Institutionen för naturvetenskap Examensarbete  

Josefine Lideberg Huvudområde: Optometri Nivå: Grundnivå Nr: 2012:O21

Keratitbehandling, antibiotika versus corneal collagen crosslinking (CXL) genom riboflavin och UVA

i

Keratitbehandling, antibiotika versus corneal collagen crosslinking (CXL) genom riboflavin och UVA Josefine Lideberg Examensarbete i Optometri, 15 hp Filosofie Kandidatexamen Handledare: Camilla Mohlin Institutionen för naturvetenskap Doktorand, FM Linnéuniversitetet 391 82 Kalmar Kjell Johansson Institutionen för hälsovetenskap och medicin Professor, PhD Örebro universitet 701 82 Örebro Examinator: Peter Gierow Institutionen för naturvetenskap Professor, FAAO Linnéuniversitetet 391 82 Kalmar Examensarbetet ingår i optikerprogrammet, 180 hp (grundnivå)

Abstrakt

Syfte: Syftet med denna studie var att jämföra antibiotikabehandling med corneal collagen crosslinking (CXL)-behandling genom fotoaktivering av riboflavin vid bakteriell keratit. Att experimentellt undersöka om en viss stam av Pseudomonas aeruginosa kunde infektera cornealt epitel var också en del av studien.

Metod: Litteraturstudie samt ett experiment med Pseudomonas aeruginosa och grisögon in vitro.

Resultat: Dagens behandling av keratit är initial med antibiotika. I experimentella studier har CXL använts både i kombination med antibiotika och som enskild behandling. Positiva resultat från studier med CXL som behandling mot keratit har rapporterats.

Resultatet av det experimentella försöket pekar på att den stam av Pseudomonas aeruginosa som användes i experimentet inte kan penetrera ett intakt epitel.

Slutsats: CXL kan bli en viktig och användbar behandlingsform vid keratit, särskilt med tanke på den ökade antibiotikaresistensutvecklingen. Ytterligare forskning på området krävs dock innan metoden kan bli fullt vedertagen.

För att kunna fastställa om stammen av Pseudomonas aeruginosa i det aktuella experimentet har virulensfaktorer för att ta sig in i ett oskadat epitel eller inte krävs fler försök.

ii

Summary

Bacterial keratitis is an infection of the cornea. Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus

epidermidis, Staphylococcus aureus and Streptococcus pneumoniae are common bacteria

associated with the infection. The most common risk factors for developing keratitis are

contact lens wear, ocular trauma or ocular surface disease. Keratitis use to be related with

symptoms like pain, sudden loss of vision, tearing and photophobia. Antibiotics are the

accepted treatment for bacterial keratitis.

Corneal collagen crosslinking (CXL) is a method using ultraviolet light-A irradiation

and riboflavin for tissue stabilization, primarily developed for the treatment of keratoconus.

Studies have been done to evaluate the efficiency using this method for the treatment of

keratitis.

Purpose: The purpose of this study was to compare the treatment using antibiotics with the

treatment using CXL in bacterial keratitis. Also, experimentally evaluate if Pseudomonas

aeruginosa could penetrate an intact corneal epithelium.

Method: Litterature and laboratory experiment, in vitro.

Result: The result of the study is that antibiotics are the most common treatment for bacterial

keratitis. CXL has successfully been used as a treatment of keratitis as the only therapy or in

combination with antibiotics.

The result of the experimental part of the study showed that Pseudomonas aeruginosa

only invaded the traumatized epithelium.

Conclusion: In conclusion, the treatment therapy by antibiotics and CXL was not really

comparable because antibiotics are the accepted treatment, while CXL only have been used in

experimental studies, so far. Nevertheless, CXL seems to be a promising alternative in the

treatment of keratitis. Further investigation will be needed to evaluate this treatment.

The strain of Pseudomonas aeruginosa which was investigated in the in vitro

experiment does not seems to have virulence factors enabling penetration into an intact

epithelium.

iii

Innehållsförteckning

Keratitbehandling, antibiotika versus corneal collagen crosslinking (CXL) genom riboflavin och UVA ......................................................................................................................................  

1 Introduktion ............................................................................................................................. 1  

1.1   Keratit ........................................................................................................................... 1  

1.1.1   Bakteriell keratit ..................................................................................................... 2  

1.1.2   Orsakande bakterier ............................................................................................... 2  

1.1.3   Infektionsförlopp .................................................................................................... 3  

1.1.4   Riskfaktorer ............................................................................................................ 4  

1.1.5   Symptombild och diagnos ...................................................................................... 5  

1.1.6   Behandling och prognos ........................................................................................ 6  

1.2   Antibiotika och antibiotikaresistens .............................................................................. 6  

1.2.1   Antibiotika ............................................................................................................. 6  

1.2.2   Antibiotikaresistens ................................................................................................ 7  

1.3   Riboflavin ..................................................................................................................... 7  

1.4   Corneal collagen crosslinking (CXL) ........................................................................... 8  

1.4.1   Behandling (treatment protocol) ............................................................................ 8  

1.4.2   Behandlingens effekt ............................................................................................. 8  

1.4.3   Antimikrobiella effekter av fotoaktiverat riboflavin .............................................. 9  

2 Syfte .................................................................................................................................. 11  

3 Material och metoder ............................................................................................................ 12  

3.1 Litteratursökning ............................................................................................................ 12  

3.2 Laborativ studie ............................................................................................................. 12  

3.2.1 Material och metod ................................................................................................. 12  

4 Resultat ................................................................................................................................. 14  

4.1 Litteraturstudie ............................................................................................................... 14  

4.1.1 Antibiotika ............................................................................................................. 14  

4.1.2 Kombinerad CXL- och antibiotikabehandling ........................................................ 14  

4.1.3 CXL-behandling ..................................................................................................... 15  

4.2 Laborativ studie ............................................................................................................. 15  

5 Diskussion ............................................................................................................................. 17  

5.1 Litteraturstudie ............................................................................................................... 17  

5.2 Laborativ studie ............................................................................................................. 20  

iv

6 Slutsats .................................................................................................................................. 22  

Tackord .................................................................................................................................... 23  

Referenser ................................................................................................................................ 24  

1

1 Introduktion

1.1 Keratit

Keratit är en infektion i cornea som kan leda till inflammation och förstöra den corneala

vävnaden (Huang, Wichiensin & Yang, 2005). Tillståndet är allvarligt och synhotande

(Schaefer, Bruttin, Zografos & Guex-Crosier, 2001). Denna infektion kan orsakas av olika

patogener såsom bakterier, svamp, virus eller parasiter (Coster & Badenoch, 1987;

Socialstyrelsen, 2002). Den corneala vävnaden består av fem lager (figur 1) och är ungefär 0,5

mm tjock. Det yttersta lagret, epitelet, är cirka 50 µm (Kanski, 2007) och utgör en av de första

försvarsbarriärerna mot invaderande bakterier (Alarcon, Tam, Mun, LeDue, Ecans & Fleiszig,

2011).

Figur 1. Ögats främre segment. Förstoringen visar corneas fem lager: epitel, Bowmans lager, stroma, Descemets membran och endotelet. (Figur av S. Lideberg, efter förlaga av Klemm, 2004).

Epitel

Bowmans lager

Stroma

Descemets membran

Endotel

Cornea

2

1.1.1 Bakteriell keratit

Förekomsten av bakteriell keratit i fullt friska ögon är väldigt ovanlig (Kanski, 2007). Risken

att drabbas av bakteriell keratit ökar då ögats naturliga skydd är nedsatt eller ögats epitel

(figur 1) är skadat till följd av exempelvis trauma, kontaktlinsbärande eller någon

epitelpåverkande sjukdom (Coster & Badenoch, 1987; Kanski, 2007; Neumann & Sjöstrand,

1992; Schaefer, et al., 2001).

Förekomsten av bakteriell keratit varierar mellan fattiga och rika länder. Det finns inga

exakta siffror för prevalensen av mikrobiell keratit i Sverige. För att uppskatta prevalensen i

Sverige har Socialstyrelsen (2002) räknat om amerikansk och brittisk data till svensk

population. Vid denna omräkning uppskattas prevalensen av mikrobiella keratiter till cirka

950 fall per år. Vidare har Socialstyrelsen även gjort jämförelse med en annan studie, där

uppskattningen istället skulle bli 250 fall per år.

1.1.2 Orsakande bakterier

Vilka organismer som orsakar keratit varierar i olika delar av världen och är bland annat

beroende av klimatet och levnadsstandarden. De vanligaste bakterierna som orsakar keratiter i

USA är Staphylococker och Pseudomonas, i fattiga länder är det däremot vanligare med

Streptococker (Huang, Wichiensin & Yang, 2005). I Sverige finns det studier som visar att

Staphylococcus aureus (S. aureus) och Staphylococcus epidermis (S. epidermis) är de

vanligaste grampositiva bakterierna som orsakar keratit, dessa två står för ca 50 procent av

alla fallen. Pseudomonas är vanligast bland de gramnegativa bakterier som orsakar keratit

(Neumann & Sjöstrand, 1992; Smittskyddsinstitutet, u.å.a). Gramnegativa bakterier är oftast

den vanligaste orsaken vid kontaktlinsrelaterade keratitier och Pseudomonas aeruginosa (P.

aeruginosa) den patogen som är starkast förknippad med detta, vilket har visats i ett flertal

studier (Huang, Wichiensin & Yang, 2005; Lingel & Casser, 2001; Tabbara, El-Sheikh &

Aabed, 2000; Willcox, 2007). Det finns också studier som inte kunnat koppla P. aeruginosa

som den mest dominanta patogen bland kontaktlinsrelaterade keratitier (Neumann &

Sjöstrand, 1992).

S. aureus är en koagulaspositiv grampositiv kockbakterie (Salyers & Whitt, 2002).

Denna bakterie hittas vanligtvis i nässporrarna hos människor men också på huden (Murray,

Rosenthal & Pfaller, 2005; Salyers & Whitt, 2002). S. aureus kan orsaka till exempel

matförgiftning, hudinfektion såsom svinkoppor, septisk ledinflammation (Murray, Rosenthal

& Pfaller, 2005) och ögoninfektion (Neumann & Sjöstrand, 1992; Schaefer, et al., 2001). De

3

virulensfaktorer som finns hos S. aureus innefattar både ytstrukturen, toxiner och enzymer

(Murray, Rosenthal & Pfaller, 2005).

S. epidermis är en koagulasnegativ, grampostiv, stafylokockbakterie och den ingår i

normalfloran hos människor (Salyers & Whitt, 2002). Förutom ögoninfektioner kan denna

bakterie också orsaka bland annat urinvägsinfektion och hjärthinneinflammation (Murray,

Rosenthal & Pfaller, 2005). Att S. epidermis är biofilmsbildande tros vara en viktig orsak till

dess virulens (Salyers & Whitt, 2002).

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) är en grampositiv streptokock som ofta är

organiserad i par eller kortare kedjor (Murray, Rosenthal & Pfaller, 2005). Bakterien håller till

i mun och hals hos människor (Salyers & Whitt, 2002). S. pneumoniae kan orsaka keratit samt

infektion i lunga, hjärnhinna, bihåla och öra samt orsaka blodförgiftning. Virulensfaktorer hos

bakterien är bland annat polysackaridkapsel, adhesiner och cytotoxiner (Murray, Rosenthal &

Pfaller, 2005).

P. aeruginosa är en vanligt förekommande gramnegativ stavbakterie (Salyers & Whitt,

2002). Denna bakterie går bland annat att finna i jord, förmultnande organiskt material,

vegetation och vatten samt i fuktiga miljöer på sjukhus såsom toaletter, golvmoppar,

respirator- och dialysutrustning och till och med i desinfektionsvätskor (Murray, Rosenthal &

Pfaller, 2005). Bakterien är också vanligt förekommande i badbassänger (Lutz & Lee, 2011).

P. aeruginosa kan orsaka infektioner i hud, öga, öra, urinvägar, blod och lunga (Murray,

Rosenthal & Pfaller, 2005; Salyers & Whitt, 2002) och är den vanligaste orsaken till

kontaktlinsrelaterad keratit (Bourcier, Thomas, Borderie, Chaumeil, & Laroche, 2003).

P. aeruginosa har ett flertal olika virulensfaktorer, som till exempel adhesiner,

lipopolysackarider (LPS), olika toxiner och dessutom är den biofilmsbildande (Salyers &

Whitt, 2002). P. aeruginosa anses vara en relativt farlig patogen, vilket bland annat beror på

dess höga antibiotikaresistens (Murray, Rosenthal & Pfaller, 2005).

1.1.3 Infektionsförlopp

Den bakteriella invasionen av cornea börjar då en bakterie tar sig förbi ögats naturliga skydd

och får fäste i epitelet. När bakterien väl fått fäste sköljas den inte bort av tårfilmen vid

blinkning. Bakterien har möjlighet att fästa i epitelet tack vare adhesiner som finns på

bakteriecellens yta. Dessa adhesiner binder till glykoproteinreceptorer på ögats yta. Om

bakterien är biofilmsbildande eller har pili på sin cellyta ökar dess möjlighet att angripa ögat.

När bakterien fått fäste i epitelet påbörjar den sin förökning om inte antibiotika eller andra

4

bakteriedödande/bakteriehämmande medel ges i detta stadium. Om epitelskadan är djup kan

bakterien ta sig in och fästa i basalmembranet eller stromat och direkt påbörjar den stromala

invasionen. I de fall då bakterierna däremot behöver penetrera epitelet för att komma in till

stromat använder de sig av sina egna cellers ytprotein (invasin). Invasiner interagerar med

epitelcellernas ytprotein (integrin) vilket bidrar till att en inflammation uppstår. Bakterierna

använder sig även av proteaser för att penetrera ett intakt epitel (Huang, Wichiensin & Yang,

2005).

De koloniserade bakterierna fäster till stromala lameller och påbörjar en produktion av

proteolytiska enzym. Dessa enzymer förstör den stromala matrisen och de collagena fibrerna.

Om bakterierna får fortsätta att föröka sig helt okontrollerat i stromat resulterar detta i att den

centrala infektionen växer och breder ut sig till omgivande delar av cornean (Huang,

Wichiensin & Yang, 2005).

Corneas svar på infektionen blir en inflammation. Inflammatoriska celler och lösliga

ämnen, såsom cytokiner, tillströmmar till det infekterade området redan några timmar efter att

bakterierna har börjat angripa (Huang, Wichiensin & Yang, 2005). Vita blodkroppar

rekryteras för fagocytos av bakterier. En omfattande rekrytering av vita blodkroppar i den

corneala vävnaden leder till nedbrytning av corneala celler och vävnad (Willcox, 2007).

Hur snabbt förloppet blir beror av vilken bakterie som har orsakat infektionen och dess

virulensfaktorer samt ögats ursprungliga hälsa (Socialstyrelsen, 2002), för virulenta bakterier

kan vävnaden förstöras inom 24 timmar (Huang, Wichiensin & Yang, 2005).

1.1.4 Riskfaktorer

Att kontaktlinsbärande är en av de största riskerna för att drabbas av keratit är flera oberoende

studier överens om (Bourcier, et al., 2003; Neumann & Sjöstrand, 1992; Schaefer, et al.,

2001) men exakt hur stor andel av keratiterna som kan kopplas till kontaktlinser varierar från

studie till studie. Bourcier, et al. (2003) visar i sin studie att 50 procent av fallen orsakades av

kontaktlinser, bland dessa associerades de allra flesta till bärande av mjuka linser. Liknande

statistik går att finna i andra studier (Neumann & Sjöstrand, 1992; Schaefer, et al., 2001).

Anledningen till att kontaktlinsanvändande är en vanlig orsak till keratit kan bero på att

bakterier får fäste i linsmaterialet vid hanteringen. Sätts sedan en kontaminerad lins på ögat

har de goda chanser att angripa ögat. Vidare kan linser påverka den friska cornean negativt till

exempel genom att linserna skaver, epitelet skadas vid i- och urtagning av linserna eller

5

cornealt ödem uppstår, vilket också är faktorer som underlättar för bakteriella angrepp

(Huang, Wichiensin & Yang, 2005).

Trauma är en annan stor riskfaktor för keratit (Kanski, 2007; Lingel & Casser, 2001;

Schaefer, et al., 2001). I fattiga länder är trauma i form av skador inom jordbruket den

vanligaste orsaken till keratit (Kanski, 2007). I urbaniserade delar av världen kan trauma till

exempel innebära refraktiv kirurgi och lösa suturer (Kanski, 2007).

Begreppet ”ocular surface disease” (ögonsjukdomar med epitelpåverkan), innefattar till

exempel torra ögon, tidigare herpeskeratit, abnormala ögonlock, bullös keratopati (Bouricer,

et al., 2003), ögonlockspåverkande sjukdomstillstånd, och kronisk blefarit (Schaefer, et al.,

2001). Även detta är en riskfaktor för keratit.

Övriga riskfaktorer kan vara systemsjukdomar som diabetes eller användning av

immunosupprimerande preparat (Kanski, 2007), undernäring och alkohol (Huang, Wichiensin

& Yang, 2005).

1.1.5 Symptombild och diagnos

Symptomen vid keratit varierar och beror bland annat på bakteriens virulensfaktorer samt hur

länge infektionen har pågått (Huang, Wichiensin & Yang, 2005). Symptomen som den

drabbade individen upplever kan innefatta smärta, fotofobi, dimsyn, ökat tårflöde samt rött

öga (Huang, Wichiensin & Yang, 2005; Kanski, 2007; Socialstyrelsen, 2002).

De kliniska fynd som kan göras vid en bakteriell keratit är epiteldefekt, infiltrat,

stromalt ödem, hypopion, pågående sårbildning, sclerit (Kanski, 2007), varigt sekret,

inflammation i ögonlock och konjunktivan (Lingel & Casser, 2001), ljusväg (Socialstyrelsen,

2002). Att enbart med hjälp av kliniska fynd ställa diagnos på vilken patogen som orsakat

infektionen går inte. En bakterieodling krävs för att bestämma vilken bakterie som har orsakat

keratiten och hur denna ska behandlas.

Provtagning för odling börjar med att en odling från konjunktivan tas. En bomullspinne

fuktas och rullas över palpebrala konjunktivan samt fornix. Därefter placeras pinnen i ett rör

som innehåller ett transportmedium (”Stuart”-medium). När konjunktivalodlingen är tagen

görs även cornealskrap av det infekterade området på cornea. Utstryk görs på olika

odlingsplattor. För att mikropsi eventuellt ska kunna utföras inokuleras dessutom 2-3

objektsglas. Odlingsmaterialet transporteras sedan till laboratoriet inom några få timmar

(Socialstyrelsen, 2002). Plattorna inkuberas därefter i 2 dygn och rören i 10 dygn

(Smittskyddsinstitutet, u.å.b).

6

1.1.6 Behandling och prognos

Behandling mot keratit bör sättas in redan innan odlingssvaren har kommit för att hindra

progressen (Kanski, 2007). Initialt ges vanligtvis behandling med bredspektrumantibiotika, i

form av ögondroppar, för att täcka både grampositiva och gramnegativa bakterier

(Socialstyrelsen, 2002). Det finns två möjliga tillvägagångssätt för denna behandling, varav

den ena är att ge fortified antibiotics (förstärkt bredspektrumantibiotika). Vid denna

behandling ges två olika droppar (oftast en kombination av cefalosporin och aminoglykosid)

för att täcka de flesta av de grampositiva och gramnegativa bakterierna. Det andra alternativet

är att ge fluorokinolon (ciprofloxacin eller ofloxacin), ett bredspektrumantibiotikum,

behandlingen blir då endast med en typ av droppar (Kanski, 2007). Utifrån odlingssvar och

resistensbestämning finns det möjlighet för insättande av en mer specificerad behandling

(Neumann & Sjöstrand, 1992; Socialstyrelsen, 2002). Vid lättare fall av keratit används

endast bredspektrumantibiotika, till skillnad från svåra fall där ett mer specifikt antibiotikum

ges efter att resistensbestämning gjorts. Cykloplegika är ett preparat som kan tillsättas vid fall

av allvarligare keratiter för att reducera risken för synerchier och ciliär spasm (Huang,

Wichiensin & Yang, 2005).

Allvarliga bakteriella keratiter kan leda till ärrbildning och oregelbunden astigmatism

med nedsatt visus som följd, men även förtunning samt perforation av cornea. Svåra

komplikationer kan kräva transplantation av cornean (Schaefer, et al., 2001). Vissa fall av

keratit är så svåra att enukleation av ögat till och med kan komma att bli nödvändig (Bourcier,

et al., 2003; Coster & Badenoch, 1987). Enligt amerikanska data är ungefär 0,5 – 1 procent av

alla infektiösa keratiter så allvarliga att de kräver operation och transplantation (Huang,

Wichiensin & Yang, 2005). Katarakt kan även uppkomma sekundärt efter en allvarlig

inflammation (Kanski, 2007).

1.2 Antibiotika och antibiotikaresistens

1.2.1 Antibiotika

Antibiotika är en substans som hämmar eller dödar bakterier och kan därför användas vid

behandling av infektioner. Antibiotika behöver vara selektivt toxiska och endast angripa

baktericeller men inte värdceller. Det finns olika typer av antibiotika som har varierande

angreppspunkter. Bakteriocidala antibiotika dödar bakterien, bakteriolytiska antibiotika

inhiberar cellväggstillväxten och leder därmed till att bakterien dör. Bakteriostatiska

7

antibiotika hämmar bakteriens tillväxt och förökning (Simonsen, Aarbakke & Hasselström,

2004).

1.2.2 Antibiotikaresistens

Antibiotikaresistensen är ett världsomspännande fenomen (Struelens, 2003) och innebär att

bakterier utvecklar motstånd mot antibiotika. Detta är inte enbart ett hot mot behandling av

bakteriella infektioner utan också mot cancerbehandlingar, transplantationer och operationer

där antibiotika har en viktig roll (Sköld, 2006). Den stora användningen av antibiotika inom

medicin, djuruppfödning och växtodling har gjort att väldiga mängder antibiotika har spritts i

naturen. Bakterier, både opportunistiska och mer patogena, har för sin överlevnads skull

behövt utveckla ett skydd mot detta och därav har antibiotikaresistensen utvecklats (Sköld,

2006). De mekanismer som en bakterie kan använda för att undvika ett antibiotikum är till

exempel enzymatisk nedbrytning av antibiotikan innan den tar sig igenom bakteriecellväggen,

förändring av bakteriens cellvägg så att den blir mindre genomtränglig för antibiotikan eller

modifiering av målet så att antibiotikan får svårare att binda in (Struelens, 2003). Eftersom

bakterier förökar sig snabbt kan antibiotikaresistenta gener fort spridas vidare inom en

bakteriestam (Sköld, 2006).

Det finns flera orsaker till att antibiotikaresistensutvecklingen har ökat. Utvecklingen

beror bland annat på att antibiotika skrivits ut utan någon diagnos på bakteriell infektion

(Sköld, 2006) samt att stor spridning av resistenta bakterier sker vid dålig hygien inom

sjukhus och daghem (Norrby & Cars, 2003).

1.3 Riboflavin

Riboflavin, vitamin B2, är en vattenlöslig vitamin och en grundläggande beståndsdel i

levande celler. Riboflavin ingår i koenzymerna flavinmononukleotid och adenindinukleotid

som har en viktig roll i metabolismen för fett, proteiner och kolhydrater (Hovakimyan,

Guthoff & Stachs, 2012). Riboflavin har en viktig roll i corneal collagen crosslinking där

vitaminen agerar som fotomediator (Wollensak, Spoerl & Seiler, 2003a).

8

1.4 Corneal collagen crosslinking (CXL)

1.4.1 Behandling (treatment protocol)

Croneal collagen crosslinking är en metod som används för att stabilisera vävnad och har

utvecklats främst för att förhindra progressen av keratokonus. Standardprotokollet för CXL

utformades av Wollensak, Spoerl och Seiler (2003a). Behandlingen utförs sterilt under

lokalanestesi. Epitelet skrapas bort över behandlingsområdet. Därpå ges ögondroppar med 0,1

procent riboflavin i intervaller, minst en gång var femte minut. Droppningen påbörjas senast

fem minuter före strålningen och varar under hela behandlingen. Ögat bestrålas under 30

minuter med UVA-ljus av 370 nm våglängd på 1 cm avstånd med strålningen 3 mW/cm2,

vilket motsvarar en effekt på 5,4 J/cm2 (Wollensak, Spoerl & Seiler, 2003a). Efter

behandlingen kan topikal antibiotika ges och en bandagelins tillpassas. Användandet av

bandagelinsen upphör då epitelet har läkt (Dhawan, Rao & Natrajan, 2011).

CXL-behandling bör inte utföras om stromat är tunnare än 400 µm eftersom det då finns

en risk att effekten går ner till endotelet där den har en cytotoxisk effekt (Wollensak, Spoerl,

Wilsch & Seiler, 2003). Preoperativa pakymetrimätningar är därför nödvändiga för att

undvika skador på endotel, lins och retina (Wollensak, 2006). Övriga kontraindikationer för

behandlingen kan till exempel vara patienter med en historia av herpeskeratit, cornealt ärr,

svår ögontorrhet, pågående graviditet, amning eller tidigare kirurgi i det främre segmentet,

detta för att nämna några (Gkika, Labiris & Kozobolis, 2011).

1.4.2 Behandlingens effekt

Resultatet av behandlingen är att det corneala stromat genomgår tvärbindningsreaktioner som

stärker vävnaden. Det är ännu inte helt klargjort på molekylär nivå vilka mekanismer som är

inblandade i reaktionen. Det troliga är att de kollagena molekylerna tvärbinds av histidine,

hydroxyproline, hydroxylysine, tyrosine och threonine genom de reaktiva syreföreningar som

bildas när riboflavin fotoaktiveras av UVA-strålningen (McCall, Kraft, Edelhauser, Kidder,

Lundquist, Bradshaw, Dedeic, Dionne, Clement & Conrad, 2010).

CXL-behandling har i laborativa studier visat sig ha biomekaniska, biokemiska,

termomekaniska och morfologiska effekter på cornean samt påverka keratocyterna

(Wollensak, 2006). Den biomekaniska påverkan, efter behandling enligt standardprotokollet,

yttrar sig genom vävnadsstyv- och stelhet (Lanchares, Angeles del Buy, Cristóbal, Lavilla &

Calvo, 2011; Spoerl, Huhle & Seiler, 1998; Wollensak, Spoerl & Seiler, 2003b). Cornean har

visat sig bli 300 procent stelare efter CXL-behandling (Wollensak, Spoerl & Seiler, 2003b).

9

Den biokemiska påverkan märks genom att en resistens mot kollagennedbrytande enzymer

uppstår (Spoerl, Wollensak & Seiler, 2004). Termomekaniska effekter efter behandlingen har

visats i en studie där den hydrotermiska krympningstemperaturen jämfördes mellan

behandlade delar (75°C) och mindre behandlade delar (70°C) av grisögon (Spoerl, Wollensak,

Dittert & Seiler, 2004). Att den kollagena fiberdiametern ökar markant är en morfologisk

effekt som CXL-behandlingen har. En studie visar att fiberdiametern ökar med hela 12

procent i den främre delen av stromat efter behandlingen (Wollensak, et al., 2004a). De

kollagena fibrerna blir också mycket välorganiserade (Mencucci, Marini, Paladini, Sarchielli,

Sgambati, Menchini & Vannelli, 2010). Apoptos av keratocyter blir också en följd av

behandlingen, vilket visualiseras genom att ett tillfälligt cornealt ödem uppstår efter

strålningen (Wollensak, et al., 2004b). En repopulation av keratocyter har observerats sex

månader efter behandlingen (Mencucci, et al., 2010).

Effekten av behandlingen verkar vara begränsad till den främre delen av stromat

(Spoerl, Huhle & Seiler, 1998; Spoerl, Wollensak & Seiler, 2004; Wollensak, Spoerl &

Seiler, 2003b). Att behandlingen är begränsad till de främre delarna av cornean är en stor

fördel eftersom den cytotoxiska effekten som riboflavin/UVA har på endotelet då undviks

(Wollensak, 2006; Wollensak, et al., 2003). En anledning till att behandlingen inte påverkar

hela cornean är att UVA-absorptionen ökar genom närvaro av riboflvin vilket ger en hastig

reducering av den UVA-strålning som tar sig igenom hela cornea (Spoerl, et al., 2004). Under

normal behandling absorberar cornean hela 90-95 procent av UVA-strålningen. Den strålning

linsen då utsätt för är 0,65 J/cm2, vilket är långt under gränsen för att utveckla katarakt

(Wollensak, 2006).

1.4.3 Antimikrobiella effekter av fotoaktiverat riboflavin

Fotoaktivering av riboflavin har visat sig vara en användbar metod för att rena blod från olika

patogener (Ruane, Edrich, Gampp, Keil, Leonard & Goodrich, 2004) och är en bland många

andra metoder för patogeninaktivering (Pelletier, Transue & Snyder, 2006). Det finns flera

verkningsmekanismer bakom de antimikrobiella egenskaperna. En av dessa är den

nedbrytande effekt som UV-ljuset har på patogenernas nukleinsyror (Kumar, Lockerbie, Keil,

Ruane, Piatz, Martin, Ravanat, Cadet & Goodrich, 2004). Studier har även visat att det sker en

nedbrytning hos mikroorganismers DNA och RNA genom de fria syreradikaler som bildas då

ribolfavinet fotoaktiveras (Pelletier, Transue & Snyder, 2006). Riboflavinmolekylen kan

också binda in mellan basparen i patogenernas DNA eller RNA. När molekylen sedan utsätts

10

för UV-ljus oxideras nukleinsyran och på så vis förhindras replikation (Corbin, 2002). Ett

antal mikroorganismer har i olika studier visat sig bli inaktiverade av UVA i kombination

med riboflavin (Makdoumi, Bäckman & Mortensen, 2010; Martins, Combs, Noguera,

Camacho, Wittmann, Walther, Cano, Dick & Behrens, 2008). Denna patogeninaktivering gör

CXL-behandling till ett möjligt redskap att använda mot keratiter. En sådan användning har

testats kliniskt och visat sig ha god effekt (Iseli, Thiel, Hafezi, Kampmeier, & Seiler, 2008;

Makdoumi, Mortensen, Sorkhabi, Malmvall & Crafoord, 2012).

11

2 Syfte

Syftet med denna studie är att jämföra antibiotikabehandling med corneal collagen

crosslinking (CXL)-behandling genom fotoaktivering av riboflavin vid bakteriell keratit. Att

experimentellt undersöka om en viss stam av Pseudomonas aeruginosa kan infektera cornealt

epitel är också en del av studien.

12

3 Material och metoder

3.1 Litteratursökning

Den litteratur som använts i arbetet är hämtad ifrån originalartiklar, översiktsartiklar och

böcker. Publikationer från Socialstyrelsen och Smittskyddsinstitutet har också använts, främst

för att ta del av statistik som är relevant för Sverige.

Artikelsökningar har gjorts via Linnéuniversitetets sökmotorer Pubmed och Google

schoolar. De sökord som har använts är ”bacterial keratitis”, ”microbial keratitis”,

”riboflavin”, ”corneal collagen crosslinking”, ”pseudomonas aeruginosa”, ”antibiotics” och

”treatment” samt kombinationer av dessa. Referenslistan ifrån olika artiklar har i vissa fall

använts för vidare sökning samt databasernas funktioner som visar relaterade artiklar.

De böcker som använts har hittats genom att gå tillbaka till tidigare kurs- eller

referenslitteratur med inriktning mot ögats fysiologi, ögats sjukdomar, mikrobiologi och

böcker som berör farmakologi. Vissa böcker har även sökts fram vid Universitetsbiblioteket i

Kalmar genom sökningar i bibliotekskatalogen samt genom att leta i hyllorna under ämnena

optometri och medicinsk mikrobiologi.

Endast litteratur på engelska och svenska har använts. Begränsningar gjordes till

bakteriella keratiter med fokus på de som är vanligast förekommande i Sverige.

3.2 Laborativ studie

3.2.1 Material och metod

De laborativa experimenten är modifierade från Zaidi, Reidy, D’Ortona, Fichorova, Pier &

Gadjeva (2001) och från Yamamoto, Yamamoto, Petroll, Cavanagh & Jester (2004). Från en

övernattkultur av P. aeruginosa (kliniskt isolat från Kalmar sjukhus, vänligen mottaget från

Britt-Inger Marklund, Linnéuniversitetet, Kalmar) överfördes 5 mL till en E-kolv med 10 mL

Luria Broth medium (Difco, England). P. aeruginosa-bakterierna tilläts därefter tillväxa under

omrörning i 1-2 timmar vid 37°C. Vid optisk täthet på cirka 0,2-0,3 vid 600 nm motsvarade

bakterietillväxten, efter spädning i fosfatbuffert (FBS; Medicago AB, Uppsala, Sverige),

1*108 koloniformande enheter (cfu)/mL.

Färska grisögon hämtades på Kalmar slakteri (KLS Ugglarps) och lades direkt i CO2-

oberoende medium (Gibco® Life Technologies™, Carlsbad, CA, USA). Ögonen finputsades

13

från muskler och vävnad, placerades därefter, med cornea uppåt, i en odlingsskål och 7,5 mL

cellodlingsmedium tillsattes, bestående av Minimun Essential Medium (MEM (1X); Gibco®

Life Technologies™, Carlsbad, CA, USA).

Dailies AquaComfort Plus, mjuk endagslins, BC:8,7 DIA:14,0 styrka: -3,00 (CIBA

VISION Corp., Duluth, GA, USA) fylldes därpå med 50-100 µL av den bakteriesuspension

som var spädd till 1*108 cfu/mL och sattes därefter på grisögonen. I försöket ingick ett

kontrollöga (utan lins och bakterie), ett öga med enbart lins, ett öga med bakteriesuspensionen

i linsen. Därtill utgjorde ett öga en experimentellt skadad cornea, där en kanyl 0,60 gauge x 25

mm (B. Braun, Meslungen AG, Tyskland) tilläts rispa rakt över cornea innan lins med tillsatt

bakteriesuspension lades över cornea. Därpå gjordes en kontroll varvid eventuella luftbubblor

mellan lins och öga togs bort genom att försiktigt tycka lite på linsen. Ögonen inkuberades i

37°C under tre timmar. För att hålla ögon och lins fuktiga droppades det, var femte minut,

några droppar FBS på varje öga.

Efter infektion av P. aeruginosa togs linsen försiktigt bort, ögonen tvättades i MEM.

För att avdöda eventuella extracellulära bakterier tilläts ögonen bada i MEM, tillsatt det cell-

impermeabla antibiotikumet gentamicin 200 µg/mL, under två timmar. Därefter fixerades

ögonvävnaden i 4% paraformaldehyd, pH 7,4 (Apoteket, Göteborg, Sverige) och

frysskyddades. Cornea skars sedan upp i 10 µm tjocka snitt och lades på objektsglas. För att

detektera bakterier i vävnaden gramfärgades snitten. Snitten fotograferades därefter med hjälp

av ett Nikon ljusmikroskop utrustad med en digitalkamera och Nis-Elements F 3,0 mjukvara

(Nikon DS-U1, Goletta, GA, USA). Bilderna processades i Adobe Photoshop (CS4 version

11.0.2, Adobe, San José, CA, USA).

14

4 Resultat

4.1 Litteraturstudie

Efter granskning och jämförelse av flera studier som berör keratit och dess behandling går det

härmed att konstatera att behandlingarna inte är helt jämförbara. Antibiotikabehandling är för

närvarande den vanligaste behandlingen och ses som förstahandsalternativ. CXL är ännu

ingen vedertagen behandlingsmetod, men studier har visat att den går att använda antingen i

kombination med antibiotika eller för sig självt. Nedan redogörs kortfattat för de tre olika

metoderna.

4.1.1 Antibiotika

Antibiotika är den vedertagna behandlingsmetoden för att hantera bakteriella keratiter.

Behandlingen inleds med ett bredspektrumantibiotikum. Ger behandlingen ett önskat resultat

finns det ingen anledning till att byta antibiotikum, men om patogenen uppvisar resistens mot

behandlingen och infektionsprogressen fortskrider bör andra alternativ till behandling

övervägas (Kanski, 2007). Antibiotikaresistenta bakterier har upptäckts bland flera isolat från

keratiter (Schaefer, et al., 2001; Tuft & Matheson, 2000; Willcox, 2011).

4.1.2 Kombinerad CXL- och antibiotikabehandling

Corneal collagen crosslinkning (CXL) är fortfarande en behandling som är under forsknings-

och utvärderingsstadie, därför är detta ännu inte är en vedertagen behandlingsmetod för

keratit. Behandlingen sker ofta som ett komplement vid svåra keratiter där

antibiotikabehandling inte haft någon effekt och för att undvika akut penetrerande

keratoplastik (PKP) (Al-Sabai, Koppen & Tassignon, 2010; Anwar, El-Danasoury & Hashem,

2011; Iseli, et al., 2008; Makdoumi, Mortensen & Crafoord, 2010).

Al-Sabai, Koppen och Tassignon (2010) beskriver ett fall av keratit orsakad av

P. aeruginosa där risk för corneal perforation uppstod trots intensiv behandling genom

förstärkt antibiotiotika. De beslutade att behandla sin patient med CXL, för att stoppa den

corneala smältningen och undvika akut keratoplastik. Efter CXL-behandling fortsatte de med

antibiotikabehandling. Den kombinerade behandlingen resulterade i att keratiten läkte, dock

med en totalt ärrbildad cornea samt kärlinväxt, men en akut keratoplastik kunde undvikas.

Anwar, El-Danasoury och Hashem (2011) presenterar en fallrapport av två keratiter, varav

15

den ena var bakteriell, som behandlats med CXL i kombination med antibiotika. Fallet med

bakteriell keratit var allvarligt och svarade ej på antiotikabehandlingen. CXL-behandlingen

följdes av fortsatt antibiotikabehandling och behandlingskombinationen resulterade här i

snabb läkning. Visus blev dock något nedsatt på grund av ett cornealt ärr men patienten

undvek corneal perforation. 2008 rapporterade Iseli, et al. fem fall av keratit, varav tre var

bakteriella, där CXL sattes in som behandling då antibiotikabehandling inte gav något

resultat. Efter CXL-behandingen fick patienterna även antibiotikabehandling. I samtliga fall

stannade den corneala smältningen upp och akut keratoplastik var ej nödvändig. Ytterligare en

studie redogör för CXL som använts i kombination med antibiotika för behandling av keratit

(Makdoumi, Mortensen & Crafoord, 2010). I denna studie rapporterar de att den corneala

smältningen avstannade i samtliga fall och att någon akut keratoplastik inte behövde utföras.

4.1.3 CXL-behandling

Makdoumi, et al. (2012) har i sin studie använt CXL som första behandling på 16 patienter

med diagnosen bakteriell keratit. Behandlingen resulterade i att de corneala såren läkte utan

ytterligare åtgärder i 14 av fallen. Den första patienten som behövde ytterligare behandling

var en patient som led av diabetes typ 1 och fick en bandagelins på grund utav långsam

epitelläkning. Vid uppföljning av denna patient uppmärksammades ett nytt sår och

antibiotikabehandling sattes då in. Den andra patienten som krävde ytterligare behandling

hade utöver sin keratit en påtaglig främre uveit som inte läkte genom CXL-behandlingen och

därför erhölls antibiotika som komplement till behandlingen.

4.2 Laborativ studie

Försöket gjordes två gånger, varav ett av försöken gav resultat. Försöket visar att det inte

fanns några synbara skillnader mellan kontrollvävnaden (figur 2A) och ögat med endast lins

(figur 2B) eller ögat med lins och P. aerugniosa (figur 2C). Däremot gick det att se att P.

aeruginosa kunde ta sig in det experimentellt skadade epitelet (vit pil). Av figur 2D samt

infogad ruta, framgår en bit av ett skadat epitel och strax där under invaderande bakterier. Det

corneala epitelet i den experimentellt skadade vävnaden såg även svullet och skadat ut.

16

Figur 2. Gramfärgning av Pseudomonas aeruginosa (P-A) och corneavävnaden. (A)

Obehandlad kontroll. (B) Kontroll med lins. (C) P-A med lins. (D) Experimentellt skadad

cornea med P-A (vit pil) och lins, Infogad ruta förstoring över invaderande P-A (svart pil).

Storleksmarkör 10 µm.

17

5 Diskussion

5.1 Litteraturstudie

Största risken att drabbas av keratit är kontaktlinsanvändande (Bouricer, et al., 2003;

Schaefer, et al., 2001) och oftast är då Pseudomonas aeruginosa den angripande bakterien

(Dutta, Cole & Willcox, 2007). Andra bakterier som är vanliga vid keratiter i Sverige är

Stafylococcus aureus, Stafylococcus epidermis och Streptococcus pneumoniae

(Socialstyrelsen, 2002).

För att förhindra progressen av sjukdomen ges initialt bredspektrumantibiotika, vilket är

den behandling som i princip alltid används vid bakteriella keratiter. Tidig behandling är av

stor betydelse för sjukdomsförloppet (Huang, Wichiensin & Yang, 2005). Då bestämning av

angripande bakterie och dess resistensbestämning tar minst två dygn behöver en så

bredtäckande behandling som möjligt ges i början (Neumann & Sjöstrand, 1992). De finns

olika för- och nackdelar med de olika antibiotikavarianterna som går att använda.

Fördelen med förstärkt antibiotika är att det är en bred behandling som täcker många

olika bakterier. En utav nackdelarna med denna form av bredspektrumantibiotika är den

begränsade tillgängligheten. Förstärkt antibiotika är inte kommersiellt tillgänglig och kräver

särskild beredning, detta leder till en ökad kostnad och risk för kontaminering. Dessutom har

förstärkt antibiotika en kort hållbarhetstid, 4-5 dagar, därtill kommer behov av nedfrysning

(Huang, Wichiensin & Yang, 2005). Utöver detta kan en frekvent droppning med dessa

antibiotika ge toxiska effekter med konjunktival nekros och vita corneala precipitat som följd,

vilket i sin tur leder till långsammare epitelläkning (Kanski, 2007).

Fluorokinolonernas fördel är att endast en typ av droppar används. De är också

kommersiellt tillgängliga och behöver inte speciell tillredning vilket reducerar kostnaden

(Kanski, 2007). Ytterligare en fördel med detta antibiotikum är att det inte ger upphov till lika

mycket obehag som förstärkt antibiotikum vid applicering (Huang, Wichiensin & Yang,

2005). En av nackdelarna med fluorokinoloner är att en ökad resistens mot detta antibiotikum

har rapporterats ifrån USA och Indien (Kanski, 2007), i motsatts till detta har en studie från

London inte kunnat påvisa någon ökad resistent utan där tycks fortfarande detta antibiotikum

ha effekt (Tuft & Matheson, 2000). En varningssignal för användandet av flourokinoloner är

att större risk för perforation har rapporterats efter användning av detta antibiotikum (Huang,

Wichiensin & Yang, 2005).

18

Det går också att diskutera hur stor lönsamhet det finns i att göra odlingar ifrån

keratiterna, 63-86 procent av odlingarna har gett ett positivt odlingssvar (Bourcier, et al.,

2003; Neumann & Sjöstrand, 1992; Schaefer, et al., 2001). Generellt sett sägs att ett positivt

odlingssvar erhålls i 60 procent av fallen (Huang, Wichiensin & Yang, 2005). Om odlingarna

är negativa och det ändå inte går att göra en resistensbestämning kan det tyckas onödigt att

lägga resurser på detta. Å andra sidan är överanvändandet av bredspektrumantibiotika en

bidragande orsak till antibiotikaresistensen och därav är resistensbestämningen ett oerhört

viktigt redskap för att kunna göra en modifiering av behandlingen till ett

smalspektrumantibiotikum. En intressant och viktig fråga är hur ofta behandlingen byts ut och

modifieras när en resistensbestämning tillhandahålls. Eftersom antibiotikaanvändningen bör

trappas ner är det hög tid att se över alternativa behandlingsformer, även när det gäller

ögoninfektioner.

Om antibiotikabehandlingen inte hjälper, antingen på grund av fel val av antibiotikum

eller antibiotikaresistens kan detta leda till corneal perforation. För högvirulenta bakterier,

såsom P. aeruginosa, kan penetrering av cornean ske inom 24 timmar (Huang, Wichiensin &

Yang, 2005). Det har visat sig att risken att keratit följs av penetrerande keratoplastik ökar

bland annat med stigande ålder, behandling med kortisondroppar, tidigare ögonkirurgi,

nedsatt syn redan vid starten av sjukdomsförloppet och fördröjt vårdsökande (Miedziak,

Miller, Rapuano, Laibson, & Cohen, 1999). Vid klinisk uppföljning av keratiter som

behandlats med antibiotika har en studie visat att behandlingen gav ”very poor outcome” (fyra

eller fler raders förlust i visus, penetrerande keratoplastik eller en stor komplikation tillstötte)

i 5 procent av fallen (Bourcier, et al., 2003). Schaefer, et al. (2001) visar i sin studie att 5,8

procent av patienterna hade ”poor clinical outcome” (här definierad som visusförlust av en rad

eller mer). Om CXL-behandling sätts in direkt vid upptäckten av att antibiotikabehandlingen

ej har effekt skulle eventuellt risken för svåra komplikationer och akuta transplantationer

reduceras. Detta konstaterar Iseli, et al. (2008) i sin studie där de kunde stoppa den corneala

smältningen för samtliga fall i studien och skjuta upp keratoplastiken till ett senare tillfälle.

Därigenom undvek de ett akut ingrepp, vilket alltid innebär risker, under pågående infektion.

Komplikationer som kan uppkomma vid penetrerande keratoplastik är permanent epiteldefekt,

läckage, glaukom, ökad infektionsrisk och avstötning av den nya vävnaden, för att nämna

några (Kanski, 2007).

Flera studier har visat goda resultat då CXL har använts som komplement vid

antibiotikabehandling (Al-Sabai, Koppen & Tassignon, 2010; Anwar, El-Danasoury &

Hashem, 2011; Makdoumi, Mortensen & Crafoord, 2010). Behandlingen har även visat sig

19

vara effektiv mot svampinfektioner (Anwar, El-Danasoury & Hashem, 2011; Iseli, 2008) och

keratiter orsakade av Acanthamoeba (Garduño-Vieryra, Gonzalez-Sanchez & Hernandez-Da

Mota, 2011).

Fotoaktiveringen av riboflavin har en direkt antimikrobiell effekt på bakterierna

(Kumar, et al., 2004). I tillägg till detta har Spoerl, Wollensak och Seiler (2004) visat att en

större motståndskraft mot kollagennedbrytande enzymer uppkommer vid CXL-behandling.

När bakterier infekterar stromat kan de producera dessa kollagennedbrytande enzymer

(Huang, Wichiensin & Yang, 2005). Det är detta som gör CXL till en potentiell

behandlingsmetod vid keratit. Ytterligare fördelar med att använda CXL som behandling är

att dess antimikrobiella verkan också gäller antibiotikaresistenta bakterier (Martins, et al.,

2008). Behandlingen har också visat sig ha en snabb effekt (Anwar, Al-Danasoury &

Hashem, 2011). En snabb läkning medför kortare sjukhusvistelse som i sin tur leder till lägre

kostnader för samhället. Svåra keratiter som behandlas med antibiotikum en gång i timmen

den första tiden kräver sjukhusvistelse. Antalet dygn på sjukhus vid behandling varierar från 3

till 60 dagar, med ett genomsnitt på 9 dagar (Bourcier, et al., 2003). Epitelläkningen efter

CXL-behandling tar vanligtvis 1-15 dagar (Anwar, El-Danasoury & Hashem, 2011; Iseli, et

al., 2008; Makdoumi, et al., 2012) men även fall av betydligt långsammare läkning, på 6

veckor samt 3 månader, har påvisats (Makdoumi, Mortensen & Crafoord, 2010).

En kontraindikation för att använda CXL som behandling av keratit är då patienten lider

av diabetes. Diabetespatienter har en långsam epitelläkning (O’Donell, 2010) och risken för

nya infektioner är därmed högre vid CXL-behandling av dessa. En bandagelins och

antibiotika kan vara ett viktigt komplement innan epitelet läkt (Makdoumi, et al., 2012).

Effekten av CXL-behandling håller sig till den främre delen av cornean, vid corneor

tunnare 400 µm kan behandlingen ge skada (Wollensak, et al., 2003). Detta är viktigt att ha i

åtanke vid djupa cornealsår. Om såren är mycket djupa eller infektionen har orsakat en

förtunning av cornean skulle behandlingen kunna ha en cytoxisk effekt istället för en läkande.

Sekundära infektioner kan uppstå i samband med keratit, eftersom CXL-behandlingen är

begränsad till den främre delen av cornean har den inte någon effekt på sådana infektioner. Ett

exempel på detta har visat sig i en studie där en patient hade en främre uveit som en följd av

keratiten och genomgick CXL-behandling. Läkning av epitelet och full tillbakagång av

hypopion observerades hos denna patient redan två dagar efter behandlingen. Trots detta

kvarstod den sekundära inflammationen i främre kammaren och antiinflammatorisk

behandling påbörjades (Makdoumi, et al., 2012).

20

Eftersom behandling av keratit bör sättas in redan innan odlingssvar har kommit, kan

det hända att CXL-behandling utförs även då odlingssvaren i efterhand visat sig vara

negativa. Sådana scenarier inträffade fyra gånger i den pilotstudie som Makdoumi, et al.

(2012) presenterat. Det kan tyckas vara olämpligt att behandla ett öga med CXL då det inte är

nödvändigt. Det angripna ögat hade å andra sidan ändå behandlats med antibiotika. Vidare är

överanvändningen av antibiotika en av orsakerna till antibiotikaresistens (Sköld, 2006).

Samtidigt går det inte att vara säker på att keratiten inte är orsakad av en patogen, även om

odlingssvaret är negativt.

Sammanfattningsvis går det att konstatera att antibiotika idag är den vedertagna

behandlingsmetoden. CXL används främst som ett komplement vid allvarliga keratiter och då

oftast i kombination med antibiotika. Fortsättningsvis borde behandling med CXL kunna

övervägas innan akut PKP utförs. Ytterligare forskning inom området krävs för att CXL ska

klassas som en vedertagen behandlingsmetod. Utifrån hittills publicerade studier kan CXL

vara ett bra behandlingsalternativ vid keratit, särskilt med tanke på antibiotikaresistens.

5.2 Laborativ studie

Det experimentella försöket med P. aeruginosa utfördes endast vid två tillfällen och enbart ett

försök visade resultat. Till följd av detta måste fler försök göras för att få ett tillförlitligt

resultat. Vid det första försöket torkade ögonen in eftersom ögonen behövde hållas fuktiga

under försökets gång i värmeskåpet (37°C).

Resultatet antyder att P. aerugniosa endast kan penetrera det skadade epitelet vilket

tyder på att denna stam av P. aerugniosa troligen inte har virulensfaktorer för penetrering.

Detta är en trolig förklaring till varför det inte var någon synlig infektion i det oskadade

epitelet. Tidigare studie har visat liknande resultat (Alarcon, et al., 2011). En annan tänkbar

orsak till varför inga bakterier lyckades penetrera epitelet kan vara att linsen inte var specifikt

tillpassade för ögat, men det borde inte vara fallet då bakterier ändå kan binda till

linsmaterialet (McLaughlin-Borlace, Stapleton, Matheson & Dart, 1998). Infektionstiden kan

också vara en tänkbar orsak till att någon infektion i det oskadade epitelet inte syns, men det

bör ej vara fallet då en tidigare studie (Yamamoto, et al., 2005) använt 30 minuter för

inkubering med P. aeruginosa. I det skadade epitelet finns det en öppning för bakterierna att

ta sig in, vilket underlättar infektionsangreppet. En indikation på detta ses i figur 2D och

infogad ruta, där bakterier är synliga precis under epitelskadan. Morfologiskt var det också

21

synligt att den experimentellt skadade cornean var svullen och deformerad, troligen åsamkat

av den bakteriella infektionen.

Ett in vitro försök innebär att experimentet inte utförs på en levande varelse utan att

experiment utförs på död vävnad. Detta medför att försöket inte ger en direkt återspegling av

verkliga keratitfall. I det laborativa experimentet finns inte ögats naturliga skyddsmekanismer

kvar, det vill säga ögonlock, tårfilm, känsel eller inflammation.

Om experimentet skulle utföras igen hade det gått att göra vissa modifieringar.

Exempelvis skulle det gå att förvara linserna i bakterielösning så att bakterierna hade haft

större chans att fästa till linsmaterialet. Alternativt skulle bakterielösning kunna droppas i

linsetui där linserna förvaras samt låta dessa bakterier få chans att tillväxa och kontaminera

linserna och att därefter applicera linserna på ögat (Dutta, Cole & Willcox, 2012;

McLaughlin-Borlace, et al., 1998). En sådan metod skulle eventuellt ge bakterierna en bättre

chans att fästa, jämfört med att endast droppa bakterielösning i linsen innan den sätts på ögat.

22

6 Slutsats

Resultatet av denna studie pekar på att corneal collagen crosslinking skulle kunna vara ett bra

behandlingsalternativ vid keratit, särskilt med tanke på den stora överanvändningen av

antibiotika och antibiotikaresistens i vårt samhälle. Idag fungerar CXL främst som ett

komplement till antibiotika, på experimentell nivå, vid svåra och allvarliga infektioner.

Därmed behövs det flera studier där CXL används som den initiala behandlingen utan att

kombineras med antibiotika, detta för att utvärdera denna metod.

Stammen av P.aeruginosa som undersöktes experimentellt verkar inte ha

virulensfaktorer för att ta sig in i ett oskadat epitel, bakterien tycks dock kunna invadera ett

skadat epitel. Dock måste fler försök göras för att fastställa resultatet.

23

Tackord

Jag vill tacka mina handledare, Camilla Mohlin och Kjell Johansson, för all hjälp, allt

engagemang och kloka svar på frågor under arbetets gång.

Ett stort tack också till min Fredrik, som trots sin obefintliga kunskap om keratiter har hjälpt

mig med korrekturläsning och gett mycket uppmuntran under dessa veckor.

Min syster Caroline ska ha tack för bidrag av artiklar.

Jag vill även rikta ett tack till min bror Samuel som bidragit med en bild och små kloka råd

under arbetets gång.

24

Referenser

Alarcon, I., Tam, C., Mun, J. J., LeDue, J., Evans, D. J. & Fleiszig, S. M. J. (2011) Factors impacting corneal epithelial barrier function against Pseudomonas aeruginosa traversal. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 52, 1386-1377.

Al-Sabai, N., Koppen, C. & Tassignon, M. J. (2010) UVA/riboflavin crosslinking as

treatment for corneal melting. Bulletin de la Société belge d’Ophtalmologie, 315, 13-17.

Anwar, H. M., El-Danasoury, A. M. & Hashem, A. N. (2011) Corneal collagen crosslinking in the treatment of infectious keratitis. Clinical Ophthalmology, 5, 1277-1280.

Bourcier, T., Thomas, F., Borderie, V., Chaumeil, C. & Laroche, L. (2003) Bacterial keratitis: predisposing factors, clinical and microbiological rewiew of 300 cases. British Journal of Ophthalmology, 87, 834-838.

Corbin, F. 3rd. (2002) Pathogen inactivation of blood components: current status and introduction of an approach using riboflavin as a photosensitizer. International Journal of Hematology, 76, 253-357.

Coster, D. J. & Badenoch, P. R. (1987) Host, microbial, and pharmacological factors affecting the outcome of suppurative keratitis. British Journal of Ophthalmology, 71, 96-101.

Dhawan, S., Rao, K. & Natrajan, S. (2011) Complications of corneal collagen cross-linking. Journal of Ophthalmology, 2011, 869015-869019.

Dutta, D., Cole, N & Willcox, M. (2012) Factors influencing bacterial adhesion to contact lenses. Molecular Vision, 18, 14-21.

Garduño-Vieyra, L., Gonzalez-Sanchez, C. R. & Hernandez-Da Mota, S. E. (2011) Ultraviolet-A light and riboflavin therapy for acanthamoeba keratitis: a case report. Case Reports in Ophthalmology, 2, 291-295.

Gkika, M., Labiris, G. & Kozobolis, V. (2011) Corneal collagen cross-linking using riboflavin and ultraviolet-A irradiation: a review of clinical and experimental studies. International Ophthalmology, 31, 309-319.

Hovakimyan, M., Guthoff, R. F. & Stachs, O. (2012) Collagen cross-linking: current status and future directions. Journal of Ophthalmology, 2012, 406850-406861.

25

Huang, A. J. W., Wichiensin, P. & Yang, M-C. (2005) Bacterial Keratitis. I: Krachmer, J. H., Mannis, M. J. & Holland, E. J. (red:er), Cornea, vol. 1, fundamentals, diagnosis and management (2:a upplagan), (s.1005-1033). Philadelphia: Mosby.

Iseli, H. P., Thiel, M. A., Hafezi, F., Kampmeier, J. & Seiler, T. (2008) Ultraviolet A/riboflavin corneal collagen cross-linking for infectious keratitis associated with corneal melts. Cornea, 27, 590-594.

Kanski, J. J. (2007) Clinical ophthalmology: a systematic approach (6:e upplagan), (s. 254-

260). Amsterdam: Elsevier Butterworth-Heinemann.

Klemm, D (2004) Anatomi cornea. Tillgänglig på Internet: http://medicomedisch.files.wordpress.com/2011/11/anatomi-cornea.jpg [Hämtad 12.05.18].

Kumar, V., Lockerbie, O., Keil, S. D., Ruane, P. H., Piatz, M. S., Martin, C. B., Ravanat, J-L., Cadet, J. & Goodrich, R. P. (2004) Riboflavin and UV-light based pathogen reduction: extent and consequence of DNA damage at the molecular level. Photochemistry and Photobiology, 80, 15-21.

Lanchares, E., Angeles del Buy, M., Cristóbal, J. A., Lavilla, L. & Calvo, B. (2011)

Biomechanical property analysis after corneal collagen cross-linking in relation to ultraviolet A irradiation time. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology, 249, 1223-1227.

Lingel, N. J. & Casser, L. (2001) Diseases of the Cornea. I: Bartlett, J. D. & Jaanus, S. D. (red:er), Clinical Ocular Pharmacology (4:e uplagan), (s. 626-632). Boston: Butterworth-Heinemann.

Lutz, J. & Lee, J. (2011) Prevalence and antimicrobial-resistance of Pseudomonas aeruginosa in swimming pools and hot tubs. International Journal of Environmental Research and Public Health, 8, 554-564.

Makdoumi, K., Bäckman, A & Mortensen, J. (2010) Evaluation of antibacterial efficacy of

photo-activated riboflavin using ultraviolet light (UVA). Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology, 248, 207-212.

Makdoumi, K., Mortensen, J. & Crafoord, S. (2010) Infectious keratitis treated with corneal

crosslinking. Cornea, 29, 1353-1357.

26

Makdoumi, K., Mortensen, J., Sorkhabi, O., Malmvall, B-O. & Crafoord, S. (2012) UVA-riboflavin photochemical therapy of bacterial keratitis: a pilot study. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology, 250, 95-102.

Martins, S. A. R., Combs, J. C., Noguera, G., Camacho, W., Wittmann, P., Walther, R., Cano, M., Dick, J. & Behrens, A. (2008) Antimicrobial efficacy of riboflavin/UVA combination (365nm) in vitro for bacterial and fungal isolates: a potential new treatment for infectious keratitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 49, 3402-3408.

McCall, A. S., Kraft, S., Edelhauser, H. F., Kidder, G. W., Lundquist, R. R., Bradshaw, H. E., Dedeic, Z., Dionne, M. J. C., Clement, E. M. & Conrad, G. W. (2010) Mechanisms of corneal tissue cross-linking in response to treatment with topical riboflavin and long-wavelength ultraviolet radiation (UVA). Investigative Ophthalmology & Visual Sience, 51, 129-138.

McLaughlin-Borlace, L., Stapleton, F., Matheson, M. & Dart, J. K. G. (1998) Bacterial biofilm on contact lenses and lens storage cases in wearers with microbial keratitis. Journal of applied microbiology, 84, 827-838.

Mencucci, R., Marini, M., Paladini, I., Sarchielli, E., Sgambati, E., Menchini, U. & Vannelli, G. B. (2010) Effects of riboflavin/UVA corneal cross-linking on keratocytes and collagen fibres in human cornea. Clinical & Experimental Ophthalmology, 38, 49-56.

Miedziak, A. I., Miller, M. R., Rapuano, C. J., Laibson, P. R. & Cohen, E. J. (1999) Risk

factors in microbial keratitis leading to penetrating keratoplasty. Ophthalmology, 106, 1166-1171.

Murray, P. R., Rosenthal, K. S. & Pfaller, M. A. (2005) Medical microbiology (5:e upplagan).

Philadelphia: Elsevier, Mosby.

Neumann, M. & Sjöstrand, J. (1992) Central microbial keratitis in a Swedish city population. Acta Ophthalmologica, 70, 160-164.

Norrby, R. & Cars, O. (2003) Antibiotika- och kemoterapi: behandling av infektioner i öppen vård (8:e upplagan). Stockholm: Liber.

O’Donnell, C. (2010) Diabetes. I: Efron, N. (red), Contact lens practice (2:a upplagan), (s.339-344). Oxford: Butterworth-Heinemann/Elsevier.

27

Pelletier, J. P. R., Transue, S. & Snyder, E. L. (2006) Pathogen inactivation techniques. Baillière’s best practice & research. Clinical Haematology, 19(1), 205-242.

Ruane, P. H., Edrich, R., Gampp, D., Keil, S. D., Leonard, R. L. & Goodrich, R. P. (2004) Photochemical inactivation of selected viruses and bacteria in platelet concentrates using riboflavin and light. Transfusion, 44, 877-885.

Salyers, A. A. & Whitt, D. D. (2002) Bacterial pathogenesis a molecular approach (2:a upplagan). Washington D.C: ASM Press.

Schaefer, F., Bruttin, O., Zografos, L. & Guex-Crosier, Y. (2001) Bacterial keratitis: a

prospective clinical microbiological study. British Journal of Ophthalmology, 85, 842-847.

Simonsen, T., Aarbakke, J. & Hasselström, J. (2004) Illustrerad farmakologi 2, sjukdomar

och behandling (2:a upplagan). Stockholm: Natur och kultur.

Sköld, O. (2006) Antibiotika och antibiotikaresistens. Lund: Studentlitteratur.

Smittskyddsinstitutet (u.å.a) Tabellariska översikter av ögoninfektioner och deras etiologi. Tillgänglig på Internet: http://www.referensmetodik.smi.se/wiki/index.php?oldid=4948 [Hämtad 12.04.24].

Smittskyddsinstitutet (u.å.b) Provtagning och transport till laboratoriet (ögoninfektioner).

Tillgänglig på Internet: http://www.referensmetodik.smi.se/wiki/index.php?oldid=6100 [Hämtad 12.04.24].

Socialstyrelsen (2002) Infektiös keratit orsakad av bakterier, svamp eller protozoer – State of the Art. Tillgänglig på Internet: http://swedeye.org/wp-content/uploads/2001-123-70.PDF [Hämtad 12.01.26].

Spoerl, E., Huhle, M. & Seiler, T. (1998) Induction of cross-links in corneal tissue.

Experimental Eye Research, 66, 97-103.

Spoerl, E., Wollensak, G. & Seiler, T. (2004) Increased resistance of crosslinked cornea against enzymatic digestion. Current Eye Research, 29, 35-40.

Spoerl, E., Wollensak, G., Dittert, D-D. & Seiler, T. (2004) Thermomechanical behavior of

collagen-cross-linked porcine cornea. Ophthalmologica, 218, 136-140.

28

Struelens, M. J. (2003) 3. The problem of resistance. I: Finch, R. G., Greenwood, D., Norrby, S. R. & Whitley, R. J. (red:er), Antibiotic and chemotherapy anti-infective agents and their use in terapy (8:e upplagan), (s. 25-47). New York: Churchill Livingstone.

Tabbara, K. F., El-Sheikh, H. & Aabed, B. (2000) Extended wear contact lens related bacterial keratitis. British Journal of Ophthalmology, 84, 327-328.

Tuft, S. J. & Matheson, M. (2000) In vitro antibiotic resistance in bacterial keratitis in London. British Journal of Ophthalmology, 84, 687-691.

Willcox, M. D. P. (2007) Pseudomonas aeruginosa infection and inflammation during contact lens wear: a review. Optometry and Vision Science, 84, 273-278.

Willcox, M. D. P. (2011) Review of resistance of ocular isolates of Pseudomonas aeruginosa and staphylococci from keratitis to ciprofloxacin, gentamicin and cephalosporins. Clinical and Experimental Optometry, 94, 161-168.

Wollensak, G., Spoerl, E. & Seiler, T. (2003a) Riboflavin/ultraviolet-A-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus. American Journal of Ophthalmology, 135, 620-627.

Wollensak, G., Spoerl, E. & Seiler, T. (2003b) Stress-strain measurements of human and porcine corneas after riboflavin-ultraviolet-A-induced cross-linking. Journal of Cataract and Refractive Surgery, 29, 1780-1785.

Wollensak, G., Spoerl, E., Wilsch, M. & Seiler, T. (2003) Endothelial cell damage after riboflavin-ultraviolet-A treatment in the rabbit. Journal of Cataract and Refractive Surgery, 29, 1786-1790.

Wollensak, G., Wilsch, M., Spoerl, E. & Seiler, T. (2004a) Collagen fibre diameter in the rabbit cornea after collagen crosslinking by riboflavin/UVA. Cornea, 23, 503-507.

Wollensak, G., Spoerl, E., Wilsch, M. & Seiler, T. (2004b) Keratocyte apoptosis after corneal collagen cross-linking using riboflavin/UVA treatment. Cornea, 23, 43-49.

Wollensak, G. (2006) Crosslinking treatment of progressive keratoconus: new hope. Current

Opinion in Ophthalmology, 17, 356-360.

29

Yamamoto, N., Yamamoto, N., Petroll, M. W., Cavanagh, H. D. & Jester, J. V. (2005) Internalization of Pseudomonas aerugniosa is mediated by lipid rafts in contact lens-wearing rabbit and cultured human corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 46, 1348-1355.

Zaidi, T., Reidy, T., D’Ortona, S., Fichorova, R., Pier, G. & Gadjeva, M. (2011) CD74 deficiency ameliorates Pseudomonas aeruginosa-induced ocular infection. Scientific Reports, 1, 58-64.

Kalmar Växjö 391 82 Kalmar Tel 0480-446200 info.nv@lnu.se Lnu.se