KALITSAL METABOLİK HASTALIKLARIN TANI ve İZLEMİNDE LABORATUVAR:

MOLEKÜLER ANALİZLERAsuman Gedikbaşı

İstanbul Üniversitesi Çocuk Sağlığı Enstitüsü

Pediatrik Temel Bilimler AD Tıbbi Genetik BD

Uluslararası Laboratuvar Tıbbı ve 19. Ulusal Klinik Biyokimya Kongresi25‐28 Nisan 2019 La Blanche Island Bodrum

Kalıtsal Metabolik Hastalıklar (KMH), 

Genetik hastalıkların TEDAVİ EDİLEBİLİR önemli bir grubu

Büyük çoğunluğu tek gen hastalıkları, otozomal resesif kalıtım, AKRABA EVLİLİĞİSIK!

Halk sağlığını kollektif olarak etkileyen «NADİR HASTALIKLAR» ın önemli bir grubu

Nadir hastalıklar,  sık görülen hastalıkların patofizyolojik mekanizmalarının anlaşılması, ve tedavi için hedef molekül geliştirilmesi açısından önemli !

29 ŞUBAT 

KMH SINIFLAMA 

Ara metabolizma bozukluklarıAmino asit metabolizması Organik asidüriler Amonyak detoksifikasyonu Yağ asidi ve ketogenezKarbonhidrat metabolizması ve transport Mitokondriyal hastalıklarKobalamin ve folat metabolizması Amino asit transportPeptid metabolizmasıBakır, demir, çinko transport ve kullanım

Kompleks moleküllerin sentez ve yıkım bozuklukları

Lizozomal depo hastalıkları Peroksizomal hastalıklar Pürin ve pirimidin metabolizmasıKonjenital glikozilasyon bozukluklarıLipoprotein metabolizmasıSafra asidi ve bilirubin metabolizması, kalıtsal kolestaz ve porfiriyalarİzoprenoid ve sterol metabolizması

Nörotransmitter bozukluklarıve ilişkili hastalıklar

Glisin ve serin metabolizmasıPterin ve biyojenik aminler metabolizması

Gama-aminobütirat metabolizmasıB6 vitamini metabolizması Kreatin

metabolizmasıDiğer nörometabolik hastalıklar

BEAH METABOLİZMA LABORATUVARI(2013‐2015..)

4

Altta yatan bir metabolik kusur hakkında güçlü bir şüphe olsa bile, klinik özelliklerde değişkenlik 

KMH'nın klinik/biyokimyasal fenotip spektrumu geniştir ve çoğu zaman spesifik değildir, daha sık görülen durumları taklit eder 

Semptomların başlangıcı fetustan erişkine kadar her yaşta ortaya çıkabilir.

Daha hafif mutasyonları ve hafif biyokimyasal fenotipleri olan hastalar, pozitif taramasonuçlarını belirlemek için kullanılan kesme değerleri ile kaçabilir

Çocuklarda IEM'in hem klinik hem de biyokimyasal fenotipleri on yıllardır bilinmektedir; tersine, geç başlangıçlı veya erişkin başlangıçlı varyantlar büyük ölçüde tanınamamaktadır.

Kesin tanı moleküler analiz,

The American Journal of Human Genetics 104, 76–93, January 3, 2019

Moleküler Tanı Neden Gerekli;,

Gerekli olmayan invaziv testlerin kesilmesi

Efektif olmayan ve potansiyel olarak zararlı tedavilerden kaçınma

Hastalığın seyri sırasında ortaya çıkmasımuhtemel komplikasyonlarının takip edilebilmesi

Hastalığın kaynağının bilinmesinin hasta ve ailesi üzerinde yarattığı pozitif etki Doğum öncesi tanı seçeneklerinin gündeme gelmesi

Aile bireylerinin erken evrede saptanması ve prognozlarında iyileşme

Olası tedavi seçenekleri

1. EVRE. Kalıtımın hücre içindeki temelini ortaya koyan:  KROMOZOMLAR

(1909‐1970)

2.evre :Kalıtımın moleküler temelini ortaya 

koyan DNA ÇİFTE SARMALI

25 Nisan 1953 – Nature

3. EVRE Kalıtımın bilgisel temelini ortaya koyan ;

genetik kod ve  Rekombinant DNA teknolojilerinin

icadı 1977 SANGER ‐ NATURE

4.EVRE İnsan Genomunun dizilenmesi :GENOMBİLİM (GENOMİK)

Genetikte son yüzyılda sağlanan ilerlemeler kabaca 4 çeyreğe denk gelen 4 ana evre;

13 Ağustos 1918 – 19 Kasım 2013 tarihleri arasında yaşamını sürdürmüş olan Nobel Kimya Ödülü’nü iki kez kazanan İngiliz biyokimyacıdır. 

1958’de proteinlerin yapısı, özellikle de insülinin kısmi hidrolizi ile aa dizisinin belirlenmesi çalışması ile kimya dalında Nobel ödülü aldı.

DNA polimerazı kullanarak tek iplikli kalıptan yeni DNA zincirleri sentezleyerek dizileyen Sanger, 1980 Nobel Kimya Ödülü’nü aldı.

Frederick Sanger

PCR   (Polymerase Chain Reaction)

Kary Banks Mullis, Amerikalı biyokimyacı. Polimeraz zincir tepkimesini keşfinden (1985) ötürü 1993 yılında Michael Smith ile birlikte Nobel Kimya Ödülüne layık görülmüştür

Biyokimyasal genetik testKlinik sorunlara neden olan enzim/enzimlerineksikliğini,  stabilite kaybını, aktivite değişimini tanımlar

Gaz Kromatografi / kütle spektrometri(GS/MS)Sıvı kromatografisi (HPLC)Tandem kütle spektrometresi (MS/MS)

Hangi enzimde sorun olduğu saptanırsa, o enzimi kodlayan gendeki mutasyon, moleküler genetik testler ile saptanır.

Biyokimyasal genetik testKlinik sorunlara neden olan enzim/enzimlerineksikliğini,  stabilite kaybını, aktivite değişimini tanımlar

Gaz Kromatografi / kütle spektrometri(GS/MS)Sıvı kromatografisi (HPLC)Tandem kütle spektrometresi (MS/MS)

Hangi enzimde sorun olduğu saptanırsa, o enzimi kodlayan gendeki mutasyon, moleküler genetik testler ile saptanır.

Genetik Test Çeşitleri

Sitogenetik testler

Kromozomları inceler

Karyotip analizi

Hedefe yönelik

FISH testi Tek bölge Çoklu bölgeTelomerikSentromerikTüm kromozom

Array • aCGH • mikroarray

Sitogenetik testler

Kromozomları inceler

Karyotip analizi

Hedefe yönelik

FISH testi Tek bölge Çoklu bölgeTelomerikSentromerikTüm kromozom

Array • aCGH • mikroarray

Moleküler genetik testler

Tüm gen inceleme

Tüm gen dizilemeTüm ekzom dizilemeTüm genom dizileme

Hedefe YönelikPZR + REGerçek zamanlı PZRMLPA

Moleküler genetik testler

Tüm gen inceleme

Tüm gen dizilemeTüm ekzom dizilemeTüm genom dizileme

Hedefe YönelikPZR + REGerçek zamanlı PZRMLPA

Genomda 6 milyar nükleotid, çift sarmal yapıda proteinler ile sıkı bir paketlenme ile interfaz kromatinini oluşturur.

10 nm

147 bç

8-114 bç

Hücre çekirdeği içinde DNA İnsan KromozomlarıBir diploid hücrede 23 çift olarak bulunur

22 çift otozom + 1 çift cinsiyet kromozomu

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18

19 20 21 22 XX

Her kromozom üzerinde, kalıtımın fiziksel ve fonksiyonel ünitesini oluşturan binlerce gen bulunur.

İnsan Genom Projesi, 20.000 protein kodlayan gen, 5.000 fonksiyonel RNA bulunduğunu gösterdi.

Mitokondrial Genom 

16,569 baz çifti uzunluğunda 37 gen içerir14

1. OXPHOS structral gene2. OXPHOS assembly factors3. MtDNA maintenance gene4. Mt translation disorders5. Mt fisson/fusion6. Mt protein import7. Mt homeostasis

8.Mt chaperones9.Mt metabolism10.Coenzyme Q10 biogenesis11.Lipid metabolism12.Phospholipid remodeling13.Fe-S cluster assembly homeostasis14.Apoptosis

Hum Mol Gene, ed 2010, Chapter 9: Organization of the Human Genome

Çekirdek ve mitokondrial  insan genomunun  DNA dizileri, boy, biçim, yapı ve şifreleri birbirinden  farklıdır

İnsan genom dizisinin >% 80 özgün bir biyolojik fonksiyonu vardır.

% 5704

X genleri

OMIM’de (Online Mendelian Inheritance in Man insan genleri ve fenotipleri kataloglayan bilgi bankası)

tanımlı insan genleri

37 mt gen

49 Y geni

732 X geni, % 515.230 otozom geni, % 95

http://www.omim.org/statistics/entryŞubat, 2019

http://www.omim.org/statistics/entryŞubat, 2016

OMIM istatistikleri

moleküler temeli bilinen fenotipler4.667

% 74

moleküler temeli bilinmeyen fenotipler

1.634

% 26

moleküler temeli bilinen fenotipler

6.369

% 80.3

moleküler temeli bilinmeyen fenotipler

1.569

% 19.7

http://www.omim.org/statistics/entryŞubat, 2019

2016 2019

İnsan GenomuGRCh38.p12 (Genome Reference Consortium Human Build 38), INSDC Assembly 

GCA_000001405.27, Dec 2013

• Yaklaşık 3,609,003,417 baz çifti

• Yaklaşık 20,418  protein kodlayan gen

• Yaklaşık  22,107 kodlanmayan gen

• Gen transcripti 206,762

• Short Variants665,437,818

• Genomun yaklaşık %50 si tekrar dizilerinden oluşur

• %5‐10’u CNV (Copy Number Variation) : Fenotipik genotipik çeşitlilik! Structural variants 6,013,031

https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Annotation

Genetik Varyasyonlar• Kromozomlardaki bir bölgede (lokus) DNA dizisi bireylerde alternatif 

şekillerde bulunabilir (genetik varyasyon), bunlar o genetik dizinin ‘allelik 

formları’ olarak adlandırılır.

• DNA’da çok sayıda genetik varyasyon meydana gelmekte (% 0.1’lik yani 

yaklaşık 3 milyon bazlık varyasyon), ancak bunların çoğu hastalıklarla ilişkili 

olmamaktadır.

• Bir genetik varyasyon için şayet bir allel toplumda % 1’den daha sık 

görülüyorsa ‘polimorfizm’ olarak adlandırılırken, görülme sıklığı daha 

düşükse ‘nadir allelik varyant’ adını alır. 

Genetik Varyasyonlar: Bireyler ve toplumlar arasında DNA dizi veya yapılarındaki değişimler

Mutasyon: Nükleotit dizinse kalıcı bir değişim

Oluşum mekanizmalası

Popülasyona özgüMAF* değerleri

Polimorfizm: nispeten yaygın varyant (MAF> 0.01)

Nadir Varyant: MAF< 0.01Nadir Varyant: MAF< 0.01

- Genellikle nötr- Hastalıkla ilişkili- Genellikle nötr

- Hastalıkla ilişkili

- Genetik hastalıklar- Genetik hastalıklar

- Genellikle önemi

bilinmiyor

- Genellikle önemi

bilinmiyor

?

*Bir popülasyonda bir varyant için en nadir allelinin görülme sıklığı

Kısa Genetik Varyasyonlar Yüksek Genetik Heterojenite

Ataksi için >300 gen

Aynı Varyasyon: Farklı seviyede etkilenmiş bireyler

Ağır fenotip Daha hafif hatta subklinik fenotip

Eksik penetrans

Değişken ekspresivite

Hastalık ilişkili bozukluğun mutasyon tipine,hastalık ilişkili gen/genleresaptanma oranlarına göre karar verilir.

Eğer belli bir hastalık için iki farklıyöntemin rezolüsyonu benzer ise laboratuarın en iyi optimize ettiği ve ucuza mal ettiği yöntem tercih edilir.

Hangi yöntem/lerin kullanılması gerektiğine  nasıl karar verilir?

Sanger zincir sonlanma yönteminde istenilen DNA kalıbının çoğaltılması ve dizi analizinin yapılabilmesi için özgül oligonükleotitlere yani primerlere ihtiyaç vardır.

Primer çiftleri kullanılacak kalıp DNA’ nın genomik DNA’dan eldesinde, çoğaltılmasında kullanılır.

PCR reaksiyonları sonucu elde edilen DNA parçaları, elektroforezde yan yana yürütülür

Otomatik DNA Dizi Reaksiyon Basamakları

• DNA İzolasyonu• PCR• PCR sonrası Pürifikasyon• Cycle Sequencing (floresan işaretli   dideoksinükleotidlerin kullanıldığı döngüsel  sekanslama reaksiyonuna)

• Pürifikasyon (Alkol Çöktürme)• Pürifikasyon sonrasında örnekler sekans cihazına yüklenir ve cihaz otomatik olarak örnekleri kapillere çeker, yürütür, lazer ışığı altında optik sensör tarafından okur ve  okuduğu ham bilgileri bilgisayar programına aktarır

PKU ilişkili, tanımlanmış ekzonik mutasyon: c.782G>A, p.R261Q, CM910287, Highest population MAF: < 0.01, Abadie (1989) Genomics 5, 936 (Homozigot)

Normal dizi

Hasta

PKU ilişkili, tanımlanmış ekzonik mutasyon: c.842C>T, Pro281Leu, p.P281L, CM910292 (Heterozigot)

Normal dizi

Hasta

Yeni Nesil Dizileme? (Next Generation Sequencing?)

(NGS)

Yeni Nesil Dizileme? (Next Generation Sequencing?)

(NGS)• …. Yeni nesil?

– 1., 2., 3.. ?

• Sanger dizilemesi sonrasındaki teknoloji

• Paralel bir şekilde milyonlarca okuma 

• Daha kıza diziler ve okumalar

• Farklı dizileme platformları & özgü yaklaşımlar

• DNA & RNA karışımları analizi

• Tüm genom yaklaşımlar

Yeni Nesil Dizileme (NGS)

Örneğe ait GenomRastgele parçalara bölme ve büyüklük ayrımı

Eşleşmiş dizileme(paired-end sequencing)

Parçacıkları yerleştirme

(read mapping)ReferansGenomu

Maps toForward strand

Maps toReverse strand

NGS Panel TestlerYüksek kalitede hedefe yönelik veri

• Yüksek kapsam derinliği– Bir bölgenin dizileme esnasında kaç kez okunduğu bilgisi

– Mutasyonları kaçırma olasılığı azdır• Ancak,

– Sonuç seçilen genlerle sınırlıdır– Tanı yapan laboratuvarın hangi paneli kullandığıönemlidir

– Bir hastalıkla ilgili yeni genler bulunduğunda kullanılan panel hızlıca ‘demode’ olabilir

Tüm exome dizileme (Whole exome sequencing, WES)

Ekzom: Genomun ‘fonksiyonel’bölgelerine toplu bir bakış

WES İş Akış Şeması

LaboratuvarLaboratuvarVeri analizi

BiyoinformatikVeri analizi

Biyoinformatik

2  Ana Husus

DNA fragmentasyonu

Fragman uçlarına adaptör

Ekzom yakalaması& amplifikasyon

Oligonükleotid hibridizayonu

Dizileme

kütüphane zenginleştirilmesi40‐500bç

Tüm Genom Ekzom Dizilemesi

>~200.000 varyant  ~400‐700:dbSNP, gnomAD, ExAC, 1000 Genom, NHLBI (ESP6500)

Temel Yeni Nesil Dizileme Terminolojisi

Reads & Tags (Okumalar & İşaretlemeler)

Paired‐end ; Mate pair dizileme

Alignment, reference bias (Hizalama, referans etkisi)

Coverage & depth (Kapsama & derinlik)

2 strands (2 sarmal)

Assembly, dustbin, sequencability 

Kapsama & Derinlik

Population data – frequencyFunctional data Segregation studies De novo observations Allelic data Computational (in silico) pathogenicity predictions

KMH Tanısında Moleküler Analizörler

Klinik exome (medeliome) dizileme

Whole humanexome sequencing

Yaklaşık 6.000 klinik ilişkisi kesin olan raporlanabilir gen Kodlanan tüm genlerin

dizilenmesi

Yeni gen keşifleri

Whole mitochondrial genome sequencing

Dizi derinliğini artırarak heteroplazminin tespiti

mümkün

Wh

K

in

John D McPherson S2 |VOL.6 NO.11s |NOVEMBER 2009 | nature methodSSuPPLement

Ins/del & tekrar bölgeleri Sınırların doğru çizilmesi

45 46

Variant prioritization after pathway analysis with Metabolomic raw data by LC / MS

Teşekkürler

poliklinik

hücre kültürü

sitogenetik

array NGS ve Sanger

moleküler genetik

ITF Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı1985 -

odalar

ımız

SBÜ Bakırköy Dr. Sadi Konuk E&A Hastanesi Metabolizma Laboratuvarı