ISTRAŽIVANJE INTERAKCIJA MALIH MOLEKULA S … · 2013-11-27 · prirodoslovno-matematiČki fakultet adriana dijanošić istraŽivanje interakcija malih molekula s polinukleotidima

PRIRODOSLOVNO-MATEMATIČKI FAKULTET

Adriana Dijanošić

ISTRAŽIVANJE INTERAKCIJA MALIH MOLEKULA S POLINUKLEOTIDIMA SPEKTROSKOPIJOM POVRŠINSKI

POJAČANOG RAMANOVOG RASPRŠENJA

DOKTORSKI RAD

Zagreb, 2013.

FACULTY OF SCIENCE

Adriana Dijanošić

SURFACE-ENHANCED RAMAN STUDY OF THE INTERACTIONS BETWEEN

SMALL MOLECULES AND POLYNUCLEOTIDES

DOCTORAL THESIS

Zagreb, 2013.

PRIRODOSLOVNO-MATEMATIČKI FAKULTET

Adriana Dijanošić

ISTRAŽIVANJE INTERAKCIJA MALIH MOLEKULA S POLINUKLEOTIDIMA SPEKTROSKOPIJOM POVRŠINSKI

POJAČANOG RAMANOVOG RASPRŠENJA

DOKTORSKI RAD

Mentor: Dr. sc. Snežana Miljanić, doc.

Zagreb, 2013.

FACULTY OF SCIENCE

Adriana Dijanošić

SURFACE-ENHANCED RAMAN STUDY OF THE INTERACTIONS BETWEEN

SMALL MOLECULES AND POLYNUCLEOTIDES

DOCTORAL THESIS

Supervisor: Dr. Snežana Miljanić, Asst. Prof.

Zagreb, 2013.

iv

Ovaj rad izrađen je u Zavodu za analitičku kemiju Kemijskog odsjeka

Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu

pod vodstvom doc. dr. sc. Snežane Miljanić.

v

Zahvaljujem se mentorici doc. dr. sc. Snežani Miljanić na odabiru teme, stručnim i svim

ostalim savjetima te uloženom trudu i vremenu koje mi je posvetila pri izradi ove disertacije.

Veliko hvala dr. sc. Ivi Piantanidi na ustupljenim spojevima te svim konstruktivnim

primjedbama i ispravcima rada.

Hvala članovima Zavoda za analitičku kemiju Kemijskog odsjeka koji su na bilo koji način

pridonijeli izradi ovog rada.

Hvala mojim prijateljima, posebno Katji, na potpori i druženju.

Hvala Dominiku na beskrajnom strpljenju i ljubavi.

Veliko hvala mojoj obitelji, bratu Mariu te osobito mami i tati, koji su uvijek bili uz mene i

pružali mi neizmjernu podršku tijekom cijelog školovanja.

Ovaj rad posvećujem njima.

Zagreb, 2013.

Adriana Dijanošić

vi

Sadržaj

SAŽETAK ................................................................................................................................ ix

ABSTRACT .............................................................................................................................. x

1. UVOD .................................................................................................................................... 1

2. LITERATURNI PREGLED ............................................................................................... 3

2.1. Nukleinske kiseline ...................................................................................................................... 3

2.1.1. Otkriće DNA ......................................................................................................................... 3

2.1.2. Građa nukleinskih kiselina .................................................................................................... 4

2.1.2.1. Sparivanje baza ............................................................................................................... 7

2.1.2.2. Utori ................................................................................................................................ 8

2.1.2.3. Strukture DNA ............................................................................................................... 9

2.1.3. Funkcija nukleinskih kiselina .............................................................................................. 11

2.2. Male organske molekule kao antitumorski lijekovi ................................................................... 12

2.2.1. Vezanje antitumorskih molekula i DNA ............................................................................. 12

2.2.1.1. Interkalatori .................................................................................................................. 12

2.2.1.2. Molekule koje se vežu u utor ........................................................................................ 14

2.2.1.3. Molekule s metalom u strukturi .................................................................................... 18

2.2.2. Poliamini kao antitumorski lijekovi .................................................................................... 19

2.2.3. Metode istraživanja interakcija malih molekula s polinukleotidima ................................... 20

2.3. Površinski pojačano Ramanovo raspršenje ................................................................................ 22

2.3.1. Ramanova spektroskopija .................................................................................................... 22

2.3.2. Spektroskopija površinski pojačanog Ramanovog raspršenja ............................................. 27

2.3.2.1. Otkriće .......................................................................................................................... 27

2.3.2.2. Metalni supstrati ........................................................................................................... 27

2.3.2.3. Teorije površinskog pojačanja Ramanovog raspršenja ................................................ 29

2.3.2.3.1. Elektromagnetski mehanizam................................................................................ 29

2.3.2.3.2. Kemijski mehanizam ili mehanizam prijenosa naboja .......................................... 32

2.3.2.4. Izborna pravila i asignacija SERS spektara .................................................................. 33

2.3.2.5. Istraživanje vezanja malih molekula s DNA SERS spektroskopijom .......................... 34

3. EKSPERIMENTALNI DIO .............................................................................................. 35

3.1. Kemikalije .................................................................................................................................. 35

3.2. Istraživani spojevi ...................................................................................................................... 36

3.2.1. 4-metil-2,7-diamino-5,10-difenil-4,9-diazapirenijev hidrogensulfat (ADAP) .................... 36

3.2.2. N1-((1H-imidazol-4-il)metil)-N3-(2(bis(2-(3-((1H-imidazol-4-l)metilamino)propilami-

vii

no)etil)amino)-etil)propan-1,3-diamin (IM) i tris(8-(4'-piridil)-3,7-diazaoktil)amin (PY) .......... 36

3.2.3. N,N′-bis(3-aminopropil)-1,4-butandiamin (Sp) ................................................................... 37

3.2.4. 2,9-di[5-(2-aminoetil)-2,5,8-triaza[9]-(2,6)-piridinofan]fenantrolin (PHENPOD) i

2,6-di[5-(2-aminoetil)-2,5,8-triaza[9]-(2,6)-piridinofan]piridin (PYPOD) .................................. 37

3.3. Priprava koloidnih suspenzija srebra .......................................................................................... 38

3.3.1. Koloid 1 ............................................................................................................................... 38

3.3.2. Koloid 2 ............................................................................................................................... 38

3.3.3. Koloid 3 ............................................................................................................................... 38

3.3.4. Koloid 4 ............................................................................................................................... 39

3.4. Priprava otopina i mjernih uzoraka ............................................................................................ 40

3.4.1. Priprava uzoraka sa spojem ADAP ..................................................................................... 40

3.4.2. Priprava uzoraka sa spojevima IM i PY ............................................................................. 41

3.4.3. Priprava uzoraka sa spojem Sp............................................................................................ 42

3.4.4. Priprava uzoraka sa spojevima PHENPOD i PYPOD ....................................................... 42

3.5. Mjerni uređaji ............................................................................................................................. 44

3.5.1. Snimanje UV/VIS apsorpcijskih spektara ........................................................................... 44

3.5.2. Određivanje pH vrijednosti koloidne suspenzije ................................................................. 44

3.5.3. Snimanje koloida transmisijskom elektronskom mikroskopijom........................................ 44

3.5.4. Snimanje FT-Ramanovih i SERS spektara .......................................................................... 44

4. REZULTATI I RASPRAVA ............................................................................................. 45

4.1. Karakterizacija koloidnih suspenzija srebra ............................................................................... 45

4.1.1. Koloid 1 ............................................................................................................................... 45

4.1.2. Koloid 2 ............................................................................................................................... 47

4.1.3. Koloid 3 ............................................................................................................................... 49

4.1.4. Koloid 4 ............................................................................................................................... 51

4.2. Istraživanje interakcija spoja ADAP s DNA .............................................................................. 53

4.2.1. FT-Ramanovi spektri spoja ADAP ..................................................................................... 53

4.2.2. SERS spektri spoja ADAP .................................................................................................. 53

4.2.2.1. Odabir koloida .............................................................................................................. 53

4.2.2.2. Koncentracijska ovisnost .............................................................................................. 55

4.2.2.3. Utjecaj pufera ............................................................................................................... 58

4.2.2.4. SERS spektri smjesa spoja ADAP i DNA.................................................................... 59

4.2.2.4.1. Utjecaj priprave uzorka ......................................................................................... 59

4.2.2.4.2. Interakcije molekula ADAP i DNA ...................................................................... 60

4.3. Istraživanje interakcija spojeva IM i PY s polinukleotidima ..................................................... 63

viii

4.3.1. FT-Ramanovi spektri spojeva IM i PY ............................................................................... 63

4.3.2. SERS spektri spojeva IM i PY ............................................................................................ 65

4.3.2.1. Odabir koloida .............................................................................................................. 65


4.3.2.3. Utjecaj NaBH4 .............................................................................................................. 70

4.3.2.4. Utjecaj pufera ............................................................................................................... 72

4.3.2.5. SERS spektri smjesa spojeva IM i PY s polinukleotidima i DNA .............................. 74

4.3.2.5.1. SERS spektri smjesa spojeva IM i PY s jednolančanim RNA polinukleotidima . 74

4.3.2.5.2. SERS spektri smjesa spojeva IM i PY s dvolančanim DNA i RNA

polinukleotidima .................................................................................................................... 80

4.3.2.5.3. SERS spektri smjesa spojeva IM i PY s ct-DNA ................................................. 86

4.4. Istraživanja sa spojem Sp ........................................................................................................... 87

4.4.1. FT-Ramanovi spektri spoja Sp ............................................................................................ 87

4.4.2. SERS spektri spoja Sp ......................................................................................................... 88


4.4.2.2. SERS spektri spoja Sp s polinukleotidima i DNA ....................................................... 91

4.4.2.2.1. SERS spektri spoja Sp s jednolančanim RNA polinukleotidima .......................... 91

4.4.2.2.2. SERS spektri spoja Sp s dvolančanim DNA/RNA polinukleotidima i ct-DNA ... 93

4.5. Istraživanja sa spojevima PHENPOD i PYPOD ...................................................................... 96

4.5.1. FT-Ramanovi spektri spojeva PHENPOD i PYPOD ........................................................ 96

4.5.2. SERS spektri spojeva PHENPOD i PYPOD ..................................................................... 98

4.5.2.1. Odabir koloida .............................................................................................................. 98


4.5.2.3. Utjecaj pufera ............................................................................................................. 102

4.5.2.4. SERS spektri smjesa spojeva PHENPOD i PYPOD s polinukleotidima i ct-DNA .. 104

4.5.2.4.1. SERS spektri smjesa spojeva PHENPOD i PYPOD s jednolančanim RNA

polinukleotidima .................................................................................................................. 104

4.5.2.4.2. SERS spektri smjesa spojeva PHENPOD i PYPOD s dvolančanim DNA i RNA

polinukleotidima te ct-DNA ................................................................................................ 109

5. ZAKLJUČAK ................................................................................................................... 114

6. LITERATURNA VRELA ............................................................................................... 117

7. POPIS KRATICA I SIMBOLA ...................................................................................... 124

8. PRILOZI .............................................................................................................................. xi

9. ŽIVOTOPIS ....................................................................................................................... xiv

ix

SAŽETAK

Sveučilište u Zagrebu Doktorski rad

Prirodoslovno-matematički fakultet

Kemijski odsjek

ISTRAŽIVANJE INTERAKCIJA MALIH MOLEKULA S POLINUKLEOTIDIMA

SPEKTROSKOPIJOM POVRŠINSKI POJAČANOG RAMANOVOG RASPRŠENJA

Adriana Dijanošić

Zavod za analitičku kemiju

Kemijski odsjek

Prirodoslovno-matematički fakultet

Sveučilište u Zagrebu

Spektroskopija površinski pojačanog Ramanovog raspršenja (SERS) primijenjena je pri

istraživanju interakcija malih organskih molekula sa svojstvima interkaliranja (ADAP) i vezanja u

utore (IM, PY, Sp, PHENPOD, PYPOD) s jednolančanim RNA polinukleotidima te dvolančanim

DNA i RNA polinukleotidima. Kao metalni supstrati korištene su koloidne suspenzije srebra

pripravljene redukcijom srebrova nitrata. Istraživane male molekule intenzivno raspršuju zračenje

kada se nalaze blizu ili su vezane na nanočestice srebra. Ovisno o koncentraciji različito se orijentiraju

na površini metala, pri čemu smanjenje koncentracije do 5106

mol dm3

prati pojačanje raspršenog

zračenja spojeva ADAP, PHENPOD i PYPOD, za razliku od slabljenja raspršenja spojeva IM i PY

te Sp.

Nove vrpce u spektrima smjesa malih molekula s polinukleotidima pripisane su vibracijama

dijelova polinukleotida koji sudjeluju u interakcijama. SERS spektri smjesa poliaminskih spojeva i

jednolančanih RNA polinukleotida ukazuju na interakcije malih molekula s dušičnim bazama

polinukleotida poli A, poli G, poli C i poli U. Male molekule spojeva IM i PY vežu se u mali i veliki

utor dvostruke uzvojnice polinukleotida poli dAdT–poli dAdT, dok interakcije s dušičnim bazama

stvaraju samo u velikom utoru polinukleotida poli dGdC–poli dGdC, poli rA–poli rU te ct-DNA.

Molekule spoja Sp, koje strukturno odgovaraju aminometilenskim poveznicama u molekulama IM i

PY, vežu se na isti način s DNA/RNA polinukleotidima kao i poliaminske molekule. Molekule

složenije strukture PHENPOD i PYPOD također se vežu u oba utora dvolančanog polinukleotida

adenina i timina. Analizom SERS spektara nisu opažene interakcije s polinukleotidom gvanina i

citozina, dok se slabim interakcijama u veliki utor dvolančanog RNA polinukleotida veže samo

PHENPOD. Također je utvrđeno da molekule PHENPOD fenantrolinskim sustavom interkaliraju u

dvostruku uzvojnicu nekih DNA analoga. Smanjenje intenziteta raspršenog zračenja u spektru

kompleksa ADAP/ct-DNA ukazuje na interkaliranje spoja u uzvojnicu nukleinske kiseline.

(xvi + 124 stranica, 78 slika, 18 tablica, 138 literaturna navoda, izvornik na hrvatskom jeziku)

Rad je pohranjen u Središnjoj kemijskoj knjižnici Prirodoslovno-matematičkog fakulteta, Sveučilišta u

Zagrebu, Horvatovac 102a, Zagreb.

Ključne riječi: površinski pojačano Ramanovo raspršenje, DNA/RNA polinukleotidi, koloid srebra

Mentor: Dr. sc. Snežana Miljanić, doc., PMF

Ocjenjivači: Dr. sc. Tomica Hrenar, izv. prof., PMF

Dr. sc. Snežana Miljanić, doc., PMF

Dr. sc. Ivo Piantanida, zn. savj., IRB

Zamjena: Dr. sc. Goran Baranović, zn. savj., IRB

Rad prihvaćen: 3. travnja 2013.

x

ABSTRACT

University of Zagreb Doctoral thesis

Faculty of Science

Department of Chemistry

SURFACE-ENHANCED RAMAN STUDY OF THE INTERACTIONS BETWEEN SMALL

MOLECULES AND POLYNUCLEOTIDES

Adriana Dijanošić

Laboratory of Analytical Chemistry

Department of Chemistry

Faculty of Science

University of Zagreb

Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy (SERS) has been applied in a study of the

interactions of small organic intercalating (ADAP) and groove-binding (IM, PY, Sp, PHENPOD,

PYPOD) molecules with single stranded RNA polynucleotides and double stranded DNA and RNA

polynucleotides. Silver colloidal suspensions, prepared by reduction of silver nitrate, were used as

metal substrates. An intense scattering was obtained from the studied small molecules close to or

bound onto the silver nanoparticles. Depending on concentration the molecules adopted various

orientations on the metal surface, whereby a decrease in concentration down to 5106

mol dm3

was

followed by enhancement of the scattered radiation of ADAP, PHENPOD and PYPOD, unlike

scattering diminution of IM, PY and Sp.

New bands in the spectra of mixtures of small molecules and polynucleotides were assigned to

vibrations of polynucleotide moieties involved in interactions. SERS spectra of the polyamine

compounds with single stranded RNA polynucleotides indicated interactions of the small molecules

with the nucleic bases of the poly A, poly G, poly C and poly U polynucleotides. The small molecules

of IM and PY bound in to the minor and the major groove of the helical poly dAdT–poly dAdT

polynucleotide, while interacting with the nucleobases only in the major groove of the poly dGdC–

poly dGdC, poly rA–poly rU polynucleotides and ct-DNA. The molecules of Sp, structurally related to

aminomethylene chains of IM and PY, bound in the same way in the DNA/RNA analogs as

polyamine molecules. Molecules of more complex structure, PHENPOD and PYPOD, also bound in

both grooves of the double stranded adenine-thymine polynucleotide. Analyzing the SERS spectra,

interactions with the guanine-cytosine polynucleotide were not observed, while the weak interactions

of PHENPOD within the major groove of the double stranded RNA polynucleotide were obtained.

Phenanthroline parts of PHENPOD molecules also intercalate into helix of some DNA analogs. A

decrease in scattered radiation intensity indicated intercalation of ADAP in the nucleic acid helix.

(xvi 124 pages, 78 figures, 18 tables, 138 references, original in Croatian)

Thesis deposited in the Central Chemical Library, Faculty of Science, University of Zagreb,

Horvatovac 102a, Zagreb, Croatia.

Keywords: surface enhanced Raman scattering, DNA/RNA polynucleotides, silver colloid

Supervisor: Dr. Snežana Miljanić, Asst. Prof., PMF

Reviewers: Dr. Tomica Hrenar, Assoc. Prof., PMF

Dr. Snežana Miljanić, Asst. Prof., PMF

Dr. Ivo Piantanida, Scientific Advisor, IRB

Substitute: Dr. Goran Baranović, Scientific Advisor, IRB

Thesis accepted: 3 April 2013

1

1. UVOD

Usprkos brojnim uspješnim terapijama i liječenju, karcinom se ubraja među najčešće

uzroke smrti ljudi u svijetu.1 Većina antitumorskih lijekova, uz poželjno djelovanje na stanice

tumora, štetno djeluje na zdrave stanice tkiva. Radi toga se sintetiziraju novi spojevi,

strukturno slični onima koji imaju aktivno antitumorsko djelovanje ili se aktivne tvari

modificiraju, a sve s ciljem prepoznavanja isključivo tumorskih stanica. U stanici se aktivne

molekule najčešće vežu s deoksiribonukleinskom kiselinom što rezultira oštećenjem

nukleinske kiseline i uzrokuje smrt stanice.2 Iz tog se razloga većina istraživanja provodi u

svrhu određivanja točnog mjesta i načina vezanja poznatih lijekova i njihovih modificiranih

formi s DNA.

Osim razumijevanju mehanizama djelovanja antitumorskih i antivirusnih lijekova,

istraživanja interakcija malih molekula s deoksiribonukleinskom kiselinom (eng.

deoxyribonucleic acid, DNA) i ribonukleinskom kiselinom (eng. ribonucleic acid, RNA)

doprinose određivanju strukturnih značajki nukleinskih kiselina, pojašnjenju mutacije gena i

nastanka pojedinih bolesti.3 Pri otkrivanju načina vezanja malih organskih molekula s

polinukleotidima primjenjuju se različite spektroskopske metode: UV/VIS apsorpcijska i

fluorescencijska spektroskopija, spektroskopija linearnog i cirkularnog dikroizma,

spektroskopija nuklearne magnetske rezonancije te infracrvena i Ramanova spektroskopija.

Svaka metoda ima svoje prednosti i nedostatke te informacijama koje pruža upotpunjuje

spoznaju o interakcijama malih molekula i nukleinskih kiselina. Uz preporuku primjene

raznovrsnih metoda, osobita pažnja pridaje se onim metodama koje se mogu koristiti za

mjerenja u biološkim uvjetima. Postavlja se stoga zahtjev za osjetljivom i selektivnom

metodom koja omogućava strukturnu analizu, kako malih organskih molekula, tako i

biomakromolekula u vodenom mediju.

Spektroskopijom površinski pojačanog Ramanovog raspršenja (eng. surface-enhanced

Raman spectroscopy, SERS) opaža se vibracijski spektar specifičan za molekulu smještenu na

ili vrlo blizu neravne metalne površine.4 Adsorpcijom molekule na metalni supstrat, raspršeno

zračenje pojačava se i do milijun puta, a fluorescencija gasi, što omogućava strukturna

istraživanja molekula koje raspršuju zračenje pri mikromolarnim koncentracijama. Prednosti

spektroskopije površinski pojačanog Ramanovog raspršenja u vidu osjetljivosti i selektivnosti

te mogućnosti mjerenja sustava u vodi, nameću SERS spektroskopiju kao vrlo suvremenu

metodu pri istraživanju prepoznavanja i vezanja biomolekula.

2

Svrha ovog rada je primijeniti spektroskopiju površinski pojačanog Ramanovog

raspršenja pri istraživanju vezanja malih organskih molekula s polinukleotidima. Suspenzije

nanočestica srebra u vodi pripravljene različitim redukcijskim postupcima djelovat će kao

vodeni medij fiziološke pH vrijednosti i istovremeno omogućiti pojačanje raspršenog zračenja

molekula. Istražit će se interakcije malih molekula, koje imaju svojstvo interkaliranja i/ili

vezanja u utore, s jednolančanim i dvolančanim DNA/RNA polinukleotidima. S obzirom da

vibracijski spektri omogućavaju uvid u strukturu molekula prije i poslije interakcije, očekuje

se da će spektralne promjene ukazati na mjesto i način vezanja molekula.

3

2. LITERATURNI PREGLED

2.1. Nukleinske kiseline

Deoksiribonukleinska kiselina i ribonukleinska kiselina su biomakromolekule koje

sudjeluju u pohrani, prijenosu i ekspresiji genetičke informacije. DNA sadrži genetičke upute

neophodne za razvitak i funkcioniranje svih živih bića i nekih virusa, dok RNA sudjeluje u

sintezi proteina te u nizu drugih životno važnih procesa.

2.1.1. Otkriće DNA

DNA je prvi izolirao švicarski liječnik F. Miescher 1869. godine.5 Tijekom razgradnje

leukocita izoliranih iz sekreta otvorenih rana zamijetio je taloženje do tada nepoznate tvari.

Desetak godina kasnije A. Kossel odredio je kemijski sastav Miescherovog spoja i zaključio

da sadrži dušične baze, šećer i fosfornu kiselinu te da u stanici ne djeluje niti kao izvor

energije niti služi za pohranu energije.6 Pedesetih godina dvadesetog stoljeća E. Chargaff sa

suradnicima otkrio je da nukleinska kiselina sadrži istu količinu purinskih (adenin, gvanin) i

pirimidinskih baza (timin, citozin) te da su molarni omjeri dušičnih baza adenin/timin te

gvanin/citozin gotovo uvijek približno jednaki jedan, a međusobni omjeri svih baza bitno

različiti od jedan.7 Omjeri dušičnih baza isti su i karakteristični za pojedinu vrstu. Usporedno

s istraživanjem sastava nukleinske kiseline, pokušavala se odrediti njezina uloga u stanicama.

A. Hershey i M. Chase utvrdili su 1952. godine na temelju prethodnih istraživanja Averya,

MacLeoda i McCarthya da je DNA genetski materijal.8 Godinu dana kasnije J. D. Watson i F.

Crick predložili su strukturu DNA koji se danas smatra prvim točnim modelom dvostruke

uzvojnice nukleinske kiseline. Model su temeljili na slici DNA koju su R. Franklin i R.

Gosling snimili metodom rentgenske difrakcije u svibnju 1952. godine (Slika 2.1.1), a objavili

sljedeće godine u časopisu Nature,9 te na Chargaffovom otkriću o jednakom broju purinskih i

pirimidinskih baza. Eksperimentalni dokazi o modelu dvostruke uzvojnice DNA objavljeni su

iste godine u časopisu Nature.10,11

Watson i Crick su u svojim radovima opisivali kako su dva

lanca nukleinske kiseline međusobno antiparalelna i povezana vodikovim vezama između

dušičnih baza. Smatrali su da prilikom replikacije pucaju vodikove veze, lanci se odmotavaju

i svaki lanac služi kao kalup za stvaranje novog lanca. Ovaj model objašnjava kako se DNA

4

replicira i kako se zadržava genetska kontinuiranost. Završnu potvrdu o mehanizmu

replikacije dali su M. Meselson i F. Stahl 1958. godine istraživanjem replikacije DNA u

Escherichii coli.12

Slika 2.1.1. Rentgenski difraktogram DNA.8

Sredinom šezdesetih godina 20. stoljeća otkriveno je da se genetski kod temelji na

tripletima baza koji su nazvani kodoni. Ovo otkriće omogućilo je Holleyu, Khorani i

Nienbergu te njihovim suradnicima konačno razbijanje genetskog koda.1315

Otkrićem

strukture i uloge DNA započinje era molekularne biologije i genetike.

2.1.2. Građa nukleinskih kiselina

DNA i RNA su dugački linearni polimeri građeni od monomernih jedinica zvanih

nukleotidi. Svaki monomer se sastoji od šećera, fosfatne skupine i dušične baze.16

Deoksiribonukleinska kiselina sadrži šećer deoksiribozu (Slika 2.1.2.a). Predmetak

„deoksi“ označava da na 2' ugljikovom atomu nedostaje hidroksilna skupina, koja je prisutna

u ribozi, građevnom šećeru ribonukleinske kiseline (Slika 2.1.2.b).

(a)

(b)

Slika 2.1.2. Šećeri u nukleinskim kiselinama: a) deoksiriboza i b) riboza.

5

Molekule šećera koje grade nukleinske kiseline su β-D-stereoizomeri. Oba šećera su

derivati furanoze i nisu planarni, već u prostoru mogu postojati u dvije konformacije:

„omotnice“ i „stolice“ (Slika 2.1.3).17

Slika 2.1.3. Konformacije šećera: a) „omotnica“ i b) „stolica“.

Kada se jedan atom iz prstena nalazi izvan ravnine koju čine preostala četiri atoma,

prsten ima oblik „omotnice“. Šećer je u konformaciji „stolice“ kada se dva susjedna atoma

nalaze van ravnine, pri čemu je jedan atom iznad, a drugi ispod ravnine. Najčešće jedan od

atoma izvan ravnine odstupa od ravnine više od drugog atoma. Ako je taj atom smješten na

istoj strani kao i C4'–C5' veza šećera i dušična baza, konformacija nosi oznaku endo (Slika

2.1.4). Ako je atom na suprotnoj strani, konformacija se označava exo. U živim organizmima

šećer u DNA nalazi se u endo konformaciji.17

Veza između šećera i dušične baze naziva se glikozidna veza. Za purinske baze vezane

na šećer glikozidni torzijski kut definiran je s četiri atoma O4'–C1'–N9–C4, a za pirimidinske

baze s O4'–C1'–N1–C2 (Slika 2.1.4).18

Glikozidni torzijski kut poprima anti konformaciju

kada su N1–C2 veza purina, odnosno C2–N3 veza pirimidina, usmjerene nasuprot prstenu

šećera (Slika 2.1.4.a). Veze dušičnih baza orijentirane na strani šećera čine sin konformaciju

(Slika 2.1.4.b).

(a) (b)

Slika 2.1.4. Konformeri deoksigvanidina: a) C2'-endo/anti i b) C3'-endo/sin.18

6

Molekule šećera su međusobno povezane dvjema fosfoesterskim vezama preko 5'O i

3'O atoma. Pri pH medija većem od 7 fosfati su dvostruko negativno nabijeni, a pri pH

manjem od 7 nose samo jedan negativan naboj.19

Dakle, okosnica nukleotida koju čine fosfati

i šećeri je negativno nabijena u fiziološkim uvjetima te je uvijek prisutna određena količina

kationa koji ju neutraliziraju.

Dušične baze su planarne aromatske heterocikličke molekule koje se dijele u dvije

skupine, purinske i pirimidinske, ovisno o molekuli čiji su derivati (Slika 2.1.5).20

Purinske

baze adenin (A) i gvanin (G) te pirimidinska baza citozin (C) grade i DNA i RNA, dok se

pirimidinska baza timin (T) nalazi samo u DNA, a RNA umjesto timina sadrži uracil (U).

Timin i uracil se razlikuju prema metilnoj skupini na C5 atomu prstena koja izostaje u

strukturi uracila.

Slika 2.1.5. Dušične baze u nukleinskim kiselinama.20

Dušična baza vezana sa šećerom čini nukleozid, dok nukleotid podrazumijeva da je na

šećer uz bazu vezana i jedna ili više fosfatnih skupina (Slika 2.1.6).18

Vezanjem većeg broja

nukleotida nastaje polinukleotid. U dvostrukoj uzvojnici smjer nukleotida u jednom lancu

suprotan je smjeru nukleotida u drugom lancu, odnosno lanci su antiparalelni. Asimetrični

završeci DNA nazivaju se 5' kraj i 3' kraj. Kada se na 5' kraju nalazi fosfatna skupina, a na 3'

kraju hidroksilna skupina, takav polinukleotid se naziva 5' nukleotid (Slika 2.1.6.c).

7

Slika 2.1.6. Strukture nukleozida: a) adenozina, rA, i b) deoksicitidina, dC, te nukleotida:

c) 5' nukleotida, pN, i d) 3' nukleotida, Np.18

U živim organizmima DNA se sastoji od dva polinukleotidna lanca koji se uvijaju

jedan oko drugoga i oko zajedničke osi u suprotnim smjerovima te stvaraju oblik dvostruke

uzvojnice.11

Fosfatna okosnica je zajedno s vezanim šećerima smještena s vanjske strane, dok

dušične baze leže unutar uzvojnice. Polarnija površina izložena je tako okolnom mediju

(vodi), dok su nepolarni dijelovi smješteni unutar uzvojnice.19,21

Dvostruka uzvojnica je

stabilna zbog vodikovih veza između komplementarnih dušičnih baza te aromatskog slaganja

baza. Interakcije koje nastaju uslijed vertikalnog privlačenja susjednih parova baza prilično su

slabe, no s obzirom na velik broj parova dušičnih baza u uzvojnici, značajno doprinose

stabilizaciji molekule DNA.

2.1.2.1. Sparivanje baza

Dva lanca polinukleotida povezana su međusobno vodikovim vezama između dušičnih

baza. Chargaffovo otkriće o jednakim omjerima adenina i timina te citozina i gvanina navelo

je Watsona i Cricka na ideju o međusobnom sparivanju purinskih i pirimidinskih baza

antiparalelnih lanaca. Opisani proces naziva se komplementarno sparivanje baza.11,22

Purinske

baze stvaraju vodikove veze s pirimidinskim bazama, točnije, adenin se komplementarno veže

s timinom, a gvanin s citozinom (Slika 2.1.7). Par baza adenin i timin povezan je dvjema

8

vodikovim vezama, dok su gvanin i citozin povezani trima vodikovim vezama. Kao rezultat

komplementarnog sparivanja sve informacije sadržane u slijedu dvostruke uzvojnice DNA su

duplicirane na svakom lancu, što je od velike važnosti u replikaciji DNA.

(a) (b)

Slika 2.1.7. Komplementarno sparivanje baza: a) adenin-timin i b) gvanin-citozin.22

Pri sparivanju baza ribonukleinske kiseline adenin se komplementarno sparuje s

uracilom dvjema vodikovim vezama.22

Pojedinačne baze u jednom lancu su planarne, no parovi baza, a shodno tome i baze

svakog para iz svakog lanca posjeduju određenu fleksibilnost. Ova fleksibilnost više ovisi o

okolini u kojoj se parovi baza nalaze, nego o samoj njihovoj prirodi.19

2.1.2.2. Utori

Neovisno o sastavu dušičnih baza, svaka dvostruka uzvojnica ima utore koji nastaju

uvijanjem antiparalelnih polinukleotidnih lanaca, a dijele se na veliki i mali utor (Slika 2.1.8).

Utori su nejednake veličine radi toga što glikozidne veze nisu dijametralno suprotne jedna

drugoj pa svaki par baza ima veću stranu koja definira veliki utor i manju stranu koja

predstavlja mali utor.19

U malom utoru se uvijek nalazi O2 atom pirimidinske baze te N3

atom purinske baze koje čine par, dok su u velikom utoru smješteni heteroatomi suprotne

strane para. Metilna skupina timina nalazi se u velikom utoru.

U svakom utoru postoje mjesta za nastajanje vodikovih veza, koja uključuju bilo

vodikov atom vezan na elektronegativan atom bilo odgovarajući heteroatom. Zahvaljujući

upravo vodikovim vezama ostvaruju se specifične interakcije s molekulama koje se vežu u

utore nukleinske kiseline. Na Slici 2.1.8 crvene strelice upućuju na atome koji mogu

sudjelovati u vodikovoj vezi kao akceptori vodika, dok su plavim strelicama označene amino

9

skupine koje doniraju vodik pri stvaranju vodikovih veza. U malom utoru N3 atom adenina ili

gvanina i O2 atom timina ili citozina mogu djelovati kao akceptori vodika, dok amino skupina

vezana na C2 atom gvanina može donirati vodik. U velikom utoru N7 atom gvanina ili

adenina je potencijalni akceptor vodika, kao i O4 atom timina te O6 atom gvanina, dok se kao

donori vodika ponašaju amino skupine vezane na C6 atom adenina i C4 atom citozina.

(a) (b)

Slika 2.1.8. Utori nastali prilikom sparivanja a) adenina i timina te b) gvanina i citozina.

2.1.2.3. Strukture DNA

DNA se javlja u različitim strukturnim oblicima, od kojih su najvažniji A-DNA, B-

DNA te Z-DNA (Slika 2.1.9).

B-DNA je najučestaliji strukturni oblik u kojoj se DNA nalazi u stanicama živih

bića.11

B-DNA je desna uzvojnica, čiji je glikozidni kut okosnice anti orijentacije, a šećer

deoksiriboza C2'-endo konformacije.18

U B-DNA su baze položene gotovo okomito na os

uzvojnice, međusobno su udaljene 3,4 Å i zakrenute jedna u odnosu na drugu za 36º. S

obzirom da se struktura uzvojnice ponavlja svakih 34 Å i puni okretaj iznosi 360º, zavojnica

sadrži 10 parova baza po okretaju. Promjer uzvojnice B-DNA iznosi 20 Å, a veliki utor je

širok i gotovo jednako dubok kao uži mali utor.

A-DNA je također desna uzvojnica, no šira i kraća od B-strukture.19

Razlike u

strukturnim značajkama A-DNA u odnosu na B-DNA proizlaze iz činjenice da je u A-DNA

šećer C3'-endo konformacije, za razliku od C2'-endo konformacije šećera u B-DNA.

10

Navedena konformacija šećera u A-DNA uzrokuje slaganje parova baza pod kutom od 19º u

odnosu na okomiti položaj prema okosnici. Veliki utor A-DNA je dubok i uzak, dok je mali

širok i vrlo plitak.

U strukturi Z-DNA fosfati u okosnici su naizmjence poredani, te je takva struktura

nestabilna i nastaje samo kratkotrajno tijekom procesa transkripcije.23

Z-DNA je lijeva

uzvojnica čiji je veliki utor dubok i uzak, a mali utor vrlo plitak. Konformacija šećera i

glikozidni torzijski kut ovise o dušičnoj bazi na koju su vezani. U slučaju gvanina kut ima syn

orijentaciju, a šećer C3'-endo konformaciju, dok je za ostale baze glikozidni kut anti

orijentacije, a šećer C2'-endo konformacije.

Slika 2.1.9. Strukture: a) A-DNA, b) B-DNA i c) Z-DNA.

18

11

2.1.3. Funkcija nukleinskih kiselina

Glavna uloga molekule DNA je dugotrajno pohranjivanje informacija potrebnih za

sintezu pojedinih dijelova stanice, kao što su proteini i molekule RNA.16

Genetska

informacija u DNA je sačuvana u slijedu dušičnih baza duž lanca nukleinske kiseline. Parovi

baza omogućavaju kopiranje genetske informacije procesom replikacije postojeće nukleinske

kiseline pri čemu nastaje novi lanac DNA. Dijelovi molekule DNA koji nose genetske

informacije nazivaju se genima.24

Ostali dijelovi DNA imaju strukturnu ulogu ili su uključeni

u kontrolu sinteze RNA.

Eukariotski organizmi pohranjuju većinu svoje DNA u jezgri stanice, a manji dio u

staničnim organelama poput mitohondrija i kloroplasta. Za razliku od njih, prokarioti

pohranjuju svoju DNA isključivo u citoplazmi. Unutar stanice DNA je smještena u nitaste

strukture zvane kromosomi. U kromosomu se nalaze proteini poput histona koji zbijaju i

motaju molekulu DNA.25

Transkripcijom DNA u stanici dolazi do nastajanja jednolančane molekule RNA.16

U

stanici postoje četiri vrste RNA molekula koje imaju različite funkcije, a to su: ribosomska

RNA (eng. ribosomal RNA, rRNA), prijenosna RNA (eng. transfer RNA, tRNA), glasnička

RNA (eng. messenger RNA, mRNA) i male jezgrine RNA (eng. small nuclear RNA, snRNA).

Najbrojnija je rRNA, koja čini oko 80 % ukupne RNA u stanici. Sastavni je dio ribosoma, te

čini glavnu komponentu na kojoj se odvija proces sinteze proteina (translacija). Oko 15 %

ukupne RNA čini tRNA. Ona sudjeluje u prijenosu aktiviranih aminokiselina do ribosoma

gdje dolazi do sinteze proteina. mRNA čini tek oko 5 % ukupne RNA, a služi kao kalup za

sintezu proteina u procesu translacije. U snRNA ubrajaju se male RNA molekule koje se

nalaze u jezgri. Imaju ulogu u nizu važnih procesa, kao što su procesiranje mRNA i

održavanje krajeva kromosoma (telomera).

12

2.2. Male organske molekule kao antitumorski lijekovi

U svrhu razumijevanja načina na koji djeluju lijekovi i njihovog utjecaja na strukturu i

funkciju nukleinske kiseline, istraživanja interakcija malih aktivnih molekula i DNA sve su

intenzivnija. Pri otkrivanju načina vezanja i utvrđivanju selektivnosti malih molekula, koriste

se oligo i polinukleotidi kontrolirane strukture i poznatog slijeda dušičnih baza.

2.2.1. Vezanje antitumorskih molekula i DNA

Biološki aktivne tvari koje se koriste kao antitumorski lijekovi mogu djelovati na

DNA na tri različita načina.3 Prvi način je interakcijom s proteinima, kao što su transkripcijski

faktori i polimeraze, koji se vežu s DNA.26

Drugi način je vezanjem s ribonukleinskom

kiselinom, nakon čega se nastali kompleks veže s DNA, te nastali hibrid DNA-RNA ometa

proces transkripcije.27

Treći način je neposrednim vezanjem kao ligandi u dvostruku

uzvojnicu DNA. Male molekule koje se vežu poput liganada s DNA dijele se u nekoliko

skupina, ovisno o mjestu i načinu vezanja te svojoj strukturi.3 Prema tome postoje molekule

koje se vežu u utore,28

molekule koje se umeću između parova baza (interkalatori),29

molekule

koje se kovalentno vežu s DNA30

i molekule čije vezanje uzrokuje kidanje lanca DNA.2

Molekule koje sadrže metal u strukturi zasebna su skupina spojeva, a s DNA mogu ostvarivati

i kovalentne i nekovalentne interakcije.31

Interkaliranje i vezanje u utore načini su povratnog

vezanja malih molekula, dok se nastajanjem kovalentnih veza molekule nepovratno vežu s

DNA.

2.2.1.1. Interkalatori

Interkaliranje kao način vezanja malih molekula s DNA prvi je predložio L. Lerman

1961. godine istražujući derivate akridina.32

Klasični interkalatori su molekule koje sadrže

nezasićene aromatske prstenove.33

Tipični primjeri interkalatora su akridinske soli, poput

proflavin klorida, te fenantridinski spojevi, kao što su etidijev bromid i propidijev jodid (Slika

2.2.1).

13

(a) (b) (c)

Slika 2.2.1. Molekulske strukture interkalatora: a) proflavin klorida, b) etidijevog bromida i c)

propidijevog jodida.33

Planarni aromatski sustavi umeću se između parova baza i pri tome ne ometaju

vodikove veze između komplementarnih dušičnih baza. Interkaliranje se zbiva po principu

isključenja najbližeg susjeda, prema kojem i pri suvišku liganda svako drugo potencijalno

mjesto za interkaliranje u zavojnici ostaje prazno. Princip isključenja najbližeg susjeda može

se ilustrirati na primjeru interkalatora diterkalina.34

Iako je poveznica između dva dijela

molekule diterkalina koji se interkaliraju u DNA dovoljno fleksibilna da omogućava umetanje

planarnih dijelova između susjednih parova baza, vezanje jednog aromatskog sustava

isključuje mogućnost vezanja drugog aromatskog sustava na susjedno mjesto (Slika 2.2.2).

Slika 2.2.2. a) Struktura diterkalina. b) Vezanje diterkalina u DNA fragment d(CGCG)2.33

(a) (b)

14

Interkalatori se približavaju mjestu vezanja u dvostrukoj uzvojnici kroz utore.

Dvostruko interkaliranje diterkalina zbiva se kroz veliki utor, dok se ranije navedeni spojevi

(proflavin klorid, etidijev bromid, propidijev jodid) interkaliraju kroz mali utor DNA.

Interkaliranje se smatra posljedicom aromatskog slaganja molekula s dušičnim bazama

molekule DNA. Stabilnost kompleksa se povećava kada je aromatski interkalator pozitivno

nabijen. Osim aromatskih i elektrostatskih interakcija, vodikove veze te prijenos naboja

također zadržavaju interkalator na veznom mjestu.35

Interakcije aromatskog slaganja baza

uzrokuju batokromne pomake u elektronskim apsorpcijskim spektrima kompleksa navedenih

interkalatora s DNA.36

Interkaliranje karakterizira mala selektivnost prema različitim sljedovima dušičnih

baza. Međutim, poznato je da se interkalatori radije vežu u YpR nego RpY, pri čemu je Y

pirimidinska baza, a R purinska baza, radi lakše dostupnog veznog mjesta.37

Vezanje

pojedinih interkalatora u DNA uzrokuje strukturne promjene uzvojnice, pri čemu se mijenja

konformacija šećera deoksiriboze iz C2'-endo u C3'-endo, a struktura DNA iz B u A.38

Interkaliranjem molekula produljuje se lanac DNA i mijenjaju kiralna svojstva.39

Osim navedenih strukturno jednostavnih interkalatora, poznati su i spojevi složenije

strukture koji se također interkaliraju između parova baza, ali se zbog veličine i oblika neki

dijelovi molekule smještaju i u utore.40

Interkalatori se većinom koriste kao antivirusni lijekovi i antibiotici,41

no neki od njih

imaju i antitumorska svojstva.42

2.2.1.2. Molekule koje se vežu u utor

Prirodni i sintetski spojevi koji se vežu u mali utor DNA tema su brojnih istraživanja

interakcija malih molekula s DNA s obzirom na njihovu biološku aktivnost i potencijalna

antitumorska svojstva. Na temelju svog kemijskog sastava molekule koje se vežu u utore

dijele se u nekoliko skupina.43

Tako se razlikuju polipiroli, čiji su najznačajniji predstavnici

distamicin A i netropsin, zatim bis(benzimidazoli) koje predstavlja Hoechst 33258,

bis(fenilamidini) u koje se ubrajaju berenil i DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) te mnogi

drugi.

Spoznajama o načinu djelovanja tvari koje ostvaruju interakcije s DNA vezanjem u

mali utor najviše su doprinijela istraživanja polipirolnih antibiotika distamicina A i netropsina

(Slika 2.2.3).44

15

(a) (b)

Slika 2.2.3. Molekulske strukture a) netropsina i b) distamicina A.44

Netropsin je izoliran iz bakterije Streptomyces netropsis i dokazano posjeduje

antivirusno i antitumorsko djelovanje. Sastoji se od niza pirolnih jedinica povezanih amidnim

vezama koje završavaju s jednim ili više pozitivno nabijenih dušikovih atoma. Distamicin je

tri-N-metilpirolni analog netropsina izoliran iz bakterije Streptomyces distamyces.

Veliki broj molekula koje se vežu u utore preferira dijelove DNA bogate AT

sljedovima.45

Uz netropsin i distamicin, u tu skupinu ubrajaju se i Hoechst 33258, DAPI te

mnogi drugi. Sve navedene molekule imaju sličnu strukturu, aromatske prstenove koji čine

zakrivljen središnji dio molekule te pozitivno nabijene skupine i donore vodika na

konveksnom kraju. Zahvaljujući upravo svom zakrivljenom obliku koji odgovara strukturi

dvostruke uzvojnice DNA, ovi spojevi mogu stvarati interakcije s malim utorom B-DNA.

Radi navedenog se distamicin A, netropsin i njihovi derivati nazivaju molekulama koje se

vežu na temelju selektivnosti prema obliku.46

Duboki i uski mali utor adenin-timin parova

baza, bez ometajuće amino skupine gvanina, osigurava idealne uvjete za vezanje molekule i

maksimalnu stabilizaciju van der Waalsovim silama, kao i nizom drugih tipova interakcija

poput hidrofobnih efekata i sl. Vodikove veze između DNA baza u utoru i niza H-donorskih i

H-akceptorskih skupina malih molekula (npr. amidnih, heterocikličnih atoma itd.) te

elektrostatske interakcije fosfatnih skupina okosnice s pozitivno nabijenim skupinama

(protoniranim alifatskim aminima, gvanidinijevim ili amidinijevim derivatima i sl.) dodatno

doprinose stabilizaciji kompleksa ligand-DNA i značajno utječu na selektivnost male

molekule prema određenim sljedovima nukleobaza.

Tako na primjer, ovisno o slijedu baza u DNA, stehiometrija vezanja distamicin:DNA

može biti 1:1 ili 2:1. Primjerice, distamicin će se vezati u omjeru 1:1 ako se u malom utoru

nalaze četiri para baza AT. Kada je u utoru smješteno pet parova baza AT ili četiri para baza

AT i jedan par baza GC, dvije molekule distamicina s nabijenim skupinama na suprotnim

16

stranama smjestit će se u isti utor.47

S obzirom da svaki od tri pirolna prstena tvori

nekovalentne interakcije jednim parom baza, a tako i svaki supstituent na krajevima molekule,

logično je očekivati da će kompleks 2:1 nastajati samo onda kada se slijed sastoji od pet ili

više AT parova baza (Slika 2.2.4).

Slika 2.2.4. Shema vezanja distamicina u mali utor DNA.45

Dvije molekule netropsina ne mogu se paralelno orijentirati jedna u odnosu na drugu

zbog elektrostatskog odbijanja pozitivno nabijenih krajeva molekule. Iz tog se razloga

netropsin veže s DNA samo u omjeru 1:1 (ref. 47). Isto vrijedi za sve molekule koje imaju

pozitivan naboj na oba kraja molekule (primjerice DAPI). Dakle, vodikove veze, van der

Waalsove sile i elektrostatske interakcije između oligopeptidnih pirolkarbamidnih struktura

koje završavaju amidino skupinama i dvostruke uzvojnice omogućavaju vezanje u područja

DNA bogata adenin-timin parovima baza.43

Analozi distamicina koji sadrže više pirolnih

jedinica u strukturi specifični su za duže AT slijedove zbog većeg broja vodikovih veza i van

der Waalsovih sila.48

Iako u svojoj strukturi ne sadrži pirolne prstenove, Hoechst 33258 također se

selektivno veže u mali utor DNA kojeg čine adenin-timin parovi baza (Slika 2.2.5). Pri tome

se planarne benzimidazolne skupine orijentiraju paralelno smjeru utora, a svaki dušikov atom

sudjeluje u vodikovim vezama s AT parovima baza, slično vezanju netropsina.49

17

Slika 2.2.5. Molekulska struktura Hoechsta 33258.

44

Stehiometrija vezanja Hoechsta 33258 s DNA također je ovisna o slijedu parova baza i

može biti 1:1 i 2:1, ali se vezanje molekula ostvaruje na drugačiji način nego u slučaju

distamicina. Pri omjeru Hoechst 33258:DNA 2:1 dvije molekule liganda smještaju se svaka u

svoj utor, a okrenute su jedna prema drugoj N-metilpiperizinskim skupinama (Slika 2.2.6).50

Slika 2.2.6. Vezanje Hoechsta 33258 s DNA u omjeru 2:1.

50

DAPI je primjer molekule koja se zahvaljujući svojoj strukturi i veličini, a ovisno o

slijedu parova baza, veže na različite načine s DNA (Slika 2.2.7).

Slika 2.2.7. Struktura molekule DAPI.45

18

Postojeći aromatski sustav u strukturi omogućava torziju molekule u konformaciju koja

nalikuje spiralnom okretaju DNA utora. Utvrđeno je da način interakcije spoja DAPI s DNA

ovisi o slijedu parova baza. Dakle, DAPI se veže u mali utor kada se u njemu nalaze tri ili više

uzastopnih AT parova baza, dok se pri manjem broju parova baza AT u utoru te u gotovo

čistom slijedu GC parova baza DAPI interkalira u DNA.51

Iz navedenih primjera vidljivo je

da molekule koje se vežu u utore polinukleotida pokazuju izrazitu selektivnost prema

određenim sljedovima parova dušičnih baza, za razliku od interkalatora.52

Stoga se takve

molekule koriste pri prepoznavanju sljedova parova baza u polinukleotidima.45,53

2.2.1.3. Molekule s metalom u strukturi

Kompleksi metala mogu stvarati interakcije s dvostrukom uzvojnicom DNA na dva

načina: kovalentno i nekovalentno.54

Interkaliranje uključuje nekovalentne interakcije i jedan

je od najčešćih načina vezanja ovih molekula. Na interkaliranje kompleksa metala utječu

planarnost liganda i geometrija koordinacije te vrsta atoma donora u ligandu i metala koji je

koordiniran.55

Smatra se da biološka aktivnost kompleksa metala koji imaju antitumorsko

djelovanje isključivo ovisi o njihovoj sposobnosti da se vežu s DNA, oštete dvostruku

uzvojnicu i na taj način ometaju njezinu funkciju.56

S obzirom da interkalatori većinom nisu

selektivni prema sljedovima parova baza, istraživanja su usmjerena na sintezu molekula koje

sadrže metalni ion u strukturi, a vežu se u utore DNA, čime se povećava selektivnost prema

određenom slijedu dušičnih baza u polinukleotidima.

Iako se cisplatin (cis-Pt(NH3)2Cl2) i karboplatin ubrajaju među najuspješnije

antitumorske lijekove u povijesti kemoterapija,57

izazivaju nuspojave, nisu specifični i

toksični su prema zdravim stanicama.58

Iz tog razloga proučavaju se brojni kompleksi

različitih metala koji bi trebali uzrokovati manje nepoželjnih popratnih pojava, a imati širi

spektar antitumorskog djelovanja. Uz komplekse platine,59

istražuju se i koordinacijski

spojevi rodija,60

rutenija,61

kadmija,54

bakra,54

cinka62

i drugih metala, a sve u svrhu

pronalaska aktivnijeg i selektivnijeg antitumorskog lijeka.

19

2.2.2. Poliamini kao antitumorski lijekovi

Male molekule koje vrlo lako ostvaruju interakcije s DNA najčešće su poliamini po

svom kemijskom sastavu. Biogene poliamine sintetiziraju žive stanice. To su linearne

molekule male molekulske mase koje su u fiziološkim uvjetima pozitivno nabijene.63

Poliamini, poput putrescina, spermidina i spermina, koji potječu od arginina i ornitina,

metabolički su regulatori proliferacije i diferencijacije stanice (Slika 2.2.8.ac). Među

biogene poliamine ubraja se i histamin (Slika 2.2.8.d). Interakcijom sa specifičnim

receptorima stanične membrane histamin sudjeluje u brojnim biološkim procesima.64

(a)

(b)

(c)

(d)

Slika 2.2.8. Molekulske strukture a) putrescina, b) spermidina, c) spermina i d) histamina.63,64

Na izravnim interakcijama poliamina i nukleinskih kiselina temelje se pojedine

biološke funkcije poliamina.65

Vezane poliaminske molekule stabiliziraju konformaciju DNA

i na taj način ju štite od pucanja lanca uslijed djelovanja vanjskih čimbenika.66

Međutim,

priroda vezanja poliamina i nukleinskih kiselina još uvijek nije sasvim poznata.67

Smatra se

da se poliaminske molekule vežu elektrostatskim interakcijma s DNA/RNA analozima, no

djeluju i na mnoge različite načine na nukleinske kiseline.68

Tumorske stanice koriste biogene poliamine u puno većim količinama nego što to čine

zdrave stanice,69

što čini poliamine dobrim kandidatima za sintezu novih antitumorskih

20

lijekova ili za poboljšanje aktivnosti postojećih antitumorskih lijekova.70

Iz tog se razloga sve

intenzivnije istražuju načini i specifična mjesta vezanja biogenih poliamina s DNA i RNA

polinukleotidima.71

Jedan od najvećih nedostataka antitumorskih terapija je djelovanje citotoksičnih

lijekova na zdrave stanice. Stoga je potrebno antitumorske lijekove učiniti selektivnima.

Selektivnost se postiže modifikacijom osnovne molekule koja pokazuje antitumorska

svojstva, primjerice uvođenjem alifatskog supstituenta u aromatsku strukturu već poznatih

interkalatora72

ili sintezom spojeva strukturno vrlo sličnih spojevima poznatog antitumorskog

djelovanja.73

2.2.3. Metode istraživanja interakcija malih molekula s polinukleotidima

Pri istraživanju interakcija malih organskih molekula i nukleinskih kiselina

primjenjuju se različite analitičke metode.3 Najčešće se koriste metode optičke spektroskopije

(apsorpcijska i fluorescencijska spektroskopija, spektroskopija linearnog i cirkularnog

dikroizma), spektroskopija nuklearne magnetske rezonancije, metode vibracijske

spektroskopije (infracrvena i Ramanova spektroskopija), spektrometrija masa te kapilarna

elektroforeza, gel elektroforeza, viskozimetrija, difrakcija kristala x-zrakama, SPR i niz

drugih metoda.74

Spektrofotometrijskim metodama određuje se konstanta stabilnosti kompleksa nastalih

vezanjem malih organskih molekula s polinukleotidima.75

S obzirom da su promjene u

apsorpcijskim spektrima molekula, poput batokromnog efekta i hipokromnog pomaka,

posljedica interkaliranja molekula u uzvojnicu DNA, primjenom UV/VIS apsorpcijske

spektroskopije može se utvrditi način vezanja molekule. Nadalje, na temelju vrpci koje se

opažaju u spektrima linearnog i cirkularnog dikroizma kompleksa malih molekula s

nukleinskim kiselinama, mogu se razlikovati interkalatori od molekula koje se vežu u utore.

Ovim metodama, međutim, ne može se odrediti točno vezno mjesto u DNA.76

Iako se i spektrometrijom masa mogu razlikovati načini vezanja malih molekula s

polinukleotidima, informacije o točnom mjestu vezanja malih molekula i strukturi kompleksa

nastalog vezanjem molekule s DNA izostaju.77

Spektroskopijom nuklearne magnetske rezonancije mogu se identificirati molekule

vrlo slabo vezane s DNA, s obzirom da interakcija s elektromagnetskim zračenjem ne

21

uzrokuje kidanje niti najslabijih veza. Ovom metodom može se odrediti točan slijed baza u

veznom mjestu DNA.51

Pri istraživanju sljedova polinukleotida na koje se preferirano vežu male molekule,

bilo da se interkaliraju u polinukleotidnu uzvojnicu ili se vežu u utore, često se koristi i

kapilarna elektroforeza.78

Iako metode vibracijske spektroskopije omogućavaju uvid u molekulsku strukturu

antitumorskih spojeva,79,80

primjena infracrvene (IR) i Ramanove spektroskopije pri

proučavanju interakcija malih molekula i polinukleotida prilično je ograničena. Voda jako

apsorbira infracrveno zračenje i tako čini IR spektroskopiju nepogodnom za istraživanje

sustava u vodenom mediju, dok Ramanovu spektroskopiju, osim zahtjeva za visokom

koncentracijom analita, otežava i fluorescencija molekula.81

S obzirom da se istraživanja

vezanja potencijalnih antitumorskih lijekova s DNA provode u biološkim uvjetima, a voda

slabo raspršuje zračenje, osjetljiva i selektivna metoda koja se temelji na Ramanovom

raspršenju nalazi svoju primjenu. Spektroskopijom površinski pojačanog Ramanovog

raspršenja raspršeno zračenje pojačava se i do milijun puta u odnosu na normalno Ramanovo

raspršenje i gasi se fluorescencija, što omogućava istraživanja strukture molekula pri niskim

koncentracijama u vodenim otopinama.4 SERS spektroskopija nameće se stoga kao vrlo

atraktivna metoda pri istraživanju prepoznavanja i vezanja biomolekula.

22

2.3. Površinski pojačano Ramanovo raspršenje

2.3.1. Ramanova spektroskopija

Ramanova spektroskopija je metoda vibracijske spektroskopije koja se primjenjuje pri

istraživanju strukture molekula.81

Razvoj Ramanove spektroskopije započinje 1923. godine

kada je A. Smekal opisao fenomen neelastičnog raspršenja zračenja. Njegovu teoriju su C. V.

Raman i K. S. Krishnan 1928. godine i eksperimentalno dokazali. Izveli su pokus u kojem su

teleskopom na tekući uzorak fokusirali sunčevu svjetlost, a raspršeno zračenje sakupljali

drugom lećom, smještenom u blizini uzorka. Sustavom optičkih filtera utvrdili su da se

frekvencija raspršenog zračenja razlikuje od frekvencije upadnog zračenja.

Djelovanjem elektromagnetskog zračenja tvar može apsorbirati zračenje, reflektirati,

raspršiti ga ili zračenje može proći kroz uzorak bez interakcije.82

U IR spektroskopiji energija

upadnog infracrvenog zračenja mora odgovarati razlici energije dvaju vibracijskih stanja da bi

molekula apsorbirala fotone i prešla iz osnovnog u više vibracijsko stanje. Nakon prolaska

zračenja kroz uzorak detektira se smanjenje intenziteta upadnog zračenja. Za razliku od IR

spektroskopije, Ramanova spektroskopija koristi pobudno zračenje samo jedne frekvencije, a

detektira se raspršeno zračenje čija se energija razlikuje od energije pobudnog zračenja.

Prilikom raspršenja zračenja nije nužno da upadni fotoni imaju energiju koja odgovara razlici

između dva vibracijska stanja molekule. Stoga izvori zračenja koji se koriste u Ramanovoj

spektroskopiji mogu emitirati zračenje ultraljubičastog (UV), vidljivog (VIS) ili bliskog

infracrvenog (NIR) područja.83,84

Interakcija elektromagnetskog vala s molekulom može uzrokovati distorziju

elektronskog oblaka oko jezgre, pri čemu elektroni prelaze u više energijsko stanje.82

Nastalo

energijsko stanje ne odgovara niti jednom stvarnom elektronskom stanju molekule, i budući

da je nestabilno, zračenje se vrlo brzo otpušta u obliku raspršenog zračenja Takvo

kratkoživuće stanje molekule često se naziva virtualno stanje.85

Distorzija elektronskog

oblaka ovisi o količini energije prenesene na molekulu, a energija virtualnog stanja o energiji

pobudnog zračenja, odnosno frekvenciji lasera.

Poznata su dva načina raspršenja zračenja: Rayleighovo i Ramanovo raspršenje.82

Najintenzivnije raspršenje je Rayleighovo raspršenje. Ono se zbiva prilikom interakcije

upadnog zračenja i elektronskog oblaka pri kojoj se jezgre atoma ne pomiču. To je elastični

proces tijekom kojeg nema značajnijeg prijenosa energije, dakle raspršeni fotoni su iste

energije kao i upadni fotoni. U odnosu na Rayleighovo raspršenje, Ramanovo raspršenje

23

rijetko se događa, s obzirom da se samo jedan od 106–10

8 upadnih fotona neelastično rasprši.

Ono se zbiva kada se interakcijom upadnog zračenja s oblakom elektrona potakne i gibanje

jezgara. S obzirom da jezgre atoma imaju znatno veću masu od elektrona, energija raspršenog

zračenja značajno se mijenja. Ovisno o tome da li se interakcija zračenja i molekule događa

kada se ona nalazi u osnovnom ili pobuđenom vibracijskom stanju, razlikuju se dvije vrste

Ramanovog raspršenja.86

Pri sobnoj temperaturi većina molekula nalazi se u osnovnom

vibracijskom stanju. Interakcijom s upadnim zračenjem prelaze u virtualno stanje, u kojem se

vrlo kratko zadržavaju, te se vraćaju u pobuđeno vibracijsko stanje. Pri povratku u pobuđeno

vibracijsko stanje raspršuju zračenje manje energije, odnosno veće valne duljine od upadnog

zračenja. Opisano raspršenje naziva se Stokesovo raspršenje koje se uobičajeno mjeri u

Ramanovoj spektroskopiji. Manji broj molekula, međutim, nalazi se u pobuđenom

vibracijskom stanju, i one se, nakon pobude u virtualno stanje, vraćaju u osnovno vibracijsko

stanje. Raspršeni fotoni u tom slučaju imaju veću energiju, odnosno manju valnu duljinu od

upadnih fotona, a opisano Ramanovo raspršenje naziva se anti-Stokesovo raspršenje. I

Stokesov i anti-Stokesov spektar sadrže iste informacije o energijama vibracija.

Procesi elastičnog i neelastičnog raspršenja mogu se promatrati i objasniti s klasičnog i

kvantno-mehaničkog stajališta.81,86

Prema klasičnoj teoriji, upadno zračenje deformira

elektronski oblak pri čemu se inducira električni dipolni moment. Mjera fleksibilnosti

elektronskog oblaka oko jezgre, odnosno lakoće kojom se elektronski oblak može polarizirati

pod utjecajem vanjskog električnog polja naziva se polarizabilnost. Polarizabilnost molekule

povezana je s induciranim dipolnim momentom prema izrazu (2.3.1)

µ = αE (2.3.1)

gdje μ označava inducirani dipolni moment, α polarizabilnost, a E jakost električnog polja.

Električno polje ovisi o frekvenciji upadnog zračenja prema (2.3.2)

E = E0cos(2πc t ) (2.3.2)

gdje je E0 jakost električnog polja upadnog zračenja, c brzina svjetlosti (u vakuumu, c = c0 =

2,99792458 × 108 m s

1), valni broj upadnog zračenja, a t vrijeme.

24

Polarizabilnost α se mijenja s vibracijskim gibanjem prema izrazu (2.3.3)

α = α0 + βcos(2πc kt) (2.3.3)

gdje je α0 polarizabilnost u ravnotežnom položaju, a β je jednaka [∂α/∂qk]0. qk je normalna

koordinata gibanja koja odgovara određenom vibracijskom gibanju k.

Uvrštavanjem izraza (2.3.2) i (2.3.3) u izraz (2.3.1) slijedi jednadžba koja prikazuje

kako inducirani dipolni moment određene vibracije ovisi o vremenu.

μ = α0E0cos(2πc t) +

0

E0 × [cos2πc( + k)t + cos2πc( – k)t] (2.3.4)

Tri različite kosinus funkcije u izrazu (2.3.4) ukazuju da inducirani dipol oscilira simultano s

tri različite frekvencije što rezultira zračenjem energije valnih brojeva 0 te 0± k. Dakle, za

određenu vibraciju Rayleighovo raspršenje javlja se pri valnom broju 0, Stokesovo

raspršenje pri 0– k, a anti-Stokesovo raspršenje pri 0+ k. Derivacija polarizabilnosti po

koordinati vibracije (2.3.5) pokazuje osjetljivost polarizabilnosti molekule na promjene

nuklearne konfiguracije u smjeru normalne koordinate vibracije, što znači da je vibracija

aktivna u Ramanovom spektru ukoliko je barem jedna komponenta polarizabilnosti različita

od nule.

0

≠ 0 (2.3.5)

Prema osnovnim principima kvantne mehanike, sva energijska stanja molekule,

elektronska, vibracijska i rotacijska, su kvantizirana. To znači da će molekula prijeći iz jednog

energijskog stanja u drugo onda kada energija elektromagnetskog zračenja koje molekula

apsorbira ili emitira odgovara razlici energije dvaju energijskih stanja. Energija je

proporcionalna frekvenciji, odnosno valnoj duljini zračenja prema izrazu (2.3.6)

ΔE = hν = h

= hc (2.3.6)

25

gdje je ΔE razlika energije između dva energijska stanja, h Planckova konstanta (h = 6,62608

× 10–34

J s), valna duljina, a ν frekvencija elektromagnetskog zračenja.

Prilikom Rayleighovog i Ramanovog raspršenja događaju se dva gotovo simultana

procesa preko virtualnog stanja u kojima sudjeluju dva fotona (Slika 2.3.1). Jedan foton

upadnog zračenja nestaje, dok drugi foton nastaje, bilo jednake frekvencije upadnom fotonu

(Rayleighovo raspršenje) ili različite frekvencije od upadnog fotona (Ramanovo raspršenje).

Raspršeni fotoni energije manje od energije upadnih fotona čine Stokesovo raspršenje, dok

raspršeni fotoni veće energije od upadnih čine anti-Stokesovo raspršenje.

Slika 2.3.1. Procesi apsorpcije te raspršenja infracrvenog zračenja.

82

Dakle, energija Stokesovog raspršenja, ΔES, opisana je izrazom (2.3.7), dok je energija anti-

Stokesovog zračenja, ΔEaS, definirana izrazom (2.3.8).

ΔES = hc( k) (2.3.7)

ΔEaS = hc( + k) (2.3.8)

Ramanov spektar prikazuje ovisnost Ramanovog intenziteta o valnom broju, odnosno

razlici valnih brojeva upadnog i raspršenog fotona (Slika 2.3.2).81

Na apscisi Ramanovog

spektra uobičajeno se ipak navode razlike valnih brojeva, a ne apsolutne vrijednosti valnih

brojeva jer se na taj način mogu međusobno uspoređivati spektri, neovisno o frekvenciji

26

pobudnog zračenja. S obzirom da je većina molekula pri sobnoj temperaturi u osnovnom

stanju, najčešće se analizira samo Stokesov spektar. U slučaju prekrivanja Stokesovog spektra

fluorescencijom uzorka izazvanom pobudnim zračenjem u vidljivom području preferira se

anti-Stokesov spektar.

Slika 2.3.2. Ramanov spektar kumarina.

81

Infracrvena i Ramanova spektroskopija su metode vibracijske spektroskopije koje se

međusobno nadopunjuju. Vrpce odgovarajućih vibracija intenzivne u Ramanovom spektru

slabog su intenziteta u IR spektru i obrnuto. S obzirom da se Ramanovo raspršenje događa

uslijed vibracija koje mijenjaju polarizabilnost molekule, najveće raspršenje zračenja

uzrokuju simetrične vibracije funkcionalnih skupina bogatih elektronima, a vrpce koje im

odgovaraju najintenzivnije su u spektru. Za molekule koje imaju centar simetrije vrijedi

dodatno izborno pravilo, pravilo međusobnog isključenja, prema kojem niti jedna vibracija

istovremeno ne može biti i IR aktivna i Raman aktivna.

Najveći nedostaci Ramanove spektroskopije su slaba osjetljivost, posebice pri analizi

otopina, te interferencije uzrokovane fluorescencijom obojanih uzoraka.87

Iz tog se razloga

razvijaju tehnike koje bi umanjile navedene nedostatke, a jedna od takvih je spektroskopija

površinski pojačanog Ramanovog raspršenja.

27

2.3.2. Spektroskopija površinski pojačanog Ramanovog raspršenja

Spektroskopijom površinski pojačanog Ramanovog raspršenja opaža se raspršenje

molekula adsorbiranih na hrapavu površinu metala.85

U odnosu na klasičnu Ramanovu

spektroskopiju intenzitet raspršenog zračenja povećava se 104 do 10

6 puta, a u nekim

sustavima čak 108 pa sve do 10

14 puta.

88 Na pojačanje Ramanovog raspršenja utječu različiti

parametri: karakteristike pobudnog zračenja (frekvencija, snaga), značajke metalnog

supstrata, struktura i svojstva analita te način adsorpcije analita na površinu metala.89

2.3.2.1. Otkriće

Površinski pojačano Ramanovo raspršenje otkrio je M. Fleischmann sa suradnicima

1974. godine.90

Zapazili su intenzivno Ramanovo raspršenje piridina adsorbiranog iz vodene

otopine na srebrovu elektrodu. Elektrodu su prethodno učinili hrapavom nizom oksidacijsko-

redukcijskih procesa. Autori su pojačanje raspršenog zračenja pripisali povećanju površine

srebrove elektrode uslijed hrapavosti, na koju se adsorbirao veći broj molekula piridina. No,

dvije grupe znanstvenika, D. L. Jeanmarie i R. P. Van Duyne91

te M. G. Albrecht i J. A.

Creighton,92

su neovisno jedni o drugima dokazali da bi samo povećanje površine srebra

uzrokovalo pojačanje raspršenja 10 puta, dok je faktor pojačanja raspršenja piridina bio 106 u

odnosu na klasično Ramanovo raspršenje piridina u otopini. Dakle, povećanje površine metala

nije bio uzrok drastičnom pojačanju raspršenog zračenja, već se radilo o efektu poznatom kao

površinsko pojačanje raspršenja.

2.3.2.2. Metalni supstrati

Površinsko raspršenje opaža se primarno za molekule adsorbirane na površini metala

koji apsorbiraju zračenje u vidljivom području elektromagnetskog spektra.93

S obzirom na

učinkovitost, metalni supstrati najčešće se pripravljaju od srebra94

i zlata,95

dok površine

drugih metala, poput bakra, željeza, litija, natrija, platine i paladija također pojačavaju

raspršeno zračenje, ali manje efikasno.96

Primjerice, reaktivnost željeza i bakra rezultira

nastankom slojeva oksida na površini metala, čime se mijenja priroda metalne površine i gubi

hrapavost. Nastali sloj oksida također predstavlja prostornu barijeru koja ometa približavanje

28

analita metalnoj površini i uzrokuje smanjenje intenziteta ili potpuni izostanak raspršenog

zračenja.97

Kao aktivne površine u SERS spektroskopiji s kojih se opaža pojačanje raspršenog

zračenja najčešće se koriste metalne elektrode98

, nanočestice metala u koloidnim

suspenzijama99

, metalne nanočestice na čvrstim podlogama100

te metalni filmovi101

(Slika

2.3.3). Značajke idealnih SERS supstrata i aktivnih površina su visoka SERS aktivnost koja

omogućava visoku osjetljivost, homogena raspodjela čestica koja osigurava jednoliko

pojačanje uz što manja odstupanja, dobra stabilnost i reproducibilnost te čistoća. 102

Naime,

nečistoće odnosno tvari koje zaostaju nakon priprave metalnog supstrata, mogu rezultirati

vrpcama u spektru mjernog uzorka i otežati interpretaciju spektra. Nažalost, još uvijek ne

postoji supstrat koji zadovoljava sve navedene uvjete pa se ovisno o vrsti analize primjenjuju

suspstrati odgovarajućih svojstava. Primjerice, u kvantitativnoj analizi reproducibilnost

suspstrata veoma je važna, dok je pri detekciji molekula u tragovima najvažnija SERS

aktivnost odnosno sposobnost pojačanja raspršenja.102

Uspješna primjena metalnih nanočestica kao supstrata u SERS spektroskopiji ovisi o

njihovim svojstvima, poput oblika i veličine te stupnju agregacije, ali i o samoj prirodi

metala.103

Koloidne nanočestice najčešće se primjenjuju kao supstrati u SERS istraživanjima

zbog financijski povoljne i jednostavne priprave. Redukcijom soli metala s nekim od spojeva,

poput natrijevog citrata,104

natrijevog borhidrida105

ili EDTA106

pripravljaju se koloidne

suspenzije koje sadrže čestice različitih veličina. Dodatkom elektrolita, poput natrijevog

klorida ili natrijevog nitrata, u koloidnu suspenziju SERS intenzitet se pojačava.107

Elektrolit

smanjuje elektrostatsku barijeru koja sprječava adsorpciju analita na koloidne čestice te

uzrokuje agregaciju čestica, što u oba slučaja rezultira pojačanjem Ramanovog raspršenja s

metalne površine.108

29

Slika 2.3.3. TEM mikrografi: a) nanočestica srebra, b) nanočestica zlata, c) nanoštapića zlata,

d) nanopločica zlata.107

2.3.2.3. Teorije površinskog pojačanja Ramanovog raspršenja

Teorije koje objašnjavaju pojačanje raspršenog zračenja s metalne površine predlažu

dva mehanizma uslijed kojih se taj efekt događa. Jedan je elektromagnetski mehanizam i

prema njemu pojačanje potječe od interakcije analita i površinskih plazmona, pri čemu je

analit adsorbiran na površinu metala ili se nalazi vrlo blizu metalne površine.109

Drugi je

kemijski mehanizam ili mehanizam prijenosa naboja, prema kojem se analit kemijski veže na

metalnu površinu i tako omogućava prijenos elektrona s metala na analit i obrnuto.110

2.3.2.3.1. Elektromagnetski mehanizam

U elektromagnetskom mehanizmu glavnu ulogu imaju površinski plazmoni. Površina

metala prekrivena je elektronima. Elektrone na površini čine vodljivi elektroni koje u rešetci

30

zadržavaju privlačne sile s pozitivno nabijenim centrima metala.111

Elektroni se mogu

relativno slobodno gibati uzduž površine, stvarajući elektronski oblak koji se proteže na

određenoj udaljenosti od površine. Interakcijom električnog polja upadnog zračenja i

elektronskog oblaka na površini metala slobodni elektroni se polariziraju te se inducira dipol

metalne čestice (Slika 2.3.4).

Slika 2.3.4. Shematski prikaz površinskih plazmona metalne sfere s naznačenim pomakom

elektronskog oblaka s obzirom na jezgru.111

Elektroni počinju koherentno oscilirati i te oscilacije se nazivaju površinski

plazmoni.112

Oni imaju rezonantnu frekvenciju pri kojoj najefikasnije apsorbiraju i raspršuju

zračenje. Rezonantna frekvencija ovisi o gustoći slobodnih elektrona, odnosno o vrsti metala i

prirodi površine. Plazmoni srebra i zlata osciliraju pri frekvencijama vidljivog zračenja te se

mogu pobuditi zračenjem VIS i NIR lasera koji se koriste u Ramanovoj spektroskopiji.113

U

slučaju pobude zračenjem u ultraljubičastom području kao supstrati se mogu koristiti

aluminij, platina ili paladij.114

Upadno zračenje može se apsorbirati ili raspršiti s površine

metala, a koji proces će biti dominantniji ovisi o vrsti metala i prirodi površine.109

Dielektrična konstanta metala sadrži realni i imaginarni dio. Raspršenje zračenja je povezano

s realnim dijelom, a apsorpcija s imaginarnim. Ovisno o veličini realnog, odnosno

imaginarnog dijela konstante, metal će apsorbirati ili raspršiti zračenje. Na glatkim metalnim

površinama plazmoni osciliraju u ravnini površine i moguća je samo apsorpcija zračenja.85

Pri

raspršenju zračenja oscilacije moraju biti okomite na ravninu površine, a one su moguće na

hrapavim površinama. Frekvencije površinskih plazmona mogu se odrediti snimanjem

apsorpcijskog spektra. Maksimum i širina plazmonske apsorpcijske vrpce ovise o obliku i

31

veličini čestica te o njihovoj kemijskoj okolini.112

Za veće čestice i agregate maksimum

apsorpcije pomiče se prema većim valnim duljinama. Tako se kontrolom svojstava

nanočestica može podesiti plazmonska rezonancija odnosno pripraviti SERS supstrati s kojih

se optimalno raspršuje zračenje odgovarajuće valne duljine.102

Fizikalna pozadina elektromagnetskog mehanizma može se objasniti na jednostavnom

primjeru metalne sfere koja se nalazi u vanjskom električnom polju i čiji je polumjer puno

manji od valne duljine zračenja.115

Kada je mala metalna sfera izložena promjenjivom

električnom polju zračenja lasera, E0, električno polje na površini opisuje se sljedećim

izrazom (2.3.9)

coscos 03

3

0 Er

agEE r

(2.3.9)

gdje je Er ukupno električno polje na udaljenosti r od površine sfere, a polumjer sfere, θ kut u

odnosu na smjer električnog polja, a g konstanta za koju vrijedi (2.3.10)

01

01

2

)(

)(

L

Lg (2.3.10)

pri čemu su ε0 i ε1 dielektrične konstante medija koji okružuje sferu i metalne sfere, a vL je

frekvencija zračenja lasera. Polarizabilnost metalne sfere, odnosno pojačanje električnog polja

na površini sfere, proporcionalno ovisi o faktoru g, a on doseže maksimum pri rezonantnoj

frekvenciji plazmona za koju vrijedi ε1(L) = 20.

Ukupno električno polje na površini metala uprosječeno je preko cijele površine male

sfere. Na svakoj točki površine električnom polju doprinose dvije komponente, polje okomito

na površinu sfere i polje paralelno s površinom sfere. S obzirom da je dielektrična konstanta

za većinu metala približno 1, iz izraza (2.3.9) i (2.3.10) proizlazi da je električno polje

okomito na površinu veće od onog paralelno s njom. Prema tome, raspršenje će biti najjače za

molekule analita koje su adsorbirane i polarizirane okomito na površinu metala. Nadalje,

jačina električnog polja obrnuto je proporcionalna r3. Udaljavanjem od površine električno

polje slabi, a time i lokalno polje koje osjeća analit, što rezultira slabijim raspršenjem

zračenja. Objašnjenje elektromagnetskog pojačanja može se sa sfernih čestica proširiti na

morfološki drugačije supstrate, pri čemu se mijenja samo brojčani faktor „2“ u izrazu

rezonancije, ovisno o obliku metala.

32

Iznimno jako električno polje nastaje na mjestu gdje se dvije čestice dodiruju. Ta

mjesta se nazivaju „vruće točke“ (hot spots).116

Eksperimentalno je dokazano da su polja

najjača kada je razmak između čestica 12 nm. Raspršeno zračenje molekule koja je

adsorbirana na takvom mjestu može se pojačati i do 1012

puta.

2.3.2.3.2. Kemijski mehanizam ili mehanizam prijenosa naboja

Ukoliko bi pojačanje raspršenja bilo posljedica samo elektromagnetskog mehanizma,

efekt pojačanja trebao bi biti neovisan o kemijskoj prirodi adsorbiranih molekula, s obzirom

da kemijska struktura analita nije definirana u elektromagnetskom modelu. No, primjećeno je

da se SERS intenziteti nekih strukturno sličnih molekula podjednake polarizabilnosti jako

razlikuju.82

Opaženo se može objasniti mehanizmom u kojem se mijenja elektronsko stanje

molekule adsorbirane na metal uslijed interakcije s površinom ili nastaje novo elektronsko

stanje kao rezultat kemisorpcije, odnosno kemijskog vezanja molekule s česticom metala.117

U procesu prijenosa naboja elektron iz metala, pobuđen upadnim fotonom, tunelira u

pobuđeno stanje adsorbirane molekule. Nastali negativni ion (adsorbirana molekula-elektron)

ima drugačiju ravnotežnu geometriju od početne neutralne molekule analita.

Mehanizam prijenosa naboja prikazan je na Slici 2.3.5. Površina metala apsorbira

upadno zračenje pri čemu nastaje par elektron-šupljina (a). Elektron se prenosi s metala na

molekulu vezanu na metal (b). Ako se pri tome molekula pobudi u virtualno stanje i nakon

toga vrati u više vibracijsko stanje osnovnog elektronskog stanja, elektron se vraća u metal

(c). Sjedinjenje elektrona sa šupljinom u metalu praćeno je otpuštanjem fotona koji nosi

informaciju o vibracijskom prijelazu molekule (d).

33

Slika 2.3.5. Mehanizam prijenosa naboja.117

Kemijski mehanizam pojačanja ponajviše ovisi o strukturnim i elektronskim

svojstvima analita. Najčešće se opaža za boje koje sadrže delokalizirani -sustav s amino i

imino skupinama, a koje vezu s metalnom površinom ostvaruju preko dušikova atoma.

Pojačanje prijenosom naboja kratkog je dosega i ograničeno je na prvi sloj molekula analita

vezanih na metal, dok se elektromagnetsko pojačanje raspršenog zračenja opaža i iz

udaljenijih slojeva.110

Ukupnom pojačanju raspršenog zračenja doprinose oba mehanizma, no

smatra se da elektromagnetsko pojačanje ima veću ulogu od kemijskog pojačanja. Kemijski

mehanizam ovisi o mjestu i geometriji vezanja te energijskim stanjima vezane molekule, a

pruža korisne informacije o interakciji između metala i analizirane molekule.118

No, ovaj

mehanizam nije osnovni mehanizam pojačanja raspršenja i primjenjiv je samo na pojedine

molekule.

2.3.2.4. Izborna pravila i asignacija SERS spektara

SERS spektar vrlo se često razlikuje od klasičnog Ramanovog spektra, a njegova

asignacija nije sasvim jednostavna. U SERS spektru mogu se javiti nove vrpce koje u

klasičnom Ramanovom spektru nisu opažene, dok neke vrpce mogu postati vrlo slabe ili čak

potpuno izostati.82

Razlog tome su većinom izborna pravila za molekule na površini metala

prema kojima vibracije polarizirane okomito na površinu najintenzivnije raspršuju zračenje, a

vibracije paralelno s njom ne doprinose raspršenju. Nadalje, adsorpcijom molekula na

34

površinu metala geometrija molekule se mijenja i dolazi do promjena normalnih vibracija. To

je najizraženije za molekule s centrom simetrije koje vezanjem na površinu gube to svojstvo.

Tada pravilo međusobnog isključenja više ne vrijedi, te se u SERS spektru javljaju vrpce i

onih vibracija koje su inače bile samo IR aktivne.

Za molekule koje u strukturi sadrže kromofor raspršeno zračenje može se dodatno

pojačati. Tada se kao pobudno zračenje koristi zračenje lasera čija frekvencija odgovara

energiji elektronskog prijelaza kromofora. Uslijed kombinacije rezonantnog i površinskog

pojačanja raspršeno zračenje pojačava se i do 1014

puta. Ova tehnika naziva se površinski

pojačano rezonantno Ramanovo raspršenje (surface-enhanced resonance Raman scattering,

SERRS).88

S obzirom na detekciju samo onih molekula koje se nalaze blizu metalne površine,

SERS tehnika je selektivna, a s obzirom na pojačanje raspršenog zračenja, i izrazito osjetljiva

u odnosu na klasičnu Ramanovu spektroskopiju.89

Iz tog se razloga široko primjenjuje u

različitim analizama, od identifikacije eksploziva, različitih ljekovitih supstancija, droga,

aditiva u hrani, pa sve do određivanja vrsta stanica i spora.119,120

2.3.2.5. Istraživanje vezanja malih molekula s DNA SERS spektroskopijom

Usprkos navedenim prednostima SERS spektroskopije pred ostalim metodama

vibracijske spektroskopije, samo je nekoliko radova objavljeno na temu istraživanja vezanja

malih molekula s polinukleotidima primjenom ove tehnike. Pri tome većina njih opisuje

promjene u spektrima interkalirajućih molekula opaženim nakon pobude vidljivim

zračenjem.121,122

Razlog tome je intenzivno raspršenje policikličkih aromatskih molekula na

površini metala uslijed rezonancije apsorpcije kromofora, površinskih plazmona i zračenja

lasera. Interkaliranjem u dvostruku uzvojnicu polinukleotida molekula se udaljava od metalne

površine pri čemu se i intenzitet raspršenja smanjuje.123

Molekule koje se potencijalno vežu u

utore, većinom poliamidi i poliamini, slabo raspršuju zračenje, te su stoga istraživanja ovih

molekula zanemarena. Međutim, SERS spektri oligonukleotida u koloidnoj suspenziji srebra,

opaženi tek nakon agregacije nanočestica sperminom, ukazali su na potencijal SERS

spektroskopije pri istraživanju molekula koje se vežu u utore nukleinskih kiselina.124

Vezanjem s poliaminskim molekulama na površini metala vrpce vibracije funkcionalnih

skupina odnosno dijelova polinukleotida koji sudjeluju u interakciji uočene se u spektru.

35

3. EKSPERIMENTALNI DIO

3.1. Kemikalije

Srebrov nitrat, p.a., Kemika

Trinatrijev citrat dihidrat, p.a., Kemika

Natrijev borhidrid, p.a., Carlo Erba Reagents

Poli(vinil alkohol), Mr 72000, p.a., Kemika

Etilendiamintetraoctena kiselina, p.a., Kemika

Natrijev hidroksid, p.a., Kemika

Klorovodična kiselina (36,5%), p.a., Kemika

Hidroksilamin hidroklorid, p.a., Kemika

Natrijev kakodilat, p. a., Sigma

Spermin tetrahidroklorid, p.a., Aldrich

Calf thymus DNA(ct-DNA), p.a., Aldrich

Poli A, p.a., Sigma

Poli G, p.a., Sigma

Poli C, p.a., Sigma

Poli U, p.a., Sigma

Poli dAdT−poli dAdT, p.a., Sigma

Poli dGdC–poli dGdC, p.a., Sigma

Poli rA−poli rU, p.a., Sigma

Laboratorijsko suđe za pripravu koloida i mjerenje uzoraka oprano je otopinom

deterdženta (Kemex), isprano običnom vodom, destiliranom vodom, 5%-tnom otopinom

dušične kiseline te deioniziranom vodom.

36

3.2. Istraživani spojevi

3.2.1. 4-metil-2,7-diamino-5,10-difenil-4,9-diazapirenijev hidrogensulfat (ADAP)

Interkalator 4-metil-2,7-diamino-5,10-difenil-4,9-diazapirenijev hidrogensulfat (ADAP)

sintetiziran je i karakteriziran prema ref. 125 (Slika 3.2.1).

Slika 3.2.1. Struktura molekule ADAP.

3.2.2. N1-((1H-imidazol-4-il)metil)-N3-(2(bis(2-(3-((1H-imidazol-4-l)metilamino)propilami-

no)etil)amino)-etil)propan-1,3-diamin (IM) i tris(8-(4'-piridil)-3,7-diazaoktil)amin (PY)

Poliaminski spojevi s imidazolnim i piridinskim prstenovima u strukturi N1-((1H-

imidazol-4-il)metil)-N3-(2(bis(2-(3-((1H-imidazol-4-l)metilamino)propilamino)etil)amino)-

etil)propan-1,3-diamin (IM) i tris(8-(4'-piridil)-3,7-diazaoktil)amin (PY) sintetizirani su i

karakterizirani prema ref. 126 (Slika 3.2.2).

(a)

(b)

Slika 3.2.2. Strukture molekula a) IM i b) PY.

37

3.2.3. N,N′-bis(3-aminopropil)-1,4-butandiamin (Sp)

Spermin (N,N′-bis(3-aminopropil)-1,4-butandiamin, Sp) je lančana poliaminska

molekula čija je struktura prikazana na slici 3.2.3.

Slika 3.2.3. Struktura molekule Sp.

3.2.4. 2,9-di[5-(2-aminoetil)-2,5,8-triaza[9]-(2,6)-piridinofan]fenantrolin (PHENPOD) i

2,6-di[5-(2-aminoetil)-2,5,8-triaza[9]-(2,6)-piridinofan]piridin (PYPOD)

Sinteza spojeva 2,9-di[5-(2-aminoetil)-2,5,8-triaza[9]-(2,6)-piridinofan]fenantrolina

(PHENPOD) i 2,6-di[5-(2-aminoetil)-2,5,8-triaza[9]-(2,6)-piridinofan]piridina (PYPOD) i

njihova karakterizacija opisane su u ref. 127 (Slika 3.2.4).

(a) (b)

Slika 3.2.4. Strukture molekula a) PHENPOD i b) PYPOD.

38

3.3. Priprava koloidnih suspenzija srebra

3.3.1. Koloid 1

Koloidna suspenzija srebra 1 pripravljena je redukcijom srebrova nitrata s

hidroksilamin hidrokloridom.128

Srebrov nitrat (0,0085 g) otopio se u destiliranoj vodi (45

cm3). Zasebno se pripremila otopina hidroksilamin hidroklorida otapanjem čvrste tvari

(0,0085 g) u vodi (5 cm3), u koju se zatim dodala otopina natrijevog hidroksida, c = 2 mol

dm3

(0,110 cm3). Pripravljena otopina hidroksilamin hidroklorida dodala se u otopinu

srebrovog nitrata uz snažno miješanje na magnetskoj miješalici. Nakon nekoliko sekundi

reakcijska smjesa poprimila je sivo smeđu boju te se miješanje nastavilo 10 minuta.

3.3.2. Koloid 2

Koloidna suspenzija srebra 2 pripravljena je redukcijom srebrova nitrata s trinatrijevim

citratom prema modificiranom Lee-Meiselovom postupku.104

Srebrov nitrat (0,00892 g)

otopio se u deioniziranoj vodi (50 cm3) te se otopina zagrijala do vrenja na uljnoj kupelji. U

vruću otopinu dodala se 1%-tna otopina trinatrijevog citrata (1 cm3) i reakcijska smjesa

miješala uz vrenje 60 minuta pri čemu je promijenila boju iz bezbojne u smeđe sivu.

3.3.3. Koloid 3

Koloidna suspenzija srebra 3 pripravljena je redukcijom srebrova nitrata s natrijevim

borhidridom.94

Natrijev borhidrid (0,00229 g) otopio se u vodi (30 cm3) i zatim hladio u

ledenoj kupelji. U ohlađenu otopinu naizmjence se dodavala otopina srebrova nitrata,

pripremljena otapanjem tvari (0,00836 g) u vodi (10 cm3), i 1%-tna otopina poli(vinil

alkohola) (5 cm3). Reakcijska smjesa se zatim kuhala 60 minuta u svrhu uklanjanja suviška

NaBH4. Pripravljena koloidna suspenzija razrijedila se vodom do ukupnog volumena od 50

cm3.

39

3.3.4. Koloid 4

Koloidna suspenzija srebra 4 pripravljena je redukcijom srebrova nitrata s

etilendiamintetraoctenom kiselinom (EDTA).106

U vruću vodu (50 cm3) dodala se otopina

EDTA, c = 0,1 mol dm3

(1 cm3), zatim otopina NaOH, c = 0,1 mol dm

3 (3 cm

3) te otopina

srebrova nitrata pripremljena otapanjem tvari (0,01699 g) u vodi (1 cm3). Smjesa se kuhala

jednu minutu i zatim se u nju dodala otopina HCl, c = 0,1 mol dm3

(1 cm3). Reakcijska

smjesa nastavila se kuhati još 23 minute sve dok nije poprimila žuto smeđu boju.

40

3.4. Priprava otopina i mjernih uzoraka

Ishodne otopine ct-DNA, dvolančanih polinukleotida (poli dGdC−poli dGdC, poli

dAdT−poli dAdT, poli rA−poli rU) i jednolančanih polinukleotida (poli A, poli G, poli C, poli

U) pripravljene su u kakodilatnom puferu pH 7,0 ionske jakosti 0,05 mol dm3

. Posebno,

otopina ct-DNA je po otapanju sonificirana i filtrirana kroz filter pora 0,45 µm, kako bi u

filtratu bili samo kraći ulomci dvolančane DNA do par stotina parova baza, karakteristične B-

DNA sekundarne strukture.129

Koncentracije ishodnih otopina polinukleotida određene su

spektrofotometrijski izražene kao koncentracije fosfata bile su sljedeće: c(ct-DNA) =

4,00×103

mol dm3

, c(poli dAdT−poli dAdT) = 2,56×10−3

mol dm3

, c(poli dGdC−poli

dGdC) = 1,10×103

mol dm3

, c(poli rA−poli rU) = 9,64×10−3

mol dm3

, c(poli A) =

8,81×10−3

mol dm3

, c(poli G) = 1,00×103

mol dm3

, c(poli C) = 1,01×103

mol dm3

i c(poli

U) = 1,03×103

mol dm3

.

3.4.1. Priprava uzoraka sa spojem ADAP

Ishodna otopina spoja ADAP koncentracije 1,9×10−4

mol dm−3

pripravljena je

otapanjem odgovarajuće mase krute tvari u deioniziranoj vodi. Radi lakše priprave mjernih

uzoraka pripravljena je i otopina koncentracije 5×10−5

mol dm−3

razrijeđivanjem ishodne

otopine s deioniziranom vodom.

U svrhu određivanja koloida na kojem ADAP najjače raspršuje zračenje pripravljeni

su uzorci dodavanjem 50 μL otopine ADAP (5×10−5

mol dm−3

) u 400 μL odgovarajuće

koloidne suspenzije srebra, te nadopunjavanjem deioniziranom vodom do 500 μL. U svim

uzorcima koncentracija spoja iznosila je 5×10−6

mol dm−3

.

Uzorci za mjerenje SERS spektara otopina različitih koncentracija spoja ADAP

pripravljeni su miješanjem 400 μL koloidne suspenzije 1 i odgovarajućeg volumena ishodnih

otopina spoja ADAP (1,9×10−4

i 5×10−5

mol dm−3

) te nadopunjavanjem deioniziranom

vodom do ukupnog volumena od 500 μL. Koncentracije spoja ADAP u pripravljenim

mjernim uzorcima bile su 5×10–5

, 1×10–5

, 5×10–6

, 1×10−6

, 5×10−7

i 1×10−7

mol dm3

.

Pri istraživanju utjecaja priprave uzorka na pojačanje Ramanova raspršenja smjese

spoja ADAP i ct-DNA pripravljene su na tri različita načina. U prvom uzorku najprije su

pomiješani ADAP i DNA, a potom je kompleksu dodan koloid srebra 1. Drugi uzorak je

41

pripravljen na način da je na koloid 1 dodan ADAP pa DNA, dok je u trećem uzorku na

koloid srebra 1 najprije dodana nukleinska kiselina, a zatim ADAP. Svi pripravljeni uzorci

sadržavali su ADAP koncentracije 5×10–6

mol dm3

i DNA koncentracije 1×10–4

mol dm3

,

pri čemu je omjer ADAP/DNA, u kojem je koncentracija nukleinske kiseline izražena kao

koncentracija parova iznosio 1/10.

Mjerni uzorci smjesa spoja ADAP i ct-DNA sadržavali su sastojke u omjerima

ADAP/DNA 10/1, 7/1, 5/1, 2/1, 1/1, 1/2, 1/5, 1/7 i 1/10. Koncentracija malih molekula u

svim uzorcima bila je 5×10–6

mol dm3

. Uzorci su pripravljeni na opisani prvi način, pri čemu

su najprije pomiješani odgovarajući volumeni kakodilatnog pufera i ishodne otopine DNA te

50 μL otopine ADAP (5×10−5

mol dm−3

), a zatim je nastalom kompleksu dodano 400 μL

koloidne suspenzije srebra 1.

3.4.2. Priprava uzoraka sa spojevima IM i PY

Ishodne otopine spojeva IM i PY koncentracija 1×10−3

mol dm−3

pripremljene su

otapanjem odgovarajuće mase čvrstih uzoraka u deioniziranoj vodi.

Koloid koji će se koristi kao metalni supstrat za daljnja SERS mjerenja odabran je

pomoću uzoraka pripravljenih dodavanjem 50 μL ishodne otopine IM u 268 μL odgovarajuće

koloidne suspenzije srebra (1, 2 ili 3) te nadopunjavanjem vodom do 500 μL. U svim

uzorcima koncentracija spoja bila je 1×10−4

mol dm−3

.

Uzorci za mjerenje SERS spektara spojeva IM i PY različitih koncentracija

pripravljeni su miješanjem 268 μL koloidne suspenzije 2 i odgovarajućeg volumena ishodnih

otopina IM, odnosno PY (1×10−3

ili 1×10−4

mol dm−3

), te nadopunjavanjem deioniziranom

vodom do ukupnog volumena od 500 μL. Koncentracije spojeva u mjernim uzorcima bile su

1×10–4

, 5×10–5

, 1×10–5

, 5×10–6

, 1×10−6

, 5×10−7

i 1×10−7

mol dm3

.

Uzorci za mjerenje SERS spektara koji su sadržavali natrijev borhidrid u svrhu

uklanjanja citratnih iona s površine nanočestica u koloidnoj suspenziji 2 pripravljeni su

miješanjem 268 μL koloida 2 i 46,3 μL otopine NaBH4 (1×103

mol dm3

), dodavanjem

odgovarajućeg volumena ishodne otopina IM, odnosno PY (1×10−3

ili 1×10−4

mol dm−3

), te

nadopunjavanjem deioniziranom vodom do ukupnog volumena od 500 μL. Koncentracije

spojeva u mjernim uzorcima bile su 1×10–4

i 5×10–6

mol dm3

.

42

Uzorci u kojima su istraživane interakcije između spojeva IM i PY te jednolančanih

polinukleotida, dvolančanih polinukleotida i ct-DNA pripravljeni su u omjerima [spoj]/[DNA

fosfati] 1/20, pri čemu je koncentracija poliaminskih molekula u svim uzorcima bila 5×106

mol dm3

, a koncentracija polinukleotida izražena kao koncentracija fosfata 1×104

mol dm3

.

Uzorci su pripravljeni u koloidnoj suspenziji 2 dodatkom najprije spoja, a potom

polinukleotida. Serija uzoraka pripravljena je i s natrijevim borhidridom, koji je na koloid

dodan prije spoja i odgovarajućeg polinukleotida, a njegova koncentracija u mjernom uzroku

iznosila je 1×103

mol dm–3

.

3.4.3. Priprava uzoraka sa spojem Sp

Ishodna otopina spoja Sp koncentracije 1×10−3

mol dm−3

pripremljena je otapanjem

odgovarajuće mase čvrstog uzorka u deioniziranoj vodi.

Uzorci za mjerenje SERS spektara spoja Sp različitih koncentracija pripravljeni su

miješanjem 268 μL koloidne suspenzije 2 i odgovarajućeg volumena ishodnih otopina Sp

(1×10−3

ili 1×10−4

mol dm−3

), te nadopunjavanjem deioniziranom vodom do ukupnog

volumena od 500 μL. Koncentracije spoja u mjernim uzorcima bile su 1×10–4

, 5×10–5

, 1×10–5

,

5×10–6

i 1×10−6

mol dm3

.

Uzorci u kojima su istraživane interakcije spoja Sp s jednolančanim polinukleotidima

i dvolančanim polinukleotidima te ct-DNA pripremani su u koloidnoj suspenziji srebra 2

dodatkom najprije spoja, a zatim polinukleotida, te nadopunjavanjem kakodilatnim puferom.

U svim uzorcima koncentracija spoja Sp bila je 5×10–6

mol dm-3

, dok je omjer koncentracija

spoja Sp i polinukleotida, [spoj]/[DNA fosfati] iznosio 1/20.

3.4.4. Priprava uzoraka sa spojevima PHENPOD i PYPOD

Ishodne otopine spojeva PHENPOD i PYPOD koncentracija 6,5×10−4

mol dm−3

,

odnosno 5×10–4

mol dm−3

pripremljene su otapanjem odgovarajuće mase čvrstog uzorka u

deioniziranoj vodi.

Pri odabiru koloida za daljnja SERS mjerenja, uzorci su pripravljeni miješanjem 78 μL

ishodne otopine PHENPOD s 400 μL odgovarajuće koloidne suspenzije (1 ili 2), te

43

nadopunjavanjem deioniziranom vodom do 500 μL. U svim uzorcima koncentracija spoja

iznosila je 1×10−4

mol dm−3

.

Uzorci za mjerenje SERS spektara spojeva PHENPOD i PYPOD različitih

koncentracija pripravljeni su miješanjem odgovarajućeg volumena ishodne otopina

PHENPOD, odnosno PYPOD (6,5×10−4

ili 5×10−4

mol dm−3

) s deioniziranom vodom, nakon

čega je dodano 400 μL koloidne suspenzije 2, tako da je ukupni volumen iznosio 500 μL.

Koncentracije spojeva u mjernim uzorcima bile su 6,5×10–5

, 3,2×10–5

, 6,5×10–6

, 3,2×10–6

,

6,5×10−6

, 3,2×10−7

i 6,5×10−8

mol dm3

.

Uzorci u kojima su istraživane interakcije spojeva PHENPOD i PYPOD s

jednolančanim polinukleotidima, dvolančanim polinukleotidima i ct-DNA pripravljeni su u

omjerima [spoj]/[DNA fosfati] 1/20. Uzorci su pripremani u koloidnoj suspenziji srebra 2

dodatkom najprije spoja, a zatim polinukleotida, te nadopunjavanjem kakodilatnim puferom.

U svim uzorcima koncentracija spoja PHENPOD, odnosno spoja PYPOD bila je 5×10–6

mol

dm-3

.

44

3.5. Mjerni uređaji

3.5.1. Snimanje UV/VIS apsorpcijskih spektara

Apsorpcijski spektri koloidnih suspenzija srebra snimljeni su pomoću UV/VIS

spektrofotometra SPECORD 200 tvrtke Analytik Jena. Korištene su kvarcne kivete duljine

puta zračenja 1,00 cm. Spektri su snimani u području između 1100 i 200 nm uz razlučivanje

od 1 nm.

3.5.2. Određivanje pH vrijednosti koloidne suspenzije

Za mjerenje pH vrijednosti koloidnih suspenzija korišten je pH metar tvrtke Mettler

Toledo (model MP 220) s kombiniranom staklenom-kalomel elektrodom InLab®413. Uređaj

je prije mjerenja baždaren s otopinama pufera pH 7,00 i 4,01.

3.5.3. Snimanje koloida transmisijskom elektronskom mikroskopijom

Nanočestice srebra u koloidnim suspenzijama 1, 2 i 3 vizualizirane su transmisijskom

elektronskom mikroskopijom (transmission electron microscopy, TEM) pomoću JEOL JEM-

1400 mikroskopa. Uzorci za snimanje TEM slika pripremljeni su nanošenjem kapi suspenzije

na ugljikom prevučenu bakrenu mrežicu (100 mesh) i sušenjem pri sobnoj temperaturi.

3.5.4. Snimanje FT-Ramanovih i SERS spektara

Ramanovi i SERS spektri snimljeni su pomoću interferometra EQUINOX 55 tvrtke

BRUKER, opremljenim s Ramanovim modulom FRA 106/S. Kao izvor zračenja za pobudu

uzoraka korišten je Nd:YAG laser koji je emitirao zračenje pri 1064 nm snage 100 mW

prilikom snimanja krutih uzoraka, odnosno 500 mW pri snimanju otopina i koloidnih

suspenzija. Za čvrste uzorke korišteni su nosači od aluminija, dok su tekući uzorci snimani u

staklenim kivetama. Spektri su snimani u području od 3500 do 100 cm

1 uz razlučivanje od 4

cm1

, a rezultat su uprosječivanja 128 snimaka.

45

4. REZULTATI I RASPRAVA

4.1. Karakterizacija koloidnih suspenzija srebra

4.1.1. Koloid 1

Koloid 1 pripravljen je redukcijom srebrova nitrata s hidroksilamin hidrokloridom.128

Hidroksilamin djeluje kao reducirajući agens, dok se kloridni ioni, zaostali nakon priprave,

smještaju uz površinu nanočestica srebra i stabiliziraju koloid.

pH koloidne suspenzije iznosio je 6,70, a valna duljina rezonancije plazmona 416 nm

(Slika 4.1.1).

Slika 4.1.1. Apsorpcijski spektar koloidne suspenzije 1.

Ramanov spektar koloidne suspenzije 1 nalikuje Ramanovom spektru vode (Slika

4.1.2). Široka vrpca u području 35003200 cm1

odgovara istezanju O–H veza u molekuli

vode, dok se slaba vrpca pri približno 1600 cm1

pripisuje promjeni kuta između dvije O–H

veze odnosno deformaciji molekule vode.130

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

Ap

so

rba

ncija

Valna duljina / nm

46

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

Slika 4.1.2. Ramanov spektar koloidne suspenzije 1.

Na TEM slici koloidne suspenzije 1 opažaju su pojedinačne i agregirane nanočestice

srebra sfernog oblika veličine od 20 do 120 nm (Slika 4.1.3).

Slika 4.1.3. TEM slika koloida 1.

47

4.1.2. Koloid 2

Koloid 2 pripravljen je redukcijom srebrova nitrata s trinatrijevim citratom.104

Citrati

reduciraju srebrove ione pri čemu nastaju acetondikarboksilna kiselina i acetoctena kiselina,

koje se zajedno sa suviškom citratnih iona adsorbiraju na površinu nanočestica i djeluju kao

stabilizirajući agensi.

Valna duljina maksimalne apsorpcije koloidne suspenzije zabilježena je pri 421 nm

(Slika 4.1.4), a pH vrijednost iznosila je 7,69.


U Ramanovom spektru koloidne suspenzije 2 vrpca pri 3200 cm1

odgovara istezanju

OH veze vode, dok se vrpca pri 1090 cm1

pripisuje istezanju CO veza citratnih aniona i

oksidacijskih produkata na površini koloidnih nanočestica (Slika 4.1.5).131

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Ap

so

rba

ncija

Valna duljina / nm

48

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1


TEM slika koloida 2 ukazuje na prisutnost sfernih nanočestica, većinom agregiranih,

veličine između 20 i 150 nm (Slika 4.1.6).


49

4.1.3. Koloid 3

Koloid 3 pripravljen je redukcijom srebrova nitrata s natrijevim borhidridom u

prisutnosti poli(vinil alkohola).95

Pri redukciji srebrovih kationa, borhidrid se oksidira do

borata koji, uz polimer u suspenziji, stabiliziraju nastale nanočestice srebra.

Valna duljina rezonancije plazmona opažena je pri 393 nm (Slika 4.1.7), a pH

koloidne suspenzije iznosio je 6,89.


U Ramanovom spektru koloidne suspenzije 3 opažaju se vrpce koje potječu od

vibracijskih modova molekule vode: istezanja OH veza pri 3200 cm1

i deformacije pri 1600

cm1

(Slika 4.1.8).130

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Ap

so

rba

ncija

Valna duljina / nm-1

50

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1


Na TEM slici koloida 3 uočavaju se sferne nanočestice srebra veličine od 20 do 50

nm, pojedinačne, ali i u manjim nakupinama (Slika 4.1.9).


51

4.1.4. Koloid 4

Koloid 4 pripravljen je redukcijom srebrova nitrata s etilendiamintetraoctenom

kiselinom (EDTA).107

Negativno nabijeni oksidacijski produkti EDTA na površini

stabiliziraju nanočestice srebra.

Rezonantna valna duljina plazmona nanočestica opažena je pri 408 nm (Slika 4.1.10).

pH koloidne suspenzije iznosio je 7,90.


Uz vrpce vibracijskih modova vode pri 3200 i 1600 cm1

, u Ramanovom spektru

koloidne suspenzije 4 opaža se vrpca pri 1090 cm1

koja odgovara istezanju CO veza

karboksilnih skupina EDTA i njezinih oksidacijskih produkata (Slika 4.1.11).130

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Ap

so

rba

ncija

Valna duljina / nm

52

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1


53

4.2. Istraživanje interakcija spoja ADAP s DNA

4.2.1. FT-Ramanovi spektri spoja ADAP

Snimljeni su Ramanovi spektri krutog uzorka spoja ADAP te zasićene vodene otopine,

c(ADAP) = 1,9×10–4

mol dm–3

(Slika 4.2.1). Izostanak vibracijskih vrpci u spektru krutine

pripisuje se tamnoljubičastoj boji uzorka koji u potpunosti apsorbira zračenje lasera. U slučaju

vodene otopine spoja, snimljeni spektar odgovara Ramanovom spektru vode. Radi slabe

topljivosti spoja ADAP u vodi nije bilo moguće pripraviti otopinu veće koncentracije koja bi

bila dovoljna za opažanje Ramanovog spektra.

Slika 4.2.1. FT-Ramanovi spektri a) vodene otopine ADAP, c = 1,9×10–4

mol dm–3

, i b)

krutog uzorka spoja ADAP.

4.2.2. SERS spektri spoja ADAP

4.2.2.1. Odabir koloida

Uvjet za površinsko pojačanje raspršenog zračenja, odnosno opažanje SERS spektra

molekule je vezanje ili blizina molekule i odgovarajuće metalne površine. U svrhu odabira

3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

54

prikladnog metalnog SERS supstrata pripravljene su četiri koloidne suspenzije srebra.

Optimalan koloid odabran je snimanjem SERS spektara spoja ADAP na pripravljenim

koloidima 1, 2, 3 i 4 (Slika 4.2.2).

Slika 4.2.2. SERS spektri spoja ADAP na a) koloidu 1, b) koloidu 2, c) koloidu 3 i

d) koloidu 4; c(ADAP) = 5×10–6

mol dm3

.

Jedino se u spektru snimljenom na koloidu 1, pripravljenom redukcijom srebrovog

nitrata s hidroksilamin hidrokloridom, javljaju vrpce koje odgovaraju vibracijskim modovima

molekule spoja ADAP. S obzirom da nanočestice srebra u koloidnoj suspenziji 1 nose

negativan naboj kloridnih iona na površini, molekule spoja ADAP se uslijed elektrostatskih

privlačnih sila pozitivno nabijenog heterocikličkog sustava smještaju blizu površine metalnih

nanočestica. Mali kloridni ioni na površini mogu se lako razmaknuti i omogućiti adsorpciju

molekula na metal koja rezultira pojačanjem Ramanovog raspršenja.

Iako su nanočestice srebra u koloidnim suspenzijama 2 i 4, nastale redukcijom s

trinatrijevim citratom odnosno EDTA, također negativno nabijene uslijed reducensa i njihovih

oksidacijskih produkata na površini, pretpostavlja se da svojom veličinom ometaju

približavanje molekula spoja ADAP površini srebra. Nanočestice srebra u koloidu 3 okružuje

stabilizirajući polimer te, osim što je neutralan i onemogućava elektrostatske sile, predstavlja

steričku barijeru između površine metala i istraživanih molekula.

Za daljnja mjerenja SERS spektara spoja ADAP stoga je korišten koloid 1.

3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400

R

am

an

ov in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

(c)

(d)

55

4.2.2.2. Koncentracijska ovisnost

Snimljeni su SERS spektri spoja ADAP u ovisnosti o koncentraciji u području 1×10–7

–5×10–5

mol dm3

(Slika 4.2.3).

Slika 4.2.3. SERS spektri spoja ADAP: a) c = 5×10–5

mol dm3

, b) c = 1×10–5

mol dm3

, c) c

= 5×10–6

mol dm3

, d) c = 1×10–6

mol dm3

, e) c = 5×10–7

mol dm3

i f) c = 1×10–7

mol dm3

.

Intenzitet površinski pojačanog raspršenog zračenja spoja ADAP ovisi o koncentraciji

spoja u koloidnoj suspenziji, no pri tome ne slijedi linearan trend. Koloidni uzorak najveće

istraživane koncentracije spoja ADAP, c = 5×10–5

mol dm3

, slabo raspršuje zračenje.

Smanjenjem koncentracije raspršenje zračenja se pojačava i dostiže svoj maksimum pri

koncentraciji 5×10–6

mol dm3

. Pri nižim koncentracijama SERS intenzitet vrpci slabi.

Spektar uzorka najmanje koncentracije spoja, c = 1×10–7

mol dm3

, odgovara spektru

koloidne suspenzije.

Zahvaljujući planarnoj aromatskoj strukturi ADAP agregira u vodenim otopinama

formirajući dimere, Ks,dim 400 dm3

mol1

.126

U strukturi dimera jedna molekula spoja ADAP

zarotirana je za 180º oko najduže molekulske osi u odnosu na drugu molekulu (Slika 4.2.4).

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

56

Slika 4.2.4. Dimer molekula ADAP.126

Pretpostavlja se da u otopini spoja ADAP najveće koncentracije, c = 5×10–5

mol dm3

,

prevladavaju dimeri molekula. U blizini koloidnih čestica dimeri se na različite načine

orijentiraju prema površini srebra što uzrokuje slabo raspršenje zračenja. Smanjenjem

koncentracije ravnoteža se pomiče na stranu monomera. Monomeri lakše zauzimaju

optimalan položaj prema površini koloidnih nanočestica što rezultira intenzivnijim i bolje

definiranim vrpcama u spektru. Smanjenjem koncentracije spoja osobito se pojačavaju vrpce

vibracijskih modova diazapirenskog sustava, što upućuje na smještanje policikličkog

aromatskog sustava molekule ADAP okomito na površinu metala.

U Tablici 4.2.1 asignirane su vibracijske vrpce spoja ADAP u SERS spektrima

otopina različitih koncentracija. Intenzivne vrpce u području 16251300 cm–1

odgovaraju

istezanjima CC i CN veza središnjeg aromatskog sustava.132

Vrpca pri 1592 cm–1

pripisuje se

istezanju benzenskih prstena vezanih na diazapirenski sustav, dok vrpce oko 1000 cm–1

potječu od njihovih deformacija. Najintenzivnije vrpce u SERS spektrima svih koncentracija

opažaju se oko 240 cm–1

s ramenom pri 211 cm–1

. S obzirom da je ADAP sintetiziran kao sol,

hidrogensulfat, intenzivna vrpca najvjerojatnije potječe od istezanja Ag–O i/ili Ag–S veza

formiranih između površine srebra i odgovarajućih atoma HSO4– iona te prekriva vrpcu

istezanja Ag–N veza molekula spoja ADAP s koloidnim nanočesticama.133

57

Tablica 4.2.1. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja ADAP različitih koncentracija.130,132

Valni broj / cm-1

Vibracija 5×10–5

mol dm3

1×10–5

mol dm3

5×10–6

mol dm3

1×10–6

mol dm3

5×10–7

mol dm3

1621 1623 1622 1622 1622 ν CC diazapiren

1594 1593 1592 ν CC fenil

1573 1573 1569 1567 ν CC/CN diazapiren

1559 1559 ν CC/CN diazapiren

1526 ν CC diazapiren

1516 1518 1512 ν CC, ν CC/CN diazapiren

1452 1451 1450 1448 δas CH3

1441 1437 1437 ν CC/CN diazapiren

1386 1386 1386 1386 1386 ν CC diazapiren, δs CH3

1353sh 1353 ν CC diazapiren

1345 1347 1349 ν CC diazapiren

1337sh 1337 1336 1336 ν CC diazapiren

1312 1312 1310 1308 δip C–H

1302 1301 δip C–H

1226 ν C–N, δip C–H

1178 1182 1182 1185 δip C–H

1150 1150 1150 1150 δip C–H

1028 1031 1030 ν CC diazapiren

998 998 998 998 998 δ CC fenil

972 972 972 972 δ CC fenil

893 ν CC diazapiren

857 850 854 857 δ diazapiren

819 816 825 824 δ diazapiren

721 721 721 721 721 δ diazapiren

687 687 692sh δ diazapiren

434 436 438 437 γ diazapiren

362 363 364 364 γ diazapiren

240 239 238 238 237 ν Ag–O / ν Ag–S / ν Ag–N

211sh 211sh 211sh 211sh 211sh ν Ag–N

ν, istezanje; δ, deformacija; γ, torzija; ip, u ravnini; s, simetrično; as, antisimetrično; sh, rame

Pojačanje raspršenja spoja ADAP posljedica je većinom elektromagnetskog

mehanizma. Molekule ADAP adsorbiraju se na površinu srebra uslijed elektrostatskih

interakcija između pozitivno nabijenog dušikovog atoma aromatskog sustava i kloridnih

58

aniona koje se nalaze na površini nanočestica srebra. Blizina molekule i metalne površine

omogućava interakciju s površinskim plazmonima. Međutim, u strukturi molekule prisutne su

i amino skupine preko kojih se može ostvariti kemijska veza s površinom metala. Iako

prekrivanje vrpci u području nižih valnih brojeva onemogućava uočavanje vrpce vibracije

nastale Ag–N veze, za očekivati je da i kemijsko pojačanje doprinosi ukupnom raspršenom

zračenju.

Budući da su pri koncentraciji 5×10–6

mol dm3

molekule spoja ADAP u otopini

prisutne kao monomeri i ujedno najintenzivnije raspršuju zračenje, daljnja istraživanja s DNA

provedena su pri toj koncentraciji spoja.

4.2.2.3. Utjecaj pufera

S obzirom da je otopina ct-DNA pripremljena u kakodilatnom puferu, istražen je

utjecaj pufera na SERS spektar spoja ADAP. Spektri spoja ADAP koncentracije 5×10–6

mol

dm3

bez pufera i u prisutnosti kakodilatnog pufera pH vrijednosti 7,4 prikazani su na Slici

4.2.5.

Slika 4.2.5. SERS spektri spoja ADAP a) bez kakodilatnog pufera i b) s kakodilatnim

puferom; c(ADAP) = 5×10–6

mol dm3

.

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

59

SERS spektri otopine ADAP bez pufera i s puferom nalikuju jedan drugome.

Prisutnost kakodilatnog pufera ne uzrokuje pojavu novih vrpca niti pomak postojećih vrpci.

Porast intenziteta vibracijskih vrpci u odnosu na spektar uzorka bez pufera posljedica je

agregacije nanočestica srebra izazvane ionima u sastavu pufera. Agregirane nanočestice

srebra doprinose pojačanju raspršenja s površine metala i shodno tome intenzivnijim vrpcama

u SERS spektru.109

4.2.2.4. SERS spektri smjesa spoja ADAP i DNA

4.2.2.4.1. Utjecaj priprave uzorka

Istražen je utjecaj priprave uzorka na pojačanje raspršenog zračenja kompleksa spoja

ADAP s ct-DNA pri omjeru ADAP/DNA 1/10 i koncentraciji spoja ADAP 5×10–6

mol

dm3

. Uzorci su pripravljeni na tri načina koji su se razlikovali prema redoslijedu dodavanja,

odnosno miješanja sastojaka s koloidnom suspenzijom srebra 1. Snimljeni spektri uspoređeni

su sa SERS spektrom spoja ADAP u prisutnosti pufera (Slika 4.2.6.a).

Slika 4.2.6. SERS spektri uzoraka ADAP/DNA s obzirom na pripravu uzoraka u usporedbi sa

SERS spektrom spoja ADAP. c(ADAP) = 5×10–6

mol dm3

, ADAP/DNA 1/10.

3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

(c)

(d)

60

Opažen je SERS spektar samo uzorka pripravljenog miješanjem spoja ADAP s

koloidom srebra, nakon čega je u suspenziju dodana DNA (Slika 4.2.6.b), dok uzorak

pripravljen miješanjem nukleinske kiseline s koloidom prije dodatka spoja, kao i onaj u koji je

koloid dodan nakon priprave kompleksa, nisu raspršili zračenje (Slike 4.2.6.c i d).

Kada se uzorak pripravlja prvotnim miješanjem koloida sa spojem, molekule ADAP

vežu se na površinu nanočestica srebra što rezultira pojačanjem Ramanovog raspršenja.

Naknadnim dodatkom DNA u uzorak intenzitet vrpci slabi, što se može pripisati vezanju

određenog broja molekula ADAP s nukleinskom kiselinom.

U slučaju kada se najprije pomiješaju nukleinska kiselina i koloid ili prethodno

pripravljeni kompleks i koloid, suvišak negativno nabijene DNA sprječava adsorpciju

molekula ADAP na površinu srebra. Elektrostatsko odbijanje negativno nabijenih fosfatnih

skupina okosnice DNA i kloridnih iona na površini nanočestica onemogućava nastalom

kompleksu približavanje površini metala s koje se raspršenje pojačava.

4.2.2.4.2. Interakcije molekula ADAP i DNA

U svrhu istraživanja interakcija molekula ADAP i DNA snimljeni su SERS spektri

smjesa spoja s DNA pripravljenih dodatkom koloida srebra 1 nastalom kompleksu (Slika

4.2.7). Svi uzorci sadržavali su spoj ADAP koncentracije 5×10–6

mol dm3

, a razlikovali su se

prema koncentracijskim omjerima ADAP/DNA u rasponu od 10/1 do 1/10.

U uzorcima koji su sadržavali suvišak spoja ADAP, smjese ADAP/DNA od 10/1

do 2/1, intenzitet vrpci spoja smanjuje se s porastom udjela DNA, što upućuje na smanjenje

broja molekula ADAP adsorbiranih na koloidne nanočestice uslijed vezanja s nukleinskom

kiselinom.133

Pri omjerima ADAP/DNA 1/1 i 1/2 slabe vrpce u SERS spektrima potječu od

kompleksa ADAP/DNA koji se nalazi u blizini površine srebra, s obzirom da u tim uzorcima

nema slobodnih malih molekula koje bi se mogle adsorbirati na nanočestice metala.

Prethodnim spektroskopskim mjerenjima utvrđeno je da ADAP uz dominantan način vezanja

odnosno interkaliranje, pri navedenim omjerima ostvaruje i drugačije interakcije s

nukleinskom kiselinom.126

Zahvaljujući pozitivno nabijenom dušiku u strukturi molekule

moguće su elektrostatske interakcije molekula ADAP s negativno nabijenim fosfatnim

61

skupinama DNA. Osim toga, amino skupine molekule interkalatora mogu stvarati vodikove

veze s kisikom iz šećera ili fosfata iz okosnice nukleinske kiseline.

Pri omjerima 1/5, 1/7 i 1/10 pri kojima je DNA prisutna u velikom suvišku u odnosu

na male molekule, gotovo u potpunosti nestaju SERS vrpce spoja ADAP, što upućuje na

interkaliranje molekula spoja u DNA kao jedini način vezanja s nukleinskom kiselinom. Pri

navedenim omjerima molekule ADAP duboko su umetnute u dvostruku zavojnicu i ne mogu

se približiti površini metala što je uvjet za pojačanje Ramanovog raspršenja.

Slika 4.2.7. SERS spektri spoja ADAP i kompleksa ADAP/DNA molarnih omjera od 10/1 do

1/10 (od vrha prema dolje); c(ADAP) = 5×10–6

mol dm3

.

Usporedbom SERS spektara kompleksa ADAP/DNA i spektra slobodnih molekula

interkalatora nije zamjećena pojava novih vrpci (Tablica 4.2.2). Osim smanjena intenziteta

svih vrpci u SERS spektru, nema značajnih pomaka vrpci u spektru kompleksa u odnosu na

spektar samog spoja ADAP. Spomenuta opažanja su i očekivana, s obzirom da većina vrpci u

spektru potječe od vibracijskih modova planarnog diazapirenskog sustava koji se umeće

između parova baza DNA. S povećanjem količine DNA položaj mijenja samo vrpca pri 238

cm1

koja se pomiče prema 232 cm–1

. Pomak prema manjem valnom broju pripisan je

slabljenju kemijske veze interkalatora s površinom metala uslijed favoriziranog vezanja

molekula s nukleinskom kiselinom.

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

72

1

97

29

9813

86

16

22

62

Opažene promjene u SERS spektrima pri odgovarajućim omjerima interkalatora i

nukleinske kiseline u skladu su s rezultatima mjerenja fluorescencije i cirkularnog dikroizma

uzoraka.126

Tablica 4.2.2. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja ADAP i kompleksa ADAP/DNA

različitih molarnih omjera; c(ADAP) = 5×10–6

mol dm3

.

Valni broj / cm–1

Vibracija ADAP

[ADAP]/[DNA]

10/1 7/1 5/1 2/1 1/1 1/2

1622 1622 1622 1622 1622 1622 1622 ν CC diazapiren

1592 1592 1591 1591 1595 1596 1600 ν CC fenil

1569 1569 1569 1569 1569 1568 1568 ν CC/CN diazapiren

1526 1526 1526 1525 1527 1525 1524 ν CC diazapiren

1512 1513sh 1513sh 1512sh 1512 1512 1511 ν CC, ν CC/CN diazapiren

1450 1450 1451 1450 1451 1450 1450 δas CH3

1437 1437 1437 1437 1438 1437 1440sh ν CC/CN diazapiren

1386 1385 1386 1385 1385 1385 1385 ν CC diazapiren,

δs CH3

1347 1347 1346 1346 1347 1348 1348 ν CC diazapiren

1336 1337 1340sh 1340sh 1338 ν CC diazapiren

1310 1311 1311 1311 1310 1312 1310 δip C–H

1301 1302 1301 1301 1302sh δip C–H

1182 1182 1182 1182 1182 1183 1182 δip C–H

1150 1149 1149 1149 1149 1149 1148 δip C–H

1030 1030 1030 1030 1030 1030 1032 ν CC diazapiren

998 996 996 996 997 996 997 δ CC fenil

972 972 972 972 972 971 971 δ CC fenil

893 891 890 892 893 892 891 ν CC diazapiren

854 855 855 859 854 861 850 δ diazapiren

825 825 825 824 824 δ diazapiren

721 721 721 721 721 721 721 δ diazapiren

439 438 439 438 438 439 438 γ diazapiren

364 364 364 363 363 363 363 γ diazapiren

238 239 239 239 238 233 232 ν Ag–O / ν Ag–S / ν Ag–N

211sh 211sh ν Ag–N

ν, istezanje; δ, deformacija; γ, torzija; ip, u ravnini; s, simetrično; as, antisimetrično; sh, rame

63

4.3. Istraživanje interakcija spojeva IM i PY s polinukleotidima

4.3.1. FT-Ramanovi spektri spojeva IM i PY

Snimljeni su Ramanovi spektri krutih uzoraka IM i PY te njihovih vodenih otopina

koncentracije 1×10–3

mol dm–3

(Slike 4.3.1 i 4.3.2). Obje poliaminske molekule slabo

raspršuju zračenje, na što upućuje slab intenzitet i mali broj vrpci u spektru čvrstih uzoraka,

dok je koncentracija spojeva u vodenim otopinama nedovoljna za opažanje Ramanovog

raspršenja te spektri otopina odgovaraju spektru vode.

Slika 4.3.1. FT-Ramanovi spektri a) krutog uzorka IM i b) vodene otopine IM,

c = 1×10–3

mol dm–3

.

U Ramanovom spektru molekule IM, koja na krajevima tri aminometilenska lanca

sadrži imidazolne prstenove, opaža se široka vrpca u području valnih brojeva 30002850 cm–1

koja se pripisuje istezanjima C–H veza metilenskih skupina, i dijelom prekriva vrpcu istezanja

C–H veza imidazolnih jedinica pri 3110 cm–1

(Tablica 4.3.1).134

Slabe vrpce pri 1624 cm–1

i

1318 cm–1

te srednja vrpca pri 1464 cm–1


potječu od istezanja

imidazolnih prstenova. Pri tome, deformacije metilenskih skupina doprinose širokim vrpcama

pri 1464 cm–1

i 1318 cm–1

. Oštra vrpca srednjeg intenziteta pri 1277 cm–1

posljedica je

deformacija CH skupina imidazolnog prstena u ravnini, a vrpce pri 830 cm–1

i 747 cm–1

3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(b)

(a)

64

svijanja van ravnine. Uslijed C–C i C–N istezanja aminometilenskih lanaca opažene su slabe

vrpce između 1200 cm–1

i 950 cm–1

.

Slika 4.3.2. FT-Ramanovi spektri a) krutog uzorka PY i b) vodene otopine PY,

c = 1×10–3

mol dm–3

.

U Ramanovom spektru poliaminskog spoja s piridinskim prstenovima u strukturi, PY,

većina vrpci odgovara vibracijskim modovima aromatskih jedinica (Tablica 4.3.2).135

Slično

spoju IM, vrpce istezanja aromatskih i alifatskih CH veza opažaju se pri 3076 cm–1

odnosno

2964 cm–1

. Srednje vrpce pri 1642 cm–1

i 1462 cm–1

te slaba vrpca pri 1602 cm–1

pripisuju se

istezanjima piridinskih skupina, dok je intenzivna vrpca pri 1010 cm–1

posljedica vibracije,

tzv. „disanja“ aromatskog prstena. Ostale vrpce u spektru potječu od deformacija CH skupina

i torzija piridinskih prstenova.

3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400

R

am

an

ov in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

65

4.3.2. SERS spektri spojeva IM i PY


Snimljeni su SERS spektri spoja IM koncentracije 1×10–4

mol dm–3

na koloidima 1, 2

i 3 (Slika 4.3.3). Iako se u spektrima sva tri uzorka uočavaju slabe i većinom široke vrpce u

području 1600800 cm1

, najizraženije su uzorku pripravljenom na koloidu 2. Nanočestice

srebra koloidne suspenzije 2 nose negativan naboj uslijed citratnih aniona na površini te

stvaraju Coulombove interakcije s molekulama spoja IM, koje su višestruko pozitivno

nabijene pri pH koloidne suspenzije 7,69.127

Intenzivna vrpca pri približno 240 cm1

pripisuje

se istezanju AgCl veze nastale između površine srebra i kloridnih iona u sastavu spoja, kao i

onih prisutnih u koloidnoj suspenziji 1.

Slika 4.3.3. SERS spektri spoja IM na a) koloidu 1, b) koloidu 2 i c) koloidu 3;

c(IM) = 1×10–4

mol dm–3

.

S obzirom da su IM i PY slične poliaminske strukture, za pretpostaviti je da će

pojačanje raspršenog zračenja molekule s piridinskim prstenovima također biti najveće na

nanočesticama srebra pripravljenim redukcijom s citratom, pa su mjerni uzorci oba spoja za

daljnja istraživanja pripravljani u koloidnoj suspenziji 2.

3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

(c)

66


Snimljeni su SERS spektri spojeva IM i PY u koloidnoj suspenziji srebra 2 u

koncentracijskom području 1×10–6

–1×10–4

mol dm3

(Slike 4.3.4 i 4.3.5).

Slika 4.3.4. SERS spektri spoja IM: a) c = 1×10–4

mol dm3

, b) c = 5×10–5

mol dm3

,

c) c = 1×10–5

mol dm3

, d) c = 5×10–6

mol dm3

i e) c = 1×10–6

mol dm3

.

Usporedbom Ramanovog spektra krutog uzorka i SERS spektara spoja IM uočava se

pomak vrpce pri 1624 cm–1

u Ramanovom spektru prema 1582 cm–1

u SERS spektru, te

porast intenziteta vrpci pri 1450 i 1326 cm–1

u SERS spektrima (Tablica 4.3.1). Osim

promjena vrpci koje potječu od istezanja imidazolnih prstenova, smještanje molekula blizu

površine srebra uzrokuje i pojačanje vrpci pri 1282, 840 i 744 cm–1

pripisanih deformacijama

CH skupina imidazolnih jedinica. Široka vrpca pri 1400 cm–1

te vrpce ispod 1100 cm–1

, sve

označene zvjezdicom na spektrima, ne potječu od istraživanog spoja nego su rezultat

vibracijskih modova citratnih aniona i njihovih oksidacijskih produkata koji su zaostali u

suspenziji nakon priprave koloida.131

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

67

Tablica 4.3.1. Vibracijske vrpce u FT-Ramanovom spektru krutog uzorka i SERS spektrima

spoja IM različitih koncentracija.130,134

Valni broj / cm–1

Vibracija FT-

Raman SERS

IM 1×10

–4

mol dm–3

5×10–5

mol dm–3

1×10–5

mol dm–3

5×10–6

mol dm–3

1×10–6

mol dm–3

3110sh ν C–H imidazol

2967 2964 2969 2969sh 2970sh 2970sh ν C–H (CH2)

1624 1582 1581 1582 1581 1577 ν imidazol

1464 1450 1447 1450sh 1450sh 1451sh ν imidazol, δsc CH2

1457 ν imidazol

1376 1394 1403 1400 1400 citrati

1318 1326 1328 1332 1328w 1325sh ν imidazol, δtw,wg CH2

1277 1282 1282 1283 1282 1282 δip C–H imidazol

1179 1170 1172 1178 1172w 1170 ν C–N

1134 1143 1143 1142 ν C‒C/C–N

1107 1102 1083 1087 1096 citrati

1060 δip C–H imidazol

1037 1038 1030 1030 1037 citrati

981 1008 1011 1010sh 1008sh 1010sh ν C–C/C‒N

950 951 951 950 951 citrati

927sh 928 927 931 923 nitrati

837 833 836 837 835 δoop C–H imidazol

744 736 738 749 738 δ C–H imidazol

238 235 ν Ag–Cl

226 226 220b ν Ag–N

ν, istezanje; δ, deformacija; ip, u ravnini; oop, izvan ravnine; sh, rame; tw, savijanje; wg, mahanje; sc, striženje

68

Slika 4.3.5. SERS spektri spoja PY: a) c = 1×10–4

mol dm3

, b) c = 5×10–5

mol dm3

,

c) c = 1×10–5

mol dm3

, d) c = 5×10–6

mol dm3

i e) c = 1×10–6

mol dm3

.

Slično spoju IM, vrpce istezanja piridinskog prstena pri 1642 cm–1

i 1602 cm–1

pomiču se prema 1610 cm–1

i 1561 cm–1

u SERS spektrima PY. Osim toga, povećava se

intenzitet vrpce pri 1011 cm–1

, koja odgovara vibracijskom modu disanja piridinskog prstena,

te vrpca pri 1214 cm–1

i 1068 cm–1

, koje se pripisuju deformacijama CH skupina prstena u

ravnini. I u SERS spektrima spoja PY uočavaju se vrpce vibracija citratnih iona na površini

nanočestica.

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

****

*

*

*

*

*

*

*

**

*

*

**

*

*

*

69


spoja PY različitih koncentracija.130,135

Valni broj / cm–1

Vibracija FT-

Raman SERS

PY 1×10

–4

mol dm–3

5×10–5

mol dm–3

1×10–5

mol dm–3

5×10–6

mol dm–3

1×10–6

mol dm–3

3076 3061 3062 3066 3065 3065 ν C–H piridin

2964 2962 2962sh 2963sh 2963 2968 ν C–H (CH2)

1642 1610 1611 1613 1614 1615 ν piridin

1602 1561 1559 1561 1566 1565sh ν piridin

1500 1500 1493 1502 1505 ν piridin

1462 1450 1449 ν piridin, δsc CH2

1394 1394 1394 1395 1401 citrati

1327 1330 1338 1338 δtw,wg CH2, δip C–H piridin

1215 1214 1214 1214 1215 1215 δip C–H piridin

1106 1101 δip C–H piridin

1066 1068 1068 1069 1069 1071 δip C–H piridin

1036 1036 1034sh 1032sh 1032sh citrati

1010 1011 1011 1014 1015 1016 ν piridin

(disanje prstena)

949 949 951 951 951 citrati

926sh 924 925 926 925 nitrati

837 830 835 837 836 836 γ piridin

800 800 800 800 801 citrati

739 738 738 738 738sh δoop C–H piridin

651 667 668 667 668 669 γ piridin

239 238 ν Ag–Cl

228 228 216b ν Ag–N


U SERS spektrima spojeva IM i PY intenzitet vrpci vibracijskih modova poliaminskih

spojeva raste s povećanjem koncentracije u uzorku. Tako vrpce oko 1450 cm–1

i 1000 cm–1

,

koje su pri nižim koncentracijama prekrivene širokim vrpcama citrata, postaju vidljive i dobro

definirane u SERS spektrima najveće mjerene koncentracije. S obzirom da povećanje

koncentracije ne uzrokuje značajnije pomake vrpci niti pojavu novih vrpci, osim onih koje su

prvotno prekrivene vrpcama vibracija citrata, može se zaključiti da su razlike između SERS

spektara različitih koncentracija posljedica utjecaja citratnih iona na površini nanočestica, a ne

promjene orijentacije molekula na njihovoj površini.

70

Površinskom pojačanju raspršenja zračenja molekula IM i PY doprinose

elektromagnetski i kemijski mehanizam. Elektrostatske interakcije između pozitivno nabijenih

molekula i citratnih aniona na nanočesticama srebra omogućavaju blizinu poliaminskih

molekula i površine metala, koja je preduvjet za površinsko pojačanje raspršenja. S obzirom

da i IM i PY na krajevima lanaca sadrže aromatske prstenove s dušikom, mogu stvarati σ-

vezu sa srebrom preko slobodnog para elektrona na dušikovom atomu. Uslijed redistribucije

naboja u aromatskim prstenovima izazvane vezanjem s površinom srebra, vrpce koje potječu

od istezanja prstenova, između 1650 i 1600 cm–1

u Ramanovom spektru krutog uzorka

pomiču se prema nižim valnim brojevima u SERS spektru. Na kemijsko vezanje poliaminskih

spojeva sa srebrovim nanočesticama upućuju i vrpce pri 226 cm–1

i 223 cm–1

u spektrima IM,

odnosno PY, koje se uočavaju pri koncentracijama manjim od 1×10–5

mol dm3

, a pripisuju

istezanju Ag–N veze. Pri većim koncentracijama poliaminskih molekula, koncentracija

kloridnih iona doprinosi intenzivnoj vrpci istezanja Ag–Cl veze (238 cm–1

) koja prekriva

vrpcu istezanja veze poliaminskih molekula sa srebrom.

4.3.2.3. Utjecaj NaBH4

S obzirom da su u SERS spektrima spojeva IM i PY opažne vrpce vibracija iona

koloidne suspenzije koje prekrivaju vrpce vibracija istraživanih molekula, tzv. anomalne

vrpce, bilo ih je potrebno ukloniti. Interferencije izazvane citratnim aniona mogu se umanjiti

dodatkom natrijevog borhidrida u mjerni uzorak, s obzirom da borhidridni ioni smanjuju

električni potencijal površine srebra i uzrokuju desorpciju citratnih iona.130

Dodatkom natrijevog borhidrida na koloid 2 spektar koloidne suspenzije srebra se ne

mijenja, odnosno ne uočavaju se vrpce koje bi potjecale od NaBH4 (Prilog 1). S obzirom da

vrpce citratnih aniona najviše utječu na SERS spektre otopina poliaminskih molekula nižih

koncentracija, snimljeni su spektri spojeva IM i PY koncentracije 5×10–6

mol dm3

na

koloidu 2 bez natrijevog borhidrida i nakon njegova dodatka (Slike 4.3.6 i 4.3.7).

U SERS spektru spoja IM snimljenom na koloidu 2 s natrijevim borhidridom, vrpce

vibracijskih modova citrata, označene zvjezdicom na Slici 4.3.6 nestaju, a javljaju se vrpce

vibracijskih modova spoja koje su u spektru bez NaBH4 prekrivene anomalnim vrpcama.

Tako se opažaju vrpce pri 1445 cm–1

i 1058 cm–1

pripisane istezanju imidazola, odnosno

deformacijama CH skupina prstena u ravnini, te pojačava intenzitet vrpci pri 1357, 1329 i

1002 cm–1

.

71

Slika 4.3.6. SERS spektri spoja IM na a) koloidu 2 i b) koloidu 2 s NaBH4;

c(IM) = 5×10–6

mol dm3

. c) FT-Ramanov spektar krutine IM.

Dodatkom natrijevog borhidrida u mjerni uzorak spoja PY također izostaju anomalne

vrpce citratnih iona (Slika 4.3.7). Pri tome se vrpce vibracijskih modova spoja PY pojačavaju,

osobito vrpca pri 1630 cm–1

. Međutim, u spektru dominira nova, vrlo intenzivna vrpca pri

1087 cm–1

, za koju se, s obzirom da je selektivno pojačana i da ne odgovara vibraciji spoja,

pretpostavlja da je posljedica prisutnosti NaBH4 u mjernom sustavu.

Zanimljivo je uočiti da vrpce pri 226 cm–1

(IM) i 228 cm

–1 (PY), koje potječu od

istezanja veze srebra i dušika u strukturi spojeva nestaju, te da se u području niskih valnih

brojeva javlja široka vrpca pri 310 cm–1

nepoznatog porijekla. Iako su dodatkom natrijevog

borhidrida interferirajuće vrpce citratnih iona na površini nanočestica uspješno uklonjene iz

SERS spektra, javile su se nove vrpce, koje nije bilo moguće asignirati.

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

(c)

**

* *

72

Slika 4.3.7. SERS spektri otopina PY na a) koloidu 2 i b) koloidu 2 s NaBH4;

c(PY) = 5×10–6

mol dm3

. c) FT-Ramanov spektar krutine PY.


S obzirom da su ishodne otopine DNA i RNA polinukleotida pripravljene u

kakodilatnom puferu, istražen je utjecaj pufera na SERS spektre IM i PY. Snimljeni su SERS

spektri uzoraka spojeva IM, odnosno PY, c = 5×10–6

mol dm–3

, na koloidu 2, u prisutnosti

kakodilatnog pufera. SERS spektri obje poliaminske molekule bez i s puferom u sustavu

gotovo su isti (Slike 4.3.8 i 4.3.9). Blagi porast intenziteta pojedinih vrpci, osobito spoja PY,

pripisuje se agregaciji koloidnih nanočestica srebra ionima u sastavu pufera koja rezultira

pojačanjem raspršenog zračenja.109

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

(c)

* ** *

73

Slika 4.3.8. SERS spektri spoja IM a) s kakodilatnim puferom i b) bez kakodilatnog pufera;

c(IM) = 5×10–6

mol dm3

.

Slika 4.3.9. SERS spektri spoja PY a) s kakodilatnim puferom i b) bez kakodilatnog pufera;

c(PY) = 5×10–6

mol dm3

.

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

74

4.3.2.5. SERS spektri smjesa spojeva IM i PY s polinukleotidima i DNA

Snimljeni su SERS spektri jednolančanih RNA polinukleotida, dvolančanih RNA i

DNA polinukleotida te ct-DNA u koloidnoj suspenziji 2 (Prilog 2). U spektrima nisu

zamijećene vrpce koje potječu od vibracijskih modova šećera, baze ili fosfata u strukturi

polinukleotida. Budući da polinukleotidi nose negativan naboj fosfatnih skupina okosnice,

odbojne elektrostatske sile s citratnim anionima na površini nanočestica sprječavaju

približavanje biomolekula površini srebra s koje se raspršeno zračenje pojačava. Utvrđeno je,

međutim, da se molekule IM i PY smještaju vrlo blizu nanočestica pri čemu vrlo vjerojatno

mijenjaju naboj na površini metala. Za očekivati je također da će polinukleotidi stvarati

interakcije s molekulama poliamina na površini i tako se približiti nanočesticama srebra. Iz

tog razloga mjerni uzorci za istraživanje interakcija poliaminskih spojeva s polinukleotidima

pripravljeni su miješanjem najprije koloidne suspenzije srebra i otopina malih molekula,

nakon čega je dodan odgovarajući polinukleotid.

4.3.2.5.1. SERS spektri smjesa spojeva IM i PY s jednolančanim RNA polinukleotidima

Snimljeni su SERS spektri smjesa jednolančanih RNA polinukleotida (poli A, poli G,

poli C i poli U) sa spojevima IM i PY u koloidnoj suspenziji srebra 2 (Slike 4.3.10 i 4.3.11).

Koncentracija poliaminskih molekula u smjesama iznosila je 5×10–6

mol dm–3

, a molarni

omjer spojeva u smjesi, u kojem je koncentracija polinukleotida izražena kao koncentracija

fosfata, bio je 1/20.

U odnosu na SERS spektre samih spojeva, u spektrima njihovih smjesa s

jednolančanim polinukleotidima opaža se povećanje intenziteta vrpci koje potječu od malih

molekula, pri čemu spektri nalikuju onima najveće mjerene koncentracije 1×10–4

mol dm–3

(Slika 4.3.4.a i 4.3.5.a). Osobito su pojačane vrpce istezanja aromatskih prstenova pri 1580

cm–1

(IM) i 1611 cm–1

(PY), te vrpca pri 1450 cm–1

koja je u spektrima spojeva koncentracije

5×10–6

mol dm–3

prekrivena anomalnom vrpcom citrata. Uz porast SERS intenziteta vrpci,

prisutnost polinukleotida u uzorku uzrokuje i relativne promjene intenziteta pojedinih vrpci.

Primjerice, u spektru smjese IM s poli C omjer intenziteta vrpci pri 1450 cm–1

i 1281 cm–1

,

I1450/I1281, jednak je 1,08, dok u spektru spoja IM koncentracije 1×10–4

mol dm3

on iznosi

0,89. S obzirom na izborna pravila na površini koja vrijede u SERS spektroskopiji, relativne

promjene intenziteta vrpci u SERS spektru upućuju na promjenu položaja molekule na

75

površini metala. Pretpostavlja se stoga da se interakcijom spojeva IM i PY s polinukleotidima

mijenja orijentacija poliaminskih molekula na površini srebra, uslijed čega su različiti

vibracijski modovi malih molekula različito pojačani.

Slika 4.3.10. SERS spektri a) IM, b) IM/poli A, c) IM/poli G, d) IM/poli C i e) IM/poli U;

c(IM) = 5×10–6

mol dm–3

, IM/poli 1/20. Anomalne vrpce koje potječu od citratnih i

nitratnih iona označene su zvjezdicom (*).

1800 1600 1400 1200 1000 800 600

*

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

im

u

c

g

a

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

15

82 *

13

28

12

81

** *

83

6

75

07

31

92

3**

13

30

*1

42

2

14

95

80

47

95

92

6

13

30

13

55 14

21

14

21

15

00

****

79

1

92

713

5214

23

16

25 **

**

79

5

92

5

13

56

14

22

14

98

****

76

Slika 4.3.11. SERS spektri a) PY, b) PY/poli A, c) PY/poli G, d) PY/poli C i e) PY/poli U;

c(PY) = 5×10–6

mol dm–3

, PY /poli 1/20. Anomalne vrpce koje potječu od citratnih i

nitratnih iona označene su zvjezdicom (*).

Osim povećanja i relativne promjene intenziteta vrpci koje potječu od malih molekula,

u SERS spektrima smjesa uočene su nove vrpce koje su pripisane vibracijskim modovima

polinukleotida (Tablica 4.3.3).136

U spektrima svih smjesa opaža se vrpca pri 1422 cm–1

koja

odgovara deformaciji metilenske skupine, a može se pripisati bilo CH2 skupinama

aminometilenskih lanaca u strukturi spojeva IM i PY, bilo 5'CH2 skupinama šećera u

okosnici.136

S obzirom da odgovarajuća vrpca nije uočena niti u Ramanovim spektrima krutih

uzoraka niti u SERS spektrima spojeva, pretpostavlja se da vrpca potječe od vibracije riboze.

Druga vrpca koja se pripisuje šećeru javlja se pri 925 cm–1

, no djelomično je prekrivena

vrpcom nitratnih aniona.

1800 1600 1400 1200 1000 800 600

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

B

u

c

g

a

16

14

15

66

* 12

14

10

70

*

10

11

* 83

7

*

73

9

66

8

**

**

73

2

92

4

12

711

33

2

14

20

92

5

12

71

13

35

14

21

****

**

**

****

92

5

12

93

14

22

92

5

12

9014

23

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

77

Tablica 4.3.3. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja IM i smjesama s jednolančanim

RNA polinukleotidima.130,134,136

Valni broj / cm–1

Vibracija c(IM) / mol dm3

[IM]/[poli] 1/20

1×10–4

5×10–6

IM/poli A IM/poli G IM/poli C IM/poli U

2964 2970sh 2963 2963 2963 2963 ν C–H (CH2)

1625 citozin

1582 1581 1579 1577 1580 1578 ν imidazol

1500 gvanin

1495 adenin

1495 uracil

1450 1450sh 1454 1452 1450 1451 ν imidazol, δsc CH2

1422 1421 1423 1422 δip CH2 šećer (C5'H2)

1376 1400 1387 1392 1393 1393 citrati

1356 uracil

1355sh gvanin

1352 citozin

1330 gvanin

1330 adenin

1326 1328 1324 1327 ν imidazol, δtw,wg CH2

1282 1282 1281 1280 1282 1282 δip C–H imidazol

1170 1172 1166 1171 1173 1168 ν C–N

1143 1147 1148 1148 1148 ν C–C/C‒N

1107 1087 1089 1093 1093 1091 citrati

1037 1030 1036 1029 1029 1036 citrati

1008 1016 1012 1012 ν C–C/C‒N

950 950 951 951 951 951 citrati

927sh 931 923 927 927 925 nitrati, šećer (ν C–C)

837 837 825 832 832 832 δoop CH imidazol

804 795 791 795 okosnica (ν O–P‒O)

744 749 748 747 745 δoop C–H imidazol

731 adenin

238 235 235 235 235 ν Ag–Cl

226 ν Ag–N


78

Najznačajnije promjene zamijećene su u spektru smjese IM/poli A. Uočava se vrlo

intenzivna vrpca pri 1330 cm–1

, koja potječe od istezanja aromatskog sustava adenina, te

vrpca pri 731 cm–1

koja se pripisuje disanju prstena adenina. Nova vrpca u spektru smjese

IM/poli G pri 1330 cm–1


odgovara vibracijama istezanja gvanina.

U SERS spektrima pirimidinskih baza javljaju se slabe vrpce pri 1352 cm–1

i 1356

cm–1

, koje se pripisuju deformacijama u ravnini C5H i C6H skupina citozina odnosno

uracila. U spektru smjese IM/poli C opaža se i slaba vrpca pri 1625 cm–1

koja odgovara

istezanju C=O skupine citozina, a upućuje na vezanje molekule spoja IM s citozinom preko

karbonilne skupine. U SERS spektrima smjesa IM/poli C i IM/poli U vrpce pri 791 cm–1

odnosno 795 cm–1

posljedica su simetričnog istezanja veza šećera i fosfata u okosnici (5'C–

O–P–O–C3).

Vrpca istezanja CC i CN veza poliaminskih lanaca pri približno 1012 cm–1

različitog je intenziteta u SERS spektrima, ovisno o polinukleotidu u smjesi. Intenzivna je u

spektru smjese s poli G, srednje jaka u spektrima smjesa s poli A i poli U, dok se u spektru

smjese s poli C javlja kao rame prekriveno susjednom vrpcom citrata (1029 cm–1

). Vrlo je

vjerojatno da se uslijed vezanja s različitim dušičnim bazama poliaminske molekule različito

smještaju na površini metala što rezultira različitim pojačanjem raspršenog zračenja vibracije

okosnice molekula.

Promjene u SERS spektrima smjesa IM s jednolančanim RNA polinukleotidima

pripravljenim na koloidu 2 u prisutnosti natrijeva borhidrida u skladu su s opisanim

promjenama u SERS spektrima uzoraka koji nisu sadržavali borhidridne anione (Prilog 3).

Slično SERS spektrima smjesa spoja IM, i u spektrima smjesa spoja PY s

jednolančanim polinukleotidima uočene su vrpce koje potječu od vibracijskih modova

polinukleotida (Tablica 4.3.4).

Vrpce vibracija adenina koje upućuju na interakciju PY s poli A opažaju se pri 1332

cm–1

i 732 cm–1

, dok široko rame pri 1335 cm–1

u spektru smjese s poli G ukazuje na vezanje

s gvaninom. U spektrima smjesa PY s polinukleotidima purinskih baza javlja se i slaba vrpca

pri 1271 cm–1

koja odgovara istezanju C–N veze amino skupine vezane na prsten dušične

baze. Slabe vrpce pri 1293 cm–1

i 1290 cm–1

u SERS spektrima smjesa s poli C odnosno poli

U posljedica su interakcija malih molekula s polinukleotidima pirimidinskih baza, a potječu

od vibracija prstena.

79

Tablica 4.3.4. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja PY i smjesama s jednolančanim


Valni broj / cm–1

Vibracija c(PY) / mol dm3

[PY]/[poli] 1/20

1×10–4

5×10–6

PY/poli A PY/poli G PY/poli C PY/poli U

3061 3065 3063 3062 3063 3063 ν C–H piridin

2962 2963 2963 2964 2964 2964 ν C–H (CH2)

1610 1614 1611 1611 1611 1611 ν piridin

1561 1566 1588 1561 1557 1556 ν piridin

1500 1502 1500 1503 1498 1502 ν piridin

1450 1453 1452 1451 1451 ν piridin, δsc (CH2)

1420 1421 1422 1423 δip C–H šećer (C5'H2)

1394 1395 1397 1397 1397 1396 citrati

1335sh gvanin

1332 adenin

1330 δtw,wg (CH2),

δip C–H piridin

1293 citozin

1290 uracil

1271 gvanin

1271 adenin

1214 1215 1214 1214 1214 1214 δip C–H piridin

1101 δip C–H piridin

1068 1069 1070 1070 1070 1070 δip C–H piridin

1036 1032sh 1034sh 1035sh 1033sh 1035sh citrati

1011 1015 1011 1011 1011 1011 ν piridin

(disanje prstena)

949 951 950 950 950 950 citrati


830 836 834 840 837 838 γ piridin

800 800 799 798 799 799 citrati,

okosnica (ν O–P‒O)

739 738 739 739 739 δoop C–H piridin

732 adenin

667 668 668 668 668 668 γ piridin

239 236 236 238 236 ν Ag–Cl

228 ν Ag–N


Dodatak natrijevog borhidrida u uzorke smjesa PY s jednolančanim RNA

polinukletodima nije uzrokovao promjene u odnosu na opisane spektre (Prilog 4).

80

4.3.2.5.2. SERS spektri smjesa spojeva IM i PY s dvolančanim DNA i RNA polinukleotidima

Pri istraživanju interakcija IM i PY s dvolančanim polinukleotidima korišteni su

polinukleotidi strukture uzvojnice, poli dAdT–poli dAdT, poli dGdC–poli dGdC te poli rA–

poli rU. Koncentracija malih molekula u uzorcima pripravljenim u koloidnoj suspenziji srebra

2 bila je 5×10–6

mol dm–3

, a molarni omjeri smjesa u kojima je koncentracija polinukleotida

izražena kao koncentracija fosfata 1/20.

U SERS spektrima svih smjesa s dvolančanim polinukleotidima opaža se povećanje

intenziteta vibracijskih vrpci imidazola pri 1580, 1450 i 1280 cm–1

, te piridina pri 1610, 1560

i 1450 cm–1

, što upućuje na vezanje poliamina s polinukleotidima. Prilikom interakcija s

polinukleotidima imidazolni i piridinski prstenovi orijentiraju se okomito na površinu srebra

čime se polarizabilnost malih molekula povećava, a raspršeno zračenje pojačava. Iz toga

slijedi da su polinukleotidi na površini srebra smješteni okosnicom paralelno površini srebra,

a dušičnim bazama okomito na metalnu površinu.

Vrpca u spektrima smjesa, koja se javlja pri 1422 cm–1

i pripisuje deformaciji 5'CH2

skupine šećera, podupire pretpostavku o smještaju okosnice blizu površine srebra (Tablica

4.3.5). Vrpce koje potječu od fosfata okosnice nisu opažene u spektrima smjesa s

dvolančanim polinukleotidima, uslijed bilo prekrivanja s anomalnim vrpcama bilo položaja

P–O veza u ravnini s metalnom površinom gdje promjene polarizabilnosti ne doprinose

površinskom raspršenju.

81

Slika 4.3.12. SERS spektri a) IM, b) IM/poli dAdT–poli dAdT, c) IM/poli dGdC–poli dGdC,

d) IM/poli rA–poli rU i e) IM/ct-DNA; c(IM) = 5×10–6

mol dm–3

, IM/poli 1/20.

Anomalne vrpce koje potječu od citratnih i nitratnih iona označene su zvjezdicom (*).

U SERS spektru smjese IM s poli dAdT–poli dAdT opažena je jaka vrpca istezanja

adenina pri 1330 cm–1

i slabija vrpca pri 732 cm–1

koja potječe od disanja prstena. Pod

pretpostavkom da se u spektru smjesa opažaju vrpce vibracija onih funkcionalnih skupina

polinukleotida koje se nalaze najbliže površini metala, kao posljedica interakcije s

poliaminima na nanočesticama srebra, može se odrediti mjesto vezanja molekula. Vibracija

adenina pri većem valnom broju odnosi se na istezanje peteročlanog prstena čiji se N7 atom

nalazi u velikom utoru. S obzirom da taj dušikov atom ne sudjeluje u Watson-Crickovom

sparivanju baza, on predstavlja slobodno mjesto za vezanje s poliaminom. S druge strane,

vrpca disanja adenina pri nižem valnom broju potječe od vibracije šesteročlanog prstena s N3

atomom u malom utoru, slobodnom za interakcije s malim molekulama. Za pretpostaviti je

stoga da se molekule spoja IM vežu i u mali i u veliki utor poli dAdT–poli dAdT

polinukleotida.

U spektrima smjesa spoja IM s poli dGdC–poli dGdC javljaju se vrpce vibracijskih

modova dušičnih baza pri 1327 cm–1

i 1352 cm–1

. Dok je vrpca pri manjem valnom broju

posljedica istezanja purinske baze, vrpci pri većem valnom broju doprinose i istezanje

peteročlanog prstena gvanina i deformacije C5–H i C6–H skupina na prstenu citozina. S

1800 1600 1400 1200 1000 800 600

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

15

81 *

12

82

13

28

** * 8

37

74

9

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

73

292

7

13

30

14

22

92

9

13

27

13

52

14

23

92

9

13

30

14

23

*

*

92

5

13

28

13

55

14

22

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

**

82

obzirom da se i N7 atom prstena gvanina i navedene CH skupine citozina nalaze u velikom

utoru, pretpostavlja se vezanje molekula spoja IM u veliki utor poli dGdC–poli dGdC

polinukleotida. Također, u SERS spektru nije uočena vrpca istezanja C=O skupine citozina

koja bi upućivala na interakcije u malom utoru polinukleotida. Favorizirano vezanje molekula

u veliki utor poli dGdC–poli dGdC polinukleotida u skladu je s činjenicom da amino skupina

gvanina u malom utoru stvara steričku smetnju i čini ga manje reaktivnim mjestom za vezanje

malih poliaminskih molekula.

U SERS spektrima smjesa spoja IM s dvolančanim RNA analogom, poli rA–poli rU,

opažena je vrpca pri 1330 cm–1

i pripisana istezanju prstena adenina s N7 atomom u velikom

utoru. S obzirom da nisu uočene vrpce koje bi odgovarale drugim vibracijskim modovima

adenina i uracila, za pretpostaviti je da se molekule IM vežu s adeninom u velikom utoru poli

rA–poli rU polinukleotida. Vezanje poliaminskih molekula isključivo u veliki utor, za razliku

od interakcija s velikim i s malim utorom polinukleotida koji osim adenina sadrži i timin,

posljedica je razlike u strukturi uzvojnica. Mali utor poli rA–poli rU polinukleotida širi je i

plići od malog utora poli dAdT–poli dAdT te onemogućava učinkovito vezanje malih

molekula.

83

Tablica 4.3.5. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja IM i smjesama s dvolančanim DNA

i RNA polinukleotidima te ct-DNA. 130,134,136

Valni broj / cm–1

Vibracija IM c = 1×10

–4

mol dm–3

IM c = 5×10

–6

mol dm–3

[IM]/[poli] 1/20

IM/

poli dAdT–

poli dAdT

IM/

poli dGdC–

poli dGdC

IM/

poli rA–

poli rU

IM/

ct-DNA

2964 2970sh 2963 2963 2963 2962 ν C–H (CH2)

1582 1581 1578 1579 1579 1578 ν imidazol

1450 1450sh 1452 1451 1451 1450 ν imidazol, δsc CH2

1422 1423 1423 1422 δip C–H šećer (C5'H2)

1376 1400 1392 1394 1392 1395 citrati

1352 1355sh gvanin

1352 citozin

1330 1330 1328 adenin

1327 1328 gvanin

1326 1328 ν imidazol, δtw,wg CH2

1282 1282 1282 1282 1282 1282 δip C–H imidazol

1170 1172 1167 1170 1170 1170 ν C–N

1143 1148 1152 1148 1146 ν C–C/C‒N

1107 1087 1096 1095 1095 1094 citrati

1037 1030 1036 1036 1036 1036 citrati

1008 1014 1011 1011 1012 ν C–C/C‒N

950 950 950 950 950 950 citrati

927sh 931 927sh 929sh 929 925 nitrati, šećer (ν C–C)

837 837 833 829 833 833 δoop C–H imidazol

794 796 794 794 okosnica (ν O–P‒O)

744 749 744 745 747 δoop C–H imidazol

732 adenin

238 235 235 235 235 ν Ag–Cl

226 ν Ag–N


84

Slika 4.3.13. SERS spektri a) PY, b) PY/poli dAdT–poli dAdT, c) PY/poli dGdC–poli dGdC,

d) PY/poli rA–poli rU i e) PY/ct-DNA; c(PY) = 5×10–6

mol dm–3

, PY/poli 1/20.

Anomalne vrpce koje potječu od citratnih i nitratnih iona označene su zvjezdicom (*).

U spektrima smjesa spoja PY s dvolančanim polinukleotidima također se opažaju

vrpce koje potječu od dušičnih baza, ali manjeg intenziteta nego u spektrima smjesa sa spojem

IM. Vrpce u spektrima smjese s poli dAdT–poli dAdT pri 1332 cm–1

i 735 cm–1

upućuju na

interakciju poliamina s adeninom i vezanje u oba utora dvolančanog polinukleotida, dok

široko rame pri 1342 cm–1

u spektru smjese s poli dGdC–poli dGdC ukazuje na interakciju

molekula PY s gvaninom u velikom utoru polinukleotida.

U spektru smjese s RNA polinukleotidom opaža se vrpca pri 1330 cm–1

, kao i u SERS

spektru smjese istog polinukleotida sa spojem IM, te se može pretpostaviti da se i molekule

spoja PY vežu s adeninom u velikom utoru poli rA–poli rU polinukleotida.

1800 1600 1400 1200 1000 800 600

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

16

14

15

66 *

*

*

*

12

14

10

70

*

*

*

*

10

14

* 83

7

*

*

*

*

73

9

66

8

*

*

*

73

5

92

4

12

63

13

32

14

22

92

513

4214

22

92

513

30

14

22

* **

* 92

413

31

12

70

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

14

22

85

Tablica 4.3.6. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja PY i smjesama s dvolančanim DNA

i RNA polinukleotidima te ct-DNA. 130,135,136

Valni broj / cm–1

Vibracija PY c = 1×10

–4

mol dm–3

PY c = 5×10

–6

mol dm–3

[PY]/[poli] 1/20

PY/

poli dAdT–

poli dAdT

PY/

poli dGdC–

poli dGdC

PY/

poli rA–

poli rU

PY/

ct-DNA

3061 3065 3063 3063 3063 3063 ν C–H piridin

2962 2963 2963 2963 2963 2963 ν C–H (CH2)

1610 1614 1610 1610 1610 1610 ν piridin

1561 1566 1560 1560 1560 1560 ν piridin

1500 1502 1497 1501 1498 1500 ν piridin

1450 1452 1451 1452 1450 ν piridin, δsc CH2

1422 1422 1422 1422 δip C–H šećer (C5'H2)

1394 1395 1395 1395 1396 1396 citrati

1342sh gvanin

1332 1330 1331 adenin

1330 δtw,wg CH2,

δip C–H piridin

1263 1270 adenin (ν C6–NH2)

1214 1215 1214 1214 1214 1214 δip C–H piridin


1068 1069 1070 1070 1070 1070 δip C–H piridin

1036 1032sh 1033 1036 1037 1034 citrati

1011 1015 1011 1011 1011 1011 ν piridin

(disanje prstena)

949 951 951 951 951 citrati


830 836 833 834 833 834 γ piridin

800 800 798 798 799 799 citrati,

okosnica (ν O–P‒O)

739 738 740 741 740 δoop C–H piridin

735 adenin

667 668 666 666 666 666 γ piridin

239 236 236 236 236 ν Ag–Cl

228 ν Ag–N


Kao i u slučaju smjesa s jednolančanim polinukleotidima, mjerni uzorci s dvolančanim

polinukleotidima pripravljeni u koloidnoj suspenziji 2 u prisutnosti natrijeva borhidrida

rezultirali su spektrima karakteristika opisanih u spektrima uzoraka bez borhidridnih iona

(Prilog 5 i 6).

86

4.3.2.5.3. SERS spektri smjesa spojeva IM i PY s ct-DNA

Snimljeni su SERS spektri smjesa spojeva IM i PY s ct-DNA u koloidnoj suspenziji

srebra 2, pri čemu je koncentracija malih molekula bila 5×10–6

mol dm–3

, a molarni omjer, u

kojem je koncentracija nukleinske kiseline izražena kao koncentracija fosfata, [spoj]/[DNA]

1/20.

U SERS spektrima smjesa opaža se pojačanje intenziteta raspršenog zračenja koje, u

skladu sa spektrima smjesa s jednolančanim i dvolančanim polinukleotidima, upućuje na

interakcije između poliaminskih molekula i nukleinske kiseline (Slike 4.3.12.e i 4.3.13.e).

Analizom SERS spektara s dvolančanim polinukleotidima utvrđeno je da interakcije s

uređenim zavojitim strukturama rezultiraju smještanjem aromatskih prstenova molekula IM i

PY okomito na površinu srebra i aminometilenskih lanaca blizu površine metala. To podupire

pretpostavku da se DNA uz površinu srebra orijentira okosnicom paralelno površini metala.

U SERS spektru smjese spoja IM s ct-DNA glavna spektralna promjena, u odnosu na

spektar spoja IM, uključuje pojavu široke vrpce pri 1325 cm–1


(Slika 4.3.12.e, Tablica 4.3.5). I vrpca i rame potječu od vibracija purinskih dušičnih baza,

odnosno istezanja peteročlanih prstenova adenina i gvanina, te upućuju na interakciju N7

atoma purina s aminoskupinama spoja IM. Dušikov atom obje purinske baze smješten je u

velikom utoru i ne sudjeluje u komplementarnom sparivanju baza vodikovim vezama. U

prilog vezanju spoja IM u veliki utor DNA je i izostanak vrpce adenina pri 732 cm–1

koja se

pripisuje disanju prstena s N3 atomom kao potencijalnim veznim mjestom u malom utoru. S

obzirom na zavojitu strukturu DNA, pretpostavlja se da su timin i citozin smješteni dalje od

metalne površine i stoga njihove i inače slabe vrpce u SERS spektru nisu zamijećene.

U SERS spektru smjese spoja PY s ct-DNA uočava se široka vrpca srednjeg

intenziteta pri 1331 cm–1

koja upućuje na interakciju s N7 atomom adenina i gvanina u

velikom utoru nukleinske kiseline (Slika 4.3.13.e, Tablica 4.3.6). Na vezanje molekula spoja

PY u veliki utor ukazuje i vrpca pri 1270 cm–1

koja se pripisuje istezanju C6–NH2 veze

adenina, s obzirom da se amino skupina adenina nalazi u velikom utoru.

87

4.4. Istraživanja sa spojem Sp

S obzirom na strukturu molekula IM i PY, u kojoj su aromatski prstenovi smješteni na

krajevima aminometilenskih poveznica, doprinos poliaminskih lanaca vezanju malih

molekula s polinukleotidima istražen je pomoću linearnog poliamina spermina. Nakon pobude

u vidljivom području zračenja, SERS spektri ukazali su na vezanje spermina u veliki utor

nukleinske kiseline,125

međutim, sustavno istraživanje koje obuhvaća snimanje

koncentracijski ovisnih SERS spektara te smjesa s jednolančanim i dvolančanim DNA/RNA

polinukleotidima i ct-DNA u bliskom infracrvenom području nije provedeno.

4.4.1. FT-Ramanovi spektri spoja Sp

Snimljeni su FT-Ramanovi spektri krutog uzorka spermina i vodene otopine

koncentracije 1×10–3

mol dm–3

(Slika 4.4.1). Molekule spermina dobro raspršuju zračenje na

što upućuju intenzivne vrpce u spektru čvrstog uzorka. U vodenoj otopini koncentracija spoja

Sp nedovoljna je za opažanje Ramanovog raspršenja te snimljeni spektar odgovara spektru

vode.

Slika 4.4.1. FT-Ramanovi spektri a) krutog uzorka spoja Sp i b) vodene otopine spoja Sp,

c = 1×10–3

mol dm–3

.

3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

88

U Ramanovom spektru krutog uzorka spoja Sp opažaju se vrlo intenzivne vrpce

istezanja C–H veza metilenskih skupina u području 2990–2800 cm–1

. S obzirom da je spoj Sp

dostupan u obliku hidroklorida, vrpca pri 3129 cm–1

pripisana je istezanju N–H veza

protonirane amino skupine, a vrpce pri 1615 cm–1

i 1592 cm–1

deformacijama primarnih i

protoniranih sekundarnih amino skupina u strukturi molekule. Vrpce deformacija metilenskih

skupina javljaju se između 1475 cm–1

i 1200 cm–1

, dok vrpcama u području 1060–925 cm–1

,

uz svijanja CH2 skupina, doprinose i istezanja C–C veza okosnice molekule. Pri nižim valnim

brojevima nalaze se vrpce koje odgovaraju deformacijama i torzijama aminometilenskog

lanca.

4.4.2. SERS spektri spoja Sp

S obzirom da je optimalno pojačanje raspršenog zračenja molekula IM i PY opaženo u

koloidu pripravljenom redukcijom srebrove soli citratnim ionima, mjerni uzorci sa spojem Sp

pripremljeni su u koloidnoj suspenziji srebra 2.


Snimljeni su SERS spektri spoja Sp u koncentracijskom području 1×10–6

– 1×10–4

mol

dm–3

(Slika 4.4.2 i Tablica 4.4.1). Smanjenjem koncentracije spoja Sp intenzitet vibracijskih

vrpci slabi, pri čemu uzorak najmanje koncentracije, 1×10–6

mol dm–3

, ne raspršuje zračenje

pa snimljeni spektar odgovara spektru koloidne suspenzije.

Osim vibracijskih vrpci spermina u SERS spektrima opažaju se i intenzivne vrpce

pripisane citratnim ionima na nanočesticama srebra. Anomalne vrpce pri približno 1400,

1090, 1030 i 950 cm–1

također su uočene u SERS spektrima spojeva IM i PY. Od navedenih

vrpci u spektru čiste koloidne suspenzije 2 javlja samo široka vrpca slabog intenziteta pri

1090 cm–1

, pripisana istezanju C–O veza citratnih iona, dok pojačanje intenziteta i pojavu

ostalih vibracijskih vrpci citrata potiče prisutnost poliaminskih molekula u koloidnoj

suspenziji. Vrlo je vjerojatno da su interferirajuće vrpce u spektru posljedica elektrostatskih

interakcija stabilizirajućih aniona na površini metala i malih pozitivno nabijenih poliaminskih

molekula.

89

Slika 4.4.2. SERS spektri spoja Sp: a) c = 1×10–4

mol dm3

, b) c = 5×10–5

mol dm3

,

c) c = 1×10–5

mol dm3

, d) c = 5×10–6

mol dm3

i e) c = 1×10–6

mol dm3

. Anomalne vrpce

koje potječu od citratnih iona označene su zvjezdicom (*).

Pojačanju raspršenja zračenja molekula spermina na koloidnim nanočesticama

doprinose i elektromagnetski i kemijski mehanizam. Pozitivno nabijene protonirane molekule

spermina elektrostatski se vežu s negativno nabijenim citratnim ionima na nanočesticama

srebra i na taj se način približavaju površini metala što rezultira elektromagnetskim

pojačanjem raspršenog zračenja. Na kemijsko vezanje molekula Sp s nanočesticama srebra

upućuje vrpca pri približno 220 cm–1

koja se uočava pri koncentracijama nižim od 1×10–5

mol

dm3

, a pripisuje istezanju Ag–N veze. Pri višim koncentracijama poliaminskih molekula,

kloridni ioni u uzorku doprinose intenzivnoj vrpci istezanja Ag–Cl veze (235 cm–1

) koja

prekriva vrpcu istezne vibracije veze molekula Sp sa srebrom.

1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

**

**

****

**** *

***

90


spoja Sp različitih koncentracija.130

Valni broj / cm–1

Vibracija FT-

Raman SERS

Sp 1×10

–4

mol dm–3

5×10–5

mol dm–3

1×10–5

mol dm–3

5×10–6

mol dm–3

3129 ν N–H (NH3+)

2989 ν C–H (CH2)

2983 ν C–H (CH2)

2944 ν C–H (CH2)

2923 ν C–H (CH2)

2881 ν C–H (CH2)

2803 ν C–H (CH2)

1615 δ NH2

1592 1588 1590 1588 1589 δ NH2

1549 1546 1551 1553 δ NH2

1471 δ CH2

1431 1445 1445 1449sh 1451sh δ CH2

1416 1417 1419 1418 δ CH2

1383 1396 1396 1403sh 1403 δ CH2; citrati

1323 δ CH2

1282 δ CH2

1202 δ CH2

1166 ν C–N–C

1120 ν C–N–C, ν C–C

1074 1083 1085 1082 1081 ν C–N; citrati

1060 1068sh δ CH2, ν C–C

1033 1035sh 1035sh 1034 1034 δ CH2, ν C–C; citrati

1008 1017 1022 δ CH2, ν C–C

970 δ CH2, ν C–C

948 949 951 951 δ CH2, ν C–C; citrati

927 925 924 925 924 δ CH2, ν C–C

911 907 906 908 906 δ CH2, ν C–N–C

837 836 837 836 836 δ CH2

793 798 799 δ CH2

777 δ CH2, δ C–C–C

755sh 752 755 755 δ C–C–C

732 735 734 735 δ C–N–H

522 δ C–C–C

416 δ C–N–C

378 γ C–C–C

343 γ C–C–C

278 γ C–C–C

238 234 ν Ag–Cl

222 217 ν Ag–N

γ, torzija; ν, istezanje; δ, deformacija; sh, rame

91

4.4.2.2. SERS spektri spoja Sp s polinukleotidima i DNA

Pri istraživanju interakcija spermina s jednolančanim i dvolančanim DNA/RNA

polinukleotidima te ct-DNA pripravljene su smjese u kojima je molarni omjer spoja i

polinukleotida iznosio 1/20. Koncentracija spoja Sp u svim uzorcima iznosila je 5×10–6

mol

dm–3

, a koncentracija polinukleotida, izražena kao koncentracija fosfata, bila je 1×10–4

mol

dm–3

. Svi uzorci pripravljeni su dodavanjem najprije spoja, a zatim polinukleotida u koloidnu

suspenziju 2.

4.4.2.2.1. SERS spektri spoja Sp s jednolančanim RNA polinukleotidima

Snimljeni su SERS spektri smjesa spoja Sp s s jednolančanim RNA polinukleotidima

poli A, poli G, poli C i poli U (Slika 4.4.3, Tablica 4.4.2). U odnosu na SERS spektar samog

spermina, u spektrima smjesa uočene su nove vrpce koje ukazuju na interakcije spoja Sp s

odgovarajućim polinukleotidima.

Slika 4.4.3. SERS spektri a) Sp, b) Sp/poli A, c) Sp/poli G, d) Sp/poli C i e) Sp/poli U;

c(Sp) = 5×10–6

mol dm–3

, Sp/poli 1/20.

1800 1600 1400 1200 1000 800 600

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

16

36

13

35

15

04

13

02

12

72

73

5

83

6

92

49

51

10

34

10

81

14

03

14

18

14

51

13

55

79

77

98

79

47

96

79

3

92

Tablica 4.4.2. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja Sp i smjesama s jednolančanim


Valni broj / cm–1

Vibracija c(Sp) / mol dm3

[Sp]/[poli] 1/20

1×10–4

5×10–6

Sp/poli A Sp/poli G Sp/poli C Sp/poli U

1636 citozin

1588 1589 1583 1579 1588 1588 δ NH2

1549 1553 1558 1546sh 1562 1562 δ NH2

1445 1451sh 1448 1446 1447 1448 δ CH2

1416 1418 1418sh 1414 1412 1417 δ CH2

1396 1403 1409 1397 1396sh 1398 δ CH2; citrati

1355 gvanin

1335 adenin

1302 citozin

1272 gvanin

1083 1081 1081 1081 1083 1084 ν C–N; citrati

1035sh 1034 1036 1035sh 1036sh 1037sh δ CH2, ν C–C; citrati

1017 1024 1023 1024 1028sh δ CH2, ν C–C

948 951 947 949 949 949 δ CH2, ν C–C; citrati

836 836 836 837sh 834 836 δ CH2

798 793sh 797 798 794 796 δ CH2; ν O–P–O

794 citozin

732 735 732 729 730sh 735 δ C–N–H

238 239 238 238 238 ν Ag–Cl

217 ν Ag–N


SERS spektrima svih smjesa zajednička je vrpca srednjeg intenziteta pri približno 800

cm–1

, kojoj doprinose i deformacije metilnih skupina spoja Sp i istezanja fosfatnih skupina

polinukleotida. Uslijed elektrostatskih interakcija između pozitivnog naboja spermina i

negativnih fosfata okosnice, polinukleotidni lanci približavaju se nanočesticama srebra, a

vrpca vibracije skupina, koje se sada nalaze blizu površine metala, pojačava.

U spektru smjese Sp/poli A opažena je intenzivna vrpca pri 1335 cm–1

i pripisana

istezanju peteročlanog prstena adenina. Dušikov atom u prstenu pogodan je za ostvarivanje

vodikovih veza s vodikom amino skupina spermina. Na interakciju s drugom purinskom

93

bazom ukazuju vrpce pri 1355 cm–1

i 1272 cm–1

u SERS spektru smjese spoja Sp s poli G,

koje odgovaraju vibracijama gvanina. Vrpca pri višem valnom broju posljedica je istezne

vibracije peteročlanog prstena baze, dok ona pri nižem valnom broju potječe od deformacije u

ravnini N9–H skupine gvanina.

U spektru smjese spoja Sp s poli C vrpca pri 1636 cm–1

pripisana je istezanju C5=C6

veze citozina, dok srednja vrpca pri 1302 cm–1

odgovara istezanju prstena. S obzirom da je


vrlo intenzivna, u odnosu na spektre ostalih smjesa s jednolančanim

polinukleotidima, pretpostavlja se da navedenoj vrpci, osim već spomenutih vibracija metilnih

skupina spermina i fosfata okosnice, doprinosi i disanje prstena citozina. U SERS spektru

spoja Sp s poli U nisu uočene vrpce koje bi upućivale na interakciju s dušičnom bazom ovog

RNA analoga.

4.4.2.2.2. SERS spektri spoja Sp s dvolančanim DNA/RNA polinukleotidima i ct-DNA

Pripravljene su smjese spoja Sp s polinukleotidima poli dAdT–poli dAdT, poli dGdC–

poli dGdC, poli rA–poli rU te ct-DNA u omjeru Sp/polinukleotid 1/20. Smjesama su

snimljeni SERS spektri koji su zatim asignirani (Slika 4.4.4, Tablica 4.4.3).

Slika 4.4.4. SERS spektri a) Sp, b) Sp/poli dAdT–poli dAdT, c) Sp/poli dGdC–poli dGdC, d)

Sp/poli rA–poli rU i e) Sp/ct-DNA; c(Sp) = 5×10–6

mol dm–3

, Sp/poli 1/20.

1800 1600 1400 1200 1000 800 600

14

51

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(b)

(c)

(d)

(e)

(a)

13

35

73

583

6

92

49

51

10

34

10

81

14

03

14

18

13

34

73

2

79

87

97

79

57

96

13

38 1

12

1

13

49

79

3

94

Tablica 4.4.3. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja Sp i smjesama s dvolančanim DNA

i RNA polinukleotidima te ct-DNA.18,130,136

Valni broj / cm–1

Vibracija Sp c = 1×10

–4

mol dm–3

Sp c = 5×10

–6

mol dm–3

[Sp]/[poli] 1/20

Sp/

poli dAdT–

poli dAdT

Sp/

poli dGdC–

poli dGdC

Sp/

poli rA–

poli rU

Sp/

ct-DNA

1588 1589 1590 1592 1596 1594 δ NH2

1549 1553 1565 1546 1559 1551 δ NH2

1445 1451sh 1448 1447 1447 1448 δ CH2

1416 1418 1415 1414 1411 1417 δ CH2

1396 1403 1394 1395 1394sh 1395 δ CH2; citrati

1349 gvanin

1335 1334 1338 adenin

1121 uracil

1083 1081 1090 1083 1088 1081 ν C–N; citrati

1035sh 1034 1035 1033 1038 1024 δ CH2, ν C–C; citrati

1017 δ CH2, ν C–C

948 951 950 948 947 948 δ CH2, ν C–C; citrati

836 836 834 835 830 837 δ CH2

798 793sh 798 797 795 796 δ CH2; ν O–P–O

732 735 732 732 733 δ C–N–H

732 adenin

238 217 241 239 241 239 ν Ag–N, Ag–Cl


Intenzivne vrpce opažene pri 1335 cm–1

i 732 cm–1

u SERS spektru smjese spoja Sp i

dvolančanog polinukleotida poli dAdT–poli dAdT pripisane su vibracijama peteročlanog,

odnosno šesteročlanog prstena adenina. Svaki prsten baze sadrži po jedan slobodan dušikov

atom koji ne sudjeluje u Watson-Crickovom sparivanju i može sudjelovati u ostvarivanju

vodikove veze s poliaminom. S obzirom da se potencijalna vezna mjesta nalaze u različitim

utorima polinukleotida, pretpostavlja se vezanje spermina i u veliki i u mali utor adenin-timin

polinukleotida. Vezanje spermina u oba utora polinukleotida adenina i timina u skladu je s

rezultatima istraživanja interakcija biogenih poliamina s polinukleotidima Ramanovom

spektroskopijom.68

Dodatak poli dGdC–poli dGdC spoju Sp na koloidu 2 rezultira pojavom

95

slabe vrpce pri 1349 cm–1

u spektru, koja odgovara istezanju manjeg prstena u strukturi

dušične baze. Položaj dušikovog atoma u peteročlanom prstenu gvanina ukazuje na vezanje

spermina u veliki utor gvanin-citozin polinukleotida.

U spektru smjese spoja Sp s poli rA–poli rU opažena je intenzivna vrpca istezanja

peteročlanog prstena adenina pri 1334 cm–1

. U odnosu na spektar spermina, uočeno je također

i vrlo široko rame pri 1121 cm–1

kojem doprinosi istezanje prstena uracila zajedno s

izvijanjem C5–H veze. Navedene vrpce upućuje na vezanje poliaminske molekule u veliki

utor dvolančanog RNA analoga.

Na vezanje molekula Sp u veliki utor nukleinske kiseline ukazuje vrlo slaba vrpca pri

1338 cm–1

u SERS spektru smjese s ct-DNA, koja odgovara istezanju peteročlanog prstena

adenina.

SERS spektri spojeva Sp, IM i PY i njihovih smjesa s dvolančanim polinukleotidima i

ct-DNA, ukazuju da se sva tri poliaminska spoja vežu s DNA/RNA polinukleotidima na isti

način, odnosno u mali i veliki utor adenin-timin polinukleotida, a samo u veliki utor gvanin-

citozin i adenin-uracil polinukleotida te ct-DNA. Pri tome interakcije istraživanih

poliaminskih molekula i polinukleotida obuhvaćaju elektrostatke interakcije između pozitivno

nabijenog dušika protoniranih amino skupina poliamina i negativnih fosfatnih skupina

okosnice polinukleotida te vodikove veze između vodikovih atoma amino skupina poliamina i

dušičnih baza polinukleotida. Aromatski prstenovi, imidazol i piridin, u strukturi IM i PY ne

utječu na mjesto vezanja poliaminskog spoja, s obzirom na utore polinukleotida, no doprinose

stabilnosti nastalih kompleksa.

96

4.5. Istraživanja sa spojevima PHENPOD i PYPOD

4.5.1. FT-Ramanovi spektri spojeva PHENPOD i PYPOD

Snimljeni su FT-Ramanovi spektri krutih uzoraka PHENPOD i PYPOD te njihovih

vodenih otopina koncentracije 6,5×10–4

mol dm–3

. U spektrima krutina opažaju se intenzivne

vrpce vibracijskih modova istraživanih poliaminskih molekula, dok je koncentracija spojeva u

vodenim otopinama preniska za opažanje Ramanovih spektara (Slike 4.5.1 i 4.5.2).

U području viših valnih brojeva Ramanovog spektra krutog uzorka PHENPOD

dominiraju vrpce istezanja CH veza aromata pri 3061 cm–1

te CH veza alifatskih lanaca pri

2967 cm–1

i 2861 cm–1

(Slika 4.5.1, Tablica 4.5.1). Intenzivnim vrpcama između 1650 cm–1

i

1350 cm–1

doprinose istezne vibracije fenantrolinskog sustava i piridinskih prstenova te

deformacije metilenskih skupina. Pri 1300 cm–1

i 1271 cm–1

opažaju se vrpce deformacija u

ravnini C–H skupina fenantrolina. Intenzivna vrpca pri 1002 cm–1

pripisuje se disanju

piridina, dok jaka vrpca pri 708 cm–1

potječe od svijanja fenantrolina.137

Slika 4.5.1. FT-Ramanovi spektri a) krutog uzorka PHENPOD i b) vodene otopine

PHENPOD, c = 6,5×10–4

mol dm–3

.

3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

97

U Ramanovom spektru krutine PYPOD opažaju se intenzivna vrpca istezanja C–H

skupina piridinskih sustava pri 3061 cm–1

te jake vrpce antisimetričnog i simetričnog istezanja

C–H veza metilenskih skupina pri 2967 cm–1

odnosno 2861 cm–1

(Slika 4.5.2, Tablica

4.5.2).135

Istezanja piridinskih prstenova doprinose intenzivnim vrpcama pri 1581 cm–1

i 1254

cm–1

, dok se vrlo intenzivna vrpca pri 1002 cm–1

pripisuje disanju aromatskih jedinica. Vrpce

u području 12001050 cm–1

potječu većinom od deformacija u ravnini C–H skupina piridina,

a one između 950 cm–1

i 700 cm–1

od svijanja odgovarajućih skupina izvan ravnine.

Slika 4.5.2. FT-Ramanovi spektri a) krutog uzorka PYPOD i b) vodene otopine spoja

PYPOD, c = 6,5×10–4

mol dm–3

.

3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

98

4.5.2. SERS spektri spojeva PHENPOD i PYPOD


U svrhu odabira prikladnog koloida za pripravu uzoraka, snimljeni su SERS spektri

spoja PHENPOD koncentracije 5×10–5

mol dm–3

u koloidnim suspenzijama srebra 1 i 2, u

kojima je opaženo pojačanje raspršenog zračenja ranije istraživanih spojeva (Slika 4.5.3).

U SERS spektrima uzoraka pripravljenim u obje koloidne suspenzije uočava se

pojačanje raspršenog zračenja molekula PHENPOD s površine metala, no intenzivnije kada

se spoj nalazi u suspenziji nanočestica srebra s citratnim ionima na površini. S obzirom na

svoj pozitivan naboj u mediju neutralne pH vrijednosti, pH(1) = 6,70 i pH(2) =7,69, spoj

PHENPOD se približava površini metala s koje se raspršeno zračenje pojačava. Za

pretpostaviti je, međutim, da ioni utječu na orijentaciju molekula na površini srebra, pri čemu

na koloidu srebra 2 molekule zauzimaju povoljniji položaj, koji u skladu s izbornim pravilima

na površini, rezultira većom promjenom polarizabilnosti i doprinosi pojačanju raspršenog

zračenja. Iz tog razloga uzorci spojeva PHENPOD i PYPOD za daljnja SERS istraživanja

pripravljeni su na koloidu 2.

Slika 4.5.3. SERS spektri spoja PHENPOD na a) koloidu 2 i b) koloidu 1;

c(PHENPOD) = 5×10–6

mol dm–3

.

3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

99


Snimljeni su SERS spektri spojeva PHENPOD i PYPOD u koloidnoj suspenziji

srebra 2 u koncentracijskom području 6,5×10–8

–6,5×10–5

mol dm3

(Slike 4.5.4 i 4.5.5).

Smanjenjem koncentracije od 6,5×10–5

mol dm3

do 3,2×10–6

mol dm3

intenzitet vibracijskih

vrpci u spektrima se povećava, pri čemu dostiže svoj maksimum pri koncentraciji spoja

PHENPOD 6,5×10–6

mol dm3

, odnosno spoja PYPOD 3,2×10–6

mol dm3

. Uzorci

koncentracija nižih od 3,2×10–6

mol dm3

ne raspršuju zračenje te snimljeni spektri

odgovaraju spektru koloidne suspenzije 2. Nelinearna ovisnost intenziteta o koncentraciji

spoja sa suprotnim trendom ukazuje na utjecaj koncentracije molekula na njihov položaj na

površini nanočestica srebra. S obzirom da prema izbornim pravilima SERS spektroskopije

raspršenju zračenja najviše doprinose vibracije s promjenom polarizabilnosti okomito na

površinu metala, pri koncentraciji pri kojoj je raspršenje najviše pojačano, molekule su

optimalno položene. Pri većim koncentracijama molekule se tijesno smještaju na površini, pri

čemu se naginju u odnosu na površinu i raspršeno zračenje slabi. S druge strane, neopažanje

raspršenog zračenja pri niskim koncentracijama posljedica je malog broja molekula u sustavu,

ali i mogućnosti polaganja malobrojnih molekula paralelno površini metala, gdje promjena

polarizabilnosti ne doprinosi raspršenom zračenju.

Slika 4.5.4. SERS spektri spoja PHENPOD: a) c = 6,5×10–5

mol dm3

, b) c = 3,2×10–5

mol

dm3

, c) c = 6,5×10–6

mol dm3

, d) c = 3,2×10–6

mol dm3

, e) c = 6,5×10–7

mol dm3

, f) c =

3,2×10–7

mol dm3

i g) c = 6,5×10–8

mol dm3

.

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

100

Slika 4.5.5. SERS spektri spoja PYPOD: a) c = 6,5×10–5

mol dm3

, b) c = 3,2×10–5

mol dm3

,

c) c = 6,5×10–6

mol dm3

, d) c = 3,2×10–6

mol dm3

, e) c = 6,5×10–7

mol dm3

, f) c = 3,2×10–7

mol dm3

i g) c = 6,5×10–8

mol dm3

.

U SERS spektru spoja PHENPOD uočavaju se većinom vrpce vibracijskih modova

fenantrolinskog i piridinskih sustava. U usporedbi s Ramanovim spektrom krutog uzorka

vrpca istezanja fenantrolina pomiče se s 1620 prema 1608 cm–1

, dok se vrpca istezanja

piridina pri 1579 cm–1

u SERS spektru javlja pri 1590 cm–1

. U SERS spektru dominira

intenzivna vrpca pri 1409 cm–1

pripisana vibraciji fenantrolina. Između 1100 i 900 cm–1

opažaju se vrpce vibracijskih modova piridina, koje ujedno karakteriziraju i SERS spektar

spoja PYPOD. Intenzivna vrpca pri 1003 cm–1

pripisuje se disanju piridina, dok vrpcama

srednjeg intenziteta u navedenom području doprinose svijanja u ravnini i izvan nje CH

skupina piridina. U području niskih valnih brojeva opažaju se vrpce pri 227 i 226 cm–1

za

PHENPOD odnosno PYPOD. Navedenim vrpcama doprinose istezanja AgCl veze između

nanočestica srebra i kloridnih iona iz sastava istraživanih spojeva, te AgN veze nastale

vezanjem molekula preko dušikovih atoma s površinom srebra. Za pretpostaviti je stoga da se

raspršeno zračenje pojačava i elektromagnetskim i kemijskim mehanizmom.

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

101


spoja PHENPOD različitih koncentracija.130,137

Valni broj / cm–1

Vibracija FT-Raman SERS

PHENPOD 6,5×10

–5

mol dm–3

3,2×10–5

mol dm–3

6,5×10–6

mol dm–3

3,2×10–6

mol dm–3

3061 νas C–H piridin

2967 νas C–H (CH2)

2861 νs C–H (CH2)

1638 ν CC/CN fenantrolin

1620 1606 1607 1608 1609 ν fenantrolin

1579 1585 1589 1590 1586 ν piridin

1542 ν fenantrolin

1506 1502 1503 1503 1504 ν fenantrolin

1465 1446 1448 1445 1447 ν piridin, sc CH2

1423 ν fenantrolin

1408 1408 1408 1409 1410 ν fenantrolin

1356 ν piridin

1300 1298 1299 1298 1298 δip C–H fenantrolin, tw CH2

1271 δip C–H fenantrolin

1253 ν piridin


1089 1081 1092 1086 1083 δip C–H piridin


1002 1003 1003 1003 1004 ν piridin (disanje prstena)

952 950 947 950 951 δ piridin

932 922 926 924 924 δ fenantrolin

891 δoop C–H piridin

842 837 837 γ piridin

775 δoop C–H fenantrolin

735 739 739 735 737 δoop C–H fenantrolin

708 707 710 708 707 δoop C–H piridin

231 ν AgCl; ν AgN

227 227 227 ν AgCl; ν AgN

γ, torzija; ν, istezanje; δ, deformacija; ip, u ravnini; oop, izvan ravnine; s, simetrično; as, antisimetrično; sh, rame; tw,

savijanje; sc, striženje

102


spoja PYPOD različitih koncentracija.130,135

Valni broj / cm–1

Vibracija FT-Raman SERS

PYPOD 6,5×10

–5

mol dm–3

3,2×10–5

mol dm–3

6,5×10–6

mol dm–3

3,2×10–6

mol dm–3

3069 νas C–H piridin

2965 νas C–H (CH2)

2866 νs C–H (CH2)

1596sh 1597 1596 1596 1595 ν piridin

1581 1579 1579 1579 1580 ν piridin

1460 1446 1441 ν piridin, sc CH2

1444sh ν piridin

1400 1400 citrati

1397 1391 1394 1398 1397 ν piridin

1353 ν piridin

1294 ν CC piridin, tw CH2

1254 1260 1263 1263 1259 ν piridin

1158 1152 1157 1159 1156 δip C–H piridin

1092 1089 1091 1081 1082 δip C–H piridin


1002 1003 1003 1005 1005 ν piridin (disanje prstena)

952sh 951 949 950 951 δoop C–H piridin

909 δoop C–H piridin

847 γ piridin

711 704 711 712 708 δoop C–H piridin

227 224 225 226 ν AgCl; ν AgN

γ, torzija; ν, istezanje; δ, deformacija; ip, u ravnini; oop, izvan ravnine; s, simetrično; as, antisimetrično; sh, rame; tw,

savijanje; sc, striženje


Utjecaj kakodilatnog pufera, u kojem su pripravljene otopine polinukleotida, istražen

je snimanjem SERS spektara uzoraka spojeva PHENPOD odnosno PYPOD, c = 5×10–6

mol

dm–3

, na koloidu 2, u prisutnosti kakodilatnog pufera u uzorku. U SERS spektrima uzoraka s

puferom nisu uočene nove vrpce koje bi potjecale od kakodilatnog pufera. Nešto intenzivnije i

oštrije vrpce istraživanih spojeva posljedica su agregacije nanočestica srebra ionima u sastavu

103

pufera. U spektru spoja PYPOD stoga su opažene i vrpce oko 1400 cm–1

koje su u spektru

uzorka bez pufera bile prekrivene anomalnom vrpcom citratnih iona.

Slika 4.5.6. SERS spektri spoja PHENPOD a) s kakodilatnim puferom i b) bez kakodilatnog

pufera; c(PHENPOD) = 5×10–6

mol dm3

.

Slika 4.5.7. SERS spektri otopine PYPOD a) s kakodilatnim puferom i b) bez kakodilatnog

pufera; c(PYPOD) = 5×10–6

mol dm3

.

3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

104

4.5.2.4. SERS spektri smjesa spojeva PHENPOD i PYPOD s polinukleotidima i ct-DNA

Pri istraživanju interakcija spojeva PHENPOD i PYPOD s jednolančanim RNA

polinukleotidima i dvolančanim DNA i RNA polinukleotidima te ct-DNA pripravljene su

smjese u omjeru [spoj]/[polinukloetid] 1/20. Pri tome je koncentracija polinukleotida izražena

kao koncentracija fosfata iznosila 1×10–4

mol dm3

, a koncentracija poliaminskih spojeva bila

je 5×10–6

mol dm3

. Uzorci su pripravljeni u koloidnoj suspenziji srebra 2 dodatkom najprije

istraživanog spoja, a zatim odgovarajućeg polinukleotida.

4.5.2.4.1. SERS spektri smjesa spojeva PHENPOD i PYPOD s jednolančanim RNA

polinukleotidima

Snimljeni su SERS spektri smjesa spojeva PHENPOD i PYPOD s jednolančanim

polinukleotidima adenina, gvanina, citozina i uracila te asiginirane vrpce u spektrima (Slike

4.5.8 i 4.5.9, Tablice 4.5.3 i 4.5.4).

Slika 4.5.8. SERS spektri a) PHENPOD, b) PHENPOD/poli A, c) PHENPOD/poli G, d)

PHENPOD/poli C i e) PHENPOD/poli U; c(PHENPOD) = 5×10–6

mol dm–3

,

PHENPOD/poli 1/20.

1800 1600 1400 1200 1000 800 600

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

13

28

15

58

16

08

15

90

15

03

14

08

12

98

10

89 10

02

71

0

74

0

78

9

16

33

79

5

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

105

U spektru smjese PHENPOD/poli A opažene su dvije vrpce koje odgovaraju

vibracijama dušične baze. Slaba vrpca pri 1558 cm–1

pripisana je svijanju NH2 skupine

adenina, dok vrpca srednjeg intenziteta pri 1328 cm–1

potječe od istezanja peteročlanog

prstena adenina. Dušikov atom manjeg prstena baze i amino skupina adenina potencijalna su

mjesta za stvaranje vodikovih veza s malim molekulama. Za pretpostaviti je da se

jednolančani polinukleotid adenina veže s molekulama PHENPOD na površini nanočestica

na način pri kojem su dušične baze usmjerene prema površini srebra, a fosfatna okosnica

položena u vodenom sloju uz površinu metala. U SERS spektru smjese spoja PHENPOD s

poli G nisu uočene vrpce vibracija dušične baze koje bi ukazivale na vezanje ovih malih

molekula s gvaninom.

Vrpce pri 1633 cm–1

i 789 cm–1

u SERS spektru smjese PHENPOD/poli C upućuju na

interakcije molekula PHENPOD s citozinom. Naime, vrpca nižem valnom broju odgovara

vibraciji disanja citozinskog prstena, dok vrpca pri 1633 cm–1

potječe od istezanja C5=C6

veze citozina. Slaba vrpca pri 795 cm–1

opažena je u spektru smjese PHENPOD s

polinukleotidom uracila i pripisana disanju prstena uracila.

106

Tablica 4.5.3. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja PHENPOD i smjesama s

jednolančanim RNA polinukleotidima.18,136,137

Valni broj / cm1

Vibracija PHENPOD

[PHENPOD]/[poli] 1/20

PHENPOD/

poli A

PHENPOD/

poli G

PHENPOD/

poli C

PHENPOD/

poli U

1633 citozin

1608 1607 1607 1609 1607 ν fenantrolin

1590 1590 1587 1591 1589 ν piridin

1558 adenin

1503 1503 1503 1505 1503 ν fenantrolin

1444 1449 1448 1451 1448 ν piridin

1408 1409 1409 1411 1409 ν fenantrolin

1328 adenin

1298 1299 1297 1299 1298 δip C–H fenantrolin

1089 1089 1087 1095 1091 δip C–H piridin

1002 1003 1003 1005 1003 ν piridin

(disanje prstena)

950 949 948 952 950 δ piridin

924 923 923 924 923 δ fenantrolin

837 833 831 831 834 γ piridin

795 uracil

789 citozin

740 741 741 741 741 δoop C–H fenantrolin

710 707 706 708 706 δoop C–H piridin

227 230 228 227 231 ν AgCl; ν AgN

γ, torzija; ν, istezanje; δ, deformacija; ip, u ravnini; oop, izvan ravnine

Za razliku od SERS spektara smjesa spoja PHENPOD s jednolančanim RNA

polinukleotidima, u spektrima smjesa spoja PYPOD uočava se veći broj vrpci koje potječu od

vibracijskih modova dušičnih baza, a posljedica su interakcija s polinukleotidima.

107

Slika 4.5.9. SERS spektri a) PYPOD, b) PYPOD/poli A, c) PYPOD/poli G, d) PYPOD/poli

C i e) PYPOD/poli U; c(PYPOD) = 5×10–6

mol dm–3

, PYPOD/poli 1/20.

U SERS spektru smjese PYPOD/poli A rame pri 721 cm–1

pripisuje se disanju, a slaba


istezanju veza šesteročlanog prstena adenina. Istezna vibracija prstena s

pet atoma doprinosi intenzivnoj vrpci pri 1331 cm–1

. Vrpca pri 1556 cm–1

potječe od svijanja

amino skupine adenina. U spektru smjese spoja PYPOD s polinukleotidom gvanina rame pri

1269 cm–1

odgovara deformaciji u ravnini N9–H skupine, dok se vrpca pri 1335 cm–1

pripisuje istezanju peteročlanog prstena dušične baze. Uslijed deformacije NH2 skupine

gvanina uočava se slaba vrpca pri 1558 cm–1

.

Na interakcije spoja PYPOD s polinukleotidom citozina upućuju vrpce istezanja

prstena pri 1297 cm–1

i 792 cm–1

, te vrpca svijanja izvan ravnine C5–H i C6–H skupina pri

1223 cm–1

. Istezanje C5=C6 veze citozina rezultira vrpcom u spektru pri 1634 cm–1

. U SERS

spektru smjese PYPOD/poli U vrpca disanja prstena uracila opaža se pri 794 cm–1

, a vrpca

svijanja C–H skupina pri 1240 cm–1

.

1800 1600 1400 1200 1000 800 600

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

15

79

14

46

13

87

12

60

11

56 10

91

10

06

95

0 70

77

21

13

31

14

93

15

56

12

69

15

58 13

35

79

2

12

23

12

97

16

34

79

4

12

40

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

108

Tablica 4.5.4. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja PYPOD i smjesama s

jednolančanim RNA polinukleotidima.18,135,136

Valni broj / cm–1

Vibracija PYPOD

[PYPOD]/[poli] 1/20

PYPOD/

poli A

PYPOD/

poli G

PYPOD/

poli C

PYPOD/

poli U

1634 citozin

1596 1598 1598 1602 1597 ν piridin

1579 1579 1578 1579 1579 ν piridin

1558 gvanin

1556 adenin

1493 adenin

1446 1454 1448 1444 1447 ν piridin

1400 1395 1395 1396 1392 citrati

1387 1382 1383 1382 1383 ν piridin

1335 gvanin

1331 adenin

1297 citozin

1269 gvanin

1260 1264 1260 1266 1266 ν piridin

1240 uracil

1223 citozin

1156 1156 1151 1157 1154 δip C–H piridin

1091 1090 1092 1089 1089 δip C–H piridin

1006 1003 1003 1002 1004 ν piridin

(disanje prstena)

950 951 951 950 951 δoop C–H piridin

847 854 854 853 853 γ piridin

794 uracil

792 citozin

721 adenin

712 713 712 707 712 δoop C–H piridin

225 229 228 225 230 ν AgCl; ν AgN


109

4.5.2.4.2. SERS spektri smjesa spojeva PHENPOD i PYPOD s dvolančanim DNA i RNA

polinukleotidima te ct-DNA

Snimljeni su i asignirani SERS spektri smjesa spojeva PHENPOD odnosno PYPOD s

dvolančanim polinukleotidima zavojite strukture poli dAdT–poli dAdT, poli dGdC–poli

dGdC, poli rA–poli rU te ct-DNA (Slike 4.5.10 i 4.5.11, Tablice 4.5.5 i 4.5.7).

Nove vrpce koje ukazuju na interakcije spoja PHENPOD s polinukleotidima uočene

su jedino u SERS spektru smjese s poli dAdT–poli dAdT. Slabe vrpce pri 1324 cm–1

i 724

cm–1

pripisane su vibracijama prstenova adenina koji imaju dušikove atome slobodne za

vodikovo vezanje i u velikom i u malom utoru. Iako RNA analog sadrži adenin u strukturi, u

spektru smjese spoja PHENPOD s poli rA–poli rU nazire se tek rame vibracije adenina pri

1326 cm–1

. S obzirom da u spektru smjese PHENPOD/poli rA–poli rU izostaje vrpca adenina

pri nižem valnom broju, za pretpostaviti je da se PHENPOD vrlo slabo veže samo u veliki

utor dvolančanog RNA polinukleotida.

Slika 4.5.10. SERS spektri a) PHENPOD, b) PHENPOD/poli dAdT–poli dAdT,

c) PHENPOD/poli dGdC–poli dGdC, d) PHENPOD/poli rA–poli rU i e) PHENPOD/ct-

DNA; c(PHENPOD) = 5×10–6

mol dm–3

, PHENPOD/poli 1/20.

1800 1600 1400 1200 1000 800 600

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

16

08

15

90

15

03

14

08

12

98

10

89

10

02

74

0 71

07

24

13

24

13

26

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

110

U SERS spektrima smjesa spoja PHENPOD s gvanin-citozin polinukleotidom te s ct-

DNA nisu uočene nove vrpce. Budući da SERS spektri nisu ukazali na interakcije spoja

PHENPOD s jednolančanim polinukleotidom gvanina, a kisik karbonilne skupine citozina

sudjeluje u sparivanju dušičnih baza dvostruke uzvojnice, za očekivati je da se male molekule

neće vezati u utore poli dGdC–poli dGdC polinukleotida. Iako 58,1 % strukture ct-DNA čine

adenin-timin parovi baza prema kojima su molekule PHENPOD pokazale afinitet vezanja,

vrpce koji bi ukazale na interakcije sa skupinama u utorima nukleinske kiseline ne uočavaju

se u SERS spektru s ct-DNA.

Tablica 4.5.5. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja PHENPOD i smjesama s

dvolančanim DNA i RNA polinukleotidima te ct-DNA.18,136,137

Valni broj / cm–1

Vibracija PHENPOD

[PHENPOD]/[poli] 1/20

PHENPOD/

poli dAdT–

poli dAdT

PHENPOD/

poli dGdC–

poli dGdC

PHENPOD/

poli rA–

poli rU

PHENPOD/

ct-DNA

1608 1607 1607 1608 1607 ν fenantrolin

1590 1589 1589 1590 1590 ν piridin

1503 1504 1503 1503 1503 ν fenantrolin

1444 1448 1448 1447 1448 ν piridin

1409 1411 1409 1410 1409 ν fenantrolin

1326 adenin

1324 adenin

1298 1298 1297 1298 1298 δip C–H fenantrolin

1089 1094 1092 1092 1092 δip C–H piridin

1002 1003 1002 1003 1003 ν piridin

(disanje prstena)

950 950 950 948 950 δ piridin

924 923 924 926 924 δ fenantrolin

837 837 837 836 837 γ piridin

740 737sh 740 740 740 δoop C–H fenantrolin

724 adenin

710 708 706 708 706 δoop C–H piridin

227 232 229 234 229 ν AgCl; ν AgN


111

S obzirom na prisutnost fenantrolinskog sustava u strukturi molekule PHENPOD,

vrlo sličnog fenantridinskom sustavu kojim se male molekule poput etidijeva bromida

interkaliraju u dvostruku uzvojnicu nukleinske kiseline,37

istraženo je interkaliranje spoja

PHENPOD s dvolančanim polinukleotidima. Na temelju SERS spektara interkalirajućih

spojeva s ct-DNA utvrđeno je da smanjenje Ramanovog intenziteta, kao posljedica umetanja

planarnog aromatskog sustava između parova baza nukleinske kiseline, upućuje na

interkaliranje.138

U svrhu opažanja promjene intenziteta raspršenog zračenja koje potječe od

fenantrolina, odabrana je intenzivna vrpca pri 1409 cm–1

. Kako bi se uklonili faktori

instrumenta, kao što su promjenjiva snaga lasera i temperatura detektora, koji utječu na

intenzitet Ramanovog raspršenja, izračunati su omjeri intenziteta odgovarajućih vrpci u SERS

spektru. Budući da se piridinski prstenovi ne interkaliraju, intenzitet vrpce piridina pri 1003

cm–1

odabran je kao referentna vrijednost. Omjer intenziteta vrpci fenantrolina i piridina,

I1409/I1003, izračunat je u spektru spoja PHENPOD te u spektrima njegovih smjesa s

dvolančanim polinukleotidima (Tablica 4.5.6). Za spoj PHENPOD omjer intenziteta,

I1409/I1003, iznosio je 1,643, dok su vrijednosti za smjese s poli dAdT–poli dAdT i poli dGdC–

poli dGdC bile manje, 1,417 i 1,432, i kao takve upućivale na djelomično interkaliranje

fenantrolina u dvostruku uzvojnicu DNA analoga. Za razliku od vrijednosti u spektrima s

DNA polinukleotidima, omjer intenziteta u spektru smjese s poli rA–poli rU 1,769, nije

ukazivao na interkaliranje spoja PHENPOD u uzvojnicu RNA polinukleotida.

Tablica 4.5.6. Omjeri intenziteta vibracijskih vrpci fenantrolinskog sustava i piridinskih

prstenova u SERS spektrima spoja PHENPOD i njegovih smjesa s dvolančanim

polinukleotidima.

I1409/I1003

PHENPOD

PHENPOD/

poli dAdT–

poli dAdT

PHENPOD/

poli dGdC–

poli dGdC

PHENPOD/

poli rA–

poli rU

PHENPOD/

ct-DNA

1,643 1,417 1,432 1,769 1,522

U spektru smjese spoja PYPOD s poli dAdT–poli dAdT, uz već dobro poznate vrpce

vibracija adenina pri 1332 cm–1

i 724 cm–1

, opažena je i nova vrpca pri 1377 cm–1

koja je

pripisana simetričnoj deformaciji CH3 skupine timina u velikom utoru polinukleotida. Uz

vrpce koje upućuju na interakcije malih molekula s dušičnim bazama, vrpca pri 834 cm–1

koja

112

odgovara istezanju fosfodiesterske OPO veze, te porast intenziteta vrpce pri 1092 cm–1

kojoj doprinosi simetrično istezanje veza fosfodioksi skupine, ukazuju na smještanje okosnice

polinukleotida blizu površine metala. Za pretpostaviti je da se molekule spoja PYPOD čvrsto

vežu u mali i veliki utor dvolančanog polinukleotida adenina i timina.

Usprkos opaženom vezanju s jednolančanim polinukleotidima gvanina, citozina i

uracila, u spektrima smjesa spoja PYPOD s dvolančanim polimerima gvanina i citozina te

adenina i uracila nisu uočene vibracijske vrpce koje bi ukazale na interakcije malih molekula

u utorima navedenih DNA i RNA analoga.

U spektru smjese spoja PYPOD s ct-DNA vrlo slabe vrpce 1377 cm–1

i 725 cm–1

posljedica su interakcija malih molekula sa sljedovima adenin-timina parova baza nukleinske

kiseline te ukazuju na vezanje spoja u mali i veliki utor dvostruke uzvojnice.

Slika 4.5.11. SERS spektri a) PYPOD, b) PYPOD/poli dAdT–poli dAdT, c) PYPOD/poli

dGdC–poli dGdC, d) PYPOD/poli rA–poli rU i e) PYPOD/ct-DNA; c(PYPOD) = 5×10–6

mol dm–3

, PYPOD/poli 1/20.

S obzirom da nije bilo moguće razlikovati vrpce vibracija središnjeg piridinskog

sustava i piridinskih prstenova u cikličkim strukturama na krajevima molekule, nije istraženo

vezanje piridina. Mali pomaci odgovarajućih vibracijskih vrpci, međutim, opaženi su u

1800 1600 1400 1200 1000 800 600

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

15

79

14

46

13

87

12

60

11

56

10

91

10

06

95

0 70

77

24

13

32

13

77

72

5

83

4

13

77

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

10

92

113

spektrima s poli dAdT–poli dAdT i ct-DNA te se pripisuju vezanju u utore odgovarajućih

polinukleotida.

Tablica 4.5.7. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja PYPOD i smjesama s dvolančanim

DNA i RNA polinukleotidima te ct-DNA.18,135,136

Valni broj / cm–1

Vibracija PYPOD

[PYPOD]/[poli] 1/20

PYPOD/

poli dAdT–

poli dAdT

PYPOD/

poli dGdC–

poli dGdC

PYPOD/

poli rA–

poli rU

PYPOD/

ct-DNA

1597 1599 1597 1597 1599 ν piridin

1579 1580 1579 1580 1579 ν piridin

1446 1451 1447 1446 1450 ν piridin

1400 1396 1395 1396 1396 citrati

1383 1383 1383 1382 1384 ν piridin

1377 1377 timin

1332 adenin

1260 1264 1269 1261 1267 ν piridin

1156 1156 1151 1158 1158 δip C–H piridin

1091 1092 1090 1094 1092 δip C–H piridin,

ν O–P‒O

1006 1005 1003 1005 1003 ν piridin

(disanje prstena)

950 950 951 949 951 δoop C–H piridin

853 854 854 853 853 γ piridin

834 okosnica (ν O–P‒O)

725 adenin

724 adenin

712 713 712 712 713 δoop C–H piridin

235 230 228 233 228 ν AgCl; ν AgN


114

5. ZAKLJUČAK

Istraživane male molekule obuhvatile su interkalator s diazapirenskim sustavom u

strukturi (ADAP) te lančanu poliaminsku molekulu (Sp) i molekule (IM, PY, PHENPOD,

PYPOD) koje se zahvaljujući aminometilenskim lancima i aromatskim prstenovima s

dušikom preferirano vežu u utore, uz mogućnost djelomičnog interkaliranja fenantrolinskim

jedinicama.

U svrhu primjene metalnog supstrata nužnog za površinsko pojačanje raspršenog

zračenja, pripravljene su koloidne suspenzije srebra koje su se razlikovale prema veličini

nanočestica srebra i specijama na njihovoj površini. Pojačanje Ramanovog raspršenja malih

molekula opaženo je na koloidima srebra pripravljenim redukcijom srebrova nitrata s

hidroksilamin hidrokloridom i trinatrijevim citratom, koji su nosili negativan naboj kloridnih

iona odnosno citratnih iona i njihovih oksidacijskih produkata na površini metala. Uslijed

privlačnih elektrostatskih sila između negativnog naboja na površini nanočestica i pozitivnog

naboja u strukturi istraživanih molekula, molekule se smještaju blizu površine ili vežu s

površinom metala, pri čemu se raspršeno zračenje elektromagnetski i kemijski pojačava. Iako

su ioni na nanočesticama srebra pripravljenim redukcijom srebrove soli s

etilendiamintetraoctenom kiselinom također negativnog naboja, svojom veličinom sprječavaju

učinkovitu adsorpciju malih molekula na površinu. Prostornu barijeru između malih molekula

i površine metala čini neutralan sloj polimera koji stabilizira koloid srebra pripravljen

redukcijskim postupkom s natrijevim borhidridom, pri čemu pojačanje Ramanovog raspršenja

izostaje.

Snimljeni su i asignirani Ramanovi spektri krutih uzoraka svih istraživanih spojeva.

Milimolarne koncentracije njihovih vodenih otopina bile su nedovoljne za opažanje

normalnog Ramanovog raspršenja, međutim, u odgovarajućim koloidnim suspenzijama srebra

sve male molekule intenzivno su raspršivale zračenje pri mikromolarnim koncentracijama. U

prisutnosti kakodilatnog pufera nanočestice srebra agregiraju te se intenzitet raspršenog

zračenja molekula na površini metala dodatno pojačava.

S obzirom na izborna pravila na površini koja vrijede u SERS spektroskopiji,

promjena intenziteta raspršenog zračenja u koncentracijski ovisnim spektrima pripisana je

različitom smještaju molekula na površini metala uvjetovanom ravnotežom dimerizacije i

koncentracijom molekula na površini. Povećanje intenziteta sa smanjenjem koncentracije

spojeva ADAP te PHENPOD i PYPOD posljedica je pomaka ravnoteže dimerizacije prema

115

monomerima interkalirajućih molekula, odnosno smanjivanja broja malih molekula na

površini, koje se aromatskim sustavima smještaju okomito na površinu metala pri čemu

najjače raspršuju zračenje. Položaj molekula fleksibilnije strukture, IM i PY te Sp, na

nanočesticama srebra ne ovisi o koncentraciji te se intenzitet raspršenog zračenja smanjuje s

koncentracijom poliaminskih molekula.

Vodeći se činjenicom da se u SERS spektrima smjesa malih molekula s

polinukleotidima opažaju vrpce vibracija strukturnih dijelova polinukleotida koji sudjeluju u

interakcijama s molekulama na površini metala, predložena su vezna mjesta i načini vezanja

istraživanih molekula s jednolančanim RNA polinukleotidima, dvolančanim DNA i RNA

polinukleotidima te ct-DNA.

U SERS spektrima interkalatora i ct-DNA, međutim, na način vezanja ne upućuje

pojava vrpci vibracija nukleinske kiseline, već promjena intenziteta raspršenog zračenja.

Umetanjem diazapirenskog sustava molekule između parova baza uzvojnice, molekule spoja

ADAP udaljavaju se od metalne površine, pri čemu raspršeno zračenje slabi. Uz

interkaliranje, kao dominantan način vezanja, raspršenje zračenja opaženo pri ekvimolarnim

omjerima smjesa s ct-DNA upućuje na vezanje malih molekula s vanjske strane uzvojnice

potaknuto elektrostatskim interakcijama i vodikovim vezama s fosfatima i šećerom iz

okosnice.

SERS spektri poliaminskih spojeva s jednolančanim RNA polinukleotidima ukazuju

da sve istraživane male molekule ostvaruju interakcije, najvjerojatnije vodikovim vezama, s

dušičnim bazama poli A, poli G, poli C i poli U, osim spoja PHENPOD u čijem spektru nisu

opažene vrpce koje bi upućivale na vezanje s polinukleotidom gvanina.

Male molekule spojeva IM i PY vežu se i u mali i u veliki utor dvostruke uzvojnice

polinukleotida poli dAdT–poli dAdT, dok interakcije s dušičnim bazama stvaraju samo u

velikom utoru polinukleotida poli dGdC–poli dGdC i poli rA–poli rU. U malom utoru

polinukleotida koji sadrži gvanin i citozin, amino skupina gvanina sterički ometa vezanje

malih molekula, dok širi i plići mali utor dvolančanog RNA polinukleotida, u odnosu na mali

utor DNA analoga, onemogućava učinkovito vezanje malih molekula. Poliaminske molekule

vežu se samo u veliki utor ct-DNA.

Spoj Sp, koji po strukturi odgovara aminometilenskim poveznicama u strukturi

molekula IM i PY, veže se na isti način s DNA/RNA polinukleotidima kao i poliaminske

molekule s malim aromatskim jedinicama u strukturi. Elektrostatske interakcije između

pozitivno nabijenog dušika protoniranih amino skupina poliamina i negativnih fosfatnih

skupina okosnice polinukleotida te vodikove veze između vodikovih atoma amino skupina

116

poliamina i dušičnih baza polinukleotida odgovorne su za vezanje spermina u utore

polinukleotida.

Molekule spojeva složenije strukture PHENPOD i PYPOD, koje sadrže

aminometilenske lance s cikličkim sustavima s piridinom na krajevima, vezane na fenantrolin,

odnosno piridin, u središtu molekule, vežu se u mali i veliki utor dvolančanog polinukleotida

adenina i timina. Nije uočeno vezanje niti jednog od ova dva poliaminska spoja u utore

polinukleotida poli dGdC–poli dGdC, dok slabe vrpce u spektru spoja PHENPOD s poli rA–

poli rU ukazuju na slabe interakcije s dušičnim bazama u velikom utoru dvolančanog RNA

polinukleotida. Vezanje u utore ct-DNA opaženo je jedino za molekulu sa središnjim

piridinskim prstenom pri čemu se pretpostavlja smještanje malih molekula u veliki utor

nukleinske kiseline. Utvrđeno je, međutim, za spoj PHENPOD, da se osim vezanja u utore

adenin-timin polinukleotida, fenantrolinskim sustavom interkalira u dvostruku uzvojnicu

nekih DNA analoga.

117

6. LITERATURNA VRELA

1. P. Zhao, L.-C. Xu, J.-W. Huang, B. Fu, H.-C. Yu, W.-H. Zheng, J. Chen, J.-H. Yao, L.-N.

Ji, Bioorg. Chem. 36 (2008) 278–287.

2. R. M. Burger, K. Drlica, B. Birdsall, J. Biol. Chem. 269 (1994) 25978–25985.

3. S. Rauf, J. J. Gooding, K. Akhtar, M. A. Ghauri, M. Rahman, M. A. Anwar, A. M.

Khalid, J. Pharm. Biomed. Anal. 37 (2005) 205–217.

4. R. Aroca u Surface-enhanced Vibrational Spectroscopy, John Wiley & Sons, West

Sussex, 2006.

5. R. Dahm, Hum. Genet. 122 (2008) 565–581.

6. M. E. Jones, Yale J. Biol. Med. 26 (1953) 80–97.

7. E. Chargaff, E. Vischer, R. Doniger, C. Green, F. Misani, J. Biol. Chem. 177 (1949) 405–

416.

8. A. D. Hershey, M. Chase, J. Gen. Physiol. 26 (1952) 36–56.

9. R. E. Franklin, R. G. Gosling, Nature 171 (1953) 740–741.

10. J. D. Watson, F. H. C. Crick, Nature 171 (1953) 737–738.

11. J. D. Watson, F. H. C. Crick, Nature 171 (1953) 964–967.

12. M. Meselson, F. W. Stahl, PNAS 44 (1958) 671–682.

13. J. H. Matthaei, O. W. Jones, R. G. Martin, M. W. Nirenberg, PNAS 48 (1962) 666–677.

14. J. G. Moffat, H. G. Khorana, J. Am. Chem. Soc. 83 (1961) 663–675.

15. R. W. Holley, G. A. Everett, J. T. Madison, A. Zamir, J. Biol. Chem. 240 (1965) 2122–

2128.

16. J. M. Berg, J. L. Tymoczko, L. Stryer, Biochemistry, Fifth edition, W. H. Freeman and

Company, New York, 2002.

17. S. C. Harvey, M. Prabhakaran, J. Am. Chem. Soc. 108 (1986) 6128–6136.

18. K. Nakamoto, M. Tsuboi, G. D. Strahan u Drug-DNA Interactions: Structures and

Spectra, John Wiley & Sons, New Jersey, 2008.

19. S. Neidle, Principles of Nucleic Acid Structure, Elsevier, London, 2008.

20. L. Clowney, S. C. Jain, A. R. Srinivasan, J. Westbrook, W. K. Olson, H. M. Berman, J.

Am. Chem. Soc. 118 (1996) 509–518.

21. J. Šponer, H. A. Gabb, J. Leszczynski, P. Hobza, Biophys. J. 73 (1997) 76–87.

22. C. F. Guerra, F. M. Bickelhaupt, J. G. Snijders, E. J. Baerends, J. Am. Chem. Soc. 122

(2000) 4117–4128.

118

23. A. Herbert, A. Rich, J. Biol. Chem. 271 (1996) 11595–11598.

24. H. Pearson, Nature 441 (2006) 398–401.

25. S. A. Gerbi, A.-K. Bielinsky. Curr. Opin. Genetics Dev. 12 (2002) 243–248.

26. a) C. Bailly, Curr. Med. Chem. 7 (2000) 39–58.;

b) D. A. Burden, N. Osheroff, Biochim. Biophys. Acta 1400 (1998) 139–154.;

c) R. Garcia-Carbonero, J. G. Supko, Clin. Cancer Res. 8 (2002) 641–661.

27. a) T. Hermann, E. Westhof, Curr. Opin. Biotechnol. 9 (1998) 66–73.;

b) L. Guan, M. D. Disney, ACS Chem. Biol. 7 (2012) 73–86.;

c) Y. Tor, Angew. Chem. Int. Ed. 38 (1999) 1579–1582.

28. R. Baliga, D. M. Crothers, PNAS 97 (2000) 7814–7818.

29. I. Ch. Gherghi, S. T. Girousi, A. N. Voulgaropoulos, R. Tzimou-Tsitouridou, Talanta 61

(2003) 103–112.

30. K. Shishido, S. Haruna, C. Yamamura, H. Iitsuka, H. Nemoto, Y. Shinohara, M. Shibuya,

Bioorg. Med. Chem. Lett. 7 (1997) 2617–2622.

31. M. A. Fuertes, C. Alonso, J. M. Pérez, Chem. Rev. 103 (2003) 645–662.

32. L. S. Lerman, J. Mol. Biol. 3 (1961) 18–30.

33. L. Strekowski, B. Wilson, Mutat. Res. 623 (2007) 3–13.

34. Q. Gao, L. D. Williams, M. Egli, D. Rabinovich, S.-L. Chen, G. J. Quigley, A. Rich, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 2422–2426.

35. G. Bischoff, S. Hoffmann, Curr. Med. Chem. 9 (2002) 321–348.

36. S. Nafisi, A. A. Saboury, N. Keramat, J.-F. Neault, H.-A. Tajmir-Riahi, J. Mol. Struct.

827 (2007) 35–43.

37. C. Laughton, B. Luisi, J. Mol. Biol. 288 (1998) 953–963.

38. J. M. Benevides, G. J. Thomas Jr., Biochemistry 44 (2005) 2993–2999.

39. J. E. Coury, L. McFail-Isom, L. D. Williams, L. A. Bottomley, Proc. Natl. Acad. Sci. USA

93 (1996) 12283–12286.

40. F. Sha, F.-M. Chen, Biophys. J. 79 (2000) 2095–2104.

41. R. D. Snyder, J. W. Green, Mutat. Res. 488 (2001) 151–169.

42. W. A. Denny, Curr. Med. Chem. 9 (2002) 1655–1665.

43. S. M. Nelson, L. R. Ferguson, W. A. Denny, Mutat. Res. 623 (2007) 24–40.

44. S. Neidle, Nat. Prod. Rep. 18 (2001) 291–309.

45. D. E. Wemmer, Biopolymers 52 (1999/2000) 197–211.

46. W. C. Tse, D. L. Boger, Chem. Biol. 11 (2004) 1607–1617.

47. J. Lah, G. Vesnaver, J. Mol. Biol. 342 (2004) 73–89.

119

48. P. Cozzi, Il Farmaco 55 (2000) 168–173.

49. L. D. Higgins, M. S. Searle, Chem. Commun. (1999) 1861–1862.

50. E. Gavathiotis, G. J. Sharman, M. S. Searle, Nucleic Acids Res. 28 (2000) 728–735.

51. D. Vlieghe, J. Sponer, L. Van Meervelt, Biochemistry 38 (1999) 16443–16451.

52. A. J. Hampshire, K. R. Fox, Biochimie 90 (2008) 988–998.

53. X. Cai, P. J. Gray Jr., D. D. Von Hoff, Cancer Treat. Rev. 35 (2009) 437–450.

54. R. Chen, C.-S. Liu, H. Zhang, Y. Guo, X.-H. Bu, M. Yang, J. Inorg. Biochem. 101 (2007)

412–421.

55. H. Xu, K.-C. Zheng, Y. Chen, Y.-Z. Li, L.-J. Lin, H. Li, P.-X. Zhang, L.-N. Ji, Dalton

Trans. (2003) 2260–2268.

56. C. J. Burrows, S. E. Rokita, Acc. Chem. Res. 27 (1994) 295–301.

57. Z. H. Siddik, Oncogene 22 (2003) 7265–7279.

58. A.-M. Florea, D. Büsselberg, Cancers 3 (2011) 1351–1371.

59. F. I. Raynaud, F. E. Boxall, P. M. Goddard, M. Valenti, M. Jones, B. A. Murrer, M.

Abrams, L. R. Kelland, Clin. Cancer Res. 3 (1997) 2063–2074.

60. H. T. Chifotides, K. R. Dunbar, Acc. Chem. Res. 38 (2005) 146–156.

61. J.-G. Liu, B.-H. Ye, H. Li, Q.-X. Zhen, L.-N. Ji, Y.-H. Fu, J. Inorg. Biochem. 76 (1999)

265–271.

62. Y.-G. Fang, J. Zhang, S.-Y. Chen, N. Jiang, H.-H. Lin, Y. Zhang, X.-Q. Yu, Bioorg. Med.

Chem. 15 (2007) 696–701.

63. A. J. Ruiz-Chica, A. Soriano, I. Tuñón, F. M. Sánchez-Jiménez, E. Silla, F. J. Ramírez,

Chem. Phys. 324 (2006) 579–590.

64. J. A. Collado, F. J. Ramírez, J. Raman Spectrosc. 30 (1999) 391–397.

65. K. Igarashi, K. Kashiwagi, Biochem. Biophys. Res. Commun. 271 (2000) 559–564.

66. H. C. Ha, J. D. Yager, P. A. Woster, R. A. Casero Jr., Biochem. Biophys. Res. Commun.

244 (1998) 298–303.

67. J. Ruiz-Chica, M. A. Medina, F. Sánchez-Jiménez, F. J. Ramírez, Biochim. Biophys. Acta

1628 (2003) 11–21.

68. H. Deng, V. A. Bloomfield, J. M. Benevides, G. J. Thomas Jr., Nucleic Acids Res. 28

(2000) 3379–3385.

69. U. Bachrach, Amino Acids 26 (2004) 307–309.

70. W. Wang, W. C. Ho, D. T. Dicker, C. MacKinnon, J. D. Winkler, R. Marmorstein, W. S.

El-Deiry, Canc. Biol. Ther. 4 (2005) 893–898.

120

71. A. J. Ruiz-Chica, M. A. Medina, F. Sánchez-Jiménez, F. J. Ramírez, J. Raman Spectrosc.

35 (2004) 93–100.

72. L. Pérez-Flores, A. J. Ruiz-Chica, J. G. Delcros, F. Sánchez-Jiménez, F. J. Ramírez, J.

Mol. Struct. 744–747 (2005) 699–704.

73. S. Marczi, LJ. Glavaš-Obrovac, T. Belovari, R. Stojković, S. Ivanković, V. Šerić, I.

Piantanida, M. Žinić, Cancer Chemother. Pharmacol. 62 (2008) 595–604.

74. T. M. Davis, W. D. Wilson, M. Eriksson, B. Nordén, A. N. Lane, M. E. Peek, L. D.

Williams, Methods Enzymol. 340 (2001) 22–290.

75. S. Bi, H. Zhang, C. Qiao, Y. Sun, C. Liu, Spectrochim. Acta A 69 (2008) 123–129.

76. H.-C. Becker, B. Nordén, J. Am. Chem. Soc. 119 (1997) 5798–5803.

77. F. Rosu, E. De Pauw, V. Gabelica, Biochimie 90 (2008) 1074–1087.

78. F. Araya, G. Huchet, I. McGroarty, G. G. Skellern, R. D. Waigh, Methods 42 (2007) 141–

149.

79. J. Ruiz-Chica, M. A. Medina, F. Sánchez-Jiménez, F. J. Ramírez, J. Mol. Struct. 408–481

(1999) 455–458.

80. W. Xie, Y. Ye, A. Shen, L. Zhou, Z. Lou, X. Wang, J. Hu, Vib. Spectrosc. 47 (2008) 119–

123.

81. G. Keresztury u Handbook of Vibrational Spectroscopy, John Wiley & Sons, West

Sussex, 2002.

82. E. Smith, G. Dent, Modern Raman Spectroscopy − A Practical Approach, John Wiley &

Sons, West Sussex, 2005.

83. H. M. Pask, P. Dekker, R. P. Mildren, D. J. Spence, J. A. Piper, Prog. Quantum Electron.

32 (2008) 121–158.

84. F. Shuzhen, Z. Xingyu, W. Qingpu, L. Zhaojun, L. Lei, C. Zhenhua, C. Xiaohan, Z.

Xiaolei, Opt. Commun. 284 (2011) 1642–1644.

85. R. Aroca, Surface-Enhanced Vibrational Spectroscopy, John Wiley & Sons, West Sussex,

2006.

86. W. R. Browne, J. J. McGarvey, Coord. Chem. Rev. 251 (2007) 454–473.

87. T. Vo-Dinh, D. L. Stokes, G. D. Griffin, M. Volkan, U. J. Kim, M. I. Simon, J. Raman

Spectrosc. 30 (1999) 785–793.

88. G. McNay, D. Eustace, W. E. Smith, K. Faulds, D. Graham, Appl. Spectrosc. 65 (2011)

825–837.

89. J. Kneipp, H. Kneipp, K. Kneipp, Chem. Soc. Rev. 37 (2008) 1052–1060.

90. M. Fleischmann, P. J. Hendra, A. J. McQuillan, Chem. Phys. Lett. 26 (1974) 163–166.

121

91. D. L. Jeanmaire, R. P. Van Duyne, J. Electroanal. Chem. 84 (1977) 1–20.

92. M. G. Albrecht, J. A. Creighton, J. Am. Chem. Soc. 99 (1977) 5215–5217.

93. H. Ehrenreich, H. R. Philipp, Phys. Rev. 128 (1962) 1622–1629.

94. P. C. Lee, D. Meisel, J. Phys. Chem. 86 (1982) 3391–3395.

95. J. Zhou, J. Ral ston, R. Sedev, D. A. Beattie, J. Colloid Interface Sci. 331 (2009) 251–262.

96. a) L. Gao, Q. Huang, X.-Y. Li, S. Yang, Phys. Chem. Chem. Phys. 3 (2001) 1661–1665.

b) J.-L. Yao, J. Tang, D.-Y. Wu, D.-M. Sun, K.-H. Xue, B. Ren, B.-W. Mao, Z.-Q. Tian,

Surf. Sci. 514 (2002) 108–116.

97. J. A. Creighton, M. S. Alvarez, D. A. Weitz, S. Garoff, M. W. Kim, J. Phys. Chem. 87

(1983) 4793–4799.

98. B. H. Loo, J. Phys. Chem. 87 (1983) 3003–3007.

99. C. M. Coyle, G. Chumanov, P. W. Jagodzinski, J. Raman Spectrosc. 29 (1998) 757–762.

100. M. Meier, A. Wokaun, T. Vo-Dinh, J. Phys. Chem. 89 (1985) 1843–1846.

101. W. W. Yu, I. M. White, Anal. Chem. 82 (2010) 9626–9630.

102. X.-M. Lin, Y. Cui, Y.-H. Xu, B. Ren, Z.-Q. Tian, Anal. Bioanal. Chem. 394 (2009) 1729–

1745.

103. M. V. Cañamares, J. V. Garcia-Ramos, S. Sanchez-Cortes, M. Castillejo, M. Oujja, J.

Colloid Interface Sci. 326 (2008) 103–109.

104. C. H. Munro, W. E. Smith, M. Garner, J. Clarkson, P. C. White, Langmuir 11 (1995)

3712–3720.

105. P. D. Nallathamby, X.-H. N. Xu, Nanoscale 2 (2010) 942–952.

106. J. Chen, J.-M. Hu, Z.-S. Xu, R.-S. Sheng, Appl. Spectrosc. 47 (1993) 292–295.

107. R. F. Aroca, R. A. Alvarez-Puebla, N. Pieczonka, S. Sanchez-Cortez, J. V. Garcia-Ramos,

Adv. Colloid Interface Sci. 116 (2005) 45–61.

108. R. A. Alvarez-Puebla, E. Arceo, P. J. G. Goulet, J. J. Garrido, R. F. Aroca, J. Phys. Chem.

B 109 (2005) 3787–3792.

109. M. Moskovits, Rev. Mod. Phys. 57 (1985) 783–826.

110. P. Kambhampati, C. M. Child, M. C. Foster, A. Campion, J. Chem. Phys. 108 (1998)

5013–5026.

111. K. L. Kelly, E. Coronado, L. L. Zhao, G. C. Schatz, J. Phys. Chem. B 107 (2003) 668–

677.

112. W. L. Barnes, A. Dereux, T. W. Ebbesen, Nature 424 (2003) 824–830.

113. P. B. Johnson, R. W. Christy, Phys. Rev. B 6 (1972) 4370–4379.

122

114. M. Sun, S. Zhang, Y. Fang, Z. Yang, D. Wu, B. Dong, H. Xu, J. Phys. Chem. C 113

(2009) 19328–19334.

115. A. Campion, P. Kambhampati, Chem. Soc. Rev. 27 (1998) 241–250.

116. E. C. Le Rue, M. Meyer, E. Blackie, P. G. Etchegoin, J. Raman Spectrosc. 39 (2008)

1127–1134.

117. A. G. Brolo, D. E. Irish, B. D. Smith, J. Mol. Struct. 405 (1997) 29–44.

118. A. Otto, J. Raman Spectrosc. 36 (2005) 497–509.

119. P. Mohaparta, J. Food Res. 1 (2012) 3–12.

120. H. Wei, H. Xu, Appl. Phys. A 89 (2007) 273–275.

121. A. Murza, S. Alvarez-Méndez, S. Sanchez-Cortes, J. V. Garcia-Ramos, Biopolymers 72

(2003) 174–184.

122. H. Morjani, J.-F. Riou, I. Nabiev, F. Lavelle, M. Manfait, Cancer Res. 53 (1993) 4784–

4790.

123. G. Breuzard, J.-M. Millot, J.-F. Riou, M. Manfait, Anal. Chem. 75 (2003) 4305–4311.

124. C.-Y. Wu, W.-Y. Lo, C.-R. Chiu, T.-S. Yang, J. Raman Spectrosc. 37 (2006) 799–807.

125. I. Piantanida, B. S. Palm, M. Žinić, H.-J. Schneider, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 (2001)

1808–1816.

126. A. Sornosa-Ten, M. T. Albelda, J. C. Frías, E. García-España, J. M. Llinares, A. Budimir,

I. Piantanida, Org. Biomol. Chem. 8 (2010) 2567–2574.

127. J. González, J. M. Llinares, R. Belda, J. Pitarch, C. Soriano, R. Tejero, B. Verdejo, E.

García-España, Org. Biomol. Chem. 8 (2010) 2367–2376.

128. V. Chiş, M. M. Venter, N. Leopold, O. Cozar, Vib. Spectrosc. 48 (2008) 210–214.

129. B. S. Palm, I. Piantanida, M. Žinić, H.–J. Schneider, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2

(2000) 385–392.

130. F. R. Dollish, W. G. Fateley, F. F. Bentley, Characteristic Raman Frequencies of Organic

Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1974.

131. S. Sánchez-Cotrés, J. V. García-Ramos, J. Raman Spectrosc. 29 (1998) 365–371.

132. P. Sett, M. ghosh, P. K. Mallick, J. Chowdhury, J. Raman Spectrosc. 39 (2008) 1878–

1889.

133. L. Rintoul, K. Crawford, H. F. Shurvell, P. M. Fredericks, Vib. Spectrosc. 15 (1997) 171–

177.

134. a) B. H. Loo, Y. Tse, K. Parsons, C. Adelman, A. El-Hage, Y. G. Lee, J. Raman

Spectrosc. 37 (2006) 299–304.

b) P. Naumov, M. Ristova, B. Šoptrajanov, M. Zugik, J. Mol. Struct. 598 (2001) 235–243.

123

135. a) T. D. Klots, Spectrochim. Acta A 54 (1998) 1481–1498.

b) D. H. Dressler, Y. Mastai, M. Rosenbluh, Y. Fleger, J. Mol. Struct. 935 (2009) 92–96.

136. a) J. M. Benevides, S. A. Overman, G.J. Thomas Jr., J. Raman Spectrosc. 36 (2005) 279–

299.

b) K.-H. Cho, J. Choo, S.-W. Joo, Spectrochim. Acta A 62 (2005) 1141–1145.

137. a) G. F. Diaz, M. M. Campos-Vallette, M. S. Saavedra, R. E. Clavijo, J. C. Canales, J.

Costamagna, J. Vargas, Vib. Spectrosc. 28 (2002) 223–234.

b) M. S. Atanassova, G. D. Dimitrov, Spectrochim. Acta A 59 (2003) 1655–1662.

138. S. Miljanić, A. Dijanošić, I. Matošević, I. Piantanida, Vib. Spectrosc. 57 (2011) 23–

29.

124

7. POPIS KRATICA I SIMBOLA

DNA – deoksiribonukleinska kiselina

RNA – ribonukleinska kiselina

A – adenin

G – gvanin

C – citozin

T – timin

U – uracil

UV – ultraljubičasto zračenje

VIS – vidljivo zračenje

SERS – površinski pojačano Ramanovo raspršenje

IR – infracrveno zračenje

NIR – blisko infracrveno zračenje

TEM – transmisijska elektronska mikroskopija

– istezna vibracija

– deformacijska vibracija

– torzija

s – simetrična vibracija

as – antisimetrična vibracija

ip – u ravnini

oop – izvan ravnine

sc – striženje

tw – uvijanje

wg – klaćenje

xi

8. PRILOZI

Slika P1. FT-Ramanovi spektri koloida 2 a) bez NaBH4 i b) s NaBH4.

Slika P2.a) FT-Ramanov spektar koloida 2. SERS spektri na koloidu 2 b) poli A, c) poli G, d)

poli C, e) poli U, f) poli dAdT–poli dAdT, g) poli dGdC–poli dGdC, h) poli rA–poli rU i i) ct-

DNA.

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(i)

xii

Slika P3. SERS spektri na koloidu 2 u prisutnosti NaBH4: a) IM, b) IM/poli A, c) IM/poli G,

d) IM/poli C i e) IM/poli U; c(IM) = 5×10–6

mol dm–3

, IM/poli 1/20.

Slika P4. SERS spektri na koloidu 2 u prisutnosti NaBH4: a) PY, b) PY/poli A, c) PY/poli G,

d) PY/poli C i e) PY/poli U; c(PY) = 5×10–6

mol dm–3

, PY/poli 1/20.

1800 1600 1400 1200 1000 800 600

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

1800 1600 1400 1200 1000 800 600

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

xiii

Slika P5. SERS spektri na koloidu 2 u prisutnosti NaBH4: a) IM, b) IM/poli dAdT–poli

dAdT, c) IM/poli dGdC–poli dGdC, d) IM/poli rA–poli rU; c(IM) = 5×10–6

mol dm–3

,

IM/poli 1/20.

Slika P6. SERS spektri na koloidu 2 u prisutnosti NaBH4: a) PY, b) PY/poli dAdT–poli

dAdT, c) PY/poli dGdC–poli dGdC, d) PY/poli rA–poli rU; c(PY) = 5×10–6

mol dm–3

,

PY/poli 1/20.

1800 1600 1400 1200 1000 800 600

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

(c)

(d)

1800 1600 1400 1200 1000 800 600

Ra

ma

no

v in

ten

zite

t

Valni broj / cm-1

(a)

(b)

(c)

(d)

xiv

9. ŽIVOTOPIS

Adriana Dijanošić je rođena 21. kolovoza 1984. godine u Varaždinu. Osnovnu školu je

završila u Ludbregu. 1999. godine upisuje Rudarsku i kemijsku školu u Varaždinu, smjer

kemijski tehničar. 2003. godine upisuje Prirodoslovno-matematički fakultet Sveučilišta u

Zagrebu koji završava 17.04.2008. godine i stječe titulu diplomiranog inženjera kemije. Od

02.06.2008. godine zaposlena je kao asistent-znanstveni novak u Zavodu za analitičku kemiju

Kemijskog odsjeka PMF-a. Iste godine upisuje Sveučilišni poslijediplomski doktorski studij

kemije. Doktorski rad izrađuje u Zavodu za analitičku kemiju Kemijskog odsjeka PMF-a pod

voditeljstvom doc. dr. sc. Snežane Miljanić u okviru projekta „Spektroskopska analiza

nezasićenih sustava i spojeva metala“.

Koautor je šest znanstvenih radova objavljenih u CC časopisima. Aktivno sudjeluje na

kongresima u Hrvatskoj i inozemstvu te je autor i koautor deset posterskih priopćenja. U

svrhu stručnog usavršavanja provela je mjesec dana u 2012. godini na Sveučilištu Eötvös

Loránd u Budimpešti.

Uz istraživački rad, sudjeluje i u nastavi kao asistent u osnovnim praktikumima

analitičke kemije. Neposredni je voditelj devet diplomskih radova. Uključena je u aktivnosti

popularizacije znanosti Kemijskog odsjeka PMF-a (Smotra Sveučilišta u Zagrebu, Otvoreni

dan Kemijskog odsjeka PMF-a).

Objavljeni radovi u CC časopisima:

1. S. Miljanić, A. Dijanošić, M. Kalac, M. Radić Stojković, I. Piantanida, D.

Pawlica, J. Eilmes, Surface-enhanced Raman scattering study of the binding

modes of a dibenzotetraaza[14]annulene derivative with DNA/RNA

polynucleotides, Croat. Chem. Acta 85 (2012) 577–584.

2. N. Galić, A. Dijanošić, D. Kontrec, S. Miljanić, Structural investigation of

aroylhydrazones in dimethylsulphoxide/water mixtures, Spectrochim. Acta A 95

(2012) 347353.

3. S. Miljanić, A. Dijanošić, K. Landeka, M. Radić Stojković, I. Piantanida, Binding

of phenanthridine-biguanide derivative with DNA/RNA polynucleotides studied

by surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS), Appl. Spectrosc. 66(1) (2012)

8289.

http://bib.irb.hr/prikazi-rad?&rad=607478



xv

4. S. Miljanić, A. Dijanošić, I. Matošević, I. Piantanida, Intercalator-DNA

interactions revealed by NIR surface-enhanced Raman spectroscopy, Vib.

Spectrosc. 57 (2011) 23–29.

5. S. Miljanić, A. Dijanošić, I. Piantanida, Z. Meić, M. T. Albelda, A. Sornosa-Ten,

E. García-Espana, Surface-Enhanced Raman Study of the Interactions between

Tripodal Cationic Polyamines and Polynucleotides, Analyst 136 (2011) 3185–

3193.

6. S. Miljanić, A. Dijanošić, Z. Meić, Surface-Enhanced Raman Spectra of

Rhodamine 19 Octadecylamide, Spectrochim. Acta A 75 (2010) 10081012.

Kongresno priopćenje u CC časopisu:

1. G. Šinko, I. Vinković Vrček, S. Miljanić, A. Dijanošić, Interaction of silver

nanoparticles with cholinesterase, Abstracts of the 36th FEBS Congress,

Biochemistry for Tomorow's Medicine, The FEBS Journal 278 (2011) 433–433.

Posterska priopćenja na znanstvenim skupovima:

1. S. Miljanić, A. Dijanošić, M. Kalac, M. Radić Stojković, I. Piantanida, D.

Pawlica, J. Eilmes, Binding modes of a DBTAA derivative with DNA/RNA

polynucleotides revealed by SERS, 31th European Congress on Molecular

Spectroscopy – Book of Abstracts / Nagy-Pora, Katalin; Chis, Vasile; Astilean,

Simion; Cozar, Onuc (ur.), Cluj-Napoca, 2012, 210–210.

2. A. Dijanošić, S. Miljanić, J. Gonzales Garcia, E. Garcia-Espana, I. Piantanida,

Study of interactions between DNA/RNA nucleotides and PHENPOD by surface

enhanced Raman spectroscopy, 31th European Congress on Molecular

Spectroscopy – Book of Abstracts / Nagy-Pora, Katalin; Chis, Vasile; Astilean,

Simion; Cozar, Onuc (ur.), Cluj-Napoca, 2012, 176–176.

3. A. Dijanošić, N. Galić, S. Miljanić, Istraživanje strukture N'-(2-hidroksi-3-

metoksifenilmetiliden)-3-piridinkarbohidrazida u smjesama dimetilsulfoksida i

vode, Knjiga sažetaka IX. susreta mladih kemijskih inženjera / Sanja Martinez

(ur.), Zagreb, 2012, 127–127.

4. A. Dijanošić, S. Miljanić, I. Piantanida, Binding of cationic polyamines with

double-stranded polynucleotides studied by surface-enhanced Raman

spectroscopy, IX International Congress of Young Chemists – Book of Abstracts,

Krakow, 2011, 119–119.












xvi

5. A. Dijanošić, S. Miljanić, I. Piantanida, Istraživanje interakcija između PYPOD i

polinukleotida primjenom površinski pojačanog Ramanovog raspršenja, Knjiga

sažetaka XXII. Hrvatskog skupa kemičara i kemijskih inženjera / Tomašić, Vesna;

Maduna Valkaj, Karolina (ur.), Zagreb, 2011, 127–127.

6. A. Dijanošić, S. Miljanić, Z. Meić, I. Piantanida, Istraživanje interakcija između

poliamina IM i polinukleotida primjenom površinski pojačanog Ramanovog

raspršenja, Knjiga sažetaka VIII. Susreta mladih kemijskih inženjera / Bolf,

Nenad; Šoljić Jerbić, Ivana (ur.), Zagreb, 2010, 155155.

7. A. Dijanošić, S. Miljanić, Z. Meić, I. Piantanida, T. M. Albelda, A. Sornosa-Ten,

E. Garcia-Espana, Surface-enhanced Raman study of the interactions between

cationic polyamines and polynucleotides, 30th European Congress on Molecular

Spectroscopy – Book of Abstracts / Beccuci, Maurizio; Gellini Cristina, Schettino,

Vincenzo (ur.), Firenza, 2010, 136–136.

8. A. Dijanošić, S. Miljanić, I. Piantanida, Surface-enhanced Raman study of the

interactions between the intercalator ADAP and DNA, 10th International

Symposium and summer School on Bioanalysis – Book of Abstracts / Matković

Čalogović, Dubravka (ur.), Zagreb, 2010, 82–82.

9. A. Dijanošić, S. Miljanić, Z. Meić, Istraživanje ravnoteže rodaminskih boja

spektroskopijom površinski pojačanog Ramanovog raspršenja, Knjiga sažetaka

XXI. Hrvatskog skupa kemičara i kemijskih inženjera / Pičuljan, Katarina; Smolec,

Sonja (ur.), Zagreb, 2009, 159159.






Documents

ISTRAŽIVANJE INTERAKCIJA MALIH MOLEKULA S … · 2013-11-27 · prirodoslovno-matematiČki fakultet adriana dijanošić istraŽivanje interakcija malih molekula s polinukleotidima