Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
Deividas Burdulis
ŠILAUOGĖS (VACCINIUM L.) GENTIES AUGALŲ VAISIŲ ANTOCIANINŲ SUDĖTIES
IR BIOLOGINIO POVEIKIO TYRIMAS
Daktaro disertacija
Biomedicinos mokslai, farmacija (09 B)
Kaunas, 2010
2
Disertacija rengta 2005-2009 metais Kauno medicinos universitete
Mokslinis vadovas:
Prof. Habil. Dr. Valdimaras Janulis (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai,
farmacija – 09 B)
Konsultantas:
Dr. Juozas Labokas (Botanikos institutas, biomedicinos mokslai, botanika – 04 B)
3
TURINYS
SANTRUMPOS ................................................................................................................................. 3
ĮVADAS ............................................................................................................................................. 5
LITERATŪROS APŢVALGA......................................................................................................... . 9
1.1 Šilauogės (Vaccinium L.) genties augalų apibūdinimas ir panaudojimas medicinai….………9
1.1.1 Vaccinium L. genties apibūdinimas ................................................................................... 9
1.1.2. Mėlynių morfologiniai poţymiai ir paplitimas ................................................................. 9
1.1.3. Šilauogių morfologiniai poţymiai, veislių apibūdinimas ............................................... 10
1.1.4. Šilauogių paplitimas ir auginimas .................................................................................. 13
1.1.5. Mėlynių ir šilauogių vaisių augalinės ţaliavos paruošos................................................ 14
1.1.6. Mėlynių ir šilauogių vaisių fitocheminė sudėtis ............................................................. 15
1.1.7. Mėlynių ir šilauogių vaisių ir jų preparatų vartojimas medicinos praktikai ................... 18
1.2. Antocianinų apibūdinimas, struktūra, biologinės savybės ir panaudojimas……………...22
1.2.1. Antocianinų bendra apţvalga, biosintezė ....................................................................... 22
1.2.2. Antocianinų farmakokinetika ir metabolizmas............................................................... 26
1.2.3. Antocianinų biologinis poveikis ..................................................................................... 28
1.2.4. Antocianinų antioksidantinis aktyvumas ........................................................................ 28
1.3. Augalinių fenolinių junginių įtaka mitochondrijose vykstantiems procesams….………..31
2. TYRIMŲ OBJEKTAS IR METODAI ........................................................................................... 5
2.1 Tyrimų objektas…………………………………………………………………………..35
2.2 Tyrimų metodai…...............................................................................................................38
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS .......................................................................... 44
3.1. Vaccinium L. genties augalų vaisių antocianinų ir antocianidinų sudėties ir kiekybinių
rodiklių įvairavimo vertinimas ................. ………………………………………………………45
3.1.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos sukūrimas Vaccinium myrtillus L.
vaisių vaistinių augalinių ţaliavų antocianidinų kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimui .... 45
3.1.2. Antocianinų sudėties įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisiuose, surinktuose iš
gamtinių cenopopuliacijų ......................................................................................................... 52
3.1.3. Antocianinų ir antocianidinų sudėties įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisių
vaistinėse augalinėse ţaliavose, surinktose Šiaurės Rytų Europos šalyse ............................... 58
3.1.4. Antocianinų ir antocianidinų sudėties pokyčių tyrimai Vaccinium myrtillus L. vaisiuose
rinkimo metu ............................................................................................................................ 62
3.1.5. Antocianinų ir antocianidinų sudėties įvairavimas šilauogių vaisiuose, ţievelėse,
minkštimuose ir išspaudose ..................................................................................................... 69
3.2. Vaccinium L. genties augalų vaisių ekstraktų biologinio poveikio tyrimai……………..87
3.2.1. Vaccinium L. genties rūšių augalinių ţaliavų vaisių ekstraktų antiradikalinių savybių
įvertinimas................................................................................................................................ 87
3.2.2. Vaccinium myrtillus L. vaisių etanolinio ir vandeninio ekstraktų poveikis ţiurkės širdies
mitochondrijų funkcijoms ........................................................................................................ 90
IŠVADOS ....................................................................................................................................... 102
LITERATŪROS SĄRAŠAS .......................................................................................................... 105
DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS .......................................... 128
4
SANTRUMPOS
ADP adenozin-5'-difosfatas
ATP adenozin-5'-trifosfatas
ATE alfa tokoferolio ekvivalentas
BDNF smegenų neurotofinis faktorius (angl. brain-derived neurotrophic factor)
cAMP ciklinis adenozinmofosfatas
CCCP karbonilcianido-m-chlorofenilhidrazonas (angl. carbonyl cyanide m-
chlorophenylhydrazone)
CREB cAMP- atsaką rišančio baltymo veiksnys (angl. cAMP-response element-binding
protein)
DTL didelio tankio lipoproteinai
ESC efektyvioji skysčių chromatografija
IU tarptautiniai vienetai (angl. international units)
KKK mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas
MAO monoamino oksidazė
MTL maţo tankio lipoproteinai
ORAC deguonies radikalų absorbcijos talpa (angl. Oxygen radical absorbance capacity)
RNS aktyvieji azoto junginiai (angl. reactive nitrogen species)
ROS aktyvieji deguonies junginiai (angl. reactive oxygen species)
V variacijos koeficientas
V2 mitochondrijų kvėpavimo greitis antrojoje metabolinėje būsenoje
V3 mitochondrijų kvėpavimo greitis trečiojoje metabolinėje būsenoje
VEGF kraujagyslių endotelinio augimo veiksnys (angl. vascular endothelial growth factor)
5
ĮVADAS
Šiuolaikinėje visuomenėje nuolat daugėjant oksidacinio streso sukeltų ligų, vis didesnis
dėmesys skiriamas šių ligų prevencijai. Pasaulyje apie 60 – 80 proc. ţmonių pirminės sveikatos
prieţiūros tikslams vartoja augalinius vaistus [5]. PSO duomenimis augaliniai vaistai yra
populiariausia ir pelningiausia tradicinės medicinos sritis [248].
Nekokybiški augaliniai produktai kelia grėsmę pacientų saugumui. Daugiau kaip 100 šalių
turi įstatymais numatytas augalinių vaistų kontrolės taisykles [248]. Efektyvumas bei galutinių
augalinių preparatų kokybė priklauso nuo naudojamų ţaliavų kokybės. Vykdant ţaliavų paruošas,
transportuojant, laikant bei gaminant fitopreparatus, yra svarbu uţtikrinti tinkamą kontrolę,
laiduojančią galutinio produkto efektyvumą bei saugumą. „Geroje vaistinių augalų auginimo ir
surinkimo praktikoje― įstatymiškai reglamentuojamos rekomendacijos bei praktika, leidţianti
uţtikrinti geros kokybės augalinių ţaliavų paruošas. Augalinių ţaliavų kokybiniai ir kiekybiniai
parametrai gali įvairuoti dėl daugybės kintančių veiksnių įtakos [81]. Patikimų, jautrių ir atrankių
analizės metodikų kūrimas ir diegimas yra vienas svarbiausių šiuolaikinio mokslo uţdavinių.
Lietuvos teritorijoje natūraliose augimvietėse auga 3 Vaccinium L. genties augalų rūšys:
mėlynė (Vaccinium myrtillus L.), vaivoras (Vaccinium uliginosum L.), bruknė (Vaccinium vitis-idea
L.). Vaccinium myrtillus L. yra labai plačiai paplitęs augalas; jis auga centrinėje ir šiaurės Europoje,
šiaurės bei vakarų Azijoje ir Šiaurės Amerikoje. Mėlynė daţna visoje Lietuvos teritorijoje [186].
Šilauogė (Vaccinium corymbosum L.) taip pat priklauso Vaccinium L. genčiai. Šilauogės laikomos
netradiciniu augalu, kuris Lietuvoje introdukuotas XX a. antroje pusėje [39, 235]. XX a. pradţioje
išvedus naujas šilauogių veisles, jos pradėtos plačiai kultivuoti. Vertinant introdukuotas šilauogių
veisles, svarbu ištirti bei palyginti vaisių cheminę sudėtį ir jos rodiklių įvairavimą, atrinkti Lietuvos
gamtinėmis sąlygomis tinkamiausias auginti veisles bei ruošti kokybišką augalinę ţaliavą.
Vertinant vaistinių augalinių ţaliavų kokybę, didţiausias dėmesys kreipiamas į biologiškai
aktyvių junginių sudėties kokybinius ir kiekinius parametrus. Vaccinium myrtillus L. vaistinės
augalinės ţaliavos kokybę reglamentuoja daugelio šalių farmakopėjos. Antocianinai – svarbiausi
mėlynių ir šilauogių vaisių veiklieji junginiai, lemiantys farmakologinį poveikį. Europos
farmakopėjoje Vaccinium myrtillus L. vaisių kokybę reglamentuoja antocianinų sudėtis ir jų kiekis.
Natūraliai Lietuvos teritorijos miškuose augančių Vaccinium myrtillus L. vaisių antocianinų sudėties
tyrimai svarbūs vertinant vietinės vaistinės augalinės ţaliavos kokybę bei racionaliai vartojant
augalinius išteklius. Vykdant vaistinių augalinių ţaliavų paruošas bei siekiant uţtikrinti gaminamų
vaistinių preparatų saugumą ir efektyvumą, tikslinga įvertinti cheminės sudėties įvairavimą bei
palyginti jį su šiaurės rytų Europos šalių regionuose surinktais pavyzdţiais. Mokslinės literatūros
6
šaltiniuose duomenų apie Lietuvoje surinktų mėlynių vaisių antocianinų sudėtį ir jų kaupimosi
dėsningumus surasti nepavyko, todėl tikslinga parinkti optimaliausią paruošų vykdymo laiką, kai
ţaliavoje susikaupę maksimalūs pagrindinių veikliųjų junginių – antocianinų – kiekiai.
Mėlynių vaisių preparatai yra plačiai vartojami medicinai, todėl mėlynių vaisių
ekstraktų, preparatų biologinio poveikio tyrimai yra neabejotinai aktualūs. Tikslinga įvertinti ne tik
vaisių ekstraktų gebėjimą sujungti laisvuosius radikalus, bet ir antocianinų poveikį vienoms
svarbiausių ląstelių organelėms – mitochondrijoms, kurios ne tik aprūpina ląstelę energija oksidacinio
fosforilinimo proceso metu, bet ir palaiko viduląstelinio Ca2+
homeostazę bei atlieka svarbų vaidmenį
apoptozės procesuose. Galimybė reguliuoti mitochondrijų funkcijas biologiškai aktyviomis
medţiagomis, pvz., antocianinais, gali padėti išlaikyti ląstelės gyvybingumą arba ją sunaikinti.
Darbo tikslas: Ištirti Lietuvoje natūraliai augančių mėlynių ir introdukuotų šilauogių vaisių
antocianinų sudėtį ir jos įvairavimą bei vaisių ekstraktų biologinį poveikį.
Uţdaviniai:
1. Sukurti efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodiką antocianidinų analizei
Vaccinium L. genties augalų vaisių ţaliavose.
2. Ištirti natūraliose augimvietėse surinktų V. myrtillus L. vaisių vaistinės augalinės ţaliavos
pavyzdţių antocianinų sudėtį bei jos kiekinių rodiklių įvairavimą skirtingose
cenopopuliacijose.
3. Įvertinti šiaurės rytų Europos šalių regionuose surinktų V. myrtillus L. vaisių vaistinių
augalinių ţaliavų antocianinų bei antocianidinų sudėtį bei palyginti su Lietuvoje surinktų
vaisių augalinių ţaliavų antocianinų ir antocianidinų sudėtimi.
4. Nustatyti antocianinų ir antocianidinų sudėtį bei jos rodiklių kitimo dinamiką V. myrtillus
L. vaisiuose paruošų metu.
5. Įvertinti Lietuvos klimatinėmis sąlygomis Botanikos instituto lauko kolekcijose
auginamų šilauogių vaisių antocianinų ir antocianidinų sudėties rodmenų įvairavimą.
6. Įvertinti Lietuvoje natūraliai augančių V. myrtillus L. bei introdukuotų šilauogių vaisių
ekstraktų antiradikalinį aktyvumą.
7. Ištirti V. myrtillus L. vaisių vandeninio ekstrakto ir etanolinio ekstrakto poveikį ţiurkės
širdies mitochondrijų oksidaciniam fosforilinimui.
Mokslinio darbo naujumas. Antocianidinams nustatyti Vaccinium L. genties augalų vaisiuose
sukurta ESC metodika, pagal kurią galima atlikti efektyvų antocianidinų komplekso išskirstymą,
kokybinę bei kiekinę analizę.
7
Pirmą kartą ištirtas ir įvertintas antocianinų ir antocianidinų kokybinės ir kiekinės
sudėties įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisiuose, surinktuose Lietuvos teritorijoje esančiose
augimvietėse. Atlikti palyginamieji mėlynių vaisių antocianinų ir antocianidinų kokybinės ir
kiekinės sudėties tyrimai bandiniuose, surinktuose Lietuvos respublikos ir šiaurės rytų Europos šalių
regionuose. Tyrimo metu vaisiuose įvertintas antocianinų ir antocianidinų pasiskirstymo pobūdis bei
įvairavimo dėsningumai rinkimo metu.
Įvertinta Botanikos instituto lauko kolekcijose auginamų šilauogių vaisių antocianidinų
komplekso sudėtis. Remiantis gautais tyrimų rezultatais, galima rekomenduoti daugiausiai
antocianinų kaupiančias sodinių šilauogių veisles („Berkeley―, „Northland―, „Northcountry―,
„Ama―, „Rancocas―) auginti Lietuvos gamtinėmis sąlygomis.
Atliktas Vaccinium L. genties augalų vaisių ekstraktų antiradikalinių savybių tyrimas. Kartu
su KMU BMTI Biochemijos laboratorijos mokslininkais nustatytas Vaccinium myrtillus L. vaisių
vandeninio ekstrakto ir etanolinio ekstrakto poveikis ţiurkės širdies mitochondrijų funkcijoms.
Tokio pobūdţio tyrimai yra nauji ir aktualūs, kadangi apie tokius tyrimus mokslinėje literatūroje
duomenų nepavyko rasti. Gauti tyrimų in vitro rezultatai naudingi ir informatyvūs tolimesniems in
vivo tyrimams.
Praktinė ir teorinė reikšmė. Sukurta ir optimizuota ESC metodika antocianidinų kokybinei ir
kiekinei Vaccinium myrtillus L. vaisių vaistinės augalinės ţaliavos analizei. Metodika pritaikyta
šilauogių vaisių antocianidinų kokybinės ir kiekinės sudėties tyrimams, ji gali būti panaudota ir kitų
Vaccinium L. genties augalinių ţaliavų, turinčių antocianinų, analizei. Kritinių išvystytos ESC
metodikos įteisinimo etapų parametrai uţtikrina metodikos tinkamumą ir patikimumą mėlynių ir
šilauogių vaisių augalinių ţaliavų kokybiniams bei kiekiniams rodikliams įvertinti.
Ištirta Vaccinium myrtillus L. vaisių augalinių ţaliavų antocianinų ir antocianidinų cheminė
sudėtis ir jos įvairavimas. Atlikti Vaccinium myrtillus L. gamtinėse cenopopuliacijose surinktų
augalinių ţaliavų veikliųjų junginių – antocianinų ir antocianidinų – kokybinės ir kiekinės sudėties
tyrimai naudingi vietinių augalinių resursų cheminei įvairovei įvertinti. Gauti rezultatai svarbūs
siekiant vietinius augalinius resursus panaudoti kuriant ir gaminant naujus preparatus.
Atlikus antocianinų bei antocianidinų sudėties tyrimus, nustatytas Vaccinium myrtillus L. vaisių
cheminės sudėties didelis heterogeniškumas, kurį apsprendţia skirtingas ţaliavos ruošimo laikas bei
geografinis veiksnys. Gautų tyrimų rezultatai naudingi siekiant pagerinti vaistinės augalinės
ţaliavos kokybę.
Botanikos instituto lauko kolekcijose auginamų šilauogių vaisių antocianinų ir antocianidinų
sudėties tyrimai aktualūs siekiant atrinkti vertingiausias Lietuvos gamtinėmis sąlygomis
aklimatizuotas veisles bei plėtojant šilauogių auginimą Lietuvoje.
8
Atlikti Vaccinium L. genties ţaliavų ekstraktų antiradikalinio aktyvumo tyrimai. Nustatyti
ekstraktai, pasiţymintys stipriausiomis antiradikalinėmis savybėmis („Berkeley―, „Ama―,
„Northland― ir mėlynių vaisių). Įvertinus antocianinų ir antocianidinų cheminę sudėtį ir
antiradikalines savybes, nustatyta tiesioginė priklausomybė. Rezultatai gali būti naudingi kuriant
antioksidantinėmis savybėmis pasiţyminčius preparatus ar maisto papildus.
Darbo rezultatų aprobavimas. Tyrimų rezultatai pristatyti 5 konferencijose: Jaunimas siekia
paţangos (Akademija, 2007 m. balandţio 13-14 d. ) Ţmogaus ir gamtos sauga (Akademija, 2007 m.
geguţės 16-19 d.), Lithuanian Network of Food Quality and Safety (Kaunas University of
Technology, Kaunas, 2007 m.), 4th Nordic Separation Science Society (NoSSS) International
Conference (Kaunas, 2007 m. rugpjūčio 26-29 d.), NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and
Related Techniques by Nordic separation Science Society (Tallinn, 2009 m. rugpjūčio 26 -29 d.).
Tyrimų tematika paskelbti 4 moksliniai straipsniai.
Darbo apimtis ir struktūra. Disertaciją sudaro įvadas, literatūros apţvalga, tyrimo objektas ir
metodai, tyrimų rezultatai ir jų aptarimas, išvados, literatūros sąrašas (280 literatūros šaltinių),
disertacijos tema paskelbtų darbų sąrašas. Darbe pateikta 44 paveikslai ir 31 lentelė. Disertacijos
apimtis 129 puslapiai.
9
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1 Šilauogės (Vaccinium L.) genties augalų apibūdinimas ir panaudojimas
medicinai
1.1.1. Vaccinium L. genties apibūdinimas
Šilauogės (Vaccinium L.) gentis priklauso virţinių (Ericaceae Juss.) šeimai. Genčiai
priskiriama apie 300-400 rūšių, paplitusių nuo arktinės iki tropikų zonos. Vieni sistematikai šią gentį
priskiria virţinių – Ericaceae Juss. šeimai, kiti – savarankiškai šilauoginių – Vacciniaceae S.P. Gray
šeimai. Tai visţaliai, ilgai ţaliuojantys ir kasmet lapus numetantys krūmokšniai, krūmai ir neaukšti
medeliai [131, 186].
Lapai praţanginiai, ištisiniai, odiški. Ţiedai kekėse, rečiau pavieniai, rutuliški arba
varpiški. Ţiedynkočiai trumpi. Vainikėlis nukrintantis. Kuokelių 8-10, dvigubai daugiau nei
vainiklapių. Mezginė apatinė, keturlizdė ar penkializdė, purka galviška. Vaisius sultinga arba
miltinga uoga. Šios genties sistematika yra sudėtinga ir vis dar tobulinama [36, 186].
Gentis skirstoma į 2 pogenčius (Oxycoccus ir Vaccinium), kurie savo ruoţtu dar skirstomi
į atskiras sekcijas. Kai kurie botanikai Oxycoccus pogentį priskiria savarankiškai genčiai. Mėlynės
(Vaccinium) ir šilauogės (Cyanococcus) sekcijos priskiriamos Vaccinium pogenčiui [36, 64, 186,
233, 234, 249].
Lietuvoje natūraliose augimvietėse auga 3 augalų rūšys, priklausančios Vaccinium L.
genčiai: mėlynė (Vaccinium myrtillus L.), vaivoras (Vaccinium uliginosum L.), bruknė (Vaccinium
vitis-idea L.). Vaismedţių soduose ir sodybose auginama keletas šilauogių rūšių ir veislių [186].
1.1.2. Mėlynių morfologiniai poţymiai ir paplitimas
Vaccinium myrtillus L. – vasarţalis, nedidelis, šakotas, daugiametis maţdaug 30 - 50 cm
aukščio krūmokšnis, kurio amţius gali siekti iki 30 metų. Šakelės stačios, briaunotos, ţalios. Apatinė
stiebo dalis sumedėjusi, šakų viršūnės išlieka ţalios, minkštos ir ţiemą gali apšalti. Šakniastiebis
ilgas, šliauţiantis. Lapai praţanginiai, odiški, kiaušiniški arba plačiai ovalūs, pliki, nusmailėjusia
viršūne, trumpakočiai, smulkiai dantytais kraštais, 1,15 - 3 cm ilgio, 0,6 – 1,8 cm pločio, numetami
kiekvienais metais. Pavasarį ką tik išsiskleidę lapai būna rausvi, vėliau tampa gelsvai ţali, o rudenį
paraudonuoja. Pavieniai rutuliški rausvai ţalsvi ţiedai išauga ant trumpų 2,5 – 3,5 mm ilgio
ţiedkočių lapų paţastyse. Taurelė priaugusi prie mezginės, penkiaskiautė, rečiau keturskiautė, vos
įţiūrima. Vainikėlis rutuliškas arba ąsotiškas blyškiai ţalios, baltos ar rausvos spalvos, suaugtinis,
10
pūstas, su 5 trumpomis, bukomis skiautėmis, 4 - 7 mm pločio, 3 - 5 mm ilgio. Kuokelių 10 arba 8,
kuokelių koteliai lygūs, dulkinės akuotuotos, uţsibaigiančios viršūninėmis angelėmis. Uoga
rutuliška, šiek tiek paplokščia, 5 – 12 mm skersmens, mėlynos ar melsvai juodos spalvos, su
pilkomis apnašomis arba be jų, violetiniu, mėsingu mezokarpiu su daugybe smulkių, rudų, ovalių
sėklų. Uogos viršūnėje yra taurelės liekana, kuri atrodo kaip apvali raukšlė [28, 96, 176].
Literatūros duomenimis Lietuvos teritorijoje aptinkamos dar 4 mėlynių atmainos: Vaccinium
myrtillus var. epruinosum Aschers – uogos blizgančios ir be apnašų; Vaccinium myrtillus var.
leucocarpum Koch – uogos gelsvai baltos; Vaccinium myrtillus var. roseolo – violaceum Butkus et
Stack. – uogos roţinės, turinčios violetinį atspalvį; Vaccinium myrtillus var. pseudotypicum – uogos
raudonai violetinės, beveik juodos, tačiau minkštimas bespalvis [10, 28, 35, 63, 96, 176, 186, 269].
Lietuvos gamtinėmis sąlygomis mėlynės praţysta geguţės mėn. pabaigoje ir ţydi iki birţelio mėn.
vidurio, o pavienių ţiedų galima rasti iki rudens. Uogos prinoksta liepos mėn. pradţioje ir ant
šakelių laikosi iki rugsėjo mėn. [10, 176, 186].
Mėlynės labiausiai paplitusios centrinėje ir šiaurės Europoje, šiaurės bei vakarų Azijoje ir
Šiaurės Amerikoje. Daţniausiai auga vidutinio drėgnumo ir drėgnuose, nelabai ūksminguose
miškuose. Mėgsta rūgščius (pH 4-5), puveningus dirvoţemius. Auga pelkėtuose pušynuose,
eglynuose, virţynuose, rečiau berţynuose, kartais kimininėse pelkėse, aukštesnėse vietose. Šiaurės
Amerikoje mėlynės auga kalnuotuose bei subalpiniuose Britų Kolumbijos, Arizonos ir Naujojo
Meksiko regionuose. Grenlandijos saloje augančios mėlynių populiacijos laikomos senovinės
introdukcijos rezultatu [96, 176].
Mėlynės paplitusios visoje Lietuvos teritorijoje. Literatūros šaltinių duomenimis Lietuvoje
yra apie 18000 ha mėlynių. Derlingais metais iš 1 ha ištisinio uogyno galima pririnkti net iki 1200
kg uogų. Mėlynes ypač sunku auginti, todėl jos yra retai kultivuojamos [28, 35, 186].
1.1.3. Šilauogių morfologiniai poţymiai, veislių apibūdinimas
Šilauoges auginti kultūroje pradėta JAV 1906 m. Šilauogių veislių registre yra apie 130
veislių. Šilauogės priskiriamos prie netradicinių augalų, kurie buvo introdukuoti Lietuvoje XX a. II-
oje pusėje. Sodinių šilauogių tyrimai Lietuvoje pradėti Botanikos institute 1969 m., siauralapės
šilauogės – 1986 m. Botanikos instituto lauko kolekcijose auginama 19 sodinių šilauogių veislių ir 1
siauralapės šilauogės veislė [235].
Daugiausia šilauogių auga Šiaurės Amerikoje. Šiuo metu priskaičiuojama net 36 šilauogių
rūšys, kurios skirstomos į tris grupes: ţemaūges, aukštaūges ir ,,triušiaakes‖. Ţemaūgių šilauogių
grupei priklauso augalai, kurių krūmo aukštis siekia iki 1 m, aukštaūgių – krūmo aukštis iki 3–5 m, o
11
,,triušiaakių‖ – krūmo aukštis iki 9 m. Didţiausią ūkinę vertę šilauogių kultivavimo raidoje turėjo
šios rūšys: Vaccinium angustifolium Ait. (ţemaūgių šilauogių grupė), V. corymbosum L., V.
formosum Andrews (aukštaūgių šilauogių grupė) ir V. virgatum Aiton (,,triušiaakių‖ šilauogių
grupė). Šios rūšys Šiaurės Amerikoje auginamos kultūroje ir jų pagrindu išvestos produktyvios
sodinių šilauogių (Vaccinium×covilleanum Butkus et Pliszka, sinonimas V. corymbosum auct. non
L.) veislės, kurių vaisiai pasiţymi skirtingu ir unikaliu skoniu bei savybėmis [39, 235].
Sodinė šilauogė – tai vasarţalis 1,5-1,8 m aukščio krūmas storais stačiais stiebais. Lapai
standūs, ţalios spalvos. Lapai lancetinės arba eliptinės formos, dantytais kraštais 10 – 80 mm ilgio ir
5 – 35 mm pločio. Ţiedai varpelio ar rutulio formos, spalva varijuoja nuo baltos, balsvai roţinės ir
raudonos, kartais iki ţalsvos. Uogos brendimo pradţioje ţalsvos spalvos, brendimo viduryje
rausvos, roţinės spalvos ir brendimo pabaigoje mėlynos ar melsvai juodos, su vaškine apnaša.
Uogos 15-20 mm skersmens, bespalviu minkštimu, auga kekėmis [36, 233, 234, 235].
Botanikos instituto lauko kolekcijose auginamų sodinių šilauogių veislės, naudotos mūsų tyrimuose:
„AMA― – veislė išvesta Vokietijoje sukryţminus Vaccinium corymbosum L.×V.
angustifolium Ait. Veislė vidutinio ankstyvumo – uogos prinoksta liepos pabaigoje,
rugpjūčio pradţioje. Jos juosvai mėlynos ar juodos, su neţymia vaškine apnaša, apvaliai
ropiškos, vidutinio stambumo, susitelkusios apvaliose tankiose kekėse, skanios. Veislė
vidutinio derlingumo. Krūmai augūs, jų aukštis iki 1,8 m, glausti. Lapai tamsiai ţali,
blizgantys, lygiakraščiai, elipsiški. Ţiedai cilindriški, ryškiai balti [36, 233, 234].
„BERKELEY― – veislė išvesta F. V. Kovill, G. M. Darrow ir F. A. Gilbert 1932 m.
kryţminant „Stanley×GS-149― („Jersey―ׄPioneer―) Nju Dţersi valstijoje. Kultivuoti
pradėta 1949 m. Uogos prinoksta rugpjūčio mėn. Jos šviesiai mėlynos su stipria vaškine
apnaša, stambios ar labai stambios, aromatingos, tvirta odele. Veislė derlinga, vidutinio
vėlyvumo. Krūmai augūs (iki 1,8 m), statūs ar šiek tiek išsiskleidę. Lapai stambūs, šviesiai
ţali, atvirkščiai kiaušiniški ar elipsiški. Ţiedai stambūs, balti, su kreminiu atspalviu.
„BLUECROP― – veislė išvesta F. V. Kovill ir O. M. Friman 1934 m. sukryţminus „GM 37
(„Jersey―ׄPioneer)―ׄCU-5 („Stanley―ׄJune―)― Nju Dţersi valstijoje. Kultivuojama nuo
1952 m. Tai pati populiariausia pasaulyje veislė. Uogos stambios ar vidutinio dydţio,
ropiškos, šviesiai mėlynos su stipria vaškine apnaša, saldţiarūgštės, aromatingos. Veislė
labai derlinga. Pagal uogų prinokimą tai vidutinio ankstyvumo veislė. Krūmai vidutinio
augumo (1,5-1,8 m), statūs ar išsiskleidę. Lapai vidutinio dydţio ar stambūs, tamsiai ţali,
blizgantys, lygiakraščiai. Ţiedai vidutinio dydţio, balti [ 233, 234, 235].
12
„DIXI― – šią veislę išvedė F.W. Kovill, sukryţminęs („Jersey―ׄPioneer―)ׄStanley― 1930
m. Uogos stambios, šiek tiek suplotos, šviesiai mėlynos su pilkšva apnaša, rūgštoko skonio,
aromatingos. Vidutinio derlumo. Iš krūmo priskinama 2,4 kg, šimto uogų masė 200 g. Tai
vėlyva veislė. Krūmai augūs, išsiskleidę, ūgliai reti. Tai viena iš atspariausių nepalankioms
ţiemojimo sąlygoms veislių. Lapai stambūs, kiaušiniški, elipsiški, beveik plikomis
apatinėmis lapo pusėmis, ţali. Ţiedai labai stambūs, balti [36, 233, 234, 235].
„HEERMA― – veislė išvesta Vokietijoje. Uogos vidutinio stambumo, apvaliai ropiškos,
tamsiai mėlynos su šviesia vaškine apnaša, susitelkusios į nedideles kekes, saldţiarūgštės,
aromatingos. Veislė vidutinio ankstyvumo ir vidutinio derlumo. Krūmai augūs (aukštesni nei
1,5 m), glausti, vienmečiai ūgliai ţalsvi. Lapai dideli, lancetiški, tamsiai ţali, blizgantys,
beveik lygiakraščiai. Ţiedai stambūs, siaurai cilindriški, balti su kreminiu atspalviu.
„NORTHBLUE― – veislė išvesta JAV kryţminant (G65ׄAshwort―)×(„Dixi―×ţemaūgė
„Michigan LB-1―). Uogos vidutinio dydţio ar didelės, tamsiai mėlynos su vaškine apnaša,
saldţiarūgštės, skanios. Iš krūmo priskinama apie 2,0-3,0 kg uogų. Uogos nėra stambios.
Krūmai vešlūs, kompaktiški ar šiek tiek išsiskleidę, ţemi, dekoratyvūs. Lapai vidutinio
dydţio, ţali. Ţiedai vidutinio stambumo, balti, neišsiskleidę – ţalsvai balti [36, 233].
„NORTHCOUNTRY― – veislė išvesta kryţminant B-6×R2P4 1983 m. Minesotos
universitete. Uogos vidutinio dydţio ar didelės, šviesiai mėlynos su vaškine apnaša, apvalios,
saldţiarūgštės, skanios. Uogos nėra stambios. Krūmai ţemi, kompaktiški ar šiek tiek
išsiskleidę, dekoratyvūs. Lapai ţali, lancetiški. Ţiedai vidutinio dydţio, balti.
„NORTHLAND― – veislė išvesta JAV 1948 m. sukryţminus „Berkeley―×H-19 (V.
angustifolium× „Pioneer―). Uogos vidutinio dydţio, apvalios ar šiek tiek suplotos, mėlynos
su vaškine apnaša, susitelkusios nedidelėse kekėse, saldţiarūgštės, beveik be aromato,
skanios. Veislė derlinga. Krūmai vidutinio augumo, tankūs, po sniegu kartais išlinkstantys.
Lapai vidutinio stambumo, ryškiai ţali, ovalūs. Ţiedai balti, smulkūs, turintys vos pastebimą
kreminį atspalvį [36, 233, 235].
„PATRIOT― – veislė išvesta 1954 m. JAV sukryţminus („Dixi―ׄMichigan LB-
1―)ׄEarliblue―. Uogos labai stambios, ropiškos, mėlynos su vaškine apnaša, susitelkusios į
tankokas kekes, saldţiarūgštės, labai skanios. Gana derlinga. Krūmai vidutinio augumo,
statūs, dekoratyvūs. Lapai vidutinio dydţio, ovalūs, gerai matomas jų gyslotumas, ţali.
Ţiedai vidutinio dydţio, balti, neišsiskleidę – rausvi.
„PUTTE― – veislė išvesta Švedijoje, Balsgardene. Tai viena atspariausių šalčiams veislių,
iškenčianti net –40oC. Uogos smulkios, ropiškos, juodos, blizgančios ar su menka melsva
13
vaškine apnaša, susitelkusios į tankokas kekes, saldţiarūgštės, labai skanios. Gana derlinga.
Krūmai ţemi ar vidutinio augumo, išsiskleidę, dekoratyvūs. Lapai vidutinio dydţio,
lancetiški, ryškiai ţali. Ţiedai vidutinio dydţio, balti.
„RANCOCAS― – ši veislė išvesta F. V. Kovill 1915 m. JAV sukryţminus
(„Brooks―ׄRassel―)ׄRubel―). Kultivuoti pradėta 1926 m. Uogos nėra didelės, šviesiai
mėlynos su stipria vaškine apnaša, susitelkusios į labai kompaktiškas ir nedideles kekes,
apvalios ar šiek tiek suplotos, saldţios, be aromato. Veislė vidutinio ankstyvumo, derlinga.
Krūmai vidutinio augumo, tankūs, reikalaujantys kasmetinio genėjimo, vienmečiai ūgliai
ţiemą rausvi. Lapai tamsiai ţali, smulkūs, elipsiški, ryškiai pjūkliškai dantytais kraštais.
Ţiedai vidutinio dydţio, balti su neryškiu rausvu atspalviu.
„NORTH HOLNA― – uogos vidutinio stambumo, apvaliai ropiškos, tamsiai mėlynos su
šviesia vaškine apnaša, susitelkusios į nedideles kekes, aromatingos. Veislė vidutinio
ankstyvumo ir vidutinio derlumo. Krūmai augūs (aukštesni nei 1,5 m), glausti, vienmečiai
ūgliai ţalsvi. Lapai nedideli, lancetiški, tamsiai ţali, blizgantys, beveik lygiakraščiai. Ţiedai
smulkūs, siaurai cilindriški, balti su kreminiu atspalviu [36, 233, 234, 235, 249].
Siauralapė šilauogė – vasarţalis, 10-30 (50) cm aukščio krūmokšnis su gausiai besišakojančiu
šakniastiebiu. Šakelės apvalios, iš pradţių ţalios, vėliau paruduoja, plikos. Lapai elipsiški ar siaurai
elipsiški, smailiaviršūniai, dantyti (kartais lygiakraščiai), ţali ar melsvai ţali, pliki, tik apatinėje
pusėje palei gyslas kartais šiek tiek plaukuoti. Ţiedai trumpuose, tankiuose ţiedynuose po keletą.
Vainikėlis baltas, kartais rausvai dryţuotas, cilindriškas ar ąsotiškas. Ţydi balandţio – geguţės mėn.
Uogos mėlynos su vaškine apnaša, kartais juodos, blizgančios ar blankios, retai – baltos, rutuliškos,
maţos, sveria (0,15) 0,3-0,5 (0,9) g, prinoksta liepos – rugpjūčio mėn. Jos rūgščiasaldės arba
saldţios [36, 161, 233, 234, 235].
Siauralapės šilauogės veislė:
„CHIGNECTO― – veislė išvesta Kanadoje atrinkus kloną iš sukultūrintos savaiminės
populiacijos. Kultivuojama nuo 1977 m. Uogos tamsiai mėlynos, su melsva vaškine apnaša,
rutuliškos, smulkios, susitelkusios nedidelėse kekėse, skanios. Veislė vidutinio derlumo,
ankstyva. Krūmai 0,8-0,9 m aukščio, glausti. Lapai šviesiai ţali, blizgantys, elipsiški. Ţiedai
cilindriški, balti, sutelkti ţiedynuose po 3-12. Veislė atspari šalčiui [36, 233, 234, 235].
1.1.4. Šilauogių paplitimas ir auginimas
Natūraliai augančių šilauogių aptinkama tik rytinėje ir šiaurės centrinėje Šiaurės Amerikos
dalyje [27]. XX a. pradţioje išvedus naujas šilauogių veisles, jos pradėtos plačiai auginti net tik
14
Šiauriniame, bet ir Pietiniame pusrutulyje: Argentinoje, Čilėje, Pietų Afrikoje, Australijoje, Naujoje
Zelandijoje. Pastaruoju metu daugiausia šilauogių auginama JAV, aukštaūgių šilauogių veislės
kultivuojamos pietinėje Kalifornijos valstijoje. Kanadoje šilauogės sudaro daugiau kaip pusę
auginamų uoginių kultūrų. Europoje šilauogės introdukuotos 1930 m. Pirmiausiai pradėtos auginti
Olandijoje ir Vokietijoje, vėliau ir kitose šalyse. Išvestos šilauogių veislės auginamos Vokietijoje,
Lenkijoje, Skandinavijos šalyse, Vengrijoje. Šiaurės pusrutulyje šilauogės priklausomai nuo veislės
ir regiono geografinės padėties prinoksta geguţės – rugsėjo mėn., o Pietiniame pusrutulyje –
lapkričio – vasario mėn. [254].
Lietuvos gamtinėmis sąlygomis šilauogių vaisiai prinoksta liepos – rugpjūčio mėn.
Lietuvoje šilauogių introdukcija pradėta XX a. II-oje pusėje. Nepaisant daugelio ribojančių
introdukciją veiksnių, aklimatizuotos šilauogių veislės sėkmingai auginamos plantacijose. Lietuvos
respublikos teritorija nedidelė, tačiau agrometeorologinės sąlygos joje nevienodos. Lietuvos
teritorija padalyta į 4 mezoklimatinius rajonus ir 10 parajonių. Nustatyta, jog ne visi mezoklimatiniai
Lietuvos rajonai yra palankūs sodinių ir siauralapių šilauogių veislėms auginti. Daugiamečių tyrimų
rezultatai leidţia daryti išvadas, kad šilauogės neblogai auga ir kai kuriais metais gana gerai dera
Pietryčių aukštumų mezoklimatinio rajono Aukštaičių parajonyje [233, 234, 235].
Šilauogėms auginiti tinkamiausi yra rūgštūs lengvi ir humusingi priesmėliai,
aukštapelkių durpė, optimaliausias dirvoţemio pH 4.0-5.0 [235, 254]. Tinkamiausios šilauogei
auginti yra pietryčių ir vakarų Lietuvos agroklimatinės zonos. Lietuvos Botanikos instituto
mokslininkai nustatė, kad ankstyvųjų ir vidutinio ankstyvumo sodinių šilauogių veislės augintinos
šiltesniuose Lietuvos rajonuose. Lietuvoje introdukuotos šilauogių veislės gana atsparios
nepalankiems ţiemojimo veiksniams, sausrai, ligoms ir kenkėjams. Lietuvos teritorijoje
kultivuojamos šilauogės labiausiai nukenčia nuo vėlyvųjų pavasarinių šalnų, todėl joms auginti
ţemos vietos netinka [235].
1.1.5. Mėlynių ir šilauogių vaisių augalinės ţaliavos paruošos
Medicinai vartojami mėlynių vaisiai (Myrtilli fructus), rečiau – lapai (Myrtilli folium).
Mėlynių vaisių vaistinė augalinė ţaliava aprašyta daugelio šalių farmakopėjose: Jungtinių Amerikos
Valstijų, Europos, Italijos, Prancūzijos, Šveicarijos, Austrijos, Vokietijos. Vaisiai vartojami švieţi,
uţšaldyti ar dţiovinti [28, 35, 63, 269].
Mėlynių vaisių paruošos atliekamos jiems sunokus liepos – rugsėjo mėn. natūraliose
augimvietėse, miškuose [96, 176]. Didţiausi mėlynių vaisių kiekiai surenkami Lenkijoje,
Rumunijoje, Bulgarijoje, Skandinavijos šalyse, Albanijoje, Rusijoje ir Alpių kalnų regiono šalyse.
15
Nustatyta, jog didţiausias mėlynių derlius uţauga vidutinio drėgnumo ir vidutinio pavėsio miškuose
[10, 28, 176].
Šilauogių vaisiais susidomėta ir intensyviai pradėta tyrinėti tik XX a. pradţioje.
Šilauogių vaisių paruošos atliekamos vaisiams visiškai sunokus. JAV ir Kanada yra didţiausios
šilauogių vaisių tiekėjos ir vartotojos pasaulyje. Meino valstijoje (JAV) uţauginama 25 proc. visų
šalies šilauogių derliaus [254]. Europoje daugiausiai šilauogių vaisių uţauginama Prancūzijoje,
Italijoje, Austrijoje. Čilė laikoma didţiausia šilauogių vaisių eksportuotoja Pietiniame pusrutulyje.
Nemaţi kiekiai vaisių uţauginami Australijoje, Pietų Afrikos Respublikoje. Šilauogės sėkmingai
auginamos ir Lietuvoje. Pirmoji komercinė plantacija įkurta Radviliškio rajone [235, 254].
Mėlynių ir šilauogių vaisiai laikomi dţiovinti arba uţšaldyti (-18 ºC temperatūroje).
Ruošiant mėlynių ir šilauogių ţaliavas dideliais kiekiais, vaisiai pramoniniu būdu gali būti
dţiovinami 100 – 105 ºC temperatūroje dţiovyklose [10]. Aukštesnių dţiovinimo temperatūrų turėtų
būti vengiama, kadangi antocianinai yra termolabilūs. Nedidelius vaisių kiekius galima dţiovinti
gerai vėdinamoje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje patalpoje, kambario temperatūroje.
Dţiovinti vaisiai laikomi orui laidţiose pakuotėse, apsaugoti nuo šviesos, drėgmės, 18 – 25 ºC
temperatūros patalpoje [10, 35, 63, 160].
Mėlynių ir šilauogių vaisiai turėtų būti transportuojami atsargiai, kadangi paţeidus vaisiaus
vientisumą, prasideda antocianinų oksidacijos procesai. Eksperimentiniais tyrimais įrodyta, jog
antioksidantiniam aktyvumui neturi įtakos kaip laikomi vaisiai – dţiovinti ar uţšaldyti, tačiau gali
turėti įtakos suminiam antocianinų kiekiui. Pastebėtas antocianinų kiekio sumaţėjimas dţiovinant
vaisius aukštesnėse temperatūrose [158, 223].
1.1.6. Mėlynių ir šilauogių vaisių fitocheminė sudėtis
Švieţiuose mėlynių vaisiuose daţniausiai būna iki 90 proc. vandens, 3-7 proc. cukrų
(sacharozės, gliukozės, fruktozės, galaktozės, ksilozės, arabinozės), pektininių medţiagų (0,6 proc.),
triterpenų [10, 28, 35, 231, 258]. Nustatyti vitaminai: askorbo rūgštis, tiaminas, pantoteno rūgštis,
nikotinamidas, β- karotenas [10, 96].
Mėlynių vaisiuose nustatyti flavonoidai: miricetinas, kvercitrinas, izokvercitrinas,
hiperozidas ir astragalinas [10, 28, 35, 82], katechino (0,02 proc.), epikatechino (0,07 proc.)
proantocianidinų: B-1, B-2, B-3, B-4; neprinokusiuose vaisiuose nustatyti nedideli kiekiai
galokatechinų ir epigalokatechinų [124, 269].
16
Išskirti ir nustatyti antocianinų - delfinidino, cianidino, petunidino, peonidino ir malvidino
-glikozidai: delfinidin-3-galaktozidas, delfinidin-3-gliukozidas, cianidin-3-galaktozidas, delfinidin-
3-arabinozidas, cianidin-3-gliukozidas, petunidin-3-galaktozidas, cianidin-3-arabinozidas, petunidin-
3-gliukozidas, peonidin-3-galaktozidas, petunidin-3-arabinozidas, peonidin-3-gliukozidas, malvidin-
3-galaktozidas, peonidin-3-arabinozidas, malvidin-3-gliukozidas, malvidin-3-arabinozidas [74, 106,
111, 123]. Pastaraisiais metais vaisiuose nustatyta antocianinų disacharidų (delfinidin-3-O-
sambubiozidas ir cianidin-3-O-sambubiozidas), kurių cukrinę dalį sudaro gliukozės ir ksilozės
molekulės [55].
1 lentelė. Mėlynių vaisių sauso ekstrakto antocianinų sudėtis (Amerikos vaistinių augalų
farmakopėja, 2001 ir Rahman M. M. et al., 2006)
Antocianinai
Vidutinis kiekis, proc.
Amerikos vaistinių augalų Rahman M. M. et al.,
farmakopėja 2006
Delfinidin-3-arabinozidas
Delfinidin-3-gliukozidas
Delfinidin-3-galaktozidas
Cianidin-3-arabinozidas
Cianidin-3-gliukozidas
Cianidin-3-galaktozidas
Peonidin-3-arabinozidas
Peonidin-3-gliukozidas
Peonidin-3-galaktozidas
Petunidin-3-arabinozidas
Petunidin-3-gliukozidas
Petunidin-3-galaktozidas
Malvidin-3-arabinozidas
Malvidin-3- gliukozidas
Malvidin-3-galaktozidas
4,32
5,81
5,04
2,19
3,42
2,75
0,22
1,31
0,34
1,08
3,67
1,89
0,81
3,35
1,27
4.23
4.67
4.91
3.10
4.12
4.08
0.24
1.69
0.39
0.96
2.89
1.51
0.52
3.01
1.98
Bendras kiekis 37,47 38,29
Ţaliavos kokybę apsprendţia biologiškai aktyvių junginių kiekis, todėl antocianinų suminis
kiekis daţnai perskaičiuojamas cianidin-3-gliukozidu ir išreiškiamas procentais. Mokslinėje
literatūroje nurodomi skirtingi antocianinų kiekiai vaisių ţaliavose. Antocianinų kiekis mėlynių
17
vaisiuose įvairuoja nuo 0,1 iki 0,5 proc. [28, 35, 176]. Europos farmakopėja reglamentuoja
minimalų suminį antocianinų kiekį, kuris turi būti ne maţesnis kaip 0,3 proc. [63], Jungtinių
Amerikos Valstijų vaistinių augalų farmakopėja nurodo suminį 0,3 - 0,7 proc. antocianinų kiekį
[10].
Mėlynių vaisiuose nustatyta nuo 5 iki 12 proc. taninų, daţniausiai katechino tipo [10, 28,
269]. Neprinokusiuose vaisiuose nustatyta fenolinių rūgščių: galo, protokatecho, m-
hidroksibenzoinės ir p-hidroksibenzoinės, vanilino, chlorogeno, kavos, siringo, ferulo bei o-, m- ir p-
kumaro. Identifikuota keletas fenolinių rūgščių esterių su cukrumis: 1-O-hidroksicinamil- β-D-
gliukozė ir p-kumarilgliukozė. Nustatyta organinių rūgščių: obuolių, chinino, pieno, oksalo, gintaro,
citrinų [10, 94, 258].
Mėlynių vaisiuose identifikuota apie 109 lakieji junginiai. Paţymėtini alifatiniai
alkoholiai, aldehidai ir ketonai, terpeno dariniai, aromatiniai junginiai ir esteriai. Nustatyti trys
pagrindinai junginiai, suteikiantys būdingą mėlynėms kvapą: trans-2-heksenalis, etil-3-metilbutiratas
ir etil-2-metilbutiratas [96]. Neprinokusiuose vaisiuose nustatyta iridoidinų glikozidų:
monotropeino ir asperulozido [10, 269]. Mėlynių vaisių sėklose nustatyta baltymų, riebalinio
aliejaus, kurio sudėtyje yra sočiųjų, mono ir polinesočiųjų riebiųjų rūgščių [22].
Mėlynių lapuose nustatyta fenolinių rūgščių, flavonoidų (aglikono kvercetino
ramnogliukozidai, arabinozidai ir gliukuronozidai) pėdsakai, chinolizidino grupės alkaloidų
(mirtino, epimirtino), iki 10 proc. katechinų ir proantocianidinų [10, 269].
Šilauogių vaisiuose nustatyta flavonolių grupės darinių: kvercetino, miricetino [85], flavan-
3-olių grupės atstovų: katechino ir epikatechino bei proantocianidinų [200, 227, 254]. Vaisiuose
nustatyti delfinidino, cianidino, petunidino, peonidino ir malvidino glikozidai: malvidin-3-
galaktozidas, delfinidin-3-galaktozidas, delfinidin-3-arabinozidas, petunidin-3-galaktozidas,
petunidin-3-arabinozidas, malvidin-3-arabinozidas, cianidin-3-gliukozidas, cianidin-3-galaktozidas,
cianidin-3-arabinozidas, delfinidin-3-gliukozidas, malvidin-3-gliukozidas, peonidin-3-gliukozidas,
peonidin-3-galaktozidas, peonidin-3-arabinozidas ir petunidin-3-gliukozidas, cianidin-3-
(malonil)gliukozidas, cianidin-3-(6‘‘-acetil)galaktozidas, delfinidin-3-(malonil)gliukozidas,
malvidin-3-(malonil)gliukozidas, delfinidin-3-(6‖-acetil)gliukozidas, peonidin-3-(6‖-
acetil)galaktozidas, cianidin-3-(6‖-acetil)gliukozidas, malvidin-3-(6‖-acetil)galaktozidas, petunidin-
3-(6‖-acetil)gliukozidas, peonidin-3-(6‖-acetil)gliukozidas, malvidin-3-(6‖-acetil)gliukozidas [74,
157, 227, 261, 262, 268]. Lenkijoje auginamų šilauogių veislių švieţiuose vaisiuose nustatyta nuo
0,097 iki 0,260 proc., Estijoje – nuo 0,125 iki 0,405 proc. antocianinų, perskaičiuojant ciandin-3-
gliukozidu [222, 236].
18
Šilauogių vaisiuose nustatyta fenolinių rūgščių: chlorogeno [227, 223], hidroksicinamo
[216,]; 0,54 proc. organinių rūgščių: obuolių, chinino, citrinų [94]; apie 80-90 proc. vandens; 10-11
proc. cukrų (gliukozės, fruktozės); 0,74 proc. baltymų; 0,33 proc. riebalų; pektinų; vitaminų:
askorbo rūgšties, tiamino, riboflavino, nikotino rūgšties, pantoteno rūgšties, piridoksino, folio
rūgšties, retinolio, tokoferolio bei karotenoidų. Šilauogių vaisiuose nustatyta mineralinių medţiagų
kalcio, vario, geleţies, magnio, mangano, fosforo, kalio, seleno, natrio, cinko druskų pavidalu [236,
254].
1.1.7. Mėlynių ir šilauogių vaisių ir jų preparatų vartojimas medicinos praktikai
Mėlynių vaisių gydomosios savybės ţinomos nuo Viduramţių laikų, tačiau plačiau
pradėta vartoti tik XVI amţiuje [28]. Mėlynių vaisiai buvo vartojami skorbutui, diabetui,
šlapimtakių susirgimams, tulţies ligoms, kosuliui, plaučių tuberkuliozei gydyti. Vėliau dţiovintų
vaisių nuovirai dėl jų sutraukiamojo bei antibakterinio poveikio buvo vartojami diarėjai, dizenterijai,
burnos ir gerklės uţdegimams gydyti [28, 96, 176, 173]. Mėlynių vaisių arbatos, sirupai buvo
vartojami laktacijai slopiniti, dizurijai gydyti [28]. Mėlynių lapų nuovirai buvo vartojami diabetui
gydyti [35, 174].
Mėlynių vaisių preparatų farmakologinį poveikį apsprendţia kompleksas antrinių
metabolitų. Vieni svarbiausių biologiškai aktyvių junginių grupių yra antocianinai, todėl šios grupės
junginių tyrimams skiriamas didţiulis dėmesys. Nustatyta, kad mėlynių vaisių preparatuose esantys
antocianinai, pasiţymi stipriu antioksidantiniu [17, 255], priešvėţiniu poveikiu [17, 50, 54, 132,
143]. In vivo tyrimais nustatyta, jog antocianinai stabilizuoja skaidulų kolageną, skatina jo sintezę,
maţina kapiliarų trapumą, pralaidumą ir trombocitų agregaciją, pasiţymi antiedeminiu poveikiu [10,
24, 28, 35, 152, 173].
Mėlynių bei šilauogių vaisių antocianinai suriša laisvuosius radikalus, aktyvina arba slopina
fermentus, veikia kaip chelatiniai junginiai apsaugodami lipidus, baltymus ir nukleino rūgštis. Jie
maţina leukocitų imobilizaciją, skatina apoptozę, slopina ląstelių proliferaciją ir angiogenezę,
svarbūs mutagenezės ir karcinogenezės prevencijai ir vėţio gydymui [50, 239, 262, 272].
Antocianinai skatina naviko nekrozės faktoriaus α (TNF-α) ekspresiją, slopina vėţinių
ląstelių augimą ir jų transformaciją [262]. Literatūroje aprašyti antocianinų poveikio mechanizmai:
1) antioksidantinis poveikis [103, 255]; 2) molekuliniai mechanizmai, susiję su antikarcinogeneze
[103]; 3) molekuliniai mechanizmai, susiję su apoptozės indukcija vėţinėse ląstelėse [102, 132, 146,
166].
19
Karcinogenezės molekulinių mechanizmų tyrimai yra reikšmingi vėţio gydymui ir
prevencijai. Buvo atlikti tyrimai su pelių JB6 epiderminių ląstelių kultūra, veikiant ją antocianidinais
(pelargonidinu, cianidinu, delfinidinu, peonidinu, petunidinu ir malvidinu) [103]. Moksliniais
tyrimais įrodyta, kad transkripcijos faktoriaus aktyvatorius proteinas 1 (AP–1) turi įtakos
karcinogenezės vystymosi skatinimui. Aktyvuodamas genų transkripciją, šis baltymas skatina
ląstelių proliferaciją ir transformaciją. UV spinduliai, augimo faktorius ir laisvieji radikalai,
aktyvuodami mitogeninę aktyvavimo proteinkinazę (MAPK) ir ekstraląstelinių signalų reguliavimo
proteinkinazę (ERK), c–Jun N-terminalinę kinazę (JNK), gali sukelti AP–1 aktyvaciją [68, 142].
Padidėjęs AP–1 aktyvumas sukelia įvairių vėţio formų vystymąsi: odos, plaučių, virškinimo trakto
ir t. t. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad antocianinai ir jų aglikonai gali lėtinti karcinogenezės
procesus [103].
Apoptozė – genetiškai kontroliuojama ląstelės mirtis – pagrindinis daugialąstelinių organizmų
homeostazės palaikymo mechanizmas [166]. Tyrimais su ţiurkių lygiaisiais raumenimis ir kepenų
ląstelėmis įrodyta, kad antocianinai maţina DNR paţeidimus, kuriuos sukelia oksidacija [143].
Buvo tirtas antocianinų aglikonų poveikis ţmogaus vėţinių ląstelių (gimdos karcinomos, gaubtinės
ţarnos adenokarcinomos) ir normalių fibroblastų gyvybiniam ciklui ir apoptozės indukcijai.
Nustatyta, kad delfinidinas stabdo normalių fibroblastų ląstelių proliferaciją ir skatina apoptozę
vėţinėse ląstelėse [146, 166]. Japonijos mokslininkai tyrė 10-ies vaisių ekstraktų poveikį vėţinių
ląstelių augimo inhibicijai. Tyrimams in vitro buvo panaudotos ţmogaus HL60 leukemijos ir
HCT116 gaubtinės ţarnos karcinomos ląstelės. Nustatyta, kad HCT116 ląstelės buvo atsparesnės
antocianinų sąlygotai apoptozės indukcijai nei HL60 ląstelės. Gauti rezultatai įrodė, kad ne tik
aglikonai, bet ir glikozidai inhibuoja vėţinių ląstelių augimą ir skatina apoptozę [68, 132].
Taikant įvairias antioksidantinio poveikio tyrimo metodikas, nustatyta teigiama koreliacija
tarp fenolinių junginių kiekio tirtuose ekstraktuose ir antioksidantinio aktyvumo [59, 104, 128, 181,
199, 224, 267, 279]. Antocianinai yra pagrindiniai junginiai, apsprendţiantys ekstraktų
antioksidantinį poveikį [279]. Tyrimais įrodytas ne tik mėlynių vaisių ekstraktų lipidų peroksidaciją
inhibuojantis, bet ir laisvuosius radikalus surišantis poveikis [14, 18, 74]. Buvo atlikti tyrimai
nustatant mėlynių vaisių fenolinių junginių antioksidantines savybes surišant superoksido (·O2¯) ir
peroksinitrilo (ONOO¯) radikalus. Nustatyta sugebėjimo surišti superoksido radikalus seka:
delfinidinas > petunidinas > malvidinas = cianidinas > (+)-katechinas > peonidinas >
pelargonidinas. Atitinkamai su peroksinitrilo radikalu: delfinidinas > cianidinas = petunidinas >
malvidinas = (+)-katechinas > peonidinas > pelargonidinas. Nustatytas antocianinų sinergistinis
surišamasis poveikis su ·O2¯ ir ONOO¯ radikalais [204]. Tirtos mėlynių vaisių ekstraktų galimybės
inhibuoti lipidų peroksidaciją, sukeltą 2,2‘-azobis(2-metil-propanimidamido) dihidrochlorido
20
liposomų membraninėje sistemoje. Ekstraktų antioksidacinės savybės vertintos stebint deguonies
suvartojimą ir matuojant konjuguotų dienų formavimąsi. Visi tirti ekstraktai apsaugojo membranas
nuo peroksilo radikalų poveikio prailgindami oksidacijos indukcijos laiką [65].
Tyrimais in vitro su izoliuotomis kraujagyslėmis įrodyta, kad mėlynų vaisių ekstraktas gali
būti efektyvi vazoprotekcinė priemonė kraujagyslių ligų prevencijai bei gydymui [21, 28].
Antocianinai slopina uţdegimą sukeliančių junginių (prostaglandinų, leukotrienų bei histamino)
sintezę ir išsiskyrimą, taip pat maţina COX-1 ir COX-2 išsiskyrimą skatinančių genų ekspresiją [9,
143, 176, 270]. Tyrimais nustatytos mėlynių vaisių antocianinų proteazes inhibuojančios savybės,
turinčios įtakos antikancerogeniniam, antioksidantiniam, priešuţdegiminiam bei neuroprotekciniam
poveikiui. Vartojant antocianinų turinčius produktus, galima apsisaugoti nuo daugelio lėtinių ir
neurodegeneracinių ligų [54].
In vitro ir in vivo tyrimuose su kompleksiniu įvairių vaisių preparatu įrodytas mėlynių
vaisių ekstraktų antiangiogeninis poveikis. Tokio tipo preparatai maţina nepageidaujamą
kraujagyslių išvešėjimą, sąlygojantį venų varikozių ir navikų formavimąsi. Tiriant kraujagyslių
endotelinio augimo faktoriaus (VEGF) ekspresiją ţmogaus HaCaT keratinocituose ir įvairių vaisių
ekstraktų įtaką jai, nustatytas šilauogių ir mėlynių ekstraktų slopinamasis poveikis, lemiantis
antiangiogeninį poveikį [17, 169, 218].
Nustatyta, jog mėlynių vaisiuose esantys polifenoliniai junginiai (antocianinai,
fenolinės rūgštys, flavonoidai, proantocianidinai) veikia antimikrobiškai Salmonella,
Staphylococcus, Helicobacter ir E. coli padermes [202, 203].
Nustatyta, kad mėlynių vaisių ekstraktai gerina naktinį matymą, akių prisitaikymą prie
tamsos bei pagreitina akies matymo atsistatymą paveikus ryškia šviesa [173]. Priešingai kiti atlikti
tyrimai pateikė kontraversiškas išvadas, įrodančias, kad mėlynių vaisių preparatų vartojimas po 160
mg 2 kartus per dieną neturi įtakos geram naktiniam matymui [183]. Klinikiniais tyrimais
patvirtintas mėlynių vaisių preparatų teigiamas poveikis hipertenzinės bei diabetinės retinopatijų ir
glaukomos gydymui. Diabetine retinopatija sergantys pacientai vartojo po 160 mg mėlynių
preparato, turinčio 36 proc. antocianinų, 2 kartus per dieną. Vartojant preparatą 1 mėnesį, 10-ies iš
13 tirtų pacientų būklė pagerėjo. Tyrėjai nustatė, kad mėlynių vaisių pigmentai gali padidinti
jautrumą šviesai ir pagerinti akies kapiliarų aprūpinimą krauju [19].
Eksperimentiniai tyrimai su laboratorinėmis ţiurkėmis ir klinikiniai tyrimai su
ţmonėmis, papildţius jų mitybos racioną mėlynių preparatais, parodė, kad galima sustabdyti
kataraktos vystymąsi [19, 97, 195]. Mėlynių vaisių ekstrakto kompleksinis preparatas su vitaminu E
sustabdė kataraktos progresavimą 97 proc. tyrime dalyvavusių 50 pacientų, sergančių senatvine
ţievine katarakta [31]. Mėlynių vaisių preparatų poveikio mechanizmai, teigiamai veikiantys
21
regėjimą, nėra tiksliai išaiškinti. Manoma, kad tai susiję su gebėjimu pagerinti akies aprūpinimą
deguonimi, krauju ir surišti laisvuosius radikalus, kurie gali suardyti kolageno struktūrą ir sukelti
kataraktą bei dėmės degeneracinius pakitimus [15, 19]. Autofluorescentiniai pigmentai, kurie
kaupiasi pagyvenusių ţmonių tinklainės pigmentinėse epitelio ląstelėse, susiję su dėmės
degeneraciniais pakitimais. Atliktas tyrimas parodė, kad A2E-epoksidai, nepriklausomai nuo
singletinio deguonies, savo oksidaciniu poveikiu paţeidţia DNR. Mėlynių ekstraktai sumaţina A2E
epoksidaciją surišdami singletinį deguonį [116].
Šilauogių vaisių gydomąsias savybes pirmieji pastebėjo vietiniai Amerikos gyventojai.
Šilauogių vaisių arbatą jie vartojo kaip pagalbinę priemonę gimdymo metu. Lapų preparatus vartojo
cukraus kiekiui kraujyje maţinti, inkstų ligoms gydyti. Šilauogių sultys buvo vartojamos kosuliui
gydyti. Šiuolaikinėje medicinoje šilauogių preparatai vartojami šlapimtakių infekcijoms gydyti [193,
254]. Šiaurės Amerikos Šilauogių tarybos duomenimis antocianinų turintys šilauogių vaisiai
rekomenduojami kaip efektyvi antioksidantinė priemonė vėţio bei širdies ir kraujagyslių ligų
prevencijai [44, 59, 181, 199, 263]. Šilauogių vaisių fenoliniai junginiai inhibuoja vėţinių ląstelių
proliferaciją ir sukelia apoptozę. Nustatyta, jog stipriausios priešvėţinės savybės iš visų
polifenolinių junginių ryškiausios antocianinų frakcijoje [272]. Atliekant šilauogių ekstraktų
mitogeninių savybių tyrimus in vitro, nustatytas limfocitų proliferaciją skatinantis poveikis [126].
Eksperimentų metu ţiurkes 30 dienų maitinant šilauogių liofilizuotais ekstraktais ( apie
3,2 mg/kg per dieną), pastebėtas ţymus trumpalaikės bei darbinės atminties pagerėjimas, tačiau
įtakos ilgalaikei atminčiai nenustatyta [57, 205]. Šilauogių polifenoliniai junginiai gali pereiti kraujo
smegenų barjerą ir lokalizuotis atsakinguose uţ atmintį ir mokymąsi smegenų centruose [12].
Naudojant įvairias modelines sistemas su ţiurkėmis, siekta išsiaiškinti šilauogių vaisių preparatų
veikimo mechanizmus gerinant atmintį. Vartojant maisto papildus su šilauogių ekstraktu,
apsisaugoma nuo atpaţinimo atminties pablogėjimo ir padidinamas baltymo (branduolio faktorius-
kapa B [NF- kB]), atsakančio į oksidacinį stresą, kiekis [78, 265].
Oksidacinis stresas yra svarbus išeminio insulto etiologijai. Šilauogių ekstraktai
pasiţymi stipriomis antioksidantinėmis savybėmis. Nustatyta, kad pavartojus jų, ţiurkių smegenų
paţeidimo laipsnis sukėlus išemiją, buvo net 23 proc. maţesnis [240]. Atliekant tyrimus su ląstelių
kultūromis ir gyvūnais, nustatytas šilauogių ekstraktų cholesterolio kiekį kraujo plazmoje maţinantis
poveikis. Į kiaulių maisto racioną pridėjus 4 proc. šilauogių ekstrakto, plazmoje nustatytas
sumaţėjęs MTL ir DTL kiekis, atitinkamai 11,7 bei 15,1 proc. [270]. Šiuolaikinis mėlynių ir
šilauogių vaisių vartojimas pagrįstas ilgamete jų vartojimo patirtimi liaudies medicinoje bei
nuosekliais moksliniais tyrimais. Atliktų mokslinių tyrimų rezultatai įrodo, jog antocianinai yra
vieni svarbiausių biologiškai aktyvių junginių mėlynių ir šilauogių vaisiuose [28, 173].
22
1.2. Antocianinų apibūdinimas, struktūra, biologinės savybės ir
panaudojimas
1.2.1. Antocianinų bendra apţvalga, biosintezė
Antocianinai yra natūralūs gamtoje plačiai paplitę pigmentai. Jie gamtoje egzistuoja
glikozidine forma (antocianinai), o jų aglikonai vadinami antocianidinais. Antocianinai nustatyti
augaluose, jų neturi gyvūnai, mikroorganizmai ir vandens augalai. Antocianinai augalams suteikia
būdingą spalvą, kuri varijuoja nuo roţinės ir violetinės iki tamsiai mėlynos [35, 114, 139, 196, 197].
Daugiausia antocianinų nustatyta ţiedų vainiklapiuose ir vaisiuose. Jie nustatyti ir kitose augalų
dalyse: šaknyse, pumpuruose, stiebuose ir poţeminiuose organuose [35, 246]. Maţesni antocianinų
kiekiai nustatyti plikasėkliuose, paparčiuose, samanose [35, 40, 119].
Taikant eksperimentinius modelius, buvo nustatyta, kad antocianinai yra sintetinami
ląstelės citoplazmoje ir transportuojami į vakuoles, kur susijungia su baltyminiu matriksu [276]. Yra
duomenų, kad antocianinai gali susidaryti augaluose vykstant flavonoidų metabolizmui.
Eksperimentiniai duomenys rodo, kad 2,3–trans–dihidro–3,4–cis–dihidroksiflavonolis yra
antocianidinų prekursorius. Antocianinų biosintezę atlieka fermentai, esantys ląstelės membranoje.
Jie katalizuoja dviejų pagrindinių biocheminių elementų (acto rūgšties ir fenilalanino),
transformaciją į galutinį produktą – antocianinus, po to jie pernešami į epidermio ląstelių vakuoles.
Ţymūs DNR genetinio kodo pakitimai sąlygoja pigmentų sintezės pakitimus [35, 111, 112].
Antocianinų sintezę veikia aplinkos veiksniai: šviesa, jos intensyvumas, šviesos bangos ilgis,
temperatūra, vandens, angliavandenių kiekis, azoto, fosforo ir boro koncentracija augimo metu.
Nustatyta, jog matoma šviesa, raudonieji bei tolimojo spektro raudonieji spinduliai didina fermentų,
katalizuojančių antocianinų biosintezės procesus, aktyvumą [35, 82, 280].
Antocianinų struktūros ypatumai, fizikocheminės savybės
Pastaruoju metu iš augalų išskirti, identifikuoti ir aprašyti 539 antocianinai [11]. Iš jų 277
antocianinų struktūra nustatyta jau po 1992 metų. Antocianinų glikozidus sudaro cukrinė dalis ir
aglikonas (antocianidinas). Antocianinai turi C6C3C6 sandarą, būdingą flavonoidams. Antocianinai
yra glikozidinti polihidroksi ir polimetoksi 2-fenilbenzopirilo (flavilio katijono) dariniai. Šį katijoną
sudaro deguonį turintis heterociklo piranas, sujungtas su benzeno ţiedu. Pirano ţiedo 2 padėtyje
prisijungęs benzeno ţiedas, kuris gali turėti skirtingų radikalų. Pagrindinė antocianinų dalis yra
aglikonas (flavilio katijonas), turintis konjuguotas dvigubas jungtis, kurios apsprendţia šviesos
absorbciją (apie 500 nm). Aglikonai daţniausiai būna penta-(3,5,7,3´,4´) arba heksa-(3,5,7,3´,4´,5´)
23
pakaitai. Aglikonai savo struktūroje turi prisijungusias acilines grupes [110, 225]. Atocianidinų
struktūrinė formulė pateikta 1 pav.
1 pav. Antocianidinų struktūrinė formulė (Rx – pakaitas, nurodytas 2 lentelėje )
Išskirti dimeriniai antocianinai grupuojami į dvi klases. Pirma klasė jungia pigmentus,
kurių molekulę sudaro antocianinai ir flavonai ar flavonoliai, susijungę acildikarboksiline jungtimi.
Kitą klasę sudaro keturi skirtingi katechinai, kovalentinėmis jungtimis susijungę su pelargonidin-3-
gliukozidu. Per pastaruosius dešimt metų buvo išskirti ir aprašyti septyni nauji dezoksiantocianidinai
ir didelė antocianidinų grupė, vadinama piranantocianidinais (2 pav.) [11, 167, 211].
Piranantocianidinai pirmą kartą identifikuoti 1996 metais [43]. Susidomėjimas šiais junginiais
nuolat didėja, kadangi piranantocianidinai yra stabilesni uţ kitų grupių antocianinus.
2 pav. Piranantocianidinų struktūrinė formulė
Gamtoje nustatyta gana neįprasta antocianinų forma – metaloantocianinai. Jų molekulės
struktūroje kovalentinėmis jungtimis yra prisijungę metalų atomai. Iš metalų daţniausiai nustatyti
24
dvivalenčiai magnio, kobalto, molibdeno, nikelio, cinko ir kadmio jonai. Daţnai pasitaiko
trivalenčių geleţies ir aliuminio jonų. Šie antocianinai – sudėtingi kompleksiniai junginiai, kurie
suteikia augalų ţiedams mėlyną spalvą [11, 30, 86].
Šiuo metu ţinoma daugiau nei 30 monomerinių antocianidinų, tačiau daţniausiai nustatomi
šeši antocianidinai: delfinidinas, cianidinas, petunidinas, malvidinas, peonidinas ir pelargonidinas.
Augaluose daţniausiai aptinkamų antocianinų aglikonai pateikti 2 lentelėje. 30 proc. visų
identifikuotų antocianidinų struktūros pagrindą sudaro cianidinas, atitinkamai 22 proc. – delfinidinas
ir 18 proc. – pelargonidinas. Trys antocianidinai (peonidinas, malvidinas ir petunidinas) sudaro 20
proc. antocianidinų struktūros pagrindą. Kiti antocianidinai turi 3–dezoksi, rečiau metilintų ir 6–
hidroksiantocianidinų struktūrą [11].
2 lentelė. Išskirti ir identifikuoti antocianidinai
Pavadinimas Grupės (pakaito) padėtis struktūrinėje formulėje
Dažniausiai augaluose nustatomi
antocianidinai
3 5 6 7 3’ 4‘ 5‘
Pelergonidinas(Pg) OH OH H OH H OH H
Cianidinas (Ci) OH OH H OH OH OH H
Delfinidinas (Df) OH OH H OH OH OH OH
Peonidinas (Pn) OH OH H OH OMe OH H
Petunidinas (Pt) OH OH H OH OMe OH OH
Malvidinas (Mv) OH OH H OH OMe OH OMe
Rečiau augaluose esantys metilinti
antocianidinai
5 – MetilCi OH OMe H OH OH OH H
7 – Metilan (rosinidinas) OH OH H OMe OMe OH H
5 – MetilDf (pulchelidinas) OH OMe H OH OH OH OH
5 – MetilPt (europidinas) OH OMe H OH OMe OH OH
5 – MetilMv (kapensinidinas) OH OMe H OH OMe OH OMe
7 – MetilMv (hirsutidinas) OH OH H OMe OMe OH OMe
6 – Hidroksilinti antocianidinai
6 – HidroksiPg OH OH OH OH H OH H
6 – HidroksiCi OH OH OH OH OH OH H
6 – Hidroksi Dp OH OH OH OH OH OH OH
3 – Dezoksi antocianidinai
25
Apigenidinas (Ap) H OH H OH H OH H
Luteolinidinas (Lt) H OH H OH OH OH H
Tricenidinas (Tr) H OH H OH OH OH OH
7 – MetilAp H OH H OMe H OH H
5 - MetilLt H OMe H OH OH OH H
5-Metil 6- hidroksiAp (karajuronas) H OMe OH OH H OH H
5,4- Dimetil-6-hidroksiAp
(carajurinas)
H OMe OH OH H OMe H
5-Metil-6-hidroksiLt H OMe OH OH OH OH H
5,4-Dimetil-6-hidroksiLt OH OMe OH OH OH OMe H
Ricionidinas OH H OH OH H OH H
Augaluose antocianinai daţniausiai esti glikozidų pavidalo. Antocianinai klasifikuojami
pagal prisijungusių cukrų molekulių skaičių (monozidai, biozidai ir triozidai). Tetrazidų augaluose
iki šiol dar nenustatyta. Cukrinė dalis su aglikonu jungiasi O–glikozidine jungtimi. Visai neseniai
buvo nustatyta, kad aglikonas su cukrine dalimi gali jungtis ir C–gikozidine jungtimi. 97 proc. visų
antocianidinų yra glikozidinti ir yra prisijungę įvairias cukrų molekules. Sfagnorubinas, rozacianinas
B ir 3–dezoksiantocianidinai yra vieninteliai natūraliai gamtoje randami antocianidinai, kurie esti
aglikonų pavidalo [11, 245].
Monozidai turi vieną cukraus molekulę. Daţniausiai jie būna susijungę su: gliukoze,
galaktoze, ramnoze, arabinoze, ksiloze ar gliukurono rūgštimi. Cukrinė dalis su aglikonu jungiasi
per C3 padėtyje esančią hidroksilinę grupę O–glikozidine jungtimi. Didţioji dauguma (90 proc.)
antocianinų yra prisijungę cukrus, kiti savo struktūroje gali būti prisijungę gliukorono rūgštį [123].
Diglikoziduose monosacharidai prijungti prie C3 ir C5 arba C3 ir C7 padėtyse esančių hidroksilinių
grupių. Galimi atvejai, kai abi cukrų molekulės yra prisijungusios C3 padėtyje [11].
Triozidai C3 padėtyje gali turėti linijinę arba šakotą iš trijų monosacharidų sudarytą cukrų
grandinę. Galimas monosacharidų prisijungimas 3´-, 4´-, ir 5´- padėtyse. Daţniausiai sutinkami di- ir
triglikozidų cukrai yra rutinozė, soforozė, sambubiozė ir gliukorutinozė [11].
Antocianinų fizikocheminės savybės. Antocianinai yra 2–fenilbezopirilo katijono dariniai,
vandeniniuose tirpaluose turi silpnas rūgštines savybes ir yra geri elektrolitai. Stiprių rūgščių
tirpaluose (pH<3) katijoninė forma yra stabili ir raudonos spalvos. Stipriai rūgščiuose tirpaluose ir
deguonies aplinkoje ar aukštoje temperatūroje vyksta hidrolizė. Silpnų rūgščių tirpaluose (pH 4 – 6)
katijonas netenka vieno ar dviejų protonų ir taip virsta anhidrobaze (chinoidinė forma), kuri stabili ir
mėlynos spalvos. Vykstant molekulės hidratacijai, susidaro pseudobazė, kuri yra bespalvė. Didėjant
26
vandeninių tirpalų pH (pH >7), 2 – fenilbenzopirilio katijonas jonizuojasi, tirpalai tampa
nebestabilūs ir antocianinų struktūra suardoma. Antocianinų stabilumas maţėja veikiant deguoniui
(t. y. oksidatoriams), temperatūrai ir šviesai [35, 144, 275].
Antocianinai yra tirpūs vandenyje ir alkoholiuose, netirpūs nepoliniuose organiniuose
tirpikliuose. Nestabilūs neutralioje ar šarminėje terpėje. Antocianinų tirpalai yra labai nestabilūs ir
gali būti laikomi azoto aplinkoje, ţemoje temperatūroje ir tamsoje. Antocianinų stabilumą
vandeniniuose tirpaluose didinantys veiksniai: acilo grupių skaičius (t. y. poliacilinti junginiai);
autopigmentacija, t. y. antocianinų jungimasis tarpusavyje; antocianinų jungimasis su flavonoidais;
jungimasis ar adsorbcija su sacharoze, proteinais, pektinais ir kitomis makromolekulėmis [34, 114,
128, 136, 178, 191, 208, 275].
Antocianinų reikšmė augalams ir gyvūnams. Antocianinai panaudojami tam tikru augalo
vystymosi metu, o vėliau šiuos pigmentus suskaido augalo fermentai. Moksliniais tyrimais įrodyta,
jog antocianinai, ypač kai jie kaupiami viršutiniame lapo paviršiuje ar epidermio ląstelėse, atlieka
fiziologines funkcijas. Antocianinai, besikaupiantys jaunuose, besivystančiuose lapuose bei lapus
metančių augalų lapuose rudenį, yra atsakas į maisto medţiagų stygių, temperatūros pokyčius ar
ultravioletinių spindulių poveikį [139].
Manoma, kad antocianinai atlieka atitinkamo tirpinio funkciją vykstant osmosiniam
prisitaikymui prie sausros, šalčio ar streso kaip antioksidantai. Antocianinai veikia kaip UV
spindulių ekranas ir yra sintezuojami kaip atsakas į augalą veikiančią UV radiaciją ir apsaugo augalo
DNR [76, 77, 112].
Antocianinai vaisiuose, darţovėse bei iš jų gautuose augaliniuose produktuose kelia vis
didesnį mokslininkų susidomėjimą. Dėl antocianinų buvimo juose augalinius produktus galima
vartoti ne tik kaip maistą, maistines daţo medţiagas, bet ir daugelio ligų prevencijai bei gydymui
[201].
1.2.2. Antocianinų farmakokinetika ir metabolizmas
Vykstant sparčiai mokslo technologijų paţangai, nuolat daugėja antocianinų tyrimų tiek in
vitro, tiek in vivo. Taikant eksperimentinius in vitro modelius bei atliekant tyrimus su laboratoriniais
gyvūnais, nustatytas antocianinų antioksidantinis, antikancerogeninis, akies tinklainės pigmentų
epitelines ląsteles apsaugantis poveikis [20, 116, 272].
Įvertinus teigiamą antocianinų poveikį organizmui, svarbu išsiaiškinti efektyviausius jų
patekimo į organizmą kelius, pasiskirstymą organuose, bioprieinamumą. Atliekant bioprieinamumo
bei antocianinų pasiskirstymo organuose tyrimus su ţiurkėmis, vartojant standartinį mėlynių
ekstraktą (Bilberon 25), kraujo plazmoje buvo nustatyti visi pagrindiniai antocianinai, išskyrus
27
peonidin 3-O- -L-arabinozidą. Antocianinų absorbcija priklauso nuo antocianinų tipo bei
koncentracijos [93].
Atlikus tyrimus su ţmonėmis, maksimali antocianinų koncentracija, pavartojus juos
peroraliai, pacientų plazmoje pasiekiama po 1,5-2,8 val. Vėliau ji laipsniškai maţėja tiek ţiurkių,
tiek ţmonių kraujo plazmoje [88, 108, 133]. Pirminės struktūros antocianinai sudarė 32 proc. visų
ţmogaus plazmoje nustatytų antocianinų, kiti – konjuguotose formose [133].
Tarp tą patį aglikoną turinčių antocianinų, pavartojus peroraliai, po 15 min. ţiurkių plazmoje
nustatyta ši seka: galaktozidas > gliukozidas > arabinozidas. Plazmos klirensas po intraveninio
vartojimo aiškiai parodo, jog arabinozidas eliminuojamas ţymiai greičiau negu gliukozidas ar
galaktozidas. Lyginant aglikonų, turinčių tas pačias cukraus molekules, pusinės eliminacijos laiką iš
kraujo plazmos, buvo nustatyta ši seka: delfinidinas > cianidinas > petunidinas = peonidinas >
malvidinas [108]. Plazmoje bei tuščiojoje ţarnoje taip pat aptinkama ir antocianinų aglikonų [241].
Antocianinų absorbcija skrandyje varijuoja nuo 19 iki 37 proc., priklausomai nuo
antocianinų struktūros. Nustatyta, kad delfinidino glikozidai iš skrandţio absorbuojami
efektyviausiai, tačiau atlikti tyrimai rodo, kad antocianinų struktūra skrandyje nekinta [241, 242]. Jie
yra stabilūs esant rūgščiai skrandţio aplinkai, tačiau tik apie 25 proc. tyrinėtų antocianinų buvo
stabilūs imituojamai kasos virškinamajai aplinkai [172]. Taikant in situ perfuzines sistemas
tyrimuose su ţiurkėmis, įrodyta, jog antocianinų glikozidai greitai bei efektyviai absorbuojami
plonajame ţarnyne [243].
Antocianinų bioprienamumas yra daug maţesnis negu kitų flavonoidų [66, 201]. Nustatyta,
kad galaktozidų bioprieinamumas didţiausias, maţesnis – cianidino bei delfinidino gliukozidų ir
arabinozidų. Petunidino ir malvidino arabinozidai ir galaktozidai turėjo didesnį bioprieinamumą
negu gliukozidai [108].
Antocianinų bioprieinamumas gali būti padidinamas vartojant juos frakcionuotos kokosų
aliejaus suspensijos mišinyje su gliukozės tirpalu [10, 25]. Cukrinė antocianinų dalis bei aglikono
stabilumas stipriai veikia jų metabolizmą. Įrodyta, jog cukrinė dalis neturi įtakos O-metilinimo
metabolizmui, bet veikia konjugaciją su gliukurono rūgštimi tiek kepenyse, tiek plonajame ţarnyne
[109]. Kepenyse ir inkstuose nustatyti O-metil antocianinai (peonidinas ir malvidinas bei kiti O-
metil antocianinai), susidarę iš delfinidino, cianidino ir peonidino gliukozidų [108, 241].
Tyrimai su gervuogių antocianinais parodė, kad antocianinų gliukozidai efektyviai ir greitai
absorbuojami skrandyje ir kaupiasi tulţies pūslėje. Atlikti eksperimentai įrodė, kad cianidin-3-
gliukozidas į tulţį patenka po 20 min. pavartojus antocianinų preparatą peroraliai. Peonidin-3-
gliukozidas (metilinta cianidin-3-gliukozido forma) taip pat nustatyta tulţyje [242]. Antocianinai
nustatyti ţiurkių šlapime nepakitusios glikozidinės formos, tačiau nei aglikonų, nei konjuguotų
28
formų šlapime nenustatyta. Peonidin-3-gliukozidas galėjo susidaryti vykstant cianidin-3-gliukozido
metilinimui kepenyse. Pacientų, vartojusių antocianinų preparatus, šlapime nustatyti ne tik pradinės
struktūros (32,5 proc.), bet ir dariniuose su gliukurono rūgštimi bei metilinti antocianinai [66, 133].
1.2.3. Antocianinų biologinis poveikis
Aktyvūs deguonies junginiai, patenkantys iš endogeninių ir egzogeninių šaltinių, gali
sukelti įvairias ligas: išeminę širdies ligą, insultą, reumatoidinį artritą, vėţį. Vaisių ir darţovių
vartojimas sumaţina šių patologijų riziką, kuri aiškinama vitaminų-antioksidantų (vitamino C,
vitamino E ir β-karoteno) poveikiu [201]. Antocianinams priskiriama daug farmakologinio poveikio
efektų [91, 171]. Šiuo metu dauguma jų yra gerai ištyrinėti ir siejami su stipriu antioksidantiniu
poveikiu, priešuţdegiminėmis [54, 262, 273], hipolipideminėmis, kraujotaką gerinančiomis,
hipoglikeminėmis [118, 171, 252], antiangiogeninėmis [174], antimikrobinėmis [95, 202, 203],
priešvirusinėmis [137] priešvėţinėmis [29, 230] bei nuo oksidacinio DNR paţeidimo
apsaugančiomis savybėmis [2, 147, 175]. Nustatyta, jog antocianinai maţina išeminės širdies ligos
riziką [47, 70, 83, 130, 209]. Šis poveikis glaudţiai siejamas su antocianinų gebėjimu maţinti
trombocitų agregaciją [60, 179, 210] bei per įvairius mechanizmus kraujagyslių aterosklerozės
procesus slopinančiu [62, 125, 238] ir kraujagysles plečiančiu [13, 37] poveikiu. Antocianinai gerina
mikrocirkuliaciją, maţina kapiliarų trapumą bei pralaidumą [230], pasiţymi kolageną
stabilizuojančiu [173] poveikiu. Atliktais klinikiniais tyrimais įrodyta, jog antocianinai gerina
regėjimą [168, 185]. Antocianinų turintys ekstraktai pasiţymi neuroprotekciniu poveikiu [54, 72,
274], juos galima vartoti fibromialgijai gydyti [58]. Naujausiais tyrimų duomenimis nustatyta, kad
antocianinai turi MAO inhibicinių savybių, dėl to juos būtų galima vartoti depresijos, nerimo bei
kitų neurodegeneracinių ligų gydymui bei profilaktikai [54].
Atliktų tyrimų gausa ir įvairovė rodo platų antocianinų biologinio poveikio spektrą.
Dauguma šių poveikių intensyviai tyrinėjami tiek in vitro, tiek in vivo sistemose [154] atliekant tai
patvirtinančius klinikinius tyrimus.
1.2.4. Antocianinų antioksidantinis aktyvumas
Laisvieji radikalai yra glaudţiai siejami su daugelio ligų etiologija, pvz.: išeminės širdies
ligos, insulto, reumatoidinio artrito, regėjimo bei atminties silpnėjimo, degeneracinių susirgimų ar
vėţio [201]. Laisvieji radikalai sintezuojami endogeniškai (energijos metabolizmo procesuose ir
antimikrobinėse gynybinėse kūno sistemose) ar kaip atsakas į egzogeninius veiksnius (cigarečių
dūmus, nesubalansuotą mitybą, sekinančią fizinę veiklą, aplinkos taršą ir maisto uţterštumą) [180].
29
Laisvieji radikalai – labai reaktyvios molekulės, dalyvaujančios daugelyje patofiziologinių reakcijų,
ypač oksidantiškai paţeidţiant baltymus, lipidus ar DNR. Prasidėję oksidantiniai procesai ląstelėje
daţnai sąlygoja rimtus ląstelės paţeidimus ir galiausiai visišką ląstelės suardymą [189]. Maisto
racionas, turintis daug vaisių ir darţovių, maţina daugelio patologijų riziką. Antocianinai yra
laikomi vienais svarbiausių natūralių antioksidantų, esančių daugelyje augalinės kilmės maisto
produktų.
Normaliomis sąlygomis deguonis mitochondrijose, endoplazminiame retikuliume
dalyvauja metaboliniuose procesuose. Esant nepakitusioms aplinkybėms, nedidelis kiekis elektronų
pereinančių per mitochondrijų elektronų transporto grandinę, nuteka ir su molekuliniu deguonimi
suformuoja aktyvius deguonies (ROS) ir azoto (RNS) junginius. Jiems priskiriami superoksido
(•O2¯), hidroksilo (HO•), azoto oksido (NO•), peroksilo (ROO•), alkoksilo (RO•) [180, 189]
radikalai bei kitos neradikalinės deguonies ir azoto formos: peroksinitrilas (ONOO¯) [271],
singletinis deguonis (1O2), vandenilio peroksidas (H2O2), hipochlorito rūgštis (HOCl) [189].
ROS susidaro įvairių ląstelinių procesų metu, tačiau neutralizuojami integruotų
antioksidantinių sistemų, kuriose dalyvauja fermentai (superoksido dismutazė, katalazė, gliutationo
peroksidazė), makromolekulės (albuminai, ceruloplazminai, feritinas) bei antioksidantai (vitaminas
C, α-tokoferolis, β-karotenas, urono rūgštis, bilirubinas, polifenoliniai junginiai). Daugybė neigiamų
veiksnių (ligos, vaistai, uţterštumas, prasta mityba) gali sutrikdyti ROS išsiskyrimo ir gynybinių
organizmo sistemų funkcionavimo pusiausvyrą ir sudaryti sąlygas oksidantiniam stresui pasireikšti
[44, 253].
Manoma, kad antocianinų antioksidantinis poveikis pasireiškia per daugelį sudėtingų
mechanizmų. Juos būtų galima suklasifikuoti taip: 1) sugebėjimą tiesiogiai surišti laisvuosius
radikalus; 2) apsaugantį nuo ROS formavimosi, kuris veikia keliomis kryptimis (sudarydami
chelatinius junginius su metalais apsaugo nuo redokso reakcijų, inhibuoja ksantino oksidazę ir
NADPH oksidazę); 3) apsaugantį nuo lipofilinių antioksidantų; 4) skatinantį antioksidantinių
fermentų išsiskyrimą [7]. Modelinėse sistemose nustatyta, kad antiradikalinėmis savybėmis
pasiţymintys antocianinai atiduoda elektroną ar vandenilio atomą iš hidroksilo pakaito laisviesiems
radikalams ir taip suriša laisvuosius radikalus nutraukdami oksidantinių procesų grandinę [260].
Antocianinai yra potencialūs laisvųjų radikalų rišikliai, gebantys surišti •O2¯ [192, 264], HO• [192,
263], H2O2 , 1O2 [263] laisvuosius radikalus.
Antioksidantinės antocianinų bei jų gliukozidų savybės daţniausiai priklauso nuo molekulės
struktūros ir pakaitų išsidėstymo. Atliekant antocianinų gebėjimo absorbuoti deguonies radikalus
(ORAC) tyrimus, nustatyta ši seka: cianidinas > delfinidinas > malvidinas ≈ peonidinas ≈
petunidinas. Manoma, kad didėjantis hidroksilo grupių skaičius molekulėje didina antioksidantinį
30
aktyvumą. Antocianinų B ţiede esanti O-dihidroksi struktūra suteikia radikalui didesnį stabilumą ir
dalyvauja elektrono pasidalijime, todėl dihidroksilinimas B ţiedo 3‗ ir 4‗ padėtyse turi įtakos
antioksidaciniam poveikiui (1 pav.).
Dvigubos jungties buvimas antocianinų C ţiede skatina elektrono delokalizaciją visoje
molekulėje siekiant stabilizuoti ariloksi radikalus dėl esančios konjugacijos. Antocianinų A ir C
ţieduose (C3 ir C5 padėtyse) esančios hidroksilo grupės reikalingos maksimaliam radikalus
surišančiam poveikiui. Lyginant antocianinų aglikonų cheminės struktūros ir poveikio ryšį,
pastebėta, kad skirtingi hidroksi ir metoksi grupių pakaitai turi įtakos antioksidantiniam poveikiui,
nors turi tą pačią struktūrą A ir C ţieduose. Antocianinų petunidino, malvidino ir peonidino B ţiede
ORAC reikšmės yra daug maţesnės lyginant su junginiais, turinčiais -OH pakaitus 3‘, 4‘ padėtyse.
Metoksi grupės buvimas 3‘ B ţiedo padėtyje maţina antioksidantinį poveikį [279]. Tiriant atskirų
aglikonų antioksidantines savybes, pastebėta, kad cianidino glikozidai pasiţymi stipresnėmis
antioksidantinėmis savybėmis negu peonidino ar malvidino glikozidai, kadangi cianidinas turi
laisvas hidroksilo grupes 3 ir 4 C ţiedo padėtyje [260].
Pereinamųjų metalų jonai atlieka svarbų vaidmenį Fentono ir Haber-Veiso reakcijų metu
formuojantis ypač reaktyviems hidroksilo radikalams. Fentono reakcijos metu susidariusios lipidų
peroksidazės (LOOH) suyra suformuodamos stiprius oksidantus, alkoksilo radikalus, sukeliančius
grandinines lipidų peroksidacijos reakcijas [69, 192]. Antocianinai pasiţymi gebėjimu surišti metalų
jonus ir sudaryti chelatinius junginius. Teigiama, kad tokiu būdu antocianinai veikia kaip
superoksido dismutazė, uţkerta kelią hidroksilo radikalams susidaryti ir taip apsaugo organizmą nuo
oksidacinio streso paţaidos [7, 33, 198].
Ksantino oksidazė yra svarbi oksidantiniam audinių paţeidimui. Ksantino dehidrogenazė ir
ksantino oksidazė dalyvauja ksantino metabolizme į šlapimo rūgštį. Ksantino dehidrogenazė yra
fermento forma, egzistuojanti fiziologinėmis sąlygomis, tačiau išemijos atveju virsta ksantino
oksidaze. Ksantino oksidazė yra ROS šaltinis. Reperfuzijos fazėje ksantino oksidazė reaguoja su
molekuliniu deguonimi ir taip suformuoja superoksido laisvuosius radikalus [190]. Nustatyta, kad
antocianinai inhibuoja ksantino oksidazę ir taip maţina superoksido radikalų formavimąsi [2, 190,
257].
NADPH oksidazės yra membranų fermentai, katalizuojantys vieno elektrono pernašą iš
NADPH į O2 formuojant superoksido radikalus. Tyrimuose su ţiurkėmis nustatyta, kad turinčio
antocianinų maisto vartojimas 6 savaites sumaţino širdies NADPH isšsiskyrimą [8]. Panašus
NADPH oksidazės aktyvumo sumaţėjimas pastebėtas neutrofiluose hemodializuojamų pacientų,
vartojusių koncentruotas raudonųjų vynuogių sultis dvi savaites [46]. Antocianinai, inhibuodami
NADPH oksidazes, maţina ROS generaciją ir apsaugo organizmą nuo oksidacinio streso ţalos.
31
Moksliniais tyrimais nustatyta, kad hidrofiliniai antioksidantai, pvz., askorbatas ir
glutationas, atlieka svarbų apsauginį vaidmenį saugodami lipofilinius antioksidantus (vitaminą E)
nuo oksidacijos [90]. Askorbo rūgštis taip pat padeda regeneruoti vitaminą E iš jo oksiduotos
formos. Tuo tarpu glutationas dalyvauja oksiduotos askorbato formos – dehidroaskorbato –
regeneracijoje į askorbatą, nors vitaminas C taip pat reikalingas oksiduotai glutationo formai
atstatyti [170, 177, 184]. Antocianinai atlieka tarpinį antioksidantinį vaidmenį apsaugodami
lipofilinius antioksidantus; be to, jie patys yra apsaugomi kitų hidrofilinių antioksidantų [7, 79].
Naujausių tyrimų duomenimis antioksidantinis antocianinų, kaip ir daugelio polifenolių,
veikimas gali pasireikšti ir netiesiogiai per antros fazės fermentus [53, 187]. Antros fazės fermentai
yra baltymai, kurių ekspresija koordinuojamai reguliuojama antioksidacinio atsako faktoriaus
(ARE), esančio atitinkamų genų aktyvatoriaus regione. Antocianinai skatina antros fazės fermentų
veiklą per ARE aktyvaciją, kadangi antros fazės fermentai atsakingi uţ ksenobiotikų ir elektrofilų
neutralizavimą bei detoksikavimą, tai tokių genų aktyvavimas gali apsaugoti nuo oksidacinio streso
[67, 120, 226].
1.3. Augalinių fenolinių junginių įtaka mitochondrijose vykstantiems procesams
Mitochondrijos yra eukariotinių ląstelių dvimembranės organelės, išsidėsčiusios
citoplazmoje ir ląstelėje atliekančios daugybę funkcijų, iš kurių pagrindinė yra ATP sintezė [165].
Mitochondrijos atlieka ir kitas svarbias funkcijas: sintetina hemą, lipidus, aminorūgštis, nukleotidus,
dalyvauja ureos cikle ir steroidinių hormonų sintezėje, dalyvauja intraląstelinio Ca2+
homeostazės
palaikyme, termogenezės procesuose [141, 221]. Naujesniais tyrimais nustyta, jog mitochondrijos
dalyvauja ir ląstelės ţūties procesuose apoptozės ar nekrozės būdu [4, 141, 150].
Mitochondrijų kvėpavimo grandinė yra sudėtinga oksidacijos-redukcijos fermentų ir
kofermentų sistema, esanti vidinėje mitochondrijų membranoje. Pagrindinė jos funkcija yra
laipsniškai išlaisvinti energiją iš redukuotų nukleotidų (NADH ir FADH2), kurie susidaro vykstant
glikolizei, riebalų rūgščių oksidacijai ir Krebso ciklo reakcijoms. Kvėpavimo grandinėje elektronai
pernešami nuo vieno jos komponento prie kito, elektronų nešikliams paeiliui oksiduojantis ir vėl
redukuojantis, o elektronų pernašos metu išsiskyręs didelis laisvosios energijos kiekis gali būti
panaudojamas ATP sintezei. Mitochondrijų elektronų pernašos grandinę sudaro daugiau kaip 80
polipeptidinių komponentų, kurie kartu grupuojami į 4 fermentų kompleksus. Tai NADH
dehidrogenazė (I kompleksas), sukcinato dehidrogenazė (II kompleksas), citochromų bc1
kompleksas (III kompleksas) ir citochromo c oksidazė (IV kompleksas). Į mitochondrijų kvėpavimo
grandinę elektronai patenka dviem keliais – per I kompleksą (nuo NADH) ir per II kompleksą (nuo
FADH2). Elektronus nuo I ir II komplekso perneša kofermentas Q ir perduoda III kompleksui, kurie
32
toliau pereina citochromui c – judriam elektronų nešikliui tarp kompleksų III ir IV. Citochromo c
oksidazė katalizuoja galutinį eklektronų pernašos mitochondrijų kvėpavimo grandine etapą, t. y.
deguonies redukcijos reakciją, kurios metu susidaro vanduo. Pagal prostetines grupes elektronų
nešikliai skirstomi į 5 tipus: flavoproteinus (jų molekulėse yra FAD ir FMN), citochromus (turinčius
hemą), ubichinoną (arba kofermentą Q), Fe-S baltymus ir baltymus, turinčius surištą Cu2+/+
joną [56,
220, 221].
Elektronų pernašos kvėpavimo grandine metu atsipalaidavusi energija saugoma
elektrocheminio protonų gradientų pavidalu ir didţiausia jos dalis panaudojama ATP sintezei.
Kadangi fosforilinimui reikalingą energiją teikia kvėpavimo grandinėje vykstantys oksidacijos-
redukcijos procesai, šis procesas vadinamas oksidaciniu fosforilinimu. ATP sintezę katalizuoja
sudėtingas vidinės membranos fermentas ATP sintezė, dar vadinama V kompleksu. ATP sintezės
efektyvumas priklauso nuo vidinės membranos laidumo jonams. Jei vidinės mitochondrijų
membranos vientisumas paţeistas, laidumas jonams didėja, tada oksidacinių procesų aktyvumas
padidėja, o fosforilinimo – sumaţėja. Oksidacijos ir fosforilinimo procesų apjungimo sutrikimas
vadinamas oksidacijos ir fosforilinimo procesų atskyrimu. Atskyrimą gali sukelti tam tikri cheminiai
junginiai, vadinami skyrikliais. Daţniausiai tai rūgštinių savybių hidrofobiniai junginiai. Tipiški
skyrikliai yra DNP ir CCCP [26, 56, 217]. Skyrikliams veikiant, elektronai pernešami kvėpavimo
grandine deguoniui, bet ATP sintezė nevyksta.
Oksidacijos-redukcijos proceso metu elektronai pernešami mitochondrijų kvėpavimo
grandine deguoniui, kuris prisijungia keturis elektronus ir keturis protonus ir virsta vandeniu. Tačiau
apie 1-5 proc. mitochondrijų kvėpavimo grandine pernešamų elektronų nesuformuoja vandens
molekulių su deguonimi. Dauguma šių „prarastų― elektronų tarpinėje kvėpavimo grandinės dalyje
sąlygoja superoksido radikalų generaciją, pagrindinį ląstelinį aktyvių deguonies formų (ROS) šaltinį
daugelyje audinių. Mitochondrijų generuoti ROS dalyvauja daugelyje degeneracinių procesų, pvz.,
senėjimo, nekrozinės ar apoptozinės ląstelės ţūties. ROS taip pat siejamos su aterosklerozės,
Alzheimerio, Parkinsono ligos, daugelio širdies ir kraujagyslių patologijų [115, 213].
Mitochondrijose susidaręs •O2¯ radikalas, intramitochondrinės Mn-superoksido dismutazės
verčiamas į H2O2; jo nustatymas naudojamas kaip mitochondrinių ROS generacijos indikatorius.
Esant laisviems Fe2+
jonams, H2O2 generuoja labai aktyvius HO• laisvuosius radikalus. Neseniai
mitochondrijose nustatyta azoto oksido sintezė, kuri leidţia organelei generuoti NO• L-arginino
oksidacijos metu [41, 237, 244]. Šis radikalas moduliuoja kvėpavimą ir ATP sintezę inhibuodamas
citochromo oksidazę. NO• gali jungtis su •O2¯ ir formuoti kitą aktyvųjį ONOO¯ radikalą, kuris gali
negrįţtamai inhibuoti mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksus [149]. Manoma, kad
pagrindinis veiksnys, skatinantis ROS ir RNS susidarymą, yra didelis ΔμH+ [221]. Norint sumaţinti
33
ΔμH+, galima panaudoti skyriklius. Manoma, kad flavonoidai gali veikti kaip skyrikliai, pernešdami
protonus per vidinę mitochondrijų membraną ir taip maţindami ΔμH+ [213] bei ROS generaciją.
Tyrimai parodė, kad kai kurie flavonoidai (kvercetinas, hiperozidas, rutinas, kvercitrinas ir kt.), ar
juos kaupiančių augalų ekstraktai (ginkmedţio, gudobelės) atskiria oksidacijos ir fosforilinimo
procesus ţiurkės širdies mitochondrijose ir maţina membraninį potencialą [23, 250, 251] bei ROS
generaciją mitochondrijose [23].
Mokslinių tyrimų duomenimis flavonoidai gali moduliuoti mitochondrijų funkciją per
redokso mechanizmus [4]. Tikėtina, jog polifenoliniai junginiai, pvz., flavonoidai, gali reaguoti su
mitochondrijų redokso centrais ir nukreipti ar sumaţinti elektronų srautą kvėpavimo grandinėje.
Dauguma tirtų junginių veikė arba inhibuojančiai, arba visai neveikė mitochondrijų kvėpavimo
grandinės I ir II kompleksų [98, 99]. NADH-oksidazę slopinantis poveikis priklauso nuo flavonoidų
struktūros ypatumų [214, 215]. Palyginus su NADH-oksidaze, sukcinatdehidrogenazė daug maţiau
jautri inhibuojančiam flavonoidų poveikiui, tačiau antocianinai atvirkščiai – pasiţymi didesniu
poveikiu sukcinatdehidrogenazei [92, 213]. Taip pat nustatyta, jog kai kurie flavonoidai gali
inhibuoti daugelį ATPazių, taip pat ir ATP sintezę (V kompleksą). Vėlesni ex vivo ir in vitro tyrimai
parodė, kad flavonai (morinas, kvercetinas) pasiţymi stipriausiomis inhibicinėmis savybėmis [213,
278]. Manoma, kad šiuo atveju redokso potencialas nėra lemiantis veiksnys ir kiti mechanizmai yra
atsakingi uţ šią inhibiciją. Viena iš hipotezių teigia, kad flavonoidai savo struktūros panašumu su
adenozino pakaitu gali rungtis dėl ADP/ATP prisijungimo vietos ATP sintezėje [49]. Kadangi
flavonoidai pasiţymi rūgštinėmis savybėmis ir yra iš dalies hidrofobinės medţiagos, tai jie gali
veikti kaip kvėpavimą nuo fosforilinimo atskiriantys veiksniai (kaip skyrikliai), tokiu būdu galintys
dalyvauti metaboliniuose reguliacijos procesuose [219, 256]. Flavonoidų protonizuotos formos,
cikliškai pernešdamos protonus per mitochondrijų vidinę membraną, disocijuoja šarminiame
matrikse. Išlaisvinusios protonus, jų jonizuotos formos dėl membranos potencialo skirtumo
išstumiamos į išorę, kur vėl prisijungia protonus [256].
Manoma, kad flavonoidai dėl teigiamo antioksidantinio poveikio gali turėti įtakos
intramitochondrinei redokso būklei. Daugybe in vitro tyrimų įrodyta, kad flavonoidai gali apsaugoti
nuo lipidų peroksidacijos, indukuotos mitochondrijose tiek fermentinių, tiek nefermentinių šaltinių
[73, 89, 207]. Tikėtina, kad flavonoidai veikia ne tik surišdami laisvuosius radikalus, bet ir I
komplekso aktyvumą. Flavonoidai taip pat gali veikti anioksidantines sistemas, esančias
mitochondrijose ir padedančias apsisaugoti nuo susidariusių laisvųjų radikalų. Nustatyta, jog
flavonoidai moduliuoja tiek citozolinio, tiek mitochondrijų SOD fermentų ekspresiją [138, 140].
Taip pat nustatyta, kad flavonoidai pagreitina ląstelių susinaikinmą – apoptozę (programuotą ląstelių
ţūtį). Manoma, kad tai susiję su citochromo c atsipalaidavimu iš mitochondrijų sumaţėjus
34
membraniniam mitochondrijų potencialui. Dėl to suaktyvinama prokaspazės 9, kurios aktyvina
kaspazes 3 ir paleidţia tolimesnę vykdančiųjų kaspazių kaskadą [4, 80].
Mitochondrijos yra vienos svarbiausių ląstelių organelių, kuriose vyksta daugybė procesų,
lemiančių ląstelės gyvybingumą, taigi, bet kokie mitochondrijų funkcijų sutrikimai gali sukelti
įvairius susirgimus. Jos tarnauja kaip svarbūs įvairių metabolinių kelių centrai, dalyvauja ląstelės
apoptoziniuose bei nekroziniuose procesuose, tačiau pagrindinė jų funkcija – ATP sintezė. Nors
antocianinai yra viena didţiausių flavonoidų grupių, pasiţyminčių plačiu farmakologinio poveikio
spektru, tačiau duomenų apie antocianinų poveikį mitochondrijoms nėra daug. Antocianų poveikio
įvertinimas mitochondrijose vykstantiems procesams yra svarbus veiksnys, ieškant naujų biologiškai
aktyvių junginių apsaugančių ląsteles nuo paţaidos.
35
2. TYRIMŲ OBJEKTAS IR METODAI
2.1 Tyrimų objektas
Tyrimų objektas – natūraliai augančių V. myrtillus L vaisiai. Cheminės sudėties
įvairavimo, sudėties kitimo dinamikos tyrimams naudotą ţaliavą sudarė mėlynių vaisių pavyzdţiai
surinkti iš įvairiuose Lietuvos regionuose esančių V. myrtillus L gamtinių cenopopuliacijų (3 pav.).
Vaisių ėminiai (50 - 100 g) buvo surinkti iš 75 cenopopuliacijų 2005 – 2007 metais (3 lentelė).
Cheminės sudėties tyrimams naudoti sodinių šilauogių (V. corymbosum auct. non L.) veislių
„Heerma―, „Rancocas―, „Bluecrop―, „Ama―, „Northblue―, „Berkeley―, „Northland―, „Dixi, „Putte―,
„North holna―, „Northcountry―, „Patriot― vaisiai, taip pat tyrimams naudoti ir siauralapės
(V. angustifolium Aiton) šilauogės bei siauralapės šilauogės veislės „Chignecto― vaisiai. Šilauogių
vaisių bandiniai buvo surinkti Botanikos instituto lauko kolekcijose, Vilniuje 2006 –2007 m.
Surinkti vaisių pavyzdţiai nedelsiant uţšaldyti ir laikyti -18 ± 1 °C temperatūroje.
3 pav. Vaccinium myrtillus L. vaisių ţaliavų rinkimo vietos gamtinėse cenopopuliacijose, 2005 –
2007
36
3 lentelė. Vaccinium myrtillus L. vaisių ėminių rinkimo laikas ir augavietės
Au
gavie
tės
Eil
.
Nr.
Rinkimo data
Augavietė
Rajonas
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
2006 07 11
2006 07 11
2006 07 11
2006 07 11
2006 08 03
2006 07 10
2006 07 13
2006 07 10
2006 08 19
2006 07 11
2006 07 10
2006 07 20
2006 07 13
2006 07 11
2006 08 03
2006 07 11
2006 07 11
2006 07 11
2006 07 13
2006 07 13
2006 07 14
2006 06 29
2006 07 16
2005 08 03
2005 08 03
2005 08 03
2005 08 25
Bobriškių miškas
Gemaitiškių miškas
Krikštonių miškas
Ryliškių miškas
Panerių miškas
Prienų šilas
Druskininkų miškas
Degsnės miškas
Varnėnų miškas
Merkinės miškas
Puzonių miškas
Gailiūnų miškas
Jurašiškės miškas
Noškūnų miškas
Darbėnų miškas
Girulių miškas
Vėţaitinės miškas
Skliausčių miškas
Kiršių miškas
Birţuvėnų miškas
Kvėdarnos miškas
Grišlaukės miškas
Vaineikių miškas
Cijūniškės miškas
Vainiūnų miškas
Rėkyvos miškas
Onuškio miškas
Varėnos
Alytaus
Lazdijų
Alytaus
Vilniaus
Prienų
Varėnos
Prienų
Ignalinos
Varėnos
Prienų
Vilniaus
Lazdijų
Alytaus
Kretingos
Klaipėdos
Klaipėdos
Telšių
Telšių
Telšių
Šilalės
Kretingos
Kretingos
Lazdijų
Lazdijų
Šiaulių
Trakų
37
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
2005 07 27
2005 07 09
2006 07 12
2006 07 17
2005 08 03
2005 07 09
2005 08 03
2006 08 08
2006 07 10
2006 07 27
2006 07 08
2006 08 11
2006 08 04
2006 07 30
2006 08 18
2006 08 18
2006 07 21
2005 08 25
2005 07 09
2005 07 09
2005 07 09
2007 07 09
2007 08 16
2007 08 02
2007 07 24
2007 07 25
2007 06 30
2007 07 09
2007 07 25
2007 06 14
2007 07 09
2007 07 09
2007 07 09
Ilgininkų miškas
Kapčiamiesčio miškas
Kapčiamiesčio miškas
Virbališkių miškas
Lekečių miškas
Merkinės miškas
Valkininkų miškas
Lenkaičių miškas
Auštkalvių miškas
Vainagių miškas
Kalnų miškas
Juodkrantės miškas
Gailiūnų miškas
Daugėliškių miškas
Panerių miškas
Rumšiškių miškas
Maksimų miškas
Raudonbalio miškas
Prienu šilas
Merkinės miškas
Darbėnų miškas
Bobriškių miškas
Uţtrakių miškas
Streipūnų miškas
Puzonių miškas
Valkininkų miškas
Obelijos miškas
Degsnės miškas
Marcinkonių miškas
Punios šilas
Perlojos miškas
Dirmiškės miškas
Krikštonių miškas
Lazdijų
Lazdijų
Lazdijų
Kupiškio
Šakių
Varėnos
Varėnos
Plungės
Kretingos
Šiaulių
Ukmergės
Klaipėdos
Vilniaus
Raseinių
Trakų
Kaišiadorių
Varėnos
Šalčininkų
Prienų
Varėnos
Kretingos
Varėnos
Trakų
Trakų
Prienų
Varėnos
Alytaus
Prienų
Varėnos
Alytaus
Varėnos
Alytaus
Lazdijų
38
2.2 Tyrimų metodai
Šilauogių ir mėlynių vaisių ekstrakto paruošimas. Antocianinų kiekio nustatymui
grūstuvėje sutrinama 50,0 g šaldytų vaisių. Atsveriama 5,00 g sutrintų vaisių, uţpilama 95 ml
metanolio tirpalu ir ekstrahuojama 10 min. ultragarso vonioje. Gautas vaisių ekstraktas filtruojamas
per popierinį filtrą į 100 ml matavimo kolbą ir praskiedţiamas 100 proc. metanoliu iki ţymės [63].
V. myrtillus L. vaisių sausojo ekstrakto poveikio širdies mitochondrijų funkcijai tyrimams
naudotas etanolinis ekstraktas, gautas mėlynių vaisių ţaliavą ekstrahuojant 50 proc. etanoliu (1:10)
maceracijos metodu. Vandeninis vaisių ekstraktas gautas reperkoliacijos metodu ekstrahuojant
augalinę ţaliavą vandeniu (1:10). Mėlynių vaisių sausieji ekstraktai gauti iš vandeninio ekstrakto ir
iš etanolinio ekstrakto nugarinus etanolį ir liofilizuojant gautą vandeninį tirpalą. Ekstraktai buvo
uţšaldomi ant sublimacijos indų paviršiaus 1 cm storiu liofilizatoriaus Freeze Dryer FD8512S
(ilShin® Europe, Ede, Nyderlandai) rotaciniame uţšaldymo modulyje ir dţiovinami šiame
liofilizatoriuje 5 militorių slėgyje (kondensatoriaus temperatūra – 85 °C).
Antocianinų suminio kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu Analizei atsimatuojama
1 ml paruošto ekstrakto, kuris praskiedţiamas metanoliu, parūgštintu 0,1 proc. vandenilio chlorido
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
2007 07 09
2007 07 09
2007 07 09
2007 07 09
2007 07 09
2007 07 09
2007 07 09
2007 07 10
2007 07 10
2007 07 25
2007 07 07
2007 07 14
2007 07 07
2007 07 24
2007 07 28
Valkininkų miškas
Merkinės miškas
Veţionių miškas
Adutiškio miškas
Varėnos miškas
Norūnų miškas
Ryliškių miškas
Birštono miškas
Nedzingės miškas
Bičionių miškas
Gulbino miškas
Ţalioji giria
Storių miškas
Naudţiūnų miškas
Dubičių miškas
Varėnos
Varėnos
Varėnos
Švenčionių
Varėnos
Alytaus
Alytaus
Prienų
Varėnos
Anykščių
Šiaulių
Panevėţio
Anykščių
Prienų
Varėnos
39
rūgštimi, matavimo kolboje iki 50 ml. Absorbcijos dydis matuojamas 528 nm bangos ilgyje,
palyginamasis tirpalas – 0,1 proc. vandenilio chlorido rūgšties tirpalas metanolyje. Naudojama 1 cm
storio kiuvetė. Antocianinų kiekis vaisiuose nustatomas UNICAM „Helios α―spektrofotometru.
Rezultatai perskaičiuojami cianidin–3–gliukozidu ir išreiškiami procentais [63]:
,718
5000
m
Ax
čia: 718 – cianidin-3-gliukozido absorbcija prie 528 nm. bangos ilgyje;
A – absorbcijos dydis 528 nm bangos ilgyje;
m – ţaliavos masė, g.
Antocianinų hidrolizė. Į 25 ml ekstrakto, gauto ekstrakcijos metu, įpilama 8,5 ml koncentruotos
vandenilio chlorido rūgšties ir kaitinama vandens vonioje su grįţtamuoju šaldytuvu 2 valandas.
Naudoti reagentai. Tyrimų metu naudoti chemiškai švarūs reagentai, gradientinio švarumo
eliuentai ir ESC grynumo etaloniniai junginiai įsigyti iš šių gamintojų: „Sigma-Aldrich Chemie―
(Šveicarija), „Carl Roth Gmbh― (Vokietija), „Fluka Chemie― (Šveicarija), „ChromaDex― (JAV),
„Lachema― (Čekija), „Roth― (Vokietija).
Chromatografinė analizė. Antocianidinų nustatymui ESC metodu atsimatuojama 2 ml gauto
ekstrakto po rūgštinės hidrolizės, skiedţiama metanoliu iki 10 ml ir filtruojama pro membraninį,
0,22 µm porų dydţio filtrą (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Vokietija). Analizė atlikta chromatografu
Waters 2690 su dviem detektoriais: Waters 2487 UV/Vis ir Waters 996 PDA (Waters, Milford,
JAV). Kolonėlė SUPELCO HYPERSIL ODS (C18) 100×3 mm, su prieškolonėle, sorbento dalelių
dydis – 3 μm. Detekcija atliekama 520 nm bangos ilgyje. Injektuojama 10 µl tiriamojo ekstrakto.
Tėkmės greitis - 1ml/min, eliuavimas - gradientinis. Eliuentas A – acetonitrilas (ACN), eliuentas B –
4 proc. ortofosfato rūgštis (H3PO4). Naudotas gradiento kitimas: 0 min – 7 proc. A (93 proc. B), 37
min – 25 proc. A (75 proc. B), 40 min – 7 proc. A (93 proc. B), 45 min – 7 proc. A (93 proc. B).
Analizė atliekama kambario temperatūroje. Atocianidinų tapatybė nustatoma lyginant analičių
sulaikymo trukmes su etaloninių junginių sulaikymo trukmėmis ir spektrais, gautais su PDA
detektoriumi. Kiekybiniam nustatymui sudaryti antocianidinų etaloninių junginių kalibraciniai
grafikai. Etaloniniai junginiai tirpinti metanolyje ir jų tirpalai paruošti apytikrėse analičių kiekiui
bandinių ekstraktuose koncentracijų ribose.
Antioksidantinio aktyvumo nustatymas. Naudojamas DFPH metodas – fotometrinis 2,2–
difenil–1–pikrilhidrazilo (DFPH˙) laisvojo radikalo sujungimo metodas. Antioksidantinis aktyvumas
įvertinamas matuojant, kiek procentų stabilaus DFPH radikalo neutralizuoja tiriamojoje medţiagoje
esantys ir antioksidantiniu aktyvumu pasiţymintys junginiai. Antioksidanto (tiriamojo ekstrakto) 50
μl metanolinio tirpalo sumaišoma 1 cm kiuvetėje su 2 ml 6×10-5
M metanolinio DFPH tirpalo.
40
Spektrofotometru išmatuojamas mėginių absorbcijos dydţio maţėjimas 515 nm bangos ilgyje kas 10
s., kol pasiekiama absorbcijos dydţio pusiausvyra (apytiksliai po 30 min.). Antioksidantinis tirpalų
aktyvumas išreiškiamas inaktyvuoto DFPH procentais:
,100
A
AAb
abDPPH
čia: Ab – tuščio bandinio adsorbcijos dydis (t = 0 min.);
Aa – bandinio su tiriamuoju tirpalu absorbcijos dydis (po 30 min.).
Nuodţiūvio nustatytas Europos farmakopėjos nurodytu metodu [63]. Cheminių tyrimų
duomenys perskaičiuoti absoliučiai sausai ţaliavai įvertinant gautus bandinių nuodţiūvio duomenis.
Mitochondrijų išskyrimas. Mitochondrijos iš Wistar ţiurkių patinėlių širdţių buvo išskiriamos
diferencinio centrifugavimo metodu 0-4 °C temperatūroje. Širdis praplaunama šaltu (4º C) tirpalu,
pasveriama, susmulkinama ţirklutėmis ir 45 sekundes stiklo-teflono homogenizatoriuje
homogenizuojama šaltoje (4C) terpėje (10 ml/g audinio), kurios sudėtis: 180 mM KCl, 10 mM
Tris-HCl, 1 mM EGTA, pH 7,7. Homogenatas centrifuguojamas 750 g greičiu 5 min., esant 4 C
temperatūrai, naudojant Centrifuge 5810R (Eppendorf AG, Vokietija) Gautas supernatantas
perkošiamas per marlę ir centrifuguojamas dar kartą 6800 g greičiu 10 min. Gautos mitochondrijų
nuosėdos suspenduojamos 150 μl suspendavimo terpės, kurios sudėtis: 180 mM KCl, 20 mM Tris-
HCl, pH 7,35.
Mitochondrijų baltymo kiekio nustatymas Biureto metodu. Baltymo kiekis
mitochondrijų suspensijoje nustatomas modifikuotu Biureto metodu [75]. Į 0,05 ml mitochondrijų
suspensijos įpilama 0,95 ml 0,33 proc. dezoksicholato tirpalo, gerai sumaišoma ir 5 min.
inkubuojama vandens termostate 37 C temperatūroje. Po to įpilama 4 ml biureto reagento,
sumaišoma ir inkubuojama vandens termostate 37 C 15 min. Gauto tirpalo optinis tankis
matuojamas spektrofotometru Hitachi 557(Hitachi, Japonija) esant 540 nm bangos ilgiui. Baltymo
kiekis surandamas pagal kalibracinę kreivę, kuriai sudaryti naudojamas standartinis baltymo tirpalas,
pagamintas iš ţmogaus serumo albumino. Mitochondrijų suspensija (50 mg/ml baltymo) buvo
laikoma leduose viso eksperimento metu.
Mitochondrijų kvėpavimo matavimas. Mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo matuojamas
termostatuojamoje kiuvetėje su Klarko tipo deguonies elektrodu (Radiometer, Danija) su poligrafine
sistema BioMed, 37C temperatūroje 1,5 ml matavimo terpėje, kurios sudėtis: 150 mM KCl, 10 mM
Tris-HCl, 5 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, pH 7,2, su substratais: 1) 5 mM piruvato ir 5 mM malato
41
arba 2) 15 mM sukcinato (+2 mM amitalio). Ištirpusio deguonies kiekis terpėje laikomas 420
nmolO/ml. Mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje (V2) buvo
registruojamas į terpę pridedant 0,5 mg/ml mitochondrijų ir atitinkamo substrato, o pridėjus 1 mM
ADP buvo registruojamas mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje (V3) (4
pav.). Pridėjus 0,12 mM atraktilozido, kuris yra ADP/ATP-nešiklio inhibitorius, registravome
mitochondrijų kvėpavimo greitį ketvirtoje metabolinėje būsenoje (VATR). Mitochondrijų išorinės
membranos intaktiškumui įvertinti atlikome citochromo c testą, į terpę pridėdami 32 μM citochromo
c (VATR+cyt c) [247] ir įvertindami, kokiu laipsniu citochromas c stimuliuoja kvėpavimą.
Mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas (KKK) apskaičiuojamas pagal deguonies
suvartojimo greitį trečioje ir antroje metabolinėse būsenose (KKK = V3/V2). Matuojant nuo
fosforilinimo atskirtą mitochondrijų kvėpavimo greitį, vietoj ADP į matavimo terpę buvo pridedama
0,19 μM karbonilcianido-m-chlorofenilhidrazono (CCCP). Veikiant CCCP, elektronai pernešami
kvėpavimo grandine deguoniui, bet ATP sintezė nevyksta. Mitochondrijų kvėpavimo greitis
išreikštas nmolO/min/mg mitochondrijų baltymo.
4 pav. Širdies mitochondrijų kvėpavimo (deguonies suvartojimo) registravimo kreivė, oksiduojant
mitochondrijoms piruvatą + malatą. Mitochondrijų kvėpavimas buvo registruojamas standartinėje
mitochondrijų kvėpavimo matavimo terpėje. Substratai: 5 mM piruvato + 5 mM malato. Priedai: O-
mitochondrijos (0,5 mg baltymo/ml); A1- 1 mM ADP; A2- 0,12 mM atraktilozido; A3 - 32 µM
citochromo c.
Paaiškinimas: į matavimo terpę įvedus 0,5 mg/ml mitochondrijų ir substratą, registruojama antroji
mitochondrijų metabolinė būsena (būsena, kai terpėje yra deguonies, oksiduojamo substrato ir
mitochondrijų). Į terpę įvedus prisotinančią ADP (200 μM-1mM) koncentraciją, mitochondrijos pereina
į trečiąją metabolinę būseną (V3), nes ATP sintazė pradeda fosforilinti ADP, naudodama membraninį
42
potencialą. Pridėjus atraktilozido, kuris yra ADP/ATP-nešiklio inhibitorius, mitochondrijos pereina į
ketvirtą metabolinę būseną (VATR). Mitochondrijų kvėpavimo greičio stimuliavimas pridėjus į terpę
citochromo c, rodo mitochondrijų išorinės membranos intaktiliškumą arba citochromo c redukciją.
Svarbus rodiklis yra mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas (KKK, angl. RCI, respiratory
control index). Jis nustatomas pagal deguonies sunaudojimo greitį trečioje ir antroje metabolinėse
būsenose (KKK = V3/V2) ir atspindi mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo pajėgumą, tai yra
pajėgumą sintetinti ATP. Kuo didesnis mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas, tuo yra geresnė
mitochondrijų funkcinė būsena.
Tiriant mėlynės vaisių sausojo ekstrakto poveikį mitochondrijoms, uţregistravus
mitochondrijų kvėpavimo greitį antroje metabolinėje būsenoje, vandeniniai ir etanoliniai ekstraktai
(3,5 mg) ištirpinti 100 μl vandens) į matavimo kiuvetę buvo pridedami skirtingais kiekiais
(vandeninis ekstraktas: 1 μl; 2,5 μl; 5 μl; 10 μl; 15 μl; 20 μl; 30 μl ir 60 μl į 1,5 ml matavimo terpės;
etanolinis ekstraktas: 0,5 μl; 1 μl; 5 μl; 10 μl; 20 μl ir 30 μl į 1,5 ml matavimo terpės) ir toliau buvo
registruojamas mitochondrijų kvėpavimas. Antocianidinų kiekiai esantys 1-ame mililitre kiuvetės
pateikiami 4 ir 5 lentelėse. Etaloninių junginių (antocianininų) mišinys paruoštas tirpinant juos
vandenyje. Antocianinų kiekis 1-ame μl mišinio buvo: cianidin-3-galaktozido 0,96 μg, malvidin-3-
galaktozido 0,45 μg ir malvidin-3-gliukozido 1,17 μg.
4 lentelė. Antocianidinų kiekiai ng/ml, įdėjus skirtingus kiekius liofilizuoto vandeninio mėlynių
vaisių ekstrakto(MVE) į 1,5 ml matavimo terpės.
Ekstrakto
kiekis, µl
Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas
Kiekis, ng/ml
1
2,5
5
10
15
20
0,140
0,349
0,698
1,396
2,094
2,792
0,361
0,903
1,805
3,610
5,415
7,220
0,215
0,537
1,074
2,147
3,221
4,294
0,150
0,376
0,752
1,503
2,255
3,01
0,314
0,785
1,570
3,140
4,710
6,280
43
30
60
4,188
8,376
10,830
21,660
6,441
12,882
4,509
9,018
9,420
18,840
5 lentelė. Antocianidinų kiekiai ng/ml, įdėjus skirtingus kiekius liofilizuoto etanolinio mėlynių vaisių
ekstrakto (EME) į 1,5 ml matavimo terpės.
Ekstrakto
kiekis, µl
Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas
Kiekis, ng/ml
0,5
1
5
15
20
30
0,088
0,175
0,875
2,625
3,500
5,250
0,399
0,797
3,985
11,955
15,94
23,91
0,129
0,258
1,290
3,870
5,160
7,740
0,096
0,191
2,865
3,820
3,820
5,730
0,138
0,276
1,380
4,140
5,520
8,280
Tyrimų duomenų statistinis įvertinimas. Statistiniam gautų duomenų apdorojimui ir
įvertinimui matematiniais-statistiniais metodais naudotas SPSS 17 (SPSS Inc., Čikaga, JAV)
statistinis paketas. SPSS pagalba apskaičiuota eksperimentinių tyrimų duomenų padėties ir sklaidos
(išsibarstymo) charakteristikos. Grafiniam gautų rezultatų pavaizdavimui naudota MS Excel
(Microsoft, JAV) kompiuterinė programa. Hierarchinės klasterinės analizės metodas pritaikytas
Vaccinium myrtillus L. gamtinių cenopopuliacijų bei skirtingų šilauogės veislių pavyzdţių
panašumo įvertinimui ir palyginimui pagal antocianidinų kiekius tiriamuose pavyzdţių grupėse.
Duomenų jungimui naudotas tolimiausio kaimyno klasterizavimo algoritmas, panašumo matu
naudojant euklidinį atstumą. Imčių normalumo prielaida tikrinama panaudojant Shapiro-Wilk‗o
testą. Cheminių poţymių skirtumų palyginimui skirtinguose Lietuvos regionuose surinktuose
Vaccinium myrtillus L. ėminiuose bei ėminiuose, rinktuose skirtingose šalyse ir tirtų šilauogių
veislių pavyzdţiuose skirtinguose klasterinės analizės pogrupiuose taikyti ranginiai Mann‗o
Whitney‗o (2 grupių atveju) ir Kruskal‘o Wallis‘o (3 ir daugiau grupių atvejų) testai. Taikant
daugkartinių porinių palyginimų Dunn‘o testą nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp atskirų
44
lyginamų duomenų grupių pagal atitinkamo antocianidino kiekius. Pritaikius blokuotų duomenų
vienfaktorinę dispersinę analizę, nustatytas atskirų antocianidinų statistiškai reikšmingas kitimas
laiko atţvilgiu. Vaccinium myrtillus L. ekstrakto poveikio širdies mitochondrijų funkcijai tyrimuose
gautų rezultatų vidurkiai pateikiami su standartinėmis paklaidomis, o skirtumai tarp vidurkių
įvertinti Stjudento t kriterijumi poriniams bandymams.
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
45
3.1. Vaccinium L. genties augalų vaisių antocianinų ir antocianidinų sudėties ir
kiekybinių rodiklių įvairavimo vertinimas
3.1.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos sukūrimas Vaccinium myrtillus L.
vaisių vaistinių augalinių ţaliavų antocianidinų kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimui
Šiuolaikinių, patikimų analizės metodų taikymas yra būtinas siekiant uţtikrinti vartojamų vaistinių
augalinių ţaliavų bei gaunamų fitopreparatų kokybės kontrolę bei atliekant cheminės sudėties
įvairovės tyrimus. Siekiant efektyviai išskirstyti, patikimai identifikuoti ir tiksliai įvertinti veikliųjų
junginių kiekinę sudėtį svarbu pasirinkti jautrius ir informatyvius metodus. Atrankių metodikų
kūrimas ir pritaikymas yra vienas iš svarbiausių šiuolaikinio mokslo uţdavinių.
Ekstrakcijos metodo optimizavimas. Ekstrakcijos tirpiklio poliškumo bei ekstrakcijos metodo
parinkimas yra svarbus pradinis ţingsnis optimizuojant augalinių ţaliavų ekstrakcijos sąlygas.
Daţniausiai antocianinų ekstrakcijai yra naudojama metanolis ir etanolis bei jų mišiniai su vandeniu.
Antocianinai neutralioje ar šariminėje aplinkoje yra nestabilūs, todėl pridedami nedideli vandenilio
chlorido, acto, citrinų, skruzdţių, vyno ar trifluoracto rūgšties kiekiai pagerinantys antocianinų
stabilumą [48, 55, 268, 277]. Atliekant tyrimus gautuose ekstraktuose esantys antocianinai buvo
hidrolizuojami.
Vertinant tirpiklio poliškumo įtaką antocianinų išeigai buvo taikytas maceracijos metodas,
suminį antocianinų kiekį nustatant spektrofotometriniu metodu. Tirta antocianinų ekstrakcijos išeiga
ekstrahuojant metanoliu ir etanoliu bei jų mišiniais su vandeniu. Tyrimams buvo naudotos 30, 50, 70,
96 proc. (v/v) etanolio koncentracijos. Vertinant etanolio ir vandeninių jo tirpalų įtaką ekstrakcijos
išeigai nustatyta, jog 50 proc. (v/v) etanolinis tirpalas uţtikrina didţiausią antocianinų kiekio išeigą
(1,421 proc.). Vertinant metanolio ir įvairių jo mišinių su vandeniu (30, 50, 70 proc. (v/v)) įtaką
ekstrakcijos išgavai nustatyta, kad didţiausia antocianinų išeiga (2,184 proc.) gaunama ekstrakcijos
tirpikliu naudojant 100 proc. metanolį. Suminiai antocianinų kiekiai mėlynių vaisių ekstraktuose
pateikti 5 ir 6 pav. Ekstrahuojant vandeniu, gauta maţiausia antocianinų išgava. Suminis antocianinų
kiekis tirtuose ţaliavų pavyzdţiuose ekstrakcijos tirpikliu naudojant vandenį siekė tik 0,710 proc.
46
5 pav. Suminis antocianinų kiekis Vaccinium myrtillus L. vaisių ėminiuose, ekstrakcijai naudojant,
įvairių koncentracijų etanolį (n=3)
6 pav. Suminis antocianinų kiekis Vaccinium myrtillus L. vaisių ėminiuose, ekstrakcijai naudojant,
įvairių koncentracijų metanolį (n=3)
Remiantis gautais rezultatais, tolimesniuose tyrimuose vertinta ekstrakcijos trukmės įtaka
antocianinų išgavai mėlynių vaisiuose. Ekstrakcijos efektyvumo palyginamiesiems tyrimams
pasirinkta: maceracijos ir modifikuotos maceracijos metodai augalinę ţaliavą veikiant ultragarsu,
ekstrakcijos tirpikliu naudojant 100 proc. metanolį. Įvertinta antocianinų ekstrakcijos išeiga mėlynių
vaisių pavyzdţius maceruojant skirtingais laiko intervalais (0,25, 0,5, 1, 2, 24 val.).
47
Nustatyta, jog maceracijos metodo efektyvumas didėja ilgėjant ekspozicijos laikui (7 pav.).
Didţiausias antocianinų kiekis gautas ekstrahuojant maceracijos metodu 24 valandas (2,525 proc.).
Vertinant ekstrakcijos ultragarso vonelėje efektyvumą, bandiniai buvo ekstrahuojami skirtingais laiko
intervalais (5, 10, 20, 30, 60 min.). Suminė antocianinų išgava, gauta veikiant ultragarsu skirtingais
laiko intervalais pateikta 8 pav. Nustatyta, kad bandinius veikiant 10 minučių ultragarsu gauta
didţiausia ekstrakcijos išeiga (3,461 proc.). Ilginant ultragarsinės ekstrakcijos ekspozicijos laiką,
antocianinų išgava sumaţėja, todėl tolimesniems tyrimams pasirinkta 10 min. trunkanti ekstrakcija
ultragarso vonelėje, kambario temperatūroje.
7 pav. Suminis antocianinų kiekis Vaccinium myrtillus L. vaisių ėminiuose, ekstrahuojant
maceracijos metodu (n=3)
8 pav. Suminis antocianinų kiekis Vaccinium myrtillus L. vaisių ėminiuose, ekstrahuojant
modifikuotos maceracijos metodu ultragarso vonelėje (n=3)
48
Antocianinų rūgštinės hidrolizės optimizavimas. Literatūros duomenimis V. myrtillus L.
vaisių ekstraktuose nustatyta daugiau kaip 15 antocianinų [106]. Išskirti, identifikuoti ir įvertinti
kiekybiškai antocianinų kompleksą mėlynių vaisių ekstraktuose ESC metodu yra sudėtinga todėl,
kad daugelio etaloninių junginių rinkoje nėra. Atlikti masių spektroskopijos tyrimai parodė, kad
efektyvus antocianinų išskirstymas vienoje ESC gradientinėje eliucijoje yra labai sudėtingas ir tai
gali turėti įtakos suminio antocianinų kiekio skaičiavimo tikslumui [106]. Siekiant tiriamus
junginius efektyviai išskirstyti ir identifikuoti pasirinkta rūgštinė hidrolizė. Rūgštinės hidrolizės
metu hidrolizavus glikozidus, mėlynių vaisiuose nustatomi 5 antocianidinai (delfinidinas, cianidinas,
petunidinas, peonidinas, malvidinas). Antocianidinus galima efektyviai išskirstyti, identifikuoti ir
kiekybiškai įvertinti.
Antocianidinų hidrolizės išeiga vertinta panaudojant skirtingus 35 proc. vandenilio chlorido
rūgšties kiekius (4, 6, 8,5, 10 ml). Įvertinta antocianidinų išeiga hidrolizuojant glikozidus vandenilio
chlorido rūgštimi 2 valandas. Nustatyta, jog pridėjus 8,5 ml vandenilio chlorido rūgšties gaunamas
didţiausias suminis antocianidinų kiekis (2,572 proc.). Naudojant 8,5 ml vandenilio chlorido
rūgšties taip pat gaunami ir didţiausi individualių antocianidinų kiekiai (6 lentelė).
Antocianinų hidrolizė ir aglikonų susidarymas buvo taip pat vertinamas atsiţvelgiant į ESC
chromatogramose esančių smailių pokyčius. Hidrolizei naudojant 4 ml vandenilio chlorido rūgšties
dauguma antocianinų hidrolizuojasi, tačiau vis dar stebimos maţos antocianinų smailės sulaikymo
trukmei esant 6-14 min. (9a pav.). Hidrolizei panaudojus 8,5 ml vandenilio chlorido rūgšties,
antocianinų smailių chromatogramoje nenustatyta (9b pav.). Naudojant 6 ml ir 8,5 ml vandenilio
chlorido rūgšties buvo gauti panašūs individualių antocianidinų kiekiai. Delfinidino ir malvidino
kiekiai liko nepakitę, tačiau kitų antocianidinų kiekis šiek tiek padidėjo. Didinant vandenilio
chlorido rūgšties kiekį nustatytas individualių antocianidinų kiekio maţėjimas.
Atliekant antocianidinų sudėties tyrimus hidrolizės metu skirtingais laiko intervalais (7
lentelė) buvo nustatyta, kad 2 val. trukmės hidrolizė sąlygoja didţiausią suminį bei individualių
antocianidinų kiekį. Delfinidino kiekis pradėjo maţėti esant 2 val. hidrolizės trukmei. Gauti tyrimų
rezultatai sutapo su literatūroje skelbtais mokslinių tyrimų duomenimis, kad delfinidinas yra
nestabilus esamomis hidrolizės sąlygomis [277]. Padidinus hidrolizės trukmę iki 2,5 val., suminis
antocianidinų kiekis sumaţėjo.
Įvertinus vandenilio chlorido rūgšties kiekio bei hidrolizės trukmės įtaką antocianidinų išeigai,
tolimesniuose tyrimuose taikyta 2 val. trukmės hidrolizė, panaudojant 8,5 ml vandenilio chlorido
rūgšties.
49
6 lentelė. Antocianidinų kiekiai proc., hidrolizei panaudojus skirtingus 35 proc. vandenilio chlorido
rūgšties kiekius
35 proc. Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas Suma
HCl proc. proc. proc. proc. proc. proc.
4 ml 0,380±0,019 1,132±0,011 0,323±0,014 0,341±0,016 0,299±0,015 2,484±0,034
6 ml 0,331±0,022 1,194±0,014 0,380±0,017 0,344±0,020 0,291±0,013 2,533±0,021
8,5 ml 0,333±0,024 1,212±0,019 0,390±0,011 0,349±0,013 0,295±0,012 2,572±0,042
10 ml 0,241±0,021 1,185±0,020 0,360±0,032 0,303±0,011 0,262±0,010 2,344±0,062
Reikšmės yra trijų bandinių vidurkiai ± vidurkio standartinė paklaida.
9 pav. Vaccinium myrtillus L. vaisių ekstrakto ESC chromatogramos hidrolizei panaudojus 4 ml (a)
ir 8,5 ml (b) 35 proc. vandenilio chlorido rūgšties.
Analičių smailės: 1- delfinidinas, 2- cianidinas, 3- petunidinas, 4- peonidinas, 5- malvidinas
50
7 lentelė. Antocianidinų sudėtis proc. hidrolizės metu
Hidrolizės Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas Suma
trukmė (val) proc. proc. proc. proc. proc. proc.
1 0,272±0,056 0,882±0,190 0,293±0,061 0,242±0,050 0,301±0,052 1,886±0,410
1,5 0,341±0,010 1,123±0,017 0,364±0,013 0,304±0,013 0,264±0,009 2,393±0,042
2 0,332±0,023 1,206±0,022 0,390±0,014 0,351±0,010 0,294±0,009 2,567±0,052
2,5 0,287±0,010 0,204±0,014 0,367±0,006 0,354±0,012 0,291±0,012 2,490±0,021
Reikšmės yra trijų bandinių vidurkiai ± vidurkio standartinė paklaida.
Chromatografinio skirstymo optimizavimas. Biologiškai aktyvių junginių kokybiniam ir
kiekybiniam nustatymui vaistinėse augalinėse ţaliavose, plačiai taikomas ESC metodas. ESC
metodo vystymo ir įteisinimo parametrai plačiai aprašyti ir išanalizuoti mokslinėje literatūroje [6,
134]. Būtina įvertinti pagrindinius ESC metodo įteisinimo etapus.
8 lentelė. Analičių smailių skiriamoji geba (Rs) antocianidinų mišinyje
An
toci
an
idin
as
Del
finid
inas
Cia
nid
inas
Pet
unid
inas
Peo
nid
inas
Mal
vid
inas
Rs 7,15 6,88 3,70 2,46
Metodo įteisinimas atliktas naudojant mėlynių vaisių ekstraktus. Daţniausiai taikomi organiniai
tirpikliai atvirkščių fazių ESC yra acetonitrilas ir metanolis. Acetonitrilo/vandens mišiniai sąlygoja
2,5 karto maţesnį klampumą nei atitinkami metanolio/vandens tirpalai, dėl to galima pasiekti net 2,5
karto didesnį tėkmės greitį. Dėl minėtų teigiamų savybių acetonitrilas pasirinktas tolimesniam
metodo vystymui. Pastaruoju metu dauguma ESC metodų naudoja įvairius kiekius rūgšties judrioje
fazėje, rūgštinės terpės palaikymui, kad uţtikrinti antocianinų stabilumą, flavilijaus katijono
formoje. Metodą optimizavome naudojant 4 proc. vandeninį ortofosfato rūgšties tirpalą. Pradiniai
tyrimai su standartinių junginių mišiniu atlikti siekiant optimalaus chromatografinio skirstymo.
Analogiškos sąlygos taikytos ir mėlynių vaisių ekstraktams. Pageidaujamos skiriamosios gebos
reikšmės (Rs >2) pasiektos etaloninių junginių ir ekstraktų pavyzdţiuose (8 lentelė).
Visų antocianidinų kalibracinėse kreivėse stebima ryški koreliacija. Koreliacijos koeficiento
(R2) reikšmės visiems analizuojamiems junginiams buvo didesnės uţ 0,99 ir patvirtino vystomo
kiekinio nustatymo metodo tiesiškumą. Tiesinės regresijos lygtys, koreliacijos koeficientai ir
51
nustatymo ribos pateiktos 9 lentelėje. Aptikimo ir nustatymo ribos tiriamiems junginiams buvo
įvertintos lyginant smailės aukštį su bazinės linijos triukšmu. Šie ribiniai parametrai svarbūs
kokybiniam ir kiekiniam tiriamų junginių nustatymui. Aptikimo ribos reikšmės svyravo nuo 0,034
iki 0,085 µg/ml, o nustatymo - atitinkamai nuo 0,076 iki 0,190 µg/ml.
9 lentelė. Antocianidinų tiesinės regresijos lygtys, koreliacijos koeficientai bei analičių aptikimo ir
nustatymo ribinės koncentracijos
Antocianidinai Regresijos Koreliacijos Aptikimo riba Nustatymo riba
lygtis koeficientas (R2) (µg/mL) (µg/mL)
Delfinidinas Y = 5,33·106x + 7,70·10
3 0,9993 0,034 0,080
Cianidinas Y = 2,54·106x + 3,82·10
3 0,9997 0,038 0,076
Petunidinas Y = 2,45·106x – 1,24·10
3 0,9991 0,085 0,190
Peonidinas Y = 2,39·106x + 1,37·10
3 0,9929 0,080 0,186
Malvidinas Y = 3,35·106x + 4,82·10
3 0,9945 0,055 0,127
Vystomo metodo glaudumo įvertinimui buvo apskaičiuotas gautų rezultatų pakartojamumas
ir atkuriamumas, kurie išreiškiami variacijos koeficientu (V). Metodo pakartojamumas ir
atkuriamumas sulaikymo trukmei V neviršija 3,4 proc., tuo tarpu šie statistiniai parametrai smailių
plotams yra pakankami ir V neviršija 4,0 proc. (10 lentelė).
10 lentelė. ESC metodo akuriamumas ir pakartojamumas
Antocianidinai
V, proc.
Sulaikymo
trukmė
Smailės
plotas
Analizė
po
analizės
Diena
po
dienos
Ekstrakcija
po
ekstrakcijos
Analizė
po
analizės
Diena
po
dienos
Ekstrakcija
po
ekstrakcijos
Delfinidinas
Cianidinas
Petunidinas
Peonidinas
Malvidinas
0,53
0,34
0,36
0,36
0,28
3,39
3,15
2,12
1,55
1,32
1,33
1,05
0,93
0,80
0,72
1,64
1,89
1,75
1,83
1,40
0,32
1,27
0,85
1,09
3,07
3,96
2,65
2,77
1,91
2,77
Sukurta ESC metodika V. myrtillus L. vaisių augalinių ţaliavų antocianidinų kokybinės ir
kiekybinės sudėties tyrimui. Optimizuotos ekstrakcijos sąlygos įvertinant svarbiausių ekstrahavimo
veiksnių įtaką antocianinų ekstrakcijos efektyvumui. Gauti duomenys apie ekstrakcijos tirpiklio
poliškumo ir ekstrakcijos metodo įtaką antocianinų sudėties rodikliams yra svarbūs siekiant gauti
optimalią ekstrakcijos išeigą. Nustatyta, kad didţiausi antocianinų kiekiai gaunami ekstrakcijos
tirpikliu naudojant 100 proc. metanolį ir ekstrahuojant vaistinių augalinių ţaliavų bandinius
ultragarso vonelėje 10 min.
52
Parinktos optimalios rūgštinės hidrolizės sąlygos, uţtikrinančios maksimalią antocianinų
hidrolizę ir antocianidinų išeigą. Atliktų tyrimų rezultatai patvirtino sukurtos atvirkščių fazių ESC
metodikos tinkamumą efektyviam antocianidinų išskirstymui. Gauti pagrindinių metodikos
įteisinimo kriterijų parametrai patvirtinantys patikimumą bei tikslumą kokybiniam ir kiekiniam
antocianidinų įvertinimui V. myrtillus L vaisių vaistinėse augalinėse ţaliavose. Sukurtas ir įteisintas
ESC metodas gali būti sėkmingai pritaikytas ir kitų augalinių ţaliavų, kaupiančių antocianinus,
kokybinei bei kiekybinei analizei.
3.1.2. Antocianinų sudėties įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisiuose, surinktuose iš
gamtinių cenopopuliacijų
Uţtikrinant vartojamų vaistinių augalinių preparatų kokybę ir saugumą būtina atlikti naudojamų
vaistinių augalinių ţaliavų tapatybę įrodančius taksonominius ar genetinius tyrimus. Daugeliu atvejų
vaistiniuose preparatuose ar augaliniuose ekstraktuose taksonominė ar genetinė analizė yra sudėtinga
ar negalima, tuomet tokių pavyzdţių tapatybė bei kokybė vertinama remiantis cheminės analizės
parametrais. Biologiškai aktyvių junginių tapatybė vaistinėje augalinėje ţaliavoje nustatoma lyginant
juos su etaloniniais junginiais [32, 42, 135].
Įvertinus biologiškai aktyvių junginių tapatybę vertinama augalinės ţaliavos kokybė.
Standartizacijos tikslas yra garantuoti vartojamų ţaliavų cheminės sudėties, bei numatomų
farmakologinių bei fiziologinių efektų pastovumą. Vaistinėje augalinėje ţaliavoje esantys biologiškai
aktyvūs junginiai, turintys tiesioginį terapinį poveikį paprastai pasirenkami kaip cheminiai ţymenys,
uţtikrinantys naudojamų preparatų kokybę, saugumą bei efektyvumą [32, 42, 153, 212].
V. myrtillus L. vaisių paruošos vykdomos gamtinėse cenopopuliacijose daugelyje šalių [10,
28]. Geografinė padėtis, skirtingos klimatinės sąlygos, paruošų laikas bei laikymo sąlygos gali turėti
didelės įtakos vaistinių augalinių ţaliavų cheminės sudėties kokybinių ir kiekybinių rodiklių
pastovumui. Suomijos mokslininkų atlikti tyrimai įrodo, kad galimas didelis cheminės sudėties
kokybinių ir kiekybinių parametrų išsibarstymas tarp toje pačioje šalyje surinktų ėminių [145].
Europos bei daugelio šalių farmakopėjose V. myrtillus L. vaisių kokybė vertinama atsiţvelgiant į
pagrindinių komponentų, lemiančių farmakologinį poveikį - antocianinų, kokybinės ir kiekybinės
sudėties rodiklius. Ruošiant kokybišką vaistinę augalinę ţaliavą, svarbu įvertinti Lietuvos
respublikos teritorijoje surinktų V. myrtillus L. vaisių augalinės ţaliavos antocianinų sudėtį, jos
įvairavimo dėsningumus pavyzdţiuose, rinktuose skirtingose cenopopuliacijose
Mėlynių vaisių cheminės sudėties tyrimai atlikti spektrofotometriniu (antocianinų suminis
kiekis) ir optimizuotu ESC (antocianidinų) metodais. Abu metodai plačiai taikomi ir papildo vienas
53
kitą [148, 206]. Antocianinų sudėties tyrimas atliktas spektrofotometriniu metodu. Šiuo metodu
nustatomas suminis antocianinų kiekis, perskaičiuojant cianidin-3-gliukozidu. Moksliniu poţiūriu
svarbu išsiaiškinti atskirų biologiškai aktyvių junginių pasiskirstymo pobūdį. Rūgštinės hidrolizės
metu gautoje chromatogramoje ryškiai matomos penkios identifikuotų analičių smailės. Visuose
tirtuose mėginiuose nustatyti šie antocianidinai: delfinidinas, cianidinas, petunidinas, peonidinas ir
malvidinas.
Nustatyta plati suminio antocianinų ir antocianidinų kiekio varijavimo amplitudė.
Antocianinų suminis kiekis kito nuo 0,828 iki 5,372 proc., tuo tarpu antocianidinų suminis kiekis
varijavo nuo 0,743 iki 5,722 proc. (10 pav.). Panašūs rezultatai pateikiami ir Suomijos mokslininkų
darbuose, kuriuose suminis antocianinų kiekis šios šalies skirtingų cenopopuliacijų bandiniuose taip
pat ţenkliai varijavo, tačiau nustatytas vidutinis suminis antocianinų kiekis yra 2,878 proc. ir
panašus į Lietuvos teritorijoje rinktų pavyzdţių antocianinų kiekio vidurkį (2,488 proc.) [145].
Maţesni suminiai antocianinų kiekiai nustatyti Italijos teritorijoje surinktuose pavyzdţiuose,
kuriuose jų kiekis varijavo nuo 1,833 iki 1,889 proc. [74]. Estijos mokslininkų atlikti tyrimai parodė,
kad jų šalyje rinktuose V. myrtillus L. ėminiuose antocianinų suminis kiekis - 2,222 proc. [236].
10 pav. Suminio antocianinų ir antocianidinų kiekio įvairavimas gamtinių Vaccinium myrtillus L.
cenopopuliacijų vaisių ėminiuose
54
11 lentelė. Vaccinium myrtillus L. gamtinėse cenopopuliacijose surinktų vaisių pavyzdţių
antocianidinų sudėties ir sklaidos charakteristika (n=75)
Antocianidinai
Keikis, proc.
S x Me V, proc. Min. Maks. M
Delfinidinas 0,083 1,305 0,451 0,032 0,349 60,53
Cianidinas 0,335 2,236 1,088 0,049 1,025 39,15
Petunidinas 0,101 1,058 0,442 0,026 0,366 50,68
Peonidinas 0,087 0,519 0,260 0,011 0,261 35,77
Malvidinas 0,054 0,799 0,289 0,018 0,260 55,02
Min. – minimali reikšmė, Maks. – maksimali reikšmė, M – aritmetinis vidurkis, S x - vidurkio standartinė paklaida, Me –
mediana, V – variacijos koeficientas.
V. myrtillus L. vaisių metanolinio ekstrakto chromatograma pateikta 11 pav. ESC metodu
tirtuose V. myrtillus L. ekstraktuose kaip ir kitų tyrėjų darbuose nustatytas vyraujantis antocianidinas
– cianidinas [277]. Jo kiekis tirtuose mėginiuose svyravo nuo 0,335 iki 2,236 proc. Nustatyti
maţiausi peonidino (0,087 - 0,519 proc.) ir malvidino (0,054 - 0,799 proc.) kiekiai. Antocianidinų
sudėties ir sklaidos charakteristikos pateiktos 11 lenteleje.
Vykdant mėlynių vaisių vaistinių augalinių ţaliavų paruošas Lietuvos respublikoje, svarbu
uţtikrinti naudojamų ţaliavų kokybę bei įvertinti cheminės sudėties homogeniškumą. Siekiant įvertinti
vietinės V. myrtillus L. ţaliavos cheminės sudėties panašumus bei skirtumus ir tikėtinas sąsajas su
atskiromis augavietėmis atlikta gautų duomenų hierarchinė klasterinė analizė. Klasterinės analizės
dendrogramoje, sudarytoje pagal individualių antocianidinų kiekius ţaliavose, surinktose iš 75
skirtingų cenopopuliacijų ryškiai išsiskyrė dvi grupės: didesnė I-oji ir kiek maţesnė II-oji (12 pav.).
Pirmąją grupę sudaro du pogrupiai: II-1-asis ir I-2-asis. I-ajam pogrupiui priskiriama 18
cenopopuliacijų (Nr. 3, 7, 1, 10, 4, 15, 6, 5, 16,17, 14, 18, 2, 12, 11, 8, 9 13), kuriose surinkti
pavyzdţiai išsiskyrė maţiausiu vidutiniu suminiu antocianidinų kiekiu (1,667 proc.). Pogrupio
ţaliavoms taip pat būdingi ţymiai maţesni uţ vidutinius visų antocianidinų kiekiai.
I-2-asis pogrupis yra pats didţiausias ir jį sudaro 39 cenopopuliacijos (Nr. 35, 54, 57, 24, 41,
25, 19, 42, 29, 36, 23, 30, 21, 22, 43, 47, 27, 31, 26, 34, 44, 46, 45, 32, 37, 20, 40, 28, 39, 33, 43, 38,
50, 52, 53, 56, 49, 51, 55). Pogrupiui priklausančių cenopopuliacijų suminis kiekis (3,574 proc.) bei
visų antocianidinų kiekiai artimiausi vidutiniam jų kiekiui. Išskirtinai didelis suminis (5,140 proc.) bei
individualių antocianidinų kiekis nustatytas 55-oje cenopopuliacijoje.
55
11 pav. Vaccinium myrtillus L.vaisių ekstrakto ESC chromatograma.
Analičių smailės pagal sulaikymo trukmę: 1- delfinidinas, 2- cianidinas, 3- petunidinas, 4-
peonidinas, 5- malvidinas
Antroji, daug maţesnė grupė taip pat susideda iš dviejų pogrupių: II-1-ojo ir II-2-ojo. II-1-jam
pogrupiui priklauso 13 cenopopuliacijų (Nr. 74, 75, 72, 71, 73, 58, 59, 65, 67, 63, 70, 68, 64). Šio
pogrupio cenopouliacijose nustatytas didţiausias suminis antocianidinų kiekis (3,050 proc.),
didesniais uţ vidurkį delfinidino, (nuo 0,276 iki 0,963 proc.), cianidino (nuo 0,496 iki 2,010 proc.),
petunidino (nuo 0,298 iki 0,868 proc.) ir peonidino (nuo 0,108 iki 0,469 proc.) kiekis.
II-2-ąjį, patį maţiausią, pogrupį sudaro 5 cenopopuliacijos (Nr. 61, 66, 62, 69, 60), kuriose
nustatyti didţiausi ciandinio kiekiai, svyruojantys nuo 0,836 iki 1,729 proc., o vidurkis (1,481 proc.),
viršijantis vidutinį šio antocianidino kiekį (1,088 proc.). Šiam pogrupiui priklausančių cenopopuliacijų
individualių antocianidinų vidurkiai didesni uţ kitų pogrupių bei visų cenopopuliacijų vidutinius
kiekius. Hierarchinės klasterinės analizės pagalba išskirtų pogrupių statistiniam palyginimui taikytas
Kruskal‗o-Wallis‗o ranginis kriterijus nepriklausomoms imtims.
Naudojantis Kruskal‗o-Wallis‗o testu nustatyta, kad klasterinės analizės būdu išskirti pogrupiai
statistiškai reikšmingai (p<0,05) skiriasi pagal delfinidino, cianidino, petunidino ir malvidino kiekius
mėlynių ţaliavose.
56
I-1
Antocianidinai
Kiekis, proc.
Min. Maks. Me Q3-Q1
Delfinidinas 0,083 0,387 0,231 0,112
Cianidinas 0,335 1,388 0,752 0,415
Petunidinas 0,101 0,437 0,255 0,146
Peonidinas 0,087 0,385 0,203 0,128
Malvidinas 0,054 0,372 0,165 0,093
I-2
AAntocianidinai
Kiekis, proc.
Min. Maks. Me Q3-Q1
Delfinidinas 0,068 1,305 0,349 0,286
Cianidinas 0,592 2,236 1,073 0,463
Petunidinas 0,095 1,058 0,376 0,268
Peonidinas 0,144 0,519 0,281 0,112
Malvidinas 0,088 0,799 0,274 0,163
II-1
Antocianidinai
Kiekis, proc.
Min. Maks. Me Q3-Q1
Delfinidinas 0,276 0,963 0,572 0,505
Cianidinas 0,496 2,010 1,082 1,005
Petunidinas 0,298 0,868 0,627 0,360
Peonidinas 0,108 0,469 0,220 0,194
Malvidinas 0,159 0,647 0,340 0,262
II-2
Antocianidinai
Kiekis, proc.
Min. Maks. Me Q3-Q1
Delfinidinas 0,404 0,873 0,761 0,265
Cianidinas 0,836 1,729 1,647 0,502
Petunidinas 0,441 0,774 0,703 0,213
Peonidinas 0,185 0,368 0,316 0,116
Malvidinas 0,261 0,540 0,470 0,184
Min. – minimali reikšmė,
Maks. – maksimali reikšmė,
Me – mediana,
Q3-Q1 – kvartilinis plotis
12 pav. Vaccinium myrtillus L. gamtinėse cenopopuliacijose surinktų vaisių pavyzdţių panašumo
dendorograma sudaryta pagal antocianidinų sudėtį mėlynių vaisių ţaliavose ir identifikuotų analičių
sudėties bei sklaidos charakteristikos pogrupiuose
57
12 lentelė. Vaccinium myrtillus L. vaisių ėminių klasterinės analizės pogrupių cheminių poţymių
daugkartinių porinių palyginimų Dunn‘o testo reikšmės
Pogrupių numeriai pagal 12 pav.; * p<0,05, **<0,01
Taikant daugkartinių porinių palyginimų Dunn‗o testą nustatyta, kad daugiausiai statistiškai
reikšmingų skirtumų yra tarp I-1 ir I-2 bei tarp I-1 ir II-2 klasterinės analizės pogrupių. I-
1 ir I-2 klasteriai statistiškai reikšmingai skyrėsi pagal delfinidino, cianidino, petunidino ir
0%
20%
40%
60%
80%
100%
I-1 I-2 II-1 II-2
klasteriai
Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas
13 pav. Vaccinium myrtillus L. vaisių ėminių antocianidinų santykinės dalies įvairavimas
cenopopuliacijų pogrupiuose, išskirtuose hierarchinės klasterinės analizės pagalba (klasterių
numeriai pagal 12 pav.)
Klasteriai Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas
I-1 – I-2 3,272* 2,981* 3,290* 2,551 3,375*
I-1 – II-1 4,494** 2,371 4,466 1,462 4,161**
I-1 – II-2 3,749** 3,140* 3,837**
2,008 3,620**
I-2 – II-1 2,196 0,043 2,149 0,607 1,726
I-2 - II-2 2,027 1,553 2,111 0,607 1,828
II-1 –II-2 0,493 1,376 0,597 0,917 0,599
58
malvidino (p<0,05) kiekius vaisių ţaliavose. Tuo tarpu I-1 ir II-2 klasteriai statistiškai
reikšmingai skyrėsi pagal delfinidino (p<0,01), cianidino (p<0,05), petunidino (p<0,01) ir malvidino
(p<0,01) kiekius ţaliavose (12 lentelė).
Siekiant sukurti racionalias vaistinių augalinių ţaliavų rinkimo rekomendacijas svarbu
palyginti ne tik antocianinų ar antocianidinų kiekius, bet ir idividualių antocianidinų sudėties
santykius ţaliavos ėminiuose. Įvertinta procentinė atskirų antocianidinų dalis klasterinės analizės
metu išskirtuose pogrupiuose ir gauti rezultatai pateikti 13 pav. Antocianidinų kiekio procentinės
dalies įvairavimas skirtinguose V. myrtillus L. vaisių ėminiuose rodo, kad tirtoms cenopopuliacijoms
būdingas neţymus cheminis polimorfizmas. Tyrimo rezultatų pasekoje nustatyta, kad tirti mėlynių
vaisių pavyzdţiai pasiţymi ryškiai išreikštu kokybinių cheminės sudėties rodiklių homogeniškumu.
Gauti tyrimų rezultatai leidţia Lietuvos Respublikos teritorijoje surinktą V. myrtillus L. vaisių
ţaliavą vertinti kaip kokybišką, turinčią pastovią kokybinę antocianidinų sudėtį, besiskiriančią tik
kiekybiniais rodikliais.
Atlikti išsamūs Lietuvos teritorijoje surinktų 75 skirtingų cenopopuliacijų mėlynių
vaistinių augalinių ţaliavų antocianinų ir antocianidinų sudėties tyrimai. Spektrofotometriniu
metodu įvertintas suminis antocianinų kiekis bei jo įvairavimas. Pritaikius optimizuotą ESC metodą
nustatyta individualių antocianidinų komplekso kokybinė ir kiekybinė sudėtis V. myrtillus L. vaisių
ţaliavose. Atlikti fitocheminiai antocianinų kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimai yra svarbūs
tolimesniems jų poveikio organizmui tyrimams. Atlikus antocianinų hidrolizę nustatyta 5
pagrindinių antocianidinų (delfinidino, cianidino, petunidino, peonidino ir malvidino) kiekinė
sudėtis. Tirtuose pavyzdţiuose tarp identifikuotų antocianidinų nustatytas didţiausias cianidino
kiekis. Apskaičiuoti variacijos koeficientai parodo didelį antocianidinų varijavimą ir galimą jų
kiekio priklausomybę nuo augavietės ir kitų aplinkos faktorių.
3.1.3. Antocianinų ir antocianidinų sudėties įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisių
vaistinėse augalinėse ţaliavose, surinktose šiaurės rytų Europos šalyse
Vaistinių augalinių ţaliavų surinktų iš skirtingų cenopopuliacijų, cheminė sudėtis dėl
klimatinių, geografinių ar gentinių faktorių įtakos gali varijuoti plačiose ribose [16, 145]. Lietuvai
įstojus į ES, vykstant intensyviai prekybai tarp kaimyninių šalių daugybė įveţtinių augalinių ţaliavų
gali patekti į vietinę rinką. Vykdant kokybiškos vaistinės augalinės ţaliavos paruošas ir panaudojant
vietinius išteklius, svarbu palyginti jų kokybinius bei kiekybinius antocianinų fitocheminės analizės
rodmenis su kitose šalyse paruoštų vaisių augalinių ţaliavų pavyzdţiais.
59
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
Švedija Rusija Baltarusija Latvija Ukraina Lietuva
kie
kis
, p
roc.
antocianinų suminis kiekis antocianidinų suminis kiekis
14 pav. Suminiai antocianų ir antocianidinų kiekiai Vaccinium myrtillus L. vaisių ėminiuose,
surinktuose įvairiose šalyse
Atlikti Lietuvos respublikoje iš skirtingų cenopopuliacijų bei Švedijos, Rusijos, Latvijos,
Baltarusijos ir Ukrainos teritorijose surinktų ėminių palyginamieji tyrimai. Įvertinus suminį
antocianinų ir antocianidinų kiekį didţiausi antocianinų (3,149 proc.) ir antocianidinų (3,093 proc.)
suminiai kiekiai nustatyti ėminiuose surinktuose Švedijos tertorijoje. Maţiausi suminiai antocianinų
(2,312 proc.) ir antocianidinų (2,289 proc.) kiekiai nustatyti V. myrtillus L. vaisių pavyzdţiuose
surinktuose Latvijoje. Lietuvos respublikos teritorijoje rinktuose mėlynių vaisių pavyzdţiuose
vidutiniškai nustatyta 2,488 proc. antocianinų ir 2,556 proc. antocianidinų. Maţesni suminiai
antocianinų kiekiai nustatyti Rusijos (2,493 proc.) ir Baltarusijos (2,451 proc.) teritorijose rinktuose
ėminiuose, ir kuriuose antocianidinų suminiai kiekiai maţesni negu Lietuvos respublikoje
surinktuose vaisių ėminiuose (2,523 proc. ir 2,340 proc.). Lietuvoje rinktų mėlynių vaisių
antocianinų kiekybinė sudėtis skyrėsi nuo Ukrainoje surinktų mėginių. Nustatytas suminis
antocianinų (2,677 proc.) ir antocianidinų (2,641 proc.) kiekis Ukrainoje rinktuose bandiniuose buvo
šiek tiek didesnis (14 pav.). Antocianinų ir antocianidinų sudėties skirtumui įtakos galėjo turėti
daugybė faktorių (paruošų laikas, geografinis veiksnys, klimatinės sąlygos), kurie lėmė skirtingus
antocianinų kiekius V. myrtillus L. vaisiuose.
60
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
Švedija Rusija Baltarusija Latvija Ukraina Lietuva
Kie
kis
, p
roc.
delfinidinas
cianidinas
petunidinas
peonidinas
malvidinas
15 pav. Antocianidinų kiekiai Vaccinium myrtillus L. vaisių ėminiuose, surinktuose skirtingose
cenopopuliacijose įvairiose šalyse
Atlikus antocianidinų kiekybinę analizę optimizuotu ESC metodu atskirų antocianidinų
statistiniam palyginimui pritaikytas Kruskal‗o-Wallis‗o ranginis kriterijus nepriklausomoms imtims.
Rezultatai parodė, kad statistiškai reikšmingų skirtumų (p>0,05) tarp antocianidinų kiekių,
skirtingose šalyse rinktuose pavyzdţiuose, nėra.
Didţiausi delfinidino kiekiai nustatyti Švedijos teritorijoje rinktuose pavyzdţiuose (0,574
proc.), o maţiausi Latvijoje rinktuose ėminiuose (0,320 proc.) Lietuvos teritorijoje esančiose
augimvietėse surinktų mėlynių vaisių ėminiuose nustatyti didesni delfinidino kiekiai (0,445 proc.)
nei Rusijos (0,438 proc.) ir Baltarusijos (0,418 proc.) teritorijoje augančių mėlynių vaisių ėminiuose.
Ukrainoje augančiuose vaisiuose susikaupia šiek tiek didesni delfinidino kiekiai (0,469 proc.).
Cianidinas – vyraujantis antocianidinas, nustatytas visų tyrinėtų šalių V. myrtillus L.
vaisių ėminiuose. Didţiausi jo kiekiai (1,209 proc.) nustatyti Švedijoje rinktuose mėlynių vaisių
ėminiuose. Lietuvoje rinktuose pavyzdţiuose kaip ir Ukrainoje rinktuose ėminiuose nustatyta 1,098
proc. cianidino. Maţiau jo nustatyta Rusijoje ir Latvijoje rinktuose bandiniuose, o maţiausi
cianidino kiekiai nustatyti Baltarusijoje rinktose mėlynėse (0,952 proc.).
Didţiausias petunidino kiekis nustatytas Švedijoje rinktuose vaisiuose (0,593 proc.).
Maţiausiai petunidino nustatyta Ukrainoje rinktuose mėlynių vaisiuose (0,287 proc.). Lietuvoje
surinktuose pavyzdţiuose daugiau nustatyta petunidino (0,446 proc.) nei surinktuose Latvijoje
(0,381 proc.) ir Baltarusijoje (0,443 proc.), tačiau maţiau nei Rusijoje (0,453 proc.).
61
Peonidino daugiausiai nustatyta Švedijoje surinktuose ėminiuose (0,339 proc.), o
maţiausiai jo nustatyta Lietuvoje surinktose mėlynių vaisiuose (0,262 proc.). Malvidino Lietuvoje
surinktuose bandiniuose nustatyta vidutiniškai 0,294 proc., jo didesni kiekiai nustatyti tik Švedijos
(0,378 proc.) ir Ukrainos (0,317 proc.) teritorijose rinktuose ėminiuose. Maţesni jo kiekiai nustatyti
Latvijos (0,276 proc.), Baltarusijos (0,249 proc.) ir Rusijos (0,289 proc.) teritorijose rinktuose
pavyzdţiuose (15 pav.).
0%
20%
40%
60%
80%
100%
pro
c.
Švedija Rusija Baltarusija Latvija Ukraina Lietuva
Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas
16 pav. Antocianidinų kiekių santykio įvairavimas V. myrtillus L. vaisių ėminiuose, rinktuose
įvairiose šalyse
Vertinant ir lyginant ţaliavų kokybę, rinktų skirtingose šalyse, svarbu palyginti ne tik
suminius ar atskirų antocianidinų kiekius, bet ir individualių antocianidinų santykį ţaliavų
ėminiuose. Šio poţymio įvertinimas gali būti reikšmingas rodiklis vertinant ţaliavų
homogeniškumą. Įvertinti individualių antocianidinų kiekiai bei jų procentinės dalies įvairavimas
pateikti 16 pav. Antocianidinų kiekio procentinės dalies įvairavimas skirtingų šalių pavyzdţiuose
leidţia vertinti mėlynių vaisius kaip natūraliai homogenišką, pastovią cheminę sudėtį turinčią
ţaliavą.
Atlikti palyginamieji tyrimai ir įvertinta V. myrtillus L. vaisių antocianinų kokybinė ir
kiekinė sudėtis įvairiose Europos šalyse surinktuose bandiniuose. Nustatyta, jog Lietuvos teritorijoje
surinktų mėlynių vaisių kokybinė antocianidinų sudėtis atitiko Švedijos, Rusijos, Baltarusijos,
Ukrainos ir Latvijos teritorijose surinktų mėlynių vaisių antocianinų sudėtį. Lietuvoje surinktų
mėlynių vaisių pavyzdţiuose nustatytas vidutinis antocianinų kiekis siekė 2,488 proc. ir buvo
62
didesnis nei Baltarusijoje ir Latvijoje, tačiau maţesnis nei Švedijoje, Rusijoje ir Ukrainoje rinktose
ţaliavose.
Antocianidinų vidutinis kiekis Lietuvos teritorijoje rinktuose ėminiuose (2,556 proc.) yra
didesnis nei Latvijos, Baltarusijos ir Rusijos teritorijose rinktuose vaisiuose, tačiau maţesnis nei
Ukrainoje ir Švedijoje rinktose ţaliavose. Statistiniam atskirų antocianidinų palyginimui tarp
skirtingų šalių pavyzdţių pritaikius Kruskal‗o-Wallis‗o ranginį kriterijų nepriklausomoms imtims
statistiškai reikšmingo skirtumo nerasta (p>0,05), todėl vietinę V. myrtillus L. ţaliavą galima vertinti
kaip kokybišką, kokybine ir kiekybine sudėtimi iš esmės nesiskiriančią nuo kitų tyrinėtų Europos
šalių ţaliavų.
3.1.4. Antocianinų ir antocianidinų sudėties pokyčių tyrimai Vaccinium myrtillus L. vaisiuose
rinkimo metu
Vaisių nokimo metu antocianų kokybinė bei kiekinė sudėtis kinta. Vaisiams nokstant
suintensyvėja antocianinų sintezė, ko pasekoje pasikeičia ir antocianinų santykis su kitais
polifenoliniais (flavonoliais ir procianidinais) junginiais [10, 38, 111, 176].
Norint gauti kokybišką vaistinę augalinę ţaliavą svarbu parinkti optimaliausią paruošų
vykdymo laiką, kai ţaliavoje susikaupę maksimalūs biologiškai aktyvių junginių kiekiai. Mokslinės
literatūros šaltiniuose trūksta išsamių duomenų apie antocianinų kokybinės ir kiekybinės sudėties
pokyčius V. myrtillus L. vaisiuose jų nokimo metu. Vykdant ţaliavų paruošas tikslinga įvertinti
Lietuvoje augančių mėlynių vaisių antocianinų sudėties pokyčius bei nustatyti optimaliausias
rinkimo laiko ribas atsiţvelgiant į Lietuvos klimatines sąlygas.
Siekiant įvertinti V. myrtillus L. vaisių vaistinės augalinės ţaliavos antocianinų cheminės
sudėties rodiklių įvairavimą nokimo metu, vaisių pavyzdţiai buvo renkami nuo jų nokimo pradţios
(birţelio 24 d.) iki pilno vaisių sunokimo ir jų nubyrėjimo (rugsėjo 15 d.). Ėminiai nokimo metu
rinkti tose pačiose cenopopuliacijose kas savaitę. Suminio antocianinų ir antocianidinų kiekio
kitimas V. myrtillus L. vaisiuose rinkimo metu pateiktas 17 pav.
Maţiausias suminis antocianinų kiekis (2,291 proc.) nustatytas vaisių nokimo pradţioje
birţelio 24 d. surinktuose ėminiuose. Didţiausias jų kiekis (7,124 proc.) nustatytas vaisių nokimo
pabaigoje (rugsėjo 15 d.) ir buvo 3,1 karto didesnis uţ kiekį nustatytą vaisių nokimo pradţioje.
Maţiausias suminis antocianidinų kiekis nustatytas birţelio 24 d. surinktuose ėminiuose (2,386
proc.).
63
0,000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000 7,000 8,000
24
1
8
15
23
30
5
12
20
25
1
15B
irželi
oL
iepos
Ru
gp
jūčio
Ru
gsė
jo
rin
kim
o d
ata
kiekis, proc.
antocianidinų suminis kiekis antocianinų suminis kiekis
17 pav. Antocianinų ir antocianidinų suminiai kiekiai Vaccinium myrtillus L. vaisiuose ţaliavų
rinkimo metu
Vaisių rinkimo metu suminis antocianidinų kiekis padidėjo 3 kartus ir vaisių rinkimo
pabaigoje buvo 7,245 proc. Blokuotų duomenų dispersinė analizė atskleidė, kad suminis antocianinų
bei antocianidinų kitimas rinkimo metu yra statistiškai reikšmingas (p<0,05). Lyginant rugsėjo 15 d.
rinktų pavyzdţių antocianinų kiekio vidurkius su kitų ėminių vidurkiais paaiškėjo, jog bandinių
rinktų nuo rugpjūčio 20 d. vidurkiai statistiškai reikšmingai nesiskiria nuo daugiausiai antocianinų ir
antocianidinų sukaupusio ėminio (p>0,05). Mūsų atliktų tyrimų rezultatų dėka nustatyta, kad
Lietuvos teritorijoje augančių V. myrtillus L. vaisiuose didţiausi antocianinų kiekiai susikaupia
rugpjūčio mėn. II-oje pusėje iki vaisių pilno sunokimo ir jų nubyrėjimo (rugsėjo 15 d.).
Vertinant individualių antocianidinų pokyčius vaisiuose rinkimo metu nustatyti maţiausi
visų antocianidinų kiekiai birţelio 24 d. surinktuose bandiniuose. Didţiausi delfinidino, cianidino ir
malvidino kiekiai nustatyti rugsėjo 15 d., o petunidino ir peonidino - rugsėjo 1 d. surinktuose
ėminiuose. Taikant blokuotų duomenų vienfaktorinę dispersinę analizę atliktas bandinio, kuriame
nustatytas didţiausias antocianidino kiekis, palyginimas su kitais bandiniais, rinktais vaisių nokimo
metu. Gauti vidurkių skirtumai pateikti 13 lentelėje.
64
13 lentelė. Antocianidinų vidutinio kiekio skirtumų palyginimas Vaccinium myrtillus L. vaisiuose jų
rinkimo metu
Vaisių rinkimo data
Antocianidinų kiekių vidurkių skirtumai, proc.
Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas
birţelio 24 0,885* 1,552* 0,931* 0,636* 0,893*
liepos 1 0,497* 1,126* 0,644* 0,581* 0,788*
liepos 8 0,485* 1,118* 0,643* 0,535* 0,716*
liepos 15 0,311* 0,876 0,496* 0,549* 0,721*
liepos 23 0,565* 1,105* 0,622* 0,403* 0,657*
liepos 30 0,494 1,012* 0,529* 0,405* 0,547*
rugpjūčio 5 0,175 0,488* 0,154* 0,287 0,524
rugpjūčio 12 0,226 0,483 0,379* 0,249 0,392
rugpjūčio 20 0,088 0,507 0,237* 0,111 0,194
rugpjūčio 25 0,067 0,207 0,176* 0,088 0,020
rugsėjo 1 0,088 0,002 - - 0,106
rugsėjo 15 - - 0,002 0,037 -
Statistiškai reikšmingi vidurkių skirtumai lyginant su bandiniu, kuriame nustatyta vidutiniškai didţiausi antocianidinų
kiekiai (*p<0,05).
Delfinidino kiekio pokyčiai V. myrtillus L. vaisiuose nokimo metu pateikti 18 pav.
Pritaikius blokuotų duomenų vienfaktorinę dispersinę analizę nustatyta, jog delfinidino kiekio
pokyčiai laiko atţvilgiu yra statistiškai reikšmingas (p<0,05). Delfinidino kiekis rinkimo metu
padidėjo 2,8 karto. Didţiausias vidutinis delfinidino kiekis vaisių rinkimo metu nustatytas rugsėjo
15 d. ėminiuose (1,366 proc.). Palyginus šio bandinio vidutinį kiekį su visais kitų ėminių vidutiniais
kiekiais nustatyta statistiškai reikšmingi skirtumai nuo birţelio 24 d. iki liepos 23 d. rinktuose
bandiniuose.
65
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
1,600
24 1 8 15 23 30 5 12 20 25 1 15
Birželio Liepos Rugpjūčio Rugsėjo
rinkimo data
kie
kis
, p
roc.
18 pav. Delfinidino kiekio įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisiuose rinkimo metu
Nustatyta, kad nuo liepos 30 d. iki rugsėjo 15 d. mėlynių vaisiuose didţiausi delfinidino kiekiai ir
vidurkių skirtumai tarp šių ėminių nėra statistiškai reikšmingi (p>0,05).
Cianidinas yra dominuojantis antocianidinas visuose vaisių ėminiuose, tačiau jo kiekis kito
maţiausiai iš visų nustatytų antocianidinų (tik 2,3 karto). Blokuotų duomenų vienfaktorinė
dispersinė analizė parodė, jog jo kitimas laiko atţvilgiu yra statistiškai reikšmingas (p<0,05).
Didţiausias vidutinis cianidino kiekis vaisių nokimo metu nustatytas rugsėjo 15 d. rinktuose
ėminiuose (2,759 proc.) (19 pav.). Palyginus šio bandinio kiekio vidurkį su visais kitų bandinių
kiekių vidurkiais nustatyta statistiškai reikšmingi skirtumai nuo birţelio 24 d. iki rugpjūčio 5 d.
rinktuose bandiniuose, išskyrus liepos 15 d. rinktus ėminius. Didţiausi cianidino kiekiai mėlynių
vaisiuose nustatyti nuo rugpjūčio 12 d. iki rugsėjo 15 d. rinktuose ėminiuose, kadangi vidurkių
skirtumai tarp šių bandinių nėra statistiškai reikšmingi (p>0,05).
66
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
24 1 8 15 23 30 5 12 20 25 1 15
Birželio Liepos Rugpjūčio Rugsėjo
rinkimo data
kie
kis
, p
ro
c.
19 pav. Cianidino kiekio įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisiuose rinkimo metu
Nustatytas 3,5 karto padidėjęs cianidino kiekis vaisių nokimo pabaigoje. Panaudojus blokuotų duomenų
vienfaktorinę dispersinę analizę nustatyta, jog petunidino kitimas laiko atţvilgiu yra statistiškai
reikšmingas (p<0,05). Didţiausias vidutinis petunidino kiekis nustatytas rugsėjo 1 d. rinktuose ėminiuose
(1,304 proc.). Palyginus šio bandinio vidurkį su visais kitais bandinių vidurkiais statistiškai reikšmingi
skirtumai nustatyti nuo birţelio 24 d. iki rugpjūčio 25 d. rinktuose bandiniuose. Šiuo atveju tik tarp 2
paskutinių ėminių statistiškai reikšmingas skirtumas nenustatytas (p>0,05). Petunidino kiekio kitimo
dinamika vaisiuose rinkimo metu pavaizduota 20 pav.
Pritaikius blokuotų duomenų vienfaktorinę dispersinę analizę nustatyta, jog peonidino kitimas
laiko atţvilgiu yra statistiškai reikšmingas (p<0,05). Didţiausias vidutinis peonidino kiekis, padidėjęs 5,1
karto vaisių rinkimo metu nustatytas rugsėjo 1 d. rinktuose ėminiuose (0,782 proc.). Nustatyti statistiškai
reikšmingi skirtumai palyginus šio ėminio vidurkį su visais kitų bandinių vidurkiais (birţelio 24 d. - liepos
30 d.). Galima konstatuoti, jog nuo rugpjūčio 5 d. iki rugsėjo 15 d. mėlynių vaisiuose yra susikaupę
didţiausi peonidino kiekiai, nes statistiškai reikšmingo vidurkių skirtumo tarp šių pavyzdţių nerasta
(p>0,05). Peonidino kiekio kitimas V. myrtillus L. vaisiuose rinkimo metu pateiktas 21 pav.
67
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
1,600
24 1 8 15 23 30 5 12 20 25 1 15
Birželio Liepos Rugpjūčio Rugsėjo
rinkimo data
kie
kis
, p
roc.
20 pav. Petunidino kiekio įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisiuose rinkimo metu
0,0000,1000,2000,3000,400
0,5000,6000,7000,8000,900
24 1 8 15 23 30 5 12 20 25 1 15
Birželio Liepos Rugpjūčio Rugsėjo
rinkimo data
kie
kis
, p
ro
c.
21 pav. Peonidino kiekio įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisiuose rinkimo metu
68
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
24 1 8 15 23 30 5 12 20 25 1 15
Birželio Liepos Rugpjūčio Rugsėjo
rinkimo data
kie
kis
, p
roc.
22 pav. Malvidino kiekio įvairavimas Vaccinium myrtillus L. vaisiuose rinkimo metu
Blokuotų duomenų vienfaktorinės dispersinės analizės rezultatai parodė, jog malvidino
kitimas laiko atţvilgiu, kaip ir kitų antocianidinų yra statistiškai reikšmingas (p<0,05). Malvidino
kiekis vaisiuose nokimo metu padidėjo 6 kartus (daugiausiai iš visų antocianidinų). Nuo 0,180 proc.
birţelio pabaigoje iki 1,072 proc. rugsėjo viduryje (22 pav.). Didţiausias vidutinis malvidino kiekis
vaisių rinkimo metu nustatytas rugsėjo 15 d. rinktuose pavyzdţiuose. Nustatyti statistiškai
reikšmingi skirtumai palyginus šio ėminio vidurkį su visais kitų bandinių vidurkiais (birţelio 24 d. -
liepos 30 d.). Taigi, galima teigti, kad nuo rugpjūčio 5 d. iki rugsėjo 15 d. mėlynių vaisiuose yra
susikaupę didţiausi malvidino kiekiai, kadangi statistiškai reikšmingo vidurkių skirtumo tarp šių
pavyzdţių neaptikta (p>0,05).
Siekiant nustatyti antocianidinų komplekso sudėties kitimo dėsningumus V. myrtillus L.
vaisiuose rinkimo metu buvo atliktas identifikuotų antocianidinų santykinės dalies kitimo dinamikos
įvertinimas (23 pav.). Vaisių nokimo metu nustatytas neţymus peonidino ir malvidino santykinės
dalies padidėjimas. Nustatyta, jog delfinidino ir cianidino santykinė dalis šiek tiek sumaţėjo vaisių
rinkimo metu.
69
0%
20%
40%
60%
80%
100%k
iek
is, p
roc.
24 1 8 15 23 30 5 12 20 25 1 15
Birželio Liepos Rugpjūčio Rugsėjo
rinkimo data
Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas
23 pav.Vaccinium myrtillus L. vaisių antocianidinų kiekių santykinės dalies įvairavimas rinkimo
metu
Apibendrinant gautus rezultatus, galima teigti, jog Lietuvos gamtinėmis sąlygomis mėlynių
vaisiuose didţiausi antocianinų kiekiai nustatyti vaisių rinkimo pabaigoje (rugsėjo 15 d.), tačiau šie
bandiniai statistiškai reikšmingai nesiskiria nuo ėminių rinktų nuo rugpjūčio 20 d. Didţiausios
antocianinų koncentracijos V. myrtillus L. vaisiuose Lietuvos gamtinėmis sąlygomis susikaupia nuo
rugpjūčio mėn. vidurio iki rugsėjo mėn. vidurio, todėl mėlynių vaistinių augalinių ţaliavų paruošas
Lietuvos respublikos augavietėse, rekomenduojame vykdyti rugpjūčio mėn. antroje pusėje. Tyrimo
metu įvertinta ir individualių antocianidinų kiekio kitimo dinamika vaisiuose rinkimo metu. Gautų
tyrimų duomenų dėka galima atlikti mėlynių vaisių augalinių ţaliavų paruošas su pageidaujamu
didesniu antocianinų kiekiu.
3.1.5. Antocianinų ir antocianidinų sudėties įvairavimas šilauogių vaisiuose, ţievelėse,
minkštimuose ir išspaudose
Šilauogių vaisių antocianinų ir antocianidinų sudėties įvairavimas. Šilauogės kaip ir
mėlynės priklauso Vaccinium L. genčiai. Jų vaisiai vartojami maistui bei medicinos praktikoje dėl
jose besikaupiančių polifenolinių junginių [216]. Per pastarąjį šimtmetį išvesta daugiau kaip 100
įvairių šilauogių veislių, kurios plačiai auginamos daugelyje pasaulio šalių. Lietuvoje - tai
introdukuotas augalas. Botanikos instituto lauko kolekcijose pradėtas auginti tik XX a. antroje
70
pusėje. Šilauogių vaisiai intensyviai tyrinėjami dėl juose susikaupusių, farmakologiškai aktyvių
junginių – antocianinų. Siekiant šilauogių vaisius plačiau pritaikyti medicinos praktikai svarbu
palyginti auginamų veislių vaisių cheminę sudėtį ir jos rodiklių įvairavimą, atrinkti Lietuvos
gamtinėmis sąlygomis uţaugintas veisles, kurios kaupia didţiausius veikliųjų junginių kiekius.
Antocianinų suminis kiekis šilauogių vaisiuose nustatytas spektrofotometriniu metodu,
antocianinų sumą perskaičiuojant cianidin-3-gliukozidu [261, 268]. Nustatyta, jog suminis
antocianinų kiekis vaisiuose tarp tirtų veislių varijuoja gana plačiose ribose. Vertingiausios yra
„Berkeley― (1,671 proc.), „Northland― (1,662 proc.), „Northcountry― (1,727 proc.) ir „Ama― (1,652
proc.) šilauogių veislės. Maţiausias suminis antocianinų kiekis rastas „Chignecto― (0,464 proc.),
„Patriot― (0,632 proc.) bei „Dixi― (0,688 proc.) veislių vaisių ėminiuose. Vertinant Lietuvos
gamtinėmis sąlygomis uţaugintų šilauogių vaisių antocianinų kokybinę ir kiekybinę sudėtį svarbu
gautus tyrimų rezultatus palyginti su kitose šalyse uţaugintų šilauogių vaisių antocianinų sudėtimi.
Literatūros šaltiniuose nurodoma apie Italijos mokslininkų atliktus darbus tiriant
antocianinų ir antocianidinų kaupimosi dėsningumus šilauogių vaisiuose [74]. Jie nustatė, jog šioje
šalyje auginamų „Patriot― veislės šilauogių vaisių antocianinų suminis kiekis (0,613 proc.) atitinka
Lietuvoje auginamų tos pačios veislės šilauogių vaisių antocianinų suminį kiekį. „Bluecrop― veislės
Italijoje auginamų šilauogių vaisiuose nustatytas maţesnis antocianinų kiekis (0,860 proc.) lyginant
su Lietuvoje uţaugintais (1,363 proc.) „Bluecrop― veislės šilauogių vaisiais. Slovakijoje
uţaugintuose „Patriot― veislės šilauogių vaisiuose nustatyta 2 kartus didesnis antocianinų kiekis
(1,253 proc.). Didesnis atocianinų suminis kiekis nustatytas ir „Northland― veislės vaisiuose (2,137
proc.), tačiau „Bluecrop― (0,545 proc.) ir „Berkeley― (1,054 proc.) veislių vaisiuose nustatyti
suminis antocianinų kiekis maţesnis uţ nustatytus tų pačių veislių vaisiuose, auginamuose Lietuvoje
[259]. Estijos mokslininkų tyrinėtuose „Northblue― (0,800 proc.) ir „Northcountry― (1,333 proc.)
veislių vaisiuose taip pat nustatyta maţesni suminiai antocianinų kiekiai [236]. Nustatytiems
antocianinų kiekybinės sudėties skirtumams galėjo turėti įtakos skirtingas ţaliavų rinkimo laikas, ne
vienodas vaisių sunokimo laipsnis, bei kiti aplinkos faktoriai.
71
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1,600 1,800 2,000
"Dixi"
"Putte"
"Rancocas"
"Heerma"
"Bluecrop"
"Ama"
"Northblue"
"Northcuontry"
"Northland"
"Berkeley"
Siauralapė
"Patriot"
"Chignecto"
"North holna"
suminis kiekis, proc.
antocianinų suma antocianidinų suma
24 pav. Suminio antocianinų ir antocianidinų kiekio įvairavimas šilauogių vaisių ėminiuose
Optimizuotas ESC metodas kokybinei ir kiekybinei mėlynių vaisių ekstraktų
antocianidinų sudėties analizei, pritaikytas ir šilauogių vaisių antocianidinų analizei. Atlikus
šilauogių vaisių antocianinų hidrolizę kaip ir mėlynių vaisiuose nustatyti tie patys antocianidinai
(delfinidinas, cianidinas, petunidinas, peonidinas, malvidinas). Šilauogių vaisių ekstrakto ESC
chromatograma pateikta 25 pav. Iš 5-ių identifikuotų analičių, kaip ir kitų tyrėjų darbuose [157, 254]
chromatogramoje dominuoja malvidino, petunidino ir delfinidino smailės.
Didţiausi suminiai antocianidinų kiekiai nustatyti „Northland― (1,585 proc.),
„Northcountry― (1,534 proc.) ir „Rancocas― (1,453 proc.) veislių ţaliavose, o maţiausiais suminiais
antocianidinų kiekiais išsiskyrė „Chignecto― (0,187 proc.), "Bluecrop" (0,528 proc.), "Heerma"
(0,553 proc.) veislės (24 pav.).
Tirtose šilauogių vaisiuose nustatytas didţiausias (0,286 proc.) malvidino vidutinis kiekis
ir maţesnis kiekis (0,263 proc.) petunidino (14 lentelė). Delfinidino koncentracija šilauogių
vaisiuose svyravo nuo 0,027 iki 0,365 proc. Didţiausias variacijos koeficientas, atspindintis junginio
variacijos amplitudę nustatytas peonidinui (77,63 proc.). Maţiausią antocianidinų komplekso dalį
šilauogių vaisiuose sudarė peonidinas, jo kiekis įvairavo nuo 0,002 iki 0,115 proc.
72
25 pav. Vaccinium corymbosum L. vaisių ekstrakto ESC chromatograma.
Analičių smailės pagal sulaikymo trukmę: 1- delfinidinas, 2- cianidinas, 3- petunidinas, 4-
peonidinas, 5- malvidinas
14 lentelė. Šilauogių vaisių antocianidinų sudėties ir sklaidos charakteristika (n=14)
Min. – minimali reikšmė, Maks. – maksimali reikšmė, M – aritmetinis vidurkis, S x - vidurkio standartinė paklaida, Me –
mediana, V – variacijos koeficientas.
Antocianidinai
Keikis, proc.
Min. Maks. M S x Me V, proc.
Delfinidinas 0,027 0,365 0,175 0,028 0,143 59,71
Cianidinas 0,054 0,356 0,150 0,041 0,140 56,86
Petunidinas 0,064 0,464 0,263 0,030 0,245 43,12
Peonidinas 0,002 0,115 0,042 0,009 0,035 77,63
Malvidinas 0,012 0,575 0,286 0,047 0,269 61,42
73
Siekiant geriau suvokti Botanikos instituto lauko kolekcijose auginamų šilauogių vaisių
antocianidinų sudėties panašumus ir skirtumus bei tikėtinas cheminės sudėties sąsajas su atskiromis
veislėmis buvo atlikta hierarchinė klasterinė analizė. Klasterinės analizės dendrogramoje, sudarytoje
pagal individualių antocianidinų kiekius ţaliavose, ryškiai išsiskyrė 2 stambios grupės: šiek tiek
didesnė I-oji ir maţesnė II-oji (27 pav.). Pirmoji grupė apjungia 8 šilauogių veisles („Heerma―,
„Bluecrop―, „Dixi―, „Putte―, Northblue―, „Ama―, „Chignecto―, „North holna―) ir siauralapę
šilauogę. Antroji maţesnė grupė apjungia 5 veisles („Northcountry―, „Berkeley―, „Rancocas―,
„Northland―, „Patriot―). Skirtumus tarp išskirtų klasterių patvirtina ir aprašomosios statistikos
rezultatai pateikti 15 lentelėje. I-oji grupė išsiskyrė maţesniais uţ vidurkį visų antocianidinų
kiekiais. II-ajai grupei priskiriamos veislės sukaupia didesnius uţ vidurkį individualių antocianidinų
kiekiais. II-ajai grupei priklausančios veislės yra vertingesnės, kadangi jų vaisiuose susikaupę
didesni veikliųjų junginių – antocianidinų kiekiai.
27 pav. Šilauogių panašumo pagal antocianidinų sudėtį vaisiuose dendrograma
74
15 lentelė. Šilauogių vaisių antocianidinų sudėties ir sklaidos charakteristika klasteriuose (n=14)
Min. – minimali reikšmė, Maks. – maksimali reikšmė, Me – mediana, Q3-Q1 – kvartilinis plotis
0%
20%
40%
60%
80%
100%
I II
klasteriai
Malvidinas
Peonidinas
Petunidinas
Cianidinas
Delfinidinas
28 pav. Šilauogių vaisių antocianidinų santykinės dalies įvairavimas grupėse, išskirtose
hierarchinės klasterinės analizės pagalba (klasterių numeriai pagal 27 pav.)
Antocianidinai Klasteriai
Keikis, proc.
Min. Maks. Me Q3-Q1
Delfinidinas
Cianidinas
Petunidinas
Peonidinas
Malvidinas
I 0,027 0,160 0,134 0,069
II 0,159 0,365 0,316 0,122
I 0,054 0,172 0,091 0,083
II 0,137 0,356 0,174 0,170
I 0,064 0,318 0,187 0,080
II 0,304 0,464 0,386 0,110
I 0,002 0,044 0,021 0,024
II 0,044 0,115 0,066 0,055
I 0,012 0,370 0,169 0,175
II 0,352 0,575 0,498 0,193
75
Hierarchinės klasterinės analizės pagalba išskirtų grupių statistiniam palyginimui taikytas
ranginis Mann‗o Whitney‗o kriterijus nepriklausomoms imtims. Naudojantis Mann‗o - Whitney‗o
testu nustatyta, kad klasterinės analizės būdu išskirtos grupės statistiškai reikšmingai (p<0,05)
skiriasi pagal delfinidino, cianidino, petunidino ir malvidino kiekius šilauogių vaisiuose.
Siekiant palyginti ir įvertinti introdukuotų šilauogių veisles svarbu palyginti ne tik
antocianinų ar antocianidinų kiekius šilauogių vaisiuose, bet ir individualių antocianidinų
santykinius kiekius analizuotuose ėminiuose. Įvertinta procentinė individualių antocianidinų sudėtis
klasterinės analizės pagalba išskirtose grupėse. Gauti rezultatai pateikti 28 pav. Antocianidinų kiekio
procentinės dalies įvairavimas tarp šilauogių vaisių ėminių įrodo, kad tirtiems šilauogių vaisių
bandiniams būdingas neţymus cheminis polimorfizmas. Nustatyta, kad I-oje grupėje apjungtoms
veislėms būdingas didesnis petunidino santykinis kiekis, tuo tarpu II-oje didţiausią dalį sudarė
malvidinas. Gauti rezultatai leidţia vertinti introdukuotų šilauogių vaisius kaip kokybišką ţaliavą,
besiskiriančią tik kiekiniais antocianidinų sudėties rodikliais.
Išanalizavus Botanikos instituto lauko kolekcijose auginamų šilauogių veislių bei
siauralapės šilauogės vaisių pavyzdţius galima teigti, jog daugiausiai antocianinų kaupiančios yra
„Berkeley―, „Northland―, „Northcountry― ir „Ama― šilauogių veislės. Didţiausi suminiai
antocianidinų kiekiai nustatyti „Northland― ir Northcountry― bei „Rancocas― veislių ţaliavose.
Paţymėtina, kad šilauogėse antocianidinų komplekse dominavo malvidinas. Antocianidinų
komplekso santykinės dalies įvairavimas gali būti svarbus chemotaksonominis poţymis, atspindintis
Vaccinium L. genties genotipinę bei tarprūšinę įvairovę.
Antocianinų ir antocianidinų sudėties įvairavimas šilauogių vaisių ţievelėse.
Vertinant mėlynių ir šilauogių vaisių homogeniškumą, atlikus fitocheminius tyrimus, pastebėti
antocianinų sudėties skirtumai tarp vaisių ţievelių ir minkštimų. Ypač dideli cheminės sudėties
skirtumai nustatyti šilauogių vaisiuose, kuriuose didţiausios antocianinų koncentracijos
susitelkusios vaisių ţievelėse [216]. Siekiant aiškiau suvokti veikliųjų junginių kaupimosi
dėsningumus, svarbu ištirti antocianinų sudėties įvairavimą šilauogių vaisių ţievelėse (egzokarpyje),
minkštimuose (mezokarpyje) ir išspaudose bei nustatyti tikėtinus priklausomybės ryšius tarp atskirų
veislių ir antocianinų koncentracijų.
Įvertinus suminius antocianinų ir antocianidinų kiekius tirtų šilauogių ţievelėse,
nustatyta, kad suminio antocianinų (0,519 - 1,983 proc.) ir antocianidinų (0,428 - 1,916 proc.) kiekio
įvairavimo amplitudė labai plati (29 pav.).
76
Didţiausi suminiai antocianinų kiekiai nustatyti „Rancocas― (1,983 proc.), „Putte― (1,505
proc.) veislių ir siauralapės (V. angustifolium Aiton.) (1,603 proc.) šilauogių ţievelėse. Didţiausi
suminiai antocianidinų kiekiai nustatyti „Rancocas― (1,916 proc.), „Northland― (1,559 proc.) ir
„Heerma― (1,387 proc.) veislių vaisių ţievelėse. Maţiausi suminiai antocianinų (0,519 proc.) ir
antocianidinų (0,428 proc.) kiekiai nustatyti „Dixi― veislės vaisių ţievelėse.
Analizuojant aprašomosios statistikos rezultatus, pateiktus 16 lentelėje, matyti, kad
šilauogių vaisių ţievelėse kaip ir vaisiuose daugiausiai nustatyta malvidino (nuo 0,139 iki 0,734
proc.) bei petunidino (nuo 0,118 iki 0,513 proc.), o maţiausiai peonidino (nuo 0,018 iki 0,082 proc.).
Lyginant cianidino ir delfinidino kiekius pastebėta, kad šilauogių vaisių ţievelėse susikaupę 1,6
karto didesni delfinidino kiekiai, o vaisiuose šių antocianidinų kiekiai vienodi.
0,000 0,500 1,000 1,500 2,000
"Dixi"
"Putte"
"Rancocas"
"Heerma"
"Bluecrop"
"Ama"
"Northblue"
"Northcuontry"
"Northland"
"Berkeley"
Siauralapė
"Patriot"
"Chignecto"
"North holna"
kiekis, proc.
antocianinų suma antocianidinų suma
29 pav. Suminio antocianinų ir antocianidinų kiekio įvairavimas šilauogių vaisių ţievelėse
Skirtingų šilauogių veislių vaisių ţievelių cheminės sudėties panašumus pagal sukauptus
antocianidinų kiekius pateikti hierarchinės klasterinės analizės dendrogramoje, kurioje tirtos veislės
pasiskirstė į 2 stambias grupes (30 pav.). I-oji grupė stambesnė, ją sudaro 9 šilauogių
77
16 lentelė. Šilauogių vaisių ţievelių antocianidinų sudėties ir sklaidos charakteristika (n=14)
Min. – minimali reikšmė, Maks. – maksimali reikšmė, M – aritmetinis vidurkis, S x - vidurkio standartinė paklaida, Me –
mediana, V – variacijos koeficientas.
30 pav. Šilauogių vaisių ţievelių panašumo pagal antocianidinų sudėtį dendrograma
veislės („Bluecrop―, „Northholna―, „Dixi―, „Chignecto―, „Putte―, „Patriot―, „Ama―, „Northblue―,
„Northcountry―) ir siauralapė šilauogė. II-oji, maţesnė grupė apima 4 veisles: „Rancocas―,
„Northland―, „Heerma―, „Berkeley―. Skirtumus tarp išskirtų grupių atspindi ir aprašomosios
statistikos rezultatai, pateikti 17 lentelėje. I-oji grupė pasiţymėjo maţesniais uţ vidurkį visų
antocianidinų kiekiais. Tuo tarpu, II-ajai grupei priklausančios veislės išsiskyrė didesniais uţ vidurkį
individualių antocianidinų kiekiais. Akivaizdu, jog II-ajai grupei priklausančios veislės yra
vertingesnės, kadangi jų vaisių ţievelėse susikaupę didesni veikliųjų junginių – antocianidinų
kiekiai.
Antocianidinai
Keikis, proc.
Min. Maks. M S x Me V, proc.
Delfinidinas 0,078 0,405 0,197 0,031 0,176 59,76
Cianidinas 0,055 0,244 0,120 0,015 0,108 47,41
Petunidinas 0,118 0,513 0,251 0,034 0,227 50,20
Peonidinas 0,018 0,082 0,043 0,006 0,041 51,34
Malvidinas 0,139 0,734 0,327 0,046 0,293 52,36
78
Hierarchinės klasterinės analizės pagalba išskirtų grupių statistiniam palyginimui naudotas
ranginis Mann‗o - Whitney‗o kriterijus nepriklausomoms imtims. Remiantis šiuo testu nustatyta,
kad klasterinės analizės metodu išskirtos grupės statistiškai reikšmingai (p<0,05) skiriasi pagal visų
antocianidinų (delfinidino, cianidino, petunidino, peonidino ir malvidino) kiekius šilauogių vaisių
ţievelėse.
Atlikto identifikuotų antocianidinų santykinės dalies įvairavimo skirtingose grupėse
įvertinimo rezultatai rodo neţymius šių junginių kiekių santykio svyravimus šilauogių vaisių
ţievelėse (31 pav.).
17 lentelė. Šilauogių vaisių ţievelių antocianidinų sudėties ir sklaidos charakteristika klasteriuose
(n=14)
Min. – minimali reikšmė, Maks. – maksimali reikšmė, Me – mediana, Q3-Q1 – kvartilinis plotis
Antocianidinai Klasteriai
Keikis, proc.
Min. Maks. Me Q3-Q1
Delfinidinas
Cianidinas
Petunidinas
Peonidinas
Malvidinas
I 0,078 0,208 0,108 0,101
II 0,256 0,405 0,381 0,120
I 0,055 0,172 0,099 0,051
II 0,108 0,244 0,189 0,102
I 0,118 0,273 0,175 0,127
II 0,308 0,513 0,423 0,160
I 0,018 0,082 0,027 0,026
II 0,043 0,075 0,059 0,031
I 0,139 0,406 0,241 0,157
II 0,344 0,734 0,490 0,352
79
0%
20%
40%
60%
80%
100%
I II
klasteriai
Malvidinas
Peonidinas
Petunidinas
Cianidinas
Delfinidinas
31 pav. Šilauogių vaisių ţievelių antocianidinų santykinės dalies įvairavimas grupėse, išskirtose
hierarchinės klasterinės analizės pagalba (klasterių numeriai pagal 30 pav.)
Atlikus Lietuvos gamtinėmis sąlygomis Botanikos instituto lauko kolekcijose uţaugintų
šilauogių vaisių ţievelių antocianinų sudėties tyrimus nustatyta, jog daugiausiai antocianinų
susikaupę „Rancocas―, „Putte― veislių ir siauralapės (V. angustifolium Aiton.) šilauogių vaisių
ţievelėse. Didţiausi suminiai antocianidinų kiekiai nustatyti ― Rancocas―, „Northland― ir „Heerma―
vaisių ţievelėse. Maţiausi suminiai antocianinų ir antocianidinų kiekiai aptikti „Dixi― veislės vaisių
ţievelėse.
Antocianinų ir antocianidinų sudėties įvairavimas šilauogių vaisių minkštimuose.
Remiantis mokslinės literatūros šaltiniais, šilauogių vaisių minkštimuose nustatyti ţymiai maţesni
antocianinų kiekiai [216]. Svarbu išaiškinti šilauogių veisles, kurių vaisių mezokarpyje susikaupę
didţiausi antocianinų ir antocianidinų kiekiai.
Įvertinus suminius antocianinų ir antocianinų kiekius tirtų šilauogių minkštimuose,
nustatyta, kad suminio antocianinų (0,011 - 0,088 proc.) bei antocianidinų (0,003 - 0,395 proc.)
kiekio įvairavimo amplitudė yra gan plati. Tyrimų rezultatai pateikti 32 pav. Didţiausi suminiai
antocianinų kiekiai nustatyti „North holna― (0,088 proc.), „Putte― (0,068 proc.) ir „Berkeley― (0,051
proc.) veislių šilauogių minkštimuose, o didţiausi suminiai antocianidinų kiekiai nustatyti
„Berkeley― (0,395 proc.), „North holna― (0,167 proc.) bei „Northland― (0,170 proc.) vaisių
minkštimuose. Maţiausi suminiai antocianinų kiekiai nustatyti „Patriot― (0,011 proc.), o
antocianidinų „Dixi― (0,003 proc.) veislių vaisių mezokarpyje.
80
Aprašomosios statistikos rezultatai pateikti 18 lentelėje, rodantys, jog šilauogių
minkštimuose, kaip ir vaisiuose bei ţievelėse, daugiausiai susikaupę malvidino (0,005 - 0,135 proc.)
bei petunidino (0,003 - 0,110 proc.), o maţiausiai peonidino (0,001 - 0,021 proc.).
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350 0,400 0,450
"Dixi"
"Putte"
"Rancocas"
"Heerma"
"Bluecrop"
"Ama"
"Northblue"
"Northcuontry"
"Northland"
"Berkeley"
Siauralapė
"Patriot"
"Chignecto"
"North holna"
kiekis, proc.
antocianinų suma antocianidinų suma
32 pav. Suminio antocianinų ir antocianidinų kiekio įvairavimas šilauogių vaisių minkštimuose
18 lentelė. Šilauogių vaisių minkštimų antocianidinų sudėties ir sklaidos charakteristika (n=14)
Min. – minimali reikšmė, Maks. – maksimali reikšmė, M – aritmetinis vidurkis, S x - vidurkio standartinė paklaida, Me –
mediana, V – variacijos koeficientas.
Antocianidinai
Keikis, proc.
Min. Maks. M S x Me V, proc.
Delfinidinas 0,002 0,065 0,018 0,005 0,019 111,71
Cianidinas 0,002 0,064 0,021 0,005 0,017 84,01
Petunidinas 0,003 0,110 0,038 0,008 0,041 77,15
Peonidinas 0,001 0,021 0,003 0,002 0,000 204,48
Malvidinas 0,005 0,135 0,041 0,010 0,039 98,01
81
Visų antocianidinų kiekiai varijavo plačiose ribose. Didţiausi variacijos koeficientai apskaičiuoti
peonidinui ir delfinidinui, atitinkamai 204,48 ir 111,71 proc.
Hierarchinės klasterinės analizės dendrograma atskleidė skirtingų veislių šilauogių
vaisių minkštimų panašumus pagal sukauptus individualių antocianidinų kiekius. Dendrogramoje
tirtos veislės pasiskirstė į 2 stambias panašaus dydţio grupes (33 pav.). I-ąją grupę sudaro 5
šilauogių veislės („Putte―, „Chignecto―, „Dixi―, „Northcountry―, „Bluecrop―) ir siauralapė šilauogė.
II-oji grupė apima 7 veisles: „Heerma―, „Northblue―, „Ama―, „Rancocas―, „North holna―,
„Northland―, „Patriot―. „Berkeley― veislės minkštimai išsiskyrė itin dideliais visų antocianidinų
kiekiais ir dėl to nebuvo priskirta prie išskirtų klasterių.
Aprašomosios statistikos rezultatai pateikti 19 lentelėje rodo skirtumus tarp grupių. I-oji
grupė pasiţymėjo maţesniais uţ vidurkį visų antocianidinų kiekiais, tačiau II-ajai grupei
priklausančios veislės išsiskyrė didesniais uţ vidurkį individualių antocianidinų kiekiais. Nustatyta,
kad II-ajai grupei priklausančios veislės vertingesnės, kadangi jų vaisių minkštimuose susikaupusios
didesnės veikliųjų junginių – antocianidinų atsargos.
Hierarchinės klasterinės analizės pagalba išskirtų grupių statistiniam palyginimui
pritaikytas ranginis Mann‗o - Whitney‗o kriterijus nepriklausomoms imtims. Remiantis šiuo testu
nustatyta, kad klasterinės analizės būdu išskirtos grupės statistiškai reikšmingai (p<0,05) skiriasi
pagal visų antocianidinų (delfinidino, cianidino, petunidino, peonidino ir malvidino) kiekius
šilauogių minkštimuose.
33 pav. Šilauogių vaisų minkštimų panašumo pagal antocianidinų sudėtį dendrograma
82
19 lentelė. Šilauogių vaisių minkštimų antocianidinų sudėties ir sklaidos charakteristika
klasteriuose (n=14)
Min. – minimali reikšmė, Maks. – maksimali reikšmė, Me – mediana, Q3-Q1 – kvartilinis plotis
Siekiant palyginti Botanikos instituto kolekcijose uţaugintų šilauogių veisles pagal
individualių antocianidinų kiekius šilauogių vaisių mezokarpyje įvertinta procentinė atskirų
antocianidinų dalis klasterinės analizės metodu išskirtose grupėse bei „Berkeley― veislėje ir gauti
rezultatai pateikti 34 pav. Nustatyta, kad I-ajai grupei priskirtoms veislėms būdingas didesnis
petunidino santykinis kiekis, o II-oje petunidinas, peonidinas ir malvidinas sudaro gana artimas
antocianinų komplekso dalis. „Berkeley― veislės minkštimams būdingas antocianidinų santykis
panašus į šilauogių vaisių santykinę sudėtį.
Antocianidinai Klasteriai
Keikis, proc.
Min. Maks. Me Q3-Q1
Delfinidinas
Cianidinas
Petunidinas
Peonidinas
Malvidinas
I 0,002 0,024 0,000 0,002
II 0,017 0,030 0,023 0,008
I 0,002 0,044 0,004 0,015
II 0,016 0,031 0,022 0,009
I 0,003 0,062 0,010 0,019
II 0,040 0,060 0,051 0,013
I 0,001 0,009 0,000 0,001
II 0,001 0,005 0,001 0,004
I 0,005 0,056 0,005 0,020
II 0,032 0,065 0,055 0,020
83
0%
20%
40%
60%
80%
100%
I II "Berkeley"
Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas
34 pav. Šilauogių vaisių minkštimų antocianidinų santykinės dalies įvairavimas pogrupiuose,
išskirtuose hierarchinės klasterinės analizės pagalba (klasterių numeriai pagal 33 pav.) ir
„Berkeley“ veislės vaisių minkštimuose
Atlikus Lietuvos klimatinėmis sąlygomis uţaugintų sodinių šilauogių veislių vaisių
minkštimų antocianinų sudėties tyrimus apibendrinant galima teigti, jog daugiausiai antocianinų
susikaupę „North holna―, „Putte― ir „Berkeley― veislių šilauogių minkštimuose. Didţiausi suminiai
antocianidinų kiekiai nustatyti „Berkeley―, „North holna― ir „Northland― veislių minkštimuose. Iš
visų tyrinėtų pavyzdţių didţiausiais individualių antocianidinų kiekiais išsiskyrė „Berkeley― veislės
minkštimai. Maţiausi suminiai antocianinų kiekiai aptikti „Patriot―, o antocianidinų „Dixi― veislių
vaisių minkštimuose.
Šilauogių vaisių išspaudų antocianinų ir antocianidinų sudėties įvairavimas. Vaisių išspaudos –
maisto pramonės atlieka, kuri gali būti panaudota kaip pigi ir turtinga veikliaisiais junginiais ţaliava
antocianinų ekstrakcijai. Atlikti moksliniai tyrimai su vynuogių išspaudomis parodė, jog išspaudos
gali būti ekonomiškai naudinga ţaliava antocianinų ekstraktų gamyboje [129, 164]. Tikslinga
išsiaiškinti šilauogių vaisių išspaudų antocianinų sudėties kokybinių ir kiekybinių parametrų
įvairavimą tirtose veislėse ir įvertinti galimybę panaudoti išspaudas vaistinių preparatų gamyboje.
Tam tikslui analizuota Botanikos instituto kolekcijose surinktų 13-os sodinių šilauogių veislių ir 1-
os siauralapės šilauogės išspaudų pavyzdţiai.
Atlikus spektrofotometrinį tyrimą, didţiausi antocianinų kiekiai nustatyti, „Rancocas―
(2,114 proc.), „Northblue― (1,196 proc.), „Berkeley― (1,152 proc.) veislių vaisių išspaudų
ekstraktuose. Maţiausias suminis antocianinų kiekis nustatytas „North holna― (0,432 proc.),
84
„Bluecrop― (0,538 proc.) bei „Dixi― (0,538 proc.) veislių išspaudų ėminiuose. Didţiausi suminiai
antocianidinų kiekiai nustatyti „Rancocas― (1,477 proc.) ir „Putte― (0,974 proc.) sodinių šilauogių
veislių bei siauralapės (1,152 proc.) vaisių išspaudose, o maţiausi suminiai antocianidinų kiekiai
nustatyti „North holna― (0,438 proc.), "Bluecrop" (0,226 proc.) ir "Heerma" (0,496 proc.) veislių
vaisių bandiniuose (35 pav.).
0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500
"Dixi"
"Putte"
"Rancocas"
"Heerma"
"Bluecrop" "Ama"
"Northblue"
"Northcuont
"Northland" "Berkeley"
Siauralapė
"Patriot"
"Chignecto"
"North
kiekis, proc.
antocianinų suma antocianidinų suma
35 pav. Suminio antocianinų ir antocianidinų kiekių įvairavimas šilauogių išspaudų ėminiuose
Aprašomosios statistikos rezultatai pateikti 20 lentelėje. Tirtuose šilauogių išspaudų
pavyzdţiuose, kaip ir vaisių ėminiuose nustatytas didţiausias vidutinis malvidino kiekis (0,223
proc.), maţesnis petunidino kiekis (0,061 - 0,315 proc.). Delfinidino koncentracija šilauogių vaisių
išspaudose svyravo nuo 0,051 iki 0,264 proc. Didţiausias variacijos koeficientas, atspindintis
junginio variacijos amplitudę apskaičiuotas cianidinui (93,81 proc.). Maţiausią antocianidinų
komplekso dalį šilauogių vaisių išspaudose sudarė peonidinas, jo kiekis įvairavo nuo 0,009 iki 0,162
proc.
Atlikta hierarchinė klasterinė analizė, kurios dendrogramoje, sudarytoje analizuojant
individualių antocianidinų kiekius vaisių išspaudose, aiškiai išsiskyrė 2 stambios grupės: šiek tiek
smulkesnė I-oji ir stambesnė II-oji. Pirmoji grupė apjungia 6 sodinių šilauogių veisles („Dixi―,
„Heerma―, „North holna―, „Ama―, „Chignecto―, „Bluecrop―). Antroji didesnė grupė susideda iš 6
veislių („Northblue―, „Northland―, „Putte―, „Northcountry―, „Berkeley―, „Patriot―) ir siauralapės
šilauogės. „Rancocas― veislės išspaudos išsiskyrė didesniais uţ vidurkį visų antocianidinų kiekiais,
85
todėl klasterinės analizės metu išskirtoms grupėms nepriskirta. I-oji grupė išsiskyrė maţesniais uţ
vidurkį visų antocianidinų kiekiais. Tuo tarpu II-ajai grupei priklausančios veislės pasiţymėjo uţ
vidurkį didesniais individualių antocianidinų kiekiais.
20 lentelė. Šilauogių vaisių išspaudų antocianidinų sudėties ir sklaidos charakteristika (n=14)
Min. – minimali reikšmė, Maks. – maksimali reikšmė, M – aritmetinis vidurkis, S x - vidurkio standartinė paklaida, Me –
mediana, V – variacijos koeficientas.
36 pav. Šilauogių vaisių išspaudų panašumo pagal antocianidinų sudėtį dendrograma
Hierarchinės klasterinės analizės pagalba išskirtų grupių statistiniam palyginimui taikytas
ranginis Mann‗o Whitney‗o kriterijus nepriklausomoms imtims. Naudojantis šiuo testu nustatyta,
kad klasterinės analizės metodu išskirtos grupės statistiškai reikšmingai (p<0,05) skiriasi pagal
delfinidino, cianidino, petunidino, peonidino ir malvidino kiekius šilauogių ţievelėse.
Įvertinta procentinė atskirų antocianidinų dalis klasterinės analizės metodu išskirtose
grupėse ir gauti rezultatai pateikti 37 pav. Antocianidinų kiekio procentinės dalies įvairavimas tarp
skirtingų V. corymbosum L. veislių išspaudų pavyzdţių rodo, kad tirtoms veislėms būdingas
Antocianidinai
Keikis, proc.
Min. Maks. M S x Me V, proc.
Delfinidinas 0,051 0,264 0,171 0,017 0,174 35,29
Cianidinas 0,047 0,657 0,163 0,041 0,120 93,88
Petunidinas 0,061 0,315 0,204 0,019 0,203 35,13
Peonidinas 0,009 0,162 0,046 0,010 0,033 83,10
Malvidinas 0,058 0,437 0,223 0,031 0,190 51,23
86
neţymus cheminis polimorfizmas. Nustatyta, kad I-oje grupėje esančioms veislėms būdingas
didesnis petunidino santykinis kiekis, tuo tarpu II-oje didţiausią antocianidinų komplekso dalį
sudarė malvidinas. „Rancocas― veislės išspaudos išsiskyrė didesniu cianidino ir peonidino
santykiniu kiekiu bei maţesne petunidino santykine dalimi (21 lentelė).
21 lentelė. Šilauogių vaisių išspaudų antocianidinų sudėties ir sklaidos charakteristika klasteriuose
(n=14)
Min. – minimali reikšmė, Maks. – maksimali reikšmė, Me – mediana, Q3-Q1 – kvartilinis plotis
Antocianidinai Klasteriai
Keikis, proc.
Min. Maks. Me Q3-Q1
Delfinidinas
Cianidinas
Petunidinas
Peonidinas
Malvidinas
I 0,051 0,164 0,118 0,073
II 0,118 0,226 0,222 0,051
I 0,047 0,124 0,088 0,053
II 0,082 0,250 0,129 0,099
I 0,061 0,193 0,139 0,139
II 0,192 0,315 0,269 0,065
I 0,009 0,032 0,021 0,015
II 0,027 0,069 0,058 0,033
I 0,058 0,162 0,133 0,054
II 0,218 0,437 0,336 0,133
87
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
I II "Rancocas"
Delfinidinas Cianidinas Petunidinas Peonidinas Malvidinas
37 pav. Šilauogių išspaudų antocianidinų santykinės dalies įvairavimas pogrupiuose, išskirtuose
hierarchinės klasterinės analizės pagalba (klasterių numeriai pagal 36 pav.) ir „Rancocas“ veislės
vaisių išspaudose
Kompleksiškai perdirbant šilauogių vaisių augalines ţaliavas, gaunamas vaisių išspaudas
galima sėkmingai panaudoti maisto papildų gamyboje. Atlikus šilauogių vaisių išspaudų
antocianidinų analizę apibendrintai galima teigti, jog išspaudų antocianidinų cheminės sudėties
kokybiniai rodikliai nesiskiria nuo atitinkamų veislių vaisių išspaudų bandinių antocianinų ir
antocianidinų sudėtimi. Šilauogių išspaudas galima vertinti kaip vertingą, turtingą antocianinais
ţaliavą, tinkančią fitopreparatų gamyboje. Vertingiausios, daugiausiai antocianinų kaupiančios yra
„Rancocas―, „Northblue― ir „Berkeley― šilauogių veislių vaisių išspaudos. Didţiausi suminiai
antocianidinų kiekiai nustatyti Rancocas― ir „Putte― sodinių šilauogių veislių bei siauralapės
šilauogės vaisių išspaudose.
3.2. Vaccinium L. genties augalų vaisių ekstraktų biologinio poveikio tyrimai
3.2.1. Vaccinium L. genties rūšių augalinių ţaliavų vaisių ekstraktų antiradikalinių savybių
įvertinimas
Literatūros duomenimis Vaccinium L. genties vaisių ekstraktai pasiţymi
antioksidantiniu poveikiu. Atlikti tyrimai, taikant įvairius antioksidantinio aktyvumo tyrimo
modelius parodė, jog mėlynių ir šilauogių vaisiuose esančios veikliosios medţiagos įvairiais
mechanizmais gali sumaţinti oksidacinio streso atsiradimo tikimybę [74]. Nustatyti tamprūs
koreliaciniai ryšiai tarp antioksidantinio aktyvumo ir polifenolinių junginių (fenilkarboninių rūgščių,
88
antocianinų, flavonolių) kiekio vaistinėse augalinėse ţaliavose [59, 74, 128, 181, 199, 224].
Antocianinai yra viena iš svarbiausių gamtinių biologiškai aktyvių junginių grupių, natūralių
antioksidantų, nustatytų daugelyje augalinės kilmės produktų [59, 181].
Moksliniais tyrimais įrodyta, kad antiradikalinėmis savybėmis pasiţymintys antocianinai
atiduoda elektroną ar vandenilio atomą iš hidroksilo grupės laisviesiems radikalams ir taip juos
suriša nutraukdami oksidacinius procesus [260]. Antocianinai yra potencialūs laisvųjų radikalų
surišėjai, gebantys surišti •O2¯, HO•, H2O2, 1O2 laisvuosius radikalus [192, 263, 264]. Siekiant
įvertinti antocianinais turtingų mėlynių ir šilauogių ekstraktų biologinio poveikio ypatumus tikslinga
įvertinti tiriamų ţaliavų preparatų antioksidantines savybes in vitro bei in vivo modeliuose.
Didėjantį pasaulio mokslininkų susidomėjimą antioksidantais iliustruoja per dešimtmetį
(1996-2006 m.) net 345 % išaugęs mokslinių straipsnių skaičius, kuriuose aprašomi antioksidantinio
poveikio tyrimai [162]. Antioksidantinių savybių tyrimai yra aktualūs ir svarbūs, kadangi laisvieji
radikalai yra glaudţiai susiję su daugelio ligų etiologija (išeminė širdies liga, insultas, reumatoidinis
artritas, regėjimo bei atminties sutrikimai, degeneraciniai susirgimai, vėţys ir kt.) [201].
Antiradikalinių savybių tyrimui naudojami cheminiai metodai, remiantis naudojamais oksidantais,
paprastai skirstomi į biologinius (superoksido anijono radikalo, vandenilio peroksido, hidroksilo
radikalo, singletinio deguonies, azoto osksido radikalo) ir ne biologinius (DFPH-1,1-difenil-2-
pikrilhidrazilo, ABTS-,2′-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfoninės rūgšties), geleţies katijono)
[162].
38 pav. DFPH radikalo inaktyvacijos priklausomybė nuo laiko
89
Preliminariam tiriamų ekstraktų antiradikalinių savybių įvertinimui pasirinktas
fotometrinis DFPH sujungimo metodas. Antioksidantinis aktyvumas įvertinamas matuojant, kiek
procentų stabilaus DFPH radikalo neutralizuoja tiriamajame ekstrakte esantys ir antioksidantiniu
aktyvumu pasiţymintys junginiai. Spektrofotometrinis DFPH metodas neparodo individualių
antocianinų antioksidantinio aktyvumo. Jo dėka nustatomas bendras, t.y. suminis visų ekstrakte
esančių atioksidantinėmis savybėmis pasiţyminčių junginių antioksidantinis aktyvumas. Šilauogių ir
mėlynių vaisiuose antioksidantinėmis savybėmis pasiţymi ne tik antocianinai, bet ir daugelis kitų
biologiškai aktyvių medţiagų. Šilauogės genties vaisiuose be antocianinų nustatyta flavonoidų,
fenolinių rūgščių, askorbo rūgšties, kurios taip pat pasiţymi stipriai išreikštomis antioksidantinėmis
savybėmis [17, 44, 199 255].
Pradiniame tyrimo etape, buvo įvertinta laisvojo radikalo (DFPH) inaktyvavimo
priklausomybė nuo laiko trukmės. Stebint absorbcijos pokyčius nustatyta, jog ilgėjant ekspozicijos
laikui, proporcingai didėja ir inaktyvuoto DFPH radikalo kiekis. Pusiausvyra, kai nebekinta
inaktyvuoto laisvojo radikalo kiekis, nusistovėjo per 30 min. Laisvojo radikalo inaktyvacijos
priklausomybė nuo laiko trukmės nustatyta šilauogių ir mėlynių vaisių ir ţievelių, ekstraktuose (38
pav.).
22 lentelė. Antiradikalinių savybių palyginimas mėlynių ir šilauogių vaisių, ţievelių, minkštimų ir
išspaudų ekstraktuose.
Tyrimo objektas Inaktyvuoto DFPH radikalo kiekis, proc.
V. corymbosum L. V. myrtillus L.
Vaisių ekstraktas 53,34 ± 0,76 63,72 ± 1,11
Vaisių ţievelių ekstraktas 76,68 ± 3,15 82,69 ± 0,37
Vaisių minkštimų ekstraktas 25,48 ± 0,10 53,27 ± 3,43
Vaisių išspaudų ekstraktas 72,87 ± 2,95 84,57 ± 1,24
Stipriausiomis antioksidantinėmis savybėmis išsiskyrė mėlynių vaisių išspaudų ekstraktai.
Surištojo laisvojo radikalo kiekis siekė 84,57 proc., maţesni jo kiekiai nustatyti ţievelių ekstraktuose
(82,69 proc.). Panašūs rezultatai gauti ir tiriant šilauogių pavyzdţius tik antiradikalinės savybės stipriau
išreikštos vaisių ţievelių ekstraktuose, inaktyvuoto DFPH kiekis siekė 76,68 proc., o išspaudų
ekstraktuose - 72,87 proc. Maţiausias surištojo radikalo kiekis nustatytas šilauogių (25,48 proc.), ir
mėlynių (53,27 proc.) minkštimų ekstraktuose (22 lentelė).
Tiriant mėlynių ir skirtingų šilauogių veislių vaisių ekstraktų antiradikalines savybes
nustatyta, jog šilauogių veislių („Berkeley―, „Ama―, „Northland―) vaisiai sukaupę didţiausius
90
antocianinų kiekius (24 pav.) taip pat pasiţymi stipriausiomis antiradikalinėmis savybėmis (23 lentelė).
Minėtos savybės būdingos „Berkeley― (82,31 proc.) „Ama― (81,65 proc.), „Northland― (52,83 proc.)
veislių vaisiams.
23 lentelė. Šilauogių ekstraktų antiradikalinės savybės
Eil. Nr. Šilauogių ekstraktai Inaktyvuoto DFPH kiekis, proc.
1. „Dixi― 15,73
2. „Putte― 35,58
3. „Rancocas― 36,49
4. „Heerma― 50,40
5. „Bluecrop― 33,22
6. „Ama― 81,65
7. „Northblue― 50,90
8. „Northcuontry― 22,95
9. „Northland― 52,83
10. „Berkeley― 82,31
11. Siauralapė 24,94
12. „Patriot― 10,01
13. „Chignecto― 6,10
14.
„North holna―
31,43
Apibendrinant galima teigti, jog spektrofotometriniu DFPH metodu galima greitai, patikimai ir
paprastai įvertinti tiriamų augalinių ţaliavų ekstraktų antiradikalines savybes. Stipriausiai išreikštomis
antiradikalinėmis savybėmis išsiskyrė mėlynių vaisių išspaudų ekstraktai, maţiausias surištojo radikalo
kiekis nustatytas šilauogių (25,48 proc.) ir mėlynių vaisių (53,27 proc.) minkštimų ekstraktuose.
Įvertintos vaisių antiradikalinės savybės ir nustatytas tiesioginis ryšys tarp antocianinų kiekio
ekstraktuose ir jų gebėjimo surišti laisvuosius radikalus. Tolimesniuose tyrimuose būtų tikslinga
išsiaiškinti atskirų veikliųjų junginių antioksidantines savybes pritaikant atrankesnes nustatymo
metodikas.
3.2.2. Vaccinium myrtillus L. vaisių etanolinio ir vandeninio ekstraktų poveikis ţiurkės širdies
mitochondrijų funkcijoms
Širdies mitochondrijos yra labai svarbios ląstelės organelės, kurios oksidacinio
fosforilinimo metu pagamina net 95 proc. ATP, reikalingo gyvybiniams procesams vykti. Nemaţai
91
susirgimų (kardiomiopatijos, išeminė širdies liga ir t.t.) yra susiję su širdies mitochondrijų funkcijos
sutrikimais, todėl siekiant kryptingai veikti mitochondrijų aktyvumą, struktūrą ir funkcijas, būtina
ištirti mitochondrijų atsaką į įvairių faktorių, jų tarpe ir į biologiškai aktyvių junginių, poveikį.
Duomenų apie tiesioginį antocianinų poveikį mitochondrijų oksidaciniam fosforilinimui
mokslinės literatūros duomenų bazėje nėra arba jie labai riboti, buvo tikslinga tirti mėlynių vaisių
ekstraktų (etanolinio ir vandeninio) ir antocianinų poveikį ţiurkės širdies mitochondrijų kvėpavimo
parametrams.
Pirmiausia įvertinome mėlynių vaisių vandeninio ekstrakto (MVE) ir mėlynių vaisių
etanolinio ekstrakto (MEE) poveikį piruvato+malato, t.y. mitochondrijų kvėpavimo grandinės I
komplekso substrato oksidacijai. Duomenys pateikti 24 ir 25 lentelėse. Nustatyta, kad mėlynių
vaisių vandeninis ekstraktas (iki 15 μl/1,5 ml) neveikė mitochondrijų kvėpavimo greičio antroje
metabolinėje būsenoje (V2), t.y. nedidino mitochondrijų membranos laidumo jonams. Toliau
didinant jo kiekį (20 μl ir 30 μl) buvo stebimas (1,2-1,3 kartus) oksidacijos ir fosforilinimo procesų
atskyrimas, tačiau statistiškai reikšmingas skirtumas gautas tik pridėjus 30 μl MVE. Mitochondrijų
kvėpavimo greičio trečioje metabolinėje būsenoje (V3) sumaţėjimas buvo stebimas tik esant terpėje
15 μl - 30 μl mėlynių vaisių vandeninio ekstrakto (nuo 27 iki 59 proc., p<0,05), tuo tarpu maţesni
MVE kiekiai statistiškai reikšmingo poveikio V3 neturėjo. Ištyrus MEE, nustatyta, kad jis 29-55
proc. (15 μl -30 μl) slopino V3, t.y panašiai, kaip ir MVE. Mitochondrijų kvėpavimo kontrolės
koeficientas (KKK) sumaţėjo 46-64 proc. (MVE ) ir 40-64 proc. (MEE), atitinkamai, ir tiktai
pridėjus didesnius (15-30 μl) ekstraktų kiekius. Maţesnės MVE ir MEE koncentracijos statistiškai
reikšmingo poveikio KKK neturėjo. Įdomu tai, kad MEE (0,5-20 μl) neveikė mitochondrijų
kvėpavimo greičio antroje metabolinėje būsenoje, o pridėjus didţiausią tirtą (30 μl MEE) kiekį, šis
efektas buvo toks pat (stimuliacija 1,31 karto) kaip ir pridėjus 30 μl MVE.
Tolesniuose eksperimentuose tyrėme mėlynių vaisių ekstraktų poveikį mitochondrijoms oksiduojant
sukcinatą, t.y. mitochondrijų kvėpavimo grandinės II komplekso substratą (25 ir 26 lentelės).
Nustatėme, jog MVE (2,5-15 μl/1,5 ml) statistiškai reikšmingai neveikė mitochondrijų funkcijos,
tačiau didesni kiekiai (20 ir 30 μl/1,5 ml) slopino V3 nuo 21 proc. iki 39 proc., atitinkamai, t.y.
maţiau lyginat su piruvato+malato oksidacija (39 pav.) ir neţymiai didino (1,3 ir 1,25 kartus,
p<0,05) mitochondrijų kvėpavimo greitį antroje metabolinėje būsenoje (V2), t.y. neţymiai atskyrė
oksidacijos ir fosforilinimo procesus. MEE statistiškai reikšmingo poveikio į V3 neturėjo, o V2
statistiškai reikšmingai padidino tik pridėjus didţiausią tirtą (30 μl) MEE kiekį.
92
24 lentelė. Mėlynių vaisių vandeninio ekstrakto (MVE) poveikis ţiurkės širdies mitochondrijų funkcijai joms oksiduojant piruvatą + malatą.
Substratas piruvatas + malatas
Kontrolė MVE(2,5 MVE(5 MVE(10 MVE(15 MVE(20 MVE(30
µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml)
V2 34,84±2,55 35,01±2,11 36,01±1,61 39,00±2,43 39,34±1,88 39,90±2,28 36,78±2,00
V2 + MVE - 33,74±1,50 38,93±5,78 34,85±1,17 41,6±2,69 47,62±4,08 48,33±1,89
**
V3 300,13±11,53 307,83±12,27 201,69±9,2 283,83±6,6 220,2±21,25* 173,94±32,30
* 122,25±21,83
*
V4 19,96±3,41 18,88±2,43 20,63±1,42 24,47±1,53 26,24±3,10 35,7±4,91 37,5±1,94*
V4+Cyt c 55,09±3,68 51,97±2,23 52,99±1,65 66,28±3,87 84,68±1,69 102,72±3,83* 71,85±5,46
KKK 9,04±0,89 8,84±0,25 8,47±0,36 7,43±0,50 4,91±1,21* 4,28±0,68
* 3,29±0,49
*
25 lentelė. Mėlynių vaisių etanolinio ekstrakto (MEE) poveikis ţiurkės širdies mitochondrijų funkcijai joms oksiduojant piruvatą + malatą.
Substratas piruvatas + malatas
Kontrolė MEE(0,5 MEE(1 MEE(5 MEE(15 MEE(20 MEE(30
µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml)
V2 51,52±6,27 58,29±2,61 65,4±1,94 56,88±5,11 60,55±5,93 56,25±2,34 61,85±3,08
V2 + MEE - 54,62±3,49 61,95±2,40 55,25±4,09 63,33±3,70 58,78±1,32 80,75±4,81**
V3 345,60±17,34 298,70±19,25 322,75±6,84 291,00±7,69* 246,50±18,87
* 225,00±11,88
* 155,25±9,68
*
V4 45,38±6,07 43,29±2,27 46,25±3,10 46,75±5,22 40,36±1,83 51,63±0,90 64,30±3,33
V4+Cyt c 86,7±6,76 83,81±2,82 82,03±1,96 86,20±1,87 133,5±12,80 142,75±11,35 137,25±12,26
KKK 7,11±0,87 5,93±0,63 4,96±0,24 5,23±0,46 4,28±0,72 4,04±0,35* 2,55±0,28*
V2- mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje, esant 0,5 mg/ml mitochondrijų ir 5 mM piruvato + 5 mM malato. V3 -
mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, esant 1mM ADP. V4 – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje
būsenoje, esant 0,12 mM atraktilozido. V4+Cyt c, mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje būsenoje pridėjus 32 µM citochromo c.
93
KKK - mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas. n=3; *p<0,05 lyginant su atitinkama kontrole, **p<0,05 lyginant su V2 atitinkamoje
grupėje.
26 lentelė. MVE poveikis ţiurkės širdies mitochondrijų funkcijai joms oksiduojant sukcinatą.
Substratas sukcinatas
Kontrolė MVE(2,5 MVE(5 MVE(10 MVE(15 MVE(20 MVE(30
µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml)
V2 144,94±4,72 135,88±6,33 131,74±5,45 138,78±2,90 156,00±2,58 146,50±2,60 130,50±5,27
V2 + MVE - 151,72±12,45 151,39±7,85 148,68±4,02* 172,25±8,13 190,50±12,53** 163,79±7,88**
V3 274,31±10,46 257,51±19,96 253,07±12,33 232,73±7,42 242,75±6,28 217,75±7,44* 167,84±5,67*
V4 138,55±7,50 137,24±11,31 135,15±8,32 138,86±2,63 163,00±6,87 168,75±10,01 134,25±7,40
V4+Cyt c 233,62±11,09 205,88±11,73* 242,45±7,85 235,22±19,56 269,00±14,49* 277,00±18,69 277,00±28,55
KKK 1,89±0,03 1,91±0,19 1,93±0,10 1,68±0,03 1,56±0,02* 1,49±0,04* 1,29 ±0,05*
27 lentelė. MEE poveikis ţiurkės širdies mitochondrijų funkcijai joms oksiduojant sukcinatą.
Substratas sukcinatas
Kontrolė MEE(1 MEE(5 MEE(15 MEE(20 MEE(30
µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml) µl/1,5 ml)
V2 141,33±3,05 122,25±6,65 126,75±4,99 134,17±1,30 157,00±21,22 163,17±5,93
V2 + MEE - 120,50±7,14 129,25±5,44 137,33±5,24 162,00±19,29 173,17±7,43**
V3 238,83±14,41 185,00±7,56 212,00±10,86 189,50±16,02 269,33±11,57 215,33±10,04
V4 130,50±2,19 109,75±5,69* 120,50±3,07* 129,17±5,33 166,00±13,01 160,00±7,64
V4+Cyt c 251,50±12,58 239,00±12,02 253,25±1,97 258,83±18,22 250,00±15,59 251,50±1,44
KKK 1,68±0,07 1,52±0,08 1,67±0,02 1,41±0,11 1,50±0,04 1,28±0,03*
Substratas: 15 mM sukcinato (+2 mM amitalio). Eksperimentinės sąlygos – kaip 24 lentelėje. n=3; *p < 0,05 lyginant su atitinkama kontrole;
**p<0,05 lyginant su V2 atitinkamoje grupėje.
94
Gauti rezultatai rodo, jog piruvato+malato oksidacija yra jautresnė mėlynių vaisių ekstrakto
poveikiui (MVE ir MEE) negu sukcinato oksidacija (39 pav. ir 40 pav.). Ankstesni mokslininkų darbai
atskleidė, kad kai kurių antocianinų poveikiui kaip tik yra jautresnė sukcinato oksidacija, vadinasi dėl
botaninės matricos kompleksiškumo tirtuose ekstraktuose stipriau išreikštas kitų, antagonistiškai
veikiančių junginių poveikis [92, 213].
39 pav. Mėlynių vaisių vandeninio ekstrakto poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui trečioje
metabolinėje būsenoje.
Eksperimentinės sąlygos – kaip 24 lentelėje. n=3; *p < 0,05 lyginant su atitinkama kontrole. Substratai:
5 mM piruvato + 5 mM malato (P+M) arba 15 mM sukcinato (Succ) (+2 mM amitalio).
95
40 pav. Mėlynių vaisių etanolinio ekstrakto poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui trečioje
metabolinėje būsenoje.
Eksperimentinės sąlygos – kaip 24 lentelėje. n=3; *p < 0,05 lyginant su atitinkama kontrole. Substratai:
5 mM piruvato + 5 mM malato (P+M) arba 15 mM sukcinato (Succ) (+2 mM amitalio).
Norėdami išsiaiškinti, kodėl naudojant dideles mėlynių vaisių ekstraktų koncentracijas stebimas
maksimalaus, su ATP sinteze susijusio kvėpavimo greičio (V3) slopinimas, ištyrėme abiejų mėlynės
vaisių ekstraktų poveikį į nuo fosforilinimo (t.y. nuo ATP sintezės) atskirtam mitochondrijų kvėpavimo
greičiui (VCCCP). 28 lentelėje pateikti rezultatai rodo, kad įdėjus 20 μl MVE VCCCP sumaţėjo 67 proc.
(substratas piruvatas+malatas) ir 27 proc. (substratas sukcinatas), p<0,05. MEE sumaţino VCCCP 66 proc.
(substratas piruvatas+malatas) ir 16 proc. (substratas sukcinatas), atitinkamai (29 lentelė ), t.y. abiem
atvejais buvo jautresnė piruvato oksidacija. Poveikis į VCCCP buvo didesnis nei į VADP tiek oksiduojant
piruvatą+malatą, tiek sukcinatą. Rezultatai rodo, kad viena iš mitochondrijų kvėpavimo trečioje
metabolinėje būsenoje sulėtėjimo prieţasčių gali būti mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso,
arba I ir II kompleksų aktyvumo sumaţėjimas. Neatmetama galimybė, kad mėlynių ekstraktai gali veikti
ir ADP/ATP nešiklį, ir/arba ATP-sintazę.
28 lentelė. MVE poveikis į nuo fosforilinimo atskirtam mitochondrijų kvėpavimo greičiui VCCCP, joms
oksiduojant piruvatą + malatą ir sukcinatą.
Substratas piruvatas + malatas Substratas sukcinatas
Kontrolė MVE (20 µl/1,5 ml) Kontrolė MVE (20 µl/1,5 ml)
VCCCP 285,50±2,60 95,17±8,42* 244,00±16,00 177,50±10,50*
VCCCP+Cyt c 302,50±7,79 129,33±16,76* 387,50±12,50 363,50±7,50*
96
29 lentelė. MEE poveikis į nuo fosforilinimo atskirtam mitochondrijų kvėpavimo greičiui VCCCP, joms
oksiduojant piruvatą + malatą ir sukcinatą.
Substratas piruvatas + malatas Substratas sukcinatas
Kontrolė MEE (20 µl/1,5 ml) Kontrolė MEE (20 µl/1,5 ml)
VCCCP 411,17±17,46 140,18±4,30* 271,00±14,55 227,33±22,88*
VCCCP+Cyt c 586,33±27,68 283,25±36,86* 405,50±11,72 384,67±26,67
Substratai: 5 mM piruvato + 5 mM malato; 15 mM sukcinato (+2 mM amitalio).VCCCP – mitochondrijų
kvėpavimo greitis esant 0,19 μM karbonilcianid-m-chlorofenilhidrazono (CCCP); VCCCP+Cyt c – nuo
fosforilinimo atskirtas mitochondrijų kvėpavimo greitis esant terpėje 32 µM citochromo c. n=3; *p <
0,05 lyginant su atitinkama kontrole.
Atlikdami eksperimentus, pastebėjome įdomų faktą: mitochondrijoms kvėpuojant ketvirtoje
metabolinėje būsenoje (substratas piruvatas+malatas, 41 pav. ir 42 pav.), ir į matavimo terpę pridėjus
egzogeninio citochromo c, mėlynių ekstrakto poveikyje (15 ir 20 µl/1,5 ml) stebimas kvėpavimo
stimuliavimas, t.y. mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje būsenoje (V4+Cyt c) padidėjo
54-86 proc. (MVE) ir 54-65 proc. Įdomu tai, kad mitochondrijoms oksiduojant piruvatą+malatą,
kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje būsenoje (V4) nesant egzogeninio citochromo c padidėjo
maţesniu laipsniu nei esant citochromui c. Sukcinato oksidacijos atveju šis padidėjimas buvo maţesnis
(15-19 proc.), pridėjus MVE ekstrakto (15-20 µl/1,5 ml), o MEE šio parametro neveikė. Ar mitochondrijų
kvėpavimo greičio ketvirtoje metabolinėje būsenoje esant citochromui c padidėjimas susijęs su mėlynių
vaisių veikliųjų komponentų sąlygota citochromo c redukcija, nėra aišku. Jei minėtas efektas būtų susijęs
su antocianinų sukelta citochromo c redukcija, tai būtų labai svarbus faktas, kadangi reguliuojant
citochromo c redokso būseną galima reguliuoti ląstelės ţūties procesą – apoptozę, pvz., atitolinti
apoptozinę ląstelių ţūtį arba apsaugoti nuo jos. Šiam pirmą kartą pastebėtam reiškiniui ir jo mechanizmo
išaiškinimui reikalingi išsamesni tyrimai.
97
41 pav. Mėlynių vandeninio ekstrakto (MVE) poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui ketvirtoje
metabolinėje būsenoje, esant egzogeniniam citochromui c
Eksperimentinės sąlygos – kaip 24 lentelėje. n=3; *p < 0,05 lyginant su atitinkama kontrole. Substratai:
5 mM piruvato + 5 mM malato (P+M) arba 15 mM sukcinato (Succ) (+2 mM amitalio).
42 pav. Mėlynių etanolinio ekstrakto (MEE) poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui ketvirtoje
metabolinėje būsenoje, esant egzogeniniam citochromui c.
Eksperimentinės sąlygos – kaip 24 lentelėje. n=3; *p < 0,05 lyginant su atitinkama kontrole. Substratai:
5 mM piruvato + 5 mM malato (P+M) arba 15 mM sukcinato (Succ) (+2 mM amitalio).
Siekiant išsiaiškinti, kokį poveikį mitochondrijų funkcijai turi mėlynių ekstraktuose identifikuoti
veiklieji komponentai, tyrėme etaloninių junginių (cianidin-3-galaktozido, malvidin-3-galaktozido ir
malvidin-3-gliukozido) įtaką širdies mitochondrijų kvėpavimo parametrams. Etaloniniai junginiai buvo
98
įvedami į terpę skirtingais kiekiais, t.y. kad galutinė veikliųjų junginių koncentracija apytiksliai atitiktų
mėlynių vandeniniame ir etanoliniame ekstraktuose esančius kiekius. Rezultatai pateikti 30 ir 31
lentelėse.
30 lentelė. Etaloninių junginių poveikis (15 µl/1,5 ml) ţiurkės širdies mitochondrijų funkcijoms joms
oksiduojant piruvatą + malatą.
Substratas piruvatas + malatas
Kontrolė Cianidin-3-
galaktozidas
Malvidin-3-
gliukozidas
malvidin-3-
galaktozidas
V2 53,67±3,07 41,27±1,67 59,53±3,64 42,03±1,53
V2 + ET
V2(+ET)/V2
V3
V4
V4+Cyt c
KKK
-
-
332,67±28,67
50,93±6,23
104,47±7,27
6,18±0,17
44,27±2,72
1,07±0,02
287,67±6,06
40,37±2,53
100,80±2,34
6,98±0,14
56,43±2,80
0,95±0,01
342,33±8,95
58,23±3,76
115,67±0,20
5,77±0,20
41,87±0,91
1,00±0,06
289,67±9,82
38,10±0,17
98,33±0,72
6,93±0,49
V2- mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje, esant 0,5 mg/ml mitochondrijų ir 5 mM piruvato + 5 mM
malato. V3 - mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, esant 1mM ADP. V4 – mitochondrijų kvėpavimo
greitis ketvirtoje metabolinėje būsenoje, esant 0,12 mM atraktilozido. V4+Cyt c, mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje
metabolinėje būsenoje pridėjus 32 µM citochromo c. KKK - mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficinetas; n=3.
31 lentelė. Etaloninių junginių (30 µl/1,5 ml) poveikis ţiurkės širdies mitochondrijų funkcijoms joms
oksiduojant piruvatą + malatą.
Substratas piruvatas + malatas
Kontrolė Cianidin-3-
galaktozidas
Malvidin-3-
gliukozidas
malvidin-3-
galaktozidas
V2 53,67±3,07 56,20±5,60 63,03±1,53 52,77±0,18
V2 + ET
V2(+ET)/V2
V3
V4
V4+Cyt c
KKK
-
-
332,67±28,67
50,93±6,23
104,47±7,27
6,18±0,17
53,83±5,36
0,96±0,02
332,67±12,72
50,83±6,55
113,00±6,66
5,99±0,37
65,17±3,44
1,04±0,08
357,67±7,80
67,70±2,69
117,00±1,73
5,69±0,26
51,67 ±1,21
0,98±0,02
335,00±3,46
52,47±0,18
113,00±1,15
6,35±0,05
99
Eksperimentinės sąlygos – kaip 24 lentelėje. n=3; *p < 0,05 lyginant su atitinkama kontrole.
Šie junginiai, priešingai nei mėlynės uogų ekstraktai, neveikė mitochondrijų kvėpavimo parametrų
nei oksiduojant piruvatą+malatą (30 ir 31 lentelės), nei sukcinatą (duomenys nepateikti). Tai rodo, jog
poveikį mitochondrijų funkcijai in vitro gali sąlygoti kiti antocianinai (delfinidin-3-galaktozidas,
delfinidin-3-gliukozidas, delfinidin-3-arabinozidas, cianidin-3-gliukozidas, petunidin-3-galaktozidas,
cianidin-3-arabinozidas, petunidin-3-gliukozidas, peonidin-3-galaktozidas, petunidin-3-arabinozidas,
peonidin-3-gliukozidas, peonidin-3-arabinozidas, malvidin-3-arabinozidas) arba neidentifikuotos, tačiau
mėlynių ekstraktuose esančios veikliosios medţiagos, tokios kaip kiti flavonoidų klasės junginiai
(miricetinas, kvercitrinas, izokvercitrinas, hiperozidas ar astragalinas), proantocianidinai ar fenolinės
rūgštys (galo, protokatechino, vanilino, chlorogeno, kavos, siringo, ferulo, kumaro).
Nors antocianinų biologinio poveikio tyrimai atliekami jau seniai, tačiau, mūsų ţiniomis, dar nėra
duomenų apie šių junginių tiesioginį poveikį mitochondrijose vykstantiems oksidacinio fosforilinimo
procesams. Todėl negalėjome palyginti mūsų gautų rezultatų su kitų Lietuvos ar uţsienio mokslininkų
darbais.
Eksperimentiškai, nustatėme koncentracijas, kurioms esant pasireiškia mėlynių ekstraktų (MVE ir
MEE) poveikis mitochondrijų funkcijoms in vitro – mitochondrijų kvėpavimo greičio antroje
metabolinėje būsenoje stimuliavimas ir trečioje metabolinėje būsenoje slopinimas bei mitochondrijų
kvėpavimo greičio ketvirtoje metabolinėje būsenoje padidėjimas, esant citochromui c. Sukcinato
oksidacija yra maţiau jautri mėlynės uogų ekstraktų poveikiui. Palyginus vandeninio ir etanolinio
mėlynių ekstraktų poveikį mitochondrijoms oksiduojant piruvatą+malatą, efektai yra panašūs, o sukcinato
oksidacijos atveju mitochondrijų funkciją labiau veikia vandeninis mėlynių vaisių ekstraktas (43 pav. ir
44 pav.). Atlikus antocianidinų analizę ESC metodu po rūgštinės hidrolizės nustatyta, jog MEE suminis
antocianidinų kiekis yra 30,5 proc. didesnis nei MVE (4 ir 5 lentelės). Etanoliniame ekstrakte rasta
daugiau delfinidino, petunidino ir peonidino, o cianidino kiekis net daugiau kaip du kartus didesnis negu
vandeniniame ekstrakte. Kadangi vandeniniame mėlynių ekstrakte nustatyti didesni malvidino kiekiai,
tikėtina, jog malvidino glikozidai gali veikti sukcinato oksidaciją. Kadangi mūsų rezultatai rodo, kad
malvidin-3-gliukozidas ir malvidin-3-galaktozidas neveikė mitochondrijų funkcijos, poveikį
mitochondrijoms gali turėti kiti malvidino glikozidai arba kitos mėlynių vaisių ekstraktuose esančios
veikliosios medţiagos
Tyrimų rezultatai rodo, jog didesnių koncentracijų mėlynių vaisių ekstraktai (tiek MVE , tiek
MEE) neţymiai atskyrė oksidacijos ir fosforilinimo procesus, tuo tarpu maţesni mėlynių ekstrakto kiekiai
neveikė vidinės mitochondrijų membranos intaktiškumo. Skulachev ir kt. autorių darbai rodo, kad silpnas
mitochondrijų oksidacijos ir fosforilinimo procesų atskyrimas gali būti naudingas ląstelei dėl laisvųjų
100
deguonies radikalų generacijos pačiose mitochondrijose slopinimo [228] ir tai gali turėti kardioprotekcinį
poveikį. Be to, yra ţinoma, kad, priklausomai nuo koncentracijos, tie patys junginiai gali veikti ir kaip
antioksidantai, ir kaip pro-oksidantai [188, 52, 71]. Taigi, veikiant mitochondrijas biologiškai aktyviais
junginiais, galbūt galima būtų slopinti, ar, priešingai, skatinti ROS generaciją ir taip reguliuoti ląstelės
signalinius kelius siekiant ląsteles apsaugančio poveikio.
43 pav. MVE ir MEE poveikio ţiurkės širdies mitochondrijų funkcijai joms oksiduojant piruvatą +
malatą, palyginimas.
Eksperimentinės sąlygos – kaip 24 lentelėje. n=3; *p < 0,05 lyginant su atitinkama kontrole.
44 pav. MVE ir MEE poveikio ţiurkės širdies mitochondrijų funkcijai joms oksiduojant sukcinatą,
palyginimas.
Eksperimentinės sąlygos – kaip 24 lentelėje. n=3; *p < 0,05 lyginant su atitinkama kontrole.
101
Įdomu tai, kad ir kitų autorių darbai rodo, jog flavonoidai rutinas, kvercitrinas, kvercetinas ir kt.
atskiria mitochondrijų oksidacijos ir fosforilinimo procesus [250, 251], tačiau maksimalus efektas yra
labai didelis (siekia net 2 kartus) naudojant net labai maţas (ng/ml) koncentracijas. Kaip labai stiprus
skyriklis veikia ir ginkmedţio ekstraktas [251], maţesniu oksidacijos ir fosforilinimo procesų atskyrimu
(apie 1,34 kartus) pasiţymi gudobelės ekstraktas [250], taip pat kaupiantis flavonoidus. Kiti autorių
darbai parodė, kad flavonoidais turtingas propolis (bendras fenolinių junginių kiekis 63-125 µg/ml)
slopino minėtą parametrą [163] ir maţino mitochondrijų kvėpavimo greitį trečioje metabolinėje būsenoje.
Tai dar kartą patvirtina, kad poveikis mitochondrijų kvėpavimo parametrams priklauso ne tik nuo
veikliųjų junginių koncentracijos, bet ir nuo jų struktūros (ginkmedyje, gudobelėje randami flavonoidai –
kvercetinas ir jo dariniai yra flavonolių klasės atstovai, propolyje randamas chrizinas yra flavonas,
pinocembrinas – flavononas, o galanginas – flavonolis), o mūsų tirto mėlynių ekstrakto veiklieji junginiai
yra antocianinų grupės atstovai. Taip pat svarbu, kad skirtingų klasių veiklieji junginiai gali veikti ne tik
sinergistiškai, bet ir panaikinti vienas kito veikimą [3, 51, 155, 159].
Kitas mūsų nustatytas reiškinys, kad didinant mėlynių ekstrakto koncentraciją, pasireiškė slopinantis
poveikis į mitochondrijų kvėpavimo greitį trečioje metabolinėje būsenoje tuo tarpu etaloniniai junginiai -
cianidin-3-galaktozidas, malvidin-3-galaktozidas ir malvidin-3-gliukozidas neveikia mitochondrijų
funkcijos. Tą patvirtina ir kitų autorių darbai, kurie tyrė cianidin-3-gliukozidą ir parodė, kad šis
antocianinas taip pat neveikia mitochondrijų funkcijos [156]. Daugiau darbų apie antocianinų tiesioginį
poveikį mitochondrijų funkcijai in vitro mokslinėse duomenų bazėse aptikti nepavyko. Kadangi mėlynių
ekstraktuose be cianidino ir malvidino glikozidų, dar identifikuoti ir kiti (petunidino, peonidino ir
delfinidino glikozidai), jie, o taip pat ir kiti polifenoliniai junginiai (kitų grupių flavonoidai,
proantocianidinai ar fenolinės rūgštys), kurie gali nulemti minėtą efektą.
Yra ţinoma, kad mitochondrijų kvėpavimo greičio slopinimas nedideliu laipsniu gali skatinti
aktyvių deguonies formų (ROS) generaciją ląstelėse. ROS kaip signalinė molekulė gali dalyvauti ląstelės
signalo perdavimo keliuose ir reguliuoti ląstelių išgyvenamumą [87, 121, 122].
Mūsų atlikti tyrimai yra nauji ir aktualūs, kadangi iki šio nei mėlynių ekstraktų, nei jų veikliųjų
komponentų - antocianinų tiesioginis poveikis izoliuotoms širdies mitochondrijų funkcijoms in vitro dar
nebuvo tyrinėtas. Mūsų duomenys rodo, kad poveikis mitochondrijų funkcijoms labai priklauso nuo
koncentracijos, į tai reiktų atsiţvelgti, parenkant koncentracijas tolimesniems in vivo eksperimentams.
Mėlynių preparatai yra plačiai vartojami medicinoje, todėl gauti duomenys aiškinantis mėlynių ekstraktų
ir juose esančių antocianinų poveikio mechanizmą subląsteliniame lygmenyje yra neabejotinai aktualūs.
Šiuos tyrimus reikia išplėsti, kad būtų galima įvertinti ne tik šių ekstraktų ar jų veikliųjų junginių
tiesioginį poveikį izoliuotoms mitochondrijoms, bet ir mitochondrijų funkcijoms intaktinėse ląstelėse,
102
panaudojant ląstelių kultūras ar eksperimentuose in vivo. Galimybė reguliuoti mitochondrijų funkcijas
natūraliomis, biologiškai aktyviomis medţiagomis, tokiomis kaip antocianinai gali padėti išlaikyti
ląstelės gyvybingumą, ar, esant reikalui, nukreipti ją apoptozės ar nekrozės keliu.
103
IŠVADOS
1. Sukurta efektyviosios skysčių chromatografijos metodika, leidţianti atlikti atrankų antocianidinų
komplekso kokybinį ir kiekinį nustatymą mėlynių vaisių vaistinėje augalinėje ţaliavoje. Įvertinti
metodikos įteisinimo parametrai, patvirtinantys jos jautrumą, tikslumą, tiesiškumą bei atrankumą.
Sukurta metodika pritaikyta šilauogių vaisių analizei. Ji gali būti taikoma kitų vaistinių augalinių
ţaliavų ar farmacinių preparatų, turinčių antocianinų, kokybiniams bei kiekiniams rodikliams
įvertinti.
2. Atlikus antocianinų ir antocianidinų sudėties tyrimus V. myrtillus L. vaisiuose, surinktuose iš 75
cenopopuliacijų, nustatyta, kad antocianinų suminis kiekis (birţelio – rugsėjo mėn.) kito nuo 0,828
iki 5,372 proc., antocianidinų – nuo 0,743 iki 5,722 proc., antocianidinų komplekso sudėtyje
dominuojantis komponentas – cianidinas (0,335 - 2,236 proc.).
3. Lietuvoje surinktą V. myrtillus L. vaisių augalinę ţaliavą galima vertinti kaip kokybišką, chemine
sudėtimi nesiskiriančią nuo kitų tyrinėtų Europos šalių mėlynių vaisių ţaliavų. Atlikus
palyginamuosius tyrimus, nustatyta, kad Lietuvos teritorijoje surinktų vaistinių augalinių ţaliavų
kokybinė antocianidinų sudėtis nesiskyrė nuo Švedijos, Rusijos, Baltarausijos, Ukrainos ir Latvijos
teritorijose surinktų ėminių kokybinės antocianidinų sudėties. Lietuvoje surinktuose mėlynių vaisių
pavyzdţiuose nustatytas vidutinis antocianinų kiekis siekė 2,488 proc. ir buvo didesnis nei
Baltarusijoje ir Latvijoje rinktose ţaliavose. Antocianidinų Lietuvos teritorijoje rinktuose ėminiuose
nustatyta vidutiniškai 2,556 proc.; tai yra didesnis kiekis nei Latvijos (2,289 proc.), Baltarusijos
(2,340 proc.) ir Rusijos (2,523 proc.) teritorijose rinktuose vaisiuose.
4. Nustatyta, jog didţiausi antocianinų kiekiai V. myrtillus L. vaisiuose Lietuvos gamtinėmis
sąlygomis susikaupia nuo rugpjūčio mėn. vidurio iki vaisių nokimo pabaigos. Mėlynių vaisių
augalinės ţaliavos paruošas Lietuvoje rekomenduojama vykdyti nuo rugpjūčio mėn. vidurio.
Įvertinus individualių antocianidinų kitimo dinamiką vaisiuose, nustatyta, kad nuo liepos mėn.
pabaigos iki rugsėjo mėn. vidurio mėlynių vaisiuose yra susikaupę didţiausi delfinidino kiekiai.
Cianidino didţiausi kiekiai nustatyti nuo rugpjūčio mėn. antros dekados iki rugsėjo mėn. vidurio,
petunidino – rugsėjo mėn., o peonidino ir malvidino didţiausi kiekiai – nuo rugpjūčio mėn 1
dekados iki rugsėjo mėn. vidurio.
5. Atlikus Lietuvoje Botanikos instituto lauko kolekcijose auginamų šilauogių vaisių antocianinų
sudėties analizę, nustatytos vertingiausios, daugiausiai antocianinų kaupiančios veislės: „Berkeley―
104
(1,671 proc.), „Northland― (1,662 proc.), „Northcountry― (1,727 proc.) ir „Ama― (1,652 proc.).
Didţiausi suminiai antocianidinų kiekiai nustatyti „Northland― (1,585 proc.), ,,Northcountry― (1,534
proc.) ir „Rancocas― (1,453 proc.) veislių vaisių ėminiuose. Nustatyta, kad šilauogių vaisių
antocianidinų kompleksui būdingas malvidino (0,058 - 0,437 proc.) dominavimas. Antocianidinų
komplekso kiekinės sudėties skirtumai gali būti svarbus chemotaksonominis poţymis, apibūdinantis
Vaccinium L. genties genotipinę bei tarprūšinę įvairovę.
6. Atliktas mėlynių ir šilauogių vaisių ekstraktų antiradikaliojo aktyvumo nustatymas. Šilauogės vaisių
ekstraktuose didţiausiu suminiu antiradikaliuoju aktyvumu pasiţymi „Berkeley― (82,31 proc.),
,,Ama― (81,65 proc.), „Northland― (52,83 proc.); mėlynių vaisių ekstraktas inaktyvavo 63,72 proc.
laisvojo radikalo. Įvertintos mėlynių ir šilauogių vaisių ekstraktų antiradikalinės savybės ir
nustatytas tiesioginis ryšys tarp antocianinų kiekio ekstraktuose ir jų gebėjimo surišti laisvuosius
radikalus.
7. V. myrtillus L. vaisių ekstraktai (etanolinis ir vandeninis), priklausomai nuo koncentracijos, slopina
maksimalų, susijusį su ATP sinteze, mitochondrijų kvėpavimo greitį (27-59 proc. oksiduojant
piruvatą+malatą) galimai dėl mitochondrijų kvėpavimo grandinės I ir II kompleksų slopinimo.
Sukcinato oksidacija yra maţiau jautri ekstraktų poveikiui. Nustatytos mėlynių vaisių ekstraktų
koncentracijos, kurios silpnai atskiria oksidacijos ir ATP sintezės procesus ir, esant egzogeniniam
citochromui c, didina mitochondrijų kvėpavimą, nesusijusį su ATP sinteze.
105
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Acker S. A. B. E, Balen G. P, den Berg D. J, Bast A, van der Vijgh V. J. F.
Influence of iron chelation on the antioxidant activity of flavonoids. Biochemical
Pharmacology 1998; 56 (8): 15 935-43.
2. Acquaviva R, Russo A, Galvano F, Galvano G, Barcellona M. L, Li Volti G,
Vanella A. Cyanidin and cyanidin 3-O-beta-D-glucoside as DNA cleavage protectors
and antioxidants. Cell Biol Toxicol. 2003; 19(4): 243–52.
3. Adams L. S, Seeram N. P, Hardy M. L, Carpenter C, Heber D. Analysis of the
Interactions of Botanical Extract Combinations Against the Viability of Prostate Cancer
Cell Lines eCAM 2006; 3(1): 117–24.
4. Adrain C, Martin S. J. The mitochondrial apoptosome: a killer unleashed by the
cytochrome seas. Trends Biochem Sci 2001; 26: 390–7.
5. Aguilar-Støenv M, Moe S. R. Medicinal plant conservation and management:
distribution of wild and cultivated species in eight countries. Biodivers Conserv 2007;
16: 1973–81.
6. Ahuja S, Dong W.M. Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC. London,
Elsevier Inc.; 2005. P. 20–45.
7. Akhlaghi M, Bandy B. Mechanisms of flavonoid protection against myocardial
ischemia–reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology 2009; 46
(3): 309-17.
8. Al-Awwadi N. A, Araiz C, Bornet A, Delbosc S, Cristol J-P, Linck N, Azay J. et al.
Extracts Enriched in Different Polyphenolic Families Normalize Increased Cardiac
NADPH Oxidase Expression while Having Differential Effects on Insulin Resistance,
Hypertension, and Cardiac Hypertrophy in High-Fructose-Fed Rats. J. Agric. Food
Chem. 2005; 53 (1): 151–7.
9. Amella M, Bronner C, Briancon F. Inhibition of mast cell histamine release by
flavonoids and bioflavonoids. Planta Medica 1985; 51: 16-20.
10. American Herbal Pharmacopoeia. Bilberry fruit. Santa Cruz: CA; 2001. p. 1-23.
11. Andersen M.Ø, Markham K.R. Flavonoids (Chemistry, Biochemistry and
Applications). LLC: JAV: Taylor & Francis Group; 2006. pp 472–511.
12. Andres-Lacueva C, Shukitt-Hale B, Galli R. L, Jauregui O, Lamuela-Raventos R.
M, Joseph J. A. Anthocyanins in aged blueberry-fed rats are found centrally and may
enhance memory. Nutritional Neuroscience 2005; 8(2): 111–20.
106
13. Andriambeloson E, Magnier C, Haan-Archipoff G, Lobstein A, Anton R, Beretz A,
Stoclet J. C, Andriantsitohaina R. Natural dietary polyphenolic compounds cause
endothelium-dependent vasorelaxation in rat thoracic aorta. J Nutr 1998; 128: 2324-33.
14. Aragón S. M, Basabe B, Benedí J. M, Villar A. M. Antioxidant action of Vaccinium
myrtillus L. Phytotherapy Research 1997; 12(1): 104 -6.
15. Arora S, Musadi M, Mukherji S, Yang Y. C. Eye nutrient products for age-related
macular degeneration: what do they contain? Eye 2004; 18: 470–3.
16. Arozarena I, Ayestaran B, Cantajo M. J, Navarro M, Vera M, Abril I, et al.
Anthocyanin copmposition of Tempranillo, Garanacha and Cabernet Sauvignon grapes
from high- and low-quality vineyards over two years. Eur Food Res Technol. 2002; 214:
202-9.
17. Bagchi D, Sen C. K, Bagchi M, Atalay M. Anti-angiogenic, Antioxidant, and Anti-
carcinogenic Properties of a Novel Anthocyanin-Rich Berry Extract Formula.
Biochemistry (Moscow) 2004; 69 (1): 75-80.
18. Bao L, Yao X-S, Yau C-C, Tsi D, Chia C-S, Nagai H, Kurihara H. Protective
Effects of Bilberry (Vaccinium myrtillus L.) Extract on Restraint Stress-Induced Liver
Damage in Mice. J. Agric. Food Chem. 2008; 56 (17): 7803–7.
19. Barrett M. The Handbook of Clinically Tested Herbal Remedies. New York: The
Haworth Herbal Press; 2004. pp. 163-83.
20. Beekwilder J, Jonker H, Meesters P, Hall R. D, Van der Meer I. M, Ric de Vos C.
H. Antioxidants in Raspberry: On-Line Analysis Links Antioxidant Activity to a
Diversity of Individual Metabolites. J. Agric. Food Chem. 2005; 53: 3313-20.
21. Bell D. R, Gochenaur K. Direct vasoactive and vasoprotective properties of
anthocyanin-rich extracts. J Appl Physiol 2006; 100: 1164–70.
22. Bere E. Wild berries: a good source of omega-3. European Journal of Clinical
Nutrition 2006; 1–3.
23. Bernatoniene J, Trumbeckaite S, Majiene D, Baniene R, Baliutyte G, Savickas A,
Toleikis A. The effect of crataegus fruit extract and some of its flavonoids on
mitochondrial oxidative phosphorylation in the heart. Phytother Res. 2009; 23(12):
1701-7.
24. Bever B, Zahnd G. Plants with oral hypoglycemic action. Quart J Crude Drug Res
1979; 17: 139-96.
107
25. Bitsch R, Netzel M, Frank T, Strass G, Bitsch I. Bioavailability and Biokinetics of
Anthocyanins From Red Grape Juice and Red Wine. Journal of Biomedicine and
Biotechnology 2004; 5: 293–8.
26. Blasig I. E, Dickens B. F, Weglicki W. B, Kramer J. H. Uncoupling of mitochondrial
oxidative phosphorylation alters lipid peroxidation-derived free radical production but
not recovery of postischemic rat hearts and post-hypoxic endothelial cells. Molecular
and Cellular Biochemistry 1996; 160/161: 167-77.
27. Blueberry for local sales and pick – your – own operations. Available at:
http://www.ces.ncsu.edu/plymouth/hort/berries/blueberry/bbpage1.html
28. Blumenthal M, Goldberg A, Brinckmann J. Herbal Medicine. Expanded Commission
E Monographs. Newton: Integrative Medicine Communications 2000; p. 16-19.
29. Bomser J, Madhavi D, Singletary K, Smith M. A. In vitro anticancer activity of fruit
extracts from Vaccinium species. Planta Med. 1996; 62(3): 212–6.
30. Boulton R. The copigmentation of anthocyanins and its role in the color of red wine: A
critical review. American Journal of Enology and Viticulture 2001; 52: 67–87.
31. Bravetti G. Fraboni E, Maccolini E. Preventive medical treatment of senile cataract
with vitamin E and anthocyanosides: clinical evaluation. Ann Ottalmol Clin Ocul 1989;
115: 109-16.
32. Breemen R. B, Fong H. H. S, Farnsworth N. R. The Role of Quality Assurance and
Standardization in the Safety of Botanical Dietary Supplements. Chem Res Toxicol.
2007; 20(4): 577–82.
33. Brown J, Kelly M. F. Inhibition of lipid peroxidation by anthocyanins, anthocyanidins
and their phenolic degradation products. European Journal of Lipid Science and
Technology 2007; 109 (1): 66 – 71.
34. Brownmiller C, Howard L.R, Prior R.L. Processing and Storage Effects on
Monomeric Anthocyanins, Percent Polymeric Color, and Antioxidant Capacity of
Processed Blueberry Products. Journal of Food Science 2008; 73 (5): 72-9.
35. Bruneton J. Pharmacognosy, phytochemistry, medicinal plants. Paris: Lavoisier
publishing; 1999. p. 355–63.
36. Budriūnienė D, Ašmontienė V, Daubaras R. Sodinė šilauogė 2002 Kaunas; p. 42.
37. Burns J, Gardner PT, O’Neil J, Crawford S, Morecroft I, McPhail DB, Lister C, et
al. Relationship among antioxidant activity, vasodilation capacity, and phenolic content
of red wines. J Agric Food Chem 2000; 48: 220-30.
108
38. Butkus V, Butkienė Z, Some results in highbush blueberry and cranberry research in
the Lithuanian SSR. Acta Horticulturae 1985; 165: 93-6.
39. Butkus V, Pliszka K. The highbush blueberry - a new cultivated species. Acta
Horticulturae 1993; 346: 81 – 6.
40. Byamukama R, Kiremire B. T, Andersen Ø. M, Steigen A. Anthocyanins from fruits
of Rubus pinnatus and Rubus rigidus. Journal of Food Composition and Analysis 2005;
18 (6): 599-605.
41. Calderon-Cortes E, Clemente-Guerrero M, Sierra-Campos E, Cortes-Rojo C,
Gaona-Zamudio F. J, Villalobos-Molina R. Functional characterization of brain
mitochondrial nitric oxide synthase during hypertension and aging. Amino Acids 2006;
30: 73–80.
42. Calixto J. B. Efficacy, safety, quality control, marketing and regulatory guidelines for
herbal medicines (phytotherapeutic agents). Brazilian Journal of Medical and Biological
Research 2000; 33: 179-89.
43. Cameira-dos Santos P. J, Brillouet J. M, Cheynier V, Moutounet M. Detection and
partial characterisation if new anthocyanin-derived pigments in wine. Journal of the
Science of Food and Agriculture 1996; 70(2): 204–8.
44. Cao G, Shukitt-Hale B, Bickford P. C, Joseph J. A, McEwen J, Prior R. L.
Hyperoxia induced changes in antioxidant capacity and the effect of dietary antioxidants.
Journal of Applied Physiology 1999; 86: 1817-22.
45. Casadesus G, Shukitt-Hale B, Stellwagen H. M, Zhu X, Lee H-Y, Smith M. A,
Joseph J. A. Modulation of Hippocampal Plasticity and Cognitive Behavior by Short-
term Blueberry Supplementation in Aged Rats. Nutritional Neuroscience, 2004; 7 (5/6):
309–16.
46. Castilla P, Dávalos A, Teruel J. L, Cerrato F, Fernández-Lucas M, Merino J. L, et
al. Comparative effects of dietary supplementation with red grape juice and vitamin E on
production of superoxide by circulating neutrophil NADPH oxidase in hemodialysis
patients. Am J Clin Nutr 2008; 87: 1053–61.
47. Cespedes C. L, El-Hafidi M, Pavon N, Alarcon J. Antioxidant and cardioprotective
activities of phenolic extracts from fruits of Chilean blackberry, Aristotelia chilensis
(Elaeocarpaceae), Maqui. Food Chemistry 2008; 107: 820–9.
48. Chandra A, Rana J, Li Y. Separation, identification, quantification, and method
validation of anthocyanins in botanical supplement raw materials by HPLC and HPLC-
MS. J. Agric. Food Chem. 2001; 49: 3515–21.
109
49. Conseil G, Baubichon-Cortay H, Dayan G, Jault J. M, Barron D, Di Pietro A.
Flavonoids: a class of modulators with bifunctional interactions at vicinal ATP-and
steroid-binding sites on mouse P-glycoprotein. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 9831–
6.
50. Cooke D, Schwarz M, Boocock D, Winterhalter P, Steward W. P, Gescher A. J,
Marczylo T. H. Effect of cyanidin-3-glucoside and an anthocyanin mixture from
bilberry on adenoma development in the ApcMin mouse model of intestinal
carcinogenesis—Relationship with tissue anthocyanin levels. Int. J. Cancer 2006; 119:
2213–20.
51. Davide D, Giovambattista D, Giuseppe C, Sergio T, Annalisa A, Claudio F.
Flavonoids, Vascular Function and Cardiovascular Protection. Current Pharmaceutical Design
2009; 15: 1072-84.
52. Dickancaitė E, Nemeikaitė A, Kalvelytė A, Cenas N. Prooxidant character of
flavonoid cytotoxicity: structure-activity relationships. Biochem Mol Biol Int. 1998;
45(5): 923-30.
53. Dinkova-Kostova A. T, Cheah J, Samouilov A, Zweier J. L, Bozak R. E, Hicks R.
J, et al. Phenolic Michael reaction acceptors: combined direct and indirect antioxidant
defenses against electrophiles and oxidants. Med Chem 2007; 3: 261–8.
54. Dreiseitel A, Schreier P, Oehme A, Locher S, Rogler G, Piberger H, Hajak G, et al.
Inhibition of proteasome activity by anthocyanins and anthocyanidins. Biochemical and
Biophysical Research Communications 2008; 372: 57–61.
55. Dua Q, Jerz G, Winterhalter P. Isolation of two anthocyanin sambubiosides from
bilberry (Vaccinium myrtillus) by high speed countercurrent chromatography. J.
Chromatogr. A 2004; 1045: 59–63.
56. Duchen M. R. Mitochondria in health and disease: perspectives on a new mitochondrial
biology. Molecular Aspects of Medicine 2004; 25 (4): 365-451.
57. Duffy K. B, Spangler E. L, Devan B. D, Guo Z, Bowker J. L, Janas A. M,
Hagepanos A, et al. A blueberry-enriched diet provides cellular protection against
oxidative stress and reduces a kainate-induced learning impairment in rats. Neurobiology
of Aging 2008; 29 (11): 1680-9.
58. Edwards A. M, Blackburn L, Christie S, Townsend S, David J. Food Supplements
in the Treatment of Primary Fibromyalgia: A Double-blind, Crossover Trial of
Anthocyanidins and Placebo. Journal of Nutritional & Environmental Medicine 2000;
10: 189–99.
110
59. Ehlenfeldt M. K, Prior R. L, Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) and
Phenolic and Anthocyanin Concentrations in Fruit and Leaf Tissues of Highbush
Blueberry. J. Agric. Food Chem. 2001; 49 (5) 2222–7.
60. Elwood PC, Renaud S, Sharp DS, Beswick AD, O’Brien JR, Yarnell JWG.
Ischemic heart disease and platelet aggregation. Circulation 1991; 83: 38-44.
61. Erlund I, Marniemi J, Hakala P, Alfthan G, Meririnne E, Aro A. Consumption of
black currants, lingonberries and bilberries increases serum quercetin concentrations.
European Journal of Clinical Nutrition 2003; 57: 37–42.
62. Esterbauer H, Gebicki J, Puhl H, Jurgens G. The role of lipid peroxidation and
antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radic Biol Med 1992; 13: 341-90.
63. European pharmacopoeia. Fifth Edition. Volume 2. Strasbourg: Council of Europe;
2005. p. 1099-1100.
64. Evans W. Ch. Pharmacognosy. Nottingham: W.B.; 2002. p. 31.
65. Faria A, Oliveira J, Neves P, Gameiro P, Santos-Buelga C, Freitas V, Mateus N.
Antioxidant Properties of Prepared Blueberry (Vaccinium myrtillus) Extracts. J. Agric.
Food Chem. 2005; 53: 6896-902.
66. Felgines C, Texier O, Besson C, Fraisse D, Lamaison J-L, Remesy C. Blackberry
Anthocyanins Are Slightly Bioavailable in Rats. J. Nutr 2002; 132: 1249-53.
67. Felton J. S, Malfatti M. A. What Do Diet-Induced Changes in Phase I and II Enzymes
Tell Us about Prevention from Exposure to Heterocyclic Amines? J. Nutr. 2006; 136:
2683–4.
68. Feng R, Ni H-M, Wang S. Y, Tourkova I. L, Shulin M. R, Harada H, Yin X-M.
Cyanidin-3-rutinoside, a natural polyphenol antioxidant, selectively kills leukemic clles
by induction of oxidative stress. J. Biol. Chem. 2007; 282 (18): 13468-76.
69. Fernandez M. T, Mira M. L, Florêncio M. H, Jennings K. R. Iron and copper
chelation by flavonoids: an electrospray mass spectrometry study. J Inorg Biochem
2002; 92: 105–11.
70. Frankel E. N, Kanner J, Kinsella J. E. Inhibition in vitro of oxidation of human low
density lipoproteins by phenolic substances in wine. Lancet 1993; 341: 454-7.
71. Galati G, Sabzevari O, Wilson J. X, O'Brien P. J. Prooxidant activity and cellular
effects of the phenoxyl radicals of dietary flavonoids and other polyphenolics.
Toxicology 2002; 177(1): 91-104.
111
72. Galli R. L, Shukitt-Hale B, Youdim K. A, Joseph J. A. Fruit polyphenolics and brain
aging: nutritional interventions targeting age-related neuronal and behavioral deficits.
Ann NY Acad Sci 2002; 959: 128-32.
73. Gao Z, Huang K, Yang X, Xu H. Free radical scavenging and antioxidant activities of
flavonoids extracted from the radix of Scutellaria baicalensis. Georgi Biochim Biophys
Acta 1999; 1472: 643–6.
74. Giovanelli G. Buratti S. Comparison of polyphenolic composition and antioxidant
activity of wild Italian blueberries and some cultivated varieties. Food Chemistry 2009;
112: 903–8.
75. Gornal A, Bradawill C, David M. Determination of serum proteins be means of the
biuret reaction. J Biol Chem. 1949; 177: 751-66.
76. Gould K. D, Winefield C. Anthocyanins– Biosynthesis, Functions, and Applications.
Wellington: Springer; 2008. pp. 1-3.
77. Gould K. S. Nature‘s Swiss Army Knife: The Diverse Protective Roles of
Anthocyanins in Leaves. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2004; 5: 314–20.
78. Goyarzu P, Malin D. H, Lau F. C, Taglialatela G, Moon W. D, Jennings R, Moy E,
et al. Blueberry Supplemented Diet: Effects on Object Recognition Memory and
Nuclear Factor-kappa B Levels in Aged Rats. Nutritional Neuroscience 2004; 7 (2): 75–
83.
79. Graversen H. B, Becker E. M, Skibsted L. H. Andersen M. L. Antioxidant
synergism between fruit juice and a-tocopherol. A comparison between high phenolic
black chokeberry Aronia melanocarpa) and high ascorbic blackcurrant (Ribes nigrum).
Eur Food Res Technol 2008; 226: 737–43.
80. Green D. R, Reed J. C. Mitochondria and apoptosis. Science 1998; 281: 1309–12.
81. Guideline on good agricultural and collection practice (GACP) for starting
materials of herbal origin. Available at:
http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/hmpc/24681605en.pdf.
82. Guo J, Han W, Wang M-H. Ultraviolet and environmental stresses involved in the
induction and regulation of anthocyanin biosynthesis: A review. African Journal of
Biotechnology 2008; 7 (25): 4966-72.
83. Guzik T. J, Harrison D. G. Vascular NADPH oxidases as drug targets for novel
antioxidant strategies. Drug Discovery Today 2006; 11 (11/12): 524-33.
112
84. Hakkinen S, Auriola S. High-performance liquid chromatography with electrospray
ionization mass spectrometry and diode array ultraviolet detection in the identification of
flavonol aglycones and glycosides in berries. J Chromatogr A 1998; 829 (1-2): 91-100.
85. Hakkinen S. H, Karenlampi S. O, Heinonen I. M, Mykkanen H. M, Torronen A. R.
Content of the flavanols quercetin, myricetin, and kaempferol in 25 edible berries.
Journal of Agricultural and Food Chemistry 1999; 47: 2274-9.
86. Hale K. L, McGrath S. P, Lombi E, Stack S. M, Terry N, Pickering I. J.
Molybdenum sequestration in Brassica species. A role for anthocyanins? Plant
Physiology 2001; 126: 1391–402.
87. Halestrap A. P, Clarke S. J, Khaliulin I. The role of mitochondria in protection of the
heart by preconditioning. Biochim Biophys Acta. 2007; 1767(8): 1007-31.
88. Harada K, Kano M, Takayanagi T, Yamakawa O, Ishikawa F. Absorption of
Acylated Anthocyanins in Rats and Humans after Ingesting an Extract of Ipomea batatas
Purple Sweet Tuber. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2004; 68 (7): 1500-7.
89. Haraguchi H, Yoshida N, Ishikawa H, Tamura Y, Mizutani K, Kinoshita T.
Protection of mitochondrial functions against oxidative stresses by isoflavans from
Glycyrrhiza glabra. J Pharm Pharmacol 2000; 52: 219–23.
90. Haramaki N, Stewart D. B, Aggarwal S, Ikeda H, Reznick A. Z, Packer L.
Networking antioxidants in the isolated rat heart are selectively depleted by ischemia–
reperfusion. Free Radic Biol Med 1998; 25: 329–39.
91. Havsteen B. H. The biochemistry and medical significance of the flavonoids.
Pharmacology & Therapeutics 2002; 96: 67– 202.
92. Hayek T, Fuhrman B, Vaya J, Rosenblat M, Belinky P, Coleman R, et al. Reduced
progression of atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice following consumption
of red wine, or its polyphenols quercetin or catechin, is associated with reduced
susceptibility of LDL to oxidation and aggregation. Arterioscler Thromb Vasc Biol
1997; 17: 2744–52.
93. He J, Magnuson B. A, Lala G, Tian Q, Schwartz S. J, Giusti M. M. Intact
anthocyanins and metabolites in rat urine and plasma after 3 months of anthocyanins
supplementation. Nutrition and Cancer 2006; 54 (1): 3-12.
94. Heidi D. J, Karen A. K, Cornett C, Hansen S. H, Christensen S. B. Hydrophilic
Carboxylic Acids and Iridoid Glycosides in the Juice of American and European
Cranberries (Vaccinium macrocarpon and V. oxycoccos), Lingonberries (V. vitis-idaea),
and Blueberries (V. Myrtillus). J. Agric. Food Chem. 2002; 50: 6871-6874.
113
95. Heinonen M. Molecular Antioxidant activity and antimicrobial effect of berry
phenolics - a Finnish perspective. Nutrition & Food Research 2007; 51 (6); 684 – 91.
96. Heinrich M, Barnes J, Gibbons S, Williamson, E.M. Fundamentals of
Pharmacognosy and Phytoterapy. London: Elsevier Science Ltd.; 2004. p 217–218.
97. Hess H, Knapka J. J, Newsome D. A. Dietary prevention of cataracts in the pink-eyed
RCS rat. Lag Anim Sci 1985; 35: 47-53.
98. Hodnick W. F, Bohmont C. W, Capps C, Pardini R. S. Inhibition of mitochondrial
NADH-oxidase (NADH-Coenzyme Q oxidoreductase) enzyme system by flavonoids: a
structure-activity study. Biochem Pharmacol 1987; 36: 2873–4.
99. Hodnick W. F, Duval D. L, Pardini R. S. Inhibition of mitochondrial respiration and
cyanide-stimulated generation of reactive oxygen species by selected flavonoids.
Biochem Pharmacol 1994; 47: 573–80.
100. Holdena J. M, Bhagwata S. A, Haytowitza D. B, Gebhardta S. E, Dwyerb J.T,
Peterson J, Beechera G. R, Eldridgec A. L, Balentined D. Development of a database
of critically evaluated flavonoids data: application of USDA‘s data quality evaluation
system. Journal of Food Composition and Analysis 2005; 18: 829–44.
101. Hou D. X. Potential mechanisms of cancer chemoprevention by anthocyanins, Curr
Mol Med 2003; 3(2): 149-59.
102. Hou D. X, Fujii M, Terahara N, Yoshimoto M. Molecular Mechanisms Behind the
Chemopreventive Effects of Anthocyanidins. Journal of Biomedicine and Biotechnology
2004; 5: 321–5.
103. Hou D. X, Kai K, Li J-J, Lin S, Terahara N, Wakamatsu M, Fujii M, et al.
Anthocyanidins inhibit activator protein 1 activity and cell transformation: structure-
activity relationship and molecular mechanisms. Carcinogenesis 2004; 25 (1): 29-36.
104. Howard L. R, Clark J. R, Brownmiller C. Antioxidant capacity and phenolic content
in blueberries as affected by genotype and growing season. Journal of the Science of
Food and Agriculture 2003; 83: 1238-47.
105. Ichiyanagi T, Hatana Y, Matsugo S, Konishi T. Structural Dependence of HPLC
Separation Pattern of Anthocyanins from Bilberry (Vaccinium myrtillus L.). Chem.
Pharm. Bull. 2004; 52 (5): 628-30.
106. Ichiyanagi T, Kashiwada Y, Ikeshiro Y, Hatano Y, Sshida Y, Horie M, et al.
Complete Assignment of Bilberry (Vaccinium myrtillus L.) Anthocyanins Separated by
Capillary Zone Electrophoresis. Chem. Pharm. Bull. 2004; 52 (2): 226-9.
114
107. Ichiyanagi T, Oikawa K, Tateyama C, Konishi T. Acid Mediated Hydrolysis of
Blueberry Anthocyanins. Chem. Pharm. Bull. 2001; 49 (1): 114-7.
108. Ichiyanagi T, Shida Y, Rahman M. M, Hatano Y, Konishi T. Bioavailability and
Tissue Distribution of Anthocyanins in Bilberry (Vaccinium myrtillus L.) Extract in
Rats. J. Agric. Food Chem. 2006; 54 (18): 6578-87.
109. Ichiyanagi T, Shida Y, Rahman M. M, Sekiya M, Hatano Y, Matsumoto H,
Hirayama M, et al. Effect on both aglycone and sugar moiety towards Phase II
metabolism of anthocyanins. Food Chemistry 2008; 110: 493–500.
110. Iwashina T. The Structure and Distribution of the Flavonoids in Plants. J. Plant Res.
2000; 113: 287-99.
111. Jaakola L, Maatta K, Pirttila A. M, Torronen R , Karenlampi S, Hohtola A.
Expression of Genes Involved in Anthocyanin Biosynthesis in Relation to Anthocyanin,
Proanthocyanidin, and Flavonol Levels during Bilberry Fruit Development. Plant
Physiology 2002; 130: 729–39.
112. Jaakola L. Flavonoid biosynthesis in bilberry (Vaccinium myrtillus L.): [Daktaro
disertacija]. Suomija, Oulu, 2003.
113. Jaiswal A. K. Nrf2 signaling in coordinated activation of antioxidant gene expression.
Free Radic Biol Med 2004; 36: 1199–207.
114. Jaldappagari S, Motohashi N, Gangeenahalli M. P, Naismith J. H. Topic in
Heterocyclic Chemistry: BioactiveMechanism of Interaction Between Anthocyanins and
Macromolecules Like DNA and Proteins. Springer-Verlag Berlin Heidelberg; 2008. p.
49–65.
115. James R. M, Cocheme H. M, Murphy M. P. Mitochondria-targeted redox probes as
tools in the study of oxidative damage and ageing. Mechanisms of Ageing and
Development 2005; 126(9): 982-6.
116. Jang Y. P, Zhou J, Nakanishi K, Sparrow J. R. Anthocyanins Protect Against A2E
Photooxidation and Membrane Permeabilization in Retinal Pigment Epithelial Cells.
Photochemistry and Photobiology 2005; 81: 529–36.
117. Jankevičienė R. Botanikos vardų ţodynas. Vilnius: Botanikos instituto leidykla; 1998.
p. 306.
118. Jankowski A, Jankowska B, Niedworok J. The effect of anthocyanin dye from grapes
on experimental diabetes. Folia Med Cracov. 2000; 41(3-4): 5–15.
119. Jones C. M, Mes P, Myers J. R. Characterization and Inheritance of the Anthocyanin
fruit (Aft) Tomato. Journal of Heredity 2003; 94(6): 449–56.
115
120. Juurlink B. H. Therapeutic potential of dietary phase 2 enzyme inducers in
ameliorating diseases that have an underlying in.ammatory component. Can J Physiol
Pharmacol 2001; 79: 266–82.
121. Kabir A. M, Cao X, Gorog D. A, Tanno M, Bassi R, Bellahcene M, Quinlan R. A,
Davis R. J, Flavell R. A, Shattock M. J, Marber M. S. Antimycin A induced
cardioprotection is dependent on pre-ischemic p38-MAPK activation but independent of
MKK3. J Mol Cell Cardiol. 2005; 39(4): 709-17.
122. Kabir A. M, Clark J. E, Tanno M, Cao X, Hothersall J. S, Dashnyam S, Gorog D.
A, Bellahcene M, Shattock M. J, Marber M. S. Cardioprotection initiated by reactive
oxygen species is dependent on activation of PKCepsilon. Am J Physiol Heart Circ
Physiol. 2006; 291(4): 1893-9.
123. Kahkonen M. P, Heinamaki J, Ollilainen V, Heinonen M. Berry anthocyanins:
isolation, identification and antioxidant activities. J Sci Food Agric 2003; 83: 1403–11.
124. Kaisu R. M-R, Kahonen M. P, Torronen A. R, Heinonen I. M. Catechins and
Procyanidins in Berries of Vaccinium Species and Their Antioxidant Activity. J. Agric.
Food Chem. 2005; 53: 8485-91.
125. Kaliora A. C, Dedoussis G. V. Z, Schmidt H. Dietary antioxidants in preventing
atherogenesis. Atherosclerosis 2006; 187: 1–17.
126. Kallas A, Connolly J, Loupin D, Sole-Plasa C, Mcarthur P. D, Lamarche P. H. The
effect of Vaccinium angustifolium extracts on lumphocyte cell proliferation: blueberries
as mitogenic agents. Ecology of Food and Nutrition 2005; 44: 97–104.
127. Kalt W, Foote K, Fillmore S. A. E, Lyon M, Van Lunen T. A, McRae K. B. Effect
of blueberry feeding on plasma lipids in pigs. British Journal of Nutrition 2008; 100: 70-
8.
128. Kalt W, Mcdonald J. E, Donner H. Anthocyanins, Phenolics, and Antioxidant
Capacity of Processed Lowbush Blueberry Products. Journal of Food Science 2000; 65
(3): 390-3.
129. Kammerer D, Kljusuric J.G, Carle R, Schieber A. Recovery of anthocyanins from
grape pomace extracts (Vitis vinifera L. cv. Cabernet Mitos) using a polymeric adsorber
resin. Eur Food Res Technol 2005; 220: 431–7.
130. Kanner J, Frankel E, Granit R, German B, Kinsella J. E. Natural antioxidants in
grapes and wines. J Agric Food Chem 1994; 42: 64-9.
131. Kathleen A. Kron, Powell E.A, Luteyn J.L. Phylogenetic relationships within the
blueberry tribe (Vacciniae, Ericaceae) based on sequence data from matK and nuclear
116
ribosomal ITS regions, with comments on the placement of Satyria. American Journal of
Botany 2002; 89(2): 327–336.
132. Katsube N, Iwashita K, Tsushida T, Yamaki K, Kobori M. Induction of Apoptosis
in Cancer Cells by Bilberry (Vaccinium myrtillus) and the Anthocyanins. J. Agric. Food
Chem. 2003; 51: 68-75.
133. Kay C. D, Mazza J, Holub B. J. Anthocyanins Exist in the Circulation Primarily as
Metabolites in Adult Men. J. Nutr. 2005; 135: 2582–8.
134. Kazakevich Y, Lobruto R. HPLC for Pharmaceutical Scientists. USA, John Wiley &
Sons, Inc.; 2007. p. 380–49.
135. Khan I. A. Issues related to botanicals. Life Sciences. 2006; 78(18): 2033-8.
136. Kırca A, Özkan M, Cemeroglu B. Stability of black carrot anthocyanins in various
fruit juices and nectars Food Chemistry 2006; 97 (4): 598-605.
137. Knox Y.M, Hayashi K, Suzutani T, Ogasawara M, Yoshida I, Shiina R, Tsukui A,
et al. Activity of anthocyanins from fruit extract of Ribes nigrum L. against influenza A
and B viruses, Acta Virol. 2001; 45: 209–15.
138. Kobuchi H, Roy S, Sen C. K, Nguyen H. G, Packer L. Quercetin inhibits inducible
ICAM-1 expression in human endothelial cells through the JNK pathway. Am J Physiol
Cell Physiol 1999; 277: C403–C11.
139. Konczak I, Zhang W. Anthocyanins-More Than Nature‘s Colours. Journal of
Biomedicine and Biotechnology 2004; 5: 239–40.
140. Kong A-N. T, Yu R, Chen C, Mandlekar S, Primiano T. Signal transduction events
elicited by natural products: role of MAPK and caspase pathways in homeostatic
response and induction of apoptosis. Arch Pharm Res 2000; 23: 1–16.
141. Kowaltowski A. J. Alternative mitochondrial functions in cell physiopathology:
beyond ATP Production. Braz J Med Biol Res 2000; 33(2): 241-50.
142. Kwon K. H, Barve A, Yu S, Huang M-T, Kong A-N. T. Cancer chemoprevention by
phytochemicals: potential molecular targets, biomarkers and animal models. Acta
Pharmacologica Sinica 2007; 28 (9): 1409 – 21.
143. Lala G, Malik M, Zhao C, He J, Kwon Y, Giusti M. M, Magnuson B. A.
Anthocyanin-Rich Extracts Inhibit Multiple Biomarkers of Colon Cancer in Rats.
Nutrition and Cancer 2006; 54 (1): 84-93.
144. Laleh G.H, Frydoonfar H, Heidary R, Jameei R, Zare S. The Effect of Light,
Temperature, pH and Species on Stability of Anthocyanin Pigments in Four Berberis
Species. Pakistan Journal of Nutrition 2006; 5(1): 90-2.
117
145. Lätti A. K, Riihinen K. R, Kainulainen P. S. Analysis of Anthocyanin Variation in
Wild Populations of Bilberry (Vaccinium myrtillus L.) in Finland. J. Agric. Food
Chem. 2008; 56(1): 190–6.
146. Lazz M. C, Savio M, Pizzala R, Cazzalini O, Perucca P, Scovassi A. I, Stivala L. A.
Anthocyanins induce cell cycle perturbations and apoptosis in different human cell lines.
Carcinogenesis 2004; 25 (8): 1427-33.
147. Lazze M, Pizzala R, Savio M, Stivala L, Prosperi E, Bianchi L. Anthocyanins
protect against DNA damage induced by tert-butyl-hydroperoxide in rat smooth muscle
and hepatoma cells. Mutat Res. 2003; 535(1): 103–15.
148. Lee J, Rennaker C, Wrolstad R. E. Correlation of two anthocyanin quantification
methods: HPLC and spectrophotometric methods. Food Chemistry 2008; 110: 782–6.
149. Lemasters J. J, Nieminen A-L. Mitochondria in Pathogenesis. London : Plenum
Publishers; 2001. p. 282-5.
150. Lemasters J. J, Qian T, He L, Kim J-S, Elmore S. P, Cascio W. E, et al. Role of
Mitochondrial Inner Membrane Permeabilization in Necrotic Cell Death, Apoptosis, and
Autophagy. Antioxidants & Redox Signaling 2002; 4(5): 769-81.
151. Lesnefsky E. J, Chen Q, Moghaddas S, Hassan M. O, Tandler B, Hoppel C. L.
Blockade of electron transport during ischemia protects cardiac mitochondria. J Biol
Chem. 2004; 279(46): 47961-7.
152. Lewis H. L. Medical Botany: Plants Affecting Human Health. New Jersey: John Wiley
& Sons, Inc.; 2003. pp. 303-4.
153. Li S. Han Q, Qiao C, Song J, Lung C, Xu C. H. Chemical markers for the quality
control of herbal medicines: an overview. Chinese Medicine 2008; 3(7): 1-16.
154. Lila M. A, Anthocyanins and Human Health: An In Vitro Investigative Approach.
Journal of Biomedicine and Biotechnology 2004; 5: 306–13.
155. Lin F-M, Chen L-R, Lin E-H, Ke F-C, Chen H-Y, Tsai M-J, et al. Compounds from
Wedelia chinensis synergistically suppress androgen activity and growth in prostate
cancer cells. Carcinogenesis 2007; 28(12): 2521–9.
156. Liobikas J, Trumbeckaitė S, Bendokas V, Baniulis D, Majienė D, Kopustinskienė
D. M, et al. Proapoptozinis juodojo serbento (Ribes nigrum L.) uogų ekstraktų poveikis
ţiurkės širdies mitochondrijoms. Ţemdirbystė 2009; 96(3): 149-57.
157. Lohachoompol V, Mulholland M, Srzednicki G, Craske J. Determination of
anthocyanins in various cultivars of highbush and rabbiteye blueberries. Food Chemistry
2008; 111 (1): 249-54.
118
158. Lohachoompol V, Srzednicki G, Craske J. The Change of Total Anthocyanins in
Blueberries and Their Antioxidant Effect After Drying and Freezing. Journal of
Biomedicine and Biotechnology 2004; 5: 248–52.
159. Ma X. H. Zheng C. J, Han L. Y, Xie B, Jia J, Cao Z. W, et al. Synergistic therapeutic
actions of herbal ingredients and their mechanisms from molecular interaction and
network perspectives Drug Discovery Today. 2009; 14(11-12): 579-88.
160. MacGregor W. Effects of Air Velocity, Air Temperature, and Berry Diameter on Wild
Blueberry Drying. Drying Technology 2005; 23: 387–96.
161. MacKenzie D.S. Perennial Ground Covers. Portland, Oregon: Timber Press, Inc; 2002.
pp. 308-9.
162. Magalhaes L. M, Segundo M. A, Reis S, Lima J. L.F.C. Methodological aspects
about in vitro evaluation of antioxidant properties. Analytica chimica acta 2008; 6 1 3:
1–19.
163. Majiene D, Trumbeckaite S, Savickas A, Toleikis A. Influence of propolis water
solution on heart mitochondrial function. J Pharm Pharmacol. 2006; 58(5): 709-13.
164. Mantell C, Rodríguez M, Martínez de la Ossa E. Semi-batch extraction of
anthocyanins from red grape pomace in packed beds: experimental results and process
modeling. Chemical Engineering Science 2002; 57 (18): 3831-8.
165. Marín-García J, Goldenthal M. J. Mitochondria and the Heart, New Jersey: Springer;
2005. p. 1-3.
166. Martin S, Giannone G, Andriantsitohaina R, Martinez M. C. Delphinidin, an active
compound of red wine, inhibits endothelial cell apoptosis via nitric oxide pathway and
regulation of calcium homeostasis. British Journal of Pharmacology 2003; 139: 1095–
102.
167. Mateus N, Oliveira J, Haettich-Motta M, Freitas V. New Family of Bluish
Pyranoanthocyanins. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2004; 5: 299–305.
168. Matsumoto H, Nakamura Y, Tachibanaki S, Kawamura S, Hirayama M.
Stimulatory effect of cyanidin 3-glycosides on the regeneration of rhodopsin. J Agric
Food Chem 2003; 51: 3560-3.
169. Matsunaga N, Chikaraishi Y, Shimazawa M, Yokota S, Hara H. Vaccinium
myrtillus (Bilberry) Extracts Reduce Angiogenesis In Vitro and In Vivo. eCAM 2007; 1-
10.
119
170. May J. M, Qu Z. C, Whitesell R. R, Cobb C. E. Ascorbate recycling in human
erythrocytes: role of GSH in reducing dehydroascorbate. Free Radic Biol Med 1996; 20:
543–51.
171. Mazza G. Anthocyanins and heart health. Ann Ist Super Sanità 2007; 43 (4): 369-74.
172. McDougall G. J, Fyffe S, Dobson P, Stewart D. Anthocyanins from red cabbage –
stability to simulated gastrointestinal digestion. Phytochemistry 2007; 68: 1285–94.
173. Michael T. Murray N.D. Bilberry (Vaccinium myrtillus). American Journal of Natural
Medicine 1997; 4 (1): 17-21.
174. Mojzis J, Varinska L, Mojzisova G, Kostova I, Mirossay L. Antiangiogenic effects
of flavonoids and chalcones. Pharmacological Research 2008; 57: 259–65.
175. Møller P, Loft S. Dietary antioxidants and beneficial effect on oxidatively damaged
DNA. Free Radical Biology & Medicine 2006; 41: 388–415.
176. Monograph Vaccinium myrtillus (Bilberry). Alternative Medicine Review 2001; 6(5):
500-4.
177. Montecinos V, Guzmán P, Barra V, Villagrán M, Muñoz-Montesino C, Sotomayor
K, et al. Vitamin C is an essential antioxidant that enhances survival of oxidatively
stressed human vascular endothelial cells in the presence of a vast molar excess of
glutathione. J Biol Chem 2007; 282: 15506–15.
178. Morais H, Ramos C, Forgasc E, Cserháti T, Matos N, Almeida V, Oliveira J.
Stability of anthocyanins extracted from grape skins. Chromatographia 2006; 56 (1):
173-5.
179. Morazzoni P, Magistretti M. J. Activity of Myrtocyan, an anthocyanoside complex
from Vaccinium myrtillus (VMA), on platelet aggregation and adhesiveness. Fitoterapia
1990; 61: 13-21.
180. Morganti P. The photoprotective activity of nutraceuticals. Clinics in Dermatology
2009; 27: 166–74.
181. Moyer R. A, Hummer K. E, Finn C. E, Frei B, Wrolstad R. E. Anthocyanins,
phenolics, and antioxidant capacity in diverse small fruits: Vaccinium, Rubus, and
Ribes. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2002; 50: 519-25.
120
182. Mpiana P.T, Mudogo V, Tshibangu D. S. T, Kitwa E. K, Kanangila A. B, Lumbu
J. B. S, et al. Antisickling activity of anthocyanins from Bombax pentadrum, Ficus
capensis and Ziziphus mucronata: Photodegradation effect. Journal of
Ethnopharmacology 2008; 120 (3): 413-8.
183. Muth E. R, Laurent J. M, Jasper P. The Effect of Bilberry Nutritional
Supplementation on Night Visual Acuity and Contrast Sensitivity. Alternative Medicine
Review 2000; 5 (2): 165-73.
184. Nagaoka S, Kakiuchi T, Ohara K, Mukai K. Kinetics of the reaction by which
natural vitamin E is regenerated by vitamin C. Chem Phys Lipids 2007; 146: 26–32.
185. Nakaishi H, Matsumoto H, Tominaga S, Hirayama M. Effects of black currant
anthocyanoside intake on dark adaptation and VDT work-induced transient refractive
alteration in healthy humans. Altern Med Rev. 2000; 5(6): 553–62.
186. Navasaitis M. Dendrologija. Vilnius: Margi raštai; 2004. p. 413-4.
187. Nelson S. K, Bose S. K, Grunwald G. K, Myhill P, McCord J. M. The induction of
human superoxide dismutase and catalase in vivo: a fundamentally new approach to
antioxidant therapy. Free Radic Biol Med 2006; 40: 341–7.
188. Nemeikaite-Ceniene A, Maroziene A, Pukalskas A, Venskutonis PR, Cenas N.
Redox properties of novel antioxidant 5,8-Dihydroxycoumarin: implications for its
prooxidant cytotoxicity. Z Naturforsch C. 2005; 60(11-12): 849-54.
189. Niederlander H. A. G, van Beek T. A, Bartasiute A, Koleva I. I. Antioxidant activity
assay on-line with liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 2008; 1210:
121–34.
190. Nijveldt R. J, Nood E, Hoorn D. E. C, Boelens P. G, Norren K, Leeuwen P. A. M.
Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and potential applications. Am J
Clin Nutr 2001; 74: 418–25.
191. Nikkhah E, Khayamay M, Heidari R, Jamee R. Effect of Sugar Treatment on
Stability of Anthocyanin Pigment in Berries. Journal of Biological Sciences 2007; 7(8):
1412-7.
192. Noda Y, Kneyuki T, Igarashi K, Mori A, Packer L. Antioxidant activity of nasunin,
an anthocyanin in eggplant peels. Toxicology 2000: 148(2-3): 119-23.
193. Ofek I, Goldhar J, Sharon N. Anti-escherichia coli adhesin activity of cranberry and
blueberry juices. Advances in Experimental and Medical Biology 1996; 408: 179-83.
121
194. Oki T, Masuda M, Furuta S, Nishiba Y, Terahara N, Suda I. Involvement of
Anthocyanins and other Phenolic Compounds in Radical-Scavenging Activity of Purple-
Fleshed Sweet Potato Cultivars. Journal of Food Science 2006; 67 (5): 1752 – 6.
195. Pautler E. L, Maga J. A, Tengerdy C. A pharmacologically potent natural product in
the bovine retina. Exp Eye Res 1986; 42: 285-8.
196. Pazmino-Duran A. E, Giusti M. M, Wrolstad R. E, Gloria B. A. Anthocyanins from
oxalis triangularis as potential food colorants. Food Chemistry 2001; 75(2): 211–6.
197. Pengelly A. Constituents of Medical Plants: An introduction to the chemistry and
therapeutics of herbal medicine. Singapore: CABI Publishing; 2004. p. 38.
198. Posmyk M. M, Kontek R, Janas K. M. Antioxidant enzymes activity and phenolic
compounds content in red cabbage seedlings exposed to copper stress. Ecotoxicology
and Environmental Safety 2009; 72: 596–602.
199. Prior R. L, Cao G, Martin A, Sofic E, McEwen J, O’Brien C, Lischner N, et al.
Antioxidant Capacity As Influenced by Total Phenolic and Anthocyanin Content,
Maturity, and Variety of Vaccinium Species. J. Agric. Food Chem. 1998; 46: 2686-93.
200. Prior R. L, Lazarus S. A, Cao G, Muccitelli H, Hammerstone J. F. Identification of
procyanidins and anthocyanins in blueberries and cranberries (Vaccinium Spp.) using
high-performance liquid chromatography/mass spectrometry. Journal of Agricultural
and Food Chemistry 2001; 49: 1270-6.
201. Prior R. L. Fruits and vegetables in the prevention of cellular oxidative damage. Am J
Clin Nutr 2003; 78: 570–8.
202. Puupponen- Pimiä R, Nohynek L, Alakomi H-L, Oksman-Caldentey K-M. The
action of berry phenolics against human intestinal pathogens. BioFactors 2005; 23: 243–
51.
203. Puupponen-Pimiä R, Nohynek L, Alakomi H-L, Oksman-Caldentey K-M.
Bioactive berry compounds-novel tools against human pathogens. Appl Microbiol
Biotechnol 2005; 67: 8–18.
204. Rahman M. M, Ichiyanagi T, Komiyama T, Hatano Y, Konishi T. Superoxide
radical- and peroxynitrite-scavenging activity of anthocyanins; structure-activity
relationship and their synergism. Free Radical Research 2006; 40(9): 993–1002.
205. Ramirez M. R, Izquierdo I, Bassols Raseira M. C, Zuanazzi J. A, Barros D,
Henriques A. T. Effect of lyophilised Vaccinium berries on memory, anxiety and
locomotion in adult rats. Pharmacological Research 2005; 52: 457–62.
122
206. Rapisarda P, Fanella F, Maccarone E. Reliability of Analytical Methods for
Determining Anthocyanins in Blood Orange Juices. J. Agric. Food Chem. 2000; 48:
2249-52.
207. Ratty A. K, Das N. P. Effects of flavonoids on nonenzymatic lipid peroxidation:
structure-activity relationship. Biochem Med Metab Biol 1988; 39: 69–79.
208. Rein M. Copigmentation reactions and color stability of berry anthocyanins: [Daktaro
disertacija]. Suomija, Helsinki, 2005.
209. Renaud S, de Lorgeril M. Wine, alcohol, platelets, and the French paradox for
coronary heart disease. Lancet 1992; 339: 1523-6.
210. Renaud S. C, Beswick A. D, Fehily A. M, Sharp D. S, Elwood P. C. Alcohol and
platelet aggregation: the Caerphilly prospective heart disease study. Am J Clin Nutr
1992; 55: 1012-7.
211. Rentzsch M, Schwarz M, Winterhalter P. Pyranoanthocyanins – an overview on
structures, occurrence, and pathways of formation. Trends in Food Science &
Technology 2007; 18 (10): 526-34.
212. Ribnicky D. M, Poulev A, Schmidt B, Cefalu W. T, Raskin I. Evaluation of
botanicals for improving human health. Am J Clin Nutr. 2008; 87: 472–5.
213. Rice-Evans C, Packer L. Flavonoids in Health and disease 2nd
edition. New York,
Basel: Marcel Dekker, Inc; 2003. pp. 4-6, 273-301.
214. Rice-Evans C. A, Miller N. J, Paganga G. Structure-antioxidant activity relationships
of flavonoids and phenolic acids. Free Radic Biol Med 1996; 20: 933–56.
215. Rice-Evans C. Plant polyphenols: free radical scavengers or chain-breaking
antioxidants? Biochem Soc Symp 1995; 61: 103–16.
216. Riihinen K, Jaakola L, KaØrenlampi S, Hohtola A. Organ-specific distribution of
phenolic compounds in bilberry (Vaccinium myrtillus) and ‗northblue‘ blueberry
(Vaccinium corymbosum x V. angustifolium). Food Chemistry 2008; 110: 156–60.
217. Rottenberg H, Hashimoto K. Fatty acid uncoupling of oxidative phosphorylation in rat
liver mitochondria. Biochemistry 1986; 25: 1747-55.
218. Roy S, Khanna S, Alessio H. M, Vider J, Babchi D, Bagchi M, Sen C. K. Anti-
angiogenic Property of Edible Berries. Free Radical Research 2002; 36 (9): 1023–31.
219. Santos A. C, Uyemura S. A, Lopes J. L, Bazon J. N, Mingatto F. E, Curti C. Effect
of naturally occurring flavonoids on lipid peroxidation and membrane permeability
transition in mitochondria. Free Radic Biol Med 1998; 24: 1455–61.
123
220. Schapira A. H. V. Mitochondrial function and dysfunction. London: Academic Press;
2002. p. 25-52.
221. Scheffler I. E. Mitochondria 2nd
edition. Hoboken, New Jersey: J. Wiley and Sons, Inc.;
2007. p. 168-339.
222. Ścibisz I, Mitek M. Antioxidant properties of highbush blueberry fruit cultivars.
Electronic Journal of Polish Agricultural Universities 2007; 10(4): 34.
223. Scibisz I, Mitek M. The changes of antioxidant properties in highbush blueberries
(Vaccinium corymbosum L.) during freezing and long-term frozen storage. Acta Sci.
Pol., Technol. Aliment. 2007; 6(4): 75-82.
224. Sellappan S, Akoh C. C, Krewer G. Phenolic compounds and antioxidant capacity of
Georgia-grown blueberries and blackberries. Journal of Agricultural and Food
Chemistry. 2002; 50: 2432-8.
225. Shi J, Mazza G, Maguer L. M. Functional foods Volume 2: Biochemical and
Processing Aspects. Kanada: CRC Press; 2002. pp 71-6.
226. Shih P-H, Yeh C-T, Yen G-C. Anthocyanins Induce the Activation of Phase II
Enzymes through the Antioxidant Response Element Pathway against Oxidative Stress-
Induced Apoptosis. J. Agric. Food Chem. 2007; 55 (23): 9427–35.
227. Skrede G, Wrolstad R. W, Durst R. W. Changes in Athocyanins and Polyphenolics
During Juice Processing of Highbush Blueberries (Vaccinium corymbosum L.). Journal
of food science 2000; 65 (2): 357-64.
228. Skulachev V. P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics.
Biochimica Biophysica Acta 1998; 1363(2): 100–24.
229. Skupie K. Evaluation of chemical composition of fresh and frozen blueberry fruit
(Vaccinium corymbosum L.). Acta Sci. Pol., Hortorum Cultus 2006; 5(1): 19-25.
230. Smith M, Marley K, Seigler D, Singletary K, Meline B. Bioactive properties of wild
blueberry fruits. J Food Sci. 2000; 65: 352–6.
231. Sokolov S. J. Fitoterapija y fitofarmakologija. Rukavodstvo dlia vračei. Moskva:
medicinskaie informacionaie agentstvo 2000; p. 949.
232. Sparrow J. R, Vollmer-Snarr H. R, Zhou J, Jang Y. P, Jockusch S, Itagaki Y,
Nakanishi K. A2E-epoxides Damage DNA in Retinal Pigment Epithelial Cells. The
Journal Of Biological Chemistry 2003; 278 (20): 18207–13.
233. Stackevičienė E, Butkus V, Butkienė Z. Stambiauogių spanguolių, sodinių ir
siauralapių šilauogių bei bruknių introdukcija Lietuvoje. Ţemės ūkio mokslai 1997, p.
58–70.
124
234. Stackevičienė E. Šilauogės. Augalų pasaulis 2006; Nr. 33. p. 23.
235. Stackevičienė E. Šilauogių (Vaccinium) introdukcinio adaptyvumo analizė. Botanica
Lithuanica 2003; 5: 97- 107.
236. Starast M, Karp K, Vool E, Moor U, Tonutare T, Paal T. Chemical composition and
quality of cultivated and natural blueberry fruit in Estonia. Vegetable crops research
bulletin 2007; 66: 143-53.
237. Steffen M, Sarkela T. M, Gybina A. A, Steele T. W, Trasseth N. J, Kuehl D, Giulivi
C. Metabolism of S-nitrosoglutathione in intact mitochondria. Biochem. J. 2001; 356:
395-402.
238. Steinberg D, Parsatharathy S, Carew T. E, Khoo J. C, Witztum J. L. Beyond
cholesterol. Modifications of low-density lipoprotein that increase its atherogenicity. N
Engl J Med 1989; 320: 915-24.
239. Stoner G. D, Wang L-S, Zikri N, Chen T, Hecht S.S, Huang C, Sardo C, et al.
Cancer prevention with freeze-dried berries and berry components. Seminars in Cancer
Biology 2007; 17: 403–10.
240. Sweeney M. I, Kalt W, S.L. Mackinnon S. L, Ashby J, K.T. Gottschall-Pass K. T.
Feeding Rats Diets Enriched in Lowbush Blueberries for Six Weeks Decreases
Ischemia-induced Brain Damage. Nutritional Neuroscience, 2002; 5 (6): 427–31.
241. Talaveara S. V, Felgines C, Texier O, Besson C, Gil-Izquierdo A, Lamaison J-L,
Reameasy C. Anthocyanin Metabolism in Rats and Their Distribution to Digestive
Area, Kidney, and Brain. J. Agric. Food Chem. 2005; 53: 3902-8.
242. Talavera S, Felgines C, Texier O, Besson C, Lamaison J-L, Remesy C.
Anthocyanins Are Efficiently Absorbed from the Stomach in Anesthetized Rats. J. Nutr
2003; 133: 4178-82.
243. Talavera S, Felgines C, Texier O, Besson C, Manach C, Lamaison J-L, Remesy C.
Anthocyanins Are Efficiently Absorbed from the Small Intestine in Rats. J. Nutr. 2004;
134: 2275–9.
244. Tatoyan A, Giulivi C. Purification and Characterization of a Nitric-oxide Synthase
from Rat Liver Mitochondria. The journal of biological chemistry 1998; 273(18):
11044–8.
245. Tatsuzawa F, Saito N, Miyoshi K, Shihinoda K, Shigihara A, Honda T. Diacylated
8-C-Glucosylcyanidin 3-Glucoside from the Flowers of Tricyrtis formosana. Chem.
Pharm. Bull. 2004; 52(5): 631-3.
125
246. Terahara N, Konczak I, Ono H, Yoshimoto M, Yamakawa O. Characterization of
Acylated Anthocyanins in Callus Induced From Storage Root of Purple-Fleshed Sweet
Potato, Ipomoea batatas L. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2004; 5: 279–86.
247. Toleikis A, Trumbeckaite S, Majiene D. Cytochrome C effect on respiration of heart
mitochondria: influence of various factors. Biosci Rep. 2005; 25(5-6): 387-97.
248. Traditional medicine. Available at:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs134/en/
249. Trehane J. Blueberries, cranberries, and other vacciniums. Portland, Oregon: Timber
Press, Inc; 2004. pp. 15-27, 85-191.
250. Trumbeckaite S, Bernatoniene J, Majiene D, Jakstas V, Savickas A, Toleikis A.
The effect of flavonoids on rat heart mitochondrial function. Biomed Pharmacother.
2006; 60(5): 245-8.
251. Trumbeckaite S, Bernatoniene J, Majiene D, Jakštas V, Savickas A, Toleikis A.
Effect of Ginkgo biloba extract on the rat heart mitochondrial function. J
Ethnopharmacol. 2007; 111(3): 512-6.
252. Tsuda T, Horio F, Uchida K, Aoki H, Osawa T. Dietary cyanidin 3-O-beta-D-
glucoside-rich purple corn color prevents obesity and ameliorates hyperglycemia in
mice. J Nutr. 2003; 133(7): 2125–30.
253. Tzika E. D, Papadimitriou V, Sotiroudis T. G, Xenakis A. Antioxidant Properties of
Fruits and Vegetables Shots and Juices: An Electron Paramagnetic Resonance Study.
Food Biophysics 2008; 3: 48–53.
254. US Highbush blueberry council. Available at:
http://www.blueberry.org/blueberries.htm
255. Valentova K, Ulrichova J, Cvak L, Simanek V. Cytoprotective effect of a bilberry
extract against oxidative damage of rat hepatocytes. Food Chemistry 2007; 101: 912–7.
256. Van Dijk C, Driessen A. J, Recourt K. The uncoupling efficiency and affinity of
flavonoids for vesicles. Biochem Pharmacol 2000; 60: 1593–600.
257. Van Hoorn D. E, Nijveldt R. J, Van Leeuwen P. A, Hofman Z, M'Rabet L, De Bont
D. B, et al. Accurate prediction of xanthine oxidase inhibition based on the structure of
flavonoids. Eur J Pharmacol 2002; 451: 111–8.
258. Viljakainen S, Vistiand A, Laakso A. Concentrations of Organic Acids and Soluble
Sugars in Juices from Nordic Berries. Acta Agriculturae Scandinavica, Section B - Plant
Soil Science 2002; 52 (2): 101 – 9.
126
259. Vollmannová A, Tóth T, Urminská D, Poláková Z, Timoracká M, Margitanová E.
Anthocyanins Content in Blueberries (Vaccinium corymbosum L.) in Relation to
Freezing Duration. Czech J. Food Sci. 2009; 27: 204-6.
260. Wang H, Cao G, Prior R. L. The oxygen radical absorbing capacity of anthocyanins. J
Agric Food Chem 1997; 45: 304–9.
261. Wang J, Kalt W, Sporns P. Comparison between HPLC and MALDI-TOF MS
Analysis of Anthocyanins in Highbush Blueberries. J. Agric. Food Chem. 2000; 48:
3330-5.
262. Wang J, Mazza G. Effects of Anthocyanins and Other Phenolic Compounds on the
Production of Tumor Necrosis Factor α in LPS/IFN-γ-Activated RAW 264.7
Macrophages. J. Agric. Food Chem. 2002; 50: 4183-89.
263. Wang S. Y, Jiao H. Scavenging Capacity of Berry Crops on Superoxide Radicals,
Hydrogen Peroxide, Hydroxyl Radicals, and Singlet Oxygen. J. Agric. Food
Chem. 2000; 48 (11): 5677–84.
264. Watanabe M. An Anthocyanin Compound in Buckwheat Sprouts and Its Contribution
to Antioxidant Capacity. Biosci. Biotechnol. Biochem.2007; 71 (2): 579-82.
265. Williams C. M, Mohsen M. A. E, Vauzour D, Rendeiro C, Butler L. T, Ellis J. A,
Whiteman M, et al. Blueberry-induced changes in spatial working memory correlate
with changes in hippocampal CREB phosphorylation and brain-derived neurotrophic
factor (BDNF) levels. Free Radical Biology and Medicine 2008; 45 (3): 295-305.
266. Wrolstad R. E, Durst R. W, Lee J. Tracking color and pigment changes in
anthocyanin products. Trends in Food Science and Technology 2005; 16 (9): 423–8.
267. Wu X, Beecher G. R, Holden J. M, Haytowitz D. B, Gebhardt S. E, Prior R. L.
Lipophilic and hydrophilic antioxidant capacities of common foods in the United States.
Journal of Agricultural and Food Chemistry 2004; 52: 4026-37.
268. Wu X, Prior R. L. Systematic Identification and characterization of anthocyanins by
HPLC-ESI-MS/MS in common foods in the united states: fruits and berries. J. Agric.
Food Chem. 2005; 53: 2589–99.
269. Wyk B-E, Wink M. Medicinal plants of the world (an illustrated scientific guide to
important medicinal plants and their uses). Portland: Timber Press, Inc.; 2004. p. 333.
270. Xia M, Ling W, Zhu H, Wang Q, Ma J, Hou M, Tang Z, et al. Anthocyanin Prevents
CD40-Activated Proinflammatory Signaling in Endothelial Cells by Regulating
Cholesterol Distribution. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2007; 27: 519-24.
127
271. Yen G-C, Duh P-D, Su H-J, Yeh C-T, Wu C-H. Scavenging effects of lotus seed
extracts on reactive nitrogen species. Food Chemistry 2006; 94: 596–602.
272. Yi W, Fisher J, Krewew G, Akoh C. C. Phenolic Compounds from Blueberries Can
Inhibit Colon Cancer Cell Proliferation and Induce Apoptosis. J. Agric. Food
Chem.2005; 53: 7320-9.
273. Youdim K. A, McDonald J, Kalt W, Joseph J. A. Potential role of dietary flavonoids
in reducing microvascular endothelium vulnerability to oxidative and inflammatory
insults. J Nutr Biochem 2002; 13: 282-8.
274. Youdim K. A, Shukitt-Hale B, Martin A, Wang H, Denisova N, Bickford P. C,
Joseph J.A. Short-term dietary supplementation of blueberry polyphenolics: beneficial
effects on aging brain performance and peripheral function. Nutr Neurosc 2000; 3: 383-
97.
275. Yuksel S, Koca I. Color Stability of Blackberry Nectars During Storage. Journal of
Food Technology 2008; 6 (4): 166-9.
276. Zhang W, Franco Ch, Curtin Ch, Conn S. To Stretch the Boundary of Secondary
Metabolite Production in Plant Cell-Based Bioprocessing: Anthocyanin as a Case Study.
Journal of Biomedicine and Biotechnology 2004; 5: 264–71.
277. Zhang Z, Kou X, Fugal K, Mclaughlin J. Comparison of HPLC Methods for
Determination of Anthocyanins and Anthocyanidins in Bilberry Extracts. J. Agric. Food
Chem. 2004; 52: 688-91.
278. Zheng J, Ramirez V. D. Inhibition of mitochondrial proton F0F1-ATPase/ATP
synthase by polyphenolic phytochemicals. Br J Pharmacol 2000; 130: 1115–23.
279. Zheng W, Wang S. Y. Oxygen Radical Absorbing Capacity of Phenolics in
Blueberries, Cranberries, Chokeberries, and Lingonberries. J. Agric. Food Chem. 2003;
51: 502-9.
280. Zhou Y, Singh B. R. Effect of Light on Anthocyanin Levels in Submerged, Harvested
Cranberry Fruit. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2004; 5: 259–263.
128
DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS
Straipsniai leidiniuose, įtrauktuose į Mokslinės informacijos instituto duomenų bazę:
1. Burdulis D, Ivanauskas L, Jakštas V, Janulis V. ― Mėlynės (Vaccinium myrtillus L.) vaisių vaistinės
augalinės ţaliavos antocianų tyrimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu“,
Medicina. ISSN 1010-660X. 2007, t. 43, Nr. 7, p. 568-574, 2007.
2. Burdulis D, Janulis V, Milašius A, Jakštas V, Ivanauskas L. ―Method development for
determination of anthocyanidin content in bilberry (Vaccinium myrtillus L) fruits‖, Journal of Liquid
Chromatography & Related Technologies, 31: 850–864, 2008 Copyright Taylor & Francis Group, LLC
© ISSN 1082-6076.
3. Burdulis D, Ivanauskas L, Dirsė V, Kazlauskas S, Raţukas A. ―Study of diversity of anthocyanin
composition in bilberry (Vaccinium myrtillus L.) fruits‖, Medicina. ISSN 1010-660X. 2007, t. 43, Nr.
12, p. 971-977, 2007.
4. Burdulis D, Šarkinas A, Jesutienė I, Stackevičienė E, Nikolajevas L, Janulis V. „Comparison of
anthocyanidin composition, antimicrobial and antioxidant activity in bilberry (Vaccinium myrtillus L) and
blueberry (Vaccinium corymbosum L) fruits‖, Acta Poloniae Pharmaceutica. Drug research. ISSN 0001-
6837. 2009, t. 66, Nr. 4. p. 399-408.
Konferencijų tezės:
1. Burdulis D. ―Antocianų nustatymas Lietuvoje augančių mėlynių (Vaccinium myrtillus L.)
vaisiuose―, Jaunimas siekia paţangos: jaunųjų mokslininkų konferencijos straipsnių
rinkinys. Akademija, 2007, Nr. 2. p. 130-3.
2. Burdulis D, Jakštas V, Ivanauskas L, Janulis V. Mėlynės (Vaccinium myrtillus L.) vaisių
vaistinės augalinės ţaliavos fitocheminis tyrimas ESC metodu, Tryliktoji, tarptautinė
mokslinė-praktinė konferencija Ţmogaus ir gamtos sauga, Akademija, Kaunas 2007
(stendinis pranešimas).
3. Burdulis D, Jakštas V, Janulis V, Analysis of Bilberry (Vaccinium myrtillus L.) fruit
anthocyanidins by HPLC, FoodBalt-2007 : 2nd Baltic conference on food science and
technology : conference program and abstracts, Kaunas, June 13-14 / Lithuanian Network of
Food Quality and Safety, Kaunas University of Technology. Kaunas, 2007, p. 52 (stendinis
pranešimas).
4. Burdulis D, Jakštas V, Ivanauskas L. Separation, identification and method validation of
anthocyanins in bilberry (Vaccinium myrtillus L.) fruits, 4th Nordic Separation Science Society
129
(NoSSS) International Conference : August 26-29, 2007, Kaunas : abstracts book and final
program / Editors: Audrius Maruška, Olga Kornyšova. ISBN 978-9955-12-232-
6. Kaunas : Vytautas Magnus University, 2007, p. 75, abstract no. P-3 (stendinis pranešimas).
5. Raudonis R, Jakštas V, Burdulis D, Bumblauskienė L, Janulis V. HPLC-PCR Method for
Determination of Antioxidant Activity in Herbal. Raw Materials and Herbal Preparations,
NoSSS 2009 - 5th Conference on separation and Related Techniques by Nordic separation
Science Society : 26-29 August, 2009, Tallinn, Estonia : Abstract book and program / Tallinn
university of tech., 2009, p. 129, abstract no. PP55 (stendinis pranešimas).