129
KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS Deividas Burdulis ŠILAUOGĖS (VACCINIUM L.) GENTIES AUGALŲ VAISIŲ ANTOCIANINŲ SUDĖTIES IR BIOLOGINIO POVEIKIO TYRIMAS Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai, farmacija (09 B) Kaunas, 2010

KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

  • Upload
    others

  • View
    1

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS

Deividas Burdulis

ŠILAUOGĖS (VACCINIUM L.) GENTIES AUGALŲ VAISIŲ ANTOCIANINŲ SUDĖTIES

IR BIOLOGINIO POVEIKIO TYRIMAS

Daktaro disertacija

Biomedicinos mokslai, farmacija (09 B)

Kaunas, 2010

Page 2: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

2

Disertacija rengta 2005-2009 metais Kauno medicinos universitete

Mokslinis vadovas:

Prof. Habil. Dr. Valdimaras Janulis (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai,

farmacija – 09 B)

Konsultantas:

Dr. Juozas Labokas (Botanikos institutas, biomedicinos mokslai, botanika – 04 B)

Page 3: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

3

TURINYS

SANTRUMPOS ................................................................................................................................. 3

ĮVADAS ............................................................................................................................................. 5

LITERATŪROS APŢVALGA......................................................................................................... . 9

1.1 Šilauogės (Vaccinium L.) genties augalų apibūdinimas ir panaudojimas medicinai….………9

1.1.1 Vaccinium L. genties apibūdinimas ................................................................................... 9

1.1.2. Mėlynių morfologiniai poţymiai ir paplitimas ................................................................. 9

1.1.3. Šilauogių morfologiniai poţymiai, veislių apibūdinimas ............................................... 10

1.1.4. Šilauogių paplitimas ir auginimas .................................................................................. 13

1.1.5. Mėlynių ir šilauogių vaisių augalinės ţaliavos paruošos................................................ 14

1.1.6. Mėlynių ir šilauogių vaisių fitocheminė sudėtis ............................................................. 15

1.1.7. Mėlynių ir šilauogių vaisių ir jų preparatų vartojimas medicinos praktikai ................... 18

1.2. Antocianinų apibūdinimas, struktūra, biologinės savybės ir panaudojimas……………...22

1.2.1. Antocianinų bendra apţvalga, biosintezė ....................................................................... 22

1.2.2. Antocianinų farmakokinetika ir metabolizmas............................................................... 26

1.2.3. Antocianinų biologinis poveikis ..................................................................................... 28

1.2.4. Antocianinų antioksidantinis aktyvumas ........................................................................ 28

1.3. Augalinių fenolinių junginių įtaka mitochondrijose vykstantiems procesams….………..31

2. TYRIMŲ OBJEKTAS IR METODAI ........................................................................................... 5

2.1 Tyrimų objektas…………………………………………………………………………..35

2.2 Tyrimų metodai…...............................................................................................................38

3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS .......................................................................... 44

3.1. Vaccinium L. genties augalų vaisių antocianinų ir antocianidinų sudėties ir kiekybinių

rodiklių įvairavimo vertinimas ................. ………………………………………………………45

3.1.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos sukūrimas Vaccinium myrtillus L.

vaisių vaistinių augalinių ţaliavų antocianidinų kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimui .... 45

3.1.2. Antocianinų sudėties įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisiuose, surinktuose iš

gamtinių cenopopuliacijų ......................................................................................................... 52

3.1.3. Antocianinų ir antocianidinų sudėties įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisių

vaistinėse augalinėse ţaliavose, surinktose Šiaurės Rytų Europos šalyse ............................... 58

3.1.4. Antocianinų ir antocianidinų sudėties pokyčių tyrimai Vaccinium myrtillus L. vaisiuose

rinkimo metu ............................................................................................................................ 62

3.1.5. Antocianinų ir antocianidinų sudėties įvairavimas šilauogių vaisiuose, ţievelėse,

minkštimuose ir išspaudose ..................................................................................................... 69

3.2. Vaccinium L. genties augalų vaisių ekstraktų biologinio poveikio tyrimai……………..87

3.2.1. Vaccinium L. genties rūšių augalinių ţaliavų vaisių ekstraktų antiradikalinių savybių

įvertinimas................................................................................................................................ 87

3.2.2. Vaccinium myrtillus L. vaisių etanolinio ir vandeninio ekstraktų poveikis ţiurkės širdies

mitochondrijų funkcijoms ........................................................................................................ 90

IŠVADOS ....................................................................................................................................... 102

LITERATŪROS SĄRAŠAS .......................................................................................................... 105

DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS .......................................... 128

Page 4: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

4

SANTRUMPOS

ADP adenozin-5'-difosfatas

ATP adenozin-5'-trifosfatas

ATE alfa tokoferolio ekvivalentas

BDNF smegenų neurotofinis faktorius (angl. brain-derived neurotrophic factor)

cAMP ciklinis adenozinmofosfatas

CCCP karbonilcianido-m-chlorofenilhidrazonas (angl. carbonyl cyanide m-

chlorophenylhydrazone)

CREB cAMP- atsaką rišančio baltymo veiksnys (angl. cAMP-response element-binding

protein)

DTL didelio tankio lipoproteinai

ESC efektyvioji skysčių chromatografija

IU tarptautiniai vienetai (angl. international units)

KKK mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas

MAO monoamino oksidazė

MTL maţo tankio lipoproteinai

ORAC deguonies radikalų absorbcijos talpa (angl. Oxygen radical absorbance capacity)

RNS aktyvieji azoto junginiai (angl. reactive nitrogen species)

ROS aktyvieji deguonies junginiai (angl. reactive oxygen species)

V variacijos koeficientas

V2 mitochondrijų kvėpavimo greitis antrojoje metabolinėje būsenoje

V3 mitochondrijų kvėpavimo greitis trečiojoje metabolinėje būsenoje

VEGF kraujagyslių endotelinio augimo veiksnys (angl. vascular endothelial growth factor)

Page 5: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

5

ĮVADAS

Šiuolaikinėje visuomenėje nuolat daugėjant oksidacinio streso sukeltų ligų, vis didesnis

dėmesys skiriamas šių ligų prevencijai. Pasaulyje apie 60 – 80 proc. ţmonių pirminės sveikatos

prieţiūros tikslams vartoja augalinius vaistus [5]. PSO duomenimis augaliniai vaistai yra

populiariausia ir pelningiausia tradicinės medicinos sritis [248].

Nekokybiški augaliniai produktai kelia grėsmę pacientų saugumui. Daugiau kaip 100 šalių

turi įstatymais numatytas augalinių vaistų kontrolės taisykles [248]. Efektyvumas bei galutinių

augalinių preparatų kokybė priklauso nuo naudojamų ţaliavų kokybės. Vykdant ţaliavų paruošas,

transportuojant, laikant bei gaminant fitopreparatus, yra svarbu uţtikrinti tinkamą kontrolę,

laiduojančią galutinio produkto efektyvumą bei saugumą. „Geroje vaistinių augalų auginimo ir

surinkimo praktikoje― įstatymiškai reglamentuojamos rekomendacijos bei praktika, leidţianti

uţtikrinti geros kokybės augalinių ţaliavų paruošas. Augalinių ţaliavų kokybiniai ir kiekybiniai

parametrai gali įvairuoti dėl daugybės kintančių veiksnių įtakos [81]. Patikimų, jautrių ir atrankių

analizės metodikų kūrimas ir diegimas yra vienas svarbiausių šiuolaikinio mokslo uţdavinių.

Lietuvos teritorijoje natūraliose augimvietėse auga 3 Vaccinium L. genties augalų rūšys:

mėlynė (Vaccinium myrtillus L.), vaivoras (Vaccinium uliginosum L.), bruknė (Vaccinium vitis-idea

L.). Vaccinium myrtillus L. yra labai plačiai paplitęs augalas; jis auga centrinėje ir šiaurės Europoje,

šiaurės bei vakarų Azijoje ir Šiaurės Amerikoje. Mėlynė daţna visoje Lietuvos teritorijoje [186].

Šilauogė (Vaccinium corymbosum L.) taip pat priklauso Vaccinium L. genčiai. Šilauogės laikomos

netradiciniu augalu, kuris Lietuvoje introdukuotas XX a. antroje pusėje [39, 235]. XX a. pradţioje

išvedus naujas šilauogių veisles, jos pradėtos plačiai kultivuoti. Vertinant introdukuotas šilauogių

veisles, svarbu ištirti bei palyginti vaisių cheminę sudėtį ir jos rodiklių įvairavimą, atrinkti Lietuvos

gamtinėmis sąlygomis tinkamiausias auginti veisles bei ruošti kokybišką augalinę ţaliavą.

Vertinant vaistinių augalinių ţaliavų kokybę, didţiausias dėmesys kreipiamas į biologiškai

aktyvių junginių sudėties kokybinius ir kiekinius parametrus. Vaccinium myrtillus L. vaistinės

augalinės ţaliavos kokybę reglamentuoja daugelio šalių farmakopėjos. Antocianinai – svarbiausi

mėlynių ir šilauogių vaisių veiklieji junginiai, lemiantys farmakologinį poveikį. Europos

farmakopėjoje Vaccinium myrtillus L. vaisių kokybę reglamentuoja antocianinų sudėtis ir jų kiekis.

Natūraliai Lietuvos teritorijos miškuose augančių Vaccinium myrtillus L. vaisių antocianinų sudėties

tyrimai svarbūs vertinant vietinės vaistinės augalinės ţaliavos kokybę bei racionaliai vartojant

augalinius išteklius. Vykdant vaistinių augalinių ţaliavų paruošas bei siekiant uţtikrinti gaminamų

vaistinių preparatų saugumą ir efektyvumą, tikslinga įvertinti cheminės sudėties įvairavimą bei

palyginti jį su šiaurės rytų Europos šalių regionuose surinktais pavyzdţiais. Mokslinės literatūros

Page 6: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

6

šaltiniuose duomenų apie Lietuvoje surinktų mėlynių vaisių antocianinų sudėtį ir jų kaupimosi

dėsningumus surasti nepavyko, todėl tikslinga parinkti optimaliausią paruošų vykdymo laiką, kai

ţaliavoje susikaupę maksimalūs pagrindinių veikliųjų junginių – antocianinų – kiekiai.

Mėlynių vaisių preparatai yra plačiai vartojami medicinai, todėl mėlynių vaisių

ekstraktų, preparatų biologinio poveikio tyrimai yra neabejotinai aktualūs. Tikslinga įvertinti ne tik

vaisių ekstraktų gebėjimą sujungti laisvuosius radikalus, bet ir antocianinų poveikį vienoms

svarbiausių ląstelių organelėms – mitochondrijoms, kurios ne tik aprūpina ląstelę energija oksidacinio

fosforilinimo proceso metu, bet ir palaiko viduląstelinio Ca2+

homeostazę bei atlieka svarbų vaidmenį

apoptozės procesuose. Galimybė reguliuoti mitochondrijų funkcijas biologiškai aktyviomis

medţiagomis, pvz., antocianinais, gali padėti išlaikyti ląstelės gyvybingumą arba ją sunaikinti.

Darbo tikslas: Ištirti Lietuvoje natūraliai augančių mėlynių ir introdukuotų šilauogių vaisių

antocianinų sudėtį ir jos įvairavimą bei vaisių ekstraktų biologinį poveikį.

Uţdaviniai:

1. Sukurti efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodiką antocianidinų analizei

Vaccinium L. genties augalų vaisių ţaliavose.

2. Ištirti natūraliose augimvietėse surinktų V. myrtillus L. vaisių vaistinės augalinės ţaliavos

pavyzdţių antocianinų sudėtį bei jos kiekinių rodiklių įvairavimą skirtingose

cenopopuliacijose.

3. Įvertinti šiaurės rytų Europos šalių regionuose surinktų V. myrtillus L. vaisių vaistinių

augalinių ţaliavų antocianinų bei antocianidinų sudėtį bei palyginti su Lietuvoje surinktų

vaisių augalinių ţaliavų antocianinų ir antocianidinų sudėtimi.

4. Nustatyti antocianinų ir antocianidinų sudėtį bei jos rodiklių kitimo dinamiką V. myrtillus

L. vaisiuose paruošų metu.

5. Įvertinti Lietuvos klimatinėmis sąlygomis Botanikos instituto lauko kolekcijose

auginamų šilauogių vaisių antocianinų ir antocianidinų sudėties rodmenų įvairavimą.

6. Įvertinti Lietuvoje natūraliai augančių V. myrtillus L. bei introdukuotų šilauogių vaisių

ekstraktų antiradikalinį aktyvumą.

7. Ištirti V. myrtillus L. vaisių vandeninio ekstrakto ir etanolinio ekstrakto poveikį ţiurkės

širdies mitochondrijų oksidaciniam fosforilinimui.

Mokslinio darbo naujumas. Antocianidinams nustatyti Vaccinium L. genties augalų vaisiuose

sukurta ESC metodika, pagal kurią galima atlikti efektyvų antocianidinų komplekso išskirstymą,

kokybinę bei kiekinę analizę.

Page 7: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

7

Pirmą kartą ištirtas ir įvertintas antocianinų ir antocianidinų kokybinės ir kiekinės

sudėties įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisiuose, surinktuose Lietuvos teritorijoje esančiose

augimvietėse. Atlikti palyginamieji mėlynių vaisių antocianinų ir antocianidinų kokybinės ir

kiekinės sudėties tyrimai bandiniuose, surinktuose Lietuvos respublikos ir šiaurės rytų Europos šalių

regionuose. Tyrimo metu vaisiuose įvertintas antocianinų ir antocianidinų pasiskirstymo pobūdis bei

įvairavimo dėsningumai rinkimo metu.

Įvertinta Botanikos instituto lauko kolekcijose auginamų šilauogių vaisių antocianidinų

komplekso sudėtis. Remiantis gautais tyrimų rezultatais, galima rekomenduoti daugiausiai

antocianinų kaupiančias sodinių šilauogių veisles („Berkeley―, „Northland―, „Northcountry―,

„Ama―, „Rancocas―) auginti Lietuvos gamtinėmis sąlygomis.

Atliktas Vaccinium L. genties augalų vaisių ekstraktų antiradikalinių savybių tyrimas. Kartu

su KMU BMTI Biochemijos laboratorijos mokslininkais nustatytas Vaccinium myrtillus L. vaisių

vandeninio ekstrakto ir etanolinio ekstrakto poveikis ţiurkės širdies mitochondrijų funkcijoms.

Tokio pobūdţio tyrimai yra nauji ir aktualūs, kadangi apie tokius tyrimus mokslinėje literatūroje

duomenų nepavyko rasti. Gauti tyrimų in vitro rezultatai naudingi ir informatyvūs tolimesniems in

vivo tyrimams.

Praktinė ir teorinė reikšmė. Sukurta ir optimizuota ESC metodika antocianidinų kokybinei ir

kiekinei Vaccinium myrtillus L. vaisių vaistinės augalinės ţaliavos analizei. Metodika pritaikyta

šilauogių vaisių antocianidinų kokybinės ir kiekinės sudėties tyrimams, ji gali būti panaudota ir kitų

Vaccinium L. genties augalinių ţaliavų, turinčių antocianinų, analizei. Kritinių išvystytos ESC

metodikos įteisinimo etapų parametrai uţtikrina metodikos tinkamumą ir patikimumą mėlynių ir

šilauogių vaisių augalinių ţaliavų kokybiniams bei kiekiniams rodikliams įvertinti.

Ištirta Vaccinium myrtillus L. vaisių augalinių ţaliavų antocianinų ir antocianidinų cheminė

sudėtis ir jos įvairavimas. Atlikti Vaccinium myrtillus L. gamtinėse cenopopuliacijose surinktų

augalinių ţaliavų veikliųjų junginių – antocianinų ir antocianidinų – kokybinės ir kiekinės sudėties

tyrimai naudingi vietinių augalinių resursų cheminei įvairovei įvertinti. Gauti rezultatai svarbūs

siekiant vietinius augalinius resursus panaudoti kuriant ir gaminant naujus preparatus.

Atlikus antocianinų bei antocianidinų sudėties tyrimus, nustatytas Vaccinium myrtillus L. vaisių

cheminės sudėties didelis heterogeniškumas, kurį apsprendţia skirtingas ţaliavos ruošimo laikas bei

geografinis veiksnys. Gautų tyrimų rezultatai naudingi siekiant pagerinti vaistinės augalinės

ţaliavos kokybę.

Botanikos instituto lauko kolekcijose auginamų šilauogių vaisių antocianinų ir antocianidinų

sudėties tyrimai aktualūs siekiant atrinkti vertingiausias Lietuvos gamtinėmis sąlygomis

aklimatizuotas veisles bei plėtojant šilauogių auginimą Lietuvoje.

Page 8: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

8

Atlikti Vaccinium L. genties ţaliavų ekstraktų antiradikalinio aktyvumo tyrimai. Nustatyti

ekstraktai, pasiţymintys stipriausiomis antiradikalinėmis savybėmis („Berkeley―, „Ama―,

„Northland― ir mėlynių vaisių). Įvertinus antocianinų ir antocianidinų cheminę sudėtį ir

antiradikalines savybes, nustatyta tiesioginė priklausomybė. Rezultatai gali būti naudingi kuriant

antioksidantinėmis savybėmis pasiţyminčius preparatus ar maisto papildus.

Darbo rezultatų aprobavimas. Tyrimų rezultatai pristatyti 5 konferencijose: Jaunimas siekia

paţangos (Akademija, 2007 m. balandţio 13-14 d. ) Ţmogaus ir gamtos sauga (Akademija, 2007 m.

geguţės 16-19 d.), Lithuanian Network of Food Quality and Safety (Kaunas University of

Technology, Kaunas, 2007 m.), 4th Nordic Separation Science Society (NoSSS) International

Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and

Related Techniques by Nordic separation Science Society (Tallinn, 2009 m. rugpjūčio 26 -29 d.).

Tyrimų tematika paskelbti 4 moksliniai straipsniai.

Darbo apimtis ir struktūra. Disertaciją sudaro įvadas, literatūros apţvalga, tyrimo objektas ir

metodai, tyrimų rezultatai ir jų aptarimas, išvados, literatūros sąrašas (280 literatūros šaltinių),

disertacijos tema paskelbtų darbų sąrašas. Darbe pateikta 44 paveikslai ir 31 lentelė. Disertacijos

apimtis 129 puslapiai.

Page 9: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

9

1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1 Šilauogės (Vaccinium L.) genties augalų apibūdinimas ir panaudojimas

medicinai

1.1.1. Vaccinium L. genties apibūdinimas

Šilauogės (Vaccinium L.) gentis priklauso virţinių (Ericaceae Juss.) šeimai. Genčiai

priskiriama apie 300-400 rūšių, paplitusių nuo arktinės iki tropikų zonos. Vieni sistematikai šią gentį

priskiria virţinių – Ericaceae Juss. šeimai, kiti – savarankiškai šilauoginių – Vacciniaceae S.P. Gray

šeimai. Tai visţaliai, ilgai ţaliuojantys ir kasmet lapus numetantys krūmokšniai, krūmai ir neaukšti

medeliai [131, 186].

Lapai praţanginiai, ištisiniai, odiški. Ţiedai kekėse, rečiau pavieniai, rutuliški arba

varpiški. Ţiedynkočiai trumpi. Vainikėlis nukrintantis. Kuokelių 8-10, dvigubai daugiau nei

vainiklapių. Mezginė apatinė, keturlizdė ar penkializdė, purka galviška. Vaisius sultinga arba

miltinga uoga. Šios genties sistematika yra sudėtinga ir vis dar tobulinama [36, 186].

Gentis skirstoma į 2 pogenčius (Oxycoccus ir Vaccinium), kurie savo ruoţtu dar skirstomi

į atskiras sekcijas. Kai kurie botanikai Oxycoccus pogentį priskiria savarankiškai genčiai. Mėlynės

(Vaccinium) ir šilauogės (Cyanococcus) sekcijos priskiriamos Vaccinium pogenčiui [36, 64, 186,

233, 234, 249].

Lietuvoje natūraliose augimvietėse auga 3 augalų rūšys, priklausančios Vaccinium L.

genčiai: mėlynė (Vaccinium myrtillus L.), vaivoras (Vaccinium uliginosum L.), bruknė (Vaccinium

vitis-idea L.). Vaismedţių soduose ir sodybose auginama keletas šilauogių rūšių ir veislių [186].

1.1.2. Mėlynių morfologiniai poţymiai ir paplitimas

Vaccinium myrtillus L. – vasarţalis, nedidelis, šakotas, daugiametis maţdaug 30 - 50 cm

aukščio krūmokšnis, kurio amţius gali siekti iki 30 metų. Šakelės stačios, briaunotos, ţalios. Apatinė

stiebo dalis sumedėjusi, šakų viršūnės išlieka ţalios, minkštos ir ţiemą gali apšalti. Šakniastiebis

ilgas, šliauţiantis. Lapai praţanginiai, odiški, kiaušiniški arba plačiai ovalūs, pliki, nusmailėjusia

viršūne, trumpakočiai, smulkiai dantytais kraštais, 1,15 - 3 cm ilgio, 0,6 – 1,8 cm pločio, numetami

kiekvienais metais. Pavasarį ką tik išsiskleidę lapai būna rausvi, vėliau tampa gelsvai ţali, o rudenį

paraudonuoja. Pavieniai rutuliški rausvai ţalsvi ţiedai išauga ant trumpų 2,5 – 3,5 mm ilgio

ţiedkočių lapų paţastyse. Taurelė priaugusi prie mezginės, penkiaskiautė, rečiau keturskiautė, vos

įţiūrima. Vainikėlis rutuliškas arba ąsotiškas blyškiai ţalios, baltos ar rausvos spalvos, suaugtinis,

Page 10: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

10

pūstas, su 5 trumpomis, bukomis skiautėmis, 4 - 7 mm pločio, 3 - 5 mm ilgio. Kuokelių 10 arba 8,

kuokelių koteliai lygūs, dulkinės akuotuotos, uţsibaigiančios viršūninėmis angelėmis. Uoga

rutuliška, šiek tiek paplokščia, 5 – 12 mm skersmens, mėlynos ar melsvai juodos spalvos, su

pilkomis apnašomis arba be jų, violetiniu, mėsingu mezokarpiu su daugybe smulkių, rudų, ovalių

sėklų. Uogos viršūnėje yra taurelės liekana, kuri atrodo kaip apvali raukšlė [28, 96, 176].

Literatūros duomenimis Lietuvos teritorijoje aptinkamos dar 4 mėlynių atmainos: Vaccinium

myrtillus var. epruinosum Aschers – uogos blizgančios ir be apnašų; Vaccinium myrtillus var.

leucocarpum Koch – uogos gelsvai baltos; Vaccinium myrtillus var. roseolo – violaceum Butkus et

Stack. – uogos roţinės, turinčios violetinį atspalvį; Vaccinium myrtillus var. pseudotypicum – uogos

raudonai violetinės, beveik juodos, tačiau minkštimas bespalvis [10, 28, 35, 63, 96, 176, 186, 269].

Lietuvos gamtinėmis sąlygomis mėlynės praţysta geguţės mėn. pabaigoje ir ţydi iki birţelio mėn.

vidurio, o pavienių ţiedų galima rasti iki rudens. Uogos prinoksta liepos mėn. pradţioje ir ant

šakelių laikosi iki rugsėjo mėn. [10, 176, 186].

Mėlynės labiausiai paplitusios centrinėje ir šiaurės Europoje, šiaurės bei vakarų Azijoje ir

Šiaurės Amerikoje. Daţniausiai auga vidutinio drėgnumo ir drėgnuose, nelabai ūksminguose

miškuose. Mėgsta rūgščius (pH 4-5), puveningus dirvoţemius. Auga pelkėtuose pušynuose,

eglynuose, virţynuose, rečiau berţynuose, kartais kimininėse pelkėse, aukštesnėse vietose. Šiaurės

Amerikoje mėlynės auga kalnuotuose bei subalpiniuose Britų Kolumbijos, Arizonos ir Naujojo

Meksiko regionuose. Grenlandijos saloje augančios mėlynių populiacijos laikomos senovinės

introdukcijos rezultatu [96, 176].

Mėlynės paplitusios visoje Lietuvos teritorijoje. Literatūros šaltinių duomenimis Lietuvoje

yra apie 18000 ha mėlynių. Derlingais metais iš 1 ha ištisinio uogyno galima pririnkti net iki 1200

kg uogų. Mėlynes ypač sunku auginti, todėl jos yra retai kultivuojamos [28, 35, 186].

1.1.3. Šilauogių morfologiniai poţymiai, veislių apibūdinimas

Šilauoges auginti kultūroje pradėta JAV 1906 m. Šilauogių veislių registre yra apie 130

veislių. Šilauogės priskiriamos prie netradicinių augalų, kurie buvo introdukuoti Lietuvoje XX a. II-

oje pusėje. Sodinių šilauogių tyrimai Lietuvoje pradėti Botanikos institute 1969 m., siauralapės

šilauogės – 1986 m. Botanikos instituto lauko kolekcijose auginama 19 sodinių šilauogių veislių ir 1

siauralapės šilauogės veislė [235].

Daugiausia šilauogių auga Šiaurės Amerikoje. Šiuo metu priskaičiuojama net 36 šilauogių

rūšys, kurios skirstomos į tris grupes: ţemaūges, aukštaūges ir ,,triušiaakes‖. Ţemaūgių šilauogių

grupei priklauso augalai, kurių krūmo aukštis siekia iki 1 m, aukštaūgių – krūmo aukštis iki 3–5 m, o

Page 11: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

11

,,triušiaakių‖ – krūmo aukštis iki 9 m. Didţiausią ūkinę vertę šilauogių kultivavimo raidoje turėjo

šios rūšys: Vaccinium angustifolium Ait. (ţemaūgių šilauogių grupė), V. corymbosum L., V.

formosum Andrews (aukštaūgių šilauogių grupė) ir V. virgatum Aiton (,,triušiaakių‖ šilauogių

grupė). Šios rūšys Šiaurės Amerikoje auginamos kultūroje ir jų pagrindu išvestos produktyvios

sodinių šilauogių (Vaccinium×covilleanum Butkus et Pliszka, sinonimas V. corymbosum auct. non

L.) veislės, kurių vaisiai pasiţymi skirtingu ir unikaliu skoniu bei savybėmis [39, 235].

Sodinė šilauogė – tai vasarţalis 1,5-1,8 m aukščio krūmas storais stačiais stiebais. Lapai

standūs, ţalios spalvos. Lapai lancetinės arba eliptinės formos, dantytais kraštais 10 – 80 mm ilgio ir

5 – 35 mm pločio. Ţiedai varpelio ar rutulio formos, spalva varijuoja nuo baltos, balsvai roţinės ir

raudonos, kartais iki ţalsvos. Uogos brendimo pradţioje ţalsvos spalvos, brendimo viduryje

rausvos, roţinės spalvos ir brendimo pabaigoje mėlynos ar melsvai juodos, su vaškine apnaša.

Uogos 15-20 mm skersmens, bespalviu minkštimu, auga kekėmis [36, 233, 234, 235].

Botanikos instituto lauko kolekcijose auginamų sodinių šilauogių veislės, naudotos mūsų tyrimuose:

„AMA― – veislė išvesta Vokietijoje sukryţminus Vaccinium corymbosum L.×V.

angustifolium Ait. Veislė vidutinio ankstyvumo – uogos prinoksta liepos pabaigoje,

rugpjūčio pradţioje. Jos juosvai mėlynos ar juodos, su neţymia vaškine apnaša, apvaliai

ropiškos, vidutinio stambumo, susitelkusios apvaliose tankiose kekėse, skanios. Veislė

vidutinio derlingumo. Krūmai augūs, jų aukštis iki 1,8 m, glausti. Lapai tamsiai ţali,

blizgantys, lygiakraščiai, elipsiški. Ţiedai cilindriški, ryškiai balti [36, 233, 234].

„BERKELEY― – veislė išvesta F. V. Kovill, G. M. Darrow ir F. A. Gilbert 1932 m.

kryţminant „Stanley×GS-149― („Jersey―ׄPioneer―) Nju Dţersi valstijoje. Kultivuoti

pradėta 1949 m. Uogos prinoksta rugpjūčio mėn. Jos šviesiai mėlynos su stipria vaškine

apnaša, stambios ar labai stambios, aromatingos, tvirta odele. Veislė derlinga, vidutinio

vėlyvumo. Krūmai augūs (iki 1,8 m), statūs ar šiek tiek išsiskleidę. Lapai stambūs, šviesiai

ţali, atvirkščiai kiaušiniški ar elipsiški. Ţiedai stambūs, balti, su kreminiu atspalviu.

„BLUECROP― – veislė išvesta F. V. Kovill ir O. M. Friman 1934 m. sukryţminus „GM 37

(„Jersey―ׄPioneer)―ׄCU-5 („Stanley―ׄJune―)― Nju Dţersi valstijoje. Kultivuojama nuo

1952 m. Tai pati populiariausia pasaulyje veislė. Uogos stambios ar vidutinio dydţio,

ropiškos, šviesiai mėlynos su stipria vaškine apnaša, saldţiarūgštės, aromatingos. Veislė

labai derlinga. Pagal uogų prinokimą tai vidutinio ankstyvumo veislė. Krūmai vidutinio

augumo (1,5-1,8 m), statūs ar išsiskleidę. Lapai vidutinio dydţio ar stambūs, tamsiai ţali,

blizgantys, lygiakraščiai. Ţiedai vidutinio dydţio, balti [ 233, 234, 235].

Page 12: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

12

„DIXI― – šią veislę išvedė F.W. Kovill, sukryţminęs („Jersey―ׄPioneer―)ׄStanley― 1930

m. Uogos stambios, šiek tiek suplotos, šviesiai mėlynos su pilkšva apnaša, rūgštoko skonio,

aromatingos. Vidutinio derlumo. Iš krūmo priskinama 2,4 kg, šimto uogų masė 200 g. Tai

vėlyva veislė. Krūmai augūs, išsiskleidę, ūgliai reti. Tai viena iš atspariausių nepalankioms

ţiemojimo sąlygoms veislių. Lapai stambūs, kiaušiniški, elipsiški, beveik plikomis

apatinėmis lapo pusėmis, ţali. Ţiedai labai stambūs, balti [36, 233, 234, 235].

„HEERMA― – veislė išvesta Vokietijoje. Uogos vidutinio stambumo, apvaliai ropiškos,

tamsiai mėlynos su šviesia vaškine apnaša, susitelkusios į nedideles kekes, saldţiarūgštės,

aromatingos. Veislė vidutinio ankstyvumo ir vidutinio derlumo. Krūmai augūs (aukštesni nei

1,5 m), glausti, vienmečiai ūgliai ţalsvi. Lapai dideli, lancetiški, tamsiai ţali, blizgantys,

beveik lygiakraščiai. Ţiedai stambūs, siaurai cilindriški, balti su kreminiu atspalviu.

„NORTHBLUE― – veislė išvesta JAV kryţminant (G65ׄAshwort―)×(„Dixi―×ţemaūgė

„Michigan LB-1―). Uogos vidutinio dydţio ar didelės, tamsiai mėlynos su vaškine apnaša,

saldţiarūgštės, skanios. Iš krūmo priskinama apie 2,0-3,0 kg uogų. Uogos nėra stambios.

Krūmai vešlūs, kompaktiški ar šiek tiek išsiskleidę, ţemi, dekoratyvūs. Lapai vidutinio

dydţio, ţali. Ţiedai vidutinio stambumo, balti, neišsiskleidę – ţalsvai balti [36, 233].

„NORTHCOUNTRY― – veislė išvesta kryţminant B-6×R2P4 1983 m. Minesotos

universitete. Uogos vidutinio dydţio ar didelės, šviesiai mėlynos su vaškine apnaša, apvalios,

saldţiarūgštės, skanios. Uogos nėra stambios. Krūmai ţemi, kompaktiški ar šiek tiek

išsiskleidę, dekoratyvūs. Lapai ţali, lancetiški. Ţiedai vidutinio dydţio, balti.

„NORTHLAND― – veislė išvesta JAV 1948 m. sukryţminus „Berkeley―×H-19 (V.

angustifolium× „Pioneer―). Uogos vidutinio dydţio, apvalios ar šiek tiek suplotos, mėlynos

su vaškine apnaša, susitelkusios nedidelėse kekėse, saldţiarūgštės, beveik be aromato,

skanios. Veislė derlinga. Krūmai vidutinio augumo, tankūs, po sniegu kartais išlinkstantys.

Lapai vidutinio stambumo, ryškiai ţali, ovalūs. Ţiedai balti, smulkūs, turintys vos pastebimą

kreminį atspalvį [36, 233, 235].

„PATRIOT― – veislė išvesta 1954 m. JAV sukryţminus („Dixi―ׄMichigan LB-

1―)ׄEarliblue―. Uogos labai stambios, ropiškos, mėlynos su vaškine apnaša, susitelkusios į

tankokas kekes, saldţiarūgštės, labai skanios. Gana derlinga. Krūmai vidutinio augumo,

statūs, dekoratyvūs. Lapai vidutinio dydţio, ovalūs, gerai matomas jų gyslotumas, ţali.

Ţiedai vidutinio dydţio, balti, neišsiskleidę – rausvi.

„PUTTE― – veislė išvesta Švedijoje, Balsgardene. Tai viena atspariausių šalčiams veislių,

iškenčianti net –40oC. Uogos smulkios, ropiškos, juodos, blizgančios ar su menka melsva

Page 13: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

13

vaškine apnaša, susitelkusios į tankokas kekes, saldţiarūgštės, labai skanios. Gana derlinga.

Krūmai ţemi ar vidutinio augumo, išsiskleidę, dekoratyvūs. Lapai vidutinio dydţio,

lancetiški, ryškiai ţali. Ţiedai vidutinio dydţio, balti.

„RANCOCAS― – ši veislė išvesta F. V. Kovill 1915 m. JAV sukryţminus

(„Brooks―ׄRassel―)ׄRubel―). Kultivuoti pradėta 1926 m. Uogos nėra didelės, šviesiai

mėlynos su stipria vaškine apnaša, susitelkusios į labai kompaktiškas ir nedideles kekes,

apvalios ar šiek tiek suplotos, saldţios, be aromato. Veislė vidutinio ankstyvumo, derlinga.

Krūmai vidutinio augumo, tankūs, reikalaujantys kasmetinio genėjimo, vienmečiai ūgliai

ţiemą rausvi. Lapai tamsiai ţali, smulkūs, elipsiški, ryškiai pjūkliškai dantytais kraštais.

Ţiedai vidutinio dydţio, balti su neryškiu rausvu atspalviu.

„NORTH HOLNA― – uogos vidutinio stambumo, apvaliai ropiškos, tamsiai mėlynos su

šviesia vaškine apnaša, susitelkusios į nedideles kekes, aromatingos. Veislė vidutinio

ankstyvumo ir vidutinio derlumo. Krūmai augūs (aukštesni nei 1,5 m), glausti, vienmečiai

ūgliai ţalsvi. Lapai nedideli, lancetiški, tamsiai ţali, blizgantys, beveik lygiakraščiai. Ţiedai

smulkūs, siaurai cilindriški, balti su kreminiu atspalviu [36, 233, 234, 235, 249].

Siauralapė šilauogė – vasarţalis, 10-30 (50) cm aukščio krūmokšnis su gausiai besišakojančiu

šakniastiebiu. Šakelės apvalios, iš pradţių ţalios, vėliau paruduoja, plikos. Lapai elipsiški ar siaurai

elipsiški, smailiaviršūniai, dantyti (kartais lygiakraščiai), ţali ar melsvai ţali, pliki, tik apatinėje

pusėje palei gyslas kartais šiek tiek plaukuoti. Ţiedai trumpuose, tankiuose ţiedynuose po keletą.

Vainikėlis baltas, kartais rausvai dryţuotas, cilindriškas ar ąsotiškas. Ţydi balandţio – geguţės mėn.

Uogos mėlynos su vaškine apnaša, kartais juodos, blizgančios ar blankios, retai – baltos, rutuliškos,

maţos, sveria (0,15) 0,3-0,5 (0,9) g, prinoksta liepos – rugpjūčio mėn. Jos rūgščiasaldės arba

saldţios [36, 161, 233, 234, 235].

Siauralapės šilauogės veislė:

„CHIGNECTO― – veislė išvesta Kanadoje atrinkus kloną iš sukultūrintos savaiminės

populiacijos. Kultivuojama nuo 1977 m. Uogos tamsiai mėlynos, su melsva vaškine apnaša,

rutuliškos, smulkios, susitelkusios nedidelėse kekėse, skanios. Veislė vidutinio derlumo,

ankstyva. Krūmai 0,8-0,9 m aukščio, glausti. Lapai šviesiai ţali, blizgantys, elipsiški. Ţiedai

cilindriški, balti, sutelkti ţiedynuose po 3-12. Veislė atspari šalčiui [36, 233, 234, 235].

1.1.4. Šilauogių paplitimas ir auginimas

Natūraliai augančių šilauogių aptinkama tik rytinėje ir šiaurės centrinėje Šiaurės Amerikos

dalyje [27]. XX a. pradţioje išvedus naujas šilauogių veisles, jos pradėtos plačiai auginti net tik

Page 14: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

14

Šiauriniame, bet ir Pietiniame pusrutulyje: Argentinoje, Čilėje, Pietų Afrikoje, Australijoje, Naujoje

Zelandijoje. Pastaruoju metu daugiausia šilauogių auginama JAV, aukštaūgių šilauogių veislės

kultivuojamos pietinėje Kalifornijos valstijoje. Kanadoje šilauogės sudaro daugiau kaip pusę

auginamų uoginių kultūrų. Europoje šilauogės introdukuotos 1930 m. Pirmiausiai pradėtos auginti

Olandijoje ir Vokietijoje, vėliau ir kitose šalyse. Išvestos šilauogių veislės auginamos Vokietijoje,

Lenkijoje, Skandinavijos šalyse, Vengrijoje. Šiaurės pusrutulyje šilauogės priklausomai nuo veislės

ir regiono geografinės padėties prinoksta geguţės – rugsėjo mėn., o Pietiniame pusrutulyje –

lapkričio – vasario mėn. [254].

Lietuvos gamtinėmis sąlygomis šilauogių vaisiai prinoksta liepos – rugpjūčio mėn.

Lietuvoje šilauogių introdukcija pradėta XX a. II-oje pusėje. Nepaisant daugelio ribojančių

introdukciją veiksnių, aklimatizuotos šilauogių veislės sėkmingai auginamos plantacijose. Lietuvos

respublikos teritorija nedidelė, tačiau agrometeorologinės sąlygos joje nevienodos. Lietuvos

teritorija padalyta į 4 mezoklimatinius rajonus ir 10 parajonių. Nustatyta, jog ne visi mezoklimatiniai

Lietuvos rajonai yra palankūs sodinių ir siauralapių šilauogių veislėms auginti. Daugiamečių tyrimų

rezultatai leidţia daryti išvadas, kad šilauogės neblogai auga ir kai kuriais metais gana gerai dera

Pietryčių aukštumų mezoklimatinio rajono Aukštaičių parajonyje [233, 234, 235].

Šilauogėms auginiti tinkamiausi yra rūgštūs lengvi ir humusingi priesmėliai,

aukštapelkių durpė, optimaliausias dirvoţemio pH 4.0-5.0 [235, 254]. Tinkamiausios šilauogei

auginti yra pietryčių ir vakarų Lietuvos agroklimatinės zonos. Lietuvos Botanikos instituto

mokslininkai nustatė, kad ankstyvųjų ir vidutinio ankstyvumo sodinių šilauogių veislės augintinos

šiltesniuose Lietuvos rajonuose. Lietuvoje introdukuotos šilauogių veislės gana atsparios

nepalankiems ţiemojimo veiksniams, sausrai, ligoms ir kenkėjams. Lietuvos teritorijoje

kultivuojamos šilauogės labiausiai nukenčia nuo vėlyvųjų pavasarinių šalnų, todėl joms auginti

ţemos vietos netinka [235].

1.1.5. Mėlynių ir šilauogių vaisių augalinės ţaliavos paruošos

Medicinai vartojami mėlynių vaisiai (Myrtilli fructus), rečiau – lapai (Myrtilli folium).

Mėlynių vaisių vaistinė augalinė ţaliava aprašyta daugelio šalių farmakopėjose: Jungtinių Amerikos

Valstijų, Europos, Italijos, Prancūzijos, Šveicarijos, Austrijos, Vokietijos. Vaisiai vartojami švieţi,

uţšaldyti ar dţiovinti [28, 35, 63, 269].

Mėlynių vaisių paruošos atliekamos jiems sunokus liepos – rugsėjo mėn. natūraliose

augimvietėse, miškuose [96, 176]. Didţiausi mėlynių vaisių kiekiai surenkami Lenkijoje,

Rumunijoje, Bulgarijoje, Skandinavijos šalyse, Albanijoje, Rusijoje ir Alpių kalnų regiono šalyse.

Page 15: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

15

Nustatyta, jog didţiausias mėlynių derlius uţauga vidutinio drėgnumo ir vidutinio pavėsio miškuose

[10, 28, 176].

Šilauogių vaisiais susidomėta ir intensyviai pradėta tyrinėti tik XX a. pradţioje.

Šilauogių vaisių paruošos atliekamos vaisiams visiškai sunokus. JAV ir Kanada yra didţiausios

šilauogių vaisių tiekėjos ir vartotojos pasaulyje. Meino valstijoje (JAV) uţauginama 25 proc. visų

šalies šilauogių derliaus [254]. Europoje daugiausiai šilauogių vaisių uţauginama Prancūzijoje,

Italijoje, Austrijoje. Čilė laikoma didţiausia šilauogių vaisių eksportuotoja Pietiniame pusrutulyje.

Nemaţi kiekiai vaisių uţauginami Australijoje, Pietų Afrikos Respublikoje. Šilauogės sėkmingai

auginamos ir Lietuvoje. Pirmoji komercinė plantacija įkurta Radviliškio rajone [235, 254].

Mėlynių ir šilauogių vaisiai laikomi dţiovinti arba uţšaldyti (-18 ºC temperatūroje).

Ruošiant mėlynių ir šilauogių ţaliavas dideliais kiekiais, vaisiai pramoniniu būdu gali būti

dţiovinami 100 – 105 ºC temperatūroje dţiovyklose [10]. Aukštesnių dţiovinimo temperatūrų turėtų

būti vengiama, kadangi antocianinai yra termolabilūs. Nedidelius vaisių kiekius galima dţiovinti

gerai vėdinamoje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje patalpoje, kambario temperatūroje.

Dţiovinti vaisiai laikomi orui laidţiose pakuotėse, apsaugoti nuo šviesos, drėgmės, 18 – 25 ºC

temperatūros patalpoje [10, 35, 63, 160].

Mėlynių ir šilauogių vaisiai turėtų būti transportuojami atsargiai, kadangi paţeidus vaisiaus

vientisumą, prasideda antocianinų oksidacijos procesai. Eksperimentiniais tyrimais įrodyta, jog

antioksidantiniam aktyvumui neturi įtakos kaip laikomi vaisiai – dţiovinti ar uţšaldyti, tačiau gali

turėti įtakos suminiam antocianinų kiekiui. Pastebėtas antocianinų kiekio sumaţėjimas dţiovinant

vaisius aukštesnėse temperatūrose [158, 223].

1.1.6. Mėlynių ir šilauogių vaisių fitocheminė sudėtis

Švieţiuose mėlynių vaisiuose daţniausiai būna iki 90 proc. vandens, 3-7 proc. cukrų

(sacharozės, gliukozės, fruktozės, galaktozės, ksilozės, arabinozės), pektininių medţiagų (0,6 proc.),

triterpenų [10, 28, 35, 231, 258]. Nustatyti vitaminai: askorbo rūgštis, tiaminas, pantoteno rūgštis,

nikotinamidas, β- karotenas [10, 96].

Mėlynių vaisiuose nustatyti flavonoidai: miricetinas, kvercitrinas, izokvercitrinas,

hiperozidas ir astragalinas [10, 28, 35, 82], katechino (0,02 proc.), epikatechino (0,07 proc.)

proantocianidinų: B-1, B-2, B-3, B-4; neprinokusiuose vaisiuose nustatyti nedideli kiekiai

galokatechinų ir epigalokatechinų [124, 269].

Page 16: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

16

Išskirti ir nustatyti antocianinų - delfinidino, cianidino, petunidino, peonidino ir malvidino

-glikozidai: delfinidin-3-galaktozidas, delfinidin-3-gliukozidas, cianidin-3-galaktozidas, delfinidin-

3-arabinozidas, cianidin-3-gliukozidas, petunidin-3-galaktozidas, cianidin-3-arabinozidas, petunidin-

3-gliukozidas, peonidin-3-galaktozidas, petunidin-3-arabinozidas, peonidin-3-gliukozidas, malvidin-

3-galaktozidas, peonidin-3-arabinozidas, malvidin-3-gliukozidas, malvidin-3-arabinozidas [74, 106,

111, 123]. Pastaraisiais metais vaisiuose nustatyta antocianinų disacharidų (delfinidin-3-O-

sambubiozidas ir cianidin-3-O-sambubiozidas), kurių cukrinę dalį sudaro gliukozės ir ksilozės

molekulės [55].

1 lentelė. Mėlynių vaisių sauso ekstrakto antocianinų sudėtis (Amerikos vaistinių augalų

farmakopėja, 2001 ir Rahman M. M. et al., 2006)

Antocianinai

Vidutinis kiekis, proc.

Amerikos vaistinių augalų Rahman M. M. et al.,

farmakopėja 2006

Delfinidin-3-arabinozidas

Delfinidin-3-gliukozidas

Delfinidin-3-galaktozidas

Cianidin-3-arabinozidas

Cianidin-3-gliukozidas

Cianidin-3-galaktozidas

Peonidin-3-arabinozidas

Peonidin-3-gliukozidas

Peonidin-3-galaktozidas

Petunidin-3-arabinozidas

Petunidin-3-gliukozidas

Petunidin-3-galaktozidas

Malvidin-3-arabinozidas

Malvidin-3- gliukozidas

Malvidin-3-galaktozidas

4,32

5,81

5,04

2,19

3,42

2,75

0,22

1,31

0,34

1,08

3,67

1,89

0,81

3,35

1,27

4.23

4.67

4.91

3.10

4.12

4.08

0.24

1.69

0.39

0.96

2.89

1.51

0.52

3.01

1.98

Bendras kiekis 37,47 38,29

Ţaliavos kokybę apsprendţia biologiškai aktyvių junginių kiekis, todėl antocianinų suminis

kiekis daţnai perskaičiuojamas cianidin-3-gliukozidu ir išreiškiamas procentais. Mokslinėje

literatūroje nurodomi skirtingi antocianinų kiekiai vaisių ţaliavose. Antocianinų kiekis mėlynių

Page 17: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

17

vaisiuose įvairuoja nuo 0,1 iki 0,5 proc. [28, 35, 176]. Europos farmakopėja reglamentuoja

minimalų suminį antocianinų kiekį, kuris turi būti ne maţesnis kaip 0,3 proc. [63], Jungtinių

Amerikos Valstijų vaistinių augalų farmakopėja nurodo suminį 0,3 - 0,7 proc. antocianinų kiekį

[10].

Mėlynių vaisiuose nustatyta nuo 5 iki 12 proc. taninų, daţniausiai katechino tipo [10, 28,

269]. Neprinokusiuose vaisiuose nustatyta fenolinių rūgščių: galo, protokatecho, m-

hidroksibenzoinės ir p-hidroksibenzoinės, vanilino, chlorogeno, kavos, siringo, ferulo bei o-, m- ir p-

kumaro. Identifikuota keletas fenolinių rūgščių esterių su cukrumis: 1-O-hidroksicinamil- β-D-

gliukozė ir p-kumarilgliukozė. Nustatyta organinių rūgščių: obuolių, chinino, pieno, oksalo, gintaro,

citrinų [10, 94, 258].

Mėlynių vaisiuose identifikuota apie 109 lakieji junginiai. Paţymėtini alifatiniai

alkoholiai, aldehidai ir ketonai, terpeno dariniai, aromatiniai junginiai ir esteriai. Nustatyti trys

pagrindinai junginiai, suteikiantys būdingą mėlynėms kvapą: trans-2-heksenalis, etil-3-metilbutiratas

ir etil-2-metilbutiratas [96]. Neprinokusiuose vaisiuose nustatyta iridoidinų glikozidų:

monotropeino ir asperulozido [10, 269]. Mėlynių vaisių sėklose nustatyta baltymų, riebalinio

aliejaus, kurio sudėtyje yra sočiųjų, mono ir polinesočiųjų riebiųjų rūgščių [22].

Mėlynių lapuose nustatyta fenolinių rūgščių, flavonoidų (aglikono kvercetino

ramnogliukozidai, arabinozidai ir gliukuronozidai) pėdsakai, chinolizidino grupės alkaloidų

(mirtino, epimirtino), iki 10 proc. katechinų ir proantocianidinų [10, 269].

Šilauogių vaisiuose nustatyta flavonolių grupės darinių: kvercetino, miricetino [85], flavan-

3-olių grupės atstovų: katechino ir epikatechino bei proantocianidinų [200, 227, 254]. Vaisiuose

nustatyti delfinidino, cianidino, petunidino, peonidino ir malvidino glikozidai: malvidin-3-

galaktozidas, delfinidin-3-galaktozidas, delfinidin-3-arabinozidas, petunidin-3-galaktozidas,

petunidin-3-arabinozidas, malvidin-3-arabinozidas, cianidin-3-gliukozidas, cianidin-3-galaktozidas,

cianidin-3-arabinozidas, delfinidin-3-gliukozidas, malvidin-3-gliukozidas, peonidin-3-gliukozidas,

peonidin-3-galaktozidas, peonidin-3-arabinozidas ir petunidin-3-gliukozidas, cianidin-3-

(malonil)gliukozidas, cianidin-3-(6‘‘-acetil)galaktozidas, delfinidin-3-(malonil)gliukozidas,

malvidin-3-(malonil)gliukozidas, delfinidin-3-(6‖-acetil)gliukozidas, peonidin-3-(6‖-

acetil)galaktozidas, cianidin-3-(6‖-acetil)gliukozidas, malvidin-3-(6‖-acetil)galaktozidas, petunidin-

3-(6‖-acetil)gliukozidas, peonidin-3-(6‖-acetil)gliukozidas, malvidin-3-(6‖-acetil)gliukozidas [74,

157, 227, 261, 262, 268]. Lenkijoje auginamų šilauogių veislių švieţiuose vaisiuose nustatyta nuo

0,097 iki 0,260 proc., Estijoje – nuo 0,125 iki 0,405 proc. antocianinų, perskaičiuojant ciandin-3-

gliukozidu [222, 236].

Page 18: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

18

Šilauogių vaisiuose nustatyta fenolinių rūgščių: chlorogeno [227, 223], hidroksicinamo

[216,]; 0,54 proc. organinių rūgščių: obuolių, chinino, citrinų [94]; apie 80-90 proc. vandens; 10-11

proc. cukrų (gliukozės, fruktozės); 0,74 proc. baltymų; 0,33 proc. riebalų; pektinų; vitaminų:

askorbo rūgšties, tiamino, riboflavino, nikotino rūgšties, pantoteno rūgšties, piridoksino, folio

rūgšties, retinolio, tokoferolio bei karotenoidų. Šilauogių vaisiuose nustatyta mineralinių medţiagų

kalcio, vario, geleţies, magnio, mangano, fosforo, kalio, seleno, natrio, cinko druskų pavidalu [236,

254].

1.1.7. Mėlynių ir šilauogių vaisių ir jų preparatų vartojimas medicinos praktikai

Mėlynių vaisių gydomosios savybės ţinomos nuo Viduramţių laikų, tačiau plačiau

pradėta vartoti tik XVI amţiuje [28]. Mėlynių vaisiai buvo vartojami skorbutui, diabetui,

šlapimtakių susirgimams, tulţies ligoms, kosuliui, plaučių tuberkuliozei gydyti. Vėliau dţiovintų

vaisių nuovirai dėl jų sutraukiamojo bei antibakterinio poveikio buvo vartojami diarėjai, dizenterijai,

burnos ir gerklės uţdegimams gydyti [28, 96, 176, 173]. Mėlynių vaisių arbatos, sirupai buvo

vartojami laktacijai slopiniti, dizurijai gydyti [28]. Mėlynių lapų nuovirai buvo vartojami diabetui

gydyti [35, 174].

Mėlynių vaisių preparatų farmakologinį poveikį apsprendţia kompleksas antrinių

metabolitų. Vieni svarbiausių biologiškai aktyvių junginių grupių yra antocianinai, todėl šios grupės

junginių tyrimams skiriamas didţiulis dėmesys. Nustatyta, kad mėlynių vaisių preparatuose esantys

antocianinai, pasiţymi stipriu antioksidantiniu [17, 255], priešvėţiniu poveikiu [17, 50, 54, 132,

143]. In vivo tyrimais nustatyta, jog antocianinai stabilizuoja skaidulų kolageną, skatina jo sintezę,

maţina kapiliarų trapumą, pralaidumą ir trombocitų agregaciją, pasiţymi antiedeminiu poveikiu [10,

24, 28, 35, 152, 173].

Mėlynių bei šilauogių vaisių antocianinai suriša laisvuosius radikalus, aktyvina arba slopina

fermentus, veikia kaip chelatiniai junginiai apsaugodami lipidus, baltymus ir nukleino rūgštis. Jie

maţina leukocitų imobilizaciją, skatina apoptozę, slopina ląstelių proliferaciją ir angiogenezę,

svarbūs mutagenezės ir karcinogenezės prevencijai ir vėţio gydymui [50, 239, 262, 272].

Antocianinai skatina naviko nekrozės faktoriaus α (TNF-α) ekspresiją, slopina vėţinių

ląstelių augimą ir jų transformaciją [262]. Literatūroje aprašyti antocianinų poveikio mechanizmai:

1) antioksidantinis poveikis [103, 255]; 2) molekuliniai mechanizmai, susiję su antikarcinogeneze

[103]; 3) molekuliniai mechanizmai, susiję su apoptozės indukcija vėţinėse ląstelėse [102, 132, 146,

166].

Page 19: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

19

Karcinogenezės molekulinių mechanizmų tyrimai yra reikšmingi vėţio gydymui ir

prevencijai. Buvo atlikti tyrimai su pelių JB6 epiderminių ląstelių kultūra, veikiant ją antocianidinais

(pelargonidinu, cianidinu, delfinidinu, peonidinu, petunidinu ir malvidinu) [103]. Moksliniais

tyrimais įrodyta, kad transkripcijos faktoriaus aktyvatorius proteinas 1 (AP–1) turi įtakos

karcinogenezės vystymosi skatinimui. Aktyvuodamas genų transkripciją, šis baltymas skatina

ląstelių proliferaciją ir transformaciją. UV spinduliai, augimo faktorius ir laisvieji radikalai,

aktyvuodami mitogeninę aktyvavimo proteinkinazę (MAPK) ir ekstraląstelinių signalų reguliavimo

proteinkinazę (ERK), c–Jun N-terminalinę kinazę (JNK), gali sukelti AP–1 aktyvaciją [68, 142].

Padidėjęs AP–1 aktyvumas sukelia įvairių vėţio formų vystymąsi: odos, plaučių, virškinimo trakto

ir t. t. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad antocianinai ir jų aglikonai gali lėtinti karcinogenezės

procesus [103].

Apoptozė – genetiškai kontroliuojama ląstelės mirtis – pagrindinis daugialąstelinių organizmų

homeostazės palaikymo mechanizmas [166]. Tyrimais su ţiurkių lygiaisiais raumenimis ir kepenų

ląstelėmis įrodyta, kad antocianinai maţina DNR paţeidimus, kuriuos sukelia oksidacija [143].

Buvo tirtas antocianinų aglikonų poveikis ţmogaus vėţinių ląstelių (gimdos karcinomos, gaubtinės

ţarnos adenokarcinomos) ir normalių fibroblastų gyvybiniam ciklui ir apoptozės indukcijai.

Nustatyta, kad delfinidinas stabdo normalių fibroblastų ląstelių proliferaciją ir skatina apoptozę

vėţinėse ląstelėse [146, 166]. Japonijos mokslininkai tyrė 10-ies vaisių ekstraktų poveikį vėţinių

ląstelių augimo inhibicijai. Tyrimams in vitro buvo panaudotos ţmogaus HL60 leukemijos ir

HCT116 gaubtinės ţarnos karcinomos ląstelės. Nustatyta, kad HCT116 ląstelės buvo atsparesnės

antocianinų sąlygotai apoptozės indukcijai nei HL60 ląstelės. Gauti rezultatai įrodė, kad ne tik

aglikonai, bet ir glikozidai inhibuoja vėţinių ląstelių augimą ir skatina apoptozę [68, 132].

Taikant įvairias antioksidantinio poveikio tyrimo metodikas, nustatyta teigiama koreliacija

tarp fenolinių junginių kiekio tirtuose ekstraktuose ir antioksidantinio aktyvumo [59, 104, 128, 181,

199, 224, 267, 279]. Antocianinai yra pagrindiniai junginiai, apsprendţiantys ekstraktų

antioksidantinį poveikį [279]. Tyrimais įrodytas ne tik mėlynių vaisių ekstraktų lipidų peroksidaciją

inhibuojantis, bet ir laisvuosius radikalus surišantis poveikis [14, 18, 74]. Buvo atlikti tyrimai

nustatant mėlynių vaisių fenolinių junginių antioksidantines savybes surišant superoksido (·O2¯) ir

peroksinitrilo (ONOO¯) radikalus. Nustatyta sugebėjimo surišti superoksido radikalus seka:

delfinidinas > petunidinas > malvidinas = cianidinas > (+)-katechinas > peonidinas >

pelargonidinas. Atitinkamai su peroksinitrilo radikalu: delfinidinas > cianidinas = petunidinas >

malvidinas = (+)-katechinas > peonidinas > pelargonidinas. Nustatytas antocianinų sinergistinis

surišamasis poveikis su ·O2¯ ir ONOO¯ radikalais [204]. Tirtos mėlynių vaisių ekstraktų galimybės

inhibuoti lipidų peroksidaciją, sukeltą 2,2‘-azobis(2-metil-propanimidamido) dihidrochlorido

Page 20: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

20

liposomų membraninėje sistemoje. Ekstraktų antioksidacinės savybės vertintos stebint deguonies

suvartojimą ir matuojant konjuguotų dienų formavimąsi. Visi tirti ekstraktai apsaugojo membranas

nuo peroksilo radikalų poveikio prailgindami oksidacijos indukcijos laiką [65].

Tyrimais in vitro su izoliuotomis kraujagyslėmis įrodyta, kad mėlynų vaisių ekstraktas gali

būti efektyvi vazoprotekcinė priemonė kraujagyslių ligų prevencijai bei gydymui [21, 28].

Antocianinai slopina uţdegimą sukeliančių junginių (prostaglandinų, leukotrienų bei histamino)

sintezę ir išsiskyrimą, taip pat maţina COX-1 ir COX-2 išsiskyrimą skatinančių genų ekspresiją [9,

143, 176, 270]. Tyrimais nustatytos mėlynių vaisių antocianinų proteazes inhibuojančios savybės,

turinčios įtakos antikancerogeniniam, antioksidantiniam, priešuţdegiminiam bei neuroprotekciniam

poveikiui. Vartojant antocianinų turinčius produktus, galima apsisaugoti nuo daugelio lėtinių ir

neurodegeneracinių ligų [54].

In vitro ir in vivo tyrimuose su kompleksiniu įvairių vaisių preparatu įrodytas mėlynių

vaisių ekstraktų antiangiogeninis poveikis. Tokio tipo preparatai maţina nepageidaujamą

kraujagyslių išvešėjimą, sąlygojantį venų varikozių ir navikų formavimąsi. Tiriant kraujagyslių

endotelinio augimo faktoriaus (VEGF) ekspresiją ţmogaus HaCaT keratinocituose ir įvairių vaisių

ekstraktų įtaką jai, nustatytas šilauogių ir mėlynių ekstraktų slopinamasis poveikis, lemiantis

antiangiogeninį poveikį [17, 169, 218].

Nustatyta, jog mėlynių vaisiuose esantys polifenoliniai junginiai (antocianinai,

fenolinės rūgštys, flavonoidai, proantocianidinai) veikia antimikrobiškai Salmonella,

Staphylococcus, Helicobacter ir E. coli padermes [202, 203].

Nustatyta, kad mėlynių vaisių ekstraktai gerina naktinį matymą, akių prisitaikymą prie

tamsos bei pagreitina akies matymo atsistatymą paveikus ryškia šviesa [173]. Priešingai kiti atlikti

tyrimai pateikė kontraversiškas išvadas, įrodančias, kad mėlynių vaisių preparatų vartojimas po 160

mg 2 kartus per dieną neturi įtakos geram naktiniam matymui [183]. Klinikiniais tyrimais

patvirtintas mėlynių vaisių preparatų teigiamas poveikis hipertenzinės bei diabetinės retinopatijų ir

glaukomos gydymui. Diabetine retinopatija sergantys pacientai vartojo po 160 mg mėlynių

preparato, turinčio 36 proc. antocianinų, 2 kartus per dieną. Vartojant preparatą 1 mėnesį, 10-ies iš

13 tirtų pacientų būklė pagerėjo. Tyrėjai nustatė, kad mėlynių vaisių pigmentai gali padidinti

jautrumą šviesai ir pagerinti akies kapiliarų aprūpinimą krauju [19].

Eksperimentiniai tyrimai su laboratorinėmis ţiurkėmis ir klinikiniai tyrimai su

ţmonėmis, papildţius jų mitybos racioną mėlynių preparatais, parodė, kad galima sustabdyti

kataraktos vystymąsi [19, 97, 195]. Mėlynių vaisių ekstrakto kompleksinis preparatas su vitaminu E

sustabdė kataraktos progresavimą 97 proc. tyrime dalyvavusių 50 pacientų, sergančių senatvine

ţievine katarakta [31]. Mėlynių vaisių preparatų poveikio mechanizmai, teigiamai veikiantys

Page 21: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

21

regėjimą, nėra tiksliai išaiškinti. Manoma, kad tai susiję su gebėjimu pagerinti akies aprūpinimą

deguonimi, krauju ir surišti laisvuosius radikalus, kurie gali suardyti kolageno struktūrą ir sukelti

kataraktą bei dėmės degeneracinius pakitimus [15, 19]. Autofluorescentiniai pigmentai, kurie

kaupiasi pagyvenusių ţmonių tinklainės pigmentinėse epitelio ląstelėse, susiję su dėmės

degeneraciniais pakitimais. Atliktas tyrimas parodė, kad A2E-epoksidai, nepriklausomai nuo

singletinio deguonies, savo oksidaciniu poveikiu paţeidţia DNR. Mėlynių ekstraktai sumaţina A2E

epoksidaciją surišdami singletinį deguonį [116].

Šilauogių vaisių gydomąsias savybes pirmieji pastebėjo vietiniai Amerikos gyventojai.

Šilauogių vaisių arbatą jie vartojo kaip pagalbinę priemonę gimdymo metu. Lapų preparatus vartojo

cukraus kiekiui kraujyje maţinti, inkstų ligoms gydyti. Šilauogių sultys buvo vartojamos kosuliui

gydyti. Šiuolaikinėje medicinoje šilauogių preparatai vartojami šlapimtakių infekcijoms gydyti [193,

254]. Šiaurės Amerikos Šilauogių tarybos duomenimis antocianinų turintys šilauogių vaisiai

rekomenduojami kaip efektyvi antioksidantinė priemonė vėţio bei širdies ir kraujagyslių ligų

prevencijai [44, 59, 181, 199, 263]. Šilauogių vaisių fenoliniai junginiai inhibuoja vėţinių ląstelių

proliferaciją ir sukelia apoptozę. Nustatyta, jog stipriausios priešvėţinės savybės iš visų

polifenolinių junginių ryškiausios antocianinų frakcijoje [272]. Atliekant šilauogių ekstraktų

mitogeninių savybių tyrimus in vitro, nustatytas limfocitų proliferaciją skatinantis poveikis [126].

Eksperimentų metu ţiurkes 30 dienų maitinant šilauogių liofilizuotais ekstraktais ( apie

3,2 mg/kg per dieną), pastebėtas ţymus trumpalaikės bei darbinės atminties pagerėjimas, tačiau

įtakos ilgalaikei atminčiai nenustatyta [57, 205]. Šilauogių polifenoliniai junginiai gali pereiti kraujo

smegenų barjerą ir lokalizuotis atsakinguose uţ atmintį ir mokymąsi smegenų centruose [12].

Naudojant įvairias modelines sistemas su ţiurkėmis, siekta išsiaiškinti šilauogių vaisių preparatų

veikimo mechanizmus gerinant atmintį. Vartojant maisto papildus su šilauogių ekstraktu,

apsisaugoma nuo atpaţinimo atminties pablogėjimo ir padidinamas baltymo (branduolio faktorius-

kapa B [NF- kB]), atsakančio į oksidacinį stresą, kiekis [78, 265].

Oksidacinis stresas yra svarbus išeminio insulto etiologijai. Šilauogių ekstraktai

pasiţymi stipriomis antioksidantinėmis savybėmis. Nustatyta, kad pavartojus jų, ţiurkių smegenų

paţeidimo laipsnis sukėlus išemiją, buvo net 23 proc. maţesnis [240]. Atliekant tyrimus su ląstelių

kultūromis ir gyvūnais, nustatytas šilauogių ekstraktų cholesterolio kiekį kraujo plazmoje maţinantis

poveikis. Į kiaulių maisto racioną pridėjus 4 proc. šilauogių ekstrakto, plazmoje nustatytas

sumaţėjęs MTL ir DTL kiekis, atitinkamai 11,7 bei 15,1 proc. [270]. Šiuolaikinis mėlynių ir

šilauogių vaisių vartojimas pagrįstas ilgamete jų vartojimo patirtimi liaudies medicinoje bei

nuosekliais moksliniais tyrimais. Atliktų mokslinių tyrimų rezultatai įrodo, jog antocianinai yra

vieni svarbiausių biologiškai aktyvių junginių mėlynių ir šilauogių vaisiuose [28, 173].

Page 22: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

22

1.2. Antocianinų apibūdinimas, struktūra, biologinės savybės ir

panaudojimas

1.2.1. Antocianinų bendra apţvalga, biosintezė

Antocianinai yra natūralūs gamtoje plačiai paplitę pigmentai. Jie gamtoje egzistuoja

glikozidine forma (antocianinai), o jų aglikonai vadinami antocianidinais. Antocianinai nustatyti

augaluose, jų neturi gyvūnai, mikroorganizmai ir vandens augalai. Antocianinai augalams suteikia

būdingą spalvą, kuri varijuoja nuo roţinės ir violetinės iki tamsiai mėlynos [35, 114, 139, 196, 197].

Daugiausia antocianinų nustatyta ţiedų vainiklapiuose ir vaisiuose. Jie nustatyti ir kitose augalų

dalyse: šaknyse, pumpuruose, stiebuose ir poţeminiuose organuose [35, 246]. Maţesni antocianinų

kiekiai nustatyti plikasėkliuose, paparčiuose, samanose [35, 40, 119].

Taikant eksperimentinius modelius, buvo nustatyta, kad antocianinai yra sintetinami

ląstelės citoplazmoje ir transportuojami į vakuoles, kur susijungia su baltyminiu matriksu [276]. Yra

duomenų, kad antocianinai gali susidaryti augaluose vykstant flavonoidų metabolizmui.

Eksperimentiniai duomenys rodo, kad 2,3–trans–dihidro–3,4–cis–dihidroksiflavonolis yra

antocianidinų prekursorius. Antocianinų biosintezę atlieka fermentai, esantys ląstelės membranoje.

Jie katalizuoja dviejų pagrindinių biocheminių elementų (acto rūgšties ir fenilalanino),

transformaciją į galutinį produktą – antocianinus, po to jie pernešami į epidermio ląstelių vakuoles.

Ţymūs DNR genetinio kodo pakitimai sąlygoja pigmentų sintezės pakitimus [35, 111, 112].

Antocianinų sintezę veikia aplinkos veiksniai: šviesa, jos intensyvumas, šviesos bangos ilgis,

temperatūra, vandens, angliavandenių kiekis, azoto, fosforo ir boro koncentracija augimo metu.

Nustatyta, jog matoma šviesa, raudonieji bei tolimojo spektro raudonieji spinduliai didina fermentų,

katalizuojančių antocianinų biosintezės procesus, aktyvumą [35, 82, 280].

Antocianinų struktūros ypatumai, fizikocheminės savybės

Pastaruoju metu iš augalų išskirti, identifikuoti ir aprašyti 539 antocianinai [11]. Iš jų 277

antocianinų struktūra nustatyta jau po 1992 metų. Antocianinų glikozidus sudaro cukrinė dalis ir

aglikonas (antocianidinas). Antocianinai turi C6C3C6 sandarą, būdingą flavonoidams. Antocianinai

yra glikozidinti polihidroksi ir polimetoksi 2-fenilbenzopirilo (flavilio katijono) dariniai. Šį katijoną

sudaro deguonį turintis heterociklo piranas, sujungtas su benzeno ţiedu. Pirano ţiedo 2 padėtyje

prisijungęs benzeno ţiedas, kuris gali turėti skirtingų radikalų. Pagrindinė antocianinų dalis yra

aglikonas (flavilio katijonas), turintis konjuguotas dvigubas jungtis, kurios apsprendţia šviesos

absorbciją (apie 500 nm). Aglikonai daţniausiai būna penta-(3,5,7,3´,4´) arba heksa-(3,5,7,3´,4´,5´)

Page 23: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

23

pakaitai. Aglikonai savo struktūroje turi prisijungusias acilines grupes [110, 225]. Atocianidinų

struktūrinė formulė pateikta 1 pav.

1 pav. Antocianidinų struktūrinė formulė (Rx – pakaitas, nurodytas 2 lentelėje )

Išskirti dimeriniai antocianinai grupuojami į dvi klases. Pirma klasė jungia pigmentus,

kurių molekulę sudaro antocianinai ir flavonai ar flavonoliai, susijungę acildikarboksiline jungtimi.

Kitą klasę sudaro keturi skirtingi katechinai, kovalentinėmis jungtimis susijungę su pelargonidin-3-

gliukozidu. Per pastaruosius dešimt metų buvo išskirti ir aprašyti septyni nauji dezoksiantocianidinai

ir didelė antocianidinų grupė, vadinama piranantocianidinais (2 pav.) [11, 167, 211].

Piranantocianidinai pirmą kartą identifikuoti 1996 metais [43]. Susidomėjimas šiais junginiais

nuolat didėja, kadangi piranantocianidinai yra stabilesni uţ kitų grupių antocianinus.

2 pav. Piranantocianidinų struktūrinė formulė

Gamtoje nustatyta gana neįprasta antocianinų forma – metaloantocianinai. Jų molekulės

struktūroje kovalentinėmis jungtimis yra prisijungę metalų atomai. Iš metalų daţniausiai nustatyti

Page 24: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

24

dvivalenčiai magnio, kobalto, molibdeno, nikelio, cinko ir kadmio jonai. Daţnai pasitaiko

trivalenčių geleţies ir aliuminio jonų. Šie antocianinai – sudėtingi kompleksiniai junginiai, kurie

suteikia augalų ţiedams mėlyną spalvą [11, 30, 86].

Šiuo metu ţinoma daugiau nei 30 monomerinių antocianidinų, tačiau daţniausiai nustatomi

šeši antocianidinai: delfinidinas, cianidinas, petunidinas, malvidinas, peonidinas ir pelargonidinas.

Augaluose daţniausiai aptinkamų antocianinų aglikonai pateikti 2 lentelėje. 30 proc. visų

identifikuotų antocianidinų struktūros pagrindą sudaro cianidinas, atitinkamai 22 proc. – delfinidinas

ir 18 proc. – pelargonidinas. Trys antocianidinai (peonidinas, malvidinas ir petunidinas) sudaro 20

proc. antocianidinų struktūros pagrindą. Kiti antocianidinai turi 3–dezoksi, rečiau metilintų ir 6–

hidroksiantocianidinų struktūrą [11].

2 lentelė. Išskirti ir identifikuoti antocianidinai

Pavadinimas Grupės (pakaito) padėtis struktūrinėje formulėje

Dažniausiai augaluose nustatomi

antocianidinai

3 5 6 7 3’ 4‘ 5‘

Pelergonidinas(Pg) OH OH H OH H OH H

Cianidinas (Ci) OH OH H OH OH OH H

Delfinidinas (Df) OH OH H OH OH OH OH

Peonidinas (Pn) OH OH H OH OMe OH H

Petunidinas (Pt) OH OH H OH OMe OH OH

Malvidinas (Mv) OH OH H OH OMe OH OMe

Rečiau augaluose esantys metilinti

antocianidinai

5 – MetilCi OH OMe H OH OH OH H

7 – Metilan (rosinidinas) OH OH H OMe OMe OH H

5 – MetilDf (pulchelidinas) OH OMe H OH OH OH OH

5 – MetilPt (europidinas) OH OMe H OH OMe OH OH

5 – MetilMv (kapensinidinas) OH OMe H OH OMe OH OMe

7 – MetilMv (hirsutidinas) OH OH H OMe OMe OH OMe

6 – Hidroksilinti antocianidinai

6 – HidroksiPg OH OH OH OH H OH H

6 – HidroksiCi OH OH OH OH OH OH H

6 – Hidroksi Dp OH OH OH OH OH OH OH

3 – Dezoksi antocianidinai

Page 25: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

25

Apigenidinas (Ap) H OH H OH H OH H

Luteolinidinas (Lt) H OH H OH OH OH H

Tricenidinas (Tr) H OH H OH OH OH OH

7 – MetilAp H OH H OMe H OH H

5 - MetilLt H OMe H OH OH OH H

5-Metil 6- hidroksiAp (karajuronas) H OMe OH OH H OH H

5,4- Dimetil-6-hidroksiAp

(carajurinas)

H OMe OH OH H OMe H

5-Metil-6-hidroksiLt H OMe OH OH OH OH H

5,4-Dimetil-6-hidroksiLt OH OMe OH OH OH OMe H

Ricionidinas OH H OH OH H OH H

Augaluose antocianinai daţniausiai esti glikozidų pavidalo. Antocianinai klasifikuojami

pagal prisijungusių cukrų molekulių skaičių (monozidai, biozidai ir triozidai). Tetrazidų augaluose

iki šiol dar nenustatyta. Cukrinė dalis su aglikonu jungiasi O–glikozidine jungtimi. Visai neseniai

buvo nustatyta, kad aglikonas su cukrine dalimi gali jungtis ir C–gikozidine jungtimi. 97 proc. visų

antocianidinų yra glikozidinti ir yra prisijungę įvairias cukrų molekules. Sfagnorubinas, rozacianinas

B ir 3–dezoksiantocianidinai yra vieninteliai natūraliai gamtoje randami antocianidinai, kurie esti

aglikonų pavidalo [11, 245].

Monozidai turi vieną cukraus molekulę. Daţniausiai jie būna susijungę su: gliukoze,

galaktoze, ramnoze, arabinoze, ksiloze ar gliukurono rūgštimi. Cukrinė dalis su aglikonu jungiasi

per C3 padėtyje esančią hidroksilinę grupę O–glikozidine jungtimi. Didţioji dauguma (90 proc.)

antocianinų yra prisijungę cukrus, kiti savo struktūroje gali būti prisijungę gliukorono rūgštį [123].

Diglikoziduose monosacharidai prijungti prie C3 ir C5 arba C3 ir C7 padėtyse esančių hidroksilinių

grupių. Galimi atvejai, kai abi cukrų molekulės yra prisijungusios C3 padėtyje [11].

Triozidai C3 padėtyje gali turėti linijinę arba šakotą iš trijų monosacharidų sudarytą cukrų

grandinę. Galimas monosacharidų prisijungimas 3´-, 4´-, ir 5´- padėtyse. Daţniausiai sutinkami di- ir

triglikozidų cukrai yra rutinozė, soforozė, sambubiozė ir gliukorutinozė [11].

Antocianinų fizikocheminės savybės. Antocianinai yra 2–fenilbezopirilo katijono dariniai,

vandeniniuose tirpaluose turi silpnas rūgštines savybes ir yra geri elektrolitai. Stiprių rūgščių

tirpaluose (pH<3) katijoninė forma yra stabili ir raudonos spalvos. Stipriai rūgščiuose tirpaluose ir

deguonies aplinkoje ar aukštoje temperatūroje vyksta hidrolizė. Silpnų rūgščių tirpaluose (pH 4 – 6)

katijonas netenka vieno ar dviejų protonų ir taip virsta anhidrobaze (chinoidinė forma), kuri stabili ir

mėlynos spalvos. Vykstant molekulės hidratacijai, susidaro pseudobazė, kuri yra bespalvė. Didėjant

Page 26: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

26

vandeninių tirpalų pH (pH >7), 2 – fenilbenzopirilio katijonas jonizuojasi, tirpalai tampa

nebestabilūs ir antocianinų struktūra suardoma. Antocianinų stabilumas maţėja veikiant deguoniui

(t. y. oksidatoriams), temperatūrai ir šviesai [35, 144, 275].

Antocianinai yra tirpūs vandenyje ir alkoholiuose, netirpūs nepoliniuose organiniuose

tirpikliuose. Nestabilūs neutralioje ar šarminėje terpėje. Antocianinų tirpalai yra labai nestabilūs ir

gali būti laikomi azoto aplinkoje, ţemoje temperatūroje ir tamsoje. Antocianinų stabilumą

vandeniniuose tirpaluose didinantys veiksniai: acilo grupių skaičius (t. y. poliacilinti junginiai);

autopigmentacija, t. y. antocianinų jungimasis tarpusavyje; antocianinų jungimasis su flavonoidais;

jungimasis ar adsorbcija su sacharoze, proteinais, pektinais ir kitomis makromolekulėmis [34, 114,

128, 136, 178, 191, 208, 275].

Antocianinų reikšmė augalams ir gyvūnams. Antocianinai panaudojami tam tikru augalo

vystymosi metu, o vėliau šiuos pigmentus suskaido augalo fermentai. Moksliniais tyrimais įrodyta,

jog antocianinai, ypač kai jie kaupiami viršutiniame lapo paviršiuje ar epidermio ląstelėse, atlieka

fiziologines funkcijas. Antocianinai, besikaupiantys jaunuose, besivystančiuose lapuose bei lapus

metančių augalų lapuose rudenį, yra atsakas į maisto medţiagų stygių, temperatūros pokyčius ar

ultravioletinių spindulių poveikį [139].

Manoma, kad antocianinai atlieka atitinkamo tirpinio funkciją vykstant osmosiniam

prisitaikymui prie sausros, šalčio ar streso kaip antioksidantai. Antocianinai veikia kaip UV

spindulių ekranas ir yra sintezuojami kaip atsakas į augalą veikiančią UV radiaciją ir apsaugo augalo

DNR [76, 77, 112].

Antocianinai vaisiuose, darţovėse bei iš jų gautuose augaliniuose produktuose kelia vis

didesnį mokslininkų susidomėjimą. Dėl antocianinų buvimo juose augalinius produktus galima

vartoti ne tik kaip maistą, maistines daţo medţiagas, bet ir daugelio ligų prevencijai bei gydymui

[201].

1.2.2. Antocianinų farmakokinetika ir metabolizmas

Vykstant sparčiai mokslo technologijų paţangai, nuolat daugėja antocianinų tyrimų tiek in

vitro, tiek in vivo. Taikant eksperimentinius in vitro modelius bei atliekant tyrimus su laboratoriniais

gyvūnais, nustatytas antocianinų antioksidantinis, antikancerogeninis, akies tinklainės pigmentų

epitelines ląsteles apsaugantis poveikis [20, 116, 272].

Įvertinus teigiamą antocianinų poveikį organizmui, svarbu išsiaiškinti efektyviausius jų

patekimo į organizmą kelius, pasiskirstymą organuose, bioprieinamumą. Atliekant bioprieinamumo

bei antocianinų pasiskirstymo organuose tyrimus su ţiurkėmis, vartojant standartinį mėlynių

ekstraktą (Bilberon 25), kraujo plazmoje buvo nustatyti visi pagrindiniai antocianinai, išskyrus

Page 27: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

27

peonidin 3-O- -L-arabinozidą. Antocianinų absorbcija priklauso nuo antocianinų tipo bei

koncentracijos [93].

Atlikus tyrimus su ţmonėmis, maksimali antocianinų koncentracija, pavartojus juos

peroraliai, pacientų plazmoje pasiekiama po 1,5-2,8 val. Vėliau ji laipsniškai maţėja tiek ţiurkių,

tiek ţmonių kraujo plazmoje [88, 108, 133]. Pirminės struktūros antocianinai sudarė 32 proc. visų

ţmogaus plazmoje nustatytų antocianinų, kiti – konjuguotose formose [133].

Tarp tą patį aglikoną turinčių antocianinų, pavartojus peroraliai, po 15 min. ţiurkių plazmoje

nustatyta ši seka: galaktozidas > gliukozidas > arabinozidas. Plazmos klirensas po intraveninio

vartojimo aiškiai parodo, jog arabinozidas eliminuojamas ţymiai greičiau negu gliukozidas ar

galaktozidas. Lyginant aglikonų, turinčių tas pačias cukraus molekules, pusinės eliminacijos laiką iš

kraujo plazmos, buvo nustatyta ši seka: delfinidinas > cianidinas > petunidinas = peonidinas >

malvidinas [108]. Plazmoje bei tuščiojoje ţarnoje taip pat aptinkama ir antocianinų aglikonų [241].

Antocianinų absorbcija skrandyje varijuoja nuo 19 iki 37 proc., priklausomai nuo

antocianinų struktūros. Nustatyta, kad delfinidino glikozidai iš skrandţio absorbuojami

efektyviausiai, tačiau atlikti tyrimai rodo, kad antocianinų struktūra skrandyje nekinta [241, 242]. Jie

yra stabilūs esant rūgščiai skrandţio aplinkai, tačiau tik apie 25 proc. tyrinėtų antocianinų buvo

stabilūs imituojamai kasos virškinamajai aplinkai [172]. Taikant in situ perfuzines sistemas

tyrimuose su ţiurkėmis, įrodyta, jog antocianinų glikozidai greitai bei efektyviai absorbuojami

plonajame ţarnyne [243].

Antocianinų bioprienamumas yra daug maţesnis negu kitų flavonoidų [66, 201]. Nustatyta,

kad galaktozidų bioprieinamumas didţiausias, maţesnis – cianidino bei delfinidino gliukozidų ir

arabinozidų. Petunidino ir malvidino arabinozidai ir galaktozidai turėjo didesnį bioprieinamumą

negu gliukozidai [108].

Antocianinų bioprieinamumas gali būti padidinamas vartojant juos frakcionuotos kokosų

aliejaus suspensijos mišinyje su gliukozės tirpalu [10, 25]. Cukrinė antocianinų dalis bei aglikono

stabilumas stipriai veikia jų metabolizmą. Įrodyta, jog cukrinė dalis neturi įtakos O-metilinimo

metabolizmui, bet veikia konjugaciją su gliukurono rūgštimi tiek kepenyse, tiek plonajame ţarnyne

[109]. Kepenyse ir inkstuose nustatyti O-metil antocianinai (peonidinas ir malvidinas bei kiti O-

metil antocianinai), susidarę iš delfinidino, cianidino ir peonidino gliukozidų [108, 241].

Tyrimai su gervuogių antocianinais parodė, kad antocianinų gliukozidai efektyviai ir greitai

absorbuojami skrandyje ir kaupiasi tulţies pūslėje. Atlikti eksperimentai įrodė, kad cianidin-3-

gliukozidas į tulţį patenka po 20 min. pavartojus antocianinų preparatą peroraliai. Peonidin-3-

gliukozidas (metilinta cianidin-3-gliukozido forma) taip pat nustatyta tulţyje [242]. Antocianinai

nustatyti ţiurkių šlapime nepakitusios glikozidinės formos, tačiau nei aglikonų, nei konjuguotų

Page 28: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

28

formų šlapime nenustatyta. Peonidin-3-gliukozidas galėjo susidaryti vykstant cianidin-3-gliukozido

metilinimui kepenyse. Pacientų, vartojusių antocianinų preparatus, šlapime nustatyti ne tik pradinės

struktūros (32,5 proc.), bet ir dariniuose su gliukurono rūgštimi bei metilinti antocianinai [66, 133].

1.2.3. Antocianinų biologinis poveikis

Aktyvūs deguonies junginiai, patenkantys iš endogeninių ir egzogeninių šaltinių, gali

sukelti įvairias ligas: išeminę širdies ligą, insultą, reumatoidinį artritą, vėţį. Vaisių ir darţovių

vartojimas sumaţina šių patologijų riziką, kuri aiškinama vitaminų-antioksidantų (vitamino C,

vitamino E ir β-karoteno) poveikiu [201]. Antocianinams priskiriama daug farmakologinio poveikio

efektų [91, 171]. Šiuo metu dauguma jų yra gerai ištyrinėti ir siejami su stipriu antioksidantiniu

poveikiu, priešuţdegiminėmis [54, 262, 273], hipolipideminėmis, kraujotaką gerinančiomis,

hipoglikeminėmis [118, 171, 252], antiangiogeninėmis [174], antimikrobinėmis [95, 202, 203],

priešvirusinėmis [137] priešvėţinėmis [29, 230] bei nuo oksidacinio DNR paţeidimo

apsaugančiomis savybėmis [2, 147, 175]. Nustatyta, jog antocianinai maţina išeminės širdies ligos

riziką [47, 70, 83, 130, 209]. Šis poveikis glaudţiai siejamas su antocianinų gebėjimu maţinti

trombocitų agregaciją [60, 179, 210] bei per įvairius mechanizmus kraujagyslių aterosklerozės

procesus slopinančiu [62, 125, 238] ir kraujagysles plečiančiu [13, 37] poveikiu. Antocianinai gerina

mikrocirkuliaciją, maţina kapiliarų trapumą bei pralaidumą [230], pasiţymi kolageną

stabilizuojančiu [173] poveikiu. Atliktais klinikiniais tyrimais įrodyta, jog antocianinai gerina

regėjimą [168, 185]. Antocianinų turintys ekstraktai pasiţymi neuroprotekciniu poveikiu [54, 72,

274], juos galima vartoti fibromialgijai gydyti [58]. Naujausiais tyrimų duomenimis nustatyta, kad

antocianinai turi MAO inhibicinių savybių, dėl to juos būtų galima vartoti depresijos, nerimo bei

kitų neurodegeneracinių ligų gydymui bei profilaktikai [54].

Atliktų tyrimų gausa ir įvairovė rodo platų antocianinų biologinio poveikio spektrą.

Dauguma šių poveikių intensyviai tyrinėjami tiek in vitro, tiek in vivo sistemose [154] atliekant tai

patvirtinančius klinikinius tyrimus.

1.2.4. Antocianinų antioksidantinis aktyvumas

Laisvieji radikalai yra glaudţiai siejami su daugelio ligų etiologija, pvz.: išeminės širdies

ligos, insulto, reumatoidinio artrito, regėjimo bei atminties silpnėjimo, degeneracinių susirgimų ar

vėţio [201]. Laisvieji radikalai sintezuojami endogeniškai (energijos metabolizmo procesuose ir

antimikrobinėse gynybinėse kūno sistemose) ar kaip atsakas į egzogeninius veiksnius (cigarečių

dūmus, nesubalansuotą mitybą, sekinančią fizinę veiklą, aplinkos taršą ir maisto uţterštumą) [180].

Page 29: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

29

Laisvieji radikalai – labai reaktyvios molekulės, dalyvaujančios daugelyje patofiziologinių reakcijų,

ypač oksidantiškai paţeidţiant baltymus, lipidus ar DNR. Prasidėję oksidantiniai procesai ląstelėje

daţnai sąlygoja rimtus ląstelės paţeidimus ir galiausiai visišką ląstelės suardymą [189]. Maisto

racionas, turintis daug vaisių ir darţovių, maţina daugelio patologijų riziką. Antocianinai yra

laikomi vienais svarbiausių natūralių antioksidantų, esančių daugelyje augalinės kilmės maisto

produktų.

Normaliomis sąlygomis deguonis mitochondrijose, endoplazminiame retikuliume

dalyvauja metaboliniuose procesuose. Esant nepakitusioms aplinkybėms, nedidelis kiekis elektronų

pereinančių per mitochondrijų elektronų transporto grandinę, nuteka ir su molekuliniu deguonimi

suformuoja aktyvius deguonies (ROS) ir azoto (RNS) junginius. Jiems priskiriami superoksido

(•O2¯), hidroksilo (HO•), azoto oksido (NO•), peroksilo (ROO•), alkoksilo (RO•) [180, 189]

radikalai bei kitos neradikalinės deguonies ir azoto formos: peroksinitrilas (ONOO¯) [271],

singletinis deguonis (1O2), vandenilio peroksidas (H2O2), hipochlorito rūgštis (HOCl) [189].

ROS susidaro įvairių ląstelinių procesų metu, tačiau neutralizuojami integruotų

antioksidantinių sistemų, kuriose dalyvauja fermentai (superoksido dismutazė, katalazė, gliutationo

peroksidazė), makromolekulės (albuminai, ceruloplazminai, feritinas) bei antioksidantai (vitaminas

C, α-tokoferolis, β-karotenas, urono rūgštis, bilirubinas, polifenoliniai junginiai). Daugybė neigiamų

veiksnių (ligos, vaistai, uţterštumas, prasta mityba) gali sutrikdyti ROS išsiskyrimo ir gynybinių

organizmo sistemų funkcionavimo pusiausvyrą ir sudaryti sąlygas oksidantiniam stresui pasireikšti

[44, 253].

Manoma, kad antocianinų antioksidantinis poveikis pasireiškia per daugelį sudėtingų

mechanizmų. Juos būtų galima suklasifikuoti taip: 1) sugebėjimą tiesiogiai surišti laisvuosius

radikalus; 2) apsaugantį nuo ROS formavimosi, kuris veikia keliomis kryptimis (sudarydami

chelatinius junginius su metalais apsaugo nuo redokso reakcijų, inhibuoja ksantino oksidazę ir

NADPH oksidazę); 3) apsaugantį nuo lipofilinių antioksidantų; 4) skatinantį antioksidantinių

fermentų išsiskyrimą [7]. Modelinėse sistemose nustatyta, kad antiradikalinėmis savybėmis

pasiţymintys antocianinai atiduoda elektroną ar vandenilio atomą iš hidroksilo pakaito laisviesiems

radikalams ir taip suriša laisvuosius radikalus nutraukdami oksidantinių procesų grandinę [260].

Antocianinai yra potencialūs laisvųjų radikalų rišikliai, gebantys surišti •O2¯ [192, 264], HO• [192,

263], H2O2 , 1O2 [263] laisvuosius radikalus.

Antioksidantinės antocianinų bei jų gliukozidų savybės daţniausiai priklauso nuo molekulės

struktūros ir pakaitų išsidėstymo. Atliekant antocianinų gebėjimo absorbuoti deguonies radikalus

(ORAC) tyrimus, nustatyta ši seka: cianidinas > delfinidinas > malvidinas ≈ peonidinas ≈

petunidinas. Manoma, kad didėjantis hidroksilo grupių skaičius molekulėje didina antioksidantinį

Page 30: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

30

aktyvumą. Antocianinų B ţiede esanti O-dihidroksi struktūra suteikia radikalui didesnį stabilumą ir

dalyvauja elektrono pasidalijime, todėl dihidroksilinimas B ţiedo 3‗ ir 4‗ padėtyse turi įtakos

antioksidaciniam poveikiui (1 pav.).

Dvigubos jungties buvimas antocianinų C ţiede skatina elektrono delokalizaciją visoje

molekulėje siekiant stabilizuoti ariloksi radikalus dėl esančios konjugacijos. Antocianinų A ir C

ţieduose (C3 ir C5 padėtyse) esančios hidroksilo grupės reikalingos maksimaliam radikalus

surišančiam poveikiui. Lyginant antocianinų aglikonų cheminės struktūros ir poveikio ryšį,

pastebėta, kad skirtingi hidroksi ir metoksi grupių pakaitai turi įtakos antioksidantiniam poveikiui,

nors turi tą pačią struktūrą A ir C ţieduose. Antocianinų petunidino, malvidino ir peonidino B ţiede

ORAC reikšmės yra daug maţesnės lyginant su junginiais, turinčiais -OH pakaitus 3‘, 4‘ padėtyse.

Metoksi grupės buvimas 3‘ B ţiedo padėtyje maţina antioksidantinį poveikį [279]. Tiriant atskirų

aglikonų antioksidantines savybes, pastebėta, kad cianidino glikozidai pasiţymi stipresnėmis

antioksidantinėmis savybėmis negu peonidino ar malvidino glikozidai, kadangi cianidinas turi

laisvas hidroksilo grupes 3 ir 4 C ţiedo padėtyje [260].

Pereinamųjų metalų jonai atlieka svarbų vaidmenį Fentono ir Haber-Veiso reakcijų metu

formuojantis ypač reaktyviems hidroksilo radikalams. Fentono reakcijos metu susidariusios lipidų

peroksidazės (LOOH) suyra suformuodamos stiprius oksidantus, alkoksilo radikalus, sukeliančius

grandinines lipidų peroksidacijos reakcijas [69, 192]. Antocianinai pasiţymi gebėjimu surišti metalų

jonus ir sudaryti chelatinius junginius. Teigiama, kad tokiu būdu antocianinai veikia kaip

superoksido dismutazė, uţkerta kelią hidroksilo radikalams susidaryti ir taip apsaugo organizmą nuo

oksidacinio streso paţaidos [7, 33, 198].

Ksantino oksidazė yra svarbi oksidantiniam audinių paţeidimui. Ksantino dehidrogenazė ir

ksantino oksidazė dalyvauja ksantino metabolizme į šlapimo rūgštį. Ksantino dehidrogenazė yra

fermento forma, egzistuojanti fiziologinėmis sąlygomis, tačiau išemijos atveju virsta ksantino

oksidaze. Ksantino oksidazė yra ROS šaltinis. Reperfuzijos fazėje ksantino oksidazė reaguoja su

molekuliniu deguonimi ir taip suformuoja superoksido laisvuosius radikalus [190]. Nustatyta, kad

antocianinai inhibuoja ksantino oksidazę ir taip maţina superoksido radikalų formavimąsi [2, 190,

257].

NADPH oksidazės yra membranų fermentai, katalizuojantys vieno elektrono pernašą iš

NADPH į O2 formuojant superoksido radikalus. Tyrimuose su ţiurkėmis nustatyta, kad turinčio

antocianinų maisto vartojimas 6 savaites sumaţino širdies NADPH isšsiskyrimą [8]. Panašus

NADPH oksidazės aktyvumo sumaţėjimas pastebėtas neutrofiluose hemodializuojamų pacientų,

vartojusių koncentruotas raudonųjų vynuogių sultis dvi savaites [46]. Antocianinai, inhibuodami

NADPH oksidazes, maţina ROS generaciją ir apsaugo organizmą nuo oksidacinio streso ţalos.

Page 31: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

31

Moksliniais tyrimais nustatyta, kad hidrofiliniai antioksidantai, pvz., askorbatas ir

glutationas, atlieka svarbų apsauginį vaidmenį saugodami lipofilinius antioksidantus (vitaminą E)

nuo oksidacijos [90]. Askorbo rūgštis taip pat padeda regeneruoti vitaminą E iš jo oksiduotos

formos. Tuo tarpu glutationas dalyvauja oksiduotos askorbato formos – dehidroaskorbato –

regeneracijoje į askorbatą, nors vitaminas C taip pat reikalingas oksiduotai glutationo formai

atstatyti [170, 177, 184]. Antocianinai atlieka tarpinį antioksidantinį vaidmenį apsaugodami

lipofilinius antioksidantus; be to, jie patys yra apsaugomi kitų hidrofilinių antioksidantų [7, 79].

Naujausių tyrimų duomenimis antioksidantinis antocianinų, kaip ir daugelio polifenolių,

veikimas gali pasireikšti ir netiesiogiai per antros fazės fermentus [53, 187]. Antros fazės fermentai

yra baltymai, kurių ekspresija koordinuojamai reguliuojama antioksidacinio atsako faktoriaus

(ARE), esančio atitinkamų genų aktyvatoriaus regione. Antocianinai skatina antros fazės fermentų

veiklą per ARE aktyvaciją, kadangi antros fazės fermentai atsakingi uţ ksenobiotikų ir elektrofilų

neutralizavimą bei detoksikavimą, tai tokių genų aktyvavimas gali apsaugoti nuo oksidacinio streso

[67, 120, 226].

1.3. Augalinių fenolinių junginių įtaka mitochondrijose vykstantiems procesams

Mitochondrijos yra eukariotinių ląstelių dvimembranės organelės, išsidėsčiusios

citoplazmoje ir ląstelėje atliekančios daugybę funkcijų, iš kurių pagrindinė yra ATP sintezė [165].

Mitochondrijos atlieka ir kitas svarbias funkcijas: sintetina hemą, lipidus, aminorūgštis, nukleotidus,

dalyvauja ureos cikle ir steroidinių hormonų sintezėje, dalyvauja intraląstelinio Ca2+

homeostazės

palaikyme, termogenezės procesuose [141, 221]. Naujesniais tyrimais nustyta, jog mitochondrijos

dalyvauja ir ląstelės ţūties procesuose apoptozės ar nekrozės būdu [4, 141, 150].

Mitochondrijų kvėpavimo grandinė yra sudėtinga oksidacijos-redukcijos fermentų ir

kofermentų sistema, esanti vidinėje mitochondrijų membranoje. Pagrindinė jos funkcija yra

laipsniškai išlaisvinti energiją iš redukuotų nukleotidų (NADH ir FADH2), kurie susidaro vykstant

glikolizei, riebalų rūgščių oksidacijai ir Krebso ciklo reakcijoms. Kvėpavimo grandinėje elektronai

pernešami nuo vieno jos komponento prie kito, elektronų nešikliams paeiliui oksiduojantis ir vėl

redukuojantis, o elektronų pernašos metu išsiskyręs didelis laisvosios energijos kiekis gali būti

panaudojamas ATP sintezei. Mitochondrijų elektronų pernašos grandinę sudaro daugiau kaip 80

polipeptidinių komponentų, kurie kartu grupuojami į 4 fermentų kompleksus. Tai NADH

dehidrogenazė (I kompleksas), sukcinato dehidrogenazė (II kompleksas), citochromų bc1

kompleksas (III kompleksas) ir citochromo c oksidazė (IV kompleksas). Į mitochondrijų kvėpavimo

grandinę elektronai patenka dviem keliais – per I kompleksą (nuo NADH) ir per II kompleksą (nuo

FADH2). Elektronus nuo I ir II komplekso perneša kofermentas Q ir perduoda III kompleksui, kurie

Page 32: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

32

toliau pereina citochromui c – judriam elektronų nešikliui tarp kompleksų III ir IV. Citochromo c

oksidazė katalizuoja galutinį eklektronų pernašos mitochondrijų kvėpavimo grandine etapą, t. y.

deguonies redukcijos reakciją, kurios metu susidaro vanduo. Pagal prostetines grupes elektronų

nešikliai skirstomi į 5 tipus: flavoproteinus (jų molekulėse yra FAD ir FMN), citochromus (turinčius

hemą), ubichinoną (arba kofermentą Q), Fe-S baltymus ir baltymus, turinčius surištą Cu2+/+

joną [56,

220, 221].

Elektronų pernašos kvėpavimo grandine metu atsipalaidavusi energija saugoma

elektrocheminio protonų gradientų pavidalu ir didţiausia jos dalis panaudojama ATP sintezei.

Kadangi fosforilinimui reikalingą energiją teikia kvėpavimo grandinėje vykstantys oksidacijos-

redukcijos procesai, šis procesas vadinamas oksidaciniu fosforilinimu. ATP sintezę katalizuoja

sudėtingas vidinės membranos fermentas ATP sintezė, dar vadinama V kompleksu. ATP sintezės

efektyvumas priklauso nuo vidinės membranos laidumo jonams. Jei vidinės mitochondrijų

membranos vientisumas paţeistas, laidumas jonams didėja, tada oksidacinių procesų aktyvumas

padidėja, o fosforilinimo – sumaţėja. Oksidacijos ir fosforilinimo procesų apjungimo sutrikimas

vadinamas oksidacijos ir fosforilinimo procesų atskyrimu. Atskyrimą gali sukelti tam tikri cheminiai

junginiai, vadinami skyrikliais. Daţniausiai tai rūgštinių savybių hidrofobiniai junginiai. Tipiški

skyrikliai yra DNP ir CCCP [26, 56, 217]. Skyrikliams veikiant, elektronai pernešami kvėpavimo

grandine deguoniui, bet ATP sintezė nevyksta.

Oksidacijos-redukcijos proceso metu elektronai pernešami mitochondrijų kvėpavimo

grandine deguoniui, kuris prisijungia keturis elektronus ir keturis protonus ir virsta vandeniu. Tačiau

apie 1-5 proc. mitochondrijų kvėpavimo grandine pernešamų elektronų nesuformuoja vandens

molekulių su deguonimi. Dauguma šių „prarastų― elektronų tarpinėje kvėpavimo grandinės dalyje

sąlygoja superoksido radikalų generaciją, pagrindinį ląstelinį aktyvių deguonies formų (ROS) šaltinį

daugelyje audinių. Mitochondrijų generuoti ROS dalyvauja daugelyje degeneracinių procesų, pvz.,

senėjimo, nekrozinės ar apoptozinės ląstelės ţūties. ROS taip pat siejamos su aterosklerozės,

Alzheimerio, Parkinsono ligos, daugelio širdies ir kraujagyslių patologijų [115, 213].

Mitochondrijose susidaręs •O2¯ radikalas, intramitochondrinės Mn-superoksido dismutazės

verčiamas į H2O2; jo nustatymas naudojamas kaip mitochondrinių ROS generacijos indikatorius.

Esant laisviems Fe2+

jonams, H2O2 generuoja labai aktyvius HO• laisvuosius radikalus. Neseniai

mitochondrijose nustatyta azoto oksido sintezė, kuri leidţia organelei generuoti NO• L-arginino

oksidacijos metu [41, 237, 244]. Šis radikalas moduliuoja kvėpavimą ir ATP sintezę inhibuodamas

citochromo oksidazę. NO• gali jungtis su •O2¯ ir formuoti kitą aktyvųjį ONOO¯ radikalą, kuris gali

negrįţtamai inhibuoti mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksus [149]. Manoma, kad

pagrindinis veiksnys, skatinantis ROS ir RNS susidarymą, yra didelis ΔμH+ [221]. Norint sumaţinti

Page 33: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

33

ΔμH+, galima panaudoti skyriklius. Manoma, kad flavonoidai gali veikti kaip skyrikliai, pernešdami

protonus per vidinę mitochondrijų membraną ir taip maţindami ΔμH+ [213] bei ROS generaciją.

Tyrimai parodė, kad kai kurie flavonoidai (kvercetinas, hiperozidas, rutinas, kvercitrinas ir kt.), ar

juos kaupiančių augalų ekstraktai (ginkmedţio, gudobelės) atskiria oksidacijos ir fosforilinimo

procesus ţiurkės širdies mitochondrijose ir maţina membraninį potencialą [23, 250, 251] bei ROS

generaciją mitochondrijose [23].

Mokslinių tyrimų duomenimis flavonoidai gali moduliuoti mitochondrijų funkciją per

redokso mechanizmus [4]. Tikėtina, jog polifenoliniai junginiai, pvz., flavonoidai, gali reaguoti su

mitochondrijų redokso centrais ir nukreipti ar sumaţinti elektronų srautą kvėpavimo grandinėje.

Dauguma tirtų junginių veikė arba inhibuojančiai, arba visai neveikė mitochondrijų kvėpavimo

grandinės I ir II kompleksų [98, 99]. NADH-oksidazę slopinantis poveikis priklauso nuo flavonoidų

struktūros ypatumų [214, 215]. Palyginus su NADH-oksidaze, sukcinatdehidrogenazė daug maţiau

jautri inhibuojančiam flavonoidų poveikiui, tačiau antocianinai atvirkščiai – pasiţymi didesniu

poveikiu sukcinatdehidrogenazei [92, 213]. Taip pat nustatyta, jog kai kurie flavonoidai gali

inhibuoti daugelį ATPazių, taip pat ir ATP sintezę (V kompleksą). Vėlesni ex vivo ir in vitro tyrimai

parodė, kad flavonai (morinas, kvercetinas) pasiţymi stipriausiomis inhibicinėmis savybėmis [213,

278]. Manoma, kad šiuo atveju redokso potencialas nėra lemiantis veiksnys ir kiti mechanizmai yra

atsakingi uţ šią inhibiciją. Viena iš hipotezių teigia, kad flavonoidai savo struktūros panašumu su

adenozino pakaitu gali rungtis dėl ADP/ATP prisijungimo vietos ATP sintezėje [49]. Kadangi

flavonoidai pasiţymi rūgštinėmis savybėmis ir yra iš dalies hidrofobinės medţiagos, tai jie gali

veikti kaip kvėpavimą nuo fosforilinimo atskiriantys veiksniai (kaip skyrikliai), tokiu būdu galintys

dalyvauti metaboliniuose reguliacijos procesuose [219, 256]. Flavonoidų protonizuotos formos,

cikliškai pernešdamos protonus per mitochondrijų vidinę membraną, disocijuoja šarminiame

matrikse. Išlaisvinusios protonus, jų jonizuotos formos dėl membranos potencialo skirtumo

išstumiamos į išorę, kur vėl prisijungia protonus [256].

Manoma, kad flavonoidai dėl teigiamo antioksidantinio poveikio gali turėti įtakos

intramitochondrinei redokso būklei. Daugybe in vitro tyrimų įrodyta, kad flavonoidai gali apsaugoti

nuo lipidų peroksidacijos, indukuotos mitochondrijose tiek fermentinių, tiek nefermentinių šaltinių

[73, 89, 207]. Tikėtina, kad flavonoidai veikia ne tik surišdami laisvuosius radikalus, bet ir I

komplekso aktyvumą. Flavonoidai taip pat gali veikti anioksidantines sistemas, esančias

mitochondrijose ir padedančias apsisaugoti nuo susidariusių laisvųjų radikalų. Nustatyta, jog

flavonoidai moduliuoja tiek citozolinio, tiek mitochondrijų SOD fermentų ekspresiją [138, 140].

Taip pat nustatyta, kad flavonoidai pagreitina ląstelių susinaikinmą – apoptozę (programuotą ląstelių

ţūtį). Manoma, kad tai susiję su citochromo c atsipalaidavimu iš mitochondrijų sumaţėjus

Page 34: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

34

membraniniam mitochondrijų potencialui. Dėl to suaktyvinama prokaspazės 9, kurios aktyvina

kaspazes 3 ir paleidţia tolimesnę vykdančiųjų kaspazių kaskadą [4, 80].

Mitochondrijos yra vienos svarbiausių ląstelių organelių, kuriose vyksta daugybė procesų,

lemiančių ląstelės gyvybingumą, taigi, bet kokie mitochondrijų funkcijų sutrikimai gali sukelti

įvairius susirgimus. Jos tarnauja kaip svarbūs įvairių metabolinių kelių centrai, dalyvauja ląstelės

apoptoziniuose bei nekroziniuose procesuose, tačiau pagrindinė jų funkcija – ATP sintezė. Nors

antocianinai yra viena didţiausių flavonoidų grupių, pasiţyminčių plačiu farmakologinio poveikio

spektru, tačiau duomenų apie antocianinų poveikį mitochondrijoms nėra daug. Antocianų poveikio

įvertinimas mitochondrijose vykstantiems procesams yra svarbus veiksnys, ieškant naujų biologiškai

aktyvių junginių apsaugančių ląsteles nuo paţaidos.

Page 35: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

35

2. TYRIMŲ OBJEKTAS IR METODAI

2.1 Tyrimų objektas

Tyrimų objektas – natūraliai augančių V. myrtillus L vaisiai. Cheminės sudėties

įvairavimo, sudėties kitimo dinamikos tyrimams naudotą ţaliavą sudarė mėlynių vaisių pavyzdţiai

surinkti iš įvairiuose Lietuvos regionuose esančių V. myrtillus L gamtinių cenopopuliacijų (3 pav.).

Vaisių ėminiai (50 - 100 g) buvo surinkti iš 75 cenopopuliacijų 2005 – 2007 metais (3 lentelė).

Cheminės sudėties tyrimams naudoti sodinių šilauogių (V. corymbosum auct. non L.) veislių

„Heerma―, „Rancocas―, „Bluecrop―, „Ama―, „Northblue―, „Berkeley―, „Northland―, „Dixi, „Putte―,

„North holna―, „Northcountry―, „Patriot― vaisiai, taip pat tyrimams naudoti ir siauralapės

(V. angustifolium Aiton) šilauogės bei siauralapės šilauogės veislės „Chignecto― vaisiai. Šilauogių

vaisių bandiniai buvo surinkti Botanikos instituto lauko kolekcijose, Vilniuje 2006 –2007 m.

Surinkti vaisių pavyzdţiai nedelsiant uţšaldyti ir laikyti -18 ± 1 °C temperatūroje.

3 pav. Vaccinium myrtillus L. vaisių ţaliavų rinkimo vietos gamtinėse cenopopuliacijose, 2005 –

2007

Page 36: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

36

3 lentelė. Vaccinium myrtillus L. vaisių ėminių rinkimo laikas ir augavietės

Au

gavie

tės

Eil

.

Nr.

Rinkimo data

Augavietė

Rajonas

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25.

26.

27.

2006 07 11

2006 07 11

2006 07 11

2006 07 11

2006 08 03

2006 07 10

2006 07 13

2006 07 10

2006 08 19

2006 07 11

2006 07 10

2006 07 20

2006 07 13

2006 07 11

2006 08 03

2006 07 11

2006 07 11

2006 07 11

2006 07 13

2006 07 13

2006 07 14

2006 06 29

2006 07 16

2005 08 03

2005 08 03

2005 08 03

2005 08 25

Bobriškių miškas

Gemaitiškių miškas

Krikštonių miškas

Ryliškių miškas

Panerių miškas

Prienų šilas

Druskininkų miškas

Degsnės miškas

Varnėnų miškas

Merkinės miškas

Puzonių miškas

Gailiūnų miškas

Jurašiškės miškas

Noškūnų miškas

Darbėnų miškas

Girulių miškas

Vėţaitinės miškas

Skliausčių miškas

Kiršių miškas

Birţuvėnų miškas

Kvėdarnos miškas

Grišlaukės miškas

Vaineikių miškas

Cijūniškės miškas

Vainiūnų miškas

Rėkyvos miškas

Onuškio miškas

Varėnos

Alytaus

Lazdijų

Alytaus

Vilniaus

Prienų

Varėnos

Prienų

Ignalinos

Varėnos

Prienų

Vilniaus

Lazdijų

Alytaus

Kretingos

Klaipėdos

Klaipėdos

Telšių

Telšių

Telšių

Šilalės

Kretingos

Kretingos

Lazdijų

Lazdijų

Šiaulių

Trakų

Page 37: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

37

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36.

37.

38.

39.

40.

41.

42.

43.

44.

45.

46.

47.

48.

49.

50.

51.

52.

53.

54.

55.

56.

57.

58.

59.

60.

2005 07 27

2005 07 09

2006 07 12

2006 07 17

2005 08 03

2005 07 09

2005 08 03

2006 08 08

2006 07 10

2006 07 27

2006 07 08

2006 08 11

2006 08 04

2006 07 30

2006 08 18

2006 08 18

2006 07 21

2005 08 25

2005 07 09

2005 07 09

2005 07 09

2007 07 09

2007 08 16

2007 08 02

2007 07 24

2007 07 25

2007 06 30

2007 07 09

2007 07 25

2007 06 14

2007 07 09

2007 07 09

2007 07 09

Ilgininkų miškas

Kapčiamiesčio miškas

Kapčiamiesčio miškas

Virbališkių miškas

Lekečių miškas

Merkinės miškas

Valkininkų miškas

Lenkaičių miškas

Auštkalvių miškas

Vainagių miškas

Kalnų miškas

Juodkrantės miškas

Gailiūnų miškas

Daugėliškių miškas

Panerių miškas

Rumšiškių miškas

Maksimų miškas

Raudonbalio miškas

Prienu šilas

Merkinės miškas

Darbėnų miškas

Bobriškių miškas

Uţtrakių miškas

Streipūnų miškas

Puzonių miškas

Valkininkų miškas

Obelijos miškas

Degsnės miškas

Marcinkonių miškas

Punios šilas

Perlojos miškas

Dirmiškės miškas

Krikštonių miškas

Lazdijų

Lazdijų

Lazdijų

Kupiškio

Šakių

Varėnos

Varėnos

Plungės

Kretingos

Šiaulių

Ukmergės

Klaipėdos

Vilniaus

Raseinių

Trakų

Kaišiadorių

Varėnos

Šalčininkų

Prienų

Varėnos

Kretingos

Varėnos

Trakų

Trakų

Prienų

Varėnos

Alytaus

Prienų

Varėnos

Alytaus

Varėnos

Alytaus

Lazdijų

Page 38: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

38

2.2 Tyrimų metodai

Šilauogių ir mėlynių vaisių ekstrakto paruošimas. Antocianinų kiekio nustatymui

grūstuvėje sutrinama 50,0 g šaldytų vaisių. Atsveriama 5,00 g sutrintų vaisių, uţpilama 95 ml

metanolio tirpalu ir ekstrahuojama 10 min. ultragarso vonioje. Gautas vaisių ekstraktas filtruojamas

per popierinį filtrą į 100 ml matavimo kolbą ir praskiedţiamas 100 proc. metanoliu iki ţymės [63].

V. myrtillus L. vaisių sausojo ekstrakto poveikio širdies mitochondrijų funkcijai tyrimams

naudotas etanolinis ekstraktas, gautas mėlynių vaisių ţaliavą ekstrahuojant 50 proc. etanoliu (1:10)

maceracijos metodu. Vandeninis vaisių ekstraktas gautas reperkoliacijos metodu ekstrahuojant

augalinę ţaliavą vandeniu (1:10). Mėlynių vaisių sausieji ekstraktai gauti iš vandeninio ekstrakto ir

iš etanolinio ekstrakto nugarinus etanolį ir liofilizuojant gautą vandeninį tirpalą. Ekstraktai buvo

uţšaldomi ant sublimacijos indų paviršiaus 1 cm storiu liofilizatoriaus Freeze Dryer FD8512S

(ilShin® Europe, Ede, Nyderlandai) rotaciniame uţšaldymo modulyje ir dţiovinami šiame

liofilizatoriuje 5 militorių slėgyje (kondensatoriaus temperatūra – 85 °C).

Antocianinų suminio kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu Analizei atsimatuojama

1 ml paruošto ekstrakto, kuris praskiedţiamas metanoliu, parūgštintu 0,1 proc. vandenilio chlorido

61.

62.

63.

64.

65.

66.

67.

68.

69.

70.

71.

72.

73.

74.

75.

2007 07 09

2007 07 09

2007 07 09

2007 07 09

2007 07 09

2007 07 09

2007 07 09

2007 07 10

2007 07 10

2007 07 25

2007 07 07

2007 07 14

2007 07 07

2007 07 24

2007 07 28

Valkininkų miškas

Merkinės miškas

Veţionių miškas

Adutiškio miškas

Varėnos miškas

Norūnų miškas

Ryliškių miškas

Birštono miškas

Nedzingės miškas

Bičionių miškas

Gulbino miškas

Ţalioji giria

Storių miškas

Naudţiūnų miškas

Dubičių miškas

Varėnos

Varėnos

Varėnos

Švenčionių

Varėnos

Alytaus

Alytaus

Prienų

Varėnos

Anykščių

Šiaulių

Panevėţio

Anykščių

Prienų

Varėnos

Page 39: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

39

rūgštimi, matavimo kolboje iki 50 ml. Absorbcijos dydis matuojamas 528 nm bangos ilgyje,

palyginamasis tirpalas – 0,1 proc. vandenilio chlorido rūgšties tirpalas metanolyje. Naudojama 1 cm

storio kiuvetė. Antocianinų kiekis vaisiuose nustatomas UNICAM „Helios α―spektrofotometru.

Rezultatai perskaičiuojami cianidin–3–gliukozidu ir išreiškiami procentais [63]:

,718

5000

m

Ax

čia: 718 – cianidin-3-gliukozido absorbcija prie 528 nm. bangos ilgyje;

A – absorbcijos dydis 528 nm bangos ilgyje;

m – ţaliavos masė, g.

Antocianinų hidrolizė. Į 25 ml ekstrakto, gauto ekstrakcijos metu, įpilama 8,5 ml koncentruotos

vandenilio chlorido rūgšties ir kaitinama vandens vonioje su grįţtamuoju šaldytuvu 2 valandas.

Naudoti reagentai. Tyrimų metu naudoti chemiškai švarūs reagentai, gradientinio švarumo

eliuentai ir ESC grynumo etaloniniai junginiai įsigyti iš šių gamintojų: „Sigma-Aldrich Chemie―

(Šveicarija), „Carl Roth Gmbh― (Vokietija), „Fluka Chemie― (Šveicarija), „ChromaDex― (JAV),

„Lachema― (Čekija), „Roth― (Vokietija).

Chromatografinė analizė. Antocianidinų nustatymui ESC metodu atsimatuojama 2 ml gauto

ekstrakto po rūgštinės hidrolizės, skiedţiama metanoliu iki 10 ml ir filtruojama pro membraninį,

0,22 µm porų dydţio filtrą (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Vokietija). Analizė atlikta chromatografu

Waters 2690 su dviem detektoriais: Waters 2487 UV/Vis ir Waters 996 PDA (Waters, Milford,

JAV). Kolonėlė SUPELCO HYPERSIL ODS (C18) 100×3 mm, su prieškolonėle, sorbento dalelių

dydis – 3 μm. Detekcija atliekama 520 nm bangos ilgyje. Injektuojama 10 µl tiriamojo ekstrakto.

Tėkmės greitis - 1ml/min, eliuavimas - gradientinis. Eliuentas A – acetonitrilas (ACN), eliuentas B –

4 proc. ortofosfato rūgštis (H3PO4). Naudotas gradiento kitimas: 0 min – 7 proc. A (93 proc. B), 37

min – 25 proc. A (75 proc. B), 40 min – 7 proc. A (93 proc. B), 45 min – 7 proc. A (93 proc. B).

Analizė atliekama kambario temperatūroje. Atocianidinų tapatybė nustatoma lyginant analičių

sulaikymo trukmes su etaloninių junginių sulaikymo trukmėmis ir spektrais, gautais su PDA

detektoriumi. Kiekybiniam nustatymui sudaryti antocianidinų etaloninių junginių kalibraciniai

grafikai. Etaloniniai junginiai tirpinti metanolyje ir jų tirpalai paruošti apytikrėse analičių kiekiui

bandinių ekstraktuose koncentracijų ribose.

Antioksidantinio aktyvumo nustatymas. Naudojamas DFPH metodas – fotometrinis 2,2–

difenil–1–pikrilhidrazilo (DFPH˙) laisvojo radikalo sujungimo metodas. Antioksidantinis aktyvumas

įvertinamas matuojant, kiek procentų stabilaus DFPH radikalo neutralizuoja tiriamojoje medţiagoje

esantys ir antioksidantiniu aktyvumu pasiţymintys junginiai. Antioksidanto (tiriamojo ekstrakto) 50

μl metanolinio tirpalo sumaišoma 1 cm kiuvetėje su 2 ml 6×10-5

M metanolinio DFPH tirpalo.

Page 40: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

40

Spektrofotometru išmatuojamas mėginių absorbcijos dydţio maţėjimas 515 nm bangos ilgyje kas 10

s., kol pasiekiama absorbcijos dydţio pusiausvyra (apytiksliai po 30 min.). Antioksidantinis tirpalų

aktyvumas išreiškiamas inaktyvuoto DFPH procentais:

,100

A

AAb

abDPPH

čia: Ab – tuščio bandinio adsorbcijos dydis (t = 0 min.);

Aa – bandinio su tiriamuoju tirpalu absorbcijos dydis (po 30 min.).

Nuodţiūvio nustatytas Europos farmakopėjos nurodytu metodu [63]. Cheminių tyrimų

duomenys perskaičiuoti absoliučiai sausai ţaliavai įvertinant gautus bandinių nuodţiūvio duomenis.

Mitochondrijų išskyrimas. Mitochondrijos iš Wistar ţiurkių patinėlių širdţių buvo išskiriamos

diferencinio centrifugavimo metodu 0-4 °C temperatūroje. Širdis praplaunama šaltu (4º C) tirpalu,

pasveriama, susmulkinama ţirklutėmis ir 45 sekundes stiklo-teflono homogenizatoriuje

homogenizuojama šaltoje (4C) terpėje (10 ml/g audinio), kurios sudėtis: 180 mM KCl, 10 mM

Tris-HCl, 1 mM EGTA, pH 7,7. Homogenatas centrifuguojamas 750 g greičiu 5 min., esant 4 C

temperatūrai, naudojant Centrifuge 5810R (Eppendorf AG, Vokietija) Gautas supernatantas

perkošiamas per marlę ir centrifuguojamas dar kartą 6800 g greičiu 10 min. Gautos mitochondrijų

nuosėdos suspenduojamos 150 μl suspendavimo terpės, kurios sudėtis: 180 mM KCl, 20 mM Tris-

HCl, pH 7,35.

Mitochondrijų baltymo kiekio nustatymas Biureto metodu. Baltymo kiekis

mitochondrijų suspensijoje nustatomas modifikuotu Biureto metodu [75]. Į 0,05 ml mitochondrijų

suspensijos įpilama 0,95 ml 0,33 proc. dezoksicholato tirpalo, gerai sumaišoma ir 5 min.

inkubuojama vandens termostate 37 C temperatūroje. Po to įpilama 4 ml biureto reagento,

sumaišoma ir inkubuojama vandens termostate 37 C 15 min. Gauto tirpalo optinis tankis

matuojamas spektrofotometru Hitachi 557(Hitachi, Japonija) esant 540 nm bangos ilgiui. Baltymo

kiekis surandamas pagal kalibracinę kreivę, kuriai sudaryti naudojamas standartinis baltymo tirpalas,

pagamintas iš ţmogaus serumo albumino. Mitochondrijų suspensija (50 mg/ml baltymo) buvo

laikoma leduose viso eksperimento metu.

Mitochondrijų kvėpavimo matavimas. Mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo matuojamas

termostatuojamoje kiuvetėje su Klarko tipo deguonies elektrodu (Radiometer, Danija) su poligrafine

sistema BioMed, 37C temperatūroje 1,5 ml matavimo terpėje, kurios sudėtis: 150 mM KCl, 10 mM

Tris-HCl, 5 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, pH 7,2, su substratais: 1) 5 mM piruvato ir 5 mM malato

Page 41: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

41

arba 2) 15 mM sukcinato (+2 mM amitalio). Ištirpusio deguonies kiekis terpėje laikomas 420

nmolO/ml. Mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje (V2) buvo

registruojamas į terpę pridedant 0,5 mg/ml mitochondrijų ir atitinkamo substrato, o pridėjus 1 mM

ADP buvo registruojamas mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje (V3) (4

pav.). Pridėjus 0,12 mM atraktilozido, kuris yra ADP/ATP-nešiklio inhibitorius, registravome

mitochondrijų kvėpavimo greitį ketvirtoje metabolinėje būsenoje (VATR). Mitochondrijų išorinės

membranos intaktiškumui įvertinti atlikome citochromo c testą, į terpę pridėdami 32 μM citochromo

c (VATR+cyt c) [247] ir įvertindami, kokiu laipsniu citochromas c stimuliuoja kvėpavimą.

Mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas (KKK) apskaičiuojamas pagal deguonies

suvartojimo greitį trečioje ir antroje metabolinėse būsenose (KKK = V3/V2). Matuojant nuo

fosforilinimo atskirtą mitochondrijų kvėpavimo greitį, vietoj ADP į matavimo terpę buvo pridedama

0,19 μM karbonilcianido-m-chlorofenilhidrazono (CCCP). Veikiant CCCP, elektronai pernešami

kvėpavimo grandine deguoniui, bet ATP sintezė nevyksta. Mitochondrijų kvėpavimo greitis

išreikštas nmolO/min/mg mitochondrijų baltymo.

4 pav. Širdies mitochondrijų kvėpavimo (deguonies suvartojimo) registravimo kreivė, oksiduojant

mitochondrijoms piruvatą + malatą. Mitochondrijų kvėpavimas buvo registruojamas standartinėje

mitochondrijų kvėpavimo matavimo terpėje. Substratai: 5 mM piruvato + 5 mM malato. Priedai: O-

mitochondrijos (0,5 mg baltymo/ml); A1- 1 mM ADP; A2- 0,12 mM atraktilozido; A3 - 32 µM

citochromo c.

Paaiškinimas: į matavimo terpę įvedus 0,5 mg/ml mitochondrijų ir substratą, registruojama antroji

mitochondrijų metabolinė būsena (būsena, kai terpėje yra deguonies, oksiduojamo substrato ir

mitochondrijų). Į terpę įvedus prisotinančią ADP (200 μM-1mM) koncentraciją, mitochondrijos pereina

į trečiąją metabolinę būseną (V3), nes ATP sintazė pradeda fosforilinti ADP, naudodama membraninį

Page 42: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

42

potencialą. Pridėjus atraktilozido, kuris yra ADP/ATP-nešiklio inhibitorius, mitochondrijos pereina į

ketvirtą metabolinę būseną (VATR). Mitochondrijų kvėpavimo greičio stimuliavimas pridėjus į terpę

citochromo c, rodo mitochondrijų išorinės membranos intaktiliškumą arba citochromo c redukciją.

Svarbus rodiklis yra mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas (KKK, angl. RCI, respiratory

control index). Jis nustatomas pagal deguonies sunaudojimo greitį trečioje ir antroje metabolinėse

būsenose (KKK = V3/V2) ir atspindi mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo pajėgumą, tai yra

pajėgumą sintetinti ATP. Kuo didesnis mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas, tuo yra geresnė

mitochondrijų funkcinė būsena.

Tiriant mėlynės vaisių sausojo ekstrakto poveikį mitochondrijoms, uţregistravus

mitochondrijų kvėpavimo greitį antroje metabolinėje būsenoje, vandeniniai ir etanoliniai ekstraktai

(3,5 mg) ištirpinti 100 μl vandens) į matavimo kiuvetę buvo pridedami skirtingais kiekiais

(vandeninis ekstraktas: 1 μl; 2,5 μl; 5 μl; 10 μl; 15 μl; 20 μl; 30 μl ir 60 μl į 1,5 ml matavimo terpės;

etanolinis ekstraktas: 0,5 μl; 1 μl; 5 μl; 10 μl; 20 μl ir 30 μl į 1,5 ml matavimo terpės) ir toliau buvo

registruojamas mitochondrijų kvėpavimas. Antocianidinų kiekiai esantys 1-ame mililitre kiuvetės

pateikiami 4 ir 5 lentelėse. Etaloninių junginių (antocianininų) mišinys paruoštas tirpinant juos

vandenyje. Antocianinų kiekis 1-ame μl mišinio buvo: cianidin-3-galaktozido 0,96 μg, malvidin-3-

galaktozido 0,45 μg ir malvidin-3-gliukozido 1,17 μg.

4 lentelė. Antocianidinų kiekiai ng/ml, įdėjus skirtingus kiekius liofilizuoto vandeninio mėlynių

vaisių ekstrakto(MVE) į 1,5 ml matavimo terpės.

Ekstrakto

kiekis, µl

Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas

Kiekis, ng/ml

1

2,5

5

10

15

20

0,140

0,349

0,698

1,396

2,094

2,792

0,361

0,903

1,805

3,610

5,415

7,220

0,215

0,537

1,074

2,147

3,221

4,294

0,150

0,376

0,752

1,503

2,255

3,01

0,314

0,785

1,570

3,140

4,710

6,280

Page 43: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

43

30

60

4,188

8,376

10,830

21,660

6,441

12,882

4,509

9,018

9,420

18,840

5 lentelė. Antocianidinų kiekiai ng/ml, įdėjus skirtingus kiekius liofilizuoto etanolinio mėlynių vaisių

ekstrakto (EME) į 1,5 ml matavimo terpės.

Ekstrakto

kiekis, µl

Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas

Kiekis, ng/ml

0,5

1

5

15

20

30

0,088

0,175

0,875

2,625

3,500

5,250

0,399

0,797

3,985

11,955

15,94

23,91

0,129

0,258

1,290

3,870

5,160

7,740

0,096

0,191

2,865

3,820

3,820

5,730

0,138

0,276

1,380

4,140

5,520

8,280

Tyrimų duomenų statistinis įvertinimas. Statistiniam gautų duomenų apdorojimui ir

įvertinimui matematiniais-statistiniais metodais naudotas SPSS 17 (SPSS Inc., Čikaga, JAV)

statistinis paketas. SPSS pagalba apskaičiuota eksperimentinių tyrimų duomenų padėties ir sklaidos

(išsibarstymo) charakteristikos. Grafiniam gautų rezultatų pavaizdavimui naudota MS Excel

(Microsoft, JAV) kompiuterinė programa. Hierarchinės klasterinės analizės metodas pritaikytas

Vaccinium myrtillus L. gamtinių cenopopuliacijų bei skirtingų šilauogės veislių pavyzdţių

panašumo įvertinimui ir palyginimui pagal antocianidinų kiekius tiriamuose pavyzdţių grupėse.

Duomenų jungimui naudotas tolimiausio kaimyno klasterizavimo algoritmas, panašumo matu

naudojant euklidinį atstumą. Imčių normalumo prielaida tikrinama panaudojant Shapiro-Wilk‗o

testą. Cheminių poţymių skirtumų palyginimui skirtinguose Lietuvos regionuose surinktuose

Vaccinium myrtillus L. ėminiuose bei ėminiuose, rinktuose skirtingose šalyse ir tirtų šilauogių

veislių pavyzdţiuose skirtinguose klasterinės analizės pogrupiuose taikyti ranginiai Mann‗o

Whitney‗o (2 grupių atveju) ir Kruskal‘o Wallis‘o (3 ir daugiau grupių atvejų) testai. Taikant

daugkartinių porinių palyginimų Dunn‘o testą nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp atskirų

Page 44: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

44

lyginamų duomenų grupių pagal atitinkamo antocianidino kiekius. Pritaikius blokuotų duomenų

vienfaktorinę dispersinę analizę, nustatytas atskirų antocianidinų statistiškai reikšmingas kitimas

laiko atţvilgiu. Vaccinium myrtillus L. ekstrakto poveikio širdies mitochondrijų funkcijai tyrimuose

gautų rezultatų vidurkiai pateikiami su standartinėmis paklaidomis, o skirtumai tarp vidurkių

įvertinti Stjudento t kriterijumi poriniams bandymams.

3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

Page 45: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

45

3.1. Vaccinium L. genties augalų vaisių antocianinų ir antocianidinų sudėties ir

kiekybinių rodiklių įvairavimo vertinimas

3.1.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos sukūrimas Vaccinium myrtillus L.

vaisių vaistinių augalinių ţaliavų antocianidinų kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimui

Šiuolaikinių, patikimų analizės metodų taikymas yra būtinas siekiant uţtikrinti vartojamų vaistinių

augalinių ţaliavų bei gaunamų fitopreparatų kokybės kontrolę bei atliekant cheminės sudėties

įvairovės tyrimus. Siekiant efektyviai išskirstyti, patikimai identifikuoti ir tiksliai įvertinti veikliųjų

junginių kiekinę sudėtį svarbu pasirinkti jautrius ir informatyvius metodus. Atrankių metodikų

kūrimas ir pritaikymas yra vienas iš svarbiausių šiuolaikinio mokslo uţdavinių.

Ekstrakcijos metodo optimizavimas. Ekstrakcijos tirpiklio poliškumo bei ekstrakcijos metodo

parinkimas yra svarbus pradinis ţingsnis optimizuojant augalinių ţaliavų ekstrakcijos sąlygas.

Daţniausiai antocianinų ekstrakcijai yra naudojama metanolis ir etanolis bei jų mišiniai su vandeniu.

Antocianinai neutralioje ar šariminėje aplinkoje yra nestabilūs, todėl pridedami nedideli vandenilio

chlorido, acto, citrinų, skruzdţių, vyno ar trifluoracto rūgšties kiekiai pagerinantys antocianinų

stabilumą [48, 55, 268, 277]. Atliekant tyrimus gautuose ekstraktuose esantys antocianinai buvo

hidrolizuojami.

Vertinant tirpiklio poliškumo įtaką antocianinų išeigai buvo taikytas maceracijos metodas,

suminį antocianinų kiekį nustatant spektrofotometriniu metodu. Tirta antocianinų ekstrakcijos išeiga

ekstrahuojant metanoliu ir etanoliu bei jų mišiniais su vandeniu. Tyrimams buvo naudotos 30, 50, 70,

96 proc. (v/v) etanolio koncentracijos. Vertinant etanolio ir vandeninių jo tirpalų įtaką ekstrakcijos

išeigai nustatyta, jog 50 proc. (v/v) etanolinis tirpalas uţtikrina didţiausią antocianinų kiekio išeigą

(1,421 proc.). Vertinant metanolio ir įvairių jo mišinių su vandeniu (30, 50, 70 proc. (v/v)) įtaką

ekstrakcijos išgavai nustatyta, kad didţiausia antocianinų išeiga (2,184 proc.) gaunama ekstrakcijos

tirpikliu naudojant 100 proc. metanolį. Suminiai antocianinų kiekiai mėlynių vaisių ekstraktuose

pateikti 5 ir 6 pav. Ekstrahuojant vandeniu, gauta maţiausia antocianinų išgava. Suminis antocianinų

kiekis tirtuose ţaliavų pavyzdţiuose ekstrakcijos tirpikliu naudojant vandenį siekė tik 0,710 proc.

Page 46: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

46

5 pav. Suminis antocianinų kiekis Vaccinium myrtillus L. vaisių ėminiuose, ekstrakcijai naudojant,

įvairių koncentracijų etanolį (n=3)

6 pav. Suminis antocianinų kiekis Vaccinium myrtillus L. vaisių ėminiuose, ekstrakcijai naudojant,

įvairių koncentracijų metanolį (n=3)

Remiantis gautais rezultatais, tolimesniuose tyrimuose vertinta ekstrakcijos trukmės įtaka

antocianinų išgavai mėlynių vaisiuose. Ekstrakcijos efektyvumo palyginamiesiems tyrimams

pasirinkta: maceracijos ir modifikuotos maceracijos metodai augalinę ţaliavą veikiant ultragarsu,

ekstrakcijos tirpikliu naudojant 100 proc. metanolį. Įvertinta antocianinų ekstrakcijos išeiga mėlynių

vaisių pavyzdţius maceruojant skirtingais laiko intervalais (0,25, 0,5, 1, 2, 24 val.).

Page 47: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

47

Nustatyta, jog maceracijos metodo efektyvumas didėja ilgėjant ekspozicijos laikui (7 pav.).

Didţiausias antocianinų kiekis gautas ekstrahuojant maceracijos metodu 24 valandas (2,525 proc.).

Vertinant ekstrakcijos ultragarso vonelėje efektyvumą, bandiniai buvo ekstrahuojami skirtingais laiko

intervalais (5, 10, 20, 30, 60 min.). Suminė antocianinų išgava, gauta veikiant ultragarsu skirtingais

laiko intervalais pateikta 8 pav. Nustatyta, kad bandinius veikiant 10 minučių ultragarsu gauta

didţiausia ekstrakcijos išeiga (3,461 proc.). Ilginant ultragarsinės ekstrakcijos ekspozicijos laiką,

antocianinų išgava sumaţėja, todėl tolimesniems tyrimams pasirinkta 10 min. trunkanti ekstrakcija

ultragarso vonelėje, kambario temperatūroje.

7 pav. Suminis antocianinų kiekis Vaccinium myrtillus L. vaisių ėminiuose, ekstrahuojant

maceracijos metodu (n=3)

8 pav. Suminis antocianinų kiekis Vaccinium myrtillus L. vaisių ėminiuose, ekstrahuojant

modifikuotos maceracijos metodu ultragarso vonelėje (n=3)

Page 48: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

48

Antocianinų rūgštinės hidrolizės optimizavimas. Literatūros duomenimis V. myrtillus L.

vaisių ekstraktuose nustatyta daugiau kaip 15 antocianinų [106]. Išskirti, identifikuoti ir įvertinti

kiekybiškai antocianinų kompleksą mėlynių vaisių ekstraktuose ESC metodu yra sudėtinga todėl,

kad daugelio etaloninių junginių rinkoje nėra. Atlikti masių spektroskopijos tyrimai parodė, kad

efektyvus antocianinų išskirstymas vienoje ESC gradientinėje eliucijoje yra labai sudėtingas ir tai

gali turėti įtakos suminio antocianinų kiekio skaičiavimo tikslumui [106]. Siekiant tiriamus

junginius efektyviai išskirstyti ir identifikuoti pasirinkta rūgštinė hidrolizė. Rūgštinės hidrolizės

metu hidrolizavus glikozidus, mėlynių vaisiuose nustatomi 5 antocianidinai (delfinidinas, cianidinas,

petunidinas, peonidinas, malvidinas). Antocianidinus galima efektyviai išskirstyti, identifikuoti ir

kiekybiškai įvertinti.

Antocianidinų hidrolizės išeiga vertinta panaudojant skirtingus 35 proc. vandenilio chlorido

rūgšties kiekius (4, 6, 8,5, 10 ml). Įvertinta antocianidinų išeiga hidrolizuojant glikozidus vandenilio

chlorido rūgštimi 2 valandas. Nustatyta, jog pridėjus 8,5 ml vandenilio chlorido rūgšties gaunamas

didţiausias suminis antocianidinų kiekis (2,572 proc.). Naudojant 8,5 ml vandenilio chlorido

rūgšties taip pat gaunami ir didţiausi individualių antocianidinų kiekiai (6 lentelė).

Antocianinų hidrolizė ir aglikonų susidarymas buvo taip pat vertinamas atsiţvelgiant į ESC

chromatogramose esančių smailių pokyčius. Hidrolizei naudojant 4 ml vandenilio chlorido rūgšties

dauguma antocianinų hidrolizuojasi, tačiau vis dar stebimos maţos antocianinų smailės sulaikymo

trukmei esant 6-14 min. (9a pav.). Hidrolizei panaudojus 8,5 ml vandenilio chlorido rūgšties,

antocianinų smailių chromatogramoje nenustatyta (9b pav.). Naudojant 6 ml ir 8,5 ml vandenilio

chlorido rūgšties buvo gauti panašūs individualių antocianidinų kiekiai. Delfinidino ir malvidino

kiekiai liko nepakitę, tačiau kitų antocianidinų kiekis šiek tiek padidėjo. Didinant vandenilio

chlorido rūgšties kiekį nustatytas individualių antocianidinų kiekio maţėjimas.

Atliekant antocianidinų sudėties tyrimus hidrolizės metu skirtingais laiko intervalais (7

lentelė) buvo nustatyta, kad 2 val. trukmės hidrolizė sąlygoja didţiausią suminį bei individualių

antocianidinų kiekį. Delfinidino kiekis pradėjo maţėti esant 2 val. hidrolizės trukmei. Gauti tyrimų

rezultatai sutapo su literatūroje skelbtais mokslinių tyrimų duomenimis, kad delfinidinas yra

nestabilus esamomis hidrolizės sąlygomis [277]. Padidinus hidrolizės trukmę iki 2,5 val., suminis

antocianidinų kiekis sumaţėjo.

Įvertinus vandenilio chlorido rūgšties kiekio bei hidrolizės trukmės įtaką antocianidinų išeigai,

tolimesniuose tyrimuose taikyta 2 val. trukmės hidrolizė, panaudojant 8,5 ml vandenilio chlorido

rūgšties.

Page 49: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

49

6 lentelė. Antocianidinų kiekiai proc., hidrolizei panaudojus skirtingus 35 proc. vandenilio chlorido

rūgšties kiekius

35 proc. Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas Suma

HCl proc. proc. proc. proc. proc. proc.

4 ml 0,380±0,019 1,132±0,011 0,323±0,014 0,341±0,016 0,299±0,015 2,484±0,034

6 ml 0,331±0,022 1,194±0,014 0,380±0,017 0,344±0,020 0,291±0,013 2,533±0,021

8,5 ml 0,333±0,024 1,212±0,019 0,390±0,011 0,349±0,013 0,295±0,012 2,572±0,042

10 ml 0,241±0,021 1,185±0,020 0,360±0,032 0,303±0,011 0,262±0,010 2,344±0,062

Reikšmės yra trijų bandinių vidurkiai ± vidurkio standartinė paklaida.

9 pav. Vaccinium myrtillus L. vaisių ekstrakto ESC chromatogramos hidrolizei panaudojus 4 ml (a)

ir 8,5 ml (b) 35 proc. vandenilio chlorido rūgšties.

Analičių smailės: 1- delfinidinas, 2- cianidinas, 3- petunidinas, 4- peonidinas, 5- malvidinas

Page 50: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

50

7 lentelė. Antocianidinų sudėtis proc. hidrolizės metu

Hidrolizės Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas Suma

trukmė (val) proc. proc. proc. proc. proc. proc.

1 0,272±0,056 0,882±0,190 0,293±0,061 0,242±0,050 0,301±0,052 1,886±0,410

1,5 0,341±0,010 1,123±0,017 0,364±0,013 0,304±0,013 0,264±0,009 2,393±0,042

2 0,332±0,023 1,206±0,022 0,390±0,014 0,351±0,010 0,294±0,009 2,567±0,052

2,5 0,287±0,010 0,204±0,014 0,367±0,006 0,354±0,012 0,291±0,012 2,490±0,021

Reikšmės yra trijų bandinių vidurkiai ± vidurkio standartinė paklaida.

Chromatografinio skirstymo optimizavimas. Biologiškai aktyvių junginių kokybiniam ir

kiekybiniam nustatymui vaistinėse augalinėse ţaliavose, plačiai taikomas ESC metodas. ESC

metodo vystymo ir įteisinimo parametrai plačiai aprašyti ir išanalizuoti mokslinėje literatūroje [6,

134]. Būtina įvertinti pagrindinius ESC metodo įteisinimo etapus.

8 lentelė. Analičių smailių skiriamoji geba (Rs) antocianidinų mišinyje

An

toci

an

idin

as

Del

finid

inas

Cia

nid

inas

Pet

unid

inas

Peo

nid

inas

Mal

vid

inas

Rs 7,15 6,88 3,70 2,46

Metodo įteisinimas atliktas naudojant mėlynių vaisių ekstraktus. Daţniausiai taikomi organiniai

tirpikliai atvirkščių fazių ESC yra acetonitrilas ir metanolis. Acetonitrilo/vandens mišiniai sąlygoja

2,5 karto maţesnį klampumą nei atitinkami metanolio/vandens tirpalai, dėl to galima pasiekti net 2,5

karto didesnį tėkmės greitį. Dėl minėtų teigiamų savybių acetonitrilas pasirinktas tolimesniam

metodo vystymui. Pastaruoju metu dauguma ESC metodų naudoja įvairius kiekius rūgšties judrioje

fazėje, rūgštinės terpės palaikymui, kad uţtikrinti antocianinų stabilumą, flavilijaus katijono

formoje. Metodą optimizavome naudojant 4 proc. vandeninį ortofosfato rūgšties tirpalą. Pradiniai

tyrimai su standartinių junginių mišiniu atlikti siekiant optimalaus chromatografinio skirstymo.

Analogiškos sąlygos taikytos ir mėlynių vaisių ekstraktams. Pageidaujamos skiriamosios gebos

reikšmės (Rs >2) pasiektos etaloninių junginių ir ekstraktų pavyzdţiuose (8 lentelė).

Visų antocianidinų kalibracinėse kreivėse stebima ryški koreliacija. Koreliacijos koeficiento

(R2) reikšmės visiems analizuojamiems junginiams buvo didesnės uţ 0,99 ir patvirtino vystomo

kiekinio nustatymo metodo tiesiškumą. Tiesinės regresijos lygtys, koreliacijos koeficientai ir

Page 51: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

51

nustatymo ribos pateiktos 9 lentelėje. Aptikimo ir nustatymo ribos tiriamiems junginiams buvo

įvertintos lyginant smailės aukštį su bazinės linijos triukšmu. Šie ribiniai parametrai svarbūs

kokybiniam ir kiekiniam tiriamų junginių nustatymui. Aptikimo ribos reikšmės svyravo nuo 0,034

iki 0,085 µg/ml, o nustatymo - atitinkamai nuo 0,076 iki 0,190 µg/ml.

9 lentelė. Antocianidinų tiesinės regresijos lygtys, koreliacijos koeficientai bei analičių aptikimo ir

nustatymo ribinės koncentracijos

Antocianidinai Regresijos Koreliacijos Aptikimo riba Nustatymo riba

lygtis koeficientas (R2) (µg/mL) (µg/mL)

Delfinidinas Y = 5,33·106x + 7,70·10

3 0,9993 0,034 0,080

Cianidinas Y = 2,54·106x + 3,82·10

3 0,9997 0,038 0,076

Petunidinas Y = 2,45·106x – 1,24·10

3 0,9991 0,085 0,190

Peonidinas Y = 2,39·106x + 1,37·10

3 0,9929 0,080 0,186

Malvidinas Y = 3,35·106x + 4,82·10

3 0,9945 0,055 0,127

Vystomo metodo glaudumo įvertinimui buvo apskaičiuotas gautų rezultatų pakartojamumas

ir atkuriamumas, kurie išreiškiami variacijos koeficientu (V). Metodo pakartojamumas ir

atkuriamumas sulaikymo trukmei V neviršija 3,4 proc., tuo tarpu šie statistiniai parametrai smailių

plotams yra pakankami ir V neviršija 4,0 proc. (10 lentelė).

10 lentelė. ESC metodo akuriamumas ir pakartojamumas

Antocianidinai

V, proc.

Sulaikymo

trukmė

Smailės

plotas

Analizė

po

analizės

Diena

po

dienos

Ekstrakcija

po

ekstrakcijos

Analizė

po

analizės

Diena

po

dienos

Ekstrakcija

po

ekstrakcijos

Delfinidinas

Cianidinas

Petunidinas

Peonidinas

Malvidinas

0,53

0,34

0,36

0,36

0,28

3,39

3,15

2,12

1,55

1,32

1,33

1,05

0,93

0,80

0,72

1,64

1,89

1,75

1,83

1,40

0,32

1,27

0,85

1,09

3,07

3,96

2,65

2,77

1,91

2,77

Sukurta ESC metodika V. myrtillus L. vaisių augalinių ţaliavų antocianidinų kokybinės ir

kiekybinės sudėties tyrimui. Optimizuotos ekstrakcijos sąlygos įvertinant svarbiausių ekstrahavimo

veiksnių įtaką antocianinų ekstrakcijos efektyvumui. Gauti duomenys apie ekstrakcijos tirpiklio

poliškumo ir ekstrakcijos metodo įtaką antocianinų sudėties rodikliams yra svarbūs siekiant gauti

optimalią ekstrakcijos išeigą. Nustatyta, kad didţiausi antocianinų kiekiai gaunami ekstrakcijos

tirpikliu naudojant 100 proc. metanolį ir ekstrahuojant vaistinių augalinių ţaliavų bandinius

ultragarso vonelėje 10 min.

Page 52: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

52

Parinktos optimalios rūgštinės hidrolizės sąlygos, uţtikrinančios maksimalią antocianinų

hidrolizę ir antocianidinų išeigą. Atliktų tyrimų rezultatai patvirtino sukurtos atvirkščių fazių ESC

metodikos tinkamumą efektyviam antocianidinų išskirstymui. Gauti pagrindinių metodikos

įteisinimo kriterijų parametrai patvirtinantys patikimumą bei tikslumą kokybiniam ir kiekiniam

antocianidinų įvertinimui V. myrtillus L vaisių vaistinėse augalinėse ţaliavose. Sukurtas ir įteisintas

ESC metodas gali būti sėkmingai pritaikytas ir kitų augalinių ţaliavų, kaupiančių antocianinus,

kokybinei bei kiekybinei analizei.

3.1.2. Antocianinų sudėties įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisiuose, surinktuose iš

gamtinių cenopopuliacijų

Uţtikrinant vartojamų vaistinių augalinių preparatų kokybę ir saugumą būtina atlikti naudojamų

vaistinių augalinių ţaliavų tapatybę įrodančius taksonominius ar genetinius tyrimus. Daugeliu atvejų

vaistiniuose preparatuose ar augaliniuose ekstraktuose taksonominė ar genetinė analizė yra sudėtinga

ar negalima, tuomet tokių pavyzdţių tapatybė bei kokybė vertinama remiantis cheminės analizės

parametrais. Biologiškai aktyvių junginių tapatybė vaistinėje augalinėje ţaliavoje nustatoma lyginant

juos su etaloniniais junginiais [32, 42, 135].

Įvertinus biologiškai aktyvių junginių tapatybę vertinama augalinės ţaliavos kokybė.

Standartizacijos tikslas yra garantuoti vartojamų ţaliavų cheminės sudėties, bei numatomų

farmakologinių bei fiziologinių efektų pastovumą. Vaistinėje augalinėje ţaliavoje esantys biologiškai

aktyvūs junginiai, turintys tiesioginį terapinį poveikį paprastai pasirenkami kaip cheminiai ţymenys,

uţtikrinantys naudojamų preparatų kokybę, saugumą bei efektyvumą [32, 42, 153, 212].

V. myrtillus L. vaisių paruošos vykdomos gamtinėse cenopopuliacijose daugelyje šalių [10,

28]. Geografinė padėtis, skirtingos klimatinės sąlygos, paruošų laikas bei laikymo sąlygos gali turėti

didelės įtakos vaistinių augalinių ţaliavų cheminės sudėties kokybinių ir kiekybinių rodiklių

pastovumui. Suomijos mokslininkų atlikti tyrimai įrodo, kad galimas didelis cheminės sudėties

kokybinių ir kiekybinių parametrų išsibarstymas tarp toje pačioje šalyje surinktų ėminių [145].

Europos bei daugelio šalių farmakopėjose V. myrtillus L. vaisių kokybė vertinama atsiţvelgiant į

pagrindinių komponentų, lemiančių farmakologinį poveikį - antocianinų, kokybinės ir kiekybinės

sudėties rodiklius. Ruošiant kokybišką vaistinę augalinę ţaliavą, svarbu įvertinti Lietuvos

respublikos teritorijoje surinktų V. myrtillus L. vaisių augalinės ţaliavos antocianinų sudėtį, jos

įvairavimo dėsningumus pavyzdţiuose, rinktuose skirtingose cenopopuliacijose

Mėlynių vaisių cheminės sudėties tyrimai atlikti spektrofotometriniu (antocianinų suminis

kiekis) ir optimizuotu ESC (antocianidinų) metodais. Abu metodai plačiai taikomi ir papildo vienas

Page 53: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

53

kitą [148, 206]. Antocianinų sudėties tyrimas atliktas spektrofotometriniu metodu. Šiuo metodu

nustatomas suminis antocianinų kiekis, perskaičiuojant cianidin-3-gliukozidu. Moksliniu poţiūriu

svarbu išsiaiškinti atskirų biologiškai aktyvių junginių pasiskirstymo pobūdį. Rūgštinės hidrolizės

metu gautoje chromatogramoje ryškiai matomos penkios identifikuotų analičių smailės. Visuose

tirtuose mėginiuose nustatyti šie antocianidinai: delfinidinas, cianidinas, petunidinas, peonidinas ir

malvidinas.

Nustatyta plati suminio antocianinų ir antocianidinų kiekio varijavimo amplitudė.

Antocianinų suminis kiekis kito nuo 0,828 iki 5,372 proc., tuo tarpu antocianidinų suminis kiekis

varijavo nuo 0,743 iki 5,722 proc. (10 pav.). Panašūs rezultatai pateikiami ir Suomijos mokslininkų

darbuose, kuriuose suminis antocianinų kiekis šios šalies skirtingų cenopopuliacijų bandiniuose taip

pat ţenkliai varijavo, tačiau nustatytas vidutinis suminis antocianinų kiekis yra 2,878 proc. ir

panašus į Lietuvos teritorijoje rinktų pavyzdţių antocianinų kiekio vidurkį (2,488 proc.) [145].

Maţesni suminiai antocianinų kiekiai nustatyti Italijos teritorijoje surinktuose pavyzdţiuose,

kuriuose jų kiekis varijavo nuo 1,833 iki 1,889 proc. [74]. Estijos mokslininkų atlikti tyrimai parodė,

kad jų šalyje rinktuose V. myrtillus L. ėminiuose antocianinų suminis kiekis - 2,222 proc. [236].

10 pav. Suminio antocianinų ir antocianidinų kiekio įvairavimas gamtinių Vaccinium myrtillus L.

cenopopuliacijų vaisių ėminiuose

Page 54: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

54

11 lentelė. Vaccinium myrtillus L. gamtinėse cenopopuliacijose surinktų vaisių pavyzdţių

antocianidinų sudėties ir sklaidos charakteristika (n=75)

Antocianidinai

Keikis, proc.

S x Me V, proc. Min. Maks. M

Delfinidinas 0,083 1,305 0,451 0,032 0,349 60,53

Cianidinas 0,335 2,236 1,088 0,049 1,025 39,15

Petunidinas 0,101 1,058 0,442 0,026 0,366 50,68

Peonidinas 0,087 0,519 0,260 0,011 0,261 35,77

Malvidinas 0,054 0,799 0,289 0,018 0,260 55,02

Min. – minimali reikšmė, Maks. – maksimali reikšmė, M – aritmetinis vidurkis, S x - vidurkio standartinė paklaida, Me –

mediana, V – variacijos koeficientas.

V. myrtillus L. vaisių metanolinio ekstrakto chromatograma pateikta 11 pav. ESC metodu

tirtuose V. myrtillus L. ekstraktuose kaip ir kitų tyrėjų darbuose nustatytas vyraujantis antocianidinas

– cianidinas [277]. Jo kiekis tirtuose mėginiuose svyravo nuo 0,335 iki 2,236 proc. Nustatyti

maţiausi peonidino (0,087 - 0,519 proc.) ir malvidino (0,054 - 0,799 proc.) kiekiai. Antocianidinų

sudėties ir sklaidos charakteristikos pateiktos 11 lenteleje.

Vykdant mėlynių vaisių vaistinių augalinių ţaliavų paruošas Lietuvos respublikoje, svarbu

uţtikrinti naudojamų ţaliavų kokybę bei įvertinti cheminės sudėties homogeniškumą. Siekiant įvertinti

vietinės V. myrtillus L. ţaliavos cheminės sudėties panašumus bei skirtumus ir tikėtinas sąsajas su

atskiromis augavietėmis atlikta gautų duomenų hierarchinė klasterinė analizė. Klasterinės analizės

dendrogramoje, sudarytoje pagal individualių antocianidinų kiekius ţaliavose, surinktose iš 75

skirtingų cenopopuliacijų ryškiai išsiskyrė dvi grupės: didesnė I-oji ir kiek maţesnė II-oji (12 pav.).

Pirmąją grupę sudaro du pogrupiai: II-1-asis ir I-2-asis. I-ajam pogrupiui priskiriama 18

cenopopuliacijų (Nr. 3, 7, 1, 10, 4, 15, 6, 5, 16,17, 14, 18, 2, 12, 11, 8, 9 13), kuriose surinkti

pavyzdţiai išsiskyrė maţiausiu vidutiniu suminiu antocianidinų kiekiu (1,667 proc.). Pogrupio

ţaliavoms taip pat būdingi ţymiai maţesni uţ vidutinius visų antocianidinų kiekiai.

I-2-asis pogrupis yra pats didţiausias ir jį sudaro 39 cenopopuliacijos (Nr. 35, 54, 57, 24, 41,

25, 19, 42, 29, 36, 23, 30, 21, 22, 43, 47, 27, 31, 26, 34, 44, 46, 45, 32, 37, 20, 40, 28, 39, 33, 43, 38,

50, 52, 53, 56, 49, 51, 55). Pogrupiui priklausančių cenopopuliacijų suminis kiekis (3,574 proc.) bei

visų antocianidinų kiekiai artimiausi vidutiniam jų kiekiui. Išskirtinai didelis suminis (5,140 proc.) bei

individualių antocianidinų kiekis nustatytas 55-oje cenopopuliacijoje.

Page 55: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

55

11 pav. Vaccinium myrtillus L.vaisių ekstrakto ESC chromatograma.

Analičių smailės pagal sulaikymo trukmę: 1- delfinidinas, 2- cianidinas, 3- petunidinas, 4-

peonidinas, 5- malvidinas

Antroji, daug maţesnė grupė taip pat susideda iš dviejų pogrupių: II-1-ojo ir II-2-ojo. II-1-jam

pogrupiui priklauso 13 cenopopuliacijų (Nr. 74, 75, 72, 71, 73, 58, 59, 65, 67, 63, 70, 68, 64). Šio

pogrupio cenopouliacijose nustatytas didţiausias suminis antocianidinų kiekis (3,050 proc.),

didesniais uţ vidurkį delfinidino, (nuo 0,276 iki 0,963 proc.), cianidino (nuo 0,496 iki 2,010 proc.),

petunidino (nuo 0,298 iki 0,868 proc.) ir peonidino (nuo 0,108 iki 0,469 proc.) kiekis.

II-2-ąjį, patį maţiausią, pogrupį sudaro 5 cenopopuliacijos (Nr. 61, 66, 62, 69, 60), kuriose

nustatyti didţiausi ciandinio kiekiai, svyruojantys nuo 0,836 iki 1,729 proc., o vidurkis (1,481 proc.),

viršijantis vidutinį šio antocianidino kiekį (1,088 proc.). Šiam pogrupiui priklausančių cenopopuliacijų

individualių antocianidinų vidurkiai didesni uţ kitų pogrupių bei visų cenopopuliacijų vidutinius

kiekius. Hierarchinės klasterinės analizės pagalba išskirtų pogrupių statistiniam palyginimui taikytas

Kruskal‗o-Wallis‗o ranginis kriterijus nepriklausomoms imtims.

Naudojantis Kruskal‗o-Wallis‗o testu nustatyta, kad klasterinės analizės būdu išskirti pogrupiai

statistiškai reikšmingai (p<0,05) skiriasi pagal delfinidino, cianidino, petunidino ir malvidino kiekius

mėlynių ţaliavose.

Page 56: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

56

I-1

Antocianidinai

Kiekis, proc.

Min. Maks. Me Q3-Q1

Delfinidinas 0,083 0,387 0,231 0,112

Cianidinas 0,335 1,388 0,752 0,415

Petunidinas 0,101 0,437 0,255 0,146

Peonidinas 0,087 0,385 0,203 0,128

Malvidinas 0,054 0,372 0,165 0,093

I-2

AAntocianidinai

Kiekis, proc.

Min. Maks. Me Q3-Q1

Delfinidinas 0,068 1,305 0,349 0,286

Cianidinas 0,592 2,236 1,073 0,463

Petunidinas 0,095 1,058 0,376 0,268

Peonidinas 0,144 0,519 0,281 0,112

Malvidinas 0,088 0,799 0,274 0,163

II-1

Antocianidinai

Kiekis, proc.

Min. Maks. Me Q3-Q1

Delfinidinas 0,276 0,963 0,572 0,505

Cianidinas 0,496 2,010 1,082 1,005

Petunidinas 0,298 0,868 0,627 0,360

Peonidinas 0,108 0,469 0,220 0,194

Malvidinas 0,159 0,647 0,340 0,262

II-2

Antocianidinai

Kiekis, proc.

Min. Maks. Me Q3-Q1

Delfinidinas 0,404 0,873 0,761 0,265

Cianidinas 0,836 1,729 1,647 0,502

Petunidinas 0,441 0,774 0,703 0,213

Peonidinas 0,185 0,368 0,316 0,116

Malvidinas 0,261 0,540 0,470 0,184

Min. – minimali reikšmė,

Maks. – maksimali reikšmė,

Me – mediana,

Q3-Q1 – kvartilinis plotis

12 pav. Vaccinium myrtillus L. gamtinėse cenopopuliacijose surinktų vaisių pavyzdţių panašumo

dendorograma sudaryta pagal antocianidinų sudėtį mėlynių vaisių ţaliavose ir identifikuotų analičių

sudėties bei sklaidos charakteristikos pogrupiuose

Page 57: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

57

12 lentelė. Vaccinium myrtillus L. vaisių ėminių klasterinės analizės pogrupių cheminių poţymių

daugkartinių porinių palyginimų Dunn‘o testo reikšmės

Pogrupių numeriai pagal 12 pav.; * p<0,05, **<0,01

Taikant daugkartinių porinių palyginimų Dunn‗o testą nustatyta, kad daugiausiai statistiškai

reikšmingų skirtumų yra tarp I-1 ir I-2 bei tarp I-1 ir II-2 klasterinės analizės pogrupių. I-

1 ir I-2 klasteriai statistiškai reikšmingai skyrėsi pagal delfinidino, cianidino, petunidino ir

0%

20%

40%

60%

80%

100%

I-1 I-2 II-1 II-2

klasteriai

Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas

13 pav. Vaccinium myrtillus L. vaisių ėminių antocianidinų santykinės dalies įvairavimas

cenopopuliacijų pogrupiuose, išskirtuose hierarchinės klasterinės analizės pagalba (klasterių

numeriai pagal 12 pav.)

Klasteriai Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas

I-1 – I-2 3,272* 2,981* 3,290* 2,551 3,375*

I-1 – II-1 4,494** 2,371 4,466 1,462 4,161**

I-1 – II-2 3,749** 3,140* 3,837**

2,008 3,620**

I-2 – II-1 2,196 0,043 2,149 0,607 1,726

I-2 - II-2 2,027 1,553 2,111 0,607 1,828

II-1 –II-2 0,493 1,376 0,597 0,917 0,599

Page 58: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

58

malvidino (p<0,05) kiekius vaisių ţaliavose. Tuo tarpu I-1 ir II-2 klasteriai statistiškai

reikšmingai skyrėsi pagal delfinidino (p<0,01), cianidino (p<0,05), petunidino (p<0,01) ir malvidino

(p<0,01) kiekius ţaliavose (12 lentelė).

Siekiant sukurti racionalias vaistinių augalinių ţaliavų rinkimo rekomendacijas svarbu

palyginti ne tik antocianinų ar antocianidinų kiekius, bet ir idividualių antocianidinų sudėties

santykius ţaliavos ėminiuose. Įvertinta procentinė atskirų antocianidinų dalis klasterinės analizės

metu išskirtuose pogrupiuose ir gauti rezultatai pateikti 13 pav. Antocianidinų kiekio procentinės

dalies įvairavimas skirtinguose V. myrtillus L. vaisių ėminiuose rodo, kad tirtoms cenopopuliacijoms

būdingas neţymus cheminis polimorfizmas. Tyrimo rezultatų pasekoje nustatyta, kad tirti mėlynių

vaisių pavyzdţiai pasiţymi ryškiai išreikštu kokybinių cheminės sudėties rodiklių homogeniškumu.

Gauti tyrimų rezultatai leidţia Lietuvos Respublikos teritorijoje surinktą V. myrtillus L. vaisių

ţaliavą vertinti kaip kokybišką, turinčią pastovią kokybinę antocianidinų sudėtį, besiskiriančią tik

kiekybiniais rodikliais.

Atlikti išsamūs Lietuvos teritorijoje surinktų 75 skirtingų cenopopuliacijų mėlynių

vaistinių augalinių ţaliavų antocianinų ir antocianidinų sudėties tyrimai. Spektrofotometriniu

metodu įvertintas suminis antocianinų kiekis bei jo įvairavimas. Pritaikius optimizuotą ESC metodą

nustatyta individualių antocianidinų komplekso kokybinė ir kiekybinė sudėtis V. myrtillus L. vaisių

ţaliavose. Atlikti fitocheminiai antocianinų kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimai yra svarbūs

tolimesniems jų poveikio organizmui tyrimams. Atlikus antocianinų hidrolizę nustatyta 5

pagrindinių antocianidinų (delfinidino, cianidino, petunidino, peonidino ir malvidino) kiekinė

sudėtis. Tirtuose pavyzdţiuose tarp identifikuotų antocianidinų nustatytas didţiausias cianidino

kiekis. Apskaičiuoti variacijos koeficientai parodo didelį antocianidinų varijavimą ir galimą jų

kiekio priklausomybę nuo augavietės ir kitų aplinkos faktorių.

3.1.3. Antocianinų ir antocianidinų sudėties įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisių

vaistinėse augalinėse ţaliavose, surinktose šiaurės rytų Europos šalyse

Vaistinių augalinių ţaliavų surinktų iš skirtingų cenopopuliacijų, cheminė sudėtis dėl

klimatinių, geografinių ar gentinių faktorių įtakos gali varijuoti plačiose ribose [16, 145]. Lietuvai

įstojus į ES, vykstant intensyviai prekybai tarp kaimyninių šalių daugybė įveţtinių augalinių ţaliavų

gali patekti į vietinę rinką. Vykdant kokybiškos vaistinės augalinės ţaliavos paruošas ir panaudojant

vietinius išteklius, svarbu palyginti jų kokybinius bei kiekybinius antocianinų fitocheminės analizės

rodmenis su kitose šalyse paruoštų vaisių augalinių ţaliavų pavyzdţiais.

Page 59: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

59

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

Švedija Rusija Baltarusija Latvija Ukraina Lietuva

kie

kis

, p

roc.

antocianinų suminis kiekis antocianidinų suminis kiekis

14 pav. Suminiai antocianų ir antocianidinų kiekiai Vaccinium myrtillus L. vaisių ėminiuose,

surinktuose įvairiose šalyse

Atlikti Lietuvos respublikoje iš skirtingų cenopopuliacijų bei Švedijos, Rusijos, Latvijos,

Baltarusijos ir Ukrainos teritorijose surinktų ėminių palyginamieji tyrimai. Įvertinus suminį

antocianinų ir antocianidinų kiekį didţiausi antocianinų (3,149 proc.) ir antocianidinų (3,093 proc.)

suminiai kiekiai nustatyti ėminiuose surinktuose Švedijos tertorijoje. Maţiausi suminiai antocianinų

(2,312 proc.) ir antocianidinų (2,289 proc.) kiekiai nustatyti V. myrtillus L. vaisių pavyzdţiuose

surinktuose Latvijoje. Lietuvos respublikos teritorijoje rinktuose mėlynių vaisių pavyzdţiuose

vidutiniškai nustatyta 2,488 proc. antocianinų ir 2,556 proc. antocianidinų. Maţesni suminiai

antocianinų kiekiai nustatyti Rusijos (2,493 proc.) ir Baltarusijos (2,451 proc.) teritorijose rinktuose

ėminiuose, ir kuriuose antocianidinų suminiai kiekiai maţesni negu Lietuvos respublikoje

surinktuose vaisių ėminiuose (2,523 proc. ir 2,340 proc.). Lietuvoje rinktų mėlynių vaisių

antocianinų kiekybinė sudėtis skyrėsi nuo Ukrainoje surinktų mėginių. Nustatytas suminis

antocianinų (2,677 proc.) ir antocianidinų (2,641 proc.) kiekis Ukrainoje rinktuose bandiniuose buvo

šiek tiek didesnis (14 pav.). Antocianinų ir antocianidinų sudėties skirtumui įtakos galėjo turėti

daugybė faktorių (paruošų laikas, geografinis veiksnys, klimatinės sąlygos), kurie lėmė skirtingus

antocianinų kiekius V. myrtillus L. vaisiuose.

Page 60: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

60

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1,400

Švedija Rusija Baltarusija Latvija Ukraina Lietuva

Kie

kis

, p

roc.

delfinidinas

cianidinas

petunidinas

peonidinas

malvidinas

15 pav. Antocianidinų kiekiai Vaccinium myrtillus L. vaisių ėminiuose, surinktuose skirtingose

cenopopuliacijose įvairiose šalyse

Atlikus antocianidinų kiekybinę analizę optimizuotu ESC metodu atskirų antocianidinų

statistiniam palyginimui pritaikytas Kruskal‗o-Wallis‗o ranginis kriterijus nepriklausomoms imtims.

Rezultatai parodė, kad statistiškai reikšmingų skirtumų (p>0,05) tarp antocianidinų kiekių,

skirtingose šalyse rinktuose pavyzdţiuose, nėra.

Didţiausi delfinidino kiekiai nustatyti Švedijos teritorijoje rinktuose pavyzdţiuose (0,574

proc.), o maţiausi Latvijoje rinktuose ėminiuose (0,320 proc.) Lietuvos teritorijoje esančiose

augimvietėse surinktų mėlynių vaisių ėminiuose nustatyti didesni delfinidino kiekiai (0,445 proc.)

nei Rusijos (0,438 proc.) ir Baltarusijos (0,418 proc.) teritorijoje augančių mėlynių vaisių ėminiuose.

Ukrainoje augančiuose vaisiuose susikaupia šiek tiek didesni delfinidino kiekiai (0,469 proc.).

Cianidinas – vyraujantis antocianidinas, nustatytas visų tyrinėtų šalių V. myrtillus L.

vaisių ėminiuose. Didţiausi jo kiekiai (1,209 proc.) nustatyti Švedijoje rinktuose mėlynių vaisių

ėminiuose. Lietuvoje rinktuose pavyzdţiuose kaip ir Ukrainoje rinktuose ėminiuose nustatyta 1,098

proc. cianidino. Maţiau jo nustatyta Rusijoje ir Latvijoje rinktuose bandiniuose, o maţiausi

cianidino kiekiai nustatyti Baltarusijoje rinktose mėlynėse (0,952 proc.).

Didţiausias petunidino kiekis nustatytas Švedijoje rinktuose vaisiuose (0,593 proc.).

Maţiausiai petunidino nustatyta Ukrainoje rinktuose mėlynių vaisiuose (0,287 proc.). Lietuvoje

surinktuose pavyzdţiuose daugiau nustatyta petunidino (0,446 proc.) nei surinktuose Latvijoje

(0,381 proc.) ir Baltarusijoje (0,443 proc.), tačiau maţiau nei Rusijoje (0,453 proc.).

Page 61: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

61

Peonidino daugiausiai nustatyta Švedijoje surinktuose ėminiuose (0,339 proc.), o

maţiausiai jo nustatyta Lietuvoje surinktose mėlynių vaisiuose (0,262 proc.). Malvidino Lietuvoje

surinktuose bandiniuose nustatyta vidutiniškai 0,294 proc., jo didesni kiekiai nustatyti tik Švedijos

(0,378 proc.) ir Ukrainos (0,317 proc.) teritorijose rinktuose ėminiuose. Maţesni jo kiekiai nustatyti

Latvijos (0,276 proc.), Baltarusijos (0,249 proc.) ir Rusijos (0,289 proc.) teritorijose rinktuose

pavyzdţiuose (15 pav.).

0%

20%

40%

60%

80%

100%

pro

c.

Švedija Rusija Baltarusija Latvija Ukraina Lietuva

Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas

16 pav. Antocianidinų kiekių santykio įvairavimas V. myrtillus L. vaisių ėminiuose, rinktuose

įvairiose šalyse

Vertinant ir lyginant ţaliavų kokybę, rinktų skirtingose šalyse, svarbu palyginti ne tik

suminius ar atskirų antocianidinų kiekius, bet ir individualių antocianidinų santykį ţaliavų

ėminiuose. Šio poţymio įvertinimas gali būti reikšmingas rodiklis vertinant ţaliavų

homogeniškumą. Įvertinti individualių antocianidinų kiekiai bei jų procentinės dalies įvairavimas

pateikti 16 pav. Antocianidinų kiekio procentinės dalies įvairavimas skirtingų šalių pavyzdţiuose

leidţia vertinti mėlynių vaisius kaip natūraliai homogenišką, pastovią cheminę sudėtį turinčią

ţaliavą.

Atlikti palyginamieji tyrimai ir įvertinta V. myrtillus L. vaisių antocianinų kokybinė ir

kiekinė sudėtis įvairiose Europos šalyse surinktuose bandiniuose. Nustatyta, jog Lietuvos teritorijoje

surinktų mėlynių vaisių kokybinė antocianidinų sudėtis atitiko Švedijos, Rusijos, Baltarusijos,

Ukrainos ir Latvijos teritorijose surinktų mėlynių vaisių antocianinų sudėtį. Lietuvoje surinktų

mėlynių vaisių pavyzdţiuose nustatytas vidutinis antocianinų kiekis siekė 2,488 proc. ir buvo

Page 62: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

62

didesnis nei Baltarusijoje ir Latvijoje, tačiau maţesnis nei Švedijoje, Rusijoje ir Ukrainoje rinktose

ţaliavose.

Antocianidinų vidutinis kiekis Lietuvos teritorijoje rinktuose ėminiuose (2,556 proc.) yra

didesnis nei Latvijos, Baltarusijos ir Rusijos teritorijose rinktuose vaisiuose, tačiau maţesnis nei

Ukrainoje ir Švedijoje rinktose ţaliavose. Statistiniam atskirų antocianidinų palyginimui tarp

skirtingų šalių pavyzdţių pritaikius Kruskal‗o-Wallis‗o ranginį kriterijų nepriklausomoms imtims

statistiškai reikšmingo skirtumo nerasta (p>0,05), todėl vietinę V. myrtillus L. ţaliavą galima vertinti

kaip kokybišką, kokybine ir kiekybine sudėtimi iš esmės nesiskiriančią nuo kitų tyrinėtų Europos

šalių ţaliavų.

3.1.4. Antocianinų ir antocianidinų sudėties pokyčių tyrimai Vaccinium myrtillus L. vaisiuose

rinkimo metu

Vaisių nokimo metu antocianų kokybinė bei kiekinė sudėtis kinta. Vaisiams nokstant

suintensyvėja antocianinų sintezė, ko pasekoje pasikeičia ir antocianinų santykis su kitais

polifenoliniais (flavonoliais ir procianidinais) junginiais [10, 38, 111, 176].

Norint gauti kokybišką vaistinę augalinę ţaliavą svarbu parinkti optimaliausią paruošų

vykdymo laiką, kai ţaliavoje susikaupę maksimalūs biologiškai aktyvių junginių kiekiai. Mokslinės

literatūros šaltiniuose trūksta išsamių duomenų apie antocianinų kokybinės ir kiekybinės sudėties

pokyčius V. myrtillus L. vaisiuose jų nokimo metu. Vykdant ţaliavų paruošas tikslinga įvertinti

Lietuvoje augančių mėlynių vaisių antocianinų sudėties pokyčius bei nustatyti optimaliausias

rinkimo laiko ribas atsiţvelgiant į Lietuvos klimatines sąlygas.

Siekiant įvertinti V. myrtillus L. vaisių vaistinės augalinės ţaliavos antocianinų cheminės

sudėties rodiklių įvairavimą nokimo metu, vaisių pavyzdţiai buvo renkami nuo jų nokimo pradţios

(birţelio 24 d.) iki pilno vaisių sunokimo ir jų nubyrėjimo (rugsėjo 15 d.). Ėminiai nokimo metu

rinkti tose pačiose cenopopuliacijose kas savaitę. Suminio antocianinų ir antocianidinų kiekio

kitimas V. myrtillus L. vaisiuose rinkimo metu pateiktas 17 pav.

Maţiausias suminis antocianinų kiekis (2,291 proc.) nustatytas vaisių nokimo pradţioje

birţelio 24 d. surinktuose ėminiuose. Didţiausias jų kiekis (7,124 proc.) nustatytas vaisių nokimo

pabaigoje (rugsėjo 15 d.) ir buvo 3,1 karto didesnis uţ kiekį nustatytą vaisių nokimo pradţioje.

Maţiausias suminis antocianidinų kiekis nustatytas birţelio 24 d. surinktuose ėminiuose (2,386

proc.).

Page 63: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

63

0,000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000 7,000 8,000

24

1

8

15

23

30

5

12

20

25

1

15B

irželi

oL

iepos

Ru

gp

jūčio

Ru

gsė

jo

rin

kim

o d

ata

kiekis, proc.

antocianidinų suminis kiekis antocianinų suminis kiekis

17 pav. Antocianinų ir antocianidinų suminiai kiekiai Vaccinium myrtillus L. vaisiuose ţaliavų

rinkimo metu

Vaisių rinkimo metu suminis antocianidinų kiekis padidėjo 3 kartus ir vaisių rinkimo

pabaigoje buvo 7,245 proc. Blokuotų duomenų dispersinė analizė atskleidė, kad suminis antocianinų

bei antocianidinų kitimas rinkimo metu yra statistiškai reikšmingas (p<0,05). Lyginant rugsėjo 15 d.

rinktų pavyzdţių antocianinų kiekio vidurkius su kitų ėminių vidurkiais paaiškėjo, jog bandinių

rinktų nuo rugpjūčio 20 d. vidurkiai statistiškai reikšmingai nesiskiria nuo daugiausiai antocianinų ir

antocianidinų sukaupusio ėminio (p>0,05). Mūsų atliktų tyrimų rezultatų dėka nustatyta, kad

Lietuvos teritorijoje augančių V. myrtillus L. vaisiuose didţiausi antocianinų kiekiai susikaupia

rugpjūčio mėn. II-oje pusėje iki vaisių pilno sunokimo ir jų nubyrėjimo (rugsėjo 15 d.).

Vertinant individualių antocianidinų pokyčius vaisiuose rinkimo metu nustatyti maţiausi

visų antocianidinų kiekiai birţelio 24 d. surinktuose bandiniuose. Didţiausi delfinidino, cianidino ir

malvidino kiekiai nustatyti rugsėjo 15 d., o petunidino ir peonidino - rugsėjo 1 d. surinktuose

ėminiuose. Taikant blokuotų duomenų vienfaktorinę dispersinę analizę atliktas bandinio, kuriame

nustatytas didţiausias antocianidino kiekis, palyginimas su kitais bandiniais, rinktais vaisių nokimo

metu. Gauti vidurkių skirtumai pateikti 13 lentelėje.

Page 64: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

64

13 lentelė. Antocianidinų vidutinio kiekio skirtumų palyginimas Vaccinium myrtillus L. vaisiuose jų

rinkimo metu

Vaisių rinkimo data

Antocianidinų kiekių vidurkių skirtumai, proc.

Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas

birţelio 24 0,885* 1,552* 0,931* 0,636* 0,893*

liepos 1 0,497* 1,126* 0,644* 0,581* 0,788*

liepos 8 0,485* 1,118* 0,643* 0,535* 0,716*

liepos 15 0,311* 0,876 0,496* 0,549* 0,721*

liepos 23 0,565* 1,105* 0,622* 0,403* 0,657*

liepos 30 0,494 1,012* 0,529* 0,405* 0,547*

rugpjūčio 5 0,175 0,488* 0,154* 0,287 0,524

rugpjūčio 12 0,226 0,483 0,379* 0,249 0,392

rugpjūčio 20 0,088 0,507 0,237* 0,111 0,194

rugpjūčio 25 0,067 0,207 0,176* 0,088 0,020

rugsėjo 1 0,088 0,002 - - 0,106

rugsėjo 15 - - 0,002 0,037 -

Statistiškai reikšmingi vidurkių skirtumai lyginant su bandiniu, kuriame nustatyta vidutiniškai didţiausi antocianidinų

kiekiai (*p<0,05).

Delfinidino kiekio pokyčiai V. myrtillus L. vaisiuose nokimo metu pateikti 18 pav.

Pritaikius blokuotų duomenų vienfaktorinę dispersinę analizę nustatyta, jog delfinidino kiekio

pokyčiai laiko atţvilgiu yra statistiškai reikšmingas (p<0,05). Delfinidino kiekis rinkimo metu

padidėjo 2,8 karto. Didţiausias vidutinis delfinidino kiekis vaisių rinkimo metu nustatytas rugsėjo

15 d. ėminiuose (1,366 proc.). Palyginus šio bandinio vidutinį kiekį su visais kitų ėminių vidutiniais

kiekiais nustatyta statistiškai reikšmingi skirtumai nuo birţelio 24 d. iki liepos 23 d. rinktuose

bandiniuose.

Page 65: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

65

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1,400

1,600

24 1 8 15 23 30 5 12 20 25 1 15

Birželio Liepos Rugpjūčio Rugsėjo

rinkimo data

kie

kis

, p

roc.

18 pav. Delfinidino kiekio įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisiuose rinkimo metu

Nustatyta, kad nuo liepos 30 d. iki rugsėjo 15 d. mėlynių vaisiuose didţiausi delfinidino kiekiai ir

vidurkių skirtumai tarp šių ėminių nėra statistiškai reikšmingi (p>0,05).

Cianidinas yra dominuojantis antocianidinas visuose vaisių ėminiuose, tačiau jo kiekis kito

maţiausiai iš visų nustatytų antocianidinų (tik 2,3 karto). Blokuotų duomenų vienfaktorinė

dispersinė analizė parodė, jog jo kitimas laiko atţvilgiu yra statistiškai reikšmingas (p<0,05).

Didţiausias vidutinis cianidino kiekis vaisių nokimo metu nustatytas rugsėjo 15 d. rinktuose

ėminiuose (2,759 proc.) (19 pav.). Palyginus šio bandinio kiekio vidurkį su visais kitų bandinių

kiekių vidurkiais nustatyta statistiškai reikšmingi skirtumai nuo birţelio 24 d. iki rugpjūčio 5 d.

rinktuose bandiniuose, išskyrus liepos 15 d. rinktus ėminius. Didţiausi cianidino kiekiai mėlynių

vaisiuose nustatyti nuo rugpjūčio 12 d. iki rugsėjo 15 d. rinktuose ėminiuose, kadangi vidurkių

skirtumai tarp šių bandinių nėra statistiškai reikšmingi (p>0,05).

Page 66: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

66

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

24 1 8 15 23 30 5 12 20 25 1 15

Birželio Liepos Rugpjūčio Rugsėjo

rinkimo data

kie

kis

, p

ro

c.

19 pav. Cianidino kiekio įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisiuose rinkimo metu

Nustatytas 3,5 karto padidėjęs cianidino kiekis vaisių nokimo pabaigoje. Panaudojus blokuotų duomenų

vienfaktorinę dispersinę analizę nustatyta, jog petunidino kitimas laiko atţvilgiu yra statistiškai

reikšmingas (p<0,05). Didţiausias vidutinis petunidino kiekis nustatytas rugsėjo 1 d. rinktuose ėminiuose

(1,304 proc.). Palyginus šio bandinio vidurkį su visais kitais bandinių vidurkiais statistiškai reikšmingi

skirtumai nustatyti nuo birţelio 24 d. iki rugpjūčio 25 d. rinktuose bandiniuose. Šiuo atveju tik tarp 2

paskutinių ėminių statistiškai reikšmingas skirtumas nenustatytas (p>0,05). Petunidino kiekio kitimo

dinamika vaisiuose rinkimo metu pavaizduota 20 pav.

Pritaikius blokuotų duomenų vienfaktorinę dispersinę analizę nustatyta, jog peonidino kitimas

laiko atţvilgiu yra statistiškai reikšmingas (p<0,05). Didţiausias vidutinis peonidino kiekis, padidėjęs 5,1

karto vaisių rinkimo metu nustatytas rugsėjo 1 d. rinktuose ėminiuose (0,782 proc.). Nustatyti statistiškai

reikšmingi skirtumai palyginus šio ėminio vidurkį su visais kitų bandinių vidurkiais (birţelio 24 d. - liepos

30 d.). Galima konstatuoti, jog nuo rugpjūčio 5 d. iki rugsėjo 15 d. mėlynių vaisiuose yra susikaupę

didţiausi peonidino kiekiai, nes statistiškai reikšmingo vidurkių skirtumo tarp šių pavyzdţių nerasta

(p>0,05). Peonidino kiekio kitimas V. myrtillus L. vaisiuose rinkimo metu pateiktas 21 pav.

Page 67: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

67

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1,400

1,600

24 1 8 15 23 30 5 12 20 25 1 15

Birželio Liepos Rugpjūčio Rugsėjo

rinkimo data

kie

kis

, p

roc.

20 pav. Petunidino kiekio įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisiuose rinkimo metu

0,0000,1000,2000,3000,400

0,5000,6000,7000,8000,900

24 1 8 15 23 30 5 12 20 25 1 15

Birželio Liepos Rugpjūčio Rugsėjo

rinkimo data

kie

kis

, p

ro

c.

21 pav. Peonidino kiekio įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisiuose rinkimo metu

Page 68: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

68

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

24 1 8 15 23 30 5 12 20 25 1 15

Birželio Liepos Rugpjūčio Rugsėjo

rinkimo data

kie

kis

, p

roc.

22 pav. Malvidino kiekio įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisiuose rinkimo metu

Blokuotų duomenų vienfaktorinės dispersinės analizės rezultatai parodė, jog malvidino

kitimas laiko atţvilgiu, kaip ir kitų antocianidinų yra statistiškai reikšmingas (p<0,05). Malvidino

kiekis vaisiuose nokimo metu padidėjo 6 kartus (daugiausiai iš visų antocianidinų). Nuo 0,180 proc.

birţelio pabaigoje iki 1,072 proc. rugsėjo viduryje (22 pav.). Didţiausias vidutinis malvidino kiekis

vaisių rinkimo metu nustatytas rugsėjo 15 d. rinktuose pavyzdţiuose. Nustatyti statistiškai

reikšmingi skirtumai palyginus šio ėminio vidurkį su visais kitų bandinių vidurkiais (birţelio 24 d. -

liepos 30 d.). Taigi, galima teigti, kad nuo rugpjūčio 5 d. iki rugsėjo 15 d. mėlynių vaisiuose yra

susikaupę didţiausi malvidino kiekiai, kadangi statistiškai reikšmingo vidurkių skirtumo tarp šių

pavyzdţių neaptikta (p>0,05).

Siekiant nustatyti antocianidinų komplekso sudėties kitimo dėsningumus V. myrtillus L.

vaisiuose rinkimo metu buvo atliktas identifikuotų antocianidinų santykinės dalies kitimo dinamikos

įvertinimas (23 pav.). Vaisių nokimo metu nustatytas neţymus peonidino ir malvidino santykinės

dalies padidėjimas. Nustatyta, jog delfinidino ir cianidino santykinė dalis šiek tiek sumaţėjo vaisių

rinkimo metu.

Page 69: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

69

0%

20%

40%

60%

80%

100%k

iek

is, p

roc.

24 1 8 15 23 30 5 12 20 25 1 15

Birželio Liepos Rugpjūčio Rugsėjo

rinkimo data

Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas

23 pav.Vaccinium myrtillus L. vaisių antocianidinų kiekių santykinės dalies įvairavimas rinkimo

metu

Apibendrinant gautus rezultatus, galima teigti, jog Lietuvos gamtinėmis sąlygomis mėlynių

vaisiuose didţiausi antocianinų kiekiai nustatyti vaisių rinkimo pabaigoje (rugsėjo 15 d.), tačiau šie

bandiniai statistiškai reikšmingai nesiskiria nuo ėminių rinktų nuo rugpjūčio 20 d. Didţiausios

antocianinų koncentracijos V. myrtillus L. vaisiuose Lietuvos gamtinėmis sąlygomis susikaupia nuo

rugpjūčio mėn. vidurio iki rugsėjo mėn. vidurio, todėl mėlynių vaistinių augalinių ţaliavų paruošas

Lietuvos respublikos augavietėse, rekomenduojame vykdyti rugpjūčio mėn. antroje pusėje. Tyrimo

metu įvertinta ir individualių antocianidinų kiekio kitimo dinamika vaisiuose rinkimo metu. Gautų

tyrimų duomenų dėka galima atlikti mėlynių vaisių augalinių ţaliavų paruošas su pageidaujamu

didesniu antocianinų kiekiu.

3.1.5. Antocianinų ir antocianidinų sudėties įvairavimas šilauogių vaisiuose, ţievelėse,

minkštimuose ir išspaudose

Šilauogių vaisių antocianinų ir antocianidinų sudėties įvairavimas. Šilauogės kaip ir

mėlynės priklauso Vaccinium L. genčiai. Jų vaisiai vartojami maistui bei medicinos praktikoje dėl

jose besikaupiančių polifenolinių junginių [216]. Per pastarąjį šimtmetį išvesta daugiau kaip 100

įvairių šilauogių veislių, kurios plačiai auginamos daugelyje pasaulio šalių. Lietuvoje - tai

introdukuotas augalas. Botanikos instituto lauko kolekcijose pradėtas auginti tik XX a. antroje

Page 70: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

70

pusėje. Šilauogių vaisiai intensyviai tyrinėjami dėl juose susikaupusių, farmakologiškai aktyvių

junginių – antocianinų. Siekiant šilauogių vaisius plačiau pritaikyti medicinos praktikai svarbu

palyginti auginamų veislių vaisių cheminę sudėtį ir jos rodiklių įvairavimą, atrinkti Lietuvos

gamtinėmis sąlygomis uţaugintas veisles, kurios kaupia didţiausius veikliųjų junginių kiekius.

Antocianinų suminis kiekis šilauogių vaisiuose nustatytas spektrofotometriniu metodu,

antocianinų sumą perskaičiuojant cianidin-3-gliukozidu [261, 268]. Nustatyta, jog suminis

antocianinų kiekis vaisiuose tarp tirtų veislių varijuoja gana plačiose ribose. Vertingiausios yra

„Berkeley― (1,671 proc.), „Northland― (1,662 proc.), „Northcountry― (1,727 proc.) ir „Ama― (1,652

proc.) šilauogių veislės. Maţiausias suminis antocianinų kiekis rastas „Chignecto― (0,464 proc.),

„Patriot― (0,632 proc.) bei „Dixi― (0,688 proc.) veislių vaisių ėminiuose. Vertinant Lietuvos

gamtinėmis sąlygomis uţaugintų šilauogių vaisių antocianinų kokybinę ir kiekybinę sudėtį svarbu

gautus tyrimų rezultatus palyginti su kitose šalyse uţaugintų šilauogių vaisių antocianinų sudėtimi.

Literatūros šaltiniuose nurodoma apie Italijos mokslininkų atliktus darbus tiriant

antocianinų ir antocianidinų kaupimosi dėsningumus šilauogių vaisiuose [74]. Jie nustatė, jog šioje

šalyje auginamų „Patriot― veislės šilauogių vaisių antocianinų suminis kiekis (0,613 proc.) atitinka

Lietuvoje auginamų tos pačios veislės šilauogių vaisių antocianinų suminį kiekį. „Bluecrop― veislės

Italijoje auginamų šilauogių vaisiuose nustatytas maţesnis antocianinų kiekis (0,860 proc.) lyginant

su Lietuvoje uţaugintais (1,363 proc.) „Bluecrop― veislės šilauogių vaisiais. Slovakijoje

uţaugintuose „Patriot― veislės šilauogių vaisiuose nustatyta 2 kartus didesnis antocianinų kiekis

(1,253 proc.). Didesnis atocianinų suminis kiekis nustatytas ir „Northland― veislės vaisiuose (2,137

proc.), tačiau „Bluecrop― (0,545 proc.) ir „Berkeley― (1,054 proc.) veislių vaisiuose nustatyti

suminis antocianinų kiekis maţesnis uţ nustatytus tų pačių veislių vaisiuose, auginamuose Lietuvoje

[259]. Estijos mokslininkų tyrinėtuose „Northblue― (0,800 proc.) ir „Northcountry― (1,333 proc.)

veislių vaisiuose taip pat nustatyta maţesni suminiai antocianinų kiekiai [236]. Nustatytiems

antocianinų kiekybinės sudėties skirtumams galėjo turėti įtakos skirtingas ţaliavų rinkimo laikas, ne

vienodas vaisių sunokimo laipsnis, bei kiti aplinkos faktoriai.

Page 71: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

71

0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1,600 1,800 2,000

"Dixi"

"Putte"

"Rancocas"

"Heerma"

"Bluecrop"

"Ama"

"Northblue"

"Northcuontry"

"Northland"

"Berkeley"

Siauralapė

"Patriot"

"Chignecto"

"North holna"

suminis kiekis, proc.

antocianinų suma antocianidinų suma

24 pav. Suminio antocianinų ir antocianidinų kiekio įvairavimas šilauogių vaisių ėminiuose

Optimizuotas ESC metodas kokybinei ir kiekybinei mėlynių vaisių ekstraktų

antocianidinų sudėties analizei, pritaikytas ir šilauogių vaisių antocianidinų analizei. Atlikus

šilauogių vaisių antocianinų hidrolizę kaip ir mėlynių vaisiuose nustatyti tie patys antocianidinai

(delfinidinas, cianidinas, petunidinas, peonidinas, malvidinas). Šilauogių vaisių ekstrakto ESC

chromatograma pateikta 25 pav. Iš 5-ių identifikuotų analičių, kaip ir kitų tyrėjų darbuose [157, 254]

chromatogramoje dominuoja malvidino, petunidino ir delfinidino smailės.

Didţiausi suminiai antocianidinų kiekiai nustatyti „Northland― (1,585 proc.),

„Northcountry― (1,534 proc.) ir „Rancocas― (1,453 proc.) veislių ţaliavose, o maţiausiais suminiais

antocianidinų kiekiais išsiskyrė „Chignecto― (0,187 proc.), "Bluecrop" (0,528 proc.), "Heerma"

(0,553 proc.) veislės (24 pav.).

Tirtose šilauogių vaisiuose nustatytas didţiausias (0,286 proc.) malvidino vidutinis kiekis

ir maţesnis kiekis (0,263 proc.) petunidino (14 lentelė). Delfinidino koncentracija šilauogių

vaisiuose svyravo nuo 0,027 iki 0,365 proc. Didţiausias variacijos koeficientas, atspindintis junginio

variacijos amplitudę nustatytas peonidinui (77,63 proc.). Maţiausią antocianidinų komplekso dalį

šilauogių vaisiuose sudarė peonidinas, jo kiekis įvairavo nuo 0,002 iki 0,115 proc.

Page 72: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

72

25 pav. Vaccinium corymbosum L. vaisių ekstrakto ESC chromatograma.

Analičių smailės pagal sulaikymo trukmę: 1- delfinidinas, 2- cianidinas, 3- petunidinas, 4-

peonidinas, 5- malvidinas

14 lentelė. Šilauogių vaisių antocianidinų sudėties ir sklaidos charakteristika (n=14)

Min. – minimali reikšmė, Maks. – maksimali reikšmė, M – aritmetinis vidurkis, S x - vidurkio standartinė paklaida, Me –

mediana, V – variacijos koeficientas.

Antocianidinai

Keikis, proc.

Min. Maks. M S x Me V, proc.

Delfinidinas 0,027 0,365 0,175 0,028 0,143 59,71

Cianidinas 0,054 0,356 0,150 0,041 0,140 56,86

Petunidinas 0,064 0,464 0,263 0,030 0,245 43,12

Peonidinas 0,002 0,115 0,042 0,009 0,035 77,63

Malvidinas 0,012 0,575 0,286 0,047 0,269 61,42

Page 73: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

73

Siekiant geriau suvokti Botanikos instituto lauko kolekcijose auginamų šilauogių vaisių

antocianidinų sudėties panašumus ir skirtumus bei tikėtinas cheminės sudėties sąsajas su atskiromis

veislėmis buvo atlikta hierarchinė klasterinė analizė. Klasterinės analizės dendrogramoje, sudarytoje

pagal individualių antocianidinų kiekius ţaliavose, ryškiai išsiskyrė 2 stambios grupės: šiek tiek

didesnė I-oji ir maţesnė II-oji (27 pav.). Pirmoji grupė apjungia 8 šilauogių veisles („Heerma―,

„Bluecrop―, „Dixi―, „Putte―, Northblue―, „Ama―, „Chignecto―, „North holna―) ir siauralapę

šilauogę. Antroji maţesnė grupė apjungia 5 veisles („Northcountry―, „Berkeley―, „Rancocas―,

„Northland―, „Patriot―). Skirtumus tarp išskirtų klasterių patvirtina ir aprašomosios statistikos

rezultatai pateikti 15 lentelėje. I-oji grupė išsiskyrė maţesniais uţ vidurkį visų antocianidinų

kiekiais. II-ajai grupei priskiriamos veislės sukaupia didesnius uţ vidurkį individualių antocianidinų

kiekiais. II-ajai grupei priklausančios veislės yra vertingesnės, kadangi jų vaisiuose susikaupę

didesni veikliųjų junginių – antocianidinų kiekiai.

27 pav. Šilauogių panašumo pagal antocianidinų sudėtį vaisiuose dendrograma

Page 74: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

74

15 lentelė. Šilauogių vaisių antocianidinų sudėties ir sklaidos charakteristika klasteriuose (n=14)

Min. – minimali reikšmė, Maks. – maksimali reikšmė, Me – mediana, Q3-Q1 – kvartilinis plotis

0%

20%

40%

60%

80%

100%

I II

klasteriai

Malvidinas

Peonidinas

Petunidinas

Cianidinas

Delfinidinas

28 pav. Šilauogių vaisių antocianidinų santykinės dalies įvairavimas grupėse, išskirtose

hierarchinės klasterinės analizės pagalba (klasterių numeriai pagal 27 pav.)

Antocianidinai Klasteriai

Keikis, proc.

Min. Maks. Me Q3-Q1

Delfinidinas

Cianidinas

Petunidinas

Peonidinas

Malvidinas

I 0,027 0,160 0,134 0,069

II 0,159 0,365 0,316 0,122

I 0,054 0,172 0,091 0,083

II 0,137 0,356 0,174 0,170

I 0,064 0,318 0,187 0,080

II 0,304 0,464 0,386 0,110

I 0,002 0,044 0,021 0,024

II 0,044 0,115 0,066 0,055

I 0,012 0,370 0,169 0,175

II 0,352 0,575 0,498 0,193

Page 75: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

75

Hierarchinės klasterinės analizės pagalba išskirtų grupių statistiniam palyginimui taikytas

ranginis Mann‗o Whitney‗o kriterijus nepriklausomoms imtims. Naudojantis Mann‗o - Whitney‗o

testu nustatyta, kad klasterinės analizės būdu išskirtos grupės statistiškai reikšmingai (p<0,05)

skiriasi pagal delfinidino, cianidino, petunidino ir malvidino kiekius šilauogių vaisiuose.

Siekiant palyginti ir įvertinti introdukuotų šilauogių veisles svarbu palyginti ne tik

antocianinų ar antocianidinų kiekius šilauogių vaisiuose, bet ir individualių antocianidinų

santykinius kiekius analizuotuose ėminiuose. Įvertinta procentinė individualių antocianidinų sudėtis

klasterinės analizės pagalba išskirtose grupėse. Gauti rezultatai pateikti 28 pav. Antocianidinų kiekio

procentinės dalies įvairavimas tarp šilauogių vaisių ėminių įrodo, kad tirtiems šilauogių vaisių

bandiniams būdingas neţymus cheminis polimorfizmas. Nustatyta, kad I-oje grupėje apjungtoms

veislėms būdingas didesnis petunidino santykinis kiekis, tuo tarpu II-oje didţiausią dalį sudarė

malvidinas. Gauti rezultatai leidţia vertinti introdukuotų šilauogių vaisius kaip kokybišką ţaliavą,

besiskiriančią tik kiekiniais antocianidinų sudėties rodikliais.

Išanalizavus Botanikos instituto lauko kolekcijose auginamų šilauogių veislių bei

siauralapės šilauogės vaisių pavyzdţius galima teigti, jog daugiausiai antocianinų kaupiančios yra

„Berkeley―, „Northland―, „Northcountry― ir „Ama― šilauogių veislės. Didţiausi suminiai

antocianidinų kiekiai nustatyti „Northland― ir Northcountry― bei „Rancocas― veislių ţaliavose.

Paţymėtina, kad šilauogėse antocianidinų komplekse dominavo malvidinas. Antocianidinų

komplekso santykinės dalies įvairavimas gali būti svarbus chemotaksonominis poţymis, atspindintis

Vaccinium L. genties genotipinę bei tarprūšinę įvairovę.

Antocianinų ir antocianidinų sudėties įvairavimas šilauogių vaisių ţievelėse.

Vertinant mėlynių ir šilauogių vaisių homogeniškumą, atlikus fitocheminius tyrimus, pastebėti

antocianinų sudėties skirtumai tarp vaisių ţievelių ir minkštimų. Ypač dideli cheminės sudėties

skirtumai nustatyti šilauogių vaisiuose, kuriuose didţiausios antocianinų koncentracijos

susitelkusios vaisių ţievelėse [216]. Siekiant aiškiau suvokti veikliųjų junginių kaupimosi

dėsningumus, svarbu ištirti antocianinų sudėties įvairavimą šilauogių vaisių ţievelėse (egzokarpyje),

minkštimuose (mezokarpyje) ir išspaudose bei nustatyti tikėtinus priklausomybės ryšius tarp atskirų

veislių ir antocianinų koncentracijų.

Įvertinus suminius antocianinų ir antocianidinų kiekius tirtų šilauogių ţievelėse,

nustatyta, kad suminio antocianinų (0,519 - 1,983 proc.) ir antocianidinų (0,428 - 1,916 proc.) kiekio

įvairavimo amplitudė labai plati (29 pav.).

Page 76: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

76

Didţiausi suminiai antocianinų kiekiai nustatyti „Rancocas― (1,983 proc.), „Putte― (1,505

proc.) veislių ir siauralapės (V. angustifolium Aiton.) (1,603 proc.) šilauogių ţievelėse. Didţiausi

suminiai antocianidinų kiekiai nustatyti „Rancocas― (1,916 proc.), „Northland― (1,559 proc.) ir

„Heerma― (1,387 proc.) veislių vaisių ţievelėse. Maţiausi suminiai antocianinų (0,519 proc.) ir

antocianidinų (0,428 proc.) kiekiai nustatyti „Dixi― veislės vaisių ţievelėse.

Analizuojant aprašomosios statistikos rezultatus, pateiktus 16 lentelėje, matyti, kad

šilauogių vaisių ţievelėse kaip ir vaisiuose daugiausiai nustatyta malvidino (nuo 0,139 iki 0,734

proc.) bei petunidino (nuo 0,118 iki 0,513 proc.), o maţiausiai peonidino (nuo 0,018 iki 0,082 proc.).

Lyginant cianidino ir delfinidino kiekius pastebėta, kad šilauogių vaisių ţievelėse susikaupę 1,6

karto didesni delfinidino kiekiai, o vaisiuose šių antocianidinų kiekiai vienodi.

0,000 0,500 1,000 1,500 2,000

"Dixi"

"Putte"

"Rancocas"

"Heerma"

"Bluecrop"

"Ama"

"Northblue"

"Northcuontry"

"Northland"

"Berkeley"

Siauralapė

"Patriot"

"Chignecto"

"North holna"

kiekis, proc.

antocianinų suma antocianidinų suma

29 pav. Suminio antocianinų ir antocianidinų kiekio įvairavimas šilauogių vaisių ţievelėse

Skirtingų šilauogių veislių vaisių ţievelių cheminės sudėties panašumus pagal sukauptus

antocianidinų kiekius pateikti hierarchinės klasterinės analizės dendrogramoje, kurioje tirtos veislės

pasiskirstė į 2 stambias grupes (30 pav.). I-oji grupė stambesnė, ją sudaro 9 šilauogių

Page 77: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

77

16 lentelė. Šilauogių vaisių ţievelių antocianidinų sudėties ir sklaidos charakteristika (n=14)

Min. – minimali reikšmė, Maks. – maksimali reikšmė, M – aritmetinis vidurkis, S x - vidurkio standartinė paklaida, Me –

mediana, V – variacijos koeficientas.

30 pav. Šilauogių vaisių ţievelių panašumo pagal antocianidinų sudėtį dendrograma

veislės („Bluecrop―, „Northholna―, „Dixi―, „Chignecto―, „Putte―, „Patriot―, „Ama―, „Northblue―,

„Northcountry―) ir siauralapė šilauogė. II-oji, maţesnė grupė apima 4 veisles: „Rancocas―,

„Northland―, „Heerma―, „Berkeley―. Skirtumus tarp išskirtų grupių atspindi ir aprašomosios

statistikos rezultatai, pateikti 17 lentelėje. I-oji grupė pasiţymėjo maţesniais uţ vidurkį visų

antocianidinų kiekiais. Tuo tarpu, II-ajai grupei priklausančios veislės išsiskyrė didesniais uţ vidurkį

individualių antocianidinų kiekiais. Akivaizdu, jog II-ajai grupei priklausančios veislės yra

vertingesnės, kadangi jų vaisių ţievelėse susikaupę didesni veikliųjų junginių – antocianidinų

kiekiai.

Antocianidinai

Keikis, proc.

Min. Maks. M S x Me V, proc.

Delfinidinas 0,078 0,405 0,197 0,031 0,176 59,76

Cianidinas 0,055 0,244 0,120 0,015 0,108 47,41

Petunidinas 0,118 0,513 0,251 0,034 0,227 50,20

Peonidinas 0,018 0,082 0,043 0,006 0,041 51,34

Malvidinas 0,139 0,734 0,327 0,046 0,293 52,36

Page 78: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

78

Hierarchinės klasterinės analizės pagalba išskirtų grupių statistiniam palyginimui naudotas

ranginis Mann‗o - Whitney‗o kriterijus nepriklausomoms imtims. Remiantis šiuo testu nustatyta,

kad klasterinės analizės metodu išskirtos grupės statistiškai reikšmingai (p<0,05) skiriasi pagal visų

antocianidinų (delfinidino, cianidino, petunidino, peonidino ir malvidino) kiekius šilauogių vaisių

ţievelėse.

Atlikto identifikuotų antocianidinų santykinės dalies įvairavimo skirtingose grupėse

įvertinimo rezultatai rodo neţymius šių junginių kiekių santykio svyravimus šilauogių vaisių

ţievelėse (31 pav.).

17 lentelė. Šilauogių vaisių ţievelių antocianidinų sudėties ir sklaidos charakteristika klasteriuose

(n=14)

Min. – minimali reikšmė, Maks. – maksimali reikšmė, Me – mediana, Q3-Q1 – kvartilinis plotis

Antocianidinai Klasteriai

Keikis, proc.

Min. Maks. Me Q3-Q1

Delfinidinas

Cianidinas

Petunidinas

Peonidinas

Malvidinas

I 0,078 0,208 0,108 0,101

II 0,256 0,405 0,381 0,120

I 0,055 0,172 0,099 0,051

II 0,108 0,244 0,189 0,102

I 0,118 0,273 0,175 0,127

II 0,308 0,513 0,423 0,160

I 0,018 0,082 0,027 0,026

II 0,043 0,075 0,059 0,031

I 0,139 0,406 0,241 0,157

II 0,344 0,734 0,490 0,352

Page 79: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

79

0%

20%

40%

60%

80%

100%

I II

klasteriai

Malvidinas

Peonidinas

Petunidinas

Cianidinas

Delfinidinas

31 pav. Šilauogių vaisių ţievelių antocianidinų santykinės dalies įvairavimas grupėse, išskirtose

hierarchinės klasterinės analizės pagalba (klasterių numeriai pagal 30 pav.)

Atlikus Lietuvos gamtinėmis sąlygomis Botanikos instituto lauko kolekcijose uţaugintų

šilauogių vaisių ţievelių antocianinų sudėties tyrimus nustatyta, jog daugiausiai antocianinų

susikaupę „Rancocas―, „Putte― veislių ir siauralapės (V. angustifolium Aiton.) šilauogių vaisių

ţievelėse. Didţiausi suminiai antocianidinų kiekiai nustatyti ― Rancocas―, „Northland― ir „Heerma―

vaisių ţievelėse. Maţiausi suminiai antocianinų ir antocianidinų kiekiai aptikti „Dixi― veislės vaisių

ţievelėse.

Antocianinų ir antocianidinų sudėties įvairavimas šilauogių vaisių minkštimuose.

Remiantis mokslinės literatūros šaltiniais, šilauogių vaisių minkštimuose nustatyti ţymiai maţesni

antocianinų kiekiai [216]. Svarbu išaiškinti šilauogių veisles, kurių vaisių mezokarpyje susikaupę

didţiausi antocianinų ir antocianidinų kiekiai.

Įvertinus suminius antocianinų ir antocianinų kiekius tirtų šilauogių minkštimuose,

nustatyta, kad suminio antocianinų (0,011 - 0,088 proc.) bei antocianidinų (0,003 - 0,395 proc.)

kiekio įvairavimo amplitudė yra gan plati. Tyrimų rezultatai pateikti 32 pav. Didţiausi suminiai

antocianinų kiekiai nustatyti „North holna― (0,088 proc.), „Putte― (0,068 proc.) ir „Berkeley― (0,051

proc.) veislių šilauogių minkštimuose, o didţiausi suminiai antocianidinų kiekiai nustatyti

„Berkeley― (0,395 proc.), „North holna― (0,167 proc.) bei „Northland― (0,170 proc.) vaisių

minkštimuose. Maţiausi suminiai antocianinų kiekiai nustatyti „Patriot― (0,011 proc.), o

antocianidinų „Dixi― (0,003 proc.) veislių vaisių mezokarpyje.

Page 80: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

80

Aprašomosios statistikos rezultatai pateikti 18 lentelėje, rodantys, jog šilauogių

minkštimuose, kaip ir vaisiuose bei ţievelėse, daugiausiai susikaupę malvidino (0,005 - 0,135 proc.)

bei petunidino (0,003 - 0,110 proc.), o maţiausiai peonidino (0,001 - 0,021 proc.).

0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350 0,400 0,450

"Dixi"

"Putte"

"Rancocas"

"Heerma"

"Bluecrop"

"Ama"

"Northblue"

"Northcuontry"

"Northland"

"Berkeley"

Siauralapė

"Patriot"

"Chignecto"

"North holna"

kiekis, proc.

antocianinų suma antocianidinų suma

32 pav. Suminio antocianinų ir antocianidinų kiekio įvairavimas šilauogių vaisių minkštimuose

18 lentelė. Šilauogių vaisių minkštimų antocianidinų sudėties ir sklaidos charakteristika (n=14)

Min. – minimali reikšmė, Maks. – maksimali reikšmė, M – aritmetinis vidurkis, S x - vidurkio standartinė paklaida, Me –

mediana, V – variacijos koeficientas.

Antocianidinai

Keikis, proc.

Min. Maks. M S x Me V, proc.

Delfinidinas 0,002 0,065 0,018 0,005 0,019 111,71

Cianidinas 0,002 0,064 0,021 0,005 0,017 84,01

Petunidinas 0,003 0,110 0,038 0,008 0,041 77,15

Peonidinas 0,001 0,021 0,003 0,002 0,000 204,48

Malvidinas 0,005 0,135 0,041 0,010 0,039 98,01

Page 81: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

81

Visų antocianidinų kiekiai varijavo plačiose ribose. Didţiausi variacijos koeficientai apskaičiuoti

peonidinui ir delfinidinui, atitinkamai 204,48 ir 111,71 proc.

Hierarchinės klasterinės analizės dendrograma atskleidė skirtingų veislių šilauogių

vaisių minkštimų panašumus pagal sukauptus individualių antocianidinų kiekius. Dendrogramoje

tirtos veislės pasiskirstė į 2 stambias panašaus dydţio grupes (33 pav.). I-ąją grupę sudaro 5

šilauogių veislės („Putte―, „Chignecto―, „Dixi―, „Northcountry―, „Bluecrop―) ir siauralapė šilauogė.

II-oji grupė apima 7 veisles: „Heerma―, „Northblue―, „Ama―, „Rancocas―, „North holna―,

„Northland―, „Patriot―. „Berkeley― veislės minkštimai išsiskyrė itin dideliais visų antocianidinų

kiekiais ir dėl to nebuvo priskirta prie išskirtų klasterių.

Aprašomosios statistikos rezultatai pateikti 19 lentelėje rodo skirtumus tarp grupių. I-oji

grupė pasiţymėjo maţesniais uţ vidurkį visų antocianidinų kiekiais, tačiau II-ajai grupei

priklausančios veislės išsiskyrė didesniais uţ vidurkį individualių antocianidinų kiekiais. Nustatyta,

kad II-ajai grupei priklausančios veislės vertingesnės, kadangi jų vaisių minkštimuose susikaupusios

didesnės veikliųjų junginių – antocianidinų atsargos.

Hierarchinės klasterinės analizės pagalba išskirtų grupių statistiniam palyginimui

pritaikytas ranginis Mann‗o - Whitney‗o kriterijus nepriklausomoms imtims. Remiantis šiuo testu

nustatyta, kad klasterinės analizės būdu išskirtos grupės statistiškai reikšmingai (p<0,05) skiriasi

pagal visų antocianidinų (delfinidino, cianidino, petunidino, peonidino ir malvidino) kiekius

šilauogių minkštimuose.

33 pav. Šilauogių vaisų minkštimų panašumo pagal antocianidinų sudėtį dendrograma

Page 82: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

82

19 lentelė. Šilauogių vaisių minkštimų antocianidinų sudėties ir sklaidos charakteristika

klasteriuose (n=14)

Min. – minimali reikšmė, Maks. – maksimali reikšmė, Me – mediana, Q3-Q1 – kvartilinis plotis

Siekiant palyginti Botanikos instituto kolekcijose uţaugintų šilauogių veisles pagal

individualių antocianidinų kiekius šilauogių vaisių mezokarpyje įvertinta procentinė atskirų

antocianidinų dalis klasterinės analizės metodu išskirtose grupėse bei „Berkeley― veislėje ir gauti

rezultatai pateikti 34 pav. Nustatyta, kad I-ajai grupei priskirtoms veislėms būdingas didesnis

petunidino santykinis kiekis, o II-oje petunidinas, peonidinas ir malvidinas sudaro gana artimas

antocianinų komplekso dalis. „Berkeley― veislės minkštimams būdingas antocianidinų santykis

panašus į šilauogių vaisių santykinę sudėtį.

Antocianidinai Klasteriai

Keikis, proc.

Min. Maks. Me Q3-Q1

Delfinidinas

Cianidinas

Petunidinas

Peonidinas

Malvidinas

I 0,002 0,024 0,000 0,002

II 0,017 0,030 0,023 0,008

I 0,002 0,044 0,004 0,015

II 0,016 0,031 0,022 0,009

I 0,003 0,062 0,010 0,019

II 0,040 0,060 0,051 0,013

I 0,001 0,009 0,000 0,001

II 0,001 0,005 0,001 0,004

I 0,005 0,056 0,005 0,020

II 0,032 0,065 0,055 0,020

Page 83: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

83

0%

20%

40%

60%

80%

100%

I II "Berkeley"

Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas

34 pav. Šilauogių vaisių minkštimų antocianidinų santykinės dalies įvairavimas pogrupiuose,

išskirtuose hierarchinės klasterinės analizės pagalba (klasterių numeriai pagal 33 pav.) ir

„Berkeley“ veislės vaisių minkštimuose

Atlikus Lietuvos klimatinėmis sąlygomis uţaugintų sodinių šilauogių veislių vaisių

minkštimų antocianinų sudėties tyrimus apibendrinant galima teigti, jog daugiausiai antocianinų

susikaupę „North holna―, „Putte― ir „Berkeley― veislių šilauogių minkštimuose. Didţiausi suminiai

antocianidinų kiekiai nustatyti „Berkeley―, „North holna― ir „Northland― veislių minkštimuose. Iš

visų tyrinėtų pavyzdţių didţiausiais individualių antocianidinų kiekiais išsiskyrė „Berkeley― veislės

minkštimai. Maţiausi suminiai antocianinų kiekiai aptikti „Patriot―, o antocianidinų „Dixi― veislių

vaisių minkštimuose.

Šilauogių vaisių išspaudų antocianinų ir antocianidinų sudėties įvairavimas. Vaisių išspaudos –

maisto pramonės atlieka, kuri gali būti panaudota kaip pigi ir turtinga veikliaisiais junginiais ţaliava

antocianinų ekstrakcijai. Atlikti moksliniai tyrimai su vynuogių išspaudomis parodė, jog išspaudos

gali būti ekonomiškai naudinga ţaliava antocianinų ekstraktų gamyboje [129, 164]. Tikslinga

išsiaiškinti šilauogių vaisių išspaudų antocianinų sudėties kokybinių ir kiekybinių parametrų

įvairavimą tirtose veislėse ir įvertinti galimybę panaudoti išspaudas vaistinių preparatų gamyboje.

Tam tikslui analizuota Botanikos instituto kolekcijose surinktų 13-os sodinių šilauogių veislių ir 1-

os siauralapės šilauogės išspaudų pavyzdţiai.

Atlikus spektrofotometrinį tyrimą, didţiausi antocianinų kiekiai nustatyti, „Rancocas―

(2,114 proc.), „Northblue― (1,196 proc.), „Berkeley― (1,152 proc.) veislių vaisių išspaudų

ekstraktuose. Maţiausias suminis antocianinų kiekis nustatytas „North holna― (0,432 proc.),

Page 84: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

84

„Bluecrop― (0,538 proc.) bei „Dixi― (0,538 proc.) veislių išspaudų ėminiuose. Didţiausi suminiai

antocianidinų kiekiai nustatyti „Rancocas― (1,477 proc.) ir „Putte― (0,974 proc.) sodinių šilauogių

veislių bei siauralapės (1,152 proc.) vaisių išspaudose, o maţiausi suminiai antocianidinų kiekiai

nustatyti „North holna― (0,438 proc.), "Bluecrop" (0,226 proc.) ir "Heerma" (0,496 proc.) veislių

vaisių bandiniuose (35 pav.).

0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500

"Dixi"

"Putte"

"Rancocas"

"Heerma"

"Bluecrop" "Ama"

"Northblue"

"Northcuont

"Northland" "Berkeley"

Siauralapė

"Patriot"

"Chignecto"

"North

kiekis, proc.

antocianinų suma antocianidinų suma

35 pav. Suminio antocianinų ir antocianidinų kiekių įvairavimas šilauogių išspaudų ėminiuose

Aprašomosios statistikos rezultatai pateikti 20 lentelėje. Tirtuose šilauogių išspaudų

pavyzdţiuose, kaip ir vaisių ėminiuose nustatytas didţiausias vidutinis malvidino kiekis (0,223

proc.), maţesnis petunidino kiekis (0,061 - 0,315 proc.). Delfinidino koncentracija šilauogių vaisių

išspaudose svyravo nuo 0,051 iki 0,264 proc. Didţiausias variacijos koeficientas, atspindintis

junginio variacijos amplitudę apskaičiuotas cianidinui (93,81 proc.). Maţiausią antocianidinų

komplekso dalį šilauogių vaisių išspaudose sudarė peonidinas, jo kiekis įvairavo nuo 0,009 iki 0,162

proc.

Atlikta hierarchinė klasterinė analizė, kurios dendrogramoje, sudarytoje analizuojant

individualių antocianidinų kiekius vaisių išspaudose, aiškiai išsiskyrė 2 stambios grupės: šiek tiek

smulkesnė I-oji ir stambesnė II-oji. Pirmoji grupė apjungia 6 sodinių šilauogių veisles („Dixi―,

„Heerma―, „North holna―, „Ama―, „Chignecto―, „Bluecrop―). Antroji didesnė grupė susideda iš 6

veislių („Northblue―, „Northland―, „Putte―, „Northcountry―, „Berkeley―, „Patriot―) ir siauralapės

šilauogės. „Rancocas― veislės išspaudos išsiskyrė didesniais uţ vidurkį visų antocianidinų kiekiais,

Page 85: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

85

todėl klasterinės analizės metu išskirtoms grupėms nepriskirta. I-oji grupė išsiskyrė maţesniais uţ

vidurkį visų antocianidinų kiekiais. Tuo tarpu II-ajai grupei priklausančios veislės pasiţymėjo uţ

vidurkį didesniais individualių antocianidinų kiekiais.

20 lentelė. Šilauogių vaisių išspaudų antocianidinų sudėties ir sklaidos charakteristika (n=14)

Min. – minimali reikšmė, Maks. – maksimali reikšmė, M – aritmetinis vidurkis, S x - vidurkio standartinė paklaida, Me –

mediana, V – variacijos koeficientas.

36 pav. Šilauogių vaisių išspaudų panašumo pagal antocianidinų sudėtį dendrograma

Hierarchinės klasterinės analizės pagalba išskirtų grupių statistiniam palyginimui taikytas

ranginis Mann‗o Whitney‗o kriterijus nepriklausomoms imtims. Naudojantis šiuo testu nustatyta,

kad klasterinės analizės metodu išskirtos grupės statistiškai reikšmingai (p<0,05) skiriasi pagal

delfinidino, cianidino, petunidino, peonidino ir malvidino kiekius šilauogių ţievelėse.

Įvertinta procentinė atskirų antocianidinų dalis klasterinės analizės metodu išskirtose

grupėse ir gauti rezultatai pateikti 37 pav. Antocianidinų kiekio procentinės dalies įvairavimas tarp

skirtingų V. corymbosum L. veislių išspaudų pavyzdţių rodo, kad tirtoms veislėms būdingas

Antocianidinai

Keikis, proc.

Min. Maks. M S x Me V, proc.

Delfinidinas 0,051 0,264 0,171 0,017 0,174 35,29

Cianidinas 0,047 0,657 0,163 0,041 0,120 93,88

Petunidinas 0,061 0,315 0,204 0,019 0,203 35,13

Peonidinas 0,009 0,162 0,046 0,010 0,033 83,10

Malvidinas 0,058 0,437 0,223 0,031 0,190 51,23

Page 86: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

86

neţymus cheminis polimorfizmas. Nustatyta, kad I-oje grupėje esančioms veislėms būdingas

didesnis petunidino santykinis kiekis, tuo tarpu II-oje didţiausią antocianidinų komplekso dalį

sudarė malvidinas. „Rancocas― veislės išspaudos išsiskyrė didesniu cianidino ir peonidino

santykiniu kiekiu bei maţesne petunidino santykine dalimi (21 lentelė).

21 lentelė. Šilauogių vaisių išspaudų antocianidinų sudėties ir sklaidos charakteristika klasteriuose

(n=14)

Min. – minimali reikšmė, Maks. – maksimali reikšmė, Me – mediana, Q3-Q1 – kvartilinis plotis

Antocianidinai Klasteriai

Keikis, proc.

Min. Maks. Me Q3-Q1

Delfinidinas

Cianidinas

Petunidinas

Peonidinas

Malvidinas

I 0,051 0,164 0,118 0,073

II 0,118 0,226 0,222 0,051

I 0,047 0,124 0,088 0,053

II 0,082 0,250 0,129 0,099

I 0,061 0,193 0,139 0,139

II 0,192 0,315 0,269 0,065

I 0,009 0,032 0,021 0,015

II 0,027 0,069 0,058 0,033

I 0,058 0,162 0,133 0,054

II 0,218 0,437 0,336 0,133

Page 87: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

87

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

I II "Rancocas"

Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas

37 pav. Šilauogių išspaudų antocianidinų santykinės dalies įvairavimas pogrupiuose, išskirtuose

hierarchinės klasterinės analizės pagalba (klasterių numeriai pagal 36 pav.) ir „Rancocas“ veislės

vaisių išspaudose

Kompleksiškai perdirbant šilauogių vaisių augalines ţaliavas, gaunamas vaisių išspaudas

galima sėkmingai panaudoti maisto papildų gamyboje. Atlikus šilauogių vaisių išspaudų

antocianidinų analizę apibendrintai galima teigti, jog išspaudų antocianidinų cheminės sudėties

kokybiniai rodikliai nesiskiria nuo atitinkamų veislių vaisių išspaudų bandinių antocianinų ir

antocianidinų sudėtimi. Šilauogių išspaudas galima vertinti kaip vertingą, turtingą antocianinais

ţaliavą, tinkančią fitopreparatų gamyboje. Vertingiausios, daugiausiai antocianinų kaupiančios yra

„Rancocas―, „Northblue― ir „Berkeley― šilauogių veislių vaisių išspaudos. Didţiausi suminiai

antocianidinų kiekiai nustatyti Rancocas― ir „Putte― sodinių šilauogių veislių bei siauralapės

šilauogės vaisių išspaudose.

3.2. Vaccinium L. genties augalų vaisių ekstraktų biologinio poveikio tyrimai

3.2.1. Vaccinium L. genties rūšių augalinių ţaliavų vaisių ekstraktų antiradikalinių savybių

įvertinimas

Literatūros duomenimis Vaccinium L. genties vaisių ekstraktai pasiţymi

antioksidantiniu poveikiu. Atlikti tyrimai, taikant įvairius antioksidantinio aktyvumo tyrimo

modelius parodė, jog mėlynių ir šilauogių vaisiuose esančios veikliosios medţiagos įvairiais

mechanizmais gali sumaţinti oksidacinio streso atsiradimo tikimybę [74]. Nustatyti tamprūs

koreliaciniai ryšiai tarp antioksidantinio aktyvumo ir polifenolinių junginių (fenilkarboninių rūgščių,

Page 88: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

88

antocianinų, flavonolių) kiekio vaistinėse augalinėse ţaliavose [59, 74, 128, 181, 199, 224].

Antocianinai yra viena iš svarbiausių gamtinių biologiškai aktyvių junginių grupių, natūralių

antioksidantų, nustatytų daugelyje augalinės kilmės produktų [59, 181].

Moksliniais tyrimais įrodyta, kad antiradikalinėmis savybėmis pasiţymintys antocianinai

atiduoda elektroną ar vandenilio atomą iš hidroksilo grupės laisviesiems radikalams ir taip juos

suriša nutraukdami oksidacinius procesus [260]. Antocianinai yra potencialūs laisvųjų radikalų

surišėjai, gebantys surišti •O2¯, HO•, H2O2, 1O2 laisvuosius radikalus [192, 263, 264]. Siekiant

įvertinti antocianinais turtingų mėlynių ir šilauogių ekstraktų biologinio poveikio ypatumus tikslinga

įvertinti tiriamų ţaliavų preparatų antioksidantines savybes in vitro bei in vivo modeliuose.

Didėjantį pasaulio mokslininkų susidomėjimą antioksidantais iliustruoja per dešimtmetį

(1996-2006 m.) net 345 % išaugęs mokslinių straipsnių skaičius, kuriuose aprašomi antioksidantinio

poveikio tyrimai [162]. Antioksidantinių savybių tyrimai yra aktualūs ir svarbūs, kadangi laisvieji

radikalai yra glaudţiai susiję su daugelio ligų etiologija (išeminė širdies liga, insultas, reumatoidinis

artritas, regėjimo bei atminties sutrikimai, degeneraciniai susirgimai, vėţys ir kt.) [201].

Antiradikalinių savybių tyrimui naudojami cheminiai metodai, remiantis naudojamais oksidantais,

paprastai skirstomi į biologinius (superoksido anijono radikalo, vandenilio peroksido, hidroksilo

radikalo, singletinio deguonies, azoto osksido radikalo) ir ne biologinius (DFPH-1,1-difenil-2-

pikrilhidrazilo, ABTS-,2′-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfoninės rūgšties), geleţies katijono)

[162].

38 pav. DFPH radikalo inaktyvacijos priklausomybė nuo laiko

Page 89: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

89

Preliminariam tiriamų ekstraktų antiradikalinių savybių įvertinimui pasirinktas

fotometrinis DFPH sujungimo metodas. Antioksidantinis aktyvumas įvertinamas matuojant, kiek

procentų stabilaus DFPH radikalo neutralizuoja tiriamajame ekstrakte esantys ir antioksidantiniu

aktyvumu pasiţymintys junginiai. Spektrofotometrinis DFPH metodas neparodo individualių

antocianinų antioksidantinio aktyvumo. Jo dėka nustatomas bendras, t.y. suminis visų ekstrakte

esančių atioksidantinėmis savybėmis pasiţyminčių junginių antioksidantinis aktyvumas. Šilauogių ir

mėlynių vaisiuose antioksidantinėmis savybėmis pasiţymi ne tik antocianinai, bet ir daugelis kitų

biologiškai aktyvių medţiagų. Šilauogės genties vaisiuose be antocianinų nustatyta flavonoidų,

fenolinių rūgščių, askorbo rūgšties, kurios taip pat pasiţymi stipriai išreikštomis antioksidantinėmis

savybėmis [17, 44, 199 255].

Pradiniame tyrimo etape, buvo įvertinta laisvojo radikalo (DFPH) inaktyvavimo

priklausomybė nuo laiko trukmės. Stebint absorbcijos pokyčius nustatyta, jog ilgėjant ekspozicijos

laikui, proporcingai didėja ir inaktyvuoto DFPH radikalo kiekis. Pusiausvyra, kai nebekinta

inaktyvuoto laisvojo radikalo kiekis, nusistovėjo per 30 min. Laisvojo radikalo inaktyvacijos

priklausomybė nuo laiko trukmės nustatyta šilauogių ir mėlynių vaisių ir ţievelių, ekstraktuose (38

pav.).

22 lentelė. Antiradikalinių savybių palyginimas mėlynių ir šilauogių vaisių, ţievelių, minkštimų ir

išspaudų ekstraktuose.

Tyrimo objektas Inaktyvuoto DFPH radikalo kiekis, proc.

V. corymbosum L. V. myrtillus L.

Vaisių ekstraktas 53,34 ± 0,76 63,72 ± 1,11

Vaisių ţievelių ekstraktas 76,68 ± 3,15 82,69 ± 0,37

Vaisių minkštimų ekstraktas 25,48 ± 0,10 53,27 ± 3,43

Vaisių išspaudų ekstraktas 72,87 ± 2,95 84,57 ± 1,24

Stipriausiomis antioksidantinėmis savybėmis išsiskyrė mėlynių vaisių išspaudų ekstraktai.

Surištojo laisvojo radikalo kiekis siekė 84,57 proc., maţesni jo kiekiai nustatyti ţievelių ekstraktuose

(82,69 proc.). Panašūs rezultatai gauti ir tiriant šilauogių pavyzdţius tik antiradikalinės savybės stipriau

išreikštos vaisių ţievelių ekstraktuose, inaktyvuoto DFPH kiekis siekė 76,68 proc., o išspaudų

ekstraktuose - 72,87 proc. Maţiausias surištojo radikalo kiekis nustatytas šilauogių (25,48 proc.), ir

mėlynių (53,27 proc.) minkštimų ekstraktuose (22 lentelė).

Tiriant mėlynių ir skirtingų šilauogių veislių vaisių ekstraktų antiradikalines savybes

nustatyta, jog šilauogių veislių („Berkeley―, „Ama―, „Northland―) vaisiai sukaupę didţiausius

Page 90: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

90

antocianinų kiekius (24 pav.) taip pat pasiţymi stipriausiomis antiradikalinėmis savybėmis (23 lentelė).

Minėtos savybės būdingos „Berkeley― (82,31 proc.) „Ama― (81,65 proc.), „Northland― (52,83 proc.)

veislių vaisiams.

23 lentelė. Šilauogių ekstraktų antiradikalinės savybės

Eil. Nr. Šilauogių ekstraktai Inaktyvuoto DFPH kiekis, proc.

1. „Dixi― 15,73

2. „Putte― 35,58

3. „Rancocas― 36,49

4. „Heerma― 50,40

5. „Bluecrop― 33,22

6. „Ama― 81,65

7. „Northblue― 50,90

8. „Northcuontry― 22,95

9. „Northland― 52,83

10. „Berkeley― 82,31

11. Siauralapė 24,94

12. „Patriot― 10,01

13. „Chignecto― 6,10

14.

„North holna―

31,43

Apibendrinant galima teigti, jog spektrofotometriniu DFPH metodu galima greitai, patikimai ir

paprastai įvertinti tiriamų augalinių ţaliavų ekstraktų antiradikalines savybes. Stipriausiai išreikštomis

antiradikalinėmis savybėmis išsiskyrė mėlynių vaisių išspaudų ekstraktai, maţiausias surištojo radikalo

kiekis nustatytas šilauogių (25,48 proc.) ir mėlynių vaisių (53,27 proc.) minkštimų ekstraktuose.

Įvertintos vaisių antiradikalinės savybės ir nustatytas tiesioginis ryšys tarp antocianinų kiekio

ekstraktuose ir jų gebėjimo surišti laisvuosius radikalus. Tolimesniuose tyrimuose būtų tikslinga

išsiaiškinti atskirų veikliųjų junginių antioksidantines savybes pritaikant atrankesnes nustatymo

metodikas.

3.2.2. Vaccinium myrtillus L. vaisių etanolinio ir vandeninio ekstraktų poveikis ţiurkės širdies

mitochondrijų funkcijoms

Širdies mitochondrijos yra labai svarbios ląstelės organelės, kurios oksidacinio

fosforilinimo metu pagamina net 95 proc. ATP, reikalingo gyvybiniams procesams vykti. Nemaţai

Page 91: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

91

susirgimų (kardiomiopatijos, išeminė širdies liga ir t.t.) yra susiję su širdies mitochondrijų funkcijos

sutrikimais, todėl siekiant kryptingai veikti mitochondrijų aktyvumą, struktūrą ir funkcijas, būtina

ištirti mitochondrijų atsaką į įvairių faktorių, jų tarpe ir į biologiškai aktyvių junginių, poveikį.

Duomenų apie tiesioginį antocianinų poveikį mitochondrijų oksidaciniam fosforilinimui

mokslinės literatūros duomenų bazėje nėra arba jie labai riboti, buvo tikslinga tirti mėlynių vaisių

ekstraktų (etanolinio ir vandeninio) ir antocianinų poveikį ţiurkės širdies mitochondrijų kvėpavimo

parametrams.

Pirmiausia įvertinome mėlynių vaisių vandeninio ekstrakto (MVE) ir mėlynių vaisių

etanolinio ekstrakto (MEE) poveikį piruvato+malato, t.y. mitochondrijų kvėpavimo grandinės I

komplekso substrato oksidacijai. Duomenys pateikti 24 ir 25 lentelėse. Nustatyta, kad mėlynių

vaisių vandeninis ekstraktas (iki 15 μl/1,5 ml) neveikė mitochondrijų kvėpavimo greičio antroje

metabolinėje būsenoje (V2), t.y. nedidino mitochondrijų membranos laidumo jonams. Toliau

didinant jo kiekį (20 μl ir 30 μl) buvo stebimas (1,2-1,3 kartus) oksidacijos ir fosforilinimo procesų

atskyrimas, tačiau statistiškai reikšmingas skirtumas gautas tik pridėjus 30 μl MVE. Mitochondrijų

kvėpavimo greičio trečioje metabolinėje būsenoje (V3) sumaţėjimas buvo stebimas tik esant terpėje

15 μl - 30 μl mėlynių vaisių vandeninio ekstrakto (nuo 27 iki 59 proc., p<0,05), tuo tarpu maţesni

MVE kiekiai statistiškai reikšmingo poveikio V3 neturėjo. Ištyrus MEE, nustatyta, kad jis 29-55

proc. (15 μl -30 μl) slopino V3, t.y panašiai, kaip ir MVE. Mitochondrijų kvėpavimo kontrolės

koeficientas (KKK) sumaţėjo 46-64 proc. (MVE ) ir 40-64 proc. (MEE), atitinkamai, ir tiktai

pridėjus didesnius (15-30 μl) ekstraktų kiekius. Maţesnės MVE ir MEE koncentracijos statistiškai

reikšmingo poveikio KKK neturėjo. Įdomu tai, kad MEE (0,5-20 μl) neveikė mitochondrijų

kvėpavimo greičio antroje metabolinėje būsenoje, o pridėjus didţiausią tirtą (30 μl MEE) kiekį, šis

efektas buvo toks pat (stimuliacija 1,31 karto) kaip ir pridėjus 30 μl MVE.

Tolesniuose eksperimentuose tyrėme mėlynių vaisių ekstraktų poveikį mitochondrijoms oksiduojant

sukcinatą, t.y. mitochondrijų kvėpavimo grandinės II komplekso substratą (25 ir 26 lentelės).

Nustatėme, jog MVE (2,5-15 μl/1,5 ml) statistiškai reikšmingai neveikė mitochondrijų funkcijos,

tačiau didesni kiekiai (20 ir 30 μl/1,5 ml) slopino V3 nuo 21 proc. iki 39 proc., atitinkamai, t.y.

maţiau lyginat su piruvato+malato oksidacija (39 pav.) ir neţymiai didino (1,3 ir 1,25 kartus,

p<0,05) mitochondrijų kvėpavimo greitį antroje metabolinėje būsenoje (V2), t.y. neţymiai atskyrė

oksidacijos ir fosforilinimo procesus. MEE statistiškai reikšmingo poveikio į V3 neturėjo, o V2

statistiškai reikšmingai padidino tik pridėjus didţiausią tirtą (30 μl) MEE kiekį.

Page 92: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

92

24 lentelė. Mėlynių vaisių vandeninio ekstrakto (MVE) poveikis ţiurkės širdies mitochondrijų funkcijai joms oksiduojant piruvatą + malatą.

Substratas piruvatas + malatas

Kontrolė MVE(2,5 MVE(5 MVE(10 MVE(15 MVE(20 MVE(30

µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml)

V2 34,84±2,55 35,01±2,11 36,01±1,61 39,00±2,43 39,34±1,88 39,90±2,28 36,78±2,00

V2 + MVE - 33,74±1,50 38,93±5,78 34,85±1,17 41,6±2,69 47,62±4,08 48,33±1,89

**

V3 300,13±11,53 307,83±12,27 201,69±9,2 283,83±6,6 220,2±21,25* 173,94±32,30

* 122,25±21,83

*

V4 19,96±3,41 18,88±2,43 20,63±1,42 24,47±1,53 26,24±3,10 35,7±4,91 37,5±1,94*

V4+Cyt c 55,09±3,68 51,97±2,23 52,99±1,65 66,28±3,87 84,68±1,69 102,72±3,83* 71,85±5,46

KKK 9,04±0,89 8,84±0,25 8,47±0,36 7,43±0,50 4,91±1,21* 4,28±0,68

* 3,29±0,49

*

25 lentelė. Mėlynių vaisių etanolinio ekstrakto (MEE) poveikis ţiurkės širdies mitochondrijų funkcijai joms oksiduojant piruvatą + malatą.

Substratas piruvatas + malatas

Kontrolė MEE(0,5 MEE(1 MEE(5 MEE(15 MEE(20 MEE(30

µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml)

V2 51,52±6,27 58,29±2,61 65,4±1,94 56,88±5,11 60,55±5,93 56,25±2,34 61,85±3,08

V2 + MEE - 54,62±3,49 61,95±2,40 55,25±4,09 63,33±3,70 58,78±1,32 80,75±4,81**

V3 345,60±17,34 298,70±19,25 322,75±6,84 291,00±7,69* 246,50±18,87

* 225,00±11,88

* 155,25±9,68

*

V4 45,38±6,07 43,29±2,27 46,25±3,10 46,75±5,22 40,36±1,83 51,63±0,90 64,30±3,33

V4+Cyt c 86,7±6,76 83,81±2,82 82,03±1,96 86,20±1,87 133,5±12,80 142,75±11,35 137,25±12,26

KKK 7,11±0,87 5,93±0,63 4,96±0,24 5,23±0,46 4,28±0,72 4,04±0,35* 2,55±0,28*

V2- mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje, esant 0,5 mg/ml mitochondrijų ir 5 mM piruvato + 5 mM malato. V3 -

mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, esant 1mM ADP. V4 – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje

būsenoje, esant 0,12 mM atraktilozido. V4+Cyt c, mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje būsenoje pridėjus 32 µM citochromo c.

Page 93: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

93

KKK - mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas. n=3; *p<0,05 lyginant su atitinkama kontrole, **p<0,05 lyginant su V2 atitinkamoje

grupėje.

26 lentelė. MVE poveikis ţiurkės širdies mitochondrijų funkcijai joms oksiduojant sukcinatą.

Substratas sukcinatas

Kontrolė MVE(2,5 MVE(5 MVE(10 MVE(15 MVE(20 MVE(30

µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml)

V2 144,94±4,72 135,88±6,33 131,74±5,45 138,78±2,90 156,00±2,58 146,50±2,60 130,50±5,27

V2 + MVE - 151,72±12,45 151,39±7,85 148,68±4,02* 172,25±8,13 190,50±12,53** 163,79±7,88**

V3 274,31±10,46 257,51±19,96 253,07±12,33 232,73±7,42 242,75±6,28 217,75±7,44* 167,84±5,67*

V4 138,55±7,50 137,24±11,31 135,15±8,32 138,86±2,63 163,00±6,87 168,75±10,01 134,25±7,40

V4+Cyt c 233,62±11,09 205,88±11,73* 242,45±7,85 235,22±19,56 269,00±14,49* 277,00±18,69 277,00±28,55

KKK 1,89±0,03 1,91±0,19 1,93±0,10 1,68±0,03 1,56±0,02* 1,49±0,04* 1,29 ±0,05*

27 lentelė. MEE poveikis ţiurkės širdies mitochondrijų funkcijai joms oksiduojant sukcinatą.

Substratas sukcinatas

Kontrolė MEE(1 MEE(5 MEE(15 MEE(20 MEE(30

µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml)

V2 141,33±3,05 122,25±6,65 126,75±4,99 134,17±1,30 157,00±21,22 163,17±5,93

V2 + MEE - 120,50±7,14 129,25±5,44 137,33±5,24 162,00±19,29 173,17±7,43**

V3 238,83±14,41 185,00±7,56 212,00±10,86 189,50±16,02 269,33±11,57 215,33±10,04

V4 130,50±2,19 109,75±5,69* 120,50±3,07* 129,17±5,33 166,00±13,01 160,00±7,64

V4+Cyt c 251,50±12,58 239,00±12,02 253,25±1,97 258,83±18,22 250,00±15,59 251,50±1,44

KKK 1,68±0,07 1,52±0,08 1,67±0,02 1,41±0,11 1,50±0,04 1,28±0,03*

Substratas: 15 mM sukcinato (+2 mM amitalio). Eksperimentinės sąlygos – kaip 24 lentelėje. n=3; *p < 0,05 lyginant su atitinkama kontrole;

**p<0,05 lyginant su V2 atitinkamoje grupėje.

Page 94: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

94

Gauti rezultatai rodo, jog piruvato+malato oksidacija yra jautresnė mėlynių vaisių ekstrakto

poveikiui (MVE ir MEE) negu sukcinato oksidacija (39 pav. ir 40 pav.). Ankstesni mokslininkų darbai

atskleidė, kad kai kurių antocianinų poveikiui kaip tik yra jautresnė sukcinato oksidacija, vadinasi dėl

botaninės matricos kompleksiškumo tirtuose ekstraktuose stipriau išreikštas kitų, antagonistiškai

veikiančių junginių poveikis [92, 213].

39 pav. Mėlynių vaisių vandeninio ekstrakto poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui trečioje

metabolinėje būsenoje.

Eksperimentinės sąlygos – kaip 24 lentelėje. n=3; *p < 0,05 lyginant su atitinkama kontrole. Substratai:

5 mM piruvato + 5 mM malato (P+M) arba 15 mM sukcinato (Succ) (+2 mM amitalio).

Page 95: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

95

40 pav. Mėlynių vaisių etanolinio ekstrakto poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui trečioje

metabolinėje būsenoje.

Eksperimentinės sąlygos – kaip 24 lentelėje. n=3; *p < 0,05 lyginant su atitinkama kontrole. Substratai:

5 mM piruvato + 5 mM malato (P+M) arba 15 mM sukcinato (Succ) (+2 mM amitalio).

Norėdami išsiaiškinti, kodėl naudojant dideles mėlynių vaisių ekstraktų koncentracijas stebimas

maksimalaus, su ATP sinteze susijusio kvėpavimo greičio (V3) slopinimas, ištyrėme abiejų mėlynės

vaisių ekstraktų poveikį į nuo fosforilinimo (t.y. nuo ATP sintezės) atskirtam mitochondrijų kvėpavimo

greičiui (VCCCP). 28 lentelėje pateikti rezultatai rodo, kad įdėjus 20 μl MVE VCCCP sumaţėjo 67 proc.

(substratas piruvatas+malatas) ir 27 proc. (substratas sukcinatas), p<0,05. MEE sumaţino VCCCP 66 proc.

(substratas piruvatas+malatas) ir 16 proc. (substratas sukcinatas), atitinkamai (29 lentelė ), t.y. abiem

atvejais buvo jautresnė piruvato oksidacija. Poveikis į VCCCP buvo didesnis nei į VADP tiek oksiduojant

piruvatą+malatą, tiek sukcinatą. Rezultatai rodo, kad viena iš mitochondrijų kvėpavimo trečioje

metabolinėje būsenoje sulėtėjimo prieţasčių gali būti mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso,

arba I ir II kompleksų aktyvumo sumaţėjimas. Neatmetama galimybė, kad mėlynių ekstraktai gali veikti

ir ADP/ATP nešiklį, ir/arba ATP-sintazę.

28 lentelė. MVE poveikis į nuo fosforilinimo atskirtam mitochondrijų kvėpavimo greičiui VCCCP, joms

oksiduojant piruvatą + malatą ir sukcinatą.

Substratas piruvatas + malatas Substratas sukcinatas

Kontrolė MVE (20 µl/1,5 ml) Kontrolė MVE (20 µl/1,5 ml)

VCCCP 285,50±2,60 95,17±8,42* 244,00±16,00 177,50±10,50*

VCCCP+Cyt c 302,50±7,79 129,33±16,76* 387,50±12,50 363,50±7,50*

Page 96: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

96

29 lentelė. MEE poveikis į nuo fosforilinimo atskirtam mitochondrijų kvėpavimo greičiui VCCCP, joms

oksiduojant piruvatą + malatą ir sukcinatą.

Substratas piruvatas + malatas Substratas sukcinatas

Kontrolė MEE (20 µl/1,5 ml) Kontrolė MEE (20 µl/1,5 ml)

VCCCP 411,17±17,46 140,18±4,30* 271,00±14,55 227,33±22,88*

VCCCP+Cyt c 586,33±27,68 283,25±36,86* 405,50±11,72 384,67±26,67

Substratai: 5 mM piruvato + 5 mM malato; 15 mM sukcinato (+2 mM amitalio).VCCCP – mitochondrijų

kvėpavimo greitis esant 0,19 μM karbonilcianid-m-chlorofenilhidrazono (CCCP); VCCCP+Cyt c – nuo

fosforilinimo atskirtas mitochondrijų kvėpavimo greitis esant terpėje 32 µM citochromo c. n=3; *p <

0,05 lyginant su atitinkama kontrole.

Atlikdami eksperimentus, pastebėjome įdomų faktą: mitochondrijoms kvėpuojant ketvirtoje

metabolinėje būsenoje (substratas piruvatas+malatas, 41 pav. ir 42 pav.), ir į matavimo terpę pridėjus

egzogeninio citochromo c, mėlynių ekstrakto poveikyje (15 ir 20 µl/1,5 ml) stebimas kvėpavimo

stimuliavimas, t.y. mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje būsenoje (V4+Cyt c) padidėjo

54-86 proc. (MVE) ir 54-65 proc. Įdomu tai, kad mitochondrijoms oksiduojant piruvatą+malatą,

kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje būsenoje (V4) nesant egzogeninio citochromo c padidėjo

maţesniu laipsniu nei esant citochromui c. Sukcinato oksidacijos atveju šis padidėjimas buvo maţesnis

(15-19 proc.), pridėjus MVE ekstrakto (15-20 µl/1,5 ml), o MEE šio parametro neveikė. Ar mitochondrijų

kvėpavimo greičio ketvirtoje metabolinėje būsenoje esant citochromui c padidėjimas susijęs su mėlynių

vaisių veikliųjų komponentų sąlygota citochromo c redukcija, nėra aišku. Jei minėtas efektas būtų susijęs

su antocianinų sukelta citochromo c redukcija, tai būtų labai svarbus faktas, kadangi reguliuojant

citochromo c redokso būseną galima reguliuoti ląstelės ţūties procesą – apoptozę, pvz., atitolinti

apoptozinę ląstelių ţūtį arba apsaugoti nuo jos. Šiam pirmą kartą pastebėtam reiškiniui ir jo mechanizmo

išaiškinimui reikalingi išsamesni tyrimai.

Page 97: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

97

41 pav. Mėlynių vandeninio ekstrakto (MVE) poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui ketvirtoje

metabolinėje būsenoje, esant egzogeniniam citochromui c

Eksperimentinės sąlygos – kaip 24 lentelėje. n=3; *p < 0,05 lyginant su atitinkama kontrole. Substratai:

5 mM piruvato + 5 mM malato (P+M) arba 15 mM sukcinato (Succ) (+2 mM amitalio).

42 pav. Mėlynių etanolinio ekstrakto (MEE) poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui ketvirtoje

metabolinėje būsenoje, esant egzogeniniam citochromui c.

Eksperimentinės sąlygos – kaip 24 lentelėje. n=3; *p < 0,05 lyginant su atitinkama kontrole. Substratai:

5 mM piruvato + 5 mM malato (P+M) arba 15 mM sukcinato (Succ) (+2 mM amitalio).

Siekiant išsiaiškinti, kokį poveikį mitochondrijų funkcijai turi mėlynių ekstraktuose identifikuoti

veiklieji komponentai, tyrėme etaloninių junginių (cianidin-3-galaktozido, malvidin-3-galaktozido ir

malvidin-3-gliukozido) įtaką širdies mitochondrijų kvėpavimo parametrams. Etaloniniai junginiai buvo

Page 98: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

98

įvedami į terpę skirtingais kiekiais, t.y. kad galutinė veikliųjų junginių koncentracija apytiksliai atitiktų

mėlynių vandeniniame ir etanoliniame ekstraktuose esančius kiekius. Rezultatai pateikti 30 ir 31

lentelėse.

30 lentelė. Etaloninių junginių poveikis (15 µl/1,5 ml) ţiurkės širdies mitochondrijų funkcijoms joms

oksiduojant piruvatą + malatą.

Substratas piruvatas + malatas

Kontrolė Cianidin-3-

galaktozidas

Malvidin-3-

gliukozidas

malvidin-3-

galaktozidas

V2 53,67±3,07 41,27±1,67 59,53±3,64 42,03±1,53

V2 + ET

V2(+ET)/V2

V3

V4

V4+Cyt c

KKK

-

-

332,67±28,67

50,93±6,23

104,47±7,27

6,18±0,17

44,27±2,72

1,07±0,02

287,67±6,06

40,37±2,53

100,80±2,34

6,98±0,14

56,43±2,80

0,95±0,01

342,33±8,95

58,23±3,76

115,67±0,20

5,77±0,20

41,87±0,91

1,00±0,06

289,67±9,82

38,10±0,17

98,33±0,72

6,93±0,49

V2- mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje, esant 0,5 mg/ml mitochondrijų ir 5 mM piruvato + 5 mM

malato. V3 - mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, esant 1mM ADP. V4 – mitochondrijų kvėpavimo

greitis ketvirtoje metabolinėje būsenoje, esant 0,12 mM atraktilozido. V4+Cyt c, mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje

metabolinėje būsenoje pridėjus 32 µM citochromo c. KKK - mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficinetas; n=3.

31 lentelė. Etaloninių junginių (30 µl/1,5 ml) poveikis ţiurkės širdies mitochondrijų funkcijoms joms

oksiduojant piruvatą + malatą.

Substratas piruvatas + malatas

Kontrolė Cianidin-3-

galaktozidas

Malvidin-3-

gliukozidas

malvidin-3-

galaktozidas

V2 53,67±3,07 56,20±5,60 63,03±1,53 52,77±0,18

V2 + ET

V2(+ET)/V2

V3

V4

V4+Cyt c

KKK

-

-

332,67±28,67

50,93±6,23

104,47±7,27

6,18±0,17

53,83±5,36

0,96±0,02

332,67±12,72

50,83±6,55

113,00±6,66

5,99±0,37

65,17±3,44

1,04±0,08

357,67±7,80

67,70±2,69

117,00±1,73

5,69±0,26

51,67 ±1,21

0,98±0,02

335,00±3,46

52,47±0,18

113,00±1,15

6,35±0,05

Page 99: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

99

Eksperimentinės sąlygos – kaip 24 lentelėje. n=3; *p < 0,05 lyginant su atitinkama kontrole.

Šie junginiai, priešingai nei mėlynės uogų ekstraktai, neveikė mitochondrijų kvėpavimo parametrų

nei oksiduojant piruvatą+malatą (30 ir 31 lentelės), nei sukcinatą (duomenys nepateikti). Tai rodo, jog

poveikį mitochondrijų funkcijai in vitro gali sąlygoti kiti antocianinai (delfinidin-3-galaktozidas,

delfinidin-3-gliukozidas, delfinidin-3-arabinozidas, cianidin-3-gliukozidas, petunidin-3-galaktozidas,

cianidin-3-arabinozidas, petunidin-3-gliukozidas, peonidin-3-galaktozidas, petunidin-3-arabinozidas,

peonidin-3-gliukozidas, peonidin-3-arabinozidas, malvidin-3-arabinozidas) arba neidentifikuotos, tačiau

mėlynių ekstraktuose esančios veikliosios medţiagos, tokios kaip kiti flavonoidų klasės junginiai

(miricetinas, kvercitrinas, izokvercitrinas, hiperozidas ar astragalinas), proantocianidinai ar fenolinės

rūgštys (galo, protokatechino, vanilino, chlorogeno, kavos, siringo, ferulo, kumaro).

Nors antocianinų biologinio poveikio tyrimai atliekami jau seniai, tačiau, mūsų ţiniomis, dar nėra

duomenų apie šių junginių tiesioginį poveikį mitochondrijose vykstantiems oksidacinio fosforilinimo

procesams. Todėl negalėjome palyginti mūsų gautų rezultatų su kitų Lietuvos ar uţsienio mokslininkų

darbais.

Eksperimentiškai, nustatėme koncentracijas, kurioms esant pasireiškia mėlynių ekstraktų (MVE ir

MEE) poveikis mitochondrijų funkcijoms in vitro – mitochondrijų kvėpavimo greičio antroje

metabolinėje būsenoje stimuliavimas ir trečioje metabolinėje būsenoje slopinimas bei mitochondrijų

kvėpavimo greičio ketvirtoje metabolinėje būsenoje padidėjimas, esant citochromui c. Sukcinato

oksidacija yra maţiau jautri mėlynės uogų ekstraktų poveikiui. Palyginus vandeninio ir etanolinio

mėlynių ekstraktų poveikį mitochondrijoms oksiduojant piruvatą+malatą, efektai yra panašūs, o sukcinato

oksidacijos atveju mitochondrijų funkciją labiau veikia vandeninis mėlynių vaisių ekstraktas (43 pav. ir

44 pav.). Atlikus antocianidinų analizę ESC metodu po rūgštinės hidrolizės nustatyta, jog MEE suminis

antocianidinų kiekis yra 30,5 proc. didesnis nei MVE (4 ir 5 lentelės). Etanoliniame ekstrakte rasta

daugiau delfinidino, petunidino ir peonidino, o cianidino kiekis net daugiau kaip du kartus didesnis negu

vandeniniame ekstrakte. Kadangi vandeniniame mėlynių ekstrakte nustatyti didesni malvidino kiekiai,

tikėtina, jog malvidino glikozidai gali veikti sukcinato oksidaciją. Kadangi mūsų rezultatai rodo, kad

malvidin-3-gliukozidas ir malvidin-3-galaktozidas neveikė mitochondrijų funkcijos, poveikį

mitochondrijoms gali turėti kiti malvidino glikozidai arba kitos mėlynių vaisių ekstraktuose esančios

veikliosios medţiagos

Tyrimų rezultatai rodo, jog didesnių koncentracijų mėlynių vaisių ekstraktai (tiek MVE , tiek

MEE) neţymiai atskyrė oksidacijos ir fosforilinimo procesus, tuo tarpu maţesni mėlynių ekstrakto kiekiai

neveikė vidinės mitochondrijų membranos intaktiškumo. Skulachev ir kt. autorių darbai rodo, kad silpnas

mitochondrijų oksidacijos ir fosforilinimo procesų atskyrimas gali būti naudingas ląstelei dėl laisvųjų

Page 100: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

100

deguonies radikalų generacijos pačiose mitochondrijose slopinimo [228] ir tai gali turėti kardioprotekcinį

poveikį. Be to, yra ţinoma, kad, priklausomai nuo koncentracijos, tie patys junginiai gali veikti ir kaip

antioksidantai, ir kaip pro-oksidantai [188, 52, 71]. Taigi, veikiant mitochondrijas biologiškai aktyviais

junginiais, galbūt galima būtų slopinti, ar, priešingai, skatinti ROS generaciją ir taip reguliuoti ląstelės

signalinius kelius siekiant ląsteles apsaugančio poveikio.

43 pav. MVE ir MEE poveikio ţiurkės širdies mitochondrijų funkcijai joms oksiduojant piruvatą +

malatą, palyginimas.

Eksperimentinės sąlygos – kaip 24 lentelėje. n=3; *p < 0,05 lyginant su atitinkama kontrole.

44 pav. MVE ir MEE poveikio ţiurkės širdies mitochondrijų funkcijai joms oksiduojant sukcinatą,

palyginimas.

Eksperimentinės sąlygos – kaip 24 lentelėje. n=3; *p < 0,05 lyginant su atitinkama kontrole.

Page 101: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

101

Įdomu tai, kad ir kitų autorių darbai rodo, jog flavonoidai rutinas, kvercitrinas, kvercetinas ir kt.

atskiria mitochondrijų oksidacijos ir fosforilinimo procesus [250, 251], tačiau maksimalus efektas yra

labai didelis (siekia net 2 kartus) naudojant net labai maţas (ng/ml) koncentracijas. Kaip labai stiprus

skyriklis veikia ir ginkmedţio ekstraktas [251], maţesniu oksidacijos ir fosforilinimo procesų atskyrimu

(apie 1,34 kartus) pasiţymi gudobelės ekstraktas [250], taip pat kaupiantis flavonoidus. Kiti autorių

darbai parodė, kad flavonoidais turtingas propolis (bendras fenolinių junginių kiekis 63-125 µg/ml)

slopino minėtą parametrą [163] ir maţino mitochondrijų kvėpavimo greitį trečioje metabolinėje būsenoje.

Tai dar kartą patvirtina, kad poveikis mitochondrijų kvėpavimo parametrams priklauso ne tik nuo

veikliųjų junginių koncentracijos, bet ir nuo jų struktūros (ginkmedyje, gudobelėje randami flavonoidai –

kvercetinas ir jo dariniai yra flavonolių klasės atstovai, propolyje randamas chrizinas yra flavonas,

pinocembrinas – flavononas, o galanginas – flavonolis), o mūsų tirto mėlynių ekstrakto veiklieji junginiai

yra antocianinų grupės atstovai. Taip pat svarbu, kad skirtingų klasių veiklieji junginiai gali veikti ne tik

sinergistiškai, bet ir panaikinti vienas kito veikimą [3, 51, 155, 159].

Kitas mūsų nustatytas reiškinys, kad didinant mėlynių ekstrakto koncentraciją, pasireiškė slopinantis

poveikis į mitochondrijų kvėpavimo greitį trečioje metabolinėje būsenoje tuo tarpu etaloniniai junginiai -

cianidin-3-galaktozidas, malvidin-3-galaktozidas ir malvidin-3-gliukozidas neveikia mitochondrijų

funkcijos. Tą patvirtina ir kitų autorių darbai, kurie tyrė cianidin-3-gliukozidą ir parodė, kad šis

antocianinas taip pat neveikia mitochondrijų funkcijos [156]. Daugiau darbų apie antocianinų tiesioginį

poveikį mitochondrijų funkcijai in vitro mokslinėse duomenų bazėse aptikti nepavyko. Kadangi mėlynių

ekstraktuose be cianidino ir malvidino glikozidų, dar identifikuoti ir kiti (petunidino, peonidino ir

delfinidino glikozidai), jie, o taip pat ir kiti polifenoliniai junginiai (kitų grupių flavonoidai,

proantocianidinai ar fenolinės rūgštys), kurie gali nulemti minėtą efektą.

Yra ţinoma, kad mitochondrijų kvėpavimo greičio slopinimas nedideliu laipsniu gali skatinti

aktyvių deguonies formų (ROS) generaciją ląstelėse. ROS kaip signalinė molekulė gali dalyvauti ląstelės

signalo perdavimo keliuose ir reguliuoti ląstelių išgyvenamumą [87, 121, 122].

Mūsų atlikti tyrimai yra nauji ir aktualūs, kadangi iki šio nei mėlynių ekstraktų, nei jų veikliųjų

komponentų - antocianinų tiesioginis poveikis izoliuotoms širdies mitochondrijų funkcijoms in vitro dar

nebuvo tyrinėtas. Mūsų duomenys rodo, kad poveikis mitochondrijų funkcijoms labai priklauso nuo

koncentracijos, į tai reiktų atsiţvelgti, parenkant koncentracijas tolimesniems in vivo eksperimentams.

Mėlynių preparatai yra plačiai vartojami medicinoje, todėl gauti duomenys aiškinantis mėlynių ekstraktų

ir juose esančių antocianinų poveikio mechanizmą subląsteliniame lygmenyje yra neabejotinai aktualūs.

Šiuos tyrimus reikia išplėsti, kad būtų galima įvertinti ne tik šių ekstraktų ar jų veikliųjų junginių

tiesioginį poveikį izoliuotoms mitochondrijoms, bet ir mitochondrijų funkcijoms intaktinėse ląstelėse,

Page 102: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

102

panaudojant ląstelių kultūras ar eksperimentuose in vivo. Galimybė reguliuoti mitochondrijų funkcijas

natūraliomis, biologiškai aktyviomis medţiagomis, tokiomis kaip antocianinai gali padėti išlaikyti

ląstelės gyvybingumą, ar, esant reikalui, nukreipti ją apoptozės ar nekrozės keliu.

Page 103: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

103

IŠVADOS

1. Sukurta efektyviosios skysčių chromatografijos metodika, leidţianti atlikti atrankų antocianidinų

komplekso kokybinį ir kiekinį nustatymą mėlynių vaisių vaistinėje augalinėje ţaliavoje. Įvertinti

metodikos įteisinimo parametrai, patvirtinantys jos jautrumą, tikslumą, tiesiškumą bei atrankumą.

Sukurta metodika pritaikyta šilauogių vaisių analizei. Ji gali būti taikoma kitų vaistinių augalinių

ţaliavų ar farmacinių preparatų, turinčių antocianinų, kokybiniams bei kiekiniams rodikliams

įvertinti.

2. Atlikus antocianinų ir antocianidinų sudėties tyrimus V. myrtillus L. vaisiuose, surinktuose iš 75

cenopopuliacijų, nustatyta, kad antocianinų suminis kiekis (birţelio – rugsėjo mėn.) kito nuo 0,828

iki 5,372 proc., antocianidinų – nuo 0,743 iki 5,722 proc., antocianidinų komplekso sudėtyje

dominuojantis komponentas – cianidinas (0,335 - 2,236 proc.).

3. Lietuvoje surinktą V. myrtillus L. vaisių augalinę ţaliavą galima vertinti kaip kokybišką, chemine

sudėtimi nesiskiriančią nuo kitų tyrinėtų Europos šalių mėlynių vaisių ţaliavų. Atlikus

palyginamuosius tyrimus, nustatyta, kad Lietuvos teritorijoje surinktų vaistinių augalinių ţaliavų

kokybinė antocianidinų sudėtis nesiskyrė nuo Švedijos, Rusijos, Baltarausijos, Ukrainos ir Latvijos

teritorijose surinktų ėminių kokybinės antocianidinų sudėties. Lietuvoje surinktuose mėlynių vaisių

pavyzdţiuose nustatytas vidutinis antocianinų kiekis siekė 2,488 proc. ir buvo didesnis nei

Baltarusijoje ir Latvijoje rinktose ţaliavose. Antocianidinų Lietuvos teritorijoje rinktuose ėminiuose

nustatyta vidutiniškai 2,556 proc.; tai yra didesnis kiekis nei Latvijos (2,289 proc.), Baltarusijos

(2,340 proc.) ir Rusijos (2,523 proc.) teritorijose rinktuose vaisiuose.

4. Nustatyta, jog didţiausi antocianinų kiekiai V. myrtillus L. vaisiuose Lietuvos gamtinėmis

sąlygomis susikaupia nuo rugpjūčio mėn. vidurio iki vaisių nokimo pabaigos. Mėlynių vaisių

augalinės ţaliavos paruošas Lietuvoje rekomenduojama vykdyti nuo rugpjūčio mėn. vidurio.

Įvertinus individualių antocianidinų kitimo dinamiką vaisiuose, nustatyta, kad nuo liepos mėn.

pabaigos iki rugsėjo mėn. vidurio mėlynių vaisiuose yra susikaupę didţiausi delfinidino kiekiai.

Cianidino didţiausi kiekiai nustatyti nuo rugpjūčio mėn. antros dekados iki rugsėjo mėn. vidurio,

petunidino – rugsėjo mėn., o peonidino ir malvidino didţiausi kiekiai – nuo rugpjūčio mėn 1

dekados iki rugsėjo mėn. vidurio.

5. Atlikus Lietuvoje Botanikos instituto lauko kolekcijose auginamų šilauogių vaisių antocianinų

sudėties analizę, nustatytos vertingiausios, daugiausiai antocianinų kaupiančios veislės: „Berkeley―

Page 104: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

104

(1,671 proc.), „Northland― (1,662 proc.), „Northcountry― (1,727 proc.) ir „Ama― (1,652 proc.).

Didţiausi suminiai antocianidinų kiekiai nustatyti „Northland― (1,585 proc.), ,,Northcountry― (1,534

proc.) ir „Rancocas― (1,453 proc.) veislių vaisių ėminiuose. Nustatyta, kad šilauogių vaisių

antocianidinų kompleksui būdingas malvidino (0,058 - 0,437 proc.) dominavimas. Antocianidinų

komplekso kiekinės sudėties skirtumai gali būti svarbus chemotaksonominis poţymis, apibūdinantis

Vaccinium L. genties genotipinę bei tarprūšinę įvairovę.

6. Atliktas mėlynių ir šilauogių vaisių ekstraktų antiradikaliojo aktyvumo nustatymas. Šilauogės vaisių

ekstraktuose didţiausiu suminiu antiradikaliuoju aktyvumu pasiţymi „Berkeley― (82,31 proc.),

,,Ama― (81,65 proc.), „Northland― (52,83 proc.); mėlynių vaisių ekstraktas inaktyvavo 63,72 proc.

laisvojo radikalo. Įvertintos mėlynių ir šilauogių vaisių ekstraktų antiradikalinės savybės ir

nustatytas tiesioginis ryšys tarp antocianinų kiekio ekstraktuose ir jų gebėjimo surišti laisvuosius

radikalus.

7. V. myrtillus L. vaisių ekstraktai (etanolinis ir vandeninis), priklausomai nuo koncentracijos, slopina

maksimalų, susijusį su ATP sinteze, mitochondrijų kvėpavimo greitį (27-59 proc. oksiduojant

piruvatą+malatą) galimai dėl mitochondrijų kvėpavimo grandinės I ir II kompleksų slopinimo.

Sukcinato oksidacija yra maţiau jautri ekstraktų poveikiui. Nustatytos mėlynių vaisių ekstraktų

koncentracijos, kurios silpnai atskiria oksidacijos ir ATP sintezės procesus ir, esant egzogeniniam

citochromui c, didina mitochondrijų kvėpavimą, nesusijusį su ATP sinteze.

Page 105: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

105

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Acker S. A. B. E, Balen G. P, den Berg D. J, Bast A, van der Vijgh V. J. F.

Influence of iron chelation on the antioxidant activity of flavonoids. Biochemical

Pharmacology 1998; 56 (8): 15 935-43.

2. Acquaviva R, Russo A, Galvano F, Galvano G, Barcellona M. L, Li Volti G,

Vanella A. Cyanidin and cyanidin 3-O-beta-D-glucoside as DNA cleavage protectors

and antioxidants. Cell Biol Toxicol. 2003; 19(4): 243–52.

3. Adams L. S, Seeram N. P, Hardy M. L, Carpenter C, Heber D. Analysis of the

Interactions of Botanical Extract Combinations Against the Viability of Prostate Cancer

Cell Lines eCAM 2006; 3(1): 117–24.

4. Adrain C, Martin S. J. The mitochondrial apoptosome: a killer unleashed by the

cytochrome seas. Trends Biochem Sci 2001; 26: 390–7.

5. Aguilar-Støenv M, Moe S. R. Medicinal plant conservation and management:

distribution of wild and cultivated species in eight countries. Biodivers Conserv 2007;

16: 1973–81.

6. Ahuja S, Dong W.M. Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC. London,

Elsevier Inc.; 2005. P. 20–45.

7. Akhlaghi M, Bandy B. Mechanisms of flavonoid protection against myocardial

ischemia–reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology 2009; 46

(3): 309-17.

8. Al-Awwadi N. A, Araiz C, Bornet A, Delbosc S, Cristol J-P, Linck N, Azay J. et al.

Extracts Enriched in Different Polyphenolic Families Normalize Increased Cardiac

NADPH Oxidase Expression while Having Differential Effects on Insulin Resistance,

Hypertension, and Cardiac Hypertrophy in High-Fructose-Fed Rats. J. Agric. Food

Chem. 2005; 53 (1): 151–7.

9. Amella M, Bronner C, Briancon F. Inhibition of mast cell histamine release by

flavonoids and bioflavonoids. Planta Medica 1985; 51: 16-20.

10. American Herbal Pharmacopoeia. Bilberry fruit. Santa Cruz: CA; 2001. p. 1-23.

11. Andersen M.Ø, Markham K.R. Flavonoids (Chemistry, Biochemistry and

Applications). LLC: JAV: Taylor & Francis Group; 2006. pp 472–511.

12. Andres-Lacueva C, Shukitt-Hale B, Galli R. L, Jauregui O, Lamuela-Raventos R.

M, Joseph J. A. Anthocyanins in aged blueberry-fed rats are found centrally and may

enhance memory. Nutritional Neuroscience 2005; 8(2): 111–20.

Page 106: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

106

13. Andriambeloson E, Magnier C, Haan-Archipoff G, Lobstein A, Anton R, Beretz A,

Stoclet J. C, Andriantsitohaina R. Natural dietary polyphenolic compounds cause

endothelium-dependent vasorelaxation in rat thoracic aorta. J Nutr 1998; 128: 2324-33.

14. Aragón S. M, Basabe B, Benedí J. M, Villar A. M. Antioxidant action of Vaccinium

myrtillus L. Phytotherapy Research 1997; 12(1): 104 -6.

15. Arora S, Musadi M, Mukherji S, Yang Y. C. Eye nutrient products for age-related

macular degeneration: what do they contain? Eye 2004; 18: 470–3.

16. Arozarena I, Ayestaran B, Cantajo M. J, Navarro M, Vera M, Abril I, et al.

Anthocyanin copmposition of Tempranillo, Garanacha and Cabernet Sauvignon grapes

from high- and low-quality vineyards over two years. Eur Food Res Technol. 2002; 214:

202-9.

17. Bagchi D, Sen C. K, Bagchi M, Atalay M. Anti-angiogenic, Antioxidant, and Anti-

carcinogenic Properties of a Novel Anthocyanin-Rich Berry Extract Formula.

Biochemistry (Moscow) 2004; 69 (1): 75-80.

18. Bao L, Yao X-S, Yau C-C, Tsi D, Chia C-S, Nagai H, Kurihara H. Protective

Effects of Bilberry (Vaccinium myrtillus L.) Extract on Restraint Stress-Induced Liver

Damage in Mice. J. Agric. Food Chem. 2008; 56 (17): 7803–7.

19. Barrett M. The Handbook of Clinically Tested Herbal Remedies. New York: The

Haworth Herbal Press; 2004. pp. 163-83.

20. Beekwilder J, Jonker H, Meesters P, Hall R. D, Van der Meer I. M, Ric de Vos C.

H. Antioxidants in Raspberry: On-Line Analysis Links Antioxidant Activity to a

Diversity of Individual Metabolites. J. Agric. Food Chem. 2005; 53: 3313-20.

21. Bell D. R, Gochenaur K. Direct vasoactive and vasoprotective properties of

anthocyanin-rich extracts. J Appl Physiol 2006; 100: 1164–70.

22. Bere E. Wild berries: a good source of omega-3. European Journal of Clinical

Nutrition 2006; 1–3.

23. Bernatoniene J, Trumbeckaite S, Majiene D, Baniene R, Baliutyte G, Savickas A,

Toleikis A. The effect of crataegus fruit extract and some of its flavonoids on

mitochondrial oxidative phosphorylation in the heart. Phytother Res. 2009; 23(12):

1701-7.

24. Bever B, Zahnd G. Plants with oral hypoglycemic action. Quart J Crude Drug Res

1979; 17: 139-96.

Page 107: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

107

25. Bitsch R, Netzel M, Frank T, Strass G, Bitsch I. Bioavailability and Biokinetics of

Anthocyanins From Red Grape Juice and Red Wine. Journal of Biomedicine and

Biotechnology 2004; 5: 293–8.

26. Blasig I. E, Dickens B. F, Weglicki W. B, Kramer J. H. Uncoupling of mitochondrial

oxidative phosphorylation alters lipid peroxidation-derived free radical production but

not recovery of postischemic rat hearts and post-hypoxic endothelial cells. Molecular

and Cellular Biochemistry 1996; 160/161: 167-77.

27. Blueberry for local sales and pick – your – own operations. Available at:

http://www.ces.ncsu.edu/plymouth/hort/berries/blueberry/bbpage1.html

28. Blumenthal M, Goldberg A, Brinckmann J. Herbal Medicine. Expanded Commission

E Monographs. Newton: Integrative Medicine Communications 2000; p. 16-19.

29. Bomser J, Madhavi D, Singletary K, Smith M. A. In vitro anticancer activity of fruit

extracts from Vaccinium species. Planta Med. 1996; 62(3): 212–6.

30. Boulton R. The copigmentation of anthocyanins and its role in the color of red wine: A

critical review. American Journal of Enology and Viticulture 2001; 52: 67–87.

31. Bravetti G. Fraboni E, Maccolini E. Preventive medical treatment of senile cataract

with vitamin E and anthocyanosides: clinical evaluation. Ann Ottalmol Clin Ocul 1989;

115: 109-16.

32. Breemen R. B, Fong H. H. S, Farnsworth N. R. The Role of Quality Assurance and

Standardization in the Safety of Botanical Dietary Supplements. Chem Res Toxicol.

2007; 20(4): 577–82.

33. Brown J, Kelly M. F. Inhibition of lipid peroxidation by anthocyanins, anthocyanidins

and their phenolic degradation products. European Journal of Lipid Science and

Technology 2007; 109 (1): 66 – 71.

34. Brownmiller C, Howard L.R, Prior R.L. Processing and Storage Effects on

Monomeric Anthocyanins, Percent Polymeric Color, and Antioxidant Capacity of

Processed Blueberry Products. Journal of Food Science 2008; 73 (5): 72-9.

35. Bruneton J. Pharmacognosy, phytochemistry, medicinal plants. Paris: Lavoisier

publishing; 1999. p. 355–63.

36. Budriūnienė D, Ašmontienė V, Daubaras R. Sodinė šilauogė 2002 Kaunas; p. 42.

37. Burns J, Gardner PT, O’Neil J, Crawford S, Morecroft I, McPhail DB, Lister C, et

al. Relationship among antioxidant activity, vasodilation capacity, and phenolic content

of red wines. J Agric Food Chem 2000; 48: 220-30.

Page 108: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

108

38. Butkus V, Butkienė Z, Some results in highbush blueberry and cranberry research in

the Lithuanian SSR. Acta Horticulturae 1985; 165: 93-6.

39. Butkus V, Pliszka K. The highbush blueberry - a new cultivated species. Acta

Horticulturae 1993; 346: 81 – 6.

40. Byamukama R, Kiremire B. T, Andersen Ø. M, Steigen A. Anthocyanins from fruits

of Rubus pinnatus and Rubus rigidus. Journal of Food Composition and Analysis 2005;

18 (6): 599-605.

41. Calderon-Cortes E, Clemente-Guerrero M, Sierra-Campos E, Cortes-Rojo C,

Gaona-Zamudio F. J, Villalobos-Molina R. Functional characterization of brain

mitochondrial nitric oxide synthase during hypertension and aging. Amino Acids 2006;

30: 73–80.

42. Calixto J. B. Efficacy, safety, quality control, marketing and regulatory guidelines for

herbal medicines (phytotherapeutic agents). Brazilian Journal of Medical and Biological

Research 2000; 33: 179-89.

43. Cameira-dos Santos P. J, Brillouet J. M, Cheynier V, Moutounet M. Detection and

partial characterisation if new anthocyanin-derived pigments in wine. Journal of the

Science of Food and Agriculture 1996; 70(2): 204–8.

44. Cao G, Shukitt-Hale B, Bickford P. C, Joseph J. A, McEwen J, Prior R. L.

Hyperoxia induced changes in antioxidant capacity and the effect of dietary antioxidants.

Journal of Applied Physiology 1999; 86: 1817-22.

45. Casadesus G, Shukitt-Hale B, Stellwagen H. M, Zhu X, Lee H-Y, Smith M. A,

Joseph J. A. Modulation of Hippocampal Plasticity and Cognitive Behavior by Short-

term Blueberry Supplementation in Aged Rats. Nutritional Neuroscience, 2004; 7 (5/6):

309–16.

46. Castilla P, Dávalos A, Teruel J. L, Cerrato F, Fernández-Lucas M, Merino J. L, et

al. Comparative effects of dietary supplementation with red grape juice and vitamin E on

production of superoxide by circulating neutrophil NADPH oxidase in hemodialysis

patients. Am J Clin Nutr 2008; 87: 1053–61.

47. Cespedes C. L, El-Hafidi M, Pavon N, Alarcon J. Antioxidant and cardioprotective

activities of phenolic extracts from fruits of Chilean blackberry, Aristotelia chilensis

(Elaeocarpaceae), Maqui. Food Chemistry 2008; 107: 820–9.

48. Chandra A, Rana J, Li Y. Separation, identification, quantification, and method

validation of anthocyanins in botanical supplement raw materials by HPLC and HPLC-

MS. J. Agric. Food Chem. 2001; 49: 3515–21.

Page 109: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

109

49. Conseil G, Baubichon-Cortay H, Dayan G, Jault J. M, Barron D, Di Pietro A.

Flavonoids: a class of modulators with bifunctional interactions at vicinal ATP-and

steroid-binding sites on mouse P-glycoprotein. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 9831–

6.

50. Cooke D, Schwarz M, Boocock D, Winterhalter P, Steward W. P, Gescher A. J,

Marczylo T. H. Effect of cyanidin-3-glucoside and an anthocyanin mixture from

bilberry on adenoma development in the ApcMin mouse model of intestinal

carcinogenesis—Relationship with tissue anthocyanin levels. Int. J. Cancer 2006; 119:

2213–20.

51. Davide D, Giovambattista D, Giuseppe C, Sergio T, Annalisa A, Claudio F.

Flavonoids, Vascular Function and Cardiovascular Protection. Current Pharmaceutical Design

2009; 15: 1072-84.

52. Dickancaitė E, Nemeikaitė A, Kalvelytė A, Cenas N. Prooxidant character of

flavonoid cytotoxicity: structure-activity relationships. Biochem Mol Biol Int. 1998;

45(5): 923-30.

53. Dinkova-Kostova A. T, Cheah J, Samouilov A, Zweier J. L, Bozak R. E, Hicks R.

J, et al. Phenolic Michael reaction acceptors: combined direct and indirect antioxidant

defenses against electrophiles and oxidants. Med Chem 2007; 3: 261–8.

54. Dreiseitel A, Schreier P, Oehme A, Locher S, Rogler G, Piberger H, Hajak G, et al.

Inhibition of proteasome activity by anthocyanins and anthocyanidins. Biochemical and

Biophysical Research Communications 2008; 372: 57–61.

55. Dua Q, Jerz G, Winterhalter P. Isolation of two anthocyanin sambubiosides from

bilberry (Vaccinium myrtillus) by high speed countercurrent chromatography. J.

Chromatogr. A 2004; 1045: 59–63.

56. Duchen M. R. Mitochondria in health and disease: perspectives on a new mitochondrial

biology. Molecular Aspects of Medicine 2004; 25 (4): 365-451.

57. Duffy K. B, Spangler E. L, Devan B. D, Guo Z, Bowker J. L, Janas A. M,

Hagepanos A, et al. A blueberry-enriched diet provides cellular protection against

oxidative stress and reduces a kainate-induced learning impairment in rats. Neurobiology

of Aging 2008; 29 (11): 1680-9.

58. Edwards A. M, Blackburn L, Christie S, Townsend S, David J. Food Supplements

in the Treatment of Primary Fibromyalgia: A Double-blind, Crossover Trial of

Anthocyanidins and Placebo. Journal of Nutritional & Environmental Medicine 2000;

10: 189–99.

Page 110: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

110

59. Ehlenfeldt M. K, Prior R. L, Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) and

Phenolic and Anthocyanin Concentrations in Fruit and Leaf Tissues of Highbush

Blueberry. J. Agric. Food Chem. 2001; 49 (5) 2222–7.

60. Elwood PC, Renaud S, Sharp DS, Beswick AD, O’Brien JR, Yarnell JWG.

Ischemic heart disease and platelet aggregation. Circulation 1991; 83: 38-44.

61. Erlund I, Marniemi J, Hakala P, Alfthan G, Meririnne E, Aro A. Consumption of

black currants, lingonberries and bilberries increases serum quercetin concentrations.

European Journal of Clinical Nutrition 2003; 57: 37–42.

62. Esterbauer H, Gebicki J, Puhl H, Jurgens G. The role of lipid peroxidation and

antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radic Biol Med 1992; 13: 341-90.

63. European pharmacopoeia. Fifth Edition. Volume 2. Strasbourg: Council of Europe;

2005. p. 1099-1100.

64. Evans W. Ch. Pharmacognosy. Nottingham: W.B.; 2002. p. 31.

65. Faria A, Oliveira J, Neves P, Gameiro P, Santos-Buelga C, Freitas V, Mateus N.

Antioxidant Properties of Prepared Blueberry (Vaccinium myrtillus) Extracts. J. Agric.

Food Chem. 2005; 53: 6896-902.

66. Felgines C, Texier O, Besson C, Fraisse D, Lamaison J-L, Remesy C. Blackberry

Anthocyanins Are Slightly Bioavailable in Rats. J. Nutr 2002; 132: 1249-53.

67. Felton J. S, Malfatti M. A. What Do Diet-Induced Changes in Phase I and II Enzymes

Tell Us about Prevention from Exposure to Heterocyclic Amines? J. Nutr. 2006; 136:

2683–4.

68. Feng R, Ni H-M, Wang S. Y, Tourkova I. L, Shulin M. R, Harada H, Yin X-M.

Cyanidin-3-rutinoside, a natural polyphenol antioxidant, selectively kills leukemic clles

by induction of oxidative stress. J. Biol. Chem. 2007; 282 (18): 13468-76.

69. Fernandez M. T, Mira M. L, Florêncio M. H, Jennings K. R. Iron and copper

chelation by flavonoids: an electrospray mass spectrometry study. J Inorg Biochem

2002; 92: 105–11.

70. Frankel E. N, Kanner J, Kinsella J. E. Inhibition in vitro of oxidation of human low

density lipoproteins by phenolic substances in wine. Lancet 1993; 341: 454-7.

71. Galati G, Sabzevari O, Wilson J. X, O'Brien P. J. Prooxidant activity and cellular

effects of the phenoxyl radicals of dietary flavonoids and other polyphenolics.

Toxicology 2002; 177(1): 91-104.

Page 111: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

111

72. Galli R. L, Shukitt-Hale B, Youdim K. A, Joseph J. A. Fruit polyphenolics and brain

aging: nutritional interventions targeting age-related neuronal and behavioral deficits.

Ann NY Acad Sci 2002; 959: 128-32.

73. Gao Z, Huang K, Yang X, Xu H. Free radical scavenging and antioxidant activities of

flavonoids extracted from the radix of Scutellaria baicalensis. Georgi Biochim Biophys

Acta 1999; 1472: 643–6.

74. Giovanelli G. Buratti S. Comparison of polyphenolic composition and antioxidant

activity of wild Italian blueberries and some cultivated varieties. Food Chemistry 2009;

112: 903–8.

75. Gornal A, Bradawill C, David M. Determination of serum proteins be means of the

biuret reaction. J Biol Chem. 1949; 177: 751-66.

76. Gould K. D, Winefield C. Anthocyanins– Biosynthesis, Functions, and Applications.

Wellington: Springer; 2008. pp. 1-3.

77. Gould K. S. Nature‘s Swiss Army Knife: The Diverse Protective Roles of

Anthocyanins in Leaves. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2004; 5: 314–20.

78. Goyarzu P, Malin D. H, Lau F. C, Taglialatela G, Moon W. D, Jennings R, Moy E,

et al. Blueberry Supplemented Diet: Effects on Object Recognition Memory and

Nuclear Factor-kappa B Levels in Aged Rats. Nutritional Neuroscience 2004; 7 (2): 75–

83.

79. Graversen H. B, Becker E. M, Skibsted L. H. Andersen M. L. Antioxidant

synergism between fruit juice and a-tocopherol. A comparison between high phenolic

black chokeberry Aronia melanocarpa) and high ascorbic blackcurrant (Ribes nigrum).

Eur Food Res Technol 2008; 226: 737–43.

80. Green D. R, Reed J. C. Mitochondria and apoptosis. Science 1998; 281: 1309–12.

81. Guideline on good agricultural and collection practice (GACP) for starting

materials of herbal origin. Available at:

http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/hmpc/24681605en.pdf.

82. Guo J, Han W, Wang M-H. Ultraviolet and environmental stresses involved in the

induction and regulation of anthocyanin biosynthesis: A review. African Journal of

Biotechnology 2008; 7 (25): 4966-72.

83. Guzik T. J, Harrison D. G. Vascular NADPH oxidases as drug targets for novel

antioxidant strategies. Drug Discovery Today 2006; 11 (11/12): 524-33.

Page 112: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

112

84. Hakkinen S, Auriola S. High-performance liquid chromatography with electrospray

ionization mass spectrometry and diode array ultraviolet detection in the identification of

flavonol aglycones and glycosides in berries. J Chromatogr A 1998; 829 (1-2): 91-100.

85. Hakkinen S. H, Karenlampi S. O, Heinonen I. M, Mykkanen H. M, Torronen A. R.

Content of the flavanols quercetin, myricetin, and kaempferol in 25 edible berries.

Journal of Agricultural and Food Chemistry 1999; 47: 2274-9.

86. Hale K. L, McGrath S. P, Lombi E, Stack S. M, Terry N, Pickering I. J.

Molybdenum sequestration in Brassica species. A role for anthocyanins? Plant

Physiology 2001; 126: 1391–402.

87. Halestrap A. P, Clarke S. J, Khaliulin I. The role of mitochondria in protection of the

heart by preconditioning. Biochim Biophys Acta. 2007; 1767(8): 1007-31.

88. Harada K, Kano M, Takayanagi T, Yamakawa O, Ishikawa F. Absorption of

Acylated Anthocyanins in Rats and Humans after Ingesting an Extract of Ipomea batatas

Purple Sweet Tuber. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2004; 68 (7): 1500-7.

89. Haraguchi H, Yoshida N, Ishikawa H, Tamura Y, Mizutani K, Kinoshita T.

Protection of mitochondrial functions against oxidative stresses by isoflavans from

Glycyrrhiza glabra. J Pharm Pharmacol 2000; 52: 219–23.

90. Haramaki N, Stewart D. B, Aggarwal S, Ikeda H, Reznick A. Z, Packer L.

Networking antioxidants in the isolated rat heart are selectively depleted by ischemia–

reperfusion. Free Radic Biol Med 1998; 25: 329–39.

91. Havsteen B. H. The biochemistry and medical significance of the flavonoids.

Pharmacology & Therapeutics 2002; 96: 67– 202.

92. Hayek T, Fuhrman B, Vaya J, Rosenblat M, Belinky P, Coleman R, et al. Reduced

progression of atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice following consumption

of red wine, or its polyphenols quercetin or catechin, is associated with reduced

susceptibility of LDL to oxidation and aggregation. Arterioscler Thromb Vasc Biol

1997; 17: 2744–52.

93. He J, Magnuson B. A, Lala G, Tian Q, Schwartz S. J, Giusti M. M. Intact

anthocyanins and metabolites in rat urine and plasma after 3 months of anthocyanins

supplementation. Nutrition and Cancer 2006; 54 (1): 3-12.

94. Heidi D. J, Karen A. K, Cornett C, Hansen S. H, Christensen S. B. Hydrophilic

Carboxylic Acids and Iridoid Glycosides in the Juice of American and European

Cranberries (Vaccinium macrocarpon and V. oxycoccos), Lingonberries (V. vitis-idaea),

and Blueberries (V. Myrtillus). J. Agric. Food Chem. 2002; 50: 6871-6874.

Page 113: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

113

95. Heinonen M. Molecular Antioxidant activity and antimicrobial effect of berry

phenolics - a Finnish perspective. Nutrition & Food Research 2007; 51 (6); 684 – 91.

96. Heinrich M, Barnes J, Gibbons S, Williamson, E.M. Fundamentals of

Pharmacognosy and Phytoterapy. London: Elsevier Science Ltd.; 2004. p 217–218.

97. Hess H, Knapka J. J, Newsome D. A. Dietary prevention of cataracts in the pink-eyed

RCS rat. Lag Anim Sci 1985; 35: 47-53.

98. Hodnick W. F, Bohmont C. W, Capps C, Pardini R. S. Inhibition of mitochondrial

NADH-oxidase (NADH-Coenzyme Q oxidoreductase) enzyme system by flavonoids: a

structure-activity study. Biochem Pharmacol 1987; 36: 2873–4.

99. Hodnick W. F, Duval D. L, Pardini R. S. Inhibition of mitochondrial respiration and

cyanide-stimulated generation of reactive oxygen species by selected flavonoids.

Biochem Pharmacol 1994; 47: 573–80.

100. Holdena J. M, Bhagwata S. A, Haytowitza D. B, Gebhardta S. E, Dwyerb J.T,

Peterson J, Beechera G. R, Eldridgec A. L, Balentined D. Development of a database

of critically evaluated flavonoids data: application of USDA‘s data quality evaluation

system. Journal of Food Composition and Analysis 2005; 18: 829–44.

101. Hou D. X. Potential mechanisms of cancer chemoprevention by anthocyanins, Curr

Mol Med 2003; 3(2): 149-59.

102. Hou D. X, Fujii M, Terahara N, Yoshimoto M. Molecular Mechanisms Behind the

Chemopreventive Effects of Anthocyanidins. Journal of Biomedicine and Biotechnology

2004; 5: 321–5.

103. Hou D. X, Kai K, Li J-J, Lin S, Terahara N, Wakamatsu M, Fujii M, et al.

Anthocyanidins inhibit activator protein 1 activity and cell transformation: structure-

activity relationship and molecular mechanisms. Carcinogenesis 2004; 25 (1): 29-36.

104. Howard L. R, Clark J. R, Brownmiller C. Antioxidant capacity and phenolic content

in blueberries as affected by genotype and growing season. Journal of the Science of

Food and Agriculture 2003; 83: 1238-47.

105. Ichiyanagi T, Hatana Y, Matsugo S, Konishi T. Structural Dependence of HPLC

Separation Pattern of Anthocyanins from Bilberry (Vaccinium myrtillus L.). Chem.

Pharm. Bull. 2004; 52 (5): 628-30.

106. Ichiyanagi T, Kashiwada Y, Ikeshiro Y, Hatano Y, Sshida Y, Horie M, et al.

Complete Assignment of Bilberry (Vaccinium myrtillus L.) Anthocyanins Separated by

Capillary Zone Electrophoresis. Chem. Pharm. Bull. 2004; 52 (2): 226-9.

Page 114: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

114

107. Ichiyanagi T, Oikawa K, Tateyama C, Konishi T. Acid Mediated Hydrolysis of

Blueberry Anthocyanins. Chem. Pharm. Bull. 2001; 49 (1): 114-7.

108. Ichiyanagi T, Shida Y, Rahman M. M, Hatano Y, Konishi T. Bioavailability and

Tissue Distribution of Anthocyanins in Bilberry (Vaccinium myrtillus L.) Extract in

Rats. J. Agric. Food Chem. 2006; 54 (18): 6578-87.

109. Ichiyanagi T, Shida Y, Rahman M. M, Sekiya M, Hatano Y, Matsumoto H,

Hirayama M, et al. Effect on both aglycone and sugar moiety towards Phase II

metabolism of anthocyanins. Food Chemistry 2008; 110: 493–500.

110. Iwashina T. The Structure and Distribution of the Flavonoids in Plants. J. Plant Res.

2000; 113: 287-99.

111. Jaakola L, Maatta K, Pirttila A. M, Torronen R , Karenlampi S, Hohtola A.

Expression of Genes Involved in Anthocyanin Biosynthesis in Relation to Anthocyanin,

Proanthocyanidin, and Flavonol Levels during Bilberry Fruit Development. Plant

Physiology 2002; 130: 729–39.

112. Jaakola L. Flavonoid biosynthesis in bilberry (Vaccinium myrtillus L.): [Daktaro

disertacija]. Suomija, Oulu, 2003.

113. Jaiswal A. K. Nrf2 signaling in coordinated activation of antioxidant gene expression.

Free Radic Biol Med 2004; 36: 1199–207.

114. Jaldappagari S, Motohashi N, Gangeenahalli M. P, Naismith J. H. Topic in

Heterocyclic Chemistry: BioactiveMechanism of Interaction Between Anthocyanins and

Macromolecules Like DNA and Proteins. Springer-Verlag Berlin Heidelberg; 2008. p.

49–65.

115. James R. M, Cocheme H. M, Murphy M. P. Mitochondria-targeted redox probes as

tools in the study of oxidative damage and ageing. Mechanisms of Ageing and

Development 2005; 126(9): 982-6.

116. Jang Y. P, Zhou J, Nakanishi K, Sparrow J. R. Anthocyanins Protect Against A2E

Photooxidation and Membrane Permeabilization in Retinal Pigment Epithelial Cells.

Photochemistry and Photobiology 2005; 81: 529–36.

117. Jankevičienė R. Botanikos vardų ţodynas. Vilnius: Botanikos instituto leidykla; 1998.

p. 306.

118. Jankowski A, Jankowska B, Niedworok J. The effect of anthocyanin dye from grapes

on experimental diabetes. Folia Med Cracov. 2000; 41(3-4): 5–15.

119. Jones C. M, Mes P, Myers J. R. Characterization and Inheritance of the Anthocyanin

fruit (Aft) Tomato. Journal of Heredity 2003; 94(6): 449–56.

Page 115: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

115

120. Juurlink B. H. Therapeutic potential of dietary phase 2 enzyme inducers in

ameliorating diseases that have an underlying in.ammatory component. Can J Physiol

Pharmacol 2001; 79: 266–82.

121. Kabir A. M, Cao X, Gorog D. A, Tanno M, Bassi R, Bellahcene M, Quinlan R. A,

Davis R. J, Flavell R. A, Shattock M. J, Marber M. S. Antimycin A induced

cardioprotection is dependent on pre-ischemic p38-MAPK activation but independent of

MKK3. J Mol Cell Cardiol. 2005; 39(4): 709-17.

122. Kabir A. M, Clark J. E, Tanno M, Cao X, Hothersall J. S, Dashnyam S, Gorog D.

A, Bellahcene M, Shattock M. J, Marber M. S. Cardioprotection initiated by reactive

oxygen species is dependent on activation of PKCepsilon. Am J Physiol Heart Circ

Physiol. 2006; 291(4): 1893-9.

123. Kahkonen M. P, Heinamaki J, Ollilainen V, Heinonen M. Berry anthocyanins:

isolation, identification and antioxidant activities. J Sci Food Agric 2003; 83: 1403–11.

124. Kaisu R. M-R, Kahonen M. P, Torronen A. R, Heinonen I. M. Catechins and

Procyanidins in Berries of Vaccinium Species and Their Antioxidant Activity. J. Agric.

Food Chem. 2005; 53: 8485-91.

125. Kaliora A. C, Dedoussis G. V. Z, Schmidt H. Dietary antioxidants in preventing

atherogenesis. Atherosclerosis 2006; 187: 1–17.

126. Kallas A, Connolly J, Loupin D, Sole-Plasa C, Mcarthur P. D, Lamarche P. H. The

effect of Vaccinium angustifolium extracts on lumphocyte cell proliferation: blueberries

as mitogenic agents. Ecology of Food and Nutrition 2005; 44: 97–104.

127. Kalt W, Foote K, Fillmore S. A. E, Lyon M, Van Lunen T. A, McRae K. B. Effect

of blueberry feeding on plasma lipids in pigs. British Journal of Nutrition 2008; 100: 70-

8.

128. Kalt W, Mcdonald J. E, Donner H. Anthocyanins, Phenolics, and Antioxidant

Capacity of Processed Lowbush Blueberry Products. Journal of Food Science 2000; 65

(3): 390-3.

129. Kammerer D, Kljusuric J.G, Carle R, Schieber A. Recovery of anthocyanins from

grape pomace extracts (Vitis vinifera L. cv. Cabernet Mitos) using a polymeric adsorber

resin. Eur Food Res Technol 2005; 220: 431–7.

130. Kanner J, Frankel E, Granit R, German B, Kinsella J. E. Natural antioxidants in

grapes and wines. J Agric Food Chem 1994; 42: 64-9.

131. Kathleen A. Kron, Powell E.A, Luteyn J.L. Phylogenetic relationships within the

blueberry tribe (Vacciniae, Ericaceae) based on sequence data from matK and nuclear

Page 116: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

116

ribosomal ITS regions, with comments on the placement of Satyria. American Journal of

Botany 2002; 89(2): 327–336.

132. Katsube N, Iwashita K, Tsushida T, Yamaki K, Kobori M. Induction of Apoptosis

in Cancer Cells by Bilberry (Vaccinium myrtillus) and the Anthocyanins. J. Agric. Food

Chem. 2003; 51: 68-75.

133. Kay C. D, Mazza J, Holub B. J. Anthocyanins Exist in the Circulation Primarily as

Metabolites in Adult Men. J. Nutr. 2005; 135: 2582–8.

134. Kazakevich Y, Lobruto R. HPLC for Pharmaceutical Scientists. USA, John Wiley &

Sons, Inc.; 2007. p. 380–49.

135. Khan I. A. Issues related to botanicals. Life Sciences. 2006; 78(18): 2033-8.

136. Kırca A, Özkan M, Cemeroglu B. Stability of black carrot anthocyanins in various

fruit juices and nectars Food Chemistry 2006; 97 (4): 598-605.

137. Knox Y.M, Hayashi K, Suzutani T, Ogasawara M, Yoshida I, Shiina R, Tsukui A,

et al. Activity of anthocyanins from fruit extract of Ribes nigrum L. against influenza A

and B viruses, Acta Virol. 2001; 45: 209–15.

138. Kobuchi H, Roy S, Sen C. K, Nguyen H. G, Packer L. Quercetin inhibits inducible

ICAM-1 expression in human endothelial cells through the JNK pathway. Am J Physiol

Cell Physiol 1999; 277: C403–C11.

139. Konczak I, Zhang W. Anthocyanins-More Than Nature‘s Colours. Journal of

Biomedicine and Biotechnology 2004; 5: 239–40.

140. Kong A-N. T, Yu R, Chen C, Mandlekar S, Primiano T. Signal transduction events

elicited by natural products: role of MAPK and caspase pathways in homeostatic

response and induction of apoptosis. Arch Pharm Res 2000; 23: 1–16.

141. Kowaltowski A. J. Alternative mitochondrial functions in cell physiopathology:

beyond ATP Production. Braz J Med Biol Res 2000; 33(2): 241-50.

142. Kwon K. H, Barve A, Yu S, Huang M-T, Kong A-N. T. Cancer chemoprevention by

phytochemicals: potential molecular targets, biomarkers and animal models. Acta

Pharmacologica Sinica 2007; 28 (9): 1409 – 21.

143. Lala G, Malik M, Zhao C, He J, Kwon Y, Giusti M. M, Magnuson B. A.

Anthocyanin-Rich Extracts Inhibit Multiple Biomarkers of Colon Cancer in Rats.

Nutrition and Cancer 2006; 54 (1): 84-93.

144. Laleh G.H, Frydoonfar H, Heidary R, Jameei R, Zare S. The Effect of Light,

Temperature, pH and Species on Stability of Anthocyanin Pigments in Four Berberis

Species. Pakistan Journal of Nutrition 2006; 5(1): 90-2.

Page 117: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

117

145. Lätti A. K, Riihinen K. R, Kainulainen P. S. Analysis of Anthocyanin Variation in

Wild Populations of Bilberry (Vaccinium myrtillus L.) in Finland. J. Agric. Food

Chem. 2008; 56(1): 190–6.

146. Lazz M. C, Savio M, Pizzala R, Cazzalini O, Perucca P, Scovassi A. I, Stivala L. A.

Anthocyanins induce cell cycle perturbations and apoptosis in different human cell lines.

Carcinogenesis 2004; 25 (8): 1427-33.

147. Lazze M, Pizzala R, Savio M, Stivala L, Prosperi E, Bianchi L. Anthocyanins

protect against DNA damage induced by tert-butyl-hydroperoxide in rat smooth muscle

and hepatoma cells. Mutat Res. 2003; 535(1): 103–15.

148. Lee J, Rennaker C, Wrolstad R. E. Correlation of two anthocyanin quantification

methods: HPLC and spectrophotometric methods. Food Chemistry 2008; 110: 782–6.

149. Lemasters J. J, Nieminen A-L. Mitochondria in Pathogenesis. London : Plenum

Publishers; 2001. p. 282-5.

150. Lemasters J. J, Qian T, He L, Kim J-S, Elmore S. P, Cascio W. E, et al. Role of

Mitochondrial Inner Membrane Permeabilization in Necrotic Cell Death, Apoptosis, and

Autophagy. Antioxidants & Redox Signaling 2002; 4(5): 769-81.

151. Lesnefsky E. J, Chen Q, Moghaddas S, Hassan M. O, Tandler B, Hoppel C. L.

Blockade of electron transport during ischemia protects cardiac mitochondria. J Biol

Chem. 2004; 279(46): 47961-7.

152. Lewis H. L. Medical Botany: Plants Affecting Human Health. New Jersey: John Wiley

& Sons, Inc.; 2003. pp. 303-4.

153. Li S. Han Q, Qiao C, Song J, Lung C, Xu C. H. Chemical markers for the quality

control of herbal medicines: an overview. Chinese Medicine 2008; 3(7): 1-16.

154. Lila M. A, Anthocyanins and Human Health: An In Vitro Investigative Approach.

Journal of Biomedicine and Biotechnology 2004; 5: 306–13.

155. Lin F-M, Chen L-R, Lin E-H, Ke F-C, Chen H-Y, Tsai M-J, et al. Compounds from

Wedelia chinensis synergistically suppress androgen activity and growth in prostate

cancer cells. Carcinogenesis 2007; 28(12): 2521–9.

156. Liobikas J, Trumbeckaitė S, Bendokas V, Baniulis D, Majienė D, Kopustinskienė

D. M, et al. Proapoptozinis juodojo serbento (Ribes nigrum L.) uogų ekstraktų poveikis

ţiurkės širdies mitochondrijoms. Ţemdirbystė 2009; 96(3): 149-57.

157. Lohachoompol V, Mulholland M, Srzednicki G, Craske J. Determination of

anthocyanins in various cultivars of highbush and rabbiteye blueberries. Food Chemistry

2008; 111 (1): 249-54.

Page 118: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

118

158. Lohachoompol V, Srzednicki G, Craske J. The Change of Total Anthocyanins in

Blueberries and Their Antioxidant Effect After Drying and Freezing. Journal of

Biomedicine and Biotechnology 2004; 5: 248–52.

159. Ma X. H. Zheng C. J, Han L. Y, Xie B, Jia J, Cao Z. W, et al. Synergistic therapeutic

actions of herbal ingredients and their mechanisms from molecular interaction and

network perspectives Drug Discovery Today. 2009; 14(11-12): 579-88.

160. MacGregor W. Effects of Air Velocity, Air Temperature, and Berry Diameter on Wild

Blueberry Drying. Drying Technology 2005; 23: 387–96.

161. MacKenzie D.S. Perennial Ground Covers. Portland, Oregon: Timber Press, Inc; 2002.

pp. 308-9.

162. Magalhaes L. M, Segundo M. A, Reis S, Lima J. L.F.C. Methodological aspects

about in vitro evaluation of antioxidant properties. Analytica chimica acta 2008; 6 1 3:

1–19.

163. Majiene D, Trumbeckaite S, Savickas A, Toleikis A. Influence of propolis water

solution on heart mitochondrial function. J Pharm Pharmacol. 2006; 58(5): 709-13.

164. Mantell C, Rodríguez M, Martínez de la Ossa E. Semi-batch extraction of

anthocyanins from red grape pomace in packed beds: experimental results and process

modeling. Chemical Engineering Science 2002; 57 (18): 3831-8.

165. Marín-García J, Goldenthal M. J. Mitochondria and the Heart, New Jersey: Springer;

2005. p. 1-3.

166. Martin S, Giannone G, Andriantsitohaina R, Martinez M. C. Delphinidin, an active

compound of red wine, inhibits endothelial cell apoptosis via nitric oxide pathway and

regulation of calcium homeostasis. British Journal of Pharmacology 2003; 139: 1095–

102.

167. Mateus N, Oliveira J, Haettich-Motta M, Freitas V. New Family of Bluish

Pyranoanthocyanins. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2004; 5: 299–305.

168. Matsumoto H, Nakamura Y, Tachibanaki S, Kawamura S, Hirayama M.

Stimulatory effect of cyanidin 3-glycosides on the regeneration of rhodopsin. J Agric

Food Chem 2003; 51: 3560-3.

169. Matsunaga N, Chikaraishi Y, Shimazawa M, Yokota S, Hara H. Vaccinium

myrtillus (Bilberry) Extracts Reduce Angiogenesis In Vitro and In Vivo. eCAM 2007; 1-

10.

Page 119: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

119

170. May J. M, Qu Z. C, Whitesell R. R, Cobb C. E. Ascorbate recycling in human

erythrocytes: role of GSH in reducing dehydroascorbate. Free Radic Biol Med 1996; 20:

543–51.

171. Mazza G. Anthocyanins and heart health. Ann Ist Super Sanità 2007; 43 (4): 369-74.

172. McDougall G. J, Fyffe S, Dobson P, Stewart D. Anthocyanins from red cabbage –

stability to simulated gastrointestinal digestion. Phytochemistry 2007; 68: 1285–94.

173. Michael T. Murray N.D. Bilberry (Vaccinium myrtillus). American Journal of Natural

Medicine 1997; 4 (1): 17-21.

174. Mojzis J, Varinska L, Mojzisova G, Kostova I, Mirossay L. Antiangiogenic effects

of flavonoids and chalcones. Pharmacological Research 2008; 57: 259–65.

175. Møller P, Loft S. Dietary antioxidants and beneficial effect on oxidatively damaged

DNA. Free Radical Biology & Medicine 2006; 41: 388–415.

176. Monograph Vaccinium myrtillus (Bilberry). Alternative Medicine Review 2001; 6(5):

500-4.

177. Montecinos V, Guzmán P, Barra V, Villagrán M, Muñoz-Montesino C, Sotomayor

K, et al. Vitamin C is an essential antioxidant that enhances survival of oxidatively

stressed human vascular endothelial cells in the presence of a vast molar excess of

glutathione. J Biol Chem 2007; 282: 15506–15.

178. Morais H, Ramos C, Forgasc E, Cserháti T, Matos N, Almeida V, Oliveira J.

Stability of anthocyanins extracted from grape skins. Chromatographia 2006; 56 (1):

173-5.

179. Morazzoni P, Magistretti M. J. Activity of Myrtocyan, an anthocyanoside complex

from Vaccinium myrtillus (VMA), on platelet aggregation and adhesiveness. Fitoterapia

1990; 61: 13-21.

180. Morganti P. The photoprotective activity of nutraceuticals. Clinics in Dermatology

2009; 27: 166–74.

181. Moyer R. A, Hummer K. E, Finn C. E, Frei B, Wrolstad R. E. Anthocyanins,

phenolics, and antioxidant capacity in diverse small fruits: Vaccinium, Rubus, and

Ribes. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2002; 50: 519-25.

Page 120: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

120

182. Mpiana P.T, Mudogo V, Tshibangu D. S. T, Kitwa E. K, Kanangila A. B, Lumbu

J. B. S, et al. Antisickling activity of anthocyanins from Bombax pentadrum, Ficus

capensis and Ziziphus mucronata: Photodegradation effect. Journal of

Ethnopharmacology 2008; 120 (3): 413-8.

183. Muth E. R, Laurent J. M, Jasper P. The Effect of Bilberry Nutritional

Supplementation on Night Visual Acuity and Contrast Sensitivity. Alternative Medicine

Review 2000; 5 (2): 165-73.

184. Nagaoka S, Kakiuchi T, Ohara K, Mukai K. Kinetics of the reaction by which

natural vitamin E is regenerated by vitamin C. Chem Phys Lipids 2007; 146: 26–32.

185. Nakaishi H, Matsumoto H, Tominaga S, Hirayama M. Effects of black currant

anthocyanoside intake on dark adaptation and VDT work-induced transient refractive

alteration in healthy humans. Altern Med Rev. 2000; 5(6): 553–62.

186. Navasaitis M. Dendrologija. Vilnius: Margi raštai; 2004. p. 413-4.

187. Nelson S. K, Bose S. K, Grunwald G. K, Myhill P, McCord J. M. The induction of

human superoxide dismutase and catalase in vivo: a fundamentally new approach to

antioxidant therapy. Free Radic Biol Med 2006; 40: 341–7.

188. Nemeikaite-Ceniene A, Maroziene A, Pukalskas A, Venskutonis PR, Cenas N.

Redox properties of novel antioxidant 5,8-Dihydroxycoumarin: implications for its

prooxidant cytotoxicity. Z Naturforsch C. 2005; 60(11-12): 849-54.

189. Niederlander H. A. G, van Beek T. A, Bartasiute A, Koleva I. I. Antioxidant activity

assay on-line with liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 2008; 1210:

121–34.

190. Nijveldt R. J, Nood E, Hoorn D. E. C, Boelens P. G, Norren K, Leeuwen P. A. M.

Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and potential applications. Am J

Clin Nutr 2001; 74: 418–25.

191. Nikkhah E, Khayamay M, Heidari R, Jamee R. Effect of Sugar Treatment on

Stability of Anthocyanin Pigment in Berries. Journal of Biological Sciences 2007; 7(8):

1412-7.

192. Noda Y, Kneyuki T, Igarashi K, Mori A, Packer L. Antioxidant activity of nasunin,

an anthocyanin in eggplant peels. Toxicology 2000: 148(2-3): 119-23.

193. Ofek I, Goldhar J, Sharon N. Anti-escherichia coli adhesin activity of cranberry and

blueberry juices. Advances in Experimental and Medical Biology 1996; 408: 179-83.

Page 121: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

121

194. Oki T, Masuda M, Furuta S, Nishiba Y, Terahara N, Suda I. Involvement of

Anthocyanins and other Phenolic Compounds in Radical-Scavenging Activity of Purple-

Fleshed Sweet Potato Cultivars. Journal of Food Science 2006; 67 (5): 1752 – 6.

195. Pautler E. L, Maga J. A, Tengerdy C. A pharmacologically potent natural product in

the bovine retina. Exp Eye Res 1986; 42: 285-8.

196. Pazmino-Duran A. E, Giusti M. M, Wrolstad R. E, Gloria B. A. Anthocyanins from

oxalis triangularis as potential food colorants. Food Chemistry 2001; 75(2): 211–6.

197. Pengelly A. Constituents of Medical Plants: An introduction to the chemistry and

therapeutics of herbal medicine. Singapore: CABI Publishing; 2004. p. 38.

198. Posmyk M. M, Kontek R, Janas K. M. Antioxidant enzymes activity and phenolic

compounds content in red cabbage seedlings exposed to copper stress. Ecotoxicology

and Environmental Safety 2009; 72: 596–602.

199. Prior R. L, Cao G, Martin A, Sofic E, McEwen J, O’Brien C, Lischner N, et al.

Antioxidant Capacity As Influenced by Total Phenolic and Anthocyanin Content,

Maturity, and Variety of Vaccinium Species. J. Agric. Food Chem. 1998; 46: 2686-93.

200. Prior R. L, Lazarus S. A, Cao G, Muccitelli H, Hammerstone J. F. Identification of

procyanidins and anthocyanins in blueberries and cranberries (Vaccinium Spp.) using

high-performance liquid chromatography/mass spectrometry. Journal of Agricultural

and Food Chemistry 2001; 49: 1270-6.

201. Prior R. L. Fruits and vegetables in the prevention of cellular oxidative damage. Am J

Clin Nutr 2003; 78: 570–8.

202. Puupponen- Pimiä R, Nohynek L, Alakomi H-L, Oksman-Caldentey K-M. The

action of berry phenolics against human intestinal pathogens. BioFactors 2005; 23: 243–

51.

203. Puupponen-Pimiä R, Nohynek L, Alakomi H-L, Oksman-Caldentey K-M.

Bioactive berry compounds-novel tools against human pathogens. Appl Microbiol

Biotechnol 2005; 67: 8–18.

204. Rahman M. M, Ichiyanagi T, Komiyama T, Hatano Y, Konishi T. Superoxide

radical- and peroxynitrite-scavenging activity of anthocyanins; structure-activity

relationship and their synergism. Free Radical Research 2006; 40(9): 993–1002.

205. Ramirez M. R, Izquierdo I, Bassols Raseira M. C, Zuanazzi J. A, Barros D,

Henriques A. T. Effect of lyophilised Vaccinium berries on memory, anxiety and

locomotion in adult rats. Pharmacological Research 2005; 52: 457–62.

Page 122: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

122

206. Rapisarda P, Fanella F, Maccarone E. Reliability of Analytical Methods for

Determining Anthocyanins in Blood Orange Juices. J. Agric. Food Chem. 2000; 48:

2249-52.

207. Ratty A. K, Das N. P. Effects of flavonoids on nonenzymatic lipid peroxidation:

structure-activity relationship. Biochem Med Metab Biol 1988; 39: 69–79.

208. Rein M. Copigmentation reactions and color stability of berry anthocyanins: [Daktaro

disertacija]. Suomija, Helsinki, 2005.

209. Renaud S, de Lorgeril M. Wine, alcohol, platelets, and the French paradox for

coronary heart disease. Lancet 1992; 339: 1523-6.

210. Renaud S. C, Beswick A. D, Fehily A. M, Sharp D. S, Elwood P. C. Alcohol and

platelet aggregation: the Caerphilly prospective heart disease study. Am J Clin Nutr

1992; 55: 1012-7.

211. Rentzsch M, Schwarz M, Winterhalter P. Pyranoanthocyanins – an overview on

structures, occurrence, and pathways of formation. Trends in Food Science &

Technology 2007; 18 (10): 526-34.

212. Ribnicky D. M, Poulev A, Schmidt B, Cefalu W. T, Raskin I. Evaluation of

botanicals for improving human health. Am J Clin Nutr. 2008; 87: 472–5.

213. Rice-Evans C, Packer L. Flavonoids in Health and disease 2nd

edition. New York,

Basel: Marcel Dekker, Inc; 2003. pp. 4-6, 273-301.

214. Rice-Evans C. A, Miller N. J, Paganga G. Structure-antioxidant activity relationships

of flavonoids and phenolic acids. Free Radic Biol Med 1996; 20: 933–56.

215. Rice-Evans C. Plant polyphenols: free radical scavengers or chain-breaking

antioxidants? Biochem Soc Symp 1995; 61: 103–16.

216. Riihinen K, Jaakola L, KaØrenlampi S, Hohtola A. Organ-specific distribution of

phenolic compounds in bilberry (Vaccinium myrtillus) and ‗northblue‘ blueberry

(Vaccinium corymbosum x V. angustifolium). Food Chemistry 2008; 110: 156–60.

217. Rottenberg H, Hashimoto K. Fatty acid uncoupling of oxidative phosphorylation in rat

liver mitochondria. Biochemistry 1986; 25: 1747-55.

218. Roy S, Khanna S, Alessio H. M, Vider J, Babchi D, Bagchi M, Sen C. K. Anti-

angiogenic Property of Edible Berries. Free Radical Research 2002; 36 (9): 1023–31.

219. Santos A. C, Uyemura S. A, Lopes J. L, Bazon J. N, Mingatto F. E, Curti C. Effect

of naturally occurring flavonoids on lipid peroxidation and membrane permeability

transition in mitochondria. Free Radic Biol Med 1998; 24: 1455–61.

Page 123: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

123

220. Schapira A. H. V. Mitochondrial function and dysfunction. London: Academic Press;

2002. p. 25-52.

221. Scheffler I. E. Mitochondria 2nd

edition. Hoboken, New Jersey: J. Wiley and Sons, Inc.;

2007. p. 168-339.

222. Ścibisz I, Mitek M. Antioxidant properties of highbush blueberry fruit cultivars.

Electronic Journal of Polish Agricultural Universities 2007; 10(4): 34.

223. Scibisz I, Mitek M. The changes of antioxidant properties in highbush blueberries

(Vaccinium corymbosum L.) during freezing and long-term frozen storage. Acta Sci.

Pol., Technol. Aliment. 2007; 6(4): 75-82.

224. Sellappan S, Akoh C. C, Krewer G. Phenolic compounds and antioxidant capacity of

Georgia-grown blueberries and blackberries. Journal of Agricultural and Food

Chemistry. 2002; 50: 2432-8.

225. Shi J, Mazza G, Maguer L. M. Functional foods Volume 2: Biochemical and

Processing Aspects. Kanada: CRC Press; 2002. pp 71-6.

226. Shih P-H, Yeh C-T, Yen G-C. Anthocyanins Induce the Activation of Phase II

Enzymes through the Antioxidant Response Element Pathway against Oxidative Stress-

Induced Apoptosis. J. Agric. Food Chem. 2007; 55 (23): 9427–35.

227. Skrede G, Wrolstad R. W, Durst R. W. Changes in Athocyanins and Polyphenolics

During Juice Processing of Highbush Blueberries (Vaccinium corymbosum L.). Journal

of food science 2000; 65 (2): 357-64.

228. Skulachev V. P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics.

Biochimica Biophysica Acta 1998; 1363(2): 100–24.

229. Skupie K. Evaluation of chemical composition of fresh and frozen blueberry fruit

(Vaccinium corymbosum L.). Acta Sci. Pol., Hortorum Cultus 2006; 5(1): 19-25.

230. Smith M, Marley K, Seigler D, Singletary K, Meline B. Bioactive properties of wild

blueberry fruits. J Food Sci. 2000; 65: 352–6.

231. Sokolov S. J. Fitoterapija y fitofarmakologija. Rukavodstvo dlia vračei. Moskva:

medicinskaie informacionaie agentstvo 2000; p. 949.

232. Sparrow J. R, Vollmer-Snarr H. R, Zhou J, Jang Y. P, Jockusch S, Itagaki Y,

Nakanishi K. A2E-epoxides Damage DNA in Retinal Pigment Epithelial Cells. The

Journal Of Biological Chemistry 2003; 278 (20): 18207–13.

233. Stackevičienė E, Butkus V, Butkienė Z. Stambiauogių spanguolių, sodinių ir

siauralapių šilauogių bei bruknių introdukcija Lietuvoje. Ţemės ūkio mokslai 1997, p.

58–70.

Page 124: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

124

234. Stackevičienė E. Šilauogės. Augalų pasaulis 2006; Nr. 33. p. 23.

235. Stackevičienė E. Šilauogių (Vaccinium) introdukcinio adaptyvumo analizė. Botanica

Lithuanica 2003; 5: 97- 107.

236. Starast M, Karp K, Vool E, Moor U, Tonutare T, Paal T. Chemical composition and

quality of cultivated and natural blueberry fruit in Estonia. Vegetable crops research

bulletin 2007; 66: 143-53.

237. Steffen M, Sarkela T. M, Gybina A. A, Steele T. W, Trasseth N. J, Kuehl D, Giulivi

C. Metabolism of S-nitrosoglutathione in intact mitochondria. Biochem. J. 2001; 356:

395-402.

238. Steinberg D, Parsatharathy S, Carew T. E, Khoo J. C, Witztum J. L. Beyond

cholesterol. Modifications of low-density lipoprotein that increase its atherogenicity. N

Engl J Med 1989; 320: 915-24.

239. Stoner G. D, Wang L-S, Zikri N, Chen T, Hecht S.S, Huang C, Sardo C, et al.

Cancer prevention with freeze-dried berries and berry components. Seminars in Cancer

Biology 2007; 17: 403–10.

240. Sweeney M. I, Kalt W, S.L. Mackinnon S. L, Ashby J, K.T. Gottschall-Pass K. T.

Feeding Rats Diets Enriched in Lowbush Blueberries for Six Weeks Decreases

Ischemia-induced Brain Damage. Nutritional Neuroscience, 2002; 5 (6): 427–31.

241. Talaveara S. V, Felgines C, Texier O, Besson C, Gil-Izquierdo A, Lamaison J-L,

Reameasy C. Anthocyanin Metabolism in Rats and Their Distribution to Digestive

Area, Kidney, and Brain. J. Agric. Food Chem. 2005; 53: 3902-8.

242. Talavera S, Felgines C, Texier O, Besson C, Lamaison J-L, Remesy C.

Anthocyanins Are Efficiently Absorbed from the Stomach in Anesthetized Rats. J. Nutr

2003; 133: 4178-82.

243. Talavera S, Felgines C, Texier O, Besson C, Manach C, Lamaison J-L, Remesy C.

Anthocyanins Are Efficiently Absorbed from the Small Intestine in Rats. J. Nutr. 2004;

134: 2275–9.

244. Tatoyan A, Giulivi C. Purification and Characterization of a Nitric-oxide Synthase

from Rat Liver Mitochondria. The journal of biological chemistry 1998; 273(18):

11044–8.

245. Tatsuzawa F, Saito N, Miyoshi K, Shihinoda K, Shigihara A, Honda T. Diacylated

8-C-Glucosylcyanidin 3-Glucoside from the Flowers of Tricyrtis formosana. Chem.

Pharm. Bull. 2004; 52(5): 631-3.

Page 125: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

125

246. Terahara N, Konczak I, Ono H, Yoshimoto M, Yamakawa O. Characterization of

Acylated Anthocyanins in Callus Induced From Storage Root of Purple-Fleshed Sweet

Potato, Ipomoea batatas L. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2004; 5: 279–86.

247. Toleikis A, Trumbeckaite S, Majiene D. Cytochrome C effect on respiration of heart

mitochondria: influence of various factors. Biosci Rep. 2005; 25(5-6): 387-97.

248. Traditional medicine. Available at:

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs134/en/

249. Trehane J. Blueberries, cranberries, and other vacciniums. Portland, Oregon: Timber

Press, Inc; 2004. pp. 15-27, 85-191.

250. Trumbeckaite S, Bernatoniene J, Majiene D, Jakstas V, Savickas A, Toleikis A.

The effect of flavonoids on rat heart mitochondrial function. Biomed Pharmacother.

2006; 60(5): 245-8.

251. Trumbeckaite S, Bernatoniene J, Majiene D, Jakštas V, Savickas A, Toleikis A.

Effect of Ginkgo biloba extract on the rat heart mitochondrial function. J

Ethnopharmacol. 2007; 111(3): 512-6.

252. Tsuda T, Horio F, Uchida K, Aoki H, Osawa T. Dietary cyanidin 3-O-beta-D-

glucoside-rich purple corn color prevents obesity and ameliorates hyperglycemia in

mice. J Nutr. 2003; 133(7): 2125–30.

253. Tzika E. D, Papadimitriou V, Sotiroudis T. G, Xenakis A. Antioxidant Properties of

Fruits and Vegetables Shots and Juices: An Electron Paramagnetic Resonance Study.

Food Biophysics 2008; 3: 48–53.

254. US Highbush blueberry council. Available at:

http://www.blueberry.org/blueberries.htm

255. Valentova K, Ulrichova J, Cvak L, Simanek V. Cytoprotective effect of a bilberry

extract against oxidative damage of rat hepatocytes. Food Chemistry 2007; 101: 912–7.

256. Van Dijk C, Driessen A. J, Recourt K. The uncoupling efficiency and affinity of

flavonoids for vesicles. Biochem Pharmacol 2000; 60: 1593–600.

257. Van Hoorn D. E, Nijveldt R. J, Van Leeuwen P. A, Hofman Z, M'Rabet L, De Bont

D. B, et al. Accurate prediction of xanthine oxidase inhibition based on the structure of

flavonoids. Eur J Pharmacol 2002; 451: 111–8.

258. Viljakainen S, Vistiand A, Laakso A. Concentrations of Organic Acids and Soluble

Sugars in Juices from Nordic Berries. Acta Agriculturae Scandinavica, Section B - Plant

Soil Science 2002; 52 (2): 101 – 9.

Page 126: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

126

259. Vollmannová A, Tóth T, Urminská D, Poláková Z, Timoracká M, Margitanová E.

Anthocyanins Content in Blueberries (Vaccinium corymbosum L.) in Relation to

Freezing Duration. Czech J. Food Sci. 2009; 27: 204-6.

260. Wang H, Cao G, Prior R. L. The oxygen radical absorbing capacity of anthocyanins. J

Agric Food Chem 1997; 45: 304–9.

261. Wang J, Kalt W, Sporns P. Comparison between HPLC and MALDI-TOF MS

Analysis of Anthocyanins in Highbush Blueberries. J. Agric. Food Chem. 2000; 48:

3330-5.

262. Wang J, Mazza G. Effects of Anthocyanins and Other Phenolic Compounds on the

Production of Tumor Necrosis Factor α in LPS/IFN-γ-Activated RAW 264.7

Macrophages. J. Agric. Food Chem. 2002; 50: 4183-89.

263. Wang S. Y, Jiao H. Scavenging Capacity of Berry Crops on Superoxide Radicals,

Hydrogen Peroxide, Hydroxyl Radicals, and Singlet Oxygen. J. Agric. Food

Chem. 2000; 48 (11): 5677–84.

264. Watanabe M. An Anthocyanin Compound in Buckwheat Sprouts and Its Contribution

to Antioxidant Capacity. Biosci. Biotechnol. Biochem.2007; 71 (2): 579-82.

265. Williams C. M, Mohsen M. A. E, Vauzour D, Rendeiro C, Butler L. T, Ellis J. A,

Whiteman M, et al. Blueberry-induced changes in spatial working memory correlate

with changes in hippocampal CREB phosphorylation and brain-derived neurotrophic

factor (BDNF) levels. Free Radical Biology and Medicine 2008; 45 (3): 295-305.

266. Wrolstad R. E, Durst R. W, Lee J. Tracking color and pigment changes in

anthocyanin products. Trends in Food Science and Technology 2005; 16 (9): 423–8.

267. Wu X, Beecher G. R, Holden J. M, Haytowitz D. B, Gebhardt S. E, Prior R. L.

Lipophilic and hydrophilic antioxidant capacities of common foods in the United States.

Journal of Agricultural and Food Chemistry 2004; 52: 4026-37.

268. Wu X, Prior R. L. Systematic Identification and characterization of anthocyanins by

HPLC-ESI-MS/MS in common foods in the united states: fruits and berries. J. Agric.

Food Chem. 2005; 53: 2589–99.

269. Wyk B-E, Wink M. Medicinal plants of the world (an illustrated scientific guide to

important medicinal plants and their uses). Portland: Timber Press, Inc.; 2004. p. 333.

270. Xia M, Ling W, Zhu H, Wang Q, Ma J, Hou M, Tang Z, et al. Anthocyanin Prevents

CD40-Activated Proinflammatory Signaling in Endothelial Cells by Regulating

Cholesterol Distribution. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2007; 27: 519-24.

Page 127: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

127

271. Yen G-C, Duh P-D, Su H-J, Yeh C-T, Wu C-H. Scavenging effects of lotus seed

extracts on reactive nitrogen species. Food Chemistry 2006; 94: 596–602.

272. Yi W, Fisher J, Krewew G, Akoh C. C. Phenolic Compounds from Blueberries Can

Inhibit Colon Cancer Cell Proliferation and Induce Apoptosis. J. Agric. Food

Chem.2005; 53: 7320-9.

273. Youdim K. A, McDonald J, Kalt W, Joseph J. A. Potential role of dietary flavonoids

in reducing microvascular endothelium vulnerability to oxidative and inflammatory

insults. J Nutr Biochem 2002; 13: 282-8.

274. Youdim K. A, Shukitt-Hale B, Martin A, Wang H, Denisova N, Bickford P. C,

Joseph J.A. Short-term dietary supplementation of blueberry polyphenolics: beneficial

effects on aging brain performance and peripheral function. Nutr Neurosc 2000; 3: 383-

97.

275. Yuksel S, Koca I. Color Stability of Blackberry Nectars During Storage. Journal of

Food Technology 2008; 6 (4): 166-9.

276. Zhang W, Franco Ch, Curtin Ch, Conn S. To Stretch the Boundary of Secondary

Metabolite Production in Plant Cell-Based Bioprocessing: Anthocyanin as a Case Study.

Journal of Biomedicine and Biotechnology 2004; 5: 264–71.

277. Zhang Z, Kou X, Fugal K, Mclaughlin J. Comparison of HPLC Methods for

Determination of Anthocyanins and Anthocyanidins in Bilberry Extracts. J. Agric. Food

Chem. 2004; 52: 688-91.

278. Zheng J, Ramirez V. D. Inhibition of mitochondrial proton F0F1-ATPase/ATP

synthase by polyphenolic phytochemicals. Br J Pharmacol 2000; 130: 1115–23.

279. Zheng W, Wang S. Y. Oxygen Radical Absorbing Capacity of Phenolics in

Blueberries, Cranberries, Chokeberries, and Lingonberries. J. Agric. Food Chem. 2003;

51: 502-9.

280. Zhou Y, Singh B. R. Effect of Light on Anthocyanin Levels in Submerged, Harvested

Cranberry Fruit. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2004; 5: 259–263.

Page 128: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

128

DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS

Straipsniai leidiniuose, įtrauktuose į Mokslinės informacijos instituto duomenų bazę:

1. Burdulis D, Ivanauskas L, Jakštas V, Janulis V. ― Mėlynės (Vaccinium myrtillus L.) vaisių vaistinės

augalinės ţaliavos antocianų tyrimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu“,

Medicina. ISSN 1010-660X. 2007, t. 43, Nr. 7, p. 568-574, 2007.

2. Burdulis D, Janulis V, Milašius A, Jakštas V, Ivanauskas L. ―Method development for

determination of anthocyanidin content in bilberry (Vaccinium myrtillus L) fruits‖, Journal of Liquid

Chromatography & Related Technologies, 31: 850–864, 2008 Copyright Taylor & Francis Group, LLC

© ISSN 1082-6076.

3. Burdulis D, Ivanauskas L, Dirsė V, Kazlauskas S, Raţukas A. ―Study of diversity of anthocyanin

composition in bilberry (Vaccinium myrtillus L.) fruits‖, Medicina. ISSN 1010-660X. 2007, t. 43, Nr.

12, p. 971-977, 2007.

4. Burdulis D, Šarkinas A, Jesutienė I, Stackevičienė E, Nikolajevas L, Janulis V. „Comparison of

anthocyanidin composition, antimicrobial and antioxidant activity in bilberry (Vaccinium myrtillus L) and

blueberry (Vaccinium corymbosum L) fruits‖, Acta Poloniae Pharmaceutica. Drug research. ISSN 0001-

6837. 2009, t. 66, Nr. 4. p. 399-408.

Konferencijų tezės:

1. Burdulis D. ―Antocianų nustatymas Lietuvoje augančių mėlynių (Vaccinium myrtillus L.)

vaisiuose―, Jaunimas siekia paţangos: jaunųjų mokslininkų konferencijos straipsnių

rinkinys. Akademija, 2007, Nr. 2. p. 130-3.

2. Burdulis D, Jakštas V, Ivanauskas L, Janulis V. Mėlynės (Vaccinium myrtillus L.) vaisių

vaistinės augalinės ţaliavos fitocheminis tyrimas ESC metodu, Tryliktoji, tarptautinė

mokslinė-praktinė konferencija Ţmogaus ir gamtos sauga, Akademija, Kaunas 2007

(stendinis pranešimas).

3. Burdulis D, Jakštas V, Janulis V, Analysis of Bilberry (Vaccinium myrtillus L.) fruit

anthocyanidins by HPLC, FoodBalt-2007 : 2nd Baltic conference on food science and

technology : conference program and abstracts, Kaunas, June 13-14 / Lithuanian Network of

Food Quality and Safety, Kaunas University of Technology. Kaunas, 2007, p. 52 (stendinis

pranešimas).

4. Burdulis D, Jakštas V, Ivanauskas L. Separation, identification and method validation of

anthocyanins in bilberry (Vaccinium myrtillus L.) fruits, 4th Nordic Separation Science Society

Page 129: KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS · Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation Science Society

129

(NoSSS) International Conference : August 26-29, 2007, Kaunas : abstracts book and final

program / Editors: Audrius Maruška, Olga Kornyšova. ISBN 978-9955-12-232-

6. Kaunas : Vytautas Magnus University, 2007, p. 75, abstract no. P-3 (stendinis pranešimas).

5. Raudonis R, Jakštas V, Burdulis D, Bumblauskienė L, Janulis V. HPLC-PCR Method for

Determination of Antioxidant Activity in Herbal. Raw Materials and Herbal Preparations,

NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation

Science Society : 26-29 August, 2009, Tallinn, Estonia : Abstract book and program / Tallinn

university of tech., 2009, p. 129, abstract no. PP55 (stendinis pranešimas).