Embed Size (px)
Citation preview
KARAKTERISTIK PROTEIN ALERGEN BABY FISH NILA
(Oreochromis niloticus) DAN HASIL OLAHANNYA
SKRIPSI
WIDYANINGSIH
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2018 M / 1440 H
KARAKTERISTIK PROTEIN ALERGEN BABY FISH NILA
(Oreochromis niloticus) DAN HASIL OLAHANNYA
SKRIPSI
Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mempreroleh Gelar Sarjana Sains
Program Studi Kimia
Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta
Oleh:
WIDYANINGSIH
11140960000058
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2018 M / 1440 H
Scanned by CamScanner
Scanned by CamScanner
Scanned by CamScanner
ABSTRAK
WIDYANINGSIH. Karakteristik Protein Alergen Baby Fish Nila
(Oreochromis niloticus) dan Hasil Olahannya. Dibimbing oleh SRI YADIAL
CHALID dan HENDRA WIJAYA.
Alergen merupakan senyawa yang memiliki kemampuan memicu respon imun
tubuh hingga menyebabkan reaksi alergi. Bahan pangan yang mengandung
protein alergen berasal dari kacang-kacangan, susu, ikan atau seafood.
Penelitian yang dilakukan adalah mengkarakterisasi protein alergen yang
terkandung pada baby fish nila (Oreochromis niloticus) dan mengetahui
pengaruh pengolahan baby fish nila dengan cara rebus dan goreng terhadap
sifat alergenisitasnya. Ekstraksi protein dilakukan menggunakan phosphate
buffer saline pH 7,5 dan disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm, pada suhu
4 °C selama 25 menit. Kadar ekstrak protein diukur dengan metode Bradford.
Ekstrak protein dikarakterisasi berdasarkan berat molekulnya menggunakan
metode elektroforesis gel poliakrilamida-natrium dodesil sulfat dengan
tegangan 90 Volt dan diuji alerginisitasnya dengan metode Imunoblotting
berdasarkan berat molekul. Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa baby
fish nila mentah, rebus dan goreng mengandung protein alergen bervariasi
dengan berat molekul sekitar 31 kDa hingga lebih dari 250 kDa. Pengolahan
dengan cara rebus dan goreng dapat mempengaruhi sifat alergenisitas pada
protein baby fish nila.
Kata kunci: Alergen, baby fish nila, imunoblotting, SDS-PAGE.
ABSTRACT
WIDYANINGSIH. Characteristics of Allergen Protein Tilapia Baby Fish
(Oreochromis niloticus) and Its Result Processed. Guided by SRI YADIAL
CHALID and HENDRA WIJAYA.
Allergens are substances that have ability to respond of allergy reaction.
Foodstuffs containing allergen proteins such as nuts, milk, fish or seafood. The
research conducted was characterize the allergen proteins contained in the tilapia
baby fish (Oreochromis niloticus) and know the effect of tilapia baby fish
processing by boiling and frying on its allergenicity. Protein extraction was
performed using phosphate buffer saline pH 7.5 and centrifuged with 4000 rpm, at
4 °C for 25 minutes. The level of protein extract determined by using Bradford
method. The protein extract was characterized by molecular weight using
polyacrylamide-sodium dodecyl sulphate gel electrophoresis method with 90 Volt
and tested its allerginicity by Imunoblotting based on molecular weight. The
results of this study are that tilapia baby fish raw, boiled and fried contains varies
allergen protein at a molecular weight about 31 kDa to more than 250 kDa.
Processing by boiled and fried can affect the allergenicity of protein tilapia baby
fish.
Keywords: Allergen, imunoblotting, SDS-PAGE, tilapia baby fish.
viii
KATA PENGANTAR
Bismillaahirrohmaanirrohim
Assalamu’alaikum Warahmatullahi Wabarakatuh
Segala puji dan syukur penulis hanturkan ke Hadirat Allah SWT, atas
segala nikmat-Nya sehingga penulis mampu menyelesaikan skripsi ini. Shalawat
serta salam semoga selalu dilimpahkan kepada junjungan kita Nabi Muhammad
SAW. Skripsi ini berjudul Karakteristik Protein Alergen Baby Fish Nila
(Oreochromis niloticus) dan Hasil Olahannya. Pada kesempatan ini, penulis
ingin menyampaikan ucapan terima kasih kepada semua pihak yang telah
membantu dan mendukung sehingga penulisan skripsi ini dapat diselesaikan.
1 Dr. Sri Yadial Chalid, M. Si selaku pembimbing I yang selalu memberikan
kepedulian, nasihat, dan bimbingan kepada peneliti.
2 Dr. Hendra Wijaya, M. Si selaku pembimbing II yang telah memberikan
pengetahuan, kepedulian, dan arahan kepada peneliti.
3 Dr. Sandra Hermanto, M. Si selaku dosen pembimbing akademik dan
sebagai dosen penguji I yang telah memberikan bimbingan dan masukan
selama perkuliahan.
4 Tarso Rudiana, M. Si selaku dosen penguji II yang telah memberikan
masukan dan saran yang bermanfaat kepada peneliti.
5 Drs. Dede Sukandar, M.Si selaku ketua Program Studi Kimia Fakultas
Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
6 Dr. Agus Salim, M.Si selaku Dekan Fakultas Sains dan Teknologi UIN
Syarif Hidayatullah Jakarta.
ix
7 Isalmi Aziz, M. T selaku Sekretaris Program Studi Kimia Fakultas Sains
dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
8 Orang tua dan keluarga tercinta Ali Saban, Ida Faridha HMS, Adi Tamara
yang telah memberikan doa, kasih sayang, nasihat, dan selalu
membangkitkan semangat serta dukungan baik moril maupun material.
9 Annisa Thaharah selaku teman seperjuangan dalam laboratorium selama
penelitian yang selalu membantu, memberikan semangat, dan dukungan
untuk menyelesaikan skripsi ini.
10 Ichva Alfiyanti Fajri, Yuniar Candra Pratiwi, Titik Tiara Sukma, dan
semua sahabat yang telah memberikan semangat dan dukungan.
11 Semua teman-teman Program Studi Kimia UIN Syarif Hidayatullah
Jakarta angkatan 2014 atas dukungan dan kerja sama selama penulis
belajar di Program Studi Kimia.
Penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi kita semua.
Wassalamu’alaikum Warahmatullahi Wabarakatuh
Jakarta, 05 Desember 2018
Widyaningsih
x
DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR .............................................................................................. viii
DAFTAR ISI ................................................................................................................ x
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................. xii
DAFTAR TABEL .................................................................................................... xiii
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................ xiv
BAB I PENDAHULUAN ............................................................................................ 1
1.1 Latar Belakang ........................................................................................................ 1
1.2 Rumusan Masalah ................................................................................................... 3
1.3 Hipotesis .................................................................................................................. 3
1.4 Tujuan Penelitian .................................................................................................... 4
1.5 Manfaat Penelitian .................................................................................................. 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................. 5
2.1 Anak ikan nila ......................................................................................................... 5
2.2 Protein ..................................................................................................................... 7
2.3 Alegi ........................................................................................................................ 8
2.4 Alergen .................................................................................................................. 10
2.5 Mekanisme Alergi ................................................................................................. 13
2.6 Karakterisasi protein dengan SDS-PAGE ............................................................. 15
2.7 Karakterisasi protein alergen dengan Imunoblotting ............................................ 18
BAB III METODE PENELITIAN .......................................................................... 20
3.1 Waktu dan tempat penelitian ................................................................................. 20
3.2 Alat dan bahan....................................................................................................... 20
3.3 Diagram alir penelitian .......................................................................................... 22
3.4 Prosedur penelitian ................................................................................................ 23
3.4.1 Preparasi Bahan Baku ................................................................................... 23
3.4.2 Karakterisasi Bahan Baku ............................................................................. 23
3.4.3 Ekstraksi protein ............................................................................................ 25
3.4.4 Analisis kadar protein ................................................................................... 26
3.4.5 Profil protein dengan SDS-PAGE ................................................................. 26
xi
3.4.6 Preparasi serum penderita alergi ................................................................... 29
3.4.7 Imunoblotting ................................................................................................ 29
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................. 31
4.1 Identifikasi baby fish nila ...................................................................................... 31
4.2 Ekstrak baby fish nila ............................................................................................ 34
4.3 Karakteristik protein baby fish nila hasil analisis SDS-PAGE ............................. 35
4.4 Imunoblotting ........................................................................................................ 40
BAB V PENUTUP ..................................................................................................... 47
5.1 Simpulan .............................................................................................................. 47
5.2 Saran ...................................................................................................................... 47
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................ 48
LAMPIRAN ............................................................................................................... 53
xii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Baby fish nila ............................................................................................. 6
Gambar 2. Jenis reaksi hipersensitivitas ...................................................................... 9
Gambar 3. Ikatan antara alergen dan IgE ................................................................. 11
Gambar 4. Struktur molekul antibodi ....................................................................... 12
Gambar 5. Mekanisme reaksi hipersensitivitas tipe I ................................................ 14
Gambar 6. Reaksi antara protein dan SDS ................................................................ 17
Gambar 7. Tahap-tahap pada imunoblotting ............................................................. 18
Gambar 8. Baby fish nila ........................................................................................... 31
Gambar 9. Hasil SDS-PAGE dengan variasi separating gel .................................... 36
Gambar 10. Hasil SDS-PAGE baby fish nila ............................................................ 37
Gambar 11. Hasil imunoblotting responden terhadap baby fish nila ....................... 41
xiii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Data pemasaran olahan baby fish ................................................................... 6
Tabel 2. Komposisi kimia baby fish nila .................................................................... 32
Tabel 3. Konsentrasi protein baby fish nila ................................................................ 35
Tabel 4. Berat molekul profil protein baby fish nila .................................................. 38
Tabel 5. Hasil kuisioner responden penderita alergi .................................................. 40
Tabel 6. Berat molekul protein alergen baby fish nila................................................ 42
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Pembuatan Pereaksi Bradford ............................................................... 53
Lampiran 2. Pembuatan Larutan Standar BSA ......................................................... 54
Lampiran 3. Pembuatan Laurtan Kerja untuk SDS-PAGE ....................................... 55
Lampiran 4. Pembuatan Larutan Kerja untuk Imunoblotting ................................... 57
Lampiran 5. Lembar Kuisinoner Responden ............................................................ 59
Lampiran 6. Naskah Persetujuan menjadi Responden .............................................. 60
Lampiran 7. Hasil Kuisioner salah satu responden ................................................... 64
Lampiran 8. Formulir Persetujuan salah satu responden .......................................... 65
Lampiran 9. Hasil Identifikasi Baby fish nila ............................................................ 66
Lampiran 10. Kurva Standar Uji Bradford ................................................................ 67
Lampiran 11. Jarak dan BM Marker pada SDS-PAGE ............................................ 68
Lampiran 12. Contoh perhitungan nilai Rf pada sampel SDS-PAGE ...................... 69
Lampiran 13. Jarak dan BM sampel baby fish pada SDS-PAGE ............................. 70
Lampiran 14. Jarak dan BM responden pada Imunoblotting .................................... 73
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Ikan nila (Oreochomis niloticus) merupakan salah satu jenis ikan yang
bernilai ekonomis tinggi, dimana kebutuhan benih maupun konsumsi ikan dari
tahun ke tahun cenderung meningkat seiring dengan perluasan usaha budidaya
(Darwisito et al., 2008). Ikan nila mengandung protein tinggi, sedikit lemak dan
kolesterol dibandingkan dengan ikan lele (Clement & Lovell, 1994). Ikan nila
juga mengandung asam-asam amino essensial yang baik untuk tubuh seperti
leusin, histidin, glisin, alanin, dan tirosin (Ogunji et al., 2015).
Produk olahan pangan dari ikan nila mengalami perkembangan cukup
pesat, salah satunya adalah olahan yang berasal dari anak ikan (baby fish) nila
yang memiliki cita rasa gurih dan lezat. Produksi baby fish memiliki peluang
keuntungan yang berlipat, dan minim risiko karena baby fish dapat dipanen lebih
cepat serta biaya produksi yang lebih murah (Iskandar et al., 2013). Olahan
pangan dari baby fish nila merupakan salah satu makanan yang halal dan
bermanfaat bagi tubuh manusia, sesuai dengan salah satu firman Allah SWT.
dalam Al-Qur’an surat Al-Maidah ayat 87 -88 yang berbunyi :
Artinya : Hai orang-orang yang beriman, janganlah kamu haramkan apa-apa
yang baik yang telah Allah halalkan bagi kamu, dan janganlah kamu
melampaui batas. Sesungguhnya Allah tidak menyukai orang-orang
2
yang melampaui batas. Dan makanlah makanan yang halal lagi baik
dari apa yang Allah telah rezekikan kepadamu, dan bertakwalah
kepada Allah yang kamu beriman kepada-Nya (QS. Al-Maidah :87-88).
Firman Allah SWT. di atas menjelaskan bahwa manusia dituntut untuk
memakan makanan halal yaitu makanan yang tidak mengandung unsur-unsur
yang diharamkan. Berdasarkan ayat tersebut, protein ikan nila merupakan salah
satu bahan pangan yang bermanfaat untuk pertumbuhan. Protein yang terkandung
dalam ikan sangat baik untuk tubuh, namun terdapat protein alergen yang dapat
memicu terjadinya alergi (Sharp & Lopata, 2014). Word Allergy Organization
(WAO) menyatakan bahwa 22% penduduk dunia menderita alergi dan terus
meningkat setiap tahun. Sebanyak 49% penderita alergi sensitif terhadap alergi
makanan (Candra et al., 2011). Alergi dapat memicu gejala ringan seperti gatal-
gatal, hidung berair, dan pembengkakan hingga menimbulkan reaksi yang cukup
berat seperti anafilaksis yang bisa menyebabkan kematian (Suseno et al., 2016).
Ikan, kerang, telur, kedelai, susu sapi, gandum, kacang tanah, kacang
pohon (tree nuts seperti kenari, walnut, hazelnut) merupakan sumber pangan yang
mengandung alergen (Gupta et al., 2013). Bahan pangan yang mengandung
protein alergen dapat diketahui berdasarkan berat molekulnya, seperti protein
alergen pada ikan mujair (Oreochromis mossambicus) dengan berat molekul
sekitar 17-114 kDa (Liu et al., 2012), protein alergen ikan tenggiri batang
ditemukan pada berat molekul sekitar 20 kDa (Misnan et al., 2005), dan ikan
tongkol pada berat molekul 27-38 kDa (Hamada et al., 2001). Proses pengolahan
pangan mengandung alergen dengan cara pemanasan berpotensi dapat
meningkatkan atau menurunkan sifat alergenisitas dari pangan tersebut (Nowak-
wegrzyn & Fiocchi, 2009). Beberapa metode untuk mendeteksi adanya protein
3
alergen yang terkandung pada suatu pangan yaitu dengan cara in vivo berupa uji
kulit kepada pasien penderita alergi dan cara in vitro berupa metode
imunoblotting, Radio Allergo Sorbent Test (RAST) dan Enzyme-Linked Immune
Assay (ELISA) (Koppelman & Hefle, 2006).
Baby fish nila (O. niloticus) merupakan salah satu bahan pangan yang
berpotensi mengandung alergen. Proses pengolahan yang dilakukan pada
penelitian ini adalah goreng dan rebus. Ekstraksi protein dilakukan dengan
phosphate buffer saline pH 7,5. Kadar protein terlarut diukur dengan metode
Bradford. Karakterisasi protein menggunakan metode SDS-PAGE dan
karakterisasi protein alergen dengan metode Imunoblotting untuk menentukan
berat molekul protein alergen.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang diatas, dirumuskan masalah:
1. Apakah baby fish nila mengandung protein alergen?
2. Apakah pengolahan baby fish nila dengan cara rebus dan goreng akan
mempengaruhi sifat alegenisitas pada protein baby fish nila?
1.3 Hipotesis
1. Baby fish nila mengandung protein alergen dengan berat molekul yang
bervariasi.
2. Pengolahan baby fish nila dengan cara rebus dan goreng dapat
mempengaruhi sifat alergenisitas pada protein baby fish nila.
4
1.4 Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah :
1. Menentukan karakter protein alergen pada baby fish nila.
2. Menentukan pengaruh proses pengolahan terhadap sifat alergenisitas
protein baby fish nila.
1.5 Manfaat Penelitian
Memberikan informasi kepada masyarakat umum bahwa baby fish nila
mengandung protein alergen, sehingga bagi penderita alergi dapat menghindari
atau meminimalisir konsumsi baby fish nila dengan cara pengolahan tertentu.
5
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Baby fish Nila (Oreochromis niloticus)
Ikan nila (Oreochromis niloticus) berasal dari Afrika dan merupakan ikan
air tawar yang termasuk dalam famili Cichlidae (Boyd, 2004). Ikan ini
mempunyai ciri-ciri bentuk tubuh bulat pipih, punggung lebih tinggi, pada badan
dan sirip ekor (caundal fin) ditemukan garis lurus (vertikal). Sirip dada, sirip
perut, sirip ekor, dan ujung sirip punggung akan berwarna merah pada saat musim
berkembang biak. Sirip punggung ikan nila terdapat garis lurus memanjang.
Saanin (1984) mengklasifikasi ikan nila sebagai berikut:
Kingdom : Animalia
Filum : Chordata
Subfilum : Vertebrata
Kelas : Osteichtyes
Subkelas : Acanthopterygii
Ordo : Percomorphi
Subordo : Percoidea
Famili : Cichlidae
Genus : Oreochromis
Spesies : Oreochromis niloticus
Produksi ikan nila di Indonesia berkembang cukup pesat dikarenakan
Indonesia memiliki sumber daya alam berlimpah terutama pada sektor perikanan,
sehingga budi daya ikan air tawar berpotensi meningkatkan nilai perekonomian
masyarakat. Produksi ikan nila di daerah Cianjur, Jawa Barat merupakan budi
daya ikan tertinggi, setelah ikan mas (Iskandar et al., 2013).
6
Produk olahan anak ikan (baby fish) di wilayah Cianjur Jawa Barat
meliputi baby fish segar, baby fish segar-mati-kemasan, dan baby fish goreng.
Produksi baby fish memiliki peluang keuntungan yang berlipat, dan minim risiko
karena baby fish dapat dipanen lebih cepat serta biaya produksi yang lebih murah.
Pemasaran produk baby fish adalah sebagai berikut,
Tabel 1. Data pemasaran olahan baby fish
No. Produk baby fish Wilayah pemasaran
1 Segar Cianjur
2 Segar-mati-kemasan Jabodetabek
3 Goreng-kemasan Jabodetabek
(Iskandar et al., 2013)
Baby fish nila merupakan ikan yang masih dalam tahap juvenile dengan
umur 3-5 minggu (Amri, 2003). Anak ikan ini memiliki panjang tubuh sekitar 3
hingga 7 cm. Bentuk baby fish nila adalah oval dengan warna hitam keemasan
dengan garis hitam vertikal di sirip belakang hingga badan. Garis tersebut
merupakan ciri khusus O. niloticus dibandingkan dengan ikan lain.
Gambar 1. Baby fish nila (Dokumentasi pribadi, 3 Oktober 2017)
7
Baby fish nila (O. niloticus) dengan umur 30 hari memiliki kandungan
protein yang cukup tinggi dan lemak yang rendah. Baby fish tersebut memiliki
kadar protein sebesar 17,2% dan lemak 1,15% (Justi et al., 2003). Ikan nila juga
memiliki asam-asam amino essensial yang baik untuk tubuh, seperti leusin,
histidin, glisin, alanin, tiorsin, dll. (Adeyeye, 2009).
2.2 Protein
Protein merupakan makromolekul yang tersusun dari asam-asam amino
membentuk ikatan peptida. Protein dalam bahan makanan yang dikonsumsi
manusia akan diserap oleh usus dalam bentuk asam amino. Beberapa asam amino
dan molekul-molekul protein kecil dapat juga diserap melalui dinding usus,
masuk ke dalam pembuluh darah. Hal tersebut akan menimbulkan reaksi alergi
dalam tubuh yang disebabkan oleh makanan mengandung protein sepeti ikan,
susu, udang, telur, dan sebagainya (Winarno, 2004).
Struktur protein dibagi menjadi empat bentuk, yaitu struktur primer,
sekunder, tersier, dan kuartener. Struktur primer merupakan susunan yang terdiri
dari asam-asam amino rantai lurus dengan unsur-unsur penyusun berupa C, H, N,
O. Struktur sekunder merupakan susunan asam-asam amino rantai lurus yang
saling berdekatan membentuk rantai polipeptida dengan bentuk tiga dimensi
karena adanya ikatan hidrogen. Struktur tersier merupakan gabungan dari struktur
sekunder yang satu dengan struktur sekunder bentuk lain yang dihubungkan
dengan ikatan hidrogen, ikatan garam, interaksi hidrofobik, dan ikatan disulfida.
Ikatan disulfida merupakan ikatan paling kuat dalam menyusun struktur tersier
protein. Struktur kuartener merupakan gabungan dari struktur primer, sekunder
8
dan tersier yang melibatkan beberapa polipeptida membentuk protein yang
kompleks (Winarno, 2004).
Fungsi utama protein bagi tubuh, yaitu sebagai berikut (Muchtadi, 2009):
1. Pertumbuhan dan pemeliharaan jaringan
2. Pembentukan senyawa tubuh yang essensial
3. Regulasi keseimbangan air
4. Mempertahankan netralitas tubuh
5. Pembentukan antibodi
6. Transpor zat gizi
Protein pada ikan termasuk sumber protein bermutu tinggi (Winarti,
2010). Protein yang terkandung pada ikan umumnya cukup stabil, berkisar 15-
20% (Sunarya, 2014). Protein daging ikan tersusun atas sarkoplasma yang
terdapat pada plasma otot, miofibril sebagai penyusun serabut otot dan stroma
yang terdapat pada jaringan ikat. Sarkoplasma mengandung berbagai macam
protein yang mudah larut air (Winarti, 2010).
2.3 Alergi
Alergi merupakan reaksi hipersensitivitas yang diperantarai oleh sistem
imun (pertahanan tubuh). Sel dan senyawa yang berperan pada reaksi
hipersensitivitas adalah sel limfosit (sel B atau sel T) pada tubuh yang merupakan
pengontrol sistem imun dan antigen merupakan suatu zat asing dari luar tubuh
yang dapat memicu terjadinya respon imun. Hipersensitivitas adalah peningkatan
reaktivitas atau sensitivitas terhadap antigen yang pernah dikenal sebelumnya
(Baratawidjaja & Rangganis, 2010).
9
Reaksi hipersensitivitas oleh Robert Coombs dan Philip HH Gell (1963)
dibagi menjadi 4 tipe, yaitu tipe I hipersensitif anafilaktik, tipe II hipersensitif
sitotoksik yang bergantung antibodi, tipe III hipersensitif yang diperani kompleks
imun, dan tipe IV hipersensitif cell-mediated (hipersensitif tipe lambat) (Gell &
Coombs, 1968) yang tertera pada Gambar 2.
Reaksi hipersensitivitas tipe I terjadi bila antigen (alergen) memicu sel B
untuk berubah menjadi sel plasma sehingga memproduksi antibodi IgE berlebih
yang menimbulkan reaksi alergi. Alergi makanan merupakan reaksi
hipersensitivitas tipe I. Reaksi hipersensitivitas tipe II melibatkan antibodi IgG
dan IgM dengan antigen permukaan sel, sehingga menimbulkan destruksi sel.
Reaksi hipersensitivitas tipe III, merupakan reaksi dimana kompleks imun yang
dibentuk oleh antigen dengan antibodi menjadikan sel fagosit mengenali
kompleks imun ini yang akan menghancurkan kompleks tersebut dan jika
kompleks imun yang dibentuk sangat banyak, akan membahayakan jaringan
tubuh. Reaksi hipersensitivitas tipe IV melibatkan pelepasan sitokin yang
merupakan reaksi hipersensitivitas tipe lambat (Kindt et al., 2007).
Gambar 2. Jenis-jenis reaksi hipersensitivitas (Kindt et al., 2007).
10
2.4 Alergen
Alergen merupakan zat yang memiliki kemampuan untuk berikatan
dengan antibodi IgE sehingga menyebabkan reaksi alergi. Senyawa yang
umumnya bersifat alergen adalah glikoprotein atau polipeptida yang larut dalam
air. Glikoprotein yang bersifat alergen umumnya memiliki berat molekul antara
10-70 KDa (Cianferoni & Spergel, 2009). Delapan jenis sumber pangan utama
yang sering menimbulkan reaksi alergi yaitu protein kacang tanah, kacang pohon
(tree nuts seperti kenari, walnut, hazelnut), susu sapi, ikan, kerang, telur, kedelai,
dan gandum (Gupta et al., 2013).
Berat molekul alergen sangat beragam, seperti ikan mujair
(O. mossambicus) memiliki protein alergen pada berat molekul sekitar 17 kDa-
114 kDa (Liu et al., 2012) dengan alergen mayor pada berat molekul 32 kDa.
Alergen mayor merupakan alergen yang dapat mengikat antibodi IgE penderita
alergi lebih dari 50% (McSherry & Blumenthal, 2008). Ikan tenggiri memiliki
protein alergen berkisar berat molekul 20 kDa (Misnan et al., 2005), dan ikan
tongkol pada berat molekul 27-38 kDa (Hamada et al., 2001). Makanan dengan
kadar protein tinggi berpotensi sebanyak 70% dapat menyebabkan alergi (Lockey
& Ledford, 2008).
Candra et al. (2011) menyebutkan bahwa sebesar 49% penderita alergi,
sensitif terhadap alergen makanan. Orang dewasa lebih banyak yang sensitif
terhadap alergen makanan, yaitu sebesar 70,6% dibandingkan anak-anak yang
hanya 29,4%. Jenis makanan yang paling banyak menyebabkan alergi pada anak-
anak dan dewasa adalah udang, kepiting, putih telur, susu sapi, dan maezena.
11
Alergen yang dikonsumsi oleh penderita alergi, pertama masuk ke dalam
tubuh melalui intestinal. Protein alergen memiliki kemampuan yang tahan
terhadap kondisi asam dalam lambung, dan tahan terhadap enzim protease dalam
saluran pencernaan. Alergen yang dikonsumsi oleh penderita alergi, akan masuk
ke dinding mukosa usus halus, sehingga akan terjadi gejala alergi (Garn & Renz,
2007). Ikatan yang terjadi antara alergen dengan antibodi IgE spesifik mirip
seperti hubungan “lock and key” (Gambar 3). Ikatan tersebut kemudian akan
melepaskan mediator-mediator sehingga menyebabkan gejala alergi (Soedarto,
2012).
Gambar 3. Ikatan antara alergen dan IgE (Abbas & Litchtman, 2009)
Bagian spesifik dari alergen yang mengikat antibodi IgE pada reaksi alergi
disebut epitop. Epitop merupakan bagian dari molekul yang secara spesifik
dikenali oleh paratop atau binding sites dari molekul antibodi (Yuliati, 2005).
Epitop dapat menentukan alergenisitas suatu protein. Ikatan antara IgE dengan
alergen umumnya terjadi bila protein alergen mengandung lebih dari 1 epitop
(Nowak-wegrzyn, 2003). Jumlah epitop dalam satu alergen berbeda dengan
jumlah epitop alergen lain. Semakin banyak jumlah epitop suatu protein alergen
yang berikatan dengan IgE, maka semakin parah gejala alergi yang ditimbulkan
(Shreffler et al., 2004).
12
Antibodi yang berperan pada reaksi alergi adalah antibodi IgE. Antibodi
merupakan suatu soluble protein yang termasuk kelas protein globulin, karena
struktur globularnya. Struktur molekul antibodi atau immunoglobulin terdiri atas 2
rantai polipeptida ringan (light chain, L) dengan berat molekul masing-masing
sekitar 25 kDa dan 2 rantai berat (heavy chains, H) dengan rantai berat molekul
masing-masing antara 50-70 kDa (Gambar 4). Rantai-rantai asam amino tersebut
dihubungkan dengan jembatan disulfida, baik intra chain diantara kedua rantai
berat maupun inter chain, antara rantai berat dan ringan (Wiradharma et al.,
2017).
Gambar 4. Struktur molekul antibodi (Griffin, 2007).
Rantai berat terdiri dari 5 kelas yang berbeda, yaitu rantai gamma (γ)
untuk antibodi IgG, alfa (α) untuk IgA, mu (μ) untuk IgM, delta (δ) untuk IgD,
dan epsilon (ε) untuk IgE. Rantai ringan terdiri dari 2 tipe, yaitu K (kappa) atau
lamda (λ), kedua rantai ringan tersebut dijumpai dalam lima kelas Ig, tetapi setiap
13
Ig hanya mengandung satu tipe rantai ringan saja (Wiradharma et al., 2017).
Rantai ringan dari antibodi tersusun dari satu variable domain dan satu constant
domain, sedangkan rantai berat tersusun dari satu variable domain dan tiga
constant domain. Variable domain dari rantai ringan dan rantai berat akan bekerja
sama untuk mengikat antigen atau alergen. Dua fragmen Fab (binds antigen) dari
rantai ringan merupakan fragmen yang berfungsi untuk mengikat antigen
(alergen) sedangkan dua fragmen Fc (binds complement) dari rantai berat
berfungsi untuk tempat pelekatan sel mastosit atau basofil (Griffin, 2007).
2.5 Mekanisme Alergi
Mekanisme alergi melibatkan produksi antibodi IgE secara berlebih,
dikarenakan terjadi paparan berulang terhadap antigen (alergen). Ikatan silang
antara IgE dan alergen akan memicu sel mastosit untuk melepaskan mediator-
mediator seperti histamin dan mediator lainnya, sehingga mempengaruhi
permeabilitas vaskular dan menyebabkan gejala alergi (Kumar et al., 2012).
Individu yang cenderung alergi, paparan terhadap beberapa antigen akan
menyebabkan aktivitas sel Th2 (allergen-specific T helper 2) dan produksi IgE.
Individu normal tidak mempunyai respon yang kuat terhadap sebagian besar
antigen asing. Ketika individu terpapar antigen seperti protein tertentu, makanan,
racun, obat, dll. Maka respon sel T yang dominan adalah pembentukan Th2.
Hipersensitivitas tersebut terjadi akibat dari aktivasi sel Th2 yang berespon
terhadap antigen protein. Antigen yang menimbulkan reaksi hipersensitivitas tipe
cepat (reaksi alergi) sering disebut sebagai alergen (Munasir & Dadi, 2010).
14
Reaksi hipersensitivitas tipe I terjadi akibat adanya antigen berupa alergen.
Paparan pertama alergen pada sel B dengan bantuan allergen-specific T helper 2
(Th2) akan mendiferensiasi sel B menjadi sel plasma. Sel plasma selanjutnya
memproduksi IgE. IgE merupakan golongan immunoglobulin (antibodi) yang
berperan pada reaksi alergi. IgE yang telah diproduksi kemudian menempel pada
sel mastosit. Paparan ulang dengan alergen yang sama akan membentuk reaksi
silang yang menyebabkan lepasnya mediator-mediator pada sel mastosit sehingga
akan menimbulkan gejala alergi. Secara garis besar, mekanisme alergi tertera pada
Gambar 5. berikut.
Gambar 5. Mekanisme reaksi hipersensitivitas tipe I (Abbas & Litchtman, 2009)
15
Tahap paparan pertama alergen hingga pembentukan reaksi silang IgE
dengan FcℇRI (reseptor Fc IgE) pada permukaan sel mastosit disebut fase
sensitisasi. IgE yang telah terpapar alergen secara berulang kali dan berikatan
silang akan melepaskan mediator-mediator. Tahap tersebut disebut fase aktivasi.
Sel mastosit memiliki peran penting pada reaksi alergi, karena pada sel mastosit
akan melepas mediator-mediator yang akan bereaksi dengan target organ dan
menyebabkan timbulnya gejala alergi. Mediator-mediator tersebut meliputi
histamin, eosinophil chemotactic factor of anaphylactic (ECF-A), dan neutrophil
chemoctatic factor (NCF). Tahapan pelepasan mediator tersebut disebut fase
efektor. Pelepasan mediator ini akan menyebabkan gejala reaksi alergi beberapa
menit setelah paparan (fase cepat) dan 6-24 jam setelah paparan berulang dengan
alergen (fase lambat) (Munasir & Dadi, 2010).
Gejala awal alergi makanan berupa rasa gatal pada mulut, kesulitan
menelan dan bernapas. Saat mencapai kulit, alergen akan menyebabkan terjadinya
eksim. Alergen menyebabkan asma bila mencapai paru-paru. Gejala alergi yang
paling membahayakan tubuh adalah anafilaktik syok yang ditandai dengan
tekanan darah yang menurun, kesadaran menurun, dan bila tidak ditangani segera
dapat menyebabkan kematian (Prawitasari & Spa, 2007).
2.6 Karakterisasi protein dengan SDS-PAGE
Sodium Dodecyl Sulfate-Poly Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-
PAGE) merupakan salah satu teknik pemisahan protein untuk melihat profil
protein dan menentukan berat molekul suatu protein tertentu (Berg et al., 2007).
Prinsip dari SDS-PAGE adalah pemisahan protein berdasarkan berat molekul
16
yang bermigrasi pada media penyangga berupa gel poliakrilamid dengan bantuan
muatan listrik. Migrasi protein pada gel poliakrilamid dipengaruhi oleh ukuran
molekul protein (Bintang, 2010).
Faktor-faktor yang mempengaruhi pembentukan gel dan pemisahan
protein, yaitu bahan-bahan yang digunakan, buffer, pH dari larutan, preparasi
sampel, hingga teknik pengerjaan SDS-PAGE. Konsentrasi akrilamid merupakan
salah satu faktor penting dalam ukuran pori-pori gel. Menurut Bollag et al.
(1991), konsentrasi akrilamid untuk memisahkan protein pada berat molekul
antara 15-200 kDa sebesar 5-12%.
Liu et al. (2012) mengkarakteristik protein ikan mujair dengan SDS-
PAGE menggunakan konsentrasi akrilamid sebesar 12,5%, menghasilkan protein
pada berat molekul 10-200 kDa. Pan et al. (2012) mengidentifikasi protein
kolagen kulit ikan nila (Tilapia zillii) memiliki berat molekul 115 kDa, 120 kDa,
dan 250 kDa dengan konsentrasi akrilamid sebesar 7,5%. Norziah et al. (2009)
mengkarakteristik gelatin ikan Herring Cina pada berat molekul 53 kDa dengan
konsentrasi akrilamid sebesar 7,5%.
Preparasi sampel sebelum elektroforesis adalah penambahan buffer sampel
yang terdiri dari SDS, gliserol, 2-mercaptoethanol dan bromphenol blue dengan
pemanasan selama 5 menit. Hal tersebut bertujuan untuk mendenaturasi protein
sehingga struktur yang akan dipisahkan lebih sederhana dan akan merusak
struktur tiga dimensi protein sehingga protein yang dipisahkan mudah untuk
bermigrasi (Bintang, 2010).
17
Gambar 6. Reaksi antara protein dan SDS (García-descalzo et al., 1995).
SDS (Sodium dodecyil sulfate) berfungsi untuk memberikan muatan
negatif pada protein yang akan dianalisis, mendenaturasi protein,
menyederhanakan protein (bentuk, ukuran, muatan) sesuai dengan Gambar 6.
Muatan negatif SDS akan mengubah sebagian struktur kompleks protein dan
secara kuat tertarik kearah anoda bila ditempatkan pada medan listrik. Deterjen
dari senyawa SDS akan mengubah konformasi (denaturasi) protein (Winarno,
2004).
Berbagai jenis protein pada suatu sampel dengan metode SDS-PAGE akan
terpisah melalui gel poliakrilamid yang didasarakan atas pergerakan berat molekul
dari protein, sehingga jalur pergerakan protein yang dihasilkan berupa pita protein
yang akan memisah sesuai dengan berat molekul dari protein-protein yang
dianalisis (Fatchiyah et al., 2011). Protein yang memiliki ukuran partikel lebih
besar akan menyebabkan gerakannya lebih lambat dibandingkan dengan
kompleks protein yang memiliki ukuran partikel yang lebih kecil. Hal tersebut
menyebabkan pita protein dengan berat molekul kecil berada dibawah, dan berat
molekul besra berada dibagian atas gel. Bobot molekul protein yang diperoleh
dapat ditentukan dengan kalibrasi menggunakan standar protein yang telah
diketahui bobot molekulnya (Rybicki et al., 1996).
18
2.7 Karakterisasi protein alergen dengan Imunoblotting
Imunoblotting atau Westren Blot adalah teknik untuk menandai suatu
protein pada membran nitroselulosa atau nilon setelah protein tersebut dipisahkan
melalui elektroforesis (Attwood et al., 2007). Metode Imunoblotting digunakan
untuk menganalisis protein alergi pada suatu sampel, mengetehui ukuran antigen
dan antibodi yang diketahui, dan digunakan dalam pencarian atau identifikasi
antigen dari campuran antigen yang tidak diketahui (Girindra, 1993).
Metode ini membutuhkan membran nitroselulosa sebagai media transfer
dari gel poliakrilamid pada SDS – PAGE dengan bantuan elektroforesis. Terdapat
3 tahapan pada imunoblotting seperti terteta pada Gambar 7. yaitu tahap
elektroforesis, elektrotransfer dan tahap deteksi. Tahap eletroforesis dan
elektrotransfer memerlukan bantuan arus listrik agar protein dapat bermigrasi
sesuai dengan berat molekulnya dan tertransfer ke membran (Kindt et al., 2007).
Gambar 7. Tahap-tahap pada imunoblotting (Kindt et al., 2007)
19
Tahap elektroforesis, merupakan tahap protein yang dipisahkan
berdasarkan berat molekul menggunakan bantuan gel poliakrilamid dalam suatu
tegangan listrik. Tahap elektrotransfer menggunakan membran nitroselulosa
sebagai media interaksi spesifik antara antigen dan antibodi. Membran ini
digunakan karena mudah mengikat, relatif tidak mahal, memudahkan bloking dan
lebih efisien (Bollag et al., 1996). Interaksi pada tahap deteksi mirip dengan reaksi
silang pada reaksi alergi, sehingga metode ini merupakan metode yang cocok
digunakan untuk mendeteksi adanya alergi pada suatu bahan pangan.
Pita protein alergi yang telah tercetak pada membran nitroselulosa dapat
dianalisis dan diidentifikasi dengan cara menginkubasi membran dalam serum
darah responden atau pasien yang alergi terhadap protein tertentu, sehingga
protein tersebut akan berikatan secara spesifik dengan IgE. Interaksi yang
diperoleh dapat terlihat setelah membran direaksikan dengan substrat, sedangkan
bobot molekul yang dianalisis dapat diperoleh dari migrasinya pada sel SDS-
PAGE (Rybicki et al., 1996).
20
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penilitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November 2017 hingga Agustus
2018 di Laboratorium Balai Besar Industri Agro, Cikaret, Bogor, Jawa Barat.
3.2 Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah blender, sentrifuse,
panci, penggorengan, kompor, SDS-PAGE Bio-Rad Mini-Protean II,
imunoblotting Mini Trans-Blot® Electrophoretic Transfer, spektrofotometer UV-
VIS (Perkin Elmer Lamda 25), freeze drier, nitrocellulose membranes for
blotting pore size 0.45 μm, size 15 cm x 15 cm (Sigma N8267), timbangan
analitik, pH meter, vortex, stirrer, termometer, labu takar, gelas ukur, gelas piala,
tabung Eppendorf, mikropipet 5 μL hingga 1000 μL, kertas saring Whatman
No.1, kertas saring biasa, dan peralatan gelas lainnya.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baby fish nila yang
diperoleh dari pasar ikan wilayah Cengkareng, Jakarta Barat. Serum darah yang
diambil dari 9 responden (8 penderita alergi seafood dan 1 normal), phosphate
buffer saline (PBS) pH 7,5, buffer tris pH 8,8 dan pH 6,8, amonium persulfat
(APS), metanol, etanol 95%, asam asetat glasial, NaCl, akuades, tween-20, H2O2
10%, TEMED (N,N,N',N'-tetramethyl-ethane-1,2-diamine), tris base, SDS
(sodium dodecyl sulphate), BSA (bovine serum albumin), akrilamid, glisin,
gliserol, bromphenol blue, 2-merkaptoetanol, NaOH, HCl, natrium pospat, kalium
sulfat, asam fosfat, TBS (tris buffer saline), susu skim, akuabides, coomasie
21
brilliant blue G-250, antibodi anti IgE manusia berlabel enzim HRP (Horseradish
Peroksidase), substrat DAB (3,3-Diaminobenzidine), N,N-metilen-bisakrilamid,
protein marker Precision Plus Protein™ Dual Color Standards (yang
mengandung 10 jenis protein standar dengan berat molekul 250 kDa, 150 kDa,
100 kDa, 75 kDa, 50 kDa, 37 kDa, 25 kDa, 20 kDa, 15 kDa, dan 10 kDa).
22
3.3 Diagram Alir Penelitian
Baby fish nila
berusia 2 – 4 minggu
Ekstrak Protein
1. Profil protein
dengan SDS-
PAGE
2. Protein alergen
(Imunoblotting)
20 g mentah
Diekstraksi
dengan PBS
- Identifikasi baby
fish nila
- Uji Proksimat
20 g digoreng
100 ℃, 3 menit
Diekstraksi
dengan PBS
20 g direbus
100 ℃, 5 menit
Diekstraksi
dengan PBS
Uji Bradford
23
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Preparasi Bahan Baku
Sebanyak 600 g baby fish nila dalam keadaan segar dilakukan pengolahan
yang berbeda, yaitu rebus dan goreng.
3.4.1.1 Baby fish nila Rebus
Sebanyak 100 g baby fish nila ditimbang, kemudian direbus dalam air
mendidih 100 ℃ selama 5 menit.
3.4.1.2 Baby fish nila Goreng
Sebanyak 100 g baby fish nila ditimbang, kemudian digoreng dalam
minyak panas 100 ℃ selama 3 menit.
3.4.2 Karakterisasi Bahan Baku
3.4.2.1 Identifikasi Bahan Baku
Identifikasi baby fish nila dilakukan di Fakultas Perikanan dan Ilmu
Kelautan IPB, Bogor Jawa Barat.
3.4.2.2 Uji Proksimat Bahan Baku
Uji Proksimat dilakukan di Pusat Laboratorium Terpadu UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta, meliputi uji kadar air, abu, protein, lemak dan karbohidrat.
Kadar Air (AOAC, 1990)
2 g sampel baby fish nila mentah, rebus dan goreng dihancurkan dengan
pisau. Sampel dipindahkan ke dalam cawan (sebelumnya ditimbang), lalu
dipanaskan dalam oven pada suhu 105 ℃ selama 3 jam dan didinginkan ke dalam
desikator. Perhitungan kadar air, adalah sebagai berikut,
24
Kadar Abu (AOAC, 1990)
2 g sampel menggunakan cawan porselin dibakar pada pembakar hingga
asap habis. Sampel kemudian ditanur pada suhu 600 ℃ selama 4-5 jam dan
didinginkan ke dalam desikator. Perhitungan kadar abu, adalah sebagai berikut,
Kadar Protein (AOAC, 1990)
Sebanyak 0,5 g sampel dimasukkan kedalam labu Kjeldahl, kemudian
ditambahkan 2 g katalis (SeO2, K2SO4, CuSO4) dan 20 mL H2SO4. Campuran
tersebut dipanaskan selama ±2,5 jam sampai berubah warna hijau toska
(destruksi). Sampel hasil dekstruksi yang telah diangkat kemudian diencerkan
dengan aquadest sampai 100 mL (dengan asam kuat). Larutan diambil 25 mL
yang ditambahkan 25 mL NaOH 30% dan 3 tetes indikator pp (dimasukkan
kedalam Erlenmeyer). Didestilasi dengan penampung 25 mL asam borat 2% dan 3
tetes Conway selama kurang lebih 20 menit setelah menetes, kemudian dititrasi
dengan HCl 0,05 N yang sebelumnya telah distandarisasi dengan asam boraks
0,05 N. Diukur volume HCl yang terpakai untuk titrasi. Perhitungan kadar protein
adalah sebagai berikut,
25
Kadar Lemak (AOAC, 1990)
Labu lemak sebelum digunakan dikeringkan dengan oven dan ditimbang
sebanyak a gram. Sebanyak 5 g sampel ditimbang dalam kertas saring lalu
diletakkan dalam alat ekstraksi soxhlet. Alat kondesor dipasang pada bagian atas
dan labu bulat pada bagian bawah. Pelarut n-heksana ditambahkan kedalam labu
dan dilakukan refluks selama minimal 5 jam. Pelarut kemudian dikeluarkan dari
labu lemak setelah ekstraksi. Labu hasil ekstraksi dikeringkan dalam oven pada
suhu 105 ℃, lalu didinginkan dan ditimbang sebagai b gram. Perhitungan kadar
lemak adalah sebagai berikut,
Kadar Karbohidrat (by difference)
Pengukuran kadar karbohidrat menggunakan rumus, sebagai berikut
3.4.3 Ekstraksi Protein (Hashimoto et al., 1979)
Sampel baby fish nila sebanyak 60 g diberikan 3 perlakuan berbeda. 20 g
baby fish digoreng pada suhu 100 °C selama 1 menit. 20 g baby fish direbus pada
suhu 100 °C selama 5 menit. Baby fish nila yang telah diberikan perlakuan,
selanjutnya ditambahkan dengan 200 mL phosphate buffer saline (PBS) pH 7,5
dengan kekuatan ion (I) = 0,05 (15,6 mM Na2HPO4, 3,5 mM KH2PO4) dan
diblender selama 3 x 1 menit, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 4000
rpm (2000 g) selama 25 menit pada suhu 4 °C. Hasil sentrifugasi terdiri dari
lapisan atas berupa cairan (supernatan) dan lapisan bawah berupa padatan (pelet).
26
Supernatan yang diperoleh dipisahkan dan disimpan dalam freezer pada suhu
-20°C.
3.4.4 Analisis kadar protein (Bradford et al., 1976)
Ekstrak protein yang diperoleh dilarutkan dengan 50 hingga 75 µL
akuades, kemudian diambil sebanyak 100 μL dimasukkan ke tabung reaksi
berwarna gelap atau tabung dimasukkan ke dalam ruang gelap. Larutan
ditambahkan 5 mL pereaksi Bradford (terdapat pada Lampiran 1), divorteks dan
diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada λ=595 nm setelah diinkubasi
selama 5 menit. Standar yang digunakan adalah BSA dengan variasi konsentrasi
sebesar 0 hingga 1000 ppm (pembuatan tertera pada Lampiran 2)
3.4.5 Analisis profil protein dengan SDS-PAGE (Laemmli, 1970)
Profil protein baby fish nila dianalisis dengan elektroforesis menggunakan
gel akrilamid. Gel yang digunakan terdiri atas dua bagian, yaitu gel atas (stacking
gel) dan gel bawah (separating gel) dengan konsentrasi stacking gel 5% dan
separating gel 12%. Tahapan yang harus dilakukan dalam elektroforesis SDS-
PAGE adalah sebagai berikut,
3.4.5.1 Preparasi Separating Gel
Dua lempeng kaca (mini slab) yang akan digunakan sebagai cetakan gel
dirangkai sesuai dengan petunjuk pemakaian alat. Sebanyak 4,8 mL larutan A
(Lampiran 3) dipipet dan dimasukkan ke dalam gelas piala 5 mL, kemudian
ditambahkan 3 mL larutan B dan 4,02 mL akuabides. Larutan tersebut kemudian
diaduk perlahan dengan menggoyangkan gelas piala, selanjutnya ditambahkan
27
sebanyak 60 μL APS 10% (pembuatan APS tercantum pada Lampiran 3) dan 4 μL
TEMED ditambahkan ke dalam larutan dan diaduk kembali dengan perlahan.
Larutan dimasukkan ke dalam lempeng kaca tanpa menimbulkan gelembung
udara dengan menggunakan mikropipet sampai sekitar 1 cm dari atas lempeng.
Bagian yang tidak diisi gel diberi akuades untuk meratakan gel yang terbentuk.
Gel dibiarkan mengalami polimerisasi selama 60-80 menit.
3.4.5.2 Preparasi Stacking Gel
Air dibuang dari atas separating gel dan dikeringkan dengan menggunakan
kertas tisu. Akuabides, larutan A, dan larutan C (Lampiran 3) masing-masing
sebanyak 2,3; 0,67; dan 1,0 mL dipipet dan dicampurkan ke dalam gelas piala dan
diaduk perlahan dengan menggoyangkan gelas piala, selanjutnya sebanyak 30 μL
APS 10% dan 5 μL TEMED ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk
kembali secara perlahan. Larutan dimasukkan ke dalam lempeng kaca tanpa
menimbulkan gelembung udara dengan menggunakan mikropipet, kemudian sisir
dimasukkan dengan cepat. Stacking gel dibiarkan mengalami polimerisasi selama
40 menit, lalu setelah gel berpolimerisasi, sisir diangkat dari atas gel dengan
perlahan dan slab ditempatkan ke dalam wadah elektroforesis. Bufer
elektroforesis dimasukkan ke wadah elektroforesis di bagian dalam dan luar agar
gel terendam.
3.4.5.3 Preparasi dan Injeksi Sampel
Sebanyak 40 μL sampel dimasukkan ke dalam tabung mikro 0,5 mL dan
ditambahkan 40 μL bufer sampel (tertera pada lampiran 3). Tabung kemudian
dipanaskan selama 5 menit dalam air mendidih. Sampel siap diinjeksikan ke
dalam sumur menggunakan mikropipet. Salah satu sumur, ditambahkan sebanyak
28
5 μL protein marker. Standar yang digunakan adalah protein marker Precision
Plus Protein™ Dual Color Standards yang mengandung 10 jenis protein standar.
3.4.5.4 Running SDS-PAGE
Wadah elektoroforesis dipasang dengan arus mengalir ke anoda. Sumber
listrik dinyalakan dan dijaga konstan pada 90 Volt. Running dilakukan selama 135
menit sampai migrasi pewarna tersisa sekitar 0,5 cm dari dasar, setelah selesai
aliran listrik dimatikan dan katup elektroda dilepaskan, lalu plat gel dipindahkan
dari wadah.
3.4.5.5 Pewarnaan Gel
Gel diangkat dari slab dan dipindahkan ke dalam wadah tertutup yang
telah berisi pewarna coomasie brilliant blue G-250 (lampiran 3) sebanyak kurang
lebih 20 mL, wadah digoyang-goyangkan sesekali selama 5-10 menit, sehingga
dihasilkan gel berwarna biru.
3.4.5.6 Destaining Gel
Gel berwarna biru dicuci dengan akuades 20 mL beberapa kali sampai
warna biru yang ada digel memudar. Larutan penghilang warna atau destaining
solution (Lampiran 3) sebanyak 10 mL ditambahkan dan digoyangkan sesekali
hingga latar belakang pita protein menjadi terang, kemudian larutan penghilang
warna dibuang dan gel siap dianalisis.
3.4.6.7 Penentuan Berat Molekul Protein
Berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresi yang
diperoleh dari kurva hubungan antara mobilitas relatif protein penanda (Rf atau
retention factor) dan logaritma berat molekul protein penanda. Mobilitas relatif
protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein, diukur dari garis
29
awal separating gel sampai ujung pita protein, dan jarak migrasi pewarna.
Mobilitas relatif tersebut dirumuskan sebagai berikut
3.4.6 Preparasi Serum Penderita Alergi (Zakaria et al., 1998)
Serum darah diambil dari 8 penderita alergi seafood atau ikan dan 1
normal yang diketahui melalui kuisioner dan persetujuan responden tertera pada
Lampiran 5. Darah responden yang diambil sebanyak 10 mL. Pengambilan darah
dilakukan oleh tenaga medis di Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta.
Darah ditempatkan dalam tabung tanpa mengandung EDTA. Darah
penderita alergi dibawa ke laboratorium untuk dipisahkan serumnya dengan cara
sentrifugasi. Darah diinkubasi selama 1 jam, kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 2500 rpm selama 20 menit. Hasil sentrifuse adalah supernatant dan
endapan. Supernatan diambil sebanyak ± 5 mL lalu disimpan pada freezer suhu
-20 °C.
3.4.7 Imunoblotting (Bollag & Edelstein, 1991)
Gel hasil elektroforesis yang tidak diwarnai dipindahkan ke wadah lain.
Alat transblotting disiapkan. Gel dan membran nitroselulosa kemudian disusun
dalam alat transblotting. Penyusunan alat transblotting dibasahi dengan larutan
buffer transfer, dan menggunakan bantuan kertas saring, serta spons. Alat yang
telah disusun kemudian dimasukkan ke dalam wadah blotting, lalu diisi dengan
bufer transfer. Blotting dilakukan pada 90 Volt selama 90 menit.
30
Membran yang telah tertransfer, kemudian dilepas dari rangkaian alat dan
difiksasi dengan metanol 50% selama 2 menit, lalu diblok dengan susu skim 5%
dalam PBST (Lampiran 4) selama 1 jam pada suhu kamar. Membran kemudian
dicuci dengan PBST 3 kali, masing-masing selama 5 menit.
Membran ditambahkan serum penderita alergi sebanyak 300 µL dengan
pengenceran 1:10 dalam PBST, yang diinkubasi selama 2 jam pada suhu kamar.
Pencucian dilakukan lagi dengan PBST sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5
menit, lalu diberi antibodi HRP conjugated monoclonal mouse anti-human IgE
(pengenceran 1:3000 dengan PBST) sebanyak 2 µL dan diinkubasi selama 1 jam
sambil digoyang. Membran dicuci kembali dengan PBST sebanyak 3 kali masing-
masing selama 5 menit, dan ditambah substrat DAB (Lampiran 4). Hasil bila
terbentuk positif kompleks protein alergen dengan serum ditandai dengan
terbentuknya pita berwarna coklat pada membran nitroselulosa.
31
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Identifikasi Baby fish Nila
Baby fish Nila yang digunakan berumur 2 hingga 4 minggu dengan ukuran
3 hingga 6 cm (Gambar 8). Baby fish tersebut merupakan famili Cichlidae dengan
nama latin Oreochromis niloticus setelah diidentifikasi pada Fakultas Perikanan
dan Ilmu Kelautan IPB. Baby fish nila berwarna hitam keemasan dengan pita atau
garis hitam melintang vertikal pada bagian sirip ekor hingga badan. Jumlah jari-
jari keras pada sirip punggung (Dorsal) berkisar antara 16 -18. Sirip samping ikan
berwarna hitam. Mulut ikan mengarah keatas, dengan bagian kepala yang tidak
menonjol. Baby fish nila memiliki bentuk badan oval dengan bagian bawah
berwarna krem emas dan memiliki warna mata cerah.
Gambar 8. Baby fih Nila (O. niloticus) (Dokumentasi pribadi)
Bagian ikan yang digunakan pada penelitian ini adalah seluruh bagian.
Pemilihan baby fish yang berkualitas dengan ciri berukuran 3 hingga 7 cm,
dengan umur ikan sekitar 2-4 minggu, tidak berbau busuk, sesuai dengan bentuk,
32
dan warna baby fish serta tidak cacat pada bagian sisi ikan. Mata pada baby fish
juga terlihat segar dan berwarna cerah tidak pucat. Pengolahan yang dilakukan
pada baby fish adalah rebus dan goreng dengan suhu 100 ℃. Suhu tersebut
merupakan kondisi optimum dan pemanasan pada umumnya untuk pengolahan
ikan. Menurut Putro et al. (2012) suhu 100 ℃ merupakan suhu penggorengan
olahan ikan dengan cita rasa, warna, dan tekstur yang baik dan disukai panelis.
Parameter komposisi kimia dalam pemilihan bahan baku alergen pangan
berupa kadar protein, karbohidrat, lemak, dan air menurut European Medicines
Agency Evaluation of Medicines for Human Use (EMEA) dalam The Guideline on
Allergen Products: Production ad Quality Issues (Limpert, 2010). Alergen pada
bahan pangan umumnya berupa protein atau glikoprotein (Cianferoni & Spergel,
2009).
Tabel 2. Komposisi kimia baby fish nila (O. niloticus)
No. Komponen (%) Sampel
Mentah Rebus Goreng
1. Air 76,83 ± 0,24 75,47 ± 0,77 27,45 ± 0,76
2. Abu 2,50 ± 0,09 4,42 ± 0,19 8,16 ± 0,02
3. Protein 19,31 ± 0,22 19,16 ± 0,21 23,68 ± 0,46
4. Lemak 1,10 ± 0,57 0,90 ± 0,42 20,44 ± 0,62
5. Karbohidrat 0,26 0,05 20,27
Baby fish nila memiliki kadar air yang cukup tinggi sebesar 76,83%.
Kadar air yang tinggi membuktikan bahwa komponen penyusun terbesar pada
baby fish nila berupa air. Proses perebusan pada ikan ini tidak mengakibatkan
penurunan kadar air secara signifikan, sebesar 75,47%, sedangkan pada proses
goreng mengalami penurunan signifikan sebesar 27,45%. Penurunan kadar air
disebabkan proses pemanasan dengan rebus akan menguapkan kandungan air
lebih sedikit dibandingkan pemanasan dengan minyak.
33
Kadar abu baby fish nila diperoleh paling tinggi pada proses goreng
sebesar 8,16%. Proses pemanasan dengan minyak diduga akan menambahkan
jumlah residu anorganik yang tersisa pada baby fish, sehingga menghasilkan kadar
abu paling tinggi dibandingkan mentah dan rebus. Kadar protein yang diperoleh
pada baby fish nila mentah, rebus dan goreng adalah 19,31, 19,16, dan 23,68%.
Kenaikan kadar protein baby fish goreng secara signifikan diduga karena
berkurangnya air pada baby fish goreng dan faktor preparasi sampel berupa
penimbangan massa pada proses pengukuran sehingga kadar protein pada baby
fish goreng meningkat.
Sundari et al. (2015) mengatakan bahwa proses pengolahan pangan selain
dapat menurunkan gizi, dapat pula bersifat menguntungkan terhadap beberapa
komponen zat gizi, misalnya perubahan kadar kandungan zat gizi, dan
peningkatan aroma. Reaksi Maillard dapat meningkatkan aroma dan warna,
sehingga reaksi Maillard pada baby fish nila goreng merupakan reaksi yang
diinginkan untuk dikonsumsi.
Reaksi Maillard merupakan reaksi kecoklatan non-enzimatis yang terjadi
antara gula pereduksi (terutama α-D-glukosa) dengan gugus amin bebas dari asam
amino, bagian dari protein. Secara garis besar, terdapat 3 tahap dalam reaksi
Maillard, yaitu tahap kondensasi, tahap penyusunan kembali (Amadori
Rearrangement), dan tahap polimerisasi. Hasil dari reaksi Maillard berupa
senyawa polimer melanoidin. Sehingga menyebabkan pembentukan warna coklat
gelap disertai aroma (Kusnandar, 2010).
Justi et al. (2003), mengidentifikasi O. niloticus mentah yang berumur 4
minggu memliki kadar protein sebesar 17,2%, sedangkan Asia et al. (2015)
34
menyebutkan bahwa kadar protein baby fish nila goreng sebesar 20,27%.
Perbedaan kadar protein pada setiap penelitian disebabkan oleh kondisi
lingkungan, habitat ikan, nutrisi, dan pakan ikan yang berbeda. Pakan yang
dikonsumsi ikan akan mempengaruhi zat gizi yang terkandung pada ikan tersebut
(Soekendarsi et al., 2016). Perbedaan kadar proksimat baby fish nila pada setiap
penelitian menunjukkan bahwa jenis ikan yang sama tetapi tempat asal dan habitat
berbeda dapat menghasilkan komposisi kimia yang berbeda tergantung pada
kondisi lingkungan, nutrisi, dan pakan yang dikonsumsi ikan tersebut.
Kadar lemak tertinggi diperoleh pada baby fish goreng sebesar 20,44%,
diduga adanya minyak goreng yang terserap oleh ikan tersebut. Pada baby fish
rebus, kadar lemak mengalami penurunan dikarenakan sifat lemak yang tidak
tahan panas, menyebabkan lemak mencair, bahkan menguap. Tinggi atau
rendahnya penurunan kandungan gizi suatu bahan pangan pangan akibat
pemasakan tergantung dari jenis bahan pangan dan suhu yang digunakan (Sundari
et al., 2015).
4.2 Ekstrak Baby fish Nila
Ekstrak protein O.niloticus diukur konsentrasi proteinnya menggunakan
metode Bradford karena memiliki sensitifitas tinggi dan mudah untuk diterapkan.
Standar yang digunakan berupa Bovine Serum Albumin (BSA) karena harganya
yang relatif murah dan tingkat kemurniannya yang tinggi (Khee, 2001).
Konsentrasi standar pada penelitian ini adalah 0 hingga 1000 mg/L. Konsentrasi
protein yang diperoleh pada baby fish nila mengalami penurunan akibat
pengolahan rebus dan goreng, yaitu sebagai berikut,
35
Tabel 3. Konsentrasi protein baby fish nila
No. Sampel Konsentrasi (mg/L)
1 Mentah 2106,63
2 Rebus 699,82
3 Goreng 604,79
Konsentrasi protein tertinggi diperoleh pada baby fish nila mentah sebesar
2106,63 mg/L dan konsentrasinya menurun akibat proses pengolahan. Hal
tersebut diduga karena proses pemanasan akan mendenaturasi protein. Pemanasan
pada pangan yang mengandung protein akan mengalamai reaksi seperti denaturasi
dan pembentukan senyawa yang secara sensori aktif seperti perubahan warna.
Reaksi yang terjadi pada saat pemanasan protein tersebut dapat mengakibatkan
kadar protein menurun (Sundari et al., 2015). Konsentrasi protein terendah
dihasilkan pada pengolahan baby fish goreng sebesar 604,79 mg/L. Kadar protein
tersebut berbeda dengan kadar protein pada uji proksimat dikarenakan faktor
preparasi sampel pada pengukuran uji proksimat.
4.3 Karakteristik protein baby fish nila hasil analisis SDS-PAGE
Profil protein baby fish nila (O. niloticus) ditentukan menggunakan SDS-
PAGE berdasarkan berat molekulnya. Konsentrasi akrilamid merupakan salah
satu faktor penting dalam ukuran pori-pori gel. Menurut Bollag et al. (1991),
konsentrasi akrilamid untuk memisahkan protein pada berat molekul antara 15-
200 kDa sebesar 5-12% (separating gel). Persentasi separating gel disesuaikan
dengan berat molekul protein yang akan dipisahkan. Penelitian ini telah dilakukan
trial and error dengan variasi persentasi separating gel, untuk mendapatkan
pemisahan protein yang maksimal.
36
M IM IR IG IM IR IG M
Separating Gel 8,5% Separating Gel 10%
M IG IR IM IG IR IM M
Separating Gel 11% Separating Gel 12%
Gambar 9. Hasil SDS-PAGE Baby fish nila dengan variasi persentasi
separating gel (M: Marker, IM: Baby fish mentah, IR: Baby fish
rebus, IG: Baby fish goreng).
Pemisahan protein sempurna ditandai dengan jumlah pita protein marker
yang sesuai dengan standarnya. Protein marker yang digunakan pada penelitian ini
berjumlah 10 standar, sehingga pita yang dihasilkan pada gel harus berjumlah 10.
Semakin kecil konsentrasi akrilamid, semakin besar pori-pori gel yang terbentuk.
Separating gel dengan konsentrasi 8,5% akrilamid, memisahkan 7 pita protein
25 kDa
37 kDa
50 kDa
75 kDa
100 kDa
150 kDa
250 kDa
15 kDa
20 kDa
25 kDa
37 kDa
50 kDa
75 kDa
100 kDa
150 kDa
250 kDa
10 kDa
15 kDa
20 kDa
25 kDa
37 kDa
50 kDa
75 kDa
100 kDa
150 kDa
250 kDa
15 kDa
20 kDa
25 kDa
37 kDa
50 kDa
75 kDa
100 kDa
150 kDa
250 kDa
37
marker. 3 standar marker lain diduga merupakan marker dengan berat molekul
rendah yang lolos karena pori-pori akrilamid yang besar sehingga tidak dapat
mendeteksi. Konsentrasi akrilamid 10% dan 11% pada separating gel
menghasilkan 9 pita protein marker. 1 protein marker diduga merupakan protein
dengan berat molekul rendah sehingga lolos dari pori-pori gel. Hal tersebut
menyebabkan 1 standar marker tidak terdeteksi.
Separating gel dengan konsentrasi akrilamid 12% merupakan konsentrasi
optimum yang dapat memisahkan protein marker secara sempurna dengan jumlah
pita sebanyak 10. Elektroforesis yang dilakukan pada penelitian ini selama 135
menit pada tegangan 90 Volt. Waktu dan tegangan tersebut merupakan kondisi
optimum untuk memisahkan protein baby fish nila dengan pita yang terpisah
sempurna hingga bawah gel dengan jumlah standar 10.
M A1 A2 B1 B2 C1 C2
IM IR IG
Gambar 10. Hasil SDS-PAGE baby fish nila mentah (IM), rebus (IR) dan
goreng (IG)
25 kDa
20 kDa
15 kDa
10 kDa
37 kDa
50 kDa
75 kDa
250 kDa
150 kDa
100 kDa
38
Penelitian ini menggunakan 2 variasi volume injeksi berbeda, untuk
membandingkan hasil pemisahan yang paling optimum. Volume injeksi ekstrak
protein baby fish mentah (IM) sebesar 15µL/sumur (A1) dan 25 µL/sumur (A2).
Volume injeksi baby fish rebus (IR) sebesar 10 µL/sumur (B1) dan 21 µL/sumur
(B2). Volume injeksi baby fish goreng (IG) sebesar 14 µL/sumur (C1) dan 24
µL/sumur (C2). Hasil SDS-PAGE pada Gambar 10. menunjukkan bahwa volume
injeksi lebih besar akan menghasilkan pemisahan pita protein yang terlihat lebih
jelas. Berat molekul protein yang diperoleh tertera pada tabel 4. berikut,
Tabel 4. Berat molekul profil protein baby fish nila
Pita
ke-
Protein Marker Mentah Rebus Goreng
Rf BM
(kDa)
Rf BM (kDa) Rf BM
(kDa)
Rf BM
(kDa)
1 0,071 250 0,032 >250 0,063 >250 0,063 >250
2 0,115 150 0,079 250 0,079 250 0,095 250
3 0,175 100 0,159 119 0,095 145 0,127 132
4 0,302 75 0,190 108 0,111 138 0,143 125
5 0,333 50 0,222 99 0,127 132 0,159 119
6 0,444 37 0,286 80 0,143 125 0,170 113
7 0,619 25 0,349 65 0,159 119 0,222 99
8 0,698 20 0,460 46 0,175 113 0,270 84
9 0,873 15 0,508 40 0,190 108 0,302 75
10 1 10 0,556 34 0,206 102 0,349 65
11 0,635 27 0,222 99 0,397 56
12 0,762 18 0,238 93 0,476 44
13 0,810 15 0,254 88 0,571 32
14 0,889 12 0,270 84 0,810 15
15 0,952 11 0,317 72 0,857 13
16 1 10 0,333 69 1 10
17 0,349 65
18 0,381 59
19 0,476 44
20 0,524 38
21 0,571 32
22 0,635 27
23 0,794 16
24 0,841 14
25 0,968 11
26 1 10
Baby fish nila mentah, rebus maupun goreng menghasilkan pita protein
bervariasi dengan berat molekul berkisar 10 hingga lebih dari 250 kDa. Berat
39
molekul tersebut diperoleh dari perhitungan nilai retention factor (Rf) yang
dihasilkan dengan cara membagi jarak migraasi pita protein dengan jarak migrasi
pewarna. Baby fish mentah menghasilkan pita protein yang cukup tebal antara 10-
18 kDa. Pengolahan dengan rebus dan goreng menghasilkan pita protein lebih
barvariasi pada berat molekul besar dengan pita yang cukup tebal pada berat
molekul 32 kDa, 125 kDa, dan lebih dari 250 kDa.
Pita protein baby fish rebus dan goreng menghasilkan pemisahan protein
yang lebih bervariasi dibandingkan mentah. Hal tersebut membuktikan bahwa
proses pengolahan pada baby fish nila akan mempengaruhi hasil pemisahan pita
protein. Pemanasan pada baby fish nila akan mendenaturasi protein yang
terkandung didalamnya, sehingga terjadi perubahan konformasi pada protein baby
fish nila. Hal tersebut akan menyebabkan pita-pita protein yang dihasilkan lebih
beragam dan lebih banyak.
Shamloo et al. (2012) mengkarakterisasi hidrolisat protein ikan
O. niloticus yang berasal dari Malaysia dengan SDS-PAGE menghasilkan pita
protein utama pada berat molekul 161 kDa dan 212 kDa. Penelitian lain,
menyimpulkan bahwa ekstrak protein tulang dan kulit ikan Oreochromis spp yang
berasal dari Taiwan menghasilkan pita protein dengan berat molekul sebesar 37
kDa hingga 250 kDa (Lin & Alashi, 2017). Kristinsson & Ingadottir, (2006)
melakukan ekstraksi daging ikan O. niloticus yang berasal dari USA,
menghasilkan pita protein utama pada berat molekul 205 kDa.
Hasil penelitian-penelitian tersebut membuktikan bahwa perbedaan jenis
ikan, habitat, umur, asal ikan, dan bagian dari ikan yang diekstraksi akan
menghasilkan pita protein yang berbeda, tetapi sedikit mendekati. Hasil yang
40
diperoleh pada penelitian ini tidak berbeda jauh dengan penelitian-penelitan
sebelumnya. Diduga bahwa umur pada ikan O. niloticus tidak mempengaruhi
secara signifikan terhadap pita-pita protein yang dihasilkan.
4.4 Imunoblotting
Imunoblotting merupakan teknik yang umum digunakan untuk mendeteksi
alergen pada suatu pangan. Sebanyak 8 serum responden penderita alergi
dinyatakan positif alergi baby fish nila dengan pengolahan yang berbeda.
Responden yang mengalami alergi terhadap beberapa pangan, tertera pada tabel 5
berikut,
Tabel 5. Hasil kuisioner responden penderita alergi
Kode
Responden
Jenis
Kelamin/Umur
Penyebab Alergi Gejala yang
ditimbulkan
1 P/21 th Udang, kepiting Gatal – gatal
2 P/22 th Seafood Gatal – gatal
3 P/20 th Ikan, udang Gatal – gatal
4 L/22 th Udang Gatal – gatal
5 P/31 th Belalang, daging sapi Gatal – gatal
6 P/ 23 th Belalang, daging sapi,
dan kambing
Gatal – gatal dan
sakit perut
7 P/41 th Belalang, daging sapi Gatal – gatal
8 L/23 th Kepiting hitam, udang,
belalang, dan lebah
Gatal – gatal,
pusing, muntah dan
diare
Kesediaan menjadi responden pada penelitian ini tertera pada Lampiran 8.
Delapan responden yang ikut serta pada pengambilan darah, teridentifikasi positif
alergi terhadap protein baby fish nila. Penyebab alergi pada responden beragam
mulai dari seafood, udang hingga belalang. Gejala alergi yang umumnya
ditimbulkan berupa gatal-gatal. Diperkirakan bahwa responden yang alergi
41
terhadap satu bahan pangan, dapat memungkinkan terjadi alergi terhadap bahan
pangan lain. Hal tersebut sulit diprediksi, karena reaksi alergi pada seseorang
tergantung pada sistem imun dari orang tersebut. Penelitian ini memperoleh
protein alergen baby fish nila dengan berat molekul beragam, berkisar 31 kDa
hingga lebih dari 250 kDa. Responden memiliki sensitifitas berbeda terhadap
protein baby fish nila yang tertera pada Gambar 11. berikut,
M IG IR IG IR IG IR IM
(1) (2) (3) (4)
IG IR IG IR IG IR IG IR (-)
(5) (6) (7) (8)
Gambar 11. Hasil Imunoblotting 9 responden terhadap baby fish nila (IG:
baby fish goreng, IR: baby fish rebus, IM: baby fish mentah)
Secara garis besar, responden positif (1), (2), (3), (5), (6), (7), dan (8)
memiliki sensitivitas terhadap baby fish rebus dan goreng. 1 responden lain (4)
10 kDa
15 kDa
20 kDa
25 kDa
37 kDa
50 kDa
75 kDa
100 kDa
150 kDa
250 kDa
42
memiliki sensitivitas terhadap baby fish mentah. Sifat alergenisitas pangan yang
mengandung alergen dipengaruhi oleh pengikatan antara IgE dari responden
dengan protein alergen dari pangan tersebut. Alergenisitas suatu protein alergen
dipengaruhi oleh epitop yang dimilikinya (Shreffler et al., 2004). Tabel 6. berikut
merupakan berat molekul yang diperoleh pada protein alergen baby fish nila,
Tabel 6. Berat molekul protein alergen baby fish nila
Resp. Sampel Berat molekul pita protein (kDa) ke-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
(1) IG >250 250 145 115 93
IR >250 250 145 115 95
(2) IG >250 250 133 93
IR >250 99 84
(3) IG >250 250 144 127
IR >250 127
(4) IM 31
(5) IG >250 250 91 86 81 77
IR >250 250 128 96 91 86
(6) IG >250 150 142 134 127 113 101 96 76 65
IR >250 250 134 120 107 101 90 81 72 65 55 52 35
(7) IG >250 83 74 67 47 43
IR >250 250 116 110 94 80 69
(8) IG >250 121 116 95
IR >250 222 134 128 116 110 105 91
Keterangan:
Resp. : Responden
IG : Baby fish goreng
IR : Baby fish rebus
IM : Baby fish mentah
Responden (1) memiliki antibodi IgE yang mengikat protein alergen baby
fish rebus dengan berat molekul sebesar 95 kDa hingga lebih dari 250 kDa, dan
goreng sebesar 93 kDa hingga lebih dari 250 kDa. Antibodi IgE Responden (2)
43
mengikat protein alergen baby fish rebus dengan berat molekul 84 kDa hingga
lebih dari 250 kDa dan goreng sebesar 93 kDa hingga lebih dari 250 kDa.
Responden (3) memiliki antibodi IgE yang berikatan dengan protein alergen baby
fish rebus pada berat molekul 127 kDa hingga lebih dari 250 kDa, dan goreng
sebesar 127 kDa hingga lebih dari 250 kDa. Responden (4) memiliki antibodi IgE
yang hanya berikatan pada protein alergen baby fish mentah dengan berat
molekuul 31 kDa.
Antibodi IgE dari Responden (5) mengikat protein alergen baby fish rebus
pada berat molekul 86 kDa hingga lebih dari 250 kDa dan goreng pada berat
molekul 77 kDa hingga lebih dari 250 kDa. Responden (6) memiliki antibodi IgE
yang berikatan dengan protein alergen baby fish rebus pada berat molekul 35 kDa
hingga lebih dari 250 kDa dan goreng pada berat molekul 65 kDa hingga lebih
dari 250 kDa. Responden (6) diduga memiliki antibodi IgE paling banyak
mengikat protein alergen, sehingga menghasilkan pita protein alergen terbanyak
dibandingkan dengan responden lain. Responden (7) memiliki IgE yang berikatan
dengan alergen baby fish rebus pada berat molekul 69 kDa hingga lebih dari 250
kDa dan goreng pada berat molekul 43 kDa hingga lebih dari 250 kDa. Antibodi
IgE Responden (8) berikatan dengan protein alergen baby fish rebus pada berat
molekul 91 kDa hingga lebih dari 250 kDa dan goreng pada berat molekul 95 kDa
hingga lebih dari 250 kDa.
Berat molekul pada setiap responden menunjukkan bahwa responden (4)
hanya sensitif terhadap baby fish mentah, sedangkan responden (1), (2), (3), (5),
(6), (7), dan (8) hanya sensitif pada protein baby fish yang diolah. Responden
negatif terhadap baby fish nila membuktikan bahwa pada orang normal tidak
44
terjadi ikatan antara IgE dan protein alergen sehingga tidak terdapat pita protein
alergen yang dihasilkan.
Responden yang positif terhadap baby fish nila akan menghasilkan pita-
pita berwarna coklat diakibatkan adanya interaksi antara antibodi (IgE) spesifik
dari serum darah responden dengan protein alergen pada baby fish nila. Interaksi
antara IgE dan protein alergen dapat berupa ikatan kovalen, gaya van der Waals,
gaya elektrostatik, hidrofobik, dan ikatan hidrogen sebagaimana ikatan yang
terjadi antara protein dengan protein. Ikatan tersebut bergantung pada susunan
asam-asam amino yang dapat mengikat protein alergen (Wiradharma et al., 2017).
Alergen yang berasal dari hewan (termasuk ikan dan kerang) umumnya
memiliki sifat termostabilitas yang tinggi. Sehingga, sifat alergenisitas pada
protein tersebut jika dipanaskan tidak menghilang, bahkan meningkat (Boye &
Godefroy, 2010). Pengolahan pangan yang mengandung alergen dapat mengubah
konformasi epitop pada protein tersebut dan membentuk alergen baru atau
membuka epitop protein yang menyebabkan alergenisitas meningkat (Sathe et al.,
2005). Proses pemanasan pada baby fish nila diduga telah mengubah konformasi
protein termasuk epitopnya. Kemungkinan epitop pada protein baby fish nila
terbuka akibat proses pemanasan. Hal tersebut menyebabkan sebagian besar
responden penderita alergi lebih sensitif terhadap baby fish nila rebus dan goreng,
dibandingkan mentah.
Menurut Nowak-wegrzyn et al. (2009), protein alergen pada suatu pangan
mengandung 2 jenis epitop, yaitu epitop komformasi dan epitop linear. Protein
alergen pada pangan yang mentah mengandung epitop linear yang memungkinkan
tertutupi oleh susunan asam-asam amino lain, sehingga struktur protein alergen
45
berbentuk kompleks dengan banyaknya lipatan. Pengolahan yang dilakukan
seperti pemanasan, penambahan enzim, dan pengubahan pH pada pangan tersebut,
akan menyebabkan susunan asam-asam amino berubah, lipatan pada struktur
protein terbuka, dan struktur protein menjadi lebih sederhana, sehingga epitop
dengan jenis komformasi akan berubah dan epitop dengan jenis linear akan
terbuka (Nowak-wegrzn et al., 2009).
Misnan et al. (2008) mengidentifikasi ikan India (Decaptetrs russelli)
yang dimasak memiliki protein alergen pada berat molekul 12 kDa. Protein
tersebut resisten terhadap panas, sehingga termostabil pada alergen merupakan
peran penting terhadap alergenisitasnya. Protein alergen mayor pada ikan laut
(Codfish) yang telah diidentifikasi berupa parvalbumin yang tahan terhadap panas
dan denaturasi kimia (Hamada, 2001). Tropomyosin merupakan alergen mayor
yang umumnya berasal dari udang, kerang-kerangan, crustaceaes, dan mollusca
(Liu et al., 2012). Menurut Nowak-wegrzyn et al. (2009), beberapa pasien lebih
alergi dengan udang yang dimasak, dibandingkan dengan udang mentah.
Data allergome, menunjukkan bahwa ikan O. niloticus dewasa memiliki
protein alergen dengan nama Ore ni, Ore ni 1, Ore ni 18kD, Ore ni 2, Ore ni
45kD, Ore ni CK, Ore ni NDKB. Ebo et al. (2010) mengidentifikasi protein
alergen yang terkandung pada O. niloticus dewasa memiliki berat molekul 18 kDa
dan 45 kDa.
Ikan O. mossambicus pada penelitian lain, teridentifikasi memiliki protein
alergen pada berat molekul sebesar 17 kDa hingga 114 kDa dengan protein
alergen mayor pada berat molekul 32 kDa. Protein tersebut bernama Ore m4 yang
termasuk golongan tropomyosin (Liu et al., 2012). Protein alergen pada
46
responden (4) dengan berat molekul 31 kDa mendekati berat molekul ikan
O. mossambicus yang berada pada berat molekul 32 kDa (Ore m4). Berat molekul
yang berdekatan tersebut, membuktikan bahwa ikan dengan genus yang sama,
namun spesies dan umur berbeda akan menghasilkan protein alergen dengan berat
molekul yang berdekatan.
47
BAB V
PENUTUP
5.1 Simpulan
1. Baby fish nila mentah, rebus dan goreng memilki protein alergen
dengan berat molekul bervariasi berkisar 31 kDa hingga lebih dari
250 kDa.
2. Pengolahan baby fish nila dengan cara rebus dan goreng dapat
mempengaruhi dan meningkatkan sifat alergenisitas protein baby fish
nila.
5.2 Saran
Saran dari penelitian ini adalah perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
tentang identifikasi jenis dan struktur protein alergen yang terkandung pada baby
fish nila dengan pengolahannya dan menambahkan lebih banyak responden alergi
spesifik terhadap ikan nila.
48
DAFTAR PUSTAKA
Abbas AK & Litchtman AH. (2009). Basic Immunology Functions and Disorders
of the Immune System. Philadelphia: WB Saunders Elsevier.
Amri KK. (2003). Budi Daya Ikan Nila secara Intensif. Jakarta: AgroMedia
Pustaka.
AOAC. (1990). AOAC: Official Methods of Analysis (Volume 1). (K. Helrich,
Ed.) (15th ed.,Vol.1). USA: Association of Official Analytical Chemists, Inc.
Asia N, Suparmi, & Sumarto. (2015). Studi Penerimaan Konsumen Terhadap
fried Baby Nila (Oreochromis niloticus) dengan ukuran berbeda. Universitas
Riau.
Attwood T, Campbell P, Parish H, Smith A, Vella F, & Stirling J. (2007). Oxford
Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology Biochemistry and
Molecular Biology (Second). UK: Oxford Univercity Press.
Baratawidjaja KG & Rangganis I. (2010). Imunologi Dasar (9th ed.). Jakarta:
FKUI Jakarta.
Berg J, Tymoczko J, & Stryer L. (2007). Biochemistry. Biochemistry, 117–144.
Bintang M. (2010). Biokimia Teknik Penelitian. (R. Astikawati, Ed.). Jakarta:
Erlangga.
Bollag D & Edelstein S. (1991). Protein Method. New York: Willey-Liss.
Boyd CE. (2004). Farm-level issues in Aquaculture certification: Tilapia. Report
commissioned by WWF-US in 2004. Auburn University, Alabama 3683, 1–
29.
Boye JI & Godefroy SB. (2010). Allergen Management In The Food Industry.
Health (San Francisco).
Bradford MM, Dong Y, Xu L, Liu S, Bai X, Bradford M, Cao Y. (1976). A rapid
and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein
utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72(1–
2), 248–254.
Candra Y, Setiarini A, & Rengganis I. (2011). Gambaran Sensitivitas Terhadap
alergen makanan. Makara Kesehatan, 15(1), 44–50.
Cianferoni A & Spergel. (2009). Food allergy: review, classification and
diagnosis. Allergol Int., 58(4), 457–66.
Clement S & Lovell RT. (1994). Comparison of processing yield and nutrient
composition of cultured Nile tilapia (Oreochromis niloticus) and channel
catfish (Ictalurus punctatus), 119, 299–310.
Darwisito S, Junior MZ, Sjafei DS, Manalu W, & Sudrajat AO. (2008).
Pemberian Pakan Mengandung Vitamin E dan Minyak Ikan pada Induk
49
Memperbaiki Kualitas Telur dan Larva Ikan Nila. Jurnal Akuakultural
Indonesia, 7(1), 1–10.
Ebo DG, Kuehn A, Bridts CH, Hilger C, Hentges F, & Stevens WJ. (2010).
Monosensitivity to Pangasius and Tilapia Caused by Allergens Other Than
Parvalbumin, 20(1), 84–88.
Fatchiyah, Laras E, Widyarti, & Rahayu S. (2011). Biologi Molekuler Prinsip
Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga.
García-descalzo L, García-lópez E, Alcázar A, Baquero F, & Cid C. (1995). Gel
Electrophoresis of Proteins.
Garn H & Renz H. (2007). Epidemiological and immunological evidence for the
hygiene hypothesis. Immuobiology, 212, 441–452.
Gell PGH & Coombs RRA. (1968). Classification of allergic reactions responsible
for drug hypersensitivity reactions. In PGH. Gell & RRA. Coombs (Eds.),
Clinical Aspects of Immunology (2nd ed., pp. 575–596). Britain: Blackwell
Scientific Publication.
Girindra A. (1993). Immunokimia. Bogor: PAU-IPB.
Griffin K. (2007). Immunology and Haematology. (D. Horton-Szar, M. Helbert, &
C. Shiach, Eds.) (third). UK: Mosby Elsevier.
Gupta RS, Ashley, Namrita J, & Greenhawt MJ. (2013). Childhood food allergies:
current diagnosis, treatment, and management strategies. Mayo Clinic
Processing, 88(5), 512–526.
Hamada Y, Nagashima Y, & Shiomi K. (2001). Identification of Collagen as a
New Fish Allergen. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 65(2),
285–291.
Hashimoto K, Watabe S, Kono M, & Shiro K. (1979). Muscle protein
composition of Sardine and Mackerel. Bulletin of the Japanese Society of
Scientific Fisheries, 1435–1441.
Iskandar AA, Raharja S, & Sumantadinata K. (2013). Pengembangan Agribisnis
Ikan Balita di UD Suhada, Kabupaten Cianjur. Manajemen IKM, 8(2), 181–
189.
Justi K, Hayashi C, Visentainer J, De Souza N, & Matsushita M. (2003). The
influence of feed supply time on the fatty acid profile of Nile tilapia
(Oreochromis niloticus) fed on a diet enriched with n-3 fatty acids. Food
Chemistry, 80(4), 489–493.
Khee CR. (2001). Determination of Total Nitrogen. Current Protocol in Food
Chemistry, (1), 1–9.
Kindt TJ, Goldsby RA, Osborne BA, & Janis K. (2007). Immunology (7th ed.).
New York: Susan Winslow.
Koppelman SJ & Hefle SL. (2006). Detecting allergens in food. Cambridge
50
England: Woodhead Publishing Limited.
Kristinsson HG & Ingadottir B. (2006). Recovery and Properties of Muscle
Proteins Extracted from Tilapia (Oreochromis niloticus) Light Muscle by pH
Shift Processing. Journal Food Science, 71(3), 132–141.
Kumar V, Abbas AK, & Aster JC. (2012). Buku Ajar Patologi Robbins. (I. M.
Nasar & S. Cornain, Eds.) (9th ed.). Elsevier.
Kusnandar F. (2010). Kimia Pangan Komponen Makro (1st ed.). Jakarta: Dian
Rakyat.
Laemmli. (1970). Cleavage of Structural Proteins During The Assembly of The
Head of Bacteriophage T4. Nature 227, (5259), 680–685.
Limpert AS. (2010). Quality of Allergen Products for Specific Immunotherapy- A
Guidance for Industry for Compilation of Module 3 for the E CTD (Quality)
Considering the German Therapy Allergen Ordinance and the new
“Guideline on Allergen Products – Production and Quality Is.
Lin H & Alashi AM. (2017). Antihypertensive properties of tilapia (Oreochromis
spp.) frame and skin enzymatic protein hydrolysates. Food & Nutrition
Research, 61(1), 1–11.
Liu R, Holck AL, Yang E, Liu C, & Xue W. (2012). Tropomyosin from tilapia
(Oreochromis mossambicus) as an allergen Experimental Allergy, 365–377.
Liu R, Yang E, Liu C, & Xue W. (2012). Tilapia (Oreochromis mossambicus)
allergens characterized by ELISA, SDS-PAGE, 2D gels, Western blotting
and MALDI-TOF mass spectrometry, 63(17), 259–266.
Lockey RF & Ledford DK. (2008). Allergens and Allergen Immunotherapy.
Molecular and Cellular Biology.
McSherry C & Blumenthal MN. (2008). Definition of An Allergen
(Immunobiology). In R.F Lockey & DK Ledford (Eds.), Allergens and
Allergen Immunotheraphy (Fourth, p. 32). USA: Informa Healthcare USA.
Misnan R, Murad S, Arip M, & Mohamed J. (2005). Characterization of
Immunoglobulin E-Binding Proteins (IgE) of Scomberomorus commerson
Lacepede, 3(2), 79–87.
Misnan R, Murad S, Jones M, Taylor G, Rahman D, Arip M, Mohamed J. (2008).
Identification of the major allergens of Indian scad (Decapterus russelli).
Asian Pacific Journal of Allergy and Immunology, 26(4), 191–198.
Muchtadi D. (2009). Pengantar Ilmu Gizi. Bandung: Alfabeta.
Munasir Z & Dadi SE. (2010). Reaksi Hipersensitivitas. In Buku Ajar Alergi-
Imunologi Anak (3rd ed., pp. 115–131). Jakarta: Ikatan Dokter Anak
Indonesia.
Norziah MH, Al-hassan A, Khairulnizam AB, Mordi MN, & Norita M. (2009).
Food Hydrocolloids Characterization of fish gelatin from surimi processing
51
wastes : Thermal analysis and effect of transglutaminase on gel properties.
Food Hydrocolloids, 23(6), 1610–1616.
Nowak-wegrzyn A. (2003). Future Approaches to Food Allergy. Pediatrics (111).
Nowak-wegrzyn A & Fiocchi A. (2009). Rare, medium, or well done? The effect
of heating and food matrix on food protein allergenicity.
Ogunji JO, Wirth M, Rennert B, & Fisheries I. (2015). Assessing the dietary
amino acid requirements of tilapia,. Growth (Lakeland), (1988), 1–9.
Pan B, Su W, Cao M, Cai Q, Weng W, & Liu G. (2012). IgE reactivity to type I
collagen and its subunits from tilapia (Tilapia zillii). Food Chemistry, 130(1),
127–133.
Prawitasari T & Spa K. (2007). Alergi Makanan, 36–37.
Putro JS, Budiastra IW, & Ahmad U. (2012). Optimasi Proses Penggorengan
Hampa dan Penyimpanan Keripik Ikan Pepetek (Leiognathus sp.). Jurnal
Keteknikan Pertania, 26(1), 25–32.
Rybicki, James MD, & Reid SJ. (1996). Moleculer Biology Techniques Manual.
University of Capetown.
Saanin H. (1984). Taksonomi dan kunci identifikasi ikan (2nd ed.). Bandung:
Binacipta.
Sathe SK, Teuber SS, & Roux KH. (2005). Effects of food processing on the
stability of food allergens, 23, 423–429.
Shamloo, Hashim M, & Khatib. (2012). Biochemical properties of red tilapia
(Oreochromis niloticus) protein hydrolysates. International Food Research
Journal, 19(1), 183–188.
Sharp MF & Lopata AL. (2014). Fish allergy: In review. Clinical Reviews in
Allergy and Immunology, 46(3), 258–271.
Shreffler WG, Beyer K, & Chu TT. (2004). Microarray immunoassay :
Association of clinical history, in vitro IgE function, and heterogeneity of
allergenic peanut epitopes. J Allergt Clin Immunology, 113, 776–782.
Soedarto. (2012). Alergi dan Penyakit Sistem Imun (1st ed.). Jakarta: Sagung Seto.
Soekendarsi E, Hasyim Z, & Hasan S. (2016). Perbandingan Kandungan Gizi
Ikan Nila Oreochromis niloticus Asal Danau Mawang Kabupaten Gowa dan
Danau Universitas Hasanuddin Kotak Makassar. 1, 39–46.
Sunarya. (2014). Mutu Keamanan Pangan Hasil Perikanan. Bogor: Penerbit CV.
The Spring.
Sundari D, Almasyhuri, & Lamid A. (2015). Pengaruh Proses Pemasakan
Terhadap Protein. Media Litbangkes, 25(4), 235–242.
Suseno R, Palupi NS, & Prangdimurti E. (2016). Alergenisitas Sistem Glikasi
Isolat Protein Kedelai-Fruktooligosakarida, 36(4), 450–458.
52
Winarno FG. (2004). Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT Gramedia Pustaka
Utama.
Winarti S. (2010). Makanan Fungsional (1st ed.). Yogyakarta: Graha Ilmu.
Wiradharma D, Pusparini, & Alvina. (2017). Konsep Dasar Imunologi (2nd ed.).
Jakarta: Sagung Seto.
Yuliati A. (2005). Identifikasi epitop dari Streptococcus mutans terhadap sekretori
Imunoglobulin A saliva. Maj. Ked. Gigi, 38, 103–107.
Zakaria FR, Khatib A, Ispurwanto, & Rahman A. (1998). Telaah sifat
alergenisitas proteim udang putih (Penaeus merguensis) untuk produksi
isolat alergen. Bulletin Teknologi Dan Industri Pangan, 2(IX), 54–59.
53
LAMPIRAN
Lampiran 1. Pembuatan Pereaksi Bradford
Pewarna coomasie brilliant blue G-250 sebanyak 100 mg dilarutkan ke
dengan 50 mL etanol 95%. Sebanyak 100 mL asam fosfat 85% ditambahkan
dan ditepatkan hingga 1 L menggunakan akuades. Larutan tersebut disaring
menggunakan kertas Whatman No.1, lalu disimpan dalam botol gelap pada
suhu 4 ℃.
54
Lampiran 2. Pembuatan Larutan Standar BSA
Larutan BSA induk dibuat dengan menambahkan 10 mg BSA yang
dilarutkan dalam 10 mL H2O. Larutan standar BSA dibuat dengan
mengencerkan larutan BSA induk ke dalam tabung reaksi gelap dengan
konsentrasi 0 hingga 1000 mg/L.
Larutan standar BSA yang telah diencerkan dengan akuadest kemudian
diambil 100 µl, dan ditambahkan pereaksi Bradford sebanyak 5 mL. Larutan
kemudian divorteks dan diukur dengan spektrofotometri pada λ=595 nm
setelah 5 menit.
Blanko, sebanyak 100 μL akuades ditambahkan 5 mL pereaksi
Bradford dan diukur dengan cara yang sama. Kurva standar yang diperoleh
digunakan untuk mengukur konsentrasi sampel.
55
Lampiran 3. Pembuatan Larutan Kerja untuk SDS-PAGE
a. Larutan A (Akrilamid 30%; 0,8 bisakrilamid) 100 mL.
Sebanyak 30 g akrilamid dan 0,8 g N,N’-metilen-bisakrilamid dilarutkan
dalam 100 mL akuadest. Pada waktu penimbangan selalu harus
menggunakan sarung tangan dan tutup wadah dengan parafilm atau
aluminium foil selama pelarutan. Larutan akrilamid dapat disimpan selama
beberapa bulan dalam lemari pendingin pada suhu 4 ℃.
b. Larutan B (Tris-HCl/SDS,pH 8,8) 100 mL.
Sebanyak 18,17 g Tris base dan 4 mL SDS 10% dilarutkan dalam 40 mL
akuades. Larutan ditepatkan pada pH 8,8 dengan HCl 1 N. Ditambahkan
akuades hingga volume total 100 mL. Larutan disimpan di lemari
pendingin pada suhu 4 ℃.
c. Larutan C (Tris-HCl/SDS pH 6,8) 100 mL
Sebanyak 6,05 g tris base dan 4 mL SDS 10% dilarutkan dalma 40 mL
akuades. Larutan ditepatkan pada pH 6,8 dengan HCl 1 N, kemudian
ditambahkan akuades hingga volume total 100 mL. Larutan disimpan di
lemari pendingin pada suhu 4 ℃.
d. 0,25 mL ammonium peroksodisulfat (APS)
Dibuat segar setiap kali akan melakukan elektroforesis dengan cara
melarutkan 0,025 g ammonium persulfat dalam 0,25 mL akuadest. Larutan
divortex.
e. SDS/buffer elektroforesis I L
Sebanyak 3 g tris base, 14,4 glisin dan 1 g SDS dilarutkan dalam 800 mL
akuades. Larutan ditepatkan hingga 1 L.
56
f. SDS/buffer sampel, 100 mL
30 mL SDS 10%, 10 mL gliserol, 5 mL 2-merkaptoetanol, 12,5 mL Tris-
HCL/SDS pH 6,8 dan 5-10 mg bromphenol blue dicampurkan.
Volumenya ditepatkan hingga 100 mL dengan akuades. Larutan disimpan
pada suhu 4 ℃.
g. Larutan pewarna (staining)
Sebanyak 1 g coomaisie brilliant blue R-250, 450 mL methanol dan 100
mL asam asetat glasial dilarutkan dalam 450 mL akuades.
h. Larutan penghilang warna (destaining)
Sebanyak 100 mL methanol dan 100 mL asam asetat glasial dilarutkan
dalam 800 mL akuades.
57
Lampiran 4. Pembuatan larutan kerja imunoblotting
a. Pembuatan buffer transfer
Sebanyak 2,9 Tris base dan 14,5 g glisin dilarutkan dalam 500 mL akuades
dan ditambah 200 mL methanol, kemudian volumenya ditepatkan sampai
1 L. Larutan disimpan pada suhu 4 ℃.
b. Pembuatan PBS (Phosfat Buffer Saline)
10x konsentrasi (untuk 1L)
Ditimbang sebanyak 100 g NaCl, 2,5 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,5 g
KH2PO4. Dilarutkan dengan akuades steril sampai 1 L, lalu disterilkan
dengan menggunakan autoclave.
1x konsentrasi
Untuk membuat PBS 1X, diambil PBS 10x sebanyak 100 mL, lalu
ditambahkan akuades steril sampai 1 L.
c. Pembuatan PBS-Tween 20 0,05%
Diambil 1 L PBS 1x, lalu ditambahkan 0,5 mL Tween-20, kemudian
larutan diaduk sampai Tween 20 larut sempurna.
d. Pewarna amido black
Ditimbang amido black sebanyak 0,1 g, lalu ditambah methanol 20 mL
dan asam asetat glasial 10 mL, kemudian ditambahkan akuades sampai
100 mL dan diaduk sampai larut sempurna.
e. Pembuatan TBS
2,42 g Tris ditambahkan dengan 29,24 g NaCl, lalu ditambahkan 0,75 L
akuades. Larutan tersebut diukur pHnya hingga 7,5 kemudian ditera
dengan akuades hingga 1 liter.
58
f. Pembuatan substrat DAB
10 mg substrat DAB ditambahkan dengan 20 mL larutan TBS.
Ditambahkan dengan 2µL hidrogen peroksida 30%. Larutan ini dibuat
segar setiap kali melakukan tahap deteksi.
g. Pembuatan skim milk 5%
5 gram susu skim dilarutkan dalam 100 mL PBST, kemudian larutan
divorteks hingga larut sempurna.
h. Pembuatan Konjugat HRP (1:3000)
Sebanyak 2µL Konjugat HRP dilarutkan dalam PBST 5998 µl, lalu
divorteks hingga larut sempurna.
i. Pengenceran Serum darah (1:10)
Sebanyak 300 µL serum darah dilarutkan pada PBST 2700 µL, kemudian
divorteks hingga larut sempurna.
59
Lampiran 5. Lembar kuisioner responden
KUISIONER ALERGI
Nama :
Jenis Kelamin :
Umur :
No. Tlp :
1. Apakah anda memiliki riwayat alergi makanan?
a. Ya
b. Tidak
2. Jenis makanan apa yang membuat anda alergi ?
a. Kacang – kacangan : ……………………………………………..
b. Ikan laut : ……………………………………………..
c. Produk laut lain : ……………………………..........................
d. Makanan lain : ……………………………………………..
3. Apakah anda selalu mengalami alergi setiap memakan makanan tersebut?
a. Ya
b. Kadang – kadang
4. Bagaimana gejala alergi yang anda alami?
a. Gatal – gatal
b. Asma
c. Pusing
d. Lain – lain : …………………………………
5. Berapa lama waktu yang diperlukan dari makan hingga timbulnya gejala
alergi?
……………….jam atau …………………….. hari.
6. Bagaimana anda mengatasi alergi yang anda alami?
a. Dengan meminum obat anti alergi.
b. Dibiarkan saja
c. Lain – lain : ……………………………………………
7. Apakah anda memiliki keluarga yang juga mengalami alergi?
a. Ya, yaitu: ………………………
b. Tidak
(………………………………….)
( )
60
Lampiran 6. Naskah Persetujuan menjadi Responden
NASKAH PENJELASAN UNTUK MEMPEROLEH PERSETUJUAN
RESPONDEN DAN FORMULIR PERSETUJUAN SETELAH
PENJELASAN (INFORMED CONSENT)
Pengambilan Darah Responden Alergi Seafood, dam Ikan Untuk Uji
Alerginisitas Protein Alergen Baby Fish Nila
Kami mengundang Anda bersama beberapa orang lainnya untuk turut
terlibat dalam program “Pengambilan Darah Responden Alergi Seafood, dan Ikan
Untuk Uji Alerginisitas Protein Alergen Baby Fish Nila”. Kami akan
menjelaskan beberapa informasi terkait dngan keikutsertaan Anda pada penelitian
ini :
Kesediaan untuk berpartisipasi
Anda tidak akan dipaksa untuk ikut serta dalam program ini, jika Anda
tidak menghendakinya. Bila Anda memutuskan untuk berhenti berpartisipasi, tak
seorangpun boleh memaksa Anda untuk berubah pikiran. Dokter dapat
memutuskan bahwa Anda tidak boleh lagi ikut serta dalam program ini, terlepas
dari keinginan Anda untuk tetap berpartisipasi atau tidak. Keputusa ini diambil
dengan selalu memperhatikan hal yang terbaik bagi Anda. Yaitu untuk melindungi
kemungkinan gangguan kesehatan.
Dasar Pemilihan Responden
Anda dipilih sebagai responden atau subjek dalam penelitian ini
berdasarkan kriteria yaitu umur 18-45 tahun dengan berat badan normal dan
dalam keadaan sehat, anda pernah mengalami alergi, anda bukan pemabuk, tidak
61
perokok berat, tidak mengikuti donor darah atau kehilangan darah sebanyak 300
ml atau lebih sebelum pelaksanaan penelitian ini. Anda tidak sakit kulit seperti
panu, kudis, kurap dan urtikaria.
Anda tidak diperbolehkan minum obat yang mengandung antihistamin
satu minggu dan selama penelitian berlangsung. Antihistamin adalah obat yang
digunakan untuk mencegah pelepasan histamin suatu zat yang dilepaskan oleh sel
mastosit sebagai sistem pertahanan tubuh dan akan menimbulkan reaksi gatal dan
merah pada kulit. Anda tidak akan dikenakan biaya atas pengambilan darah ini.
Tujuan dan Manfaat
Tujuan dari penelitian ini adalah mendapatkan data tentang protein alergen
yang terkandung pada baby fish nila. Data tersebut akan menambahkan informasi
bagi masyarakat umum dan bagi penderita alergi untuk meminimalisir konsumsi
ikan atau serangga. Data tersebut juga dapat diteliti lebih lanjut dan berpotensi
untuk dikembangkan sebagai bahan alergen untuk mendeteksi penyakit alergi
makanan dengan metode imunostick.
Prosedur Penelitian
Pada program selama 1 hari, Anda diminta untuk memberikan ±10 ml
darah yang akan diambil oleh tenaga medis. Darah yang telah diambil, kemudian
dipisahkan dan diambil bagian plasma darah. Profil protein alergen yang
terkandung pada baby fish nila. akan diketahui menggunakan metode
imunoblotting dengan bantuan plasma darah. Metode imunoblotting merupakan
metode uji alerginisitas menggunakan elektroforesis dan penyangga berupa kertas
nitroselulosa. Kertas nitroselulosa yang telah terdapat protein alergen, kemudian
direaksikan dengan darah yang Anda berikan, hasil warna hitam atau coklat
merupakan hasil positif bahwa sampel baby fish nila mengandung protein alergen
yang dapat bereaksi dengan darah Anda.
Kemungkinan resiko dan perawatan
Tidak ada resiko yang terjadi pada pengambilan darah ini, karena kami
hanya menggunakan jarum yang steril dan pengambilan darah dilakukan oleh
tenaga kesehatan terlatih.
62
Kerahasiaan
Catatan mengenai identitas dan hasil pemeriksaan Anda akan dirahasiakan.
Pertanyaan-pertanyaan
Bila ada pertanyaan mengenai program ini, mengenai hak-hak Anda harap
Anda melapor kepada Widyaningsih yang dapat dihubungi melalui nomor
handphone 089601896523 atau melalui email di [email protected]
Keputusan untuk berpartisipasi
Anda tidak akan dipaksa untuk ikut serta dalam program ini bila Anda
tidak menghendakinya. Bila Anda memutuskan untuk berhenti berpartisipasi, tak
seorang pun boleh memaksa Anda untuk berubah pikiran. Dokter dapat
memutuskan bahwa Anda tidak boleh lagi ikut serta dalam program ini, terlepas
dari keinginan Anda untuk tetap betpartisipasi atau tidak. Keputusan ini diambil
dengan selalu memperhatikan hal yang terbaik bagi Anda. Yaitu untuk melindungi
kemungkinan gangguan kesehatan.
Insentif
Sebagai rasa terimakasih atas partisipasi Anda pada program ini, kami
akan memberikan makan siang dan susu setelah proses pengambilan darah selesai.
Dan kami berdoa semoga semua urusan Anda dipermudah oleh Allah SWT.,
karena Anda telah mempermudah urusan orang lain.
Tanda Tangan
Bila Anda sudah paham dengan penjelasan tentang program ini, maka
Anda diminta untuk mebubuhkan tanda tangan pada lembaran Persetujuan
Berpartisipasi (Informed Consent) yang telah kami sediakan.
63
Formulir Persetujuan Berpartisipasi (Informed Consent)
Pengambilan Darah Responden Alergi Seafood, Ikan dan Serangga Untuk
Uji Alerginisitas Protein Alergen Baby Fish Nila
Saya telah membaca apa yang tertera pada Naskah Penjelasan
Memperoleh Persetujuan Responden di atas. Saya memahami program ini, maka
saya :
Nama Responden : ………………………………………………………….
Alamat : ………………………………………………………….
………………………………………………………….
………………………………………………………….
Nomor Kontak : ………………………………………………………….
Saya menegaskan bahwa secara sukarela dan penuh kesadaran
keikutsertaan saya pada program ini dengan catatan semua data mengenai diri
saya dirahasiakan, dan bila suatu saat pada program ini saya dirugikan dalam
bentuk apapun maka saya berhak membatalkan persetujuan ini
Jakarta, 13 Februari 2018
Mengetahui, Yang Membuat Pernyataan
Peneliti, Responden,
(Widyaningsih) (………………………….)
64
Lampiran 7. Hasil kuisioner salah satu responden
65
Lampiran 8. Formulir persetujuan salah satu responden
66
Lampiran 9. Hasil Identifikai baby fish nila
67
Lampiran 10. Kurva Standar Uji Bradford
Nilai regresi yang diperoleh pada kurva standar adalah 0,9934 dengan
persamaan y = 0,0006x – 0,0087, dengan nilai absorbansi standar sebagai berikut,
No. Konsentrasi standar (mg/L) Absorbansi rata – rata
1 0 0
2 100 0,0272
3 200 0,1143
4 300 0,1658
5 500 0,3059
6 600 0,3512
7 700 4317
8 800 0,4638
9 900 0,5071
68
Lampiran 11. Jarak dan BM marker pada SDS-PAGE
No. BM (kDa) Jarak Pita (cm) Rf (x) Log BM (y)
1 250 0,45 0,071 2,398
2 150 0,73 0,115 2,176
3 100 1,1 0,175 2
4 75 1,9 0,302 1,875
5 50 2,1 0,333 1,699
6 37 2,8 0,444 1,568
7 25 3,9 0,619 1,398
8 20 4,4 0,698 1,301
9 15 5,5 0,873 1,176
10 10 6,3 1 1
69
Lampiran 12. Contoh perhitungan nilai Rf pada sampel dengan SDS-PAGE
Kurva marker pada SDS-PAGE yang diperoleh dari lampiran 11.
Contoh perhitungan pada pita protein ke-4 pada baby fish mentah
Rf sebagai sumbu x, yang diperoleh dari perhitungan :
Rf = Jarak migrasi protein
Jarak migrasi pewarna
= 1,2
6,3
= 0,190
Log BM sebagai sumbu y, yang diperoleh dari Log berat molekul pada protein
marker,
Sehingga diperoleh persamaan,
y = a – b x
= 2,293 – 1,369 x
= 2,293 – 1,369 (0,190)
= 2,293 – 0,260
= 2,033
Nilai bobot molekul protein diperoleh dari antilog y sebesar
Antilog y = Bobot molekul
Antilog 2,033 = 108
70
Lampiran 13. Jarak dan BM sampel baby fish nila pada SDS-PAGE
A. Baby fish nila mentah
No. Ekstrak baby fish mentah
Jarak (cm) Rf BM (kDa)
1 0,2 0,032 >250
2 0,5 0,079 250
3 1 0,159 119
4 1,2 0,190 108
5 1,4 0,222 99
6 1,8 0,286 80
7 2,2 0,349 65
8 2,9 0,460 46
9 3,2 0,508 40
10 3,5 0,556 34
11 4 0,635 27
12 4,8 0,762 18
13 5,1 0,810 15
14 5,6 0,889 12
15 6 0,952 11
16 6,3 1 10
71
B. Baby fish nila rebus
No. Ekstrak baby fish rebus
Jarak (cm) Rf BM (kDa)
1 0,4 0,063 >250
2 0,5 0,079 250
3 0,6 0,095 145
4 0,7 0,111 138
5 0,8 0,127 132
6 0,9 0,143 125
7 1 0,159 119
8 1,1 0,175 113
9 1,2 0,190 108
10 1,3 0,206 102
11 1,4 0,222 99
12 1,5 0,238 93
13 1,6 0,254 88
14 1,7 0,270 84
15 2 0,317 72
16 2,1 0,333 69
17 2,2 0,349 65
18 2,4 0,381 59
19 3 0,476 44
20 3,3 0,524 38
21 3,6 0,571 32
22 4 0,635 27
23 5 0,794 16
24 5,3 0,841 14
25 6,1 0,968 11
26 6,3 1 10
72
C. Baby fish nila goreng
No. Ekstrak baby fish goreng
Jarak (cm) Rf BM (kDa)
1 0,4 0,063 >250
2 0,6 0,095 250
3 0,8 0,127 132
4 0,9 0,143 125
5 1 0,159 119
6 1,1 0,175 113
7 1,4 0,222 99
8 1,7 0,270 84
9 1,9 0,302 75
10 2,2 0,349 65
11 2,5 0,397 56
12 3 0,476 44
13 3,6 0,571 32
14 5,1 0,810 15
15 5,4 0,857 13
16 6,3 1 10
73
Lampiran 14. Jarak dan BM responden pada Imunoblotting
A. Imunoblotting Responden (1)
No. (+) Baby fish nila rebus (+) Baby fish nila goreng
Jarak (cm) Rf BM (kDa) Jarak (cm) Rf BM (kDa)
1 0,5 0,096 >250 0,5 0,096 >250
2 0,6 0,115 250 0,6 0,115 250
3 0,7 0,135 145 0,7 0,135 145
4 0,8 0,154 115 0,8 0,154 115
5 1,15 0,221 95 1,2 0,231 93
B. Imunoblotting Responden (2)
No. (+) Baby fish nila rebus (+) Baby fish nila goreng
Jarak (cm) Rf BM (kDa) Jarak (cm) Rf BM (kDa)
1 0,3 0,055 >250 0,5 0,091 >250
2 1,1 0,200 99 0,6 0,109 250
3 1,4 0,255 84 0,9 0,091 133
4 1,2 0,218 93
74
C. Imunoblotting Responden (3)
No. (+) Baby fish nila rebus (+) Baby fish nila goreng
Jarak (cm) Rf BM (kDa) Jarak (cm) Rf BM (kDa)
1 0,5 0,020 >250 0,5 0,098 >250
2 0,9 0,176 127 0,6 0,118 250
3 0,7 0,137 144
4 0,9 0,176 127
D. Imunoblotting Responden (4)
No. (+) Baby fish nila mentah
Jarak (cm) Rf BM (kDa)
1 3 0,545 31
75
E. Imunoblotting Responden (5)
No. (+) Baby fish nila rebus (+) Baby fish nila goreng
Jarak (cm) Rf BM (kDa) Jarak (cm) Rf BM (kDa)
1 0,3 0,052 >250 0,4 0,069 >250
2 0,6 0,103 250 0,6 0,086 250
3 1,1 0,190 128 1,7 0,293 91
4 1,6 0,276 96 1,8 0,310 86
5 1,7 0,293 91 1,9 0,328 81
6 1,8 0,310 86 2 0,345 77
F. Imunoblotting Responden (6)
No. (+) Baby fish nila rebus (+) Baby fish nila goreng
Jarak (cm) Rf BM (kDa) Jarak (cm) Rf BM (kDa)
1 0,5 0,077 >250 0,5 0,089 >250
2 0,6 0,096 250 0,7 0,125 150
3 0,9 0,115 134 0,8 0,143 142
4 1,1 0,135 120 0,9 0,161 134
5 1,3 0,154 107 1 0,179 127
6 1,4 0,221 101 1,2 0,214 113
7 1,6 0,286 90 1,4 0,250 101
8 1,8 0,321 81 1,5 0,268 96
9 2 0,357 72 1,9 0,339 76
10 2,2 0,393 65 2,2 0,393 65
11 2,5 0,446 55
12 2,6 0,464 52
13 3,3 0,589 35
76
G. Imunoblotting Responden (7)
No. (+) Baby fish nila rebus (+) Baby fish nila goreng
Jarak (cm) Rf BM (kDa) Jarak (cm) Rf BM (kDa)
1 0,3 0,051 >250 0,3 0,051 >250
2 0,5 0,086 250 1,65 0,280 83
3 1 0,169 116 1,85 0,314 74
4 1,1 0,186 110 2,05 0,347 67
5 1,4 0,237 94 2,75 0,466 47
6 1,7 0,288 80 2,9 0,492 43
7 2 0,339 69
H. Imunoblotting Responden (8)
No. (+) Baby fish nila rebus (+) Baby fish nila goreng
Jarak (cm) Rf BM (kDa) Jarak (cm) Rf BM (kDa)
1 0,5 0,076 >250 0,5 0,076 >250
2 0,7 0,107 222 1,2 0,183 121
3 1 0,153 134 1,3 0,198 116
4 1,1 0,168 128 1,7 0,260 95
5 1,3 0,198 116
6 1,4 0,214 110
7 1,5 0,229 105
8 1,8 0,275 91
