURA ............................................................................................................................ 181

BIOGRAFIJA SA BIBLIOGRAFIJOM ..................................................................................... 195

15

UVOD

Kvantitativna analiza lekova i ostalih farmaceutskih preparata je sastavni deo kontrole ovih proizvoda obzirom na injenicu da delotvorne koncentracije nisu uvek i bezbedne. Njihova primena je ograniena rokom trajanja, jer se tokom vremena mogu hemijski promeniti, pri emu dolazi do gubitka njihovog aktivnog dejstva, a u nekim sluajevima i do pojave toksinih efekata.

Terapijska kontrola lekova je od najvee koristi onda kada ozbiljnost klinike situacije

zahteva agresivnu primenu leka. esto se javljaju i sluajna trovanja lekovima, npr. aspirin je odgovoran za vei broj sluajnog trovanja kod dece nego bilo koja druga supstanca. Kod osoba osetljivih na aspirin kao zamena primenjuje se natrijum salicilat, koji takoe moe da izazove toksine efekte usled prekomerne administracije i/ili akumulacije u organizmu. Rasprostranjena primena antibiotika vodi ka poveanju faktora rezistencije itd. Laboratorijski nalazi daju osnovu za blagovremeno i racionalno prilagoavanje doze leka. Metabolizam lekova se odvija u jetri, dok je renalna ekskrecija glavni nain za eliminaciju lekova i njihovih metabolita, kao i proizvoda metabolizma proteina, npr. uree. Smanjena bubrena funkcija, uzrokovana razliitim bolestima i/ili lekovima, dovodi do poveanja koncentracije lekova i metabolita u krvi.

Pored kontrole lekova vana je i kontrola pojedinih aminokiselina kao komponenata

farmaceutskih preparata. Npr. kod osoba koje boluju od reumatoidnog artritisa ili katarakte treba davati histidin kao dodatak ishrani. Dok poveane vrednosti ove aminokiseline smanjuju nivo cinka u organizmu i dovode do alergijskih, ak i asmatinih reakcija.

Iz ovih razloga postoji stalna potreba za razvojem novih i osetljivih analitikih metoda za

analizu i praenje koncentracije navedenih supstanci u razliitim vrstama uzoraka. Kinetikospektrofotometrijske metode hemijske analize su relativno brze i dovoljno selektivne za odreivanje niskih koncentracija razliitih supstanci u rastvoru. Pored toga, one ne zahtevaju skupu opremu i uglavnom koriste lako dostupne reagense, to ih ini pogodnim za primenu u laboratorijskim uslovima. Cilj ove disertacije bio je:

16

- prouavanje uticaja streptomicina i neomicina na odreivanje uree primenom modifikovane Berthelot-ove metode, kao i razrada i primena kinetikospektrofotometrijskih metoda za odreivanje uree i navedenih antibiotika,

- razvoj i primena kinetikospektrofotometrijskih metoda za odreivanje ampicilina i histidina i

- razvoj i primena kinetikospektrofotometrijske metode za odreivanje salicilata primenom Fenton-ove reakcije.

Rad se sastoji iz sledeih delova: Teorijski deo, Eksperimentalni deo, Rezultati i diskusija, Izvod, Summary i Literatura.

U Teorijskom delu opisane su osobine, primena i literaturni pregled metoda za odreivanje gore navedenih supstanci. Posebno su opisane metode koriene u eksperimentalnom radu i obradi rezultata: modifikovana Berthelot-ova i UV metoda za odreivanje uree, mikrobioloka metoda difuzije za odreivanje antibiotika, osnovi Fenton-ove hemije, hemijska kinetika, regresiona i korelaciona analiza, UV/Vis spektrofotometrija i HPLC.

U Eksperimentalnom delu dat je program i metodika eksperimenta, pregled primenjenenih reagenasa, aparature i eksperimentalne tehnike, kao i postupci pripreme uzoraka za odreivanje navedenih supstanci primenom kinetikospektrofotometrijskih i uporednih (referentnih) metoda.

Posebna panja je posveena poglavlju Rezultati i diskusija u kome su, u okviru est delova, prezentovani obraeni i analizirani eksperimentalno dobijeni rezultati za kinetikospektrofotometrijsko odreivanje uree, streptomicina, neomicina, ampicilina, histidina i salicilata. Naime, prikazani su:

- apsorpcioni spektri reaktanata i ispitivanih sistema, - rezultati odreivanja optimalnih uslova odigravanja reakcija, odnosno zavisnosti brzine

reakcija od koncentracije svakog uesnika i red reakcija u odnosu na svaki reaktant pojedinano,

- kinetike jednaine za ispitivane procese, - radne krive i jednaine za odreivanje navedenih supstanci, - termodinamike karakteristike reakcionih sistema, - rezultati granice odreivanja i granice detekcija, - rezultati tanosti i preciznosti odreivanja, - rezultati ispitivanja selektivnosti i - rezultati primene kreiranih kinetikospektrofotometrijskih metoda na farmaceutske

preparate.

17

U Izvodu su sumirani rezultati do kojih se dolo u ovom radu. Isti tekst je u engleskoj varijanti prezentovan u delu Summary.

Spisak koriene literature je naveden u estom delu i na kraju je data biografija i spisak objavljenih radova.

Koliina aktivnog sastojka je glavno merilo u

kategorizaciji farmaceutskih proizvoda.

prof. dr Nada Kovaevi

21

1. TEORIJSKI DEO

1.1. Farmaceutski preparati Farmaceutski preparati (gr. = nauka o spravljanju i davanju leka; lat. praeparatum = neto pripremljeno, npr. lek i dr.) (Vujaklija, 1961, str. 762 i 997) su lekovite aktivne supstance, pomone supstance i ostali proizvodi, koji se koriste za humanu i veterinarsku upotrebu. Farmaceutski oblik leka predstavlja kombinaciju aktivne supstance (remedium) i pomonih supstanci (excipientia) koja je prikladna za primenu. Izbor oblika za aplikaciju neke aktivne supstance zavisi od brojnih faktora kao to su: karakteristika same aktivne supstance i njene stabilnosti, terapijskog cilja, naina doziranja, mesta primene i stanja pacijenta. Jedna aktivna supstanca moe biti formulisana u vie razliitih farmaceutskih oblika. Farmakopejske monografije o lekovitim preparatima primenjuju se na sve preparate koji su obuhvaeni tom definicijom. Farmaceutski preparat mora da odgovara zahtevima iste u toku celog perioda roka trajanja, a o naznaenom roku odluuje ovlaena ustanova na osnovu eksperimentalnih rezultata dobijenih u studijama stabilnosti.

Lekoviti preparati koje propisuju monografije, podeljeni su u tri grupe prema nainu primene, a ove na vrste i kategorije (Jugoslovenska farmakopeja 2000, 2001, str. 331):

1. preparati za oralnu upotrebu:

- kapsule (tvrde, meke, gastrorezistentne i kapsule sa modifikovanim oslobaanjem lekovite supstance),

- granule (umee, obloene, gastrorezistente i granule sa modifikovanim oslobaanjem lekovite supstance),

- teni preparati za oralnu upotrebu (rastvori, emulzije i suspenzije), - prakovi za oralnu upotrebu i - tablete (neobloene, obloene, umee, rastvorljive, disperzibilne, gastrorezistentne,

tablete sa modifikovanim oslobaanjem lekovite supstance i tablete za primenu u ustima);

22

2. preparati za kou/spoljanju upotrebu:

- lekovite pene, - teni preparati za primenu na koi (amponi i penelosioni), - tapiistikovi (uretralni i tapii za unoenje u rane), - prakovi za spoljanju upotrebu, - poluvrsti preparati za spoljanju upotrebu (paste i hidrofilni i hidrofobni kremovi, geli

i masti) i - transdermalni flasteri i

3. preparati za specifina mesta aplikacije:

- preparati za ui (kapi, sprej, prakovi, tamponi, poluvrsti preparati i preparati za

ispiranje), - preparati za oi (kapi, losioni, oftalmoloki inserti i poluvrsti preparati), - preparati za nos (kapi, teni sprej, prakovi, tapii, poluvrsti preparati i preparati za

ispiranje), - parenteralni preparati (implanti, injekcije, intravenske infuzije, koncentrati i prakovi

za injekcije i intravenske infuzije), - preparati pakovani pod pritiskomaerosoli, - preparati za inhalaciju (tenosti, prakovi, preparati za rasprivanje i preparati za

inhalaciju u inhalatorima pod pritiskom i sa dozatorom), - preparati za irigaciju, - rektalni preparati (supozitorije, kapsule, rastvori, suspenzije, prakovi, tablete, masti,

gelovi, pene i tamponi), - lekoviti tamponi, - vaginalni preparati (pesari, tablete, kapsule, pene i tamponi) i - ekstrakti (teni, meki i suvi).

Posebno su navedene i obraene sledee grupe preparata:

4. radiofarmaceutici, 5. droge, 6. zavojni i hirurki materijali i 7. vakcine, serumi i derivati krvi.

Posebna grupa proizvoda na farmaceutskom tritu su dijetetski suplementi. To su preparati

koji dopunjuju normalnu ishranu i predstavljaju koncentrovane izvore vitamina, minerala ili drugih supstanci sa hranljivim ili fiziolokim efektom pojedinano ili u kombinaciji, a u prometu su u dizajniranim oblicima, tako da se mogu uzimati u doziranim koliinama (kapsule, pastile, tablete, pilule, prakovi, kapi i sl.) (Jugoslovenska farmakopeja 2000, 2001, str. 1085).

23

Kvantitativna analiza aktivnih supstanci u farmaceutskim preparatima predstavlja sastavni

deo njihove kontrole kvaliteta i veoma je znaajna, s obzirom na injenicu da, pri odreenim okolnostima, ovi preparati mogu, ne samo izgubiti aktivno dejstvo i pokazivati smanjenu efikasnost, ve mogu pokazivati i toksine efekte.

Mehanizam delovanja aktivne komponente farmaceutskog preparata odnosi se na odreene

biohemijske ili fizioloke procese, koji izazivaju bioloku reakciju. Lekovi uglavnom deluju preko receptora koji se nalaze na povrini elije ili unutar nje. Vani receptori lekova su celularni proteini, kao to su enzimi, strukturni ili transportni proteini. Brzina odvijanja enzimskih procesa koji metaboliu veinu lekova obino slede kinetiku reakcije prvog reda. Drugim reima brzina metabolizma srazmerna je koncentraciji leka.

Jetra je glavni organ odgovoran za metabolizam leka. Njena uloga se sastoji u tome da

lipofilne nepolarne molekule pretvara u polarnije oblike koji se rastvaraju u vodi. Molekul leka moe da se promeni reakcijama koje menjaju njegovu hemijsku strukturu (oksidacija, redukcija ili hidroliza), ili reakcijama koje konjuguju lek (glukuronidacija, sulfatacija), ili i jednim i drugim. Biolokom transformacijom lekova mogu nastati farmakoloki aktivni i neaktivni metaboliti. Renalna ekskrecija predstavlja glavni put eliminacije lekova i njihovih metabolita (Moyer, 1997, str. 891).

24

1.1.1. Urea

Urea (karbamid, karbonil diamid) je jedinjenje azota (slika 1) prvi put otkriveno u urinu

1773. godine i prva je organska supstanca koja je vetaki sintetisana iz neorganskog meterijala 1828. godine. To je netoksina supstanca u obliku belog kristalnog praha ili transparentnih kristala, veoma rastvorna u vodi (51,8 g/100 cm3, 20 C) i etanolu, praktino nerastvorna u hloroformu i etru. Topi se na temperaturi od 133 C do 135 C.

Slika 1. Hemijska struktura uree.

Zahvaljujui svojim karakteristinim svojstvima, urea se koristi u mnogim industrijskim granama za izradu adheziva, vezivnih proizvoda, zaptivnih smesa, smola, lepkova, punioca, katalizatora, humektanata i dehidratacionih sredstava. Takoe se koristi kao ubrivo, zatim kao dodatak ivotinjskoj hrani i kao analitiki reagens. Zbog znatne rastvorljivosti u stratum corneum-u, urea je vana za njegovu hidrataciju. Bolesti, kao to su, atopini dermatitis ili kliniki suva koa su posledica smanjenog sadraja uree. Za negu i leenje takve koe koriste se razliiti kozmetiki proizvodi i dermatoloki preparati sa sadrajem uree od 110 % (dezodoransi, amponi, farbe za kosu, skidai boja, teni sapuni i deterdenti, kreme, losioni itd.) radi pospeivanja rehidratacije. Kao keratolitiki agens, urea (20 %) se koristi u preparatima za leenje bolesti kao to su ihtioza vulgaris, hiperkeratoza dlanova i stopala, kseroza i keratozis pilaris (Robertson i Maibach, 1995, str. 932).

Urea je znaajan endogeni proizvod metabolizma belanevina kod sisara. U elijama se neprekidno vre procesi razgradnje hranom unetih proteina do peptida i amino kiselina i procesi sinteze proteina iz amino kiselina unetih u sklopu proteina. Glutamat je kljuni molekul u elijskom metabolizmu proteina pri kome u telu nastaju amino kiseline kao metaboliko gorivo za druge funkcionalne procese. Kljuni proces u degradaciji amino kiselina je reverzibilna reakcija transaminacije, pri emu se NH2-grupa amino kiseline donora prenosi na akceptor, odgovarajuu -keto kiselinu. Kao akceptori amino grupe obino slue tri keto kiseline: pirogroana, koja prelazi u alanin, oksalsiretna, koja prelazi u asparaginsku i ketoglutarna, koja prelazi u glutaminsku. Iz alanina i asparaginske kiseline moe nastati glutaminska kiselina dodatnim premetanjem amino grupa. Ovo je vano jer se na taj nain amino azot iz svih amino kiselina, koje podleu procesu transaminacije, moe prevesti u glutaminsku kiselinu, iz koje se

25

procesom oksidativne dezaminacije osloboa u obliku toksinog amonijaka. Mehanizmi detoksikacije amonijaka u organizmu oveka su: sinteza uree, stvaranje amida (glutamina i asparagina), reduktivna aminacija -ketoglutarne kiseline i produkcija amonijumovih soli. U ovim procesima se oslobaa glutaminska kiselina, koja se putem krvi vraa do perifernih tkiva gde ponovo moe da vee amonijak i da ga iz elija eksportuje u obliku glutamina.

Biosinteza uree uz pomo enzima jetre predstavlja glavni put u detoksikaciji oraganizma od

amonijaka. Kao rezultat ovog biolokog procesa produkuju se enormne koliine uree: organizam svake odrasle osobe izlui u toku godine priblino 10 kg uree, uglavnom urinom (> 90 %), a preko gastrointestinalnog trakta i koe vei deo preostale koliine. Normalna koa sadri priblino 1 % uree. Poluvreme spontantanog razlaganja uree je priblino 3,6 godina, ali u prisustvu ureaze, hidroliza uree je 104 puta bra. Proizvodi ove rekcije su amonijak i karbaminska kiselina, koja potom spontano hidrolizuje u amonijak i ugljenu kiselinu:

COOH-NH NH OH NH-CO-NH 23

ureaza222 (1)

32322 COH NH OH COOH-NH (2)

Molekuli amonijaka se pri fiziolokoj vrednosti pH protonuju molekulima vode, a ugljena kiselina disosuje:

-

423 2OH 2NH O2H NH 2 (3)

-332 HCO H COH

(4)

Ciklus sinteze uree je od vitalnog znaaja za organizam, jer nemogunost njenog formiranja dovodi do intoksikacije amonijakom koja se prati odreenom klinikom simptomatologijom (povraanje, pospanost i mentalna retardacija), a potpuno odsustvo nekog od hepatinih enzima dovodi do smrti.

Kliniki znaaj odreivanja uree u plazmi ili serumu koristi se kao indikator funkcije

bubrega i jetre, jer razliita oboljenja ovih organa dovode do porasta koncentracije uree u krvi (Nikoli, 2000, str. 444 i 448; Amtul et al.,2002).

1.1.1.1. Metode za odreivanje uree

Za odreivanje uree koriene su razliite metode kao to su kolorimetrija, UV/Vis spektrofotometrija, potenciometrija, fluorimetrija, amperometrija, enzimske metode, HPLC hromatografija sa hidrofilnim interakcijama (HILIC), infracrvena spektrometrija sa Furijeovom transformacijom (FTIR), flow-injection analiza (FIA, protona analiza injektovanjem),

26

hemiluminiscencija itd. Pregled nekih od ovih metoda dat je u tabeli 1. Navedene metode se esto dele na direktne i indirektne. Direktne procedure su zasnovane na kondenzacionim reakcijama uree sa razliitim jedinjenjima (reaktantima ili meuproizvodima) pri emu nastaju proizvodi koji menjaju karakteristike sistema (boja, pH, apsorbanca, provodljivost itd.). Sve enzimske metode su indirektne procedure. One su degradivne jer poinju sa hidrolizom uree pomou ureaze (urea amidohidrolaza, EC 3.5.1.5), pri emu nastaje amonijum jon, koji se moe odreivati na razliite naine. Npr. Berthelot-ova metoda i njena modifikovana verzija, kao i odreivanje uree sa glutamat-dehidrogenazom (GLDH ili L-glutamat:NAD(P)+ oksidoreduktaza, EC 1.4.1.3) koriste spektrofotometrijski pristup u kvantitativnom merenju amonijaka i danas se primenjuju za rutinsko odreivanje uree u klinikim laboratorijama (Fransis et al., 2002; Fawcett i Scott, 1960; Patton i Crouch, 1977; Majki-Singh et al., 1995, str. 497; Kavari i Raki, 1987, str.89). Tabela 1. Metode za odreivanje uree.

Metoda Opseg linearnosti Granica detekcije RSD (%) Uzorak Literatura

HILIC 60 140 gcm-3 7,5 gcm-3 6,70 kozmetiki preparati Dallet et al., 2000

FTIR 0,125 0,375 mgcm-3 0,4 gcm-3 < 3,03 krema i vazelin

Otte et al., 2002

Spektrofotometrija 6 90 gcm-3 0,34 ngcm-3 2,10

dermatoloki i kozmetiki

preparati

Boji et al., 2008

do 2 gdm-3 0,009 gdm-3 < 2,34 serum, urin bioMerieux sa

FIA spektrofotometrija

0 25 gcm-3 0,9 gcm-3 / vina Gonzalez-Rodriguez et al., 2002

2 12 mmoldm-3 / 1,40 ivotinjska plazma Luca i Reis,

2001

FIA fluorimetrija

1 100 moldm-3

/ 3,00 alkoholna pia

Lida et al., 2004

Enzimska spektrofotometrija

50 500 mmoldm-3

0 100 mmoldm-3

2,2 mmoldm-3 0,047 mmoldm-3

< 6,62 < 5,10

urin serum

Orsonneau et al., 1992

Kinetikoenzimska

spektrofotometrija

0 714,3 mmoldm-3 0 142,9

mmoldm-3

0,066 mmoldm-3 < 1,15 < 0,58 urin

serum Morishita

et al., 1997

Potenciometrija

80 20 mg / < 0,40 ista supstanca

Villaseor i Limpert,

1998

8,9105 1,1103 moldm-3 / < 3,50 serum

Sehitogullari et al.,

2002

27

0,1 1,0 mmoldm-3 / < 5,60 serum

Correia et al., 2005

Diferencijalna pHmetrija

0 30 mgdm-3 0,3 mgdm-3 < 4,50 vina Larcher et al., 2007

0 5000 mgdm-3 / < 1,50 mleko Luzzana i Giardino,

1999

Amperometrija 210-5 210-4

moldm-3 510-6 moldm-3 < 5,60 ubriva Guilbault i Seo, 1994

Konduktometrija 5 70 mmoldm-3 / / serum Thavarungkul et al.,

1999 HPTLC*

denzitometrija 10 50 gcm-3 1,87 gcm-3 3,84 farm. preparati Knorst et

al., 1997 Spektrofotometrija 8 128 gcm-3 5,18 gcm-3 2,72 farm. preparati (*) High Performance Thin Layer Chromatography (tankoslojna hromatografija visoke efikasnosti)

Britanska i Jugoslovenska farmakopeja propisuju Kjeldahl-ovu metodu kao zvaninu

metodu za odreivanje uree u dermatolokim i kozmetikim preparatima (British Pharmacopoeia, 2005, str. 1480; Jugoslovenska farmakopeja 2000, 2001, str. 1053).

1.1.1.1.1. Kinetikospektrofotometrijska (enzimska) metoda

Ova metoda se zasniva na dvostrukoj enzimskoj katalizi i primeni Warburg-Christianovog optikog testa. Koristi sistem koji sadri ureazu i glutamat dehidrogenazu (GLDH) koja sadri NAD ili NADP kao koenzim. Optiki test se bazira na osobini redukovanih oblika piridin-koenzima (NADH2 ili NADPH2) da apsorbuju svetlost talasnih duina 340360 nm, dok njihovi oksidovani oblici (NAD ili NADP) ne apsorbuju svetlost u ovom podruju. Promena intenziteta apsorpcije svetlosti na 340 nm odraava brzinu katalizovane reakcije, a metode u kojima se primenjuje ovaj test spadaju u kinetike procedure.

Dakle, osloboeni amonijak, koji nastaje u reakciji razlaganja uree pomou ureaze

(jednaina 1), odreuje se prema reakciji (jednaina 5) sa 2-ketoglutaratom i redukovanim koenzimom NADH (nikotinamid-adenin-dinukleotid), koju katalizuje enzim GLDH i pri emu nastaje glutaminska kiselina i oksidovani oblik koenzima NAD+:

NH4+ + HOOC(CH2)2COCOO + NADH ADP GLDH,

ADP GLDH, NAD++H2O+HOOC(CH2)2CH

N H3COO (5)

Adenozindifosfat (ADP) se dodaje da aktivira i stabilizuje GLDH. Meru za koliinu prisutnog amonijaka nastalog razlaganjem uree predstavlja opadanje apsorbance, koja je proporcionalna koliini utroenog NADH. U ovoj reakciji ne interferiraju druga azotna jedinjenja, bilirubin,

28

hemoglobin i lipemija. Preciznost metode je odlina, a primenjljiva je i za rad na automatskim analizatorima, to je ini metodom izbora za odreivanje uree (Hallet i Cook, 1971; Gutman i Bergmeyer, 1974, str. 1794).

Ureaza

Ureaza je znaajna u istoriji enzimologije kao prvi enzim koji je izolovan i prekristalisan (James Sumner, 1926.). Pripada grupi metaloenzima i sastoji se iz dve polujedinice koje su vrsto povezane kovalentnim vezama i ima dva aktivna centra (slika 2).

Slika 2. Aktivni centar ureaze.

Svaki aktivni centar sadri dva atoma nikla povezana preko karboksilatne grupe

karboksilatnog ostatka lizina (Lys) i hidroksidnog jona. Jedan atom nikla (Ni1) organizovan je u kvadratno piramidalnoj geometriji sa koordinacionim brojem pet, a drugi atom nikla (Ni2) u pseudooktaedarnoj geometriji sa koordinacionim brojem 6. Ni1 vezuje dva molekula histidina preko atoma azota iz svakog od imidazolovih prstena, a preko kiseonikovih atoma vezuje molekule lizina i vode, kao i hidroksidnu grupu. Ni2 vezuje dva molekula histidina preko atoma azota iz svakog od imidazolovih prstena, a preko kiseonikovih atoma vezuje molekule Lys, vode, asparagina i hidroksidnu grupu. Aktivni centar je visoko specifian i vezuje samo ureu ili hidroksiureu, a optimalna pH vrednost za aktivnost ureaze je 7,3 u fosfatnom puferu (slika 3).

29

Slika 3. Kriva aktivnosti ureaze u zavisnosti od pH sredine (Moss et al., 1997, str. 366).

Prema jednom od moguih mehanizama razgradnje uree pomou ureaze, Ni1 reaguje kao Lewis-ova kiselina. Metalni jon polarizuje karbonilnu grupu uree i aktivira je prema nukleofilnom napadu. U ovom procesu su dva molekula vode zamenjena jednim molekulom uree. Drugi atom nikla (Ni2) vezuje OH jon, koji napada parcijalno pozitivno naelektrisan ugljenik iz karbonilne grupe molekula uree. Jedna od dve amino grupe uree se protonuje. Histidin ima ulogu kiseline. Rezultat reakcije je formiranje amonijaka i karbaminske kiseline, koja se spontano razgrauje na amonijak i ugljen-dioksid (slika 4) i (jednaine 14).

Slika 4. Mehanizam razgradnje uree pomou ureaze.

30

1.1.2. Streptomicin

Streptomicin sulfat (SMS) je prvi otkriveni aminoglikozidni anitbiotik i prvi antibiotik

dobijen iz bakterije. Izolovan je iz soja Streptomyces griseus 1944. godine. Streptomicin se, prema hemijskoj strukturi, sastoji od streptidina i streptobiozamina (slika 5). Streptidin je aglikon i derivat je inozitola sa dve guanidinske grupe (1,3-diguanidino-2,4,5,6-tetrahidroksi-cikloheksan). Streptobiozamin je disaharid izgraen od dve eerne komponente: furanoidne streptoze i N-metil-2-glukozamina, koji su povezani -glikozidnom vezom. Veza izmeu streptidina i streptobiozamina je takoe -glikozidna. Streptoza sadri slobodnu aldehidnu grupu na C3 poloaju. SMS je beli prah, bez mirisa, higroskopan, ali stabilan na uticaj svetlosti i vazduha. Dobro je rastvoran u vodi, vrlo slabo rastvoran u alkoholu i praktino nerastvoran u veini ostalih organskih rastvaraa. Proizvodi se u obliku sulfatne soli zbog vee rastvorljivosti. Vodeni rastvori SMS pokazuju slabo kiselu ili skoro neutralnu reakciju i mogu biti uvani na sobnoj temperaturi nedelju dana bez gubitka dejstva. Zagrevanjem rastvora dolazi do razlaganja streptomicina. Takoe, jake kiseline i alkalije mogu da izvre inaktivaciju streptomicina.

Slika 5. Hemijska struktura streptomicina:di[O-2-deoksi-2-metilamino--L-glukopiranozil-(12)-O-5-

deoksi-3-C-formil- -L-liksofuranozil-(14)-N, N-diamidino-D-streptamin].

SMS se koristi u leenju infekcija u humanoj i veterinarskoj medicini, kao i u oblasti agrikulture. Klinika primena se sastoji u tretiranju mikobakterijskih infekcija (tuberkuloze, meningitisa i dr.) u dnevnoj dozi od 0,51 g (30 mg/kg/d). Takoe se koristi u leenju netuberkuloznih uzronika kao to su: kuga, tularemija, bruceloza i dr. u dnevnoj dozi od 1g. U kombinaciji sa penicilinom primenjuje se kod leenja infektivnog endokarditisa izazvanog enterokokama. SMS se slabo apsorbuje iz gastrointestinalnog trakta, a nakon intramuskularnog davanja njegova koncentracija u krvi se postie izuzetno brzo (nakon 12 sata). Ona je proporcionalna dozi i u toku 5 asova opada ~ 50 %. SMS se vezuje za proteine plazme priblino 2030 %, metabolie u bubrezima i izluuje se nepromenjen u mokrai 3090 % od parenteralne doze u toku 24 sata. Najozbiljniji toksini efekat koji uzrokuje SMS je naruavanje vestibularne funkcije (vertigo i gubitak ravnotee). Frekventnost i ozbiljnost ovog disbalansa proporcionalni

31

su duini administracije leka, nakon prestanaka terapije dolazi do deliminog oporavka naruenih funkcija. Istovremenu ili sekvencijalnu upotrebu drugih aminoglikozida sa streptomicinom treba izbegavati, da bi se smanjila mogunost ototoksinog delovanja (Jawetz, 1995, str. 699; Moffat, 1986, str. 976).

1.1.2.1. Metode za odreivanje streptomicina

Streptomicin je odreivan razliitim metodama kao to su spektrofotometrija, spektrofluorimetrija, hemiluminiscencija, HPLC sa razliitim detektorima, imunohemijska detekcija, kapilarna elektroforeza i dr. Pregled nekih od ovih metoda dat je u tabeli 2. Tabela 2. Metode za odreivanje streptomicina.

Metoda Opseg linearnosti Granica detekcije

(LOD)

RSD (%) Uzorak Literatura

Kinetiko-spektrofotometrijska

0,15 1,94 1,94 15,48 gcm-3 0,02 gcm

-3 < 9,30 injekcija Miti et al., 2006

Spektrofotometrija

1,87 279,8 gcm-3 0,96 gcm-3 2,40 farm. preparati Li i Gao,

2008

0,8 4,0 gcm-3 / / lekovi Sastry et al., 1998

0,005 0,4 gcm-3 0,1 gcm-3 / farm. preparati Aman et al.,

1995

8 80 gcm-3 / / farm. preparati Zakhari et al., 1990

Derivativna spektrofotometrija do 30 gcm

-3 0,42 gcm-3 / injekcija Morelli et al., 1994

Hemiluminiscencija 5 1000 gcm-3 1,4 gcm-3 2,10 plazma Huang et al,. 2001

8,6610-9 1,7210-6 moldm-3

5,1610-9 moldm-3 1,94 mleko

Wan et al,. 2006

LC sa fluorescentnim detektorom 02000 gkg

-1 8 gkg-1 15,60 mleko Suhren i

Knappstein, 1998

HPLC sa fluorimetrijskim

detektorom

10 400 gkg-1 0,005 gkg-1 < 3,50 med Edder i Corvi, 1999

5 40 gcm-3 1 gcm-3 2,75 serum Kubo et al., 1987

Spektrofluorimetrija

5 60 ppm / / farm. preparati Rizk et al.,

1995

0,025 0,4 gcm-3 0,006 gcm-3 / farm.

preparati, plazma

Belal et al., 2001

HPLC 10 80 gcm-3 0,5 gcm-3 < 6,40 serum Granados i Meza, 2007

5 50 gcm-3 2 gcm-3 2,07 serum Kurosawa et

32

al., 1985 24 240 gcm-3 2 gcm-3 1,10 / Whall, 1981

Enzimska imuno analiza 0,1 30 ngcm

-3 5,1 ngcm-3

(mleko) / mleko, tkiva

Haasnoot et al., 1999

Kapilarna elektroforeza

0,05 1 mgcm-3 10 gcm-3 0,21-0,44 / Flurer, 1995

20 200 gcm-3 6 gcm-3 0,22 baktericidi Maia et al.,

2007

Britanska i Jugoslovenska farmakopeja propisuju mikrobioloku difuzionu metodu za odreivanje streptomicina (British Pharmacopoeia, 2005, str. 1356; Jugoslovenska farmakopeja 2000, 2001, str. 959).

33

1.1.3. Neomicin

Neomicin sulfat (NMS), izolovan rastom odreenih sojeva Streptomyces fradiae 1949.

godine, predstavlja smeu dva izomera, neomicina B i neomicina C, iji je glavni sastojak neomicin B (slika 6). Neomicini B i C su glikozidi neamina (neomicin A) i neobiozamina B ili C. Centralni deo molekula neomicina je 2-dezoksistreptamin, aglikon koji je vezan za jedan monosaharidni i jedan disaharidni deo. Neomicin B se razlikuje od neomicina C po stereohemiji eera vezanog terminalno za D-ribozu (Hanko i Rohrer, 2007; Adams et al., 1998) . NMS je bela ili bledo uta kristalna supstanca, higroskopna i fotosenzitivna, ali stabilna u irem intervalu pH. Vrlo lako je rastvorljiva u vodi, teko rastvorna u alkoholu, a gotovo nerastvorljiva u acetonu i etru.

Slika 6. Hemijska struktura neomicina B: 4-O-(2,6-diamino-2,6-dideoksi--D-glukopiranozil)- 5-O-[3-O(2,6-diamino-2,6-dideoksi--L-idopiranozil)--D-ribofuranozil]-2-deoksi-D-streptamin.

Parenteralna primena neomicina je naputena zbog njegove izrazite toksinosti i njegova

upotreba je ograniena na povrinsku aplikaciju (inficirane povrine, apscesi i dr.) i oralnu (kod hepatine kome, hiperlipidemije i dr.). Ukupan sadraj leka u prvom sluaju je ogranien na 15 mg/kg/d, jer moe dovesti do sistemske toksinosti zbog njegove apsorpcije. Ukupan sadraj leka u drugom sluaju je 1 g na svakih 68 sati u toku 12 dana. Lek se neznatno apsorbuje iz gastrointestinalnog trakta i ekskretuje se fecesom. Eventualno apsorbovane koliine se izbacuju preko bubrega u urin (Jawetz, 1995, str. 699; Brody et al., 1998, str. 288).

34

1.1.3.1. Metode za odreivanje neomicina

Neomicin je odreivan razliitim metodama kao to su spektrofotometrija, spektrofluorimetrija, hemiluminiscencija, HPLC sa razliitim detektorima, imunohemijska detekcija, gasna hromatografija, kapilarna elektroforeza (CE), kapilarna izotahoforeza (cITP) i dr. Pregled nekih od ovih metoda dat je u literaturi (Stead, 2000) i u tabeli 3.

Tabela 3. Metode za odreivanje neomicina.

Metoda Opseg linearnosti Granica detekcije

(LOD)

RSD (%) Uzorak Literatura

Potenciometrijamikrobiologija 0,17 3,33 gcm

-3 0,05 gcm-3 / krv, plazma Simpson i Kobos, 1983

Spektrofotometrija

/ / 2,10 farm. preparati Gupta et al., 1983

1,710-4 1,910-3 moldm-3 / 1,00 farm. preparati

Confino i Bontchev,

1990 0,8 28 gcm-3 / 0,89 farm. preparati Amin, 1996

10 55 gcm-3 / / farm. preparati Marques et al., 1989

6,15 28,68 gcm-3 1,22 gcm-3 < 1,71 farm. preparati Sunari et al.. 2007

HPAECIPAD* 4 200 pmol 0,21 pmol / farm. preparati Hanko i Rohrer, 2007

HPLC

0,45 4,0 mgcm-3 / < 1,00 farm. preparat Tsuji et al., 1979 0,25 1 gcm-31 10 gcm-3 / 4,40

plazma, urin

Shaikh et al., 1991

75 125 % / < 1,00

mast (farm. preparat)

veterinarske formulacije

Binns i Tsuji, 1984

HPLCESLD**

2 50 gcm-3 (logaritamska kalibraciona)

0,6 gdm-3 1,70 farm. preparati Megoulas i Koupparis,

2004

Tena hromatografija 5 160 % (od 0,5 gcm-3) / < 1,30 farm. preparati Adams et al.,

1997

GLC*** 3,0 4,6 mg / < 2,0 mast (farm. preparat) Van Giessen i Tsuji 1971

Mikrobiologija (difuziona metoda) 0,5 2,5 gcm

-3 / / serum Van

Soestbergen 1969

Spektrofluorimetrijakinetika

0,07 1 gcm-3 1 70 gcm-3 0,02 gcm

-3 < 1,80 farm. preparati Gala et al., 1995 0,05 20 gcm-3 20 70 gcm-3 0,03 gcm

-3 < 1,30 farm. preparati Gala et al.. 1995 Kolorimetrija 0,4 58 gcm-3 0,04 gcm-3 < 1,19 farm. preparati Amin i Issa,

35

2003.

0,5 5 mgcm-3 / / farm. preparati Agrawl et al., 1976

CEUV 0,76 1,26 mgcm-3 / < 2,70 masti Huidobro et al., 2009 (cITP) sa

konduktometrijom 10 100 mgdm-3 5,69 mgdm-3 < 2,10 farm. preparati Kurzawa et al., 2009

HILICMSMS (LCMS) 0,1 5 gcm

-3 / < 7,90 serum Oertel et al., 2004

LC 0,2 1 mgkg-1 0,1 mgkg-1 < 7,90 tkiva Posyniak, 2001 (*) High Performance Anion Exchange Chromatography with Integrated Pulsed Amperometric Detection (hromatografija anjonske izmene visoke efikasnosti sa integrisanom pulsnom amperometrijskom detekcijom), (**) Evaporative Light Scattering Detection (detekcija rasutog zraenja), (***) Gas Liquid Chromatography (gasno tena hromatograija).

Britanska i Jugoslovenska farmakopeja propisuju mikrobioloku difuzionu metodu za

odreivanje neomicina (British Pharmacopoeia, 2005, str. 957; Jugoslovenska farmakopeja 2000, 2001, str. 751).

1.1.3.1.1. Mikrobioloka metoda

Aktivnost antibiotika se procenjuje poreenjem inhibicije rasta osetljivih mikroorganizama pod dejstvom poznatih koncentracija ispitivanog antibiotika i standardnog preparata. Standardni preparati su supstance ija je aktivnost precizno odreena u odnosu na odgovarajui internacionalni standard ili internacionalni referentni preparat.

Odreivanje mora biti planirano na nain koji omoguava validaciju matematikog modela, na kome se zasniva jednaina za izraunavanje aktivnosti. Ukoliko se izabere paralelno linijski model, dve log doza-odgovor (ili transformisan odgovor) linije ispitivanog i standardnog preparata moraju biti paralelne, linearne i izvan opsega doza korienih u obraunu. Ovi uslovi moraju biti verifikovani testovima validacije za datu verovatnou, obino P = 0,05. Drugi matematiki modeli, kao model odnosa nagiba, mogu da se koriste pod uslovom da je pruen dokaz o validnosti. Ukoliko u monografiji nije drugaije propisano, granice pouzdanosti tj. granice greke (P = 0,95) su od 95105 % od izraunate aktivnosti. Jedan od naina izvoenja ogleda je metoda difuzije.

Metoda difuzije

Potrebna koliina odgovarajue podloge se rastopi i zaseje na pogodnoj temperaturi, na

primer 4850 C za vegetativne oblike, poznatom koliinom suspenzije mikroorganizama, osetljivih na ispitivani antibiotik. Pod dejstvom antibiotika korienih u odreivanju, treba da se formiraju dovoljno velike i jasno definisane zone inhibicije. Podloga se promea i odmah razlije u

36

Petrijeve olje ili velike etvrtaste posude. Tom prilikom se obrazuje sloj podloge debljine 25 mm. Druga mogunost je upotreba dvoslojnih podloga. U tom sluaju zasejava se samo gornji sloj podloge. Povrina podloge, u momentu upotrebe, treba da bude suva i bez primetnog rasta ili odumiranja mikroorganizama.

Koristei odgovarajui rastvara ili rastvor pufera pripreme se rastvori standardnih

preparata i ispitivanog antibiotika u poznatim koncentracijama pod pretpostavkom da su istih aktivnosti. Rastvori se nanose na povrinu podloge pomou sterilnih cilindara od porcelana, nerajueg elika ili nekog drugog pogodnog materijala. Mogu da se nanose u otvore napravljene na podlozi. U svaki cilindar ili otvor nanosi se ista koliina rastvora. Alternativno se mogu koristiti papirnati diskovi od sterilnog apsorbujueg papira odgovarajueg kvaliteta, tako to se impregniraju rastvorima standardnog preparata ili ispitivanog antibiotika i reaju na povrinu zasejane hranljive podloge.

U cilju procene validnosti odreivanja, koriste se najmanje tri doze standardnog preparata i

tri doze ispitivanog antibiotika. Pretpostavljene aktivnosti doza ispitivanog antibiotika i standardnog preparata su iste. Daje se prednost korienju serije doza u geometrijskoj progresiji. Kada se linearnost sistema potvrdi odgovarajuim brojem eksperimenata kroz ogled tri-take, u rutinskim analizama moe se primeniti ogled dve take, ukoliko odobre ovlaena lica ili ustanova. U svim spornim sluajevima mora se primeniti ogled tri-take.

Pripremljeni rastvori se nanose u Petri olje ili etvrtaste posude prema statistiki

pogodnom dizajnu. Rastvori ispitivanog antibiotika i standardnog preparata se rasporeuju tako da se izbegne interakcija koncentrovanijih rastvora. Vreme inkubacije na propisanoj temperaturi traje oko 18 h. Predifuzija traje obino 14 h na sobnoj temperaturi ili na oko 4 C, kako bi se smanjio uticaj vremena potrebnog za nanoenje rastvora i poboljao nagib regresionog pravca.

Prenici zona inhibicija se mere sa preciznou od najmanje 0,1 mm. Mogu se meriti i

povrine zona inhibicija sa odgovarajuom preciznou. Aktivnost se izraunava pogodnom statistikom metodom. U cilju obezbeenja zahtevane preciznosti odreivanja, mora se koristiti dovoljan broj ponavljanja za svaku dozu. Odreivanje se moe ponoviti, a rezultati statistiki kombinovati. Tako se dobija garancija da aktivnost ispitivanog antibiotika nije ispod zahtevanog minimuma (Jugoslovenska farmakopeja 2000, 2001, str. 100).

37

1.1.4. Natrijum salicilat

Natrijum salicilat (NaS), natrijumov estar salicilne kiseline (slika 10), pripada grupi

nesteroidnih anti-inflamatornih lekova. NaS je jedan od nekoliko analoga acetilsalicilne kiseline (aspirina) koji se kliniki koristi. Zbog metaboliziranja acetilsalicilata do salicilata, ovo neacetilovano jedinjenje ima sline farmakoloke efekte kao aspirin u tretiranju inflamatornih bolesti kao to su osteoartritis i reumatoidni artritis. Ovaj lek predstavlja potencijalnu zamenu za aspirin kod ljudu alerginih na njega (Baranovskii i Bolotin, 2007; Brody et al., 1998, str. 415). NaS se oralno daje u dozi do 10 g/d. Vezuje se za proteine plazme 5090 %. Izluuje se u nepromenjenom obliku kroz urin (Moffat, 1986, str. 966). Uprkos korienju salicilata kao antipiretika i analgetika, oni mogu biti prilino toksini ukoliko se koriste u velikim dozama. Kada je koncentracija salicilata u krvi vea od 2,2 mmoldm-3 (300 mgdm-3), on postaje toksian, to zahteva praenje koncentracije u serumu. Efikasan terapeutski opseg se kree od 1,1 do 2,2 mmoldm-3 (150300 mgdm-3), to je veoma blizu granice toksinosti, dok se preporuena terapeutska doza ukupnih salicilata u plazmi kree od 0,15 do 2,1 mmoldm-3. Koncentracija salicilata vea od 4,3 mmoldm-3 (600 mg/l) se smatra smrtonosnom (Junior et al., 2000; Smith i Smith, 1966; Stewart i Watson, 1987). Salicilat se takoe koristi kao konzervans u proizvodnji hrane i pia, ali je njegovo korienje u ove svrhe u nekim zemljama zbog toksinosti zabranjeno (Swain et al, 1985). Aspirin spada u najvee uzronike sluajnog trovanja kod dece (Proudfoot, 1983). Amerika asocijacija za kontrolu otrova je objavila da je u 2000. godini 1 % svih trovanja i 5,6 % svih smrtnih sluajeva bilo uzrokovano salicilatima (Litovitz et al., 2001).

Slika 10. Hemijska struktura natrijum salicilata: natrijum-2-hidroksibenzenkarboksilat.

NaS je supstanca u obliku belog kristalnog praha ili sitnih bezbojnih kristala ili sjajnih

pahuljica. Sadri karboksilni anjon u poloaju 1 i hidroksilnu grupu u poloaju 2 benzenovog prstena, to ga ini potpuno rastvornim u vodi. Slabo se rastvara u alkoholu, a praktino je nerastvoran u etru i hloroformu (Jugoslovenska farmakopeja 2000, 2001, str.774).

1.1.4.1. Metode za odreivanje natrijum salicilata

Najee koriena metoda za odreivanje salicilata zasnovana je na Trinderovoj reakciji: salicilati iz rastvora reaguju sa feri jonima i grade purpurni kompleks u kiseloj sredini (Trinder,

38

1954). U ovoj reakciji se koristi i merkuri hlorid, koji je veoma toksian (Stojanovi et al., 1984, str. 650651). Za odreivanje natrijum salicilata koriene su razliite metode kao to su kolorimetrijske, spektrofotometrijske, spektrofluorimetrijske, enzimske, amperometrijske, potenciometrijske, polarografske, HPLC. Pregled nekih od ovih metoda dat je u tabeli 5.

Britanska Farmakopeja daje potenciometrijsku metodu za odreivanje NaS titracijom perhlornom kiselinom (British Pharmacopoeia, 2005, str. 1313). Tabela 5. Metode za odreivanje natrijum salicilata.

Metoda Opseg linearnosti Granica detekcije

(LOD)

RSD (%) Uzorak Literatura

Kolorimetrija do 5 mmoldm-3 / / serum Chubb et al., 1986 Derivativna

spektrofotometrija 0 36 gcm-3 / < 2,00 farm. preparati

Tobias, 1983

Spektrofotometrija do 1,4 moldm-3 6,5 nmoldm-3 / urin, plazma

Bouvrette i Luong, 1996

Spektrofluorimetrija

0,1 0,3 gcm-3 0,05 gcm-3 / serum Damiani et al., 2002

0,1 8 mmoldm-3 / 5,90 plazma Gupta i

Zamkanei, 1990

Enzimska do 700 gcm-3 15,7 gcm-3 < 4,50 serum You i

Bitikofer, 1984

Amperometrija do 7 mmoldm-3 / / puna krv Frew et al., 1989

2,310-6 1,410-5 moldm-3 / < 7,00 serum

Junior et al., 2000

Potenciometrija

110-5 110-1 moldm-3

510-6 moldm-3 /

farm. preparati

Ardakani et al., 2007

610-6 110-1 moldm-3

210-6 moldm-3 /

farm. preparati

Xu et al., 2005

Polarografija do 620 gcm-3 / < 6,50 serum You, 1985

HPLC 0 400 gcm-3 0,2 4 mgcm-3

(ukupni salicilati) / 7,90 plazma Buskin et al., 1982

HPLC sa fluorescentnom

detekcijom 1 500 gdm-3 1 gdm-3 /

pijaa voda za ivotinje

Zuidema et al., 2006

39

1.1.4.1.1. Osnovi Fenton-ove reakcije

Fenton-ova hemija obuhvata reakcije peroksida (uglavnom H2O2) u prisustvu gvoa i dobijanje visoko reaktivnih vrsta kao to su hidroksi radikali koji oksiduju organska ili neorganska jedinjenja prisutna u sistemu. Istorija Fenton-ove hemije poinje 1894. godine kada Henry J. Fenton saoptava da H2O2 moe da se aktivira prisustvom soli Fe(II) i da pri tome oksiduje tartarnu kiselinu. Nakon toga, Fenton-ova i srodne reakcije postale su veoma znaajne u sintezi, biolokoj hemiji, hemiji prirodnih i tretmanu otpadnih voda. Mehanizam ove reakcije je veoma sloen, i jo nedovoljno ispitan, a najee se prikazuje sledeim reakcijama (Pignatello et al., 2006):

HO HO Fe OH Fe 322

2 (6)

OH HO OH HO 2222

(7)

OH Fe Fe HO 3 2 (8) Nagraeni Fe3+ joni mogu dalje reagovati sa H2O2 u tzv. Fenton-like reakcijama u kojima se regenerie Fe2+, podravajui na taj nain Fenton-ov proces:

H HO Fe OHFe 2

222

3 (9)

Reakcija (9) je za nekoliko redova veliine sporija od reakcije (6). Meutim, postoje drugi naini za redukciju Fe3+ do Fe2+:

HO Fe HOFe 2

22

3 (10) 2

2 -2

3 O Fe O Fe (11) R Fe R Fe 23 (12)

Hidroksi radikali, prisutni u veoma malim koncentracijama, reaguju na dobro poznat nain sa organskim jedinjenjima, oduzimanjem vodonika iz CH, NH ili OH veza, dodavanjem vodonika na C=C veze, ili adicijom na aromatine prstenove:

R OH H -R HO 2 (13)

C-C-HO CCHO (14)

Kada je prisutan veliki viak H2O2, ukupno Fe2+ dodato na poetku reakcije bie brzo oksidovano do Fe3+ i nakon toga sistem e se ponaati nezavisno od poetnog oksidacionog stanja gvoa.

40

1.1.5. Ampicilin

Ampicilin (Amp) je semisintetski penicilinski antibiotik irokog spektra delovanja na

grampozitivne mikroorganizme, osetljive i na druge peniciline, dok je aktivniji od drugih penicilina na neke gramnegativne bakterije i enterokokne infekcije. Ampicilin je u komercijalnoj upotrebi od 1961. godine u obliku farmaceutskih preparata kao to su kapsule, tablete, praak za oralnu suspenziju, praak za injekcije i intravenozne infuzije. Amino grupa u strukturi ovog leka (slika 7) omoguava njegovo prodiranje u spoljanju membranu gramnegativne bakterije to ga razlikuje od ostalih penicilina.

Slika 7. Hemijska struktura ampicilin trihidrata:

(2S, 5R, 6R)- [(R)-2-amino-2-fenilacetamido]-3,3-dimetil- 7-okso-4-tia-1azabiciklo[3.2.0] heptan-2-karboksilna kiselina.

Ampicilin trihidrat je beli kristalni prah rastvoran u vodi, a praktino nerastvoran u etanolu,

acetonu, ugljen tetrahloridu, hloroformu i etru. Rastvara se u razblaenim rastvorima kiselina i alkalnih hidroksida. Moe da izazove alergijske reakcije u vidu svraba do visokog intenziteta u vidu anafilaktikog oka.

Terapeutska koncentracija ampicilina u plazmi dostie vrednost od 2,65 do 4 gcm-3 nakon 2 h od oralne primene 500 mg leka. Priblino 20 % se vezuje za proteine plazme, a ~ 30 % se ekskretuje u urin u nepromenjenom obliku tokom prvih 6 sati, dok se nakon parenteralne administracije ekskretuje ak 75 % u nepromenjenom obliku (Moffat, 1986, str. 351). Prisustvo bazne amino i kisele karboksilne grupe omoguava ampicilinu da u neutralnoj sredini postoji u obliku zwitter-jona HX (slika 8 i 9). Upravo ova amfoterna priroda mu ograniava oralnu apsorpciju. U baznoj sredini je u obliku anjona X, a u kiseloj sredini je u obliku katjona H2X+. Ima dve konstante disocijacije. Konstanta K1 odgovara disocijaciji katjona koji gubi proton iz COOH grupe pri emu nastaje zwitter-jon, a K2 odgovara disocijaciji zwitter-jona koji gubi proton iz amino grupe i nastaje anjon X.

41

Slika 8. Ampicilin: jonizacija zwitter-jona.

Slika 9. Raspodela joniazovanih oblika ampicilina u zavisnosti od pH vrednosti rastvora.

1.1.5.1. Metode za odreivanje ampicilina

Amp je odreivan razliitim metodama kao to su kolorimetrija, spektrofotometrija, spektrofluorimetrija, FIA, HPLC, polarografija, NMR i druge. Pregled nekih od ovih metoda dat je u tabeli 4.

Britanska i Jugoslovenska farmakopeja propisuju tenu hromatografiju za odreivanje ampicilina (British Pharmacopoeia, 2005, str. 85; Jugoslovenska farmakopeja 2000, 2001, str. 42).

42

Tabela 4. Metode za odreivanje ampicilina.

Metoda Opseg linearnosti Granica detekcije (LOD)

RSD (%) Uzorak Literatura

Spektrofotometrija

8 140 gcm-3 / 0,70 farm. preparati Devani et al., 1992

5 50 gcm-3 / / farm. preparati Smith et al.,

1967

0,8 4 gcm-3 / / farm. preparati Sastry et al.,

1998

20 100 gcm-3 / 0,44 farm. preparati Mahgoub i Ali, 1998

0,5 21 gcm-3 / 1,30 farm. preparati Amin et al.,

1994

Kolorimetrija 6 30 gcm-3 / < 2,00 farm. preparati El-Shafie et

al., 1996 Kinetika

spektrofotometrija 8 40 gcm-3 0,73 gcm-3 / farm. preparati

Belal et al., 2000

Tena hromatografija 0,5 8 gcm

-3 0,01 gcm-3 < 3,20 plazma Nelis et al., 1992

HPLC

10 100 gcm-3 5 gcm-3 < 4,68 urin El-Sebai et al., 1988 0,2 4 gcm-3 5 25 gcm-3 / < 3,57 plazma

Akhtar et al., 1993

0,19 9,41 gcm-3 / / serum Ishida et al, 1999

5 600 gcm-3 1,8 gcm-3 < 0,70 farm. preparati Tsou et al.,

2007

1 50 ngg-1 0,6 ngg-1 < 5,00 tkiva Luo et al., 1997

Spektrofluorimetrija

0,01 15 gcm-3 0,003 gcm-3 < 1,10 mleko Gala et al., 1997

2 10 moldm-3 410-7 moldm-3

5,210-7 moldm-3 (FIA)

4,60 farm. preparati

Fernndez-Gonzlez et

al., 2003

FIA

210-5 610-4 moldm-3 810

-6 moldm-3 0,16 farm. preparati Garcia et al., 1994

70 450 mgdm-3 50 mgdm-3 4,20 farm. preparati Al-Momani,

2004 0,2610-6 210-4

moldm-3 2,110-6 210-6 moldm-3 (FIA)

0,2610-6 moldm-3 2,110-6

moldm-3 FIA

0,60 0,80

farm. preparati

Fernandez-Gonzalez et

al., 2002

Polarografija 0,04 3,5 mgcm-3 / < 0,86 farm. preparati

El Sayed et al., 1994

8 200 gcm-3 / / farm. preparati Belal et al.,

1998

NMR 30 50 mg/0,5 cm3 / 1,74 farm. preparati Shin et al.,

1981

43

1.1.6. Histidin

Histidin (His) je prvi put izolovan od strane nemakog fiziara Albrehta Kossela 1896.

Prvobitno se smatralo da je His esencijalna amino kiselina samo za decu, meutim dugorona prouavanja su pokazala da je esencijalna i za odrasle (Kopple i Swendseid, 1975). To je supstanca u obliku belog kristalnog praha ili bezbojnih kristala rastvorna u vodi, vrlo slabo rastvorna u alkoholu, praktino nerastvorna u etru (Jugoslovenska farmakopeja 2000, 2001, str. 432).

Histidin sadri imidazolovu grupu (slika 11) koja je najznaajnija u puferskoj ulozi proteina

za odravanje pH sredine u fiziolokim granicama. Pri pH = 7 histidin je u katjonskom obliku < 10 % (Grant et al., 1997, str. 304). Imidazolov boni lanac ima pKa vrednost priblino 6, dok pKa cele aminokiseline iznosi oko 6,5. Ovo znai da pri fiziolokom pH mala pomeranja pH vrednosti rastvora mogu da dovedu do promene ukupnog naelektrisanja kiseline. Ispod pH = 6 imidazolov prsten e biti uglavnom protonovan, to znai da e imati dve NH veze i imae pozitivno naelektrisanje koje e biti podjednako rasporeeno izmeu dva azotova atoma (slika 12). Imidazolov prsten histidina zadrava aromatina svojstva na svim pH vrednostima. esto je ligand u metaloproteinima i deo je katalitikih mesta nekih enzima (npr. ureaza).

Slika 11. Hemijska struktura histidina: (S)-2-amino-3(imidazol-4-il)propionska kiselina.

Znaaj histidina u organizmu je u: izgradnji belanevina, formiranju dipeptida karnozina i

anserina u miiima i nastanku histamina. Glavni put u razgradnji histidina je preko urokaninske kiseline do konanih metabolita: glutaminske kiseline, formijata i amonijaka. U inicijalnoj fazi razgradnje vri se dezaminacija histidina u urokaninsku kiselinu pod dejstvom enzima histidaze. Dekarboksilacijom histidina dejstvom histidin dekarboksilaze nastaje bioloki vano jedinjenje histamin. Histamin se ubraja u tkivne hormone. Iz elija se oslobaa pri alergijskim i upalnim procesima. Deluje vazodilatatorno, a istovremeno poveava permeabilitet krvnih sudova zbog ega dolazi do pojave edema i pada krvnog pritiska. Razgradnja histamina vri se oksidativnom dezaminacijom pod dejstvom histaminaze (diaminooksidaze) pri emu nastaje imidazolacetaldehid, koji pod dejstvom aldehid oksidaze prelazi u imidazol siretnu kiselinu koja se izluuje urinom.

44

Slika 12. Protonizacija i deprotonizacija imidazolove grupe histidina (pH = 67).

Posledica deficita enzima histidaze je poremeaj u katabolizmu histidina u urokaninsku

kiselinu. Bolest se naziva histidinemija, a simptomi su mentalna retardacija, epilepsija i potekoe u govoru. Zbog poremeaja u razgradnji histidina u glavnom metabolikom putu, on se gomila u krvi i pojaano izluuje urinom. Ovaj poremeaj favorizuje sporedni put razgradnje procesom transaminacije, zbog ega se u urinu nalaze poveane koncentracije imidazol-pirogroane, imidazol-mlene i imidazol-siretne kiseline (Nikoli, 2000, str 497).

1.1.6.1. Metode za odreivanje histidina

His je odreivan razliitim metodama kao to su kolorimetrija, spektrofotometrija, kinetika spektrofotometrija, spektrofluorimetrija, hemiluminiscencija, HPLC, voltametrija, kapilarna elektroforeza i druge. Pregled nekih od ovih metoda dat je u tabeli 6.

Farmakopeje daju potenciometrijsku metodu za odreivanje His titracijom

hlorovodoninom kiselinom (Jugoslovenska farmakopeja 2000, 2001, str. 433; British Pharmacopoeia, 2005, str. 713).

45

Tabela 6. Metode za odreivanje histidina.

Metoda Opseg linearnostiGranica detekcije (LOD)

RSD (%) Uzorak Literatura

Kolorimetrija 1 60 gcm-3 / 3,00 / Newman i Turnbull, 1960 Kapilarna

elektroforeza 110-6 110-3

moldm-3 10-6

moldm-3 / koa Hermann i

Abeck, 2000

Spektrofluorimetrija 5 7,5 gcm-3 / / serum Gerber, 1970

100 500 gcm-3 / / serum Ambrose et al., 1969

Spektrofotometrija 2,2 5,13 gcm-3 / < 1,00 farm. preparati Patel et al.,

2009 Kinetika

spektrofotometrija 0,15 1,56

gcm-3 0,03

gcm-3 / farm.

preparati Miti et al.,

2004

Hemiluminiscencija

110-6 110-3 moldm-3

0,56 moldm-3 1,60

farm. preparati Zhu et al., 2002

0,05 5 mmoldm-3

0,01 mmoldm-3 0,93 riba

Kiba et al., 2006

Mikrobioloka metoda 2 20 gcm

-3 / / proteini, hrana Horn et al.,

1948 HPLC sa

fluorescentnom derivatizacijom

0,002 100 nmolcm-3

0,0015 nmolcm-3 0,58

serum, urin, koa

Tateda et al., 2001

HPLC 50 150 gcm-3 2,2 gcm-3 < 2,00 farm. preparati

Shieh et al., 2007

3,7 1000 moldm-3

1,1 moldm-3 < 3,23 tkiva Wadud, 2002

Voltametrija

610-4 210-3 moldm-3 / /

model sistem Jaselskis, 1958

510-8 110-6 moldm-3 / 5,20 /

Moreira i Fogg, 1991

46

1.2. Kinetike metode analize

1.2.1. Kinetika hemijskih reakcija

Hemijska kinetika (gr. = pokretan) (Vujaklija, 1961, str. 428) je nauka o brzini hemijskih reakcija. Hemijska reakcija je proces u kome iz jednih hemijskih vrsta (reaktanata) nastaju druge hemijske vrste (produkti). Svi hemijski procesi, bez obzira na prirodu, odvijaju se konanim brzinama, teei ravnotenom stanju, ukljuujui pri tome dve oblasti: kinetiku (dinamiku), u kojoj se sistem pribliava ravnotei, i ravnotenu (statiku), kada svi procesi u sistemu dostignu ravnoteu (slika 13).

Slika 13. Kinetika i ravnotena oblast hemijske reakcije. Promena analitikog signala sa vremenom za reaktante (1) i produkte (2).

Sve rekacije nisu pogodne za ravnotena merenja, jer se u mnogima javljaju sporedni

procesi, ili se ravnotea dostie veoma sporo, ili prinos proizvoda reakcije nije kvantitativan. U ovakvim sluajevima se primenjuju kinetike metode, koje se zasnivaju na merenju brzine hemijskih reakcija dovoljno stabilnih reakcionih sistema. Brzina reakcije se definie kao broj molova supstance, koja se troi ili nastaje po jedinici zapremine i u jedinici vremena. Za reakciju opteg tipa:

A + B P (15) brzina reakcije u vremenu t jednaka je promeni koncentracije bilo kog uesnika reakcije sa vremenom:

1

2

Signal

vreme

ravnotena oblast

kinetika oblast

47

ttt dBd

dAd

dPd (16)

Takoe, brzina reakcije moe da se predstavi kao veliina proporcionalna koncentracijama reaktanata:

B Ak (17)

gde je k konstanta brzine i predstavlja reakcinu brzinu po jedinici koncentracije reaktanata.

Ako je jedan od reaktanta iz jednaine (17) u znatnom viku, npr. B, promena njegove

koncentracije u toku reakcije je zanemarljiva. Zato se koncentracija tog reaktanta moe objediniti sa konstantom brzine k u novu konstantu k. Tada je reakcija pseudo nultog reda u odnosu na reaktant B i pseudo prvog reda u odnosu na reaktant A:

A 'B AdAd kkt const

(18)

Koncentracija supstance A u ovom izrazu moe biti zamenjena bilo kojom merljivom veliinom (optika rotacija, apsorbanca, dielektrina konstanta, provodljivost, pritisak, indeks prelamanja itd.), koja je direktno proporcionalna koncentraciji, to omoguava primenu razliitih analitikih tehnika u cilju praenja i odreivanja brzine reakcije.

Suma eksponenata u izrazu (17) definie red reakcije.Ovi eksponenti esto nisu jednaki stehiometrijskim koeficijentima. Zbog toga se u optem sluaju iz jednaine (17) ne moe zakljuiti o redu reakcije u odnosu na dati reaktant. Red reakcije je empirijski parametar i, kako ukupni, tako i pojedinani, ne mora biti uvek ceo broj. U takvim sluajevima mehanizam reakcije je sloeniji. Dobija se jedino eksperimentalnim odreivanjem za datu hemijsku reakciju pri odabranim uslovima.

Da bi se postavila kinetika jednaina odabranog reakcionog sistema potrebno je odrediti parcijalne redove posmatrane reakcije u odnosu na razliite promenljive koje utiu na proces. Parcijalni redovi reakcije mogu se dobiti na dva naina zavisno od toga da li se koristi diferencijalni ili integralni oblik kinetike jednaine. Diferencijalna metoda je zasnovana na merenju inicijalne brzine reakcije (tg ) i uglavnom se koristi za odreivanje parcijalnih redova. Parcijalni red reakcije n povezan je sa koncentracijom preko jednaine za inicijalnu brzinu reakcije:

AdAd tg A

nkt

(19)

48

gde je: A vrsta za koju se odreuje parcijalni red, kA konstanta brzine pseudo ntog reda.

Logaritmovanjem ovog izraza dobija se jednaina prave: A log log ) (tg log A nk (20)

iji je nagib n, a odseak log kA. U praksi, odreivanje parcijalnog reda po svakom reaktantu koji utie na sistem vri se tako to se koncentracija tog reaktanta menja, dok se koncentracije ostalih odravaju konstantnim ili u velikom viku. Kada je na taj nain odreen uticaj svake promenljive i njene koncentracije na reakciju, moe se postaviti kinetika jednaina. Jednaine brzine reakcije mogu sadrati i koncentraciju katalizatora i H3O+ jona.

1.2.2. Faktori koji utiu na brzinu hemijske reakcije

Generalno, postoje dva tipa reakcija koje se vezuju za kinetike metode: spore reakcije (ije je polu-vreme 10 s ili due) i brze reakcije (koje dostiu taku polureakcije za manje od 10 s). Odreivanje kinetike sporih reakcija zahteva neko vreme i smatra se nepraktinim za reakcije sa polu-vremenom duim od 2 h. Ukoliko je reakciji potrebno vie od 2 h ili manje od 10 s da se razvije, njena brzina moe biti podeena tako da polu-vreme bude u nekom prihvatljivom praktinom opsegu sporih reakcija biranjem pogodnije temperature reakcionog sistema, promenom koncentracija reaktanata, korienjem drugog rastvaraa, podeavanjem pogodne vrednosti jonske sile reakcione sredine itd.

1.2.2.1. Uticaj temperature

U optem sluaju brzina hemijske reakcije poveava se sa poveanjem temperature, jer konstanta brzine reakcije zavisi od temperature. Jo je Vant Hoff ustanovio 1884. godine da se pri poveanju temperature za 10 C brzina reakcije poveava dva do tri puta. Kvantitativno ovu zavisnost moemo izraziti Arrhenius-ovom jednainom:

2,303RTEaAlog log k (21)

ili u eksponencijalnom obliku:

49

RTEa

A

ek (22) gde je: k konstanta brzine hemijske reakcije,

A faktor uestanosti sudara (Arrhenius-ova integralna konstanta), T apsolutna temperatura, Ea energija aktivacije i R univerzalna gasna konstanta (8,31441 JK-1mol-1).

Jednaina (21) koristi se za odreivanje energije aktivacije i faktora uestanosti (A), ako je konstanta brzine izmerena na razliitim temperaturama. Grafiki se to postie prikazivanjem zavisnosti:

log k = f (1/T) (23) gde je nagib prave jednak:

2,303R

Ea tg (24)

a energija aktivacije:

Rtg 2,3030 Ea (25) U kinetikokatalitikim istraivanjima esto se odreuje Ea (u nekim sluajevima i entropija aktivacije), jer njena vrednost doprinosi odreivanju mehanizma reakcije (Mller et al., 1983, str. 26).

1.2.2.2. Uticaj koncentracije reaktanata

Uticaj koncentracije reaktanata na brzinu hemijske reakcije dat je osnovnim zakonom hemijske kinetike, zakonom o dejstvu masa (C. M. Guldberg i P. Vage), prema kome se reakcije sa malim konstantama brzina mogu ubrzati korienjem reaktanata velikih koncentracija.

1.2.2.3. Uticaj rastvaraa

Uticaj rastvaraa na brzinu reakcije izmeu reaktanata A i B, koja se odvija preko nastajanja aktiviranog kompleksa AB*, moe se prikazati Kirkwood-ovom jednainom (Laidler, 1965, str. 227):

50

N)11(

T83M)11(

T2ln ln

2

0

kk

ekk (26)

gde je:

B

2B

A

2A

AB

BA ZZ)ZZ( Mrrr

3AB

2AB

3B

2B

3A

2A N

rrr

k0 konstanta brzine reakcije u rastvoru rastvaraa beskonane relativne permitivnosti, relativna permitivnost rastvaraa,

2A ,

2B i

2AB dipolni momenat reaktanata A, B i njihovog aktiviranog kompleksa,

ZA i ZB naelektrisanje vrsta A i B,

Ar , Br , i ABr jonski radijusi reaktanata A, B i njihovog aktiviranog kompleksa i

e naelektrisanje protona (1,60210-19 C). Limitirajui faktor hemijske reakcije sa ueem rastvaraa jeste entalpija solvatacije

reaktanata i aktiviranog kompleksa. Veina katalitikih reakcija, koje se primenjuju u kinetikim metodama, odigravaju se u vodenoj sredini. Meutim, ukoliko je jedan od reaktanata nerastvoran u vodi, ili kada je potrebno odvojiti katalizator od matriksa ekstrakcijom, potrebni su vodeno-organski sistemi. Tada obavezno treba razmatrati promenu brzine reakcije od sastava rastvaraa. Prema uticaju, rastvarai se dele u sledee grupe (Hauptmann et al., 1977):

- nepolarne aprotine, - polarne aprotine i - protogenine (sadre OH ili NH grupe).

Kod jonskih reakcija, poveanje dielektrine konstante rastvaraa poveava brzinu reakcije

jona istog naelektrisanja i smanjuje brzinu reakcije jona razliitog naelektrisanja. Brzina reakcije izmeu neutralnih molekula, koji grade izrazito polaran aktiviran kompeks, poveava se sa poveanjem polarnosti rastvaraa. Kod reakcija jon-molekul gde nastaje slabo polaran aktiviran kompleks, brzina se neznatno menja.

1.2.2.4. Uticaj katalizatora

Katalizator je supstanca koja menja brzinu hemijske reakcije bez uticaja na poloaj ravnotee. Uestvuje u reakciji menjajui njen mehanizam, kontinualno se regenerie u nekom od stupnjeva i na kraju reakcije izlazi hemijski nepromenjen. Male koliine su esto dovoljne da

51

prouzrokuju odigravanje reakcije u znatnoj meri, tako to smanjuju energiju aktivacije. Reakcije koje se odigravaju u prisustvu katalizatora zovu se katalitike. Ukoliko se reakcija odvija u jednoj fazi radi se o homogenoj katalizi, a ako se reakcija odigrava na granici faza onda govorimo o heterogenoj katalizi. Homogeno katalitike reakcije se najee primenjuju kod katalitikih metoda analize.

Reakcije koje se primenjuju za odreivanje koncentracije katalizatora nazivaju se

indikatorske reakcije, a supstanca ija promena koncentracije slui kao mera za brzinu proticanja reakcije naziva se indikatorska supstanca (Jacimirskii, 1967).

1.2.2.4.1. Biokatalizatori (enzimi) Enzimi (gr. = u kvascu) ili fermenti (lat. fermentatio = vrenje) (Koraevi, 2000,

str. 3) su prvi katalizatori biolokog porekla. Njihova funkcija se sastoji u ubrzavanju hemijskih procesa pretvaranja organske materije (supstrata) u proizvod hemijskih reakcija. Biokatalizatori su proteinske prirode, a nemaju ni energetsku, niti gradivnu ulogu. Njihova aktivnost je neophodna za odvijanje procesa bitnih za ivot elija i funkcionisanje organizma kao celine. Kao i neorganski, i ovi katalizatori su aktivni u minimalnim koliinama, ne nalaze se u konanim produktima i ne menjaju konstantu ravnotee reakcija koje katalizuju. Enzimi imaju i odreena svojstva po kojima se razlikuju od neorganskih katalizatora:

- mnogo su efikasniji, - pokazuju manje ili vie izraenu specifinost prema supstratu i prema vrsti hemijske

reakcije koju katalizuju, - podleu procesima denaturacije pod uticajem visoke temperature, soli tekih metala,

jakih baza i kiselina, - podleu procesima razgradnje i resinteze njihovih molekula jer im je vreme trajanja u

elijama ogranieno, - njihova aktivnost podlee kontrolnim mehanizmima, tj. regulaciji pod uticajem razliitih

faktora: alosterijskih efektora, koncentracije supstrata, kofaktora, aktivatora, inhibitora, kovalentne modifikacije itd.,

- ispoljavaju katalitiku aktivnost pri relativno niskim temperaturama, pri skoro neutralnim pH vrednostima i uz nizak atmosferski pritisak,

- omoguavaju ekonomian tok sloenih metabolikih procesa, - veoma su bitni u odravanju homeostaze, tj. u ouvanju normalnih koncentracija

sastojaka vanih za bioloke funkcije elija, tkiva i organizma kao celine i - odlikuju se specifinom strukturom molekula i poseduju aktivni centar.

52

Prema hemijskoj grai molekula, enzimi su proteini, to znai da se sastoje iz jednog ili vie peptidnih lanaca. U zavisnosti od toga da li u svojim molekulima, pored aminokiselina, sadre i neku neproteinsku materiju, izvrena je njihova podela na dve osnovne grupe:

- proetein-enzime u iju strukturu ulaze samo aminokiseline i - proteid-enzime, koji pored aminokiselina imaju i nebelanevinsku komponentu

(koenzim).

Kod proteid-enzima proteinska komponenta (apoenzim) i neproteinski deo (koenzim) zajedno grade kompletan ferment (holoenzim). Apofermenti su nosioci specifinosti enzima prema supstratu. Kofermenti, po hemijskoj prirodi obino organske materije sloene strukture (npr. B-vitamini ili njihovi derivati), odreuju tip hemijske reakcije koju enzim katalizuje. Predstavljaju delove aktivnih centara sloenih fermenata, direktno uestvuju u stvaranju kompleksa sa supstratom i termostabilniji su od apoenzima. Vea grupa enzima moe da ima isti koenzim (na primer, mnoge dehidrogenaze sadre NAD i zbog toga katalizuju procese oksidacijedehidrogenacije), ali koji e supstrat biti oksidovan zavisi od apoenzima. Koenzimi su, prema hemijskoj grai, svrstani u dve grupe:

- koenzimi vitaminske i - koenzimi nevitaminske strukture.

Koenzimi vitaminske prirode su na primer koenzimi piridin-dehidrogenaza (NAD i NADP), koji u svom sastavu sadre amid nikotinske kiseline ili vitamin PP. Vezujui H-atome preuzete od supstrata direktno uestvuju u katalitikom procesu jer su veoma slabo vezani za proteinsku komponentu enzima. Pri tome je jedan atom vodonika vezan za koenzim, a drugi se nalazi u rastvoru u obliku jona vodonika. Otuda se redukovani oblici oznaavaju kao NADH + H+, tj. NADPH + H+. Predavanjem vodonika drugim akceptorima, oni se reoksidiu i tada imaju pozitivan naboj (NAD+ i NADP+). Glutamat dehidrogenaza je jedan od najvanijih dehidrogenaza koja sadri NAD kao koenzim.

Neki od enzima, bez obzira na grupu, sadre odreeni metal kao strukturni sastojak

molekula (slika 2), i oznaavaju se kao metaloenzimi (npr. katalaza sadri gvoe, karboanhidraza sadri cink, ureaza sadri nikal itd.). Za razliku od onih jona metala koji igraju ulogu enzimskih aktivatora ili inhibitora, ovde je metal vrsto vezan sa apoenzimom. Ovi enzimi obino sadre po jedan ili dva atoma metala na svaku subjedinicu molekula. Funkcija jona metala moe biti razliita zavisno od prirode metala i prirode apoenzima. Tako metal moe imati jednu ili vie sledeih uloga:

- uestvuje u izgradnji aktivnog centra fermenta, - pomae odravanje tercijarne strukture enzimskog molekula koja je adekvatna za

53

interakciju sa supstratom, - aktivira enzim-supstrat kompleks ime direktno uzima uee u katalitikoj promeni

supstrata, - uestvuje u prenoenju elektrona u toku enzimske reakcije, - vri povezivanje enzima sa supstratom i - omoguava spajanje koenzima sa apoenzimom i tako stabilie strukturu proteid-enzima.

Ukoliko prisustvo metala odreuje katalitiku aktivnost enzima, ferment gubi katalitika svojstva uklanjanjem metala iz njegovog molekula. Ali, kada joni metala imaju ulogu aktivatora, njihovo odvajanje od enzima izaziva pad aktivnosti, a ne i gubitak katalitike sposobnosti fermenta.

Aktivni centar i specifinost enzima Aktivni centar je deo molekula enzima koji neposredno uestvuje u vezivanju supstrata pri njegovoj katalitikoj transformaciji. Struktura i prostorna organizacija aktivnog centra predstavlja osnovu znaajne karakteristike enzima, specifinost. Ovaj centar je sastavljen iz malog broja funkcionalnih grupa i predstavlja samo minimalni deo peptidnog lanca. Ukoliko je enzim iz grupe proteid-fermenta, u sastav aktivnog centra ulazi i koenzim (i jon metala kod metaloenzima). Najee u sastav aktivnih centara ulaze neke od sledeih funkcionalnih grupa aminokiselina: imidazolov prsten histidina, epsilon amino grupa lizina, karbokslina grupa glutaminske kiseline, gvanidino grupa arginina, indolovo jezgro triptofana, karbokslina grupa asparaginske kiseline, sulfhidrilna grupa cisteina, hidroksilna grupa serina i treonina. Ove grupe imaju sposobnost da formiraju vodonine mostove, to je vano za odravanje tercijarne strukture enzima. Takoe, one mogu da grade komplekse sa jonima razliitih metala. Karakteristina sposobnost aktivnog centra uslovljena je ne samo hemijskom prirodom aminokiselinskih ostataka koji ga izgrauju, ve i prirodom okolnih aminokiselina. Poznato je da izvesni enzimi mogu da imaju iste aktivne centre, a da ispoljavaju razliito delovanje. Pri razaranju aktivnog centra ili njegovim blokiranjem hemijskim agensima, ferment gubi svoju katalitiku mo. Specifinost delovanja enzima je vaan bioloki fenomen jer obezbeuje celishodnost procesa u ivoj eliji. Ukoliko ona ne bi bila izraena, svaki ferment bi delovao na svaku organsku materiju, hemijske reakcije bi se odvijale haotino, to bi vodilo u nekontrolisanu razgradnju organskih supstanci, a time i do prestanka ivota. Faktori koji utiu na aktivnost enzima

Aktivnost enzima je adekvatna brzini katalizovane reakcije, a oznaava koliinu supstrata koja se pod uticajem enzimskih molekula u jedinici vremena transformie u produkt reakcije. Najvaniji faktori koji utiu na aktivnost enzima su:

54

- koncentracija enzima, broj molekula enzima u jedinici zapremine, ili na jedinicu teine. Brzina reakcije je pri optimalnim uslovima (temperatura, pH, viak supstrata, prisustvo aktivatora i koenzima) direktno proporcionalna koncentraciji enzima:

= k [E] (27)

gde je brzina katalizovane reakcije, tj. aktivnost enzima, [E] je koncentracija enzima i k je konstanta brzine reakcije. Grafiki prikaz odnosa koncentracije enzima i brzine rekcije je prava linija, a svako odstupanje od pravolinijskog oblika ukazuje na prisustvo inhibitora ili na istovremeno odigravanje neke sporedne reakcije supstrata. Ova zakonitost je od velikog praktinog znaaja u dijagnostici i nauno-istraivakom radu, jer omoguava odreivanje enzimske aktivnosti umesto koncentracije enzima; - koncentracija jona vodonika je vrlo manifestna kod svih fermenata. Enzimi su maksimalno aktivni u uskom intervalu pH vrednosti. Smatra se da je uticaj pH najbitniji na enzimske molekule, mada je koncentracija jona vodonika vana i za stepen jonizacije supstrata ukoliko njegovi molekuli podleu disocijaciji. Uticaj pH na proteinsku prirodu enzima kao polielektrolita povezuje se sa njegovim raznovrsnim jonskim oblicima koji nastaju od velikog broja grupa koje mogu da disosuju razliito zavisno od pH vrednosti sredine. Optimalna vrednost ove konstante je ona pri kojoj molekuli enzima imaju onu jonsku formu koja je najadekvatnija za kontakt supstrata sa njegovim aktivnim centrom. Zavisno od pH moe da se promeni jonizacija hemijskih grupa koje izgrauju aktivni centar, kao i grupa koje uestvuju u vezivanju jona metala, ili omoguuju spajanje apoenzima sa koenzimom; - koncentracija supstrata na enzimsku aktivnost je specifina, jer bioloki katalizatori pokazuju fenomen zasienja supstratom. Kod svih enzima je karakteristino zasienje supstratom, samo je za razliite fermente potrebna razliita kocentracija supstrata da se zasienje postigne. Zavisnost brzine reakcije, , od koncentracije supstrata, [S], ilustruje grafik na slici 14.

Slika 14. Uticaj koncentracije supstrata na enzimsku aktivnost (Koraevi, 2000, str. 21).

55

Sa grafika se vidi da se pri niskim koncentracijama supstrata brzina reakcije poveava srazmerno porastu koncentracije supstrata, segment (A) je linearan. Pri daljem poveanju koncentracije supstrata brzina reakcije raste sporije i nije proporcionalna koncentraciji supstrata, segment (B). Pri daljem poveanju koncentracije supstrata brzina reakcije dostie najveu vrednost i na tom nivou se dalje odrava, segment (C). Dostignuta brzina na ovom segmentu se naziva maksimalna ili granina brzina (Vmax). U ovim uslovima brzinu katalizovane reakcije ograniava koncentracija enzima, a ne koncentracija supstrata. Ona koncentracija supstrata, pri kojoj se dostigne polovina maksimalne brzine, oznaava se kao Km vrednost, ili Michaelis-Menten-ova konstanta, koja se izraava brojem mola (ili mmola) na litar. Ovaj parametar je uvek stalna vrednost za odreeni enzim i odreeni supstrat, a njegove vrednosti takoe zavise od temperature, pH i prisustva efektora (aktivatora ili inhibitora). Reciprona vrednost Km konstante u praksi se definie kao afinitet enzima prema supstratu. Ukoliko enzim ima manju Km konstantu za odreeni supstrat, utoliko e se efikasnije vriti pretvaranje supstrata u produkt reakcije (vei je njegov afinitet za dati supstrat), i obrnuto. Specifian uticaj koncentracije supstrata na brzinu enzimske reakcije ispoljava se zbog toga to se u toku katalize gradi intermedijarno jedinjenje (kompleks enzim-supstrat, [ES]), koje se potom razlae na produkt reakcije i enzim. Kad je [S] vrlo veliko u poreenju sa Km, sav enzim je zasien supstratom i praktino je u obliku [ES] kompleksa, to omoguuje maksimalnu brzinu reakcije. Dalje poveanje [S] ne poveava brzinu reakcije jer nema slobodnih molekula enzima za vezivanje supstrata. U fiziolokim uslovima u elijama i tkivima [S] je najee bliska Km vrednosti za dati enzim i enzimi nisu zasieni supstratom. Zato su brzine biohemijskih reakcija in vivo pod uticajem [S], ali pri odreivanju aktivnosti enzima in vitro, neophodno je da je [S] viestruko vee od Km kako bi se postiglo da reakciona brzina zavisi samo od koncentracije enzima, a ne od koncentracije supstrata; - temperatura. Od 30 C do 40 C veina enzima ima svoj optimum, pri kome je enzimska aktivnost najvea, a enzimski molekuli najstabilniji. Karakteristino je da se pri poveanju temperature za svakih 10 C (izmeu 10 C i 40 C), aktivnost enzma poveava 1,52 puta. Na temperaturama veim od 50 C mnogi enzimi se denaturiu, a iznad 80 C inaktiviu se skoro svi enzimi (slika 15). Izuzetno mali broj enzima je stabilan pri kratkotrajnom zagrevanju pri visokim temperaturama (npr. ribonukleaza je postojana na 100 C tokom nekoliko minuta). Inaktivacija enzima visokim temperaturama je ireverzibilan proces, dok je inaktivacija enzima na niskim temperaturama ( 25 C i nie) reverzibilne prirode, to omoguava uvanje enzimskih uzoraka. Na optimalnoj temperaturi aktivnost enzima (brzina reakcije) se linearno poveava u odreenom vremenskom intervalu, jer se toplota pretvara u kinetiku energiju i poveava se broj sudara reagujuih estica u jedinici vremena, a time i brzina reakcije (slika 16);

56

Slika 15. ematski dijagram uticaja temperature na brzinu

enzimski i neenzimski katalizovane