Ketrampilan Dasar LaboratoriumKetrampilan Dasar Laboratorium

Program Program StudiStudi IlmuIlmu Biomedik 20Biomedik 201111

Kuliah 5: Oktober 10 Masalah regresi linear dari praktikum minggu

yang lalu

Sentrifugasi

Pemurnian makromolekul

DNA

protein

Teknik PCR

Praktikum 5: Isolasi DNA dan PCR

GrafikGrafik dandan RegresiRegresi LinearLinear

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

0 100 200 300 400 500 600

Sera

pan

Konsentrasi Urea (mg/dl)

Hasil Serapan Beberapa Sempel Urea yang diukur pada

Panjang Gelombang sama dengan 600nm

Group meja 1

Group meja 3

GrafikGrafik dandan RegresiRegresi LinearLinear

y = 0.0025x + 1.9355

R² = 0.0843

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

0 100 200 300 400 500 600

Sera

pan

Konsentrasi Urea (mg/dl)

Hasil Serapan Beberapa Sempel Urea yang diukur pada

Panjang Gelombang sama dengan 600nm

Group meja 1

Group meja 3

Linear (Group meja 1)

Bagian data yang berbanding lurus

GrafikGrafik dandan RegresiRegresi LinearLinear

y = 0.0825x - 0.0593

R² = 0.9902

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

0 100 200 300 400 500 600

Sera

pan

Konsentrasi Urea (mg/dl)

Hasil Serapan Beberapa Sempel Urea yang diukur pada

Panjang Gelombang sama dengan 600nm

Group meja 1

Group meja 3

meja 1 dibawa konsentrasi 60mg/dl

Linear (meja 1 dibawa konsentrasi 60mg/dl)

GrafikGrafik dandan RegresiRegresi LinearLinear

Caranya dalam Excel…..

1. Tabel data sudah terisa (X, Y1, Y2 dll)

2. Pilih data yang mau digambarkan

3. Gambarkan sebagai grafik “scatter”

4. Dari grafik yg muncul lihat bagian data yg

berbanding lurus

5. Klik “select data”

6. Isilah tabel yang muncul dgn subset data

7. Klik “layout” dan pilih “trendline/ more trendline

options”

8. Pilih rumus dan nilai r2 muncul pada grafiknya dan

“close”

SentrifugasiSentrifugasi partikel preparat yang berat dan

besar turun lebih cepat

= 2rm(1-)

f

Faktor2 yang mempengaruhi kecepatan partikel turun:

ukuran dan beratnya (m,)

densitas larutan ()

radias/jarak dari pusat rotasi (r)

angular velocity (kecepatan alat sentrifus) ()

frictional coefficient larutan (f)

= 2rm(1-)

f

LEBIH CEPAT KALAU...

yang diatas semakin besar atau yang dibawah semakin kecil

ukuran dan beratnya (m,) lebih besar

densitas larutan () lebih kecil

radias (r) lebih besar

kecepatan alat sentrifus () lebih besar

frictional coefficient larutan (f) lebih kecil

PemurnianPemurnian DNADNA

1. pengumpulan/panen sel-sel

2. pemecahan sel-sel

3. pencernaan protein agar asam nucleat dilepaskan

4. pengendapan DNA

PengumpulanPengumpulan//panenpanen selsel--selsel

DNA dapat diisolasi/dimurnikan dari sumber sel

apapun (yaitu sel-sel yang berisi inti sel!)

SEL-SEL PERLU DIPANEN “cell harvesting” dari: jaringan langsung (contoh daging buah,

sel-sel epitelial mulut, sel-sel kulit, dll), darah, sperma, dll

PemecahanPemecahan selsel--selsel Ikatan antara sel-sel jaringan serta membran

sel, membran inti sel harus dihancurkan biar

molekul DNA dapat dikeluarkannya

TEKNIK-TEKNIK: homogenisasi dgn detergen

membran

detergen

Konsekuensi: membran

dipecah

PencernaanPencernaan protein protein agar DNA agar DNA lepaslepas daridari kompleksnyakompleksnya

DNA

kromatin

nukleosom

kro

mo

som

DNA terbungkus dalam

protein histon serta

protein kromosom yang

non-histon

PengendapanPengendapan Protein Protein dandan DNADNA

Protein serta asam nukleik merupakan makromolekul yang bersifat polar - akibatnya kedua-duanya larut dalam larutan yang berdasarkan akuades.

KONSENTRASI GARAM YANG TINGGI: berperan untuk menetralisasi muatan positif dan negatif pada makromolekul dengan akibatnya sifat polar makromolekul tsb semakin lemah tidak melarut lagi dalam buffernya.

PengendapanPengendapan DNA DNA dalamdalam etanoletanol::

Etanol mempunyai dielektrik

konstan yang tidak sekuat

dielektrik konstan akuades.

Akibatnya bagian

makromolekul yang

bermuatan positif dan negatif dapat

berinteraksi satu dengan yang lain dan sifat

polar (hidrofilik) pada makromolekul tersebut

dikurangi tidak melarut lagi dalam buffernya

PengendapanPengendapan DNA DNA dengandengan etanoletanol

PENGARUH TEMPERATUR:

Menurut pendapat orang banyak, semakin dingin temperatur suatu larutan, semakin kurang jumlah pelarut yang dapat dilarutkan dalamnya.

? ? ? ? Dasarnya secara kimiawi kurang kuat, tapi kita akan

ikut yang berpengalaman itu dan menggunakan etanol yang dingin untuk pengendapan sempel DNA kita

PemurnianPemurnian Protein Protein

((praktikumpraktikum 6 6 -- mingguminggu depandepan)) Tujuan jelas...yaitu “Why?” sudah dijawab

(misalnya mau meneliti struktur protein tertentu supaya mengerti fungsinya atau dapat mendesain obat, dll; mau pakai dalam assay diagnostik; mau buat antibodi; dll)

Caranya yg dipakai berdasarkan sifat protein yang ingin diisolasi

Pakai assay yang sesuai dengan tujuan, dan yang memungkinkan/feasible untuk mengetahui preparat semakin murni

PemurnianPemurnian Protein…Protein…

Sifat protein yang boleh dipakai untuk memisahkan satu tipe protein dari yang lain

Solubility Binding interactions Surface-exposed hydrophobic residues Charged surface residues Isoelectric Point Size and shape

MolekulMolekul protein protein sangatsangat beragamberagam dibandingdibanding dengandengan asamasam nukleatnukleat (DNA (DNA atauatau RNA)RNA)

KenapaKenapa????

Basic scheme of protein purificationBasic scheme of protein purification

From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC

Guidelines for protein purificationGuidelines for protein purification

Define objectives

Define properties of target protein

Identify critical contaminants

Minimize the number of steps

Use a different technique at each step

Develop analytical assays

Adapted from: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC

How pure should my protein be?How pure should my protein be?

Application Required Purity

Therapeutic use, in vivo

studies Extremely high > 99%

Biochemical assays, X-ray

crystallography High 95-99%

N-terminal sequencing,

antigen for antibody

production, NMR

Moderately high < 95%

Adapted from: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC

Basic scheme of protein purificationBasic scheme of protein purification

Liquid

chromatography

(higher resolution,

higher cost)

Liquid

chromatography

(lower resolution,

lower cost) Reversible

precipitation

with salt or

organic

molecules

Cell growth,

protein over-

expression

Cell lysis

Removal of

cell debris

PPRAKTIKUMRAKTIKUM 6: 6: IISOLASISOLASI PPROTEINROTEIN DARIDARI DDARAHARAH

DARAH UTUH

Lisis Sel

(buffer hemolisis)

Protein membran

M

Protein sitoplasmik

S

sentrifugasi

Protein dlm supernatan

Gs

Protein dlm endapan

Gp

sentrifugasi

Protein dlm supernatan

Es

Protein dlm endapan

Ep

sentrifugasi

SEL-SEL DARAH PLASMA

sentrifugasi

“salting out” ethanol precipitation

PCR: PCR: polymerase chain reactionpolymerase chain reaction

http://sciencebiotech.net/mengenal-pcr-polymerase-

chain-reaction/

3 langkah per siklus

Denaturasi

Annealing

(penempelan)

Ekstensi (penambahan)

PCRPCR

PraktikumPraktikum 5: 5: PraktikumPraktikum

IIsolasisolasi DNADNA dandan PCRPCR

Isolasi DNA dari buah dan sel2 epitelial (protokol untuk isolasi DNA dari darah termasuk dalam bahan penuntun, tapi tidak akan dilaksanakan)

** tolonglah bawa buah** (~50 g per macam buah yang ingin diperiksa)

2-3 kelompok mulai dengan isolasi dari buah dan kelompok lain mulai dgn isolasi dari sel-sel epitelial mulut

ReferencesReferences::

Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. & Walter, P. 2008. Molecular Biology of the Cell (5th ed), Garland Science, Taylor & Francis Group, New York.

Holme, D. J. & Peck, H. 1998. Analytical

Biochemistry (3rd ed), Addison Wesley Longman Inc., New York.

http://sciencebiotech.net/mengenal-pcr-

polymerase-chain-reaction/ Protein Purification Handbook. Amersham

Biosciences. 18-1132-29, Edition AC