Isi Bab III Pkl Fixed 2

8/20/2019 Isi Bab III Pkl Fixed 2

1/67

BAB III

IDENTIFIKASI DAN DETEKSI PARASIT, BAKTERI, SERTA VIRUS

PADA KOMODITAS PERIKANAN DI BKIPM KELAS I JAKARTA II

3.1 Teori Umum Ideni!i"#$i d#n Dee"$i P#r#$i, B#"eri, $er# Viru$

%#d# Komodi#$ Peri"#n#n

Komoditas perikanan merupakan salah satu komoditas yang penting dalam

bidang ekspor dan impor, terutama berkaitan dengan keamanan pangan. Jenis-

jenis parasit, bakteri, dan virus pada komoditas perikanan perlu diketahui

pengertian umumnya, sebagai antisipasi dari penurunan mutu produk perikanan

yang mengancam kesehatan manusia.

3.1.1 Pen&eri#n P#r#$i

Parasit merupakan organisme yang salah satu cara hidupnya merugikan

organisme lain. Organisme yang hidup sebagai parasit selama hidupnya

memerlukan organisme lain sebagai tempat hidupnya. Organisme lain itu dapat

berupa tuan rumah utama (inang utama atau inang akhir), inang perantara, vektor

dan predator. enurut !rabda ("##"), parasit adalah organisme yang hidup di

dalam atau pada organisme lain yang biasanya menimbulkan bahaya terhadap

inangnya. Parasitisme merupakan salah satu bentuk hubungan antara penumpang

(parasit) yang tergantung pada inang dan merugikan kehidupan inang dan tanpa

inang organisme tersebut tidak dapat hidup. $nang merupakan habitat dan tempat

pemberi makanan bagi organisme penumpang (parasit). Parasit dapat dibedakan

berdasarkan ketergantungannya terhadap inang (Kabata et., al "#%&), diantaranya'

") empat di ubuh $kan

erdasarkan habitat atau tempatnya di tubuh ikan, parasit dibedakan

menjadi ektoparasit dan endoparasit. *ktoparasit adalah parasit yang terdapat pada

bagian luar tubuh ikan atau di bagian yang masih mendapat udara dari luar.

*ktoparasit menyerang kulit, sirip, operculum, rongga mulut dan insang ikan.

*ktoparasit, contohnya Lernea cyprinacea, Argulus japonicas, Dactylogirus sp.,

Gyrodactilus sp., Trichodina sp. dan lain sebagainya. *ndoparasit adalah parasit

yang hidupnya di dalam tubuh inang seperti di pencernaan (usus), peredaran darah

(pembuluh darah), otak, otot daging dan organ tubuh seperti ginjal, hati dan

11


2/67

12

gelembung renang. *ndoparasit, contohnya Sangunicola inermis, Myxosoma

cerebralis, Cryptobis borreli, Anisais spp., dan lain sebagainya.

+) aktu erdapatnya pada ubuh

erdasarkan aktu terdapat di dalam tubuh ikan, parasit dibedakan

menjadi parasit temporer, parasit permanen, dan parasit periodik. Parasit temporer

adalah parasit yang berada pada tubuh inang pada aktu mengambil makanan

saja, bila sudah mendapatkan makanannya parasit meninggalkan inang dan parasit

hidup bebas, contohnya pacet, lintah, dan nyamuk. Parasit permanen adalah

parasit yang selama hidupnya termasuk seluruh siklus hidupnya berada pada

tubuh inang. Parasit periodik adalah parasit yang hanya pada inang pada sebagiansiklus hidupnya.

) Kelangsungan /idup pada $nang (Ketergantungan pada $nang)

erdasarkan si0at ketergantungannya pada inang, parasit dibedakan

menjadi parasit obligat dan parasit 0akultati0. Parasit obligat adalah kelompok

parasit yang selama hidupnya tergantung pada inang, tanpa mendapat inang pada

sebagian dari stadium larvanya, maka parasit tersebut akan mati, contohnya

Lernea sp. dan Argulus sp. Parasit 0akultati0 adalah sekelompok parasit yang dapat

hidup tanpa inang, contohnya Saprolegnia sp. dan !habditis sp.1) $nang bagi Parasit

eradasarkan si0at inang bagi parasit, parasit dibedakan menjadi inang

akhir (end host ), inang perantara (intermediate host ), inang reser"oir (reser"oir

host ), inang transport (transport host ), dan vektor. $nang akhir (end host ) adalah

tuan rumah, parasit akan tumbuh menjadi deasa, contohnya cacing Ascaris

masuk ke dalam tubuh inang berupa telur (kista) dan dalam tubuh inang telur

berkembang menjadi cacing deasa. $nang perantara (intermediate host ) adalah

inang sementara bagi parasit, contohnya Cyclops merupkan inang perantara bagi

cacing #otriocephalus latus.

$nang reser"oir (reser"oir host ) adalah kelompok hean yang dapat

menjadi penyimpan atau habitat cadangan bagi parasit, contohnya Armadillo

merupakan inang reser"oir bagi parasit Trypanosoma cru$i dan inang reser"oir

tersebut dapat membantu penyebaran parasit Trypanosoma cru$i. $nang transpor

(tansport host ) merupakan hean yang membaa parasit di dalam tubuh atau di


3/67

luar tubuh dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun stadium dalam

kehidupannya, contohnya inang transport adalah lalat yang membaa Amoeba.

2. Anisais spp

Klasi0ikasi Anisais menurut !rabda ("##") dapat dilihat pada !ambar &,

sebagai berikut'

Phylum ' 3emathelminthes

4lass ' 3ematoda

Ordo ' 2scaridida

5amily ' 2nisakidae

!enus ' Anisais

6pesies ' Anisais sp.

'#m(#r ). Anisais sp.1

enurut illiams 7 Jones ("##1), Anisais baik dalam bentuk larva

maupun deasa, merupakan parasit yang sangat umum dijumpai pada spesies

ikan air laut. !rabda ("##") menyebutkan baha Anisais merupakan golongan

cacing nematoda yang berukuran besar dengan tiga buah bibir yang mengelilingi

mulutnya.

"http%&&'''.e(cleansing.com&parasites&anisaiasis(Anisais(simplex.htm l

8etak tiga buah bibirnya antara lain satu terletak di dorsal dan dua lainnya

di sisi ventro-lateral. eberapa spesies memiliki bibir yang dipisahkan oleh

interlabia yang berukuran lebih kecil (!rabda "##"). 2danya bibir yang

13

http://www.e-cleansing.com/parasites/anisakiasis-anisakis-simplex.htmlhttp://www.e-cleansing.com/parasites/anisakiasis-anisakis-simplex.htmlhttp://www.e-cleansing.com/parasites/anisakiasis-anisakis-simplex.htmlhttp://www.e-cleansing.com/parasites/anisakiasis-anisakis-simplex.html


4/67

berkembang baik pada 0amili 2nisakidae deasa merupakan karakteristik khas.

Kutikula jelas terlihat beralur transversal di sepanjang tubuhnya dan tembus

cahaya (3uchjangreed et., al. +99:). Anisais memiliki eso0agus yang lurus,

berbentuk silindris atau sedikit mengalami pelebaran di bagian posteriornya,

terdiri atas dua bagian, yaitu bagian anterior yang berupa otot dan bagian posterior

yang berbentuk kelenjar atau ventrikulus. agian ventrikulus berhubungan dengan

usus halus dan bagian terminal dari sistem pencernaannya adalah rektum yang

membuka keluar melalui anus dengan tiga kelenjar anal besar yang berasosiasi

dengan rektum. or0ologi Anisais dapat dilihat pada !ambar :.

'#m(#r *. Mor!o+o&i Anisakis

a) Predileksi

;istribusi dan lokalisasi in0eksi cacing ini pada ikan terbesar ditemukan

pada usus kemudian hati dan lambung dan tidak tertutup kemungkinan terjadinya

in0eksi pada bagian lain dari tubuh ikan seperti sirip, paru-paru, telur di uterus dan

insang.

)http%&&nmlc.org&)*+)&*)&marine(mammal(parasite(o(the(month(ans'er(january()*+)

erdasarkan hasil observasi yang sudah pernah dilaporkan, tidak pernah

ditemukan adanya migrasi postmortem dari cacing deasa karena cacing ini tidak

dapat bermigrasi ke daging ataupun bagian tubuh dengan tingkat vaskularisasi

yang tinggi. ;istribusi cacing ini mengindikasikan kemampuannya bermigrasi

14


5/67

pada lokasi yang berbeda dari organ-organ tubuh ikan (3uchjangreed et., al.

+99:).

b) 6iklus /idup 4acing Anisais

;i


6/67

8arva akan mengalami pergantian kulit (moulting ), berkembang menjadi larva

stadium keempat dan kemudian menjadi deasa.

. 1erinsus sp.

6tudi mengenai 1erinsus spp. dimulai tahun "#1: oleh >niversitas e62 dan e


7/67

mempunyai interval daerah inang yang luas. 6pesies 1erinsus lain yang telah

dideskripsi, yaitu 1erinsus 4ug'adi, 1erinsus chesapeai, 1erinsus andre'si

dan 1erinsus mediterraneus (@illalba et., al.)**/5. 1erinsus mengin0eksi

berbagai jenis Mollusca (abalone, tiram, kerang, ? scallops?, kerang mutiara dll) di

lima benua, dengan konsekuensi dramatis di banyak area. Penyakit ini telah

menimbulkan kerugian ekonomi yang cukup parah sehingga para peneliti di

seluruh dunia berusaha untuk mempelajari parasit ini.

!enus 1erinsus pada mulanya ditempatkan di ordo Perkinsea dalam

0ilum Apicomplexa. 2nalisa taksonomi berdasar se4uencing nukleotida menandai

baha secara 0ilogeni, 1erinsus lebih dekat dengan ;ino0lagellata dan pada

4occidean dan 1iroplasma apicomplexa dibanding dengan pada jamur atau

0lagellata. Penelitian terbaru mengindikasikan baha parasit ini bukan termasuk

Apicomplexa tapi lebih dekat hubungannya dengan ;ino0lagellida (!oggin dan

arker "##, Perkins "##:, 6iddal et., al. "##=, Aeece et., al. "##= dalam oer

+99:).

4. ;eteksi olekular Parasit 1erinsus olseni enggunakan eknik P4A( 1olymerase Chain !eaction)

Prinsip kerja P4A adalah memperbanyak ;32 suatu patogen sampai

jumlah yang dapat dilihat dengan mata telanjang. eknik ini bekerja dalam siklus

yang berulang-ulang sebanyak 9B19 kali setiap siklus terdiri dari tahapan

reaksi yaitu denaturation (pemecahan ;32 target), annealing (penempelan

primer pada ;32 target), dan elongation (pemanjangan primer dengan bantuan

enCim polymerase). Proses pemeriksaan untuk P4A terdiri dari tahapan utama

yaitu, ekstraksi ;32 atau A32 target, ampli0ikasi dan elektro0oresis (deteksi

;32). Pada penelitian ini digunakan dua pasangan primer, sebagai berikut'

&D 44! 4 ! ! !2E!4 44 D

&D 242 42 !!4 4 42 2! 2! D

Aeaksi P4A terdiri dari buer ("9 m ris, p/ #,+F ",& m g4l+F

=&m K4l 9,9+G een-+9F "9 H Tetramethylamonium Chloride (24)F "9

HgEml 62F +,&G Dimethyl Suloxide (;6O) dan &G 0ormamidF " H masing-

masing primerF +99 H masing-masing d2P, d4P, d!P dan dPF ",& unit

17


8/67

Ta4 polymerase dan ;32 template dalam volume total +& Hl. 6ampel P4A

dipanaskan dalam Thermocycler pada #& 94 selama 1 menit dan 19 siklus pada #&

94 selama 1 menit, & 94 selama 1 menit dan :& 94 selama 1 menit dengan

ekstensi akhir :& 94 selama 1 menit (4asas et., al.+99+ dalam oss et., al.+99:).

3.1. Pen&eri#n B#"eri

akteri (dari kata 8atin bacteriumF jamak' bacteria) adalah kelompok

organisme yang tidak memiliki membran inti sel. Organisme ini termasuk ke

dalam domain prokariota dan berukuran sangat kecil (mikroskopik), serta

memiliki peran besar dalam kehidupan di bumi, beberapa kelompok bakteri

dikenal sebagai agen penyebab in0eksi dan penyakit. 6truktur sel bakteri relati0

sederhana, yaitu tanpa nukleus atau inti sel, kerangka sel, dan organel-organel lain

seperti mitokondria dan kloroplas, hal inilah yang menjadi dasar perbedaan antara

sel prokariot dengan sel eukariot yang lebih kompleks.

akteri dapat ditemukan di hampir semua tempat, diantaranya di tanah,

air , udara, dalam simbiosis dengan organisme lain maupun sebagai agen parasit

( patogen), bahkan dalam tubuh ikan. akteri pada umumnya berukuran 9,&B& Im,

tetapi terdapat bakteri tertentu yang dapat berdiameter hingga =99 Im. akteri

tersebut pada umumnya memiliki dinding sel, seperti sel tumbuhan dan jamur ,

tetapi dengan bahan pembentuk sangat berbeda ( peptidoglikan). eberapa jenis

bakteri bersi0at motil (mampu bergerak) dan mobilitasnya ini disebabkan oleh

0lagel, sehingga perlu dilakukannya pengecekan bakteri pada ikan yang

dilalulitaskan di K$P kelas " Jakarta + yang bertujuan untuk pencegahan penularan bakteri yang dapat membahayakan manusia.

8aboratorium akteriologi, ikan atau sampel yang datang akan diuji

bakteri apa yang ada atau yang terkandung dalam sampel tersebut hal ini

bertujuan untuk mengetahui jenis ikan konsumsi tersebut terdapat bakteri yang

berbahaya untuk manusia dan pada ikan hias tersebut apakah terdapat bakteri

yang berbahaya untuk kelangsungan hidup ikan hias lain, serta mencegah

masuknya bakteri berbahaya yang masuk, sehingga ikan yang teridenti0ikasi

18

https://id.wikipedia.org/wiki/Bahasa_Latinhttps://id.wikipedia.org/wiki/Organismehttps://id.wikipedia.org/wiki/Prokariotahttps://id.wikipedia.org/wiki/Prokariotahttps://id.wikipedia.org/wiki/Bumihttps://id.wikipedia.org/wiki/Infeksihttps://id.wikipedia.org/wiki/Penyakithttps://id.wikipedia.org/wiki/Nukleushttps://id.wikipedia.org/wiki/Kerangka_selhttps://id.wikipedia.org/wiki/Kerangka_selhttps://id.wikipedia.org/wiki/Organelhttps://id.wikipedia.org/wiki/Organelhttps://id.wikipedia.org/wiki/Mitokondriahttps://id.wikipedia.org/wiki/Kloroplashttps://id.wikipedia.org/wiki/Kloroplashttps://id.wikipedia.org/wiki/Selhttps://id.wikipedia.org/wiki/Prokariothttps://id.wikipedia.org/wiki/Eukariothttps://id.wikipedia.org/wiki/Tanahhttps://id.wikipedia.org/wiki/Tanahhttps://id.wikipedia.org/wiki/Airhttps://id.wikipedia.org/wiki/Udarahttps://id.wikipedia.org/wiki/Simbiosishttps://id.wikipedia.org/wiki/Simbiosishttps://id.wikipedia.org/wiki/Parasithttps://id.wikipedia.org/wiki/Patogenhttps://id.wikipedia.org/wiki/Dinding_selhttps://id.wikipedia.org/wiki/Tumbuhanhttps://id.wikipedia.org/wiki/Fungihttps://id.wikipedia.org/wiki/Peptidoglikanhttps://id.wikipedia.org/wiki/Flagelhttps://id.wikipedia.org/wiki/Bahasa_Latinhttps://id.wikipedia.org/wiki/Organismehttps://id.wikipedia.org/wiki/Prokariotahttps://id.wikipedia.org/wiki/Bumihttps://id.wikipedia.org/wiki/Infeksihttps://id.wikipedia.org/wiki/Penyakithttps://id.wikipedia.org/wiki/Nukleushttps://id.wikipedia.org/wiki/Kerangka_selhttps://id.wikipedia.org/wiki/Organelhttps://id.wikipedia.org/wiki/Mitokondriahttps://id.wikipedia.org/wiki/Kloroplashttps://id.wikipedia.org/wiki/Selhttps://id.wikipedia.org/wiki/Prokariothttps://id.wikipedia.org/wiki/Eukariothttps://id.wikipedia.org/wiki/Tanahhttps://id.wikipedia.org/wiki/Airhttps://id.wikipedia.org/wiki/Udarahttps://id.wikipedia.org/wiki/Simbiosishttps://id.wikipedia.org/wiki/Parasithttps://id.wikipedia.org/wiki/Patogenhttps://id.wikipedia.org/wiki/Dinding_selhttps://id.wikipedia.org/wiki/Tumbuhanhttps://id.wikipedia.org/wiki/Fungihttps://id.wikipedia.org/wiki/Peptidoglikanhttps://id.wikipedia.org/wiki/Flagel


9/67

membaa bakteri berbahaya akan langsung dimusnahkan untuk mencegah

penyebaran bakteri berbahaya tersebut.

Persiapkan hal-hal yang berhubungan dengan pengujian sebelum

melakukan uji bakteri. Pengujian bakteri terlebih dahulu harus mengetahui alur

kerja 8aboratorium akteriologi agar lebih terarah. 2lur kerja 8aboratorium

akteriologi, diantaranya'

") Pembuatan edia

Pembuatan media dilakukan di 8aboratorium edia. 8aboratorium edia

merupakan 8aboratorium yang berada di alai K$P Kelas $ Jakarta $$ anjung

Priok, di dalam lab ini kita dapat melakukan pembuatan media, contohnya

pembuatan media 62 (Tryptone Soy Agar5, 6$2 (Triple Sugar 6ron Agar ),

edia >ji iokimia, !2 ( #rilliant Green Agar ), 46, Aeagen untuk Penguji

>ji iokimia dan lain sebagainya. 8aboratorium edia selain pembuatan media

laboratorium ini melakukan sterilisasi alat, bahan dan hal lain yang menunjang

kebutuhan setiap laboratorium.

+) Pelabelan 4ontoh >ji

6ampel ikan yang akan diuji selanjutnya diberi tanda atau memberi label

pada sampel uji dengan menggunakan nomor uji agar sampel tidak tertukar dan

memudahkan untuk melakukan rekap data.

) 7eropsi

7eropsi dahulu sampel ikan sebelum sampel ikan diperiksa baik parasit,

bakteri, 0ormalin ataupun virus. 7eropsi merupakan proses pemotongan bagian

ikan atau sampel yang akan diperiksa. $kan yang akan diuji melalui laboratorium

bakteri maka ikan harus di bedah terlebih dahulu sampai bagian hati dan ginjalikan terlihat.

1) Pengujian

eknik untuk melakukan pengujian bakteri bisa melalui dua cara, yaitu'

• Konvensional akteri dengan tahapan, sebagai berikut'

o $solat aal

o Pemurnian

o >ji biokimia

o Pembacaan dan identi0ikasi hasil

19


10/67

• iologi olekuler dengan tahapan, sebagai berikut'

o *kstraksi

o 2mpli0ikasio *lektro0oresis

o $nterpretasi hasil

&) Aekaman atau Aekap ;ata

Aekamanan atau rekap data didapatkan dari hasil pengujian baik dengan

menggunakan metode konvensional bakteri ataupun dengan metode biologi

molekuler. Aekaman data dilakukan dengan mencatat hasil pemeriksaan dari dua

metode pengujian ke dalam 'orboo .

3.1.3 Pen&eri#n Viru$

@irus merupakan seperangkat gen di dalam bungkus protein. @irus dapat

hidup dengan cara menempatkan gen-gennya dalam tubuh inang, kemudian

memperbanyak dirinya. /asil penggandaan ini, yang akan mengin0eksi sel-sel

inangnya, sehingga dengan cepat mampu memberi pengaruh buruk bagi sel inang

yang ditempelinya.

Prinsipnya virus tidak dapat dimusnahkan dengan cara pemanasan ataupun

pendinginan, sehingga adan Kesehatan /ean ;unia atau 8ice 6nternational

des 9pi$ooties (O$*) tahun +99: mengeluarkan tujuh nama virus pada udang yang

dikategorikan berbahaya dan harus diaspadai dalam sistem perdagangan

internasional, diantaranya :hite Spot Syndrome 3irus (66@) menyerang ;32

danTaura Syndrome 3irus (6@) menyerang A32.

") Penyakit :hite Spot Syndrome 3irus:hite Spot Syndrome merupakan jenis penyakit yang menyerang udang,

kelompok 1enaeid . eberapa jenis udang 1enaeid yang berpotensi menjadi inang

utama, yaitu 1enaeus monodon dan L. 3annamei, sedangkan udang air taar

( Macrobrachium spp.).

:hite Spot Disease adalah jenis virus ;32 yang dikelompokkan ke dalam

Keluarga 7ima"iridae. :hite Spot Syndrome 3irus (66@) merupakan partikel

bentuk batang (rod ) dengan ukuran 19B""9 nm < "99B199 nm, mengandung "9B

20


11/67

"& polypeptida dan terdapat satu atau lebih nucleocapsid yang tertutup sampul

(en"elope).

6erangan 66@ dapat menyebabkan udang menjadi lemah dan gejala

klinis yang nampak, diantaranya usus kosong, tubuh pucat, karapas mudah

terlepas dan muncul bercak putih dengan diameter 9,&B+,9 mm pada bagian

cephalothorax sampai menyebar keseluruh tubuh. 8uka sering dijadikan indikasi

kerusakan sistemik jaringan ektodermal dan mesodermal, termasuk jaringan

haemopoietic, insang, epitelium subkutikula, epidermis kutikula perut, dan organ

lymphoid . entuk in0eksi dan mor0ologi :hite Spot Syndrome 3irus (66@)

dapat dilihat pada !ambar % a dan b.

'#m(#r /. Ud#n& 0#n& Terin!e"$i SSV, #. Ber2#" %ui %#d# "#r#%#$4

d#n (. In!e"$i +#n5u SSV)1'''."etcare.gr&pics;noda"irosis;lesions.html


12/67

7orthern 1in Shrimp ( 1enaeus duorarum), 7orthern :hite Shrimp ( 1enaeus

setierus), dan Southern :hite Shrimp ( 1enaeus schmitti).

Taura Syndrome adalah virus A32 yang diklasi0ikasikan keluarga

Dicistro"iridae. Partikel virion 6@ sebesar + nm, berbentuk tanpa en"elope

dengan densitas sebesar ".% gEml. !enom yang dimiliki oleh 6@ berbentuk

linier, single stranded A32 () dengan "9,+9& nukleotida. ;aerah serangan virus

6@ antara lain epitelium kutikula (hypodermis), eksoskeleton, saluran

pencernaan, alat pernapasan, jaringan penghubung, jaringan haematopoietic,

organ lymphoid, dan kelenjar antennal. entuk in0eksi dan mor0ologi Taura

Syndrome 3irus (6@) dapat dilihat pada !ambar # a dan b.

'#m(#r 6. Ud#n& 0#n& Terin!e"$i TSV, #. Tu(u (er7#rn# "ei#m#n*

d#n (. E"or "i%#$ (er7#rn# "emer##n-

:'''.disease.'atch=library.enaca.org&2ealth&>ieldGuide&histopage&ts.html

Taura syndrome memiliki tiga 0ase serangan, yaitu akut, transisi, dan

kronis. Kondisi akut atau lesi patognomonik terjadi pada epitelium kutikula,sedangkan pada 0ase transisi dan kronis penyakit tidak tampak lesi patognomonik

dan pendeteksian dilakukan dengan metode molekular dan antibodi. 6erangan

virus 6@ dapat dikenali dengan sejumlah tanda klinis seperti kosongnya perut

hingga terjadinya proli0erasi arna, karapas yang lunak, perubahan arna ekor

udang menjadi merah, kerusakan nekrosis epitel kutikula, serta kematian massal

udang "annamei sebesar 19G hingga lebih dari #9G pada 0ase post(lar"ae,

ju"enile, dan deasa.

22

b.a.


13/67

) Prinsip-Prinsip >mum P4A

1olymerase Chain !eaction (P4A) adalah teknik sintesis dan ampli0ikasi

;32 secara in "itro. eknik ini memungkinkan adanya ampli0ikasi antara dua

region ;32 yang diketahui, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu

memasukkannya ke dalam sel (in "i"o). eknik ini pertama kali dikembangkan

oleh Karry ullis pada tahun "#%&. eknik P4A dapat digunakan untuk

mengampli0ikasi segmen ;32 dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa

jam.

1) Komponen Proses P4A

Komponen-komponen yang diperlukan pada proses P4A adalah ;32

template, sepasang primer , d3Ps ( Deoxynucleotide Triphosphates), buer P4A,

magnesium klorida (g4l+), dan enCim ;32 polimerase. Komponen P4A

dijelaskan lebih lanjut, sebagai berikut'

A. Deoxynucleotide Acid (;32) Template

Deoxynucleotide Acid (;32) template di dalam proses P4A memiliki

0ungsi sebagai cetakan untuk pembentukan molekul ;32 baru yang sama.

Deoxynucleotide Acid (;32) template ini dapat berupa ;32 kromosom, ;32

plasmid ataupun 0ragmen ;32 apapun asal di dalam ;32 template tersebut

mengandung 0ragmen ;32 target yang dituju. Deoxynucleotide Acid (;32)

template untuk proses P4A dapat dilakukan dengan menggunakan metode lisis sel

atau perusakan dinding sel tanpa harus merusak ;32 yang diinginkan. Perusakan

tersebut dilakukan dengan memecahkan dinding sel menggunakan buer lisis.

#. 1rimer

Pada proses P4A, primer ber0ungsi sebagai pembatas 0ragmen ;32 target

yang akan diampli0ikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-O/) pada

ujung D yang diperlukan untuk proses eksistensi ;32. Perancangan primer dapat

dilakukan berdasarkan urutan ;32 yang telah diketahui ataupun dari urutan

protein yang dituju.

4. Deoxynucleotide Triphosphates (d3Ps)

Deoxynucleotide Triphosphates (d3Ps) merupakan campuran yang

terdiri atas d2P ( Deosiadenosin Triosat ), dP ( Deositimidin Triosat ),

23


14/67

d4P ( Deosisitidin Triosat ) dan d!P ( Deosiguanosin Triosat ). Proses P4A

d3Ps bertindak sebagai building bloc ;32 yang diperlukan dalam proses

ekstensi ;32. Deoxynucleotide Triphosphates (d3Ps) akan menempel pada

gugus BO/ pada ujung D dari primer membentuk untai baru yang komplementer

dengan untai ;32 template.

;. #uer P4A

Aeaksi P4A hanya akan berlangsung pada kondisi p/ tertentu. #uer P4A

diperlukan untuk melakukan proses P4A. 5ungsi buer di sini adalah untuk

menjamin p/ medium, selain itu buer P4A diperlukan juga adanya ion g+,

ion tersebut berasal dari berasal g4l+. agnesium klorida (g4l+) bertindak

sebagai ko0aktor yang ber0ungsi menstimulasi aktivitas ;32 polimerase.

agnesium klorida (g4l+) ini akan meningkatkan interaksi primer dengan

template yang membentuk komplek larut dengan d3P (senyaa antara).

*. *nCim ;32 1olimerase

*nCim ;32 polimerase ber0ungsi sebagai katalisator untuk reaksi

polimerisasi ;32. Pada proses P4A enCim ini diperlukan untuk tahap ekstensi

;32. eknik P4A digunakan dengan panjang 0ragmen ;32 yang dapat

diampli0ikasi hingga mencapai & kilo basa. 2mpli0ikasi 0ragmen ;32 pendek

(kurang dari tiga kilo basa) relati0 lebih mudah dilakukan, sedangkan 0ragmen

;32 panjang (lebih besar dari tiga kilo basa) memerlukan beberapa kondisi

khusus, diantaranya adalah diperlukan ;32 polimerase dengan aktivitas yang

kuat dan juga buer P4A dengan p/ dan kapasitas tinggi ( 2igh(salt buer ).

3. Meodo+o&i Ideni!i"#$i d#n Dee"$i P#r#$i, B#"eri, $er# Viru$

%#d# Komodi#$ Peri"#n#n

etodologi selama melakukan identi0ikasi dan deteksi parasit, bakteri

serta virus pada komoditas perikanan di K$P Kelas $, meliputi alat, bahan, dan

prosedur kerja serta dijelaskan lebih rinci pada subbab ini.

3..1 Meodo+o&i P#r#$i

etodologi parasit terdiri dari identi0ikasi parasit pada >ro$en >ish,

identi0ikasi ikan hias air taar ( Li"e Tropical >ish), dan deteksi parasit 1erinsus

olseni pada kerang darah ( Anadara granosa) dijelaskan pada subbab ini.

24


15/67

") $denti0ikasi Parasit pada >ro$en >ish

8angkah-langkah yang dilakukan dalam melakukan identi0ikasi parasit

pada ikan beku ( >ro$en >ish), khususnya ikan sarden (Sardinella sp.) dan ikan

macerel (Scomber japonicas) di K$P Kelas $ Jakarta $$, sebagai berikut'

2. Persiapan 2lat dan ahan $denti0ikasi Parasit pada >ro$en >ish

2lat dan bahan yang digunakan dalam identi0ikasi parasit pada >ro$en ish

disajikan pada abel +.

abel +. 2lat dan ahan $denti0ikasi Parasit pada >ro$en >ish

No. A+# B##n

" 2lat edah 5iksasi atau Pengaetan+ adah 6ampel ahan Pearnaan 7 Pengecetan

ikroskop dan sets glass ahan Clearing 7 Mouting

1 Jarum Pentul

. Prosedur Pelaksanaan

Prosedur identi0ikasi parasit pada ikan beku, diantaranya'

• $kan dineropsi dengan membuat tiga potongan, yaitu '

o 6ampel ikan dipotong mulai dari depan anus ke atas hingga

operkulum.

o 6ampel ikan dipotong secara longitudinal mulai dari depan anus

hingga ke operkulum baah.

o 6ampel ikan dipotong mulai dari akhir potongan kedua hingga akhir

potongan pertama.

• $si perut ikan diambil dan diletakkan di caan petri lalu diamati di baah

mikroskop.

• Organ dalam ikan (ginjal, usus, dan gonad) diamati di baah mikroskop.

Anisais yang ditemukan kemudian dipisahkan dan diletakkan pada

petridisc atau object glass.• Anisais diaetkan pada botol yang berisi larutan alkohol =9G.

+) $denti0ikasi Parasit pada $kan /ias 2ir aar ( Li"e Tropical >ish)

8angkah-langkah dalam melakukan identi0ikasi parasit pada ikan hias air

taar adalah sebagai berikut'

• Jenis ikan diidenti0ikasi kemudian diukur panjang total (Total Length)

ikan.

25


16/67

• $kan dimatikan dengan cara menusuk jarum pada bagian otak atau dibius

dengan alkohol =9G atau menggunakan air es.• agian tubuh ikan yang diperiksa, diantaranya insang, lendir, sirip dan

usus dengan menggunting sedikit dari bagian organ-organ tersebut, kecuali

pemeriksaan pada lendir dengan cara mengerok ikan dari anterior hingga

posterior.

• asing-masing preparat diletakkan pada caan petri kemudian ditetesi

dengan akuades.

• Preparat diamati di baah mikroskop.

) ;eteksi Parasit 1erinsus olseni pada Kerang ;arah ( Anadara granosa)

dengan eknik P4A

8angkah-langkah yang dilakukan dalam pengujian parasit 1erinsus

olseni pada kerang darah ( Anadara granosa), sebagai berikut'

2. Persiapan 2lat dan ahan

2lat dan bahan yang digunakan dalam mendeteksi parasit 1erinsus olseni

pada Kerang ;arah ( Anadara granosa) dengan eknik P4A ( 1olymerase Chain

!eaction). 2lat dan bahan deteksi parasit 1erinsus olseni dapat dilihat pada

abel , sebagai berikut'

abel . 2lat dan ahan ;eteksi Parasit 1erinsus olseni

No. B##n U5i No. A+# U5i

E"$r#"$i

a. *tanol #&G a. otol tempat cairan limbah

b. Lysis buer b. !unting

c. 6ampel kerang +9 mg c. $nkubasi

d. * buer d. ikropipet ukuran "99 Ildan "999 Il

e. isu bersih e. ikrotip ukuran "99 Il

dan "999 Il

0. Microtube ukuran besar

g. 3ampan

h. 1etridisc

i. Pinset

j. Aak mikropipet

k. Aak mirotube

l. !erigerated microcentriuge

m. imbangan digital

26


17/67


n. @orteks

Am%+i!i"#$ia. >irst P4A 1reMix a. Mirotube ukuran +.9 ml˃

b. 7ested P4A 1reMix b. ikropipet ukuran "9 Il

c. P () 6tandar "91 kopi c. ikrotip ukuran "9 Il

d. ;32 Template (66@) d. P4A chamber

e. ?east tA32 (kontrol negati0) e. Spin do'n

0. 6@$yme ;32 1olymerase 0. Aak mikropipet

g. Aak mirotube

Mem(u# Agarose

a. Agarose ",&G a. !elas ukur "99 ml

esar ".& g b. abung erlenmeyer

Kecil 9.=& g c. Oven

b. 2* #uer "

esar "99 ml

Kecil +& ml

E+e"ro!ore$i$

a. 2kuades a. 2lat *lektro0oresis

b. Plasmid ;32 66@ hasil

2mpli0ikasi

b. Kertas para0ilm

c. ;32 Marer %%, :9 bp,

bp

c. Mirotube ukuran +.9 ml˃

d. :@$ Gel Doc (36D8C )

. Prosedur Pelaksanaan

Prosedur pelaksanaan dalam melakukan deteksi parasit 1erinsus olseni

pada kerang darah ( Anadara granosa) dengan teknik P4A ( 1olymerase Chain

!eaction), diantaranya'

a) *kstraksi ;32 Aeagen Promega

8angkah-langkah ekstraksi ;32, diantaranya'

• 4angkang kerang dibuka secara perlahan dengan cara menyisipkan pisau

pada bagian anterior cangkang lalu potong bagian adductor .

•

6ampel dinkubasi pada suhu "99

9

4 selama 9 menit.

27


18/67

• 6ampel ditambahkan Il A32 solution lalu diinkubasi kembali selama 9

menit pada suhu 9

9

4.• 6ampel tersebut ditambahkan +99 Il 1rotein 1recipitation Solution lalu di

vorteks.

• 6ampel di sentriuse pada kecepatan "&.999 < g selama 1 menit.

• 6upernatan :99 Il diambil dari sampel.

• 6upernatan dipindahkan ke dalam mirotube baru ",&ml berisi :99 Il

isopraponol lalu di bolak-balik.

• 6ampel diambil pada bagian insang, kaki, dan mantel.

• 6ampel dimasukkan dalam microtube ",& ml berisi :99 Il larutan

7uclease Lysis Solution.• 6ampel digerus menggunakan pestel atau dihaluskan dengan gunting.

• 6ampel di sentriuse kembali dengan kecepatan "&.999 g selama " menit.

• 6upernatan dibuang dan ditambah :99 Il etanol =9G kemudian di

sentriuse dengan kecepatan "&.999 g selama " menit.

• 6ampel ditambahkan "99 Il ;32 !ehidration Solution dan diinkubasi

pada suhu :& 94 selama " jam.

b) 2mpli0ikasi

8angkah-langkah dalam melakukan ampli0ikasi ;32, diantaranya'

• 8ampu >@ pada P4A chamber dihidupkan selama & menit, selanjutnya

dimatikan lampu >@ dan dinyalakan lampu neon.

• Mirotube 9,+ ml disiapkan sesuai jumlah contoh uji, kemudian diberi

label dan letakkan di atas microplate.

• Aeagen P4A Green Master Mix, primer 1erinsus olseni, 7ucleuse >ree

:ater , #o"ine serum albumin, ;32 template serta kontrol positi0

diletakkan di atas nampan es dalam P4A chamber .

• 4ampuran reagen dibuat ke dalam microtube 9,+ ml dengan komposisi 'o "+,& Il P4A green master mix

o +,& Il 7uclease(ree 'ater

o +,& Il 1rimer or'ard speciic spesies 1erinsus olseni

o +,& Il 1rimer reser"e speciic spesies 1erinsus olseni

o +,& Il #o"ine 6erum 2lbumin Acetylated .

• ;32template parasit atau kontrol positi0 atau kontrol negati0 ditambahkan

sebanyak +,& Il sehingga total volume campuran reagen +& Il

• 8arutan dicampur hingga homogen dengan cara pippetting .

28


19/67

• abung campuran reagen dicampur selama " menit untuk menurunkan

larutan pada dasar microtube.• esin P4A Thermal Cycler dihidupkan, dimasukkan microtube yang

berisi campuran reagen, dan dijalankan dengan program siklus sesuai

abel 1.

abel 1. Proses esin P4A

NO Re#"$i Suu 89:; #"u Si"+u$

" Denaturation aal #& 1 menit "

+ Denaturation #1 " menit 19

Annealing :+ " menit 191 9tension :& menit 19

& >inal elongation :& "9 menit "

c) Pembuatan agar gel untuk elektro0oresis.

8angkah-langkah pembuatan gel agarose untuk elektro0oresis, sebagai

berikut'

• 6isir dari gel agarose yang sudah mengeras diambil sehingga terbentuk

sumur.• 2* buer dituangkan ke dalam tangki elektro0oresis sampai menutupi

permukaan gel .

d) *lektro0oresis

8angkah-langkah dalam melakukan elektro0oresis, sebagai berikut'

• Green 'oring solution sebanyak " Il diambil dan dicampurkan dengan &

Il ;32 marer atau yang telah mengandung #romaphenol blue di atas

plastik para0ilm.

• 6ampel dimasukkan ke sumur atau lubang pertama pada agarose secara

perlahan dan hati-hati.

• 8arutan sybr green sebanyak " Il diambil dan dicampurkan dengan "9 Il

produk hasil ampli0ikasi atau termasuk kontrol di atas para0ilm hingga

homogen. 6etiap campuran di pipet.

• 4ampuran tersebut dimasukkan ke dalam sumur atau lubang kedua pada

agarose secara perlahan dan hati-hati. 2lat elektro0oresis tersebut di tutup

hingga rapat dan mesin atau po'er suplai dihidupkan dengan kekuatan

listrik %9 volt, maksimal +99 m2 selama 9 menit.

29


20/67

• 2lat dimatikan kemudian gel diangkat dari tangki elektro0oresis kemudian

dibilas atau merendam " menit dalam larutan akuades, gel dapat langsungdiletakkan pada alat 36D8C untuk membaca hasil akhir.

• erat molekul ;32 akan terlihat dengan jelas dan berpendar berupa garis

putih atau band . !ambar didokumentasikan dengan kamera Polaroid.

• Pembacaan /asil $nterprestasi, sebagai berikut'

o /asil dinyatakan Positi0 bila terlihat band pada 1&9 bp.

o /asil dinyatakan 3egati0 bila tidak terlihat band .

3.. Meodo+o&i B#"eri

etodologi bakteri terdiri dari alat, bahan, identi0ikasi bakteri (isolasi

bakteri, pemurnian bakteri, uji biokimia), dan uji bakteri dijelaskan pada subbab

ini.

") 2lat dan ahan ;eteksi akteri

2lat dan ahan termasuk yang digunakan dalam melakukan isolasi aal

bakteri, pemurnian bakteri, uji biokimia dan identi0ikasi bakteri dapat dilihat

dalam abel &.

abel &. 2lat dan ahan ;eteksi akteri

Jeni$ U5i A+# B##n

") $solasi aal bakteri • #iosaety Cabinet

• 8ampu unsen

• Jarum Ose

• $nkubator

• Tryptone Soy Agar (62)

• #rilliant Green Agar (!2)

• 46

• 2lkohol =9 G

+) Pemurnian bakteri • #iosaety Cabinet • 8ampu unsen

• Jarum Ose

• $nkubator

• Tryptone Soy Agar (62)• 6$2

• 2lkohol =9G

) >ji biokimia

2. >ji gram

• 8ampu unsen

• 8bject Glass dan

Co"er Glass

• Jarum Ose

• ikroskop

• KO/ G

• !ram Stain

• 2lkohol =9G

• A4uadest

• $solasi murni pada media

30


21/67

Jeni$ U5i A+# B##n

62

. >ji oksidase • 8ampu bunsen

• Jarum ose atau

tusuk gigi steril

• 4aan petri

kosong

• Aeagen Oksidase

• Kertas 6aring

• $solat akteri urni

4. >ji katalase • 8ampu bunsen

• Jarum ose atau

tusuk gigi steril

• Kaca objek

• /+O+ G

• 2lkohol =9G

• $solat bakteri murni

• isu

;. U5i Triple

Sugar Iron

Agar 8TSIA;

• 8ampu bunsen

• Jarum ose

• $nkubator ($K2 =)

• edia 6$2


*. U5i

Fermen#$i

K#r(oidr#

8U5i 'u+#;

• 8ampu bunsen

• Jarum ose

lancip

• #iosaety

Cabinet

• !ula yang biasa digunakan

di K$P kelas " Jakarta +

yaitu '

2donitol

2rabinosa

;ulcitol

!alaktosa !lukosa

!lyserol

8aktosa

$nositol

$nulin

annitol

anosa

altosa

Ahamnosa

6ukrosa 6orbitol

rehalose

;-


22/67

Jeni$ U5i A+# B##n

• KO/ 19G

!. >ji hidrolisa

gelatin

• 8ampu bunsen

• Jarum ose

• #iosaety Cabinet

• $nkubator

• Ae0rigrator 194

• edia gelatin dalam tabung


/. U5i Motility • #iosaety Cabinet

• 8ampu unsen

• Jarum ose

• $nkubator

• KO/ G

• 2lkohol =9G


• edia $O ( Motility, 6ndol

7 8rnithin) dalam tabung

reaksi

$. U5i Indol • #iosaety Cabinet

• 8ampu unsen

• Jarum ose

• $nkubator

• 2lkohol =9G


• edia $O ( Motility, 6ndol


reaksi

• Aeagen kovaks

J. U5i Ornithin • #iosaety Cabinet

• 8ampu unsen• Jarum ose

• $nkubator

• 2lkohol =9G

• $solat bakteri murni• edia $O ( Motility, 6ndol


reaksi

• Aeagen kovaks

K. U5i O"$id#i!

d#n

Fermen#i!

• 8ampu bunsen

• Jarum ose lancip

• $nkubator


• edia OE5 tanpa para0in

(media Oksidati0)

• edia OE5 dengan para0in

(media 0ermentati0)


8. U5i Lysin Iron

Agar 8LIA;


• 8ampu unsen

• Jarum ose

• $nkubator

• 2lkohol =9G


• edia 8$2

. U5i Ureanase • 8ampu bunsen

• Jarum ose


• $nkubator

• edia urea


3. U5i Citrate • 8ampu bunsen

• Jarum ose

• edia Citrate agar


32


23/67

Jeni$ U5i A+# B##n


• $nkubator

O. ueler

/inton(/)

• 8ampu bunsen

• Jarum ose


• $nkubator

• edia ueler /inton (/)


• 2ntibiotik *3A E 3@

P. 62 1G • 8ampu bunsen

• Jarum ose


• $nkubator

• edia ueler /inton (/)


1) $denti0ikasi bakteri • 2lat tulis• Kertas untuk

mencatat hasil uji

• 6umber untuk

bahan acuan

• 6emua hasil uji biokimia

+) $denti0ikasi akteri pada Komoditas Perikanan di K$P Kelas $

8angkah-langkah yang dilakukan dalam melakukan identi0ikasi bakteri

pada komoditas perikanan di K$P Kelas $ Jakarta $$ secara berurutan, yaituisolasi aal bakteri, pemurnian bakteri, uji biokimia dan identi0ikasi bakteri,

sebagai berikut'

2. $solasi 2al akteri

$solasi aal bakteri bertujuan untuk mengetahui pertumbuhan bakteri pada

media umum (62, !2, dan 46).

. Pemurnian akteri

Pemurnian bakteri bertujuan untuk memperoleh biakan murni dari suatu

jenis bakteri tunggal.

4. >ji iokimia>ji biokimia bertujuan untuk mengetahui jenis bakteri dengan cara

mengetahui si0at dari bakteri yang diuji dengan berbagai pengujian contoh

uji gram, uji oksidase, uji katalase, uji Triple Sugar 6ron Agar (6$2), uji

0ermentasi karbohidrat (uji gula), uji Methyl !ed dan 3oges 1rosauer

(A@P), uji hidrolisa gelatin, uji motility, uji indol, uji ornithin, uji

oksidati0 dan 0ermentati0, uji Lysin 6ron Agar (8$2), uji ureanase, uji

citrate, ueler /inton, uji 62 1G.

33


24/67

a) >ji !ram, bertujuan untuk menentukan bakteri isolasi murni termasuk

gram positi0 atau gram negati0 dengan menggunakan pengecatan gram

strain dan tanpa menggunakan pengecatan, tetapi menggunakan larutan

KO/ G.

b) >ji Oksidase, bertujuan untuk mengetahui ada atau tidaknya enCim

oksidase pada bakteri.

c) >ji Katalase, bertujuan untuk mengetahui bakteri tersebut menghasilkan

enCim katalase atau tidak.

d) >ji Triple Sugar 6ron Agar (6$2), bertujuan untuk menentukan

kemampuan bakteri men0ermentasi karbohidrat tertentu yang tergabung

dalam medium basal, dengan atau tanpa membentuk gas, serta produksi

hydrogen sulide (/+6).

e) >ji 5ermentasi Karbohidrat (>ji !ula), bertujuan untuk mengetahui

kemampuan bakteri dalam mengurai karbohidrat (gula) menghasilkan

asam dan gas.

0) >ji Methyl !ed dan 3oges 1rosauer (A@P), bertujuan untuk'

• >ji A ( Methyl !ed ) digunakan untuk mengetahui kemampuan bakteri

dalam mem0ermentasikan glukosa dalam menghasilkan asam.

• >ji @P (3oges 1rosauer ) digunakan untuk mendeterminasi bakteri yang

mampu menghasilkan ecethyl carbinol (acetion) dari 0ermentasi glukosa.

g) >ji /idrolisa !elatin, bertujuan untuk mengetahui ada atau tidaknya

enCim gelatinase pada suatu bakteri.

h) >ji Motility, bertujuan untuk mengetahui bakteri tersebut motil (bergerak)

atau non motil (tidak bergerak).

i) >ji $ndol, bertujuan untuk mengetahui bakteri tersebut memecah indol

atau tidak dari molekul tryptophan dengan terbentuknya cincin berarna

merah. j) >ji 8rnithin, bertujuan untuk mengetahui kemampuan enCimatik bakteri

untuk mengkarboksilase ornithin menjadi bentuk amine (basa)

k) >ji Oksidati0 dan 5ermentati0, bertujuan untuk mengetahui kemampuan

bakteri menghasilkan asam dari karbohidrat apakah secara oksidati0 atau

0ermentati0.

l) >ji Lysin 6ron Agar (8$2), bertujuan untuk mengetahui kemampuan

bakteri memproduksi lysin

34


25/67

m) >ji >reanase, bertujuan untuk mengetahui suatu bakteri tersebut

menghasilkan en$yme ureanase atau tidak.

n) >ji Citrate, bertujuan untuk mendeterminasi kemampuan bakteri

menggunakan asam citrate sebagai sumber karbon (4) untuk

metabolismenya.

o) ueler /inton, bertujuan untuk mengetahui resistensi atau sensitivitas

bakteri terhadap antibiotik (*3A atau 3@).

p) >ji 62 1G, bertujuan untuk mengetahui bakteri tersebut tumbuh atau

tidak pada media 62 1 G.

;. $denti0ikasi akteri bertujuan untuk menentukan jenis bakteri dari hasil uji

biokimia, dengan membandingkan karakteristik bakteri hasil uji dengan

sumber yang sudah ada.

) >ji akteri pada Komoditas Perikanan

>ji bakteri pada komoditas perikanan yang telah dilakukan selama Praktik

Kerja 8apang di K$P Kelas " Jakarta $$ yang dilakukan selama " bulan dengan

1 tahap dan dilakukan selama 1 hari, yaitu'

2. $solasi 2al akteri

$solasi aal bakteri yang dilakukan pada hari ke " dengan tujuan untuk

mengetahui pertumbuhan bakteri pada media umum (62, !2, dan 46).

$solasi aal bakteri dilakukan dengan cara'

• Permukaan #iosaety Cabinet dibersihkan dengan alkohol =9G

• 2pi unsen dinyalakan dan ose dipanaskan

• usuk organ target (kuit, ginjal atau hati) atau bila sampel berbentuk

daging digerus menggunakan penumbuk secara aseptik lalu media 62,

!2 dan 46 digores dengan menggunakan jarum ose. edia 62,

!2 dan 46 dapat dilihat pada !ambar "9 (a, b, dan c).

• iakan bakteri diinkubasi pada suhu = 94 selama +1 sampai 1% jam

dalam inkubator.

35

a. b.


26/67

'#m(#r 19. Medi# Umum Tum(u B#"eri #. TSA, (. B'A, d#n 2. T:BS

. Pemurnian akteri

Pemurnian bakteri dilakukan pada hari ke-+ bertujuan untuk memperoleh

biakan murni dari suatu jenis bakteri tunggal, sehingga hanya satu jenis bakteri

yang tumbuh pada media. Pemurnian bakteri dilakukan dengan cara'

• Permukaan #iosaety Cabinet dibersihkan dengan alkohol =9G.

• 2pi bunsen dinyalakan dan ose dipanaskan.

• Koloni yang terpisah dan dominan atau terbanyak diambil dengan

anggapan baha bakteri yang tumbuh dominan adalah sebagai penyebab

timbulnya penyakit, dan selanjutnya diisolasi ke media 62 dan 6$2.

edia 62 dan 6$2 dapat dilihat pada !ambar "".

• iakan bakteri diinkubasi pada suhu +% 94 selama "+B1% jam dalam

incubator.

'#m(#r 11. B#"eri 0#n& Tum(u %#d# Medi# TSA d#n Medi# TSIA

4. >ji biokimia akteri

>ji iokimia akteri dilakukan pada hari ke- dengan tujuan menguji

bakteri agar diketahui jenis bakteri menggunakan berbagai jenis uji, yaitu uji

gram, uji oksidase, uji katalase, uji Triple Sugar 6ron Agar (6$2), uji 0ermentasi

36

c.


27/67

karbohidrat (uji gula), uji Methyl !ed dan 3oges 1rosauer (A@P), uji hidrolisa

gelatin, uji motility, uji indol , uji ornithin, uji oksidati0 dan 0ermentati0, uji Lysin

6ron Agar (8$2), uji ureanase, uji citrate, ueler /inton dan >ji 62 1 G. edia

yang digunakan untuk uji biokimia dapat dilihat pada !ambar "+ a dan b.

#.

(.

'#m(#r 1. Medi# 0#n& Di&un#"#n unu" U5i Bio"imi# #. T#(un& d#n

(. :#7#n Peri

a) >ji !ram

Prosedur kerja uji gram, sebagai berikut'

• >ji dengan KO/ G, yaitu'

o Permukaan #iosaety Cabinet dibersihkan dengan alkohol =9G.

o 2pi bunsen dinyalakan dan ose dipanaskan.

o KO/ G sebanyak " tetes diteteskan di atas object glass.

37


28/67

o Ose yang sudah dimurnikan, lalu dioleskan dalam larutan KO/ G

dan dihomogenkan dengan menggunakan ose secara perlahan-lahanselama " menit, angkat ose perlahan-lahan untuk mengamati

perlendiran.

• >ji dengan menggunakan gram stain, yaitu'

o Permukaan #iosaety Cabinet dan object glass dibersihkan dengan

alkohol =9G, kemudian api bunsen dinyalakan dan ose dipanaskan.

o 2kuades steril diteteskan di atas object glass dan angina-anginkan

object glass hingga kering.

o Koloni bakteri yang sudah dimurnikan diambil secara aseptik dan

disuspensikan pada obje glass dan diangin-anginkan object glass

hingga kering.

o 8bject glass ditetesi dengan pearna gram 2 (kristal violet) hingga

menutupi suspensi bakteri dan dibiarkan selama " menit, lalu dibilas

dengan air mengalir dan diangin-anginkan hingga kering.

o 8bject glass ditetesi dengan pearna gram (lugol iodine) hingga

menutupi suspensi dan dibiarkan selama " menit, lalu dibilas dengan

air mengalir dan diangin-anginkan hingga kering.o 8bject glass ditetesi dengan gram 4 (larutan etanol ' acetone) hingga

menutupi suspensi dan dibiarkan selama 9 detik, lalu dibilas dengan

air mengalir dan diangin-anginkan hingga kering.

o 8bject glass ditetesi gram ; (sa0ranin) hingga menutupi suspensi dan

dibiarkan selama " menit, lalu dibilas dengan air mengalir dan diangin-

anginkan hingga kering.

o Koloni bakteri diamati bentuk dan arna di baah mikroskop pada

pembesaran 19B"99.

b) >ji Oksidase

Prosedur kerja uji oksidase, sebagai berikut'

• Kertas saring ditetesi dengan larutan Tetra methyl p(phenylene diamine

dihidrochloride.

• $solat bakteri murni diambil dengan jarum ose steril atau tusuk gigi

steril dan dioleskan pada kertas saring.

c) >ji Katalase

Prosedur kerja uji katalase, sebagai berikut'

38


29/67

• Kaca objek dibersihkan dengan menggunakan tisu yang telah dibasahi

dengan alkohol =9G.• $solat bakteri murni diambil secara aseptik dengan jarum ose steril atau

tusuk gigi steril dan letakan pada kaca objek.

• larutan /+O+ G diteteskan.

d) >ji Triple Sugar 6ron Agar (6$2)

Prosedur kerja uji Triple Sugar 6ron Agar (6$2), sebagai berikut'

• edia 6$2 disiapkan dari rerigrator , dan diamkan sampai suhu

kamar.

• $solat bakteri murni diambil dengan jarum ose steril dan

diinokulasikan ke dalam media 6$2 dengan cara tusukan dan

goresan.

• edia 6$2 diinkubasi ke dalam inkubator suhu += 94B= 94 sesuai

dengan bakteri yang diinginkan selama +1 jam.

e) >ji 5ermentasi Karbohidrat (>ji !ula)

Prosedur kerja uji 0ermentasi karbohidrat (uji gula), sebagai berikut'

• edia gula disiapkan dari re0rigrator, diamkan sampai suhu kamar.

• $solat bakteri murni diambil dengan jarum ose steril, kemudian

diinokulasikan ke dalam media gula dengan cara tusukan.

• edia gula diinkubasi ke dalam inkubator suhu += 94B= 94 sesuai

dengan bakteri yang diinginkan selama +1 jam.

0) >ji Methyl !ed dan 3oges 1rosauer (A@P)

Prosedur kerja uji Methyl !ed dan 3oges 1rosauer (A@P), sebagai

berikut'



• edia A@P disiapkan dari dalam rerigerator , diamkan sampai suhu

kamar.

• edia A@P diambil secara aseptis isolat bakteri murni dengan jarum

ose steril dan diinokulasikan ke dalam media A@P cair.

• edia A@P dinkubasi ke dalam inkubator suhu += 94B =94 sesuai

bakteri yang diinginkan selama +1 jam.

• edia A@P yang telah diinkubasi +1B1% jam media dibagi + tabung

untuk uji A dan satu lagi untuk uji @P.

o >ji A, yaitu reagen A diteteskan pada biak bakteri.

o >ji @P, yaitu '

39


30/67

iak bakteri ditambahkan ke dalam tabung, dan ditambah L

naphtol sebanyak separuh bagian biak cair (kocok). KO/ 19G ditambahkan sebanyak separuh reagen L naphtol .

iak bakteri dalam tabung dikocok sampai homogen selama

"9B"& menit.

g) >ji hidrolisa gelatin

Prosedur kerja uji hidrolisa gelatin, sebagai berikut'



• edia gelatin disiapkan dari dalam rerigerator , diamkan sampai suhu

kamar.

• $solat bakteri murni diambil dengan jarum ose steril, kemudian

diinokulasikan ke dalam media gelatin.

• edia gelatin diinkubasi ke dalam inkubator suhu += 94B= 94 sesuai


• edia gelatin yang sudah ditanam bakteri selama +1 jam atau lebih,

dimasukan ke dalam lemari es atau temperatur 1 94 selama "9 menit.

h) >ji Motility, 6ndol dan 8rnithin ($O)

Prosedur kerja uji Motility, 6ndol dan 8rnithin ($O), sebagai berikut'

•

Permukaan #iosaety Cabinet dibersihkan dengan alkohol =9G.• 2pi bunsen dinyalakan dan ose dipanaskan.

• edia $O disiapkan dari dalam rerigerator , diamkan sampai suhu

kamar.

• $solat bakteri murni diambil secara aseptis dengan jarum ose steril dan

diinokulasikan ke dalam media $O dengan cara ditusukan tegak lurus

ditengah media.

• edia $O diinkubasi ke dalam inkubator suhu += 94B= 94 sesuai


i) >ji Oksidati0 dan 5ermentati0

Prosedur kerja uji oksidati0 dan 0ermentati0, sebagai berikut'



• 6ebanyak + media OE5 yang berisi para0in dan tanpa para0in disiapkan

dari dalam rerigerator , diamkan sampai suhu kamar.

• $solat bakteri murni diambil secara aseptis dengan jarum ose steril dan

ditusukkan isolat bakteri murni ke dalam media OE5 tanpa para0in

dengan cara tegak lurus kemudian pada OE5 berisi para0in, dengan

40


31/67

tabung dimiringkan dan biakan ditusukan biakan tanpa mengenai

para0in, tabung ditegakan kembali.

• edia OE5 diinkubasi ke dalam inkubator suhu += 94B= 94 sesuai


j) >ji Lysin 6ron 2gar (8$2)

Prosedur kerja uji Lysin 6ron 2gar (8$2), sebagai berikut'


• 2pi unsen dinyalakan dan ose dipanaskan.

• edia 8$2 disiapkan dari dalam re0rigerator, diamkan sampai suhu

kamar.

• $solat bakteri murni diambil dengan jarum ose steril dan

diinokulasikan ke dalam media 8$2 dengan cara digoreskan dan

ditusukan tegak lurus di tengah media.

• edia 8$2 diinkubasi ke dalam inkubator suhu += 94B= 94 sesuai


k) >ji >reanase

Prosedur kerja uji ureanase, sebagai berikut'



•

edia urea disiapkan dari rerigerator , diamkan sampai suhu kamar.• $solat bakteri murni diambil dengan jarum ose steril dan inokulasikan

ke dalam media urea.

• edia urea diinkubasi ke dalam inkubator suhu += 94B= 94 sesuai


l) >ji Citrate

Prosedur kerja uji citrate, sebagai berikut'



• edia citrate agar disiapkan dari dalam rerigerator , diamkan sampai

suhu kamar.

• $solat bakteri murni diambil dengan jarum ose steril dan inokulasikan

ke dalam media citrate agar.

• edia citrate agar diinkubasi ke dalam inkubator suhu += 94B= 94

sesuai bakteri yang diinginkan selama +1 jam.

m) ueler /inton

Prosedur kerja ueler /inton, sebagai berikut'


•2pi bunsen dinyalakan dan ose dipanaskan.

41


32/67

• media / agar disiapkan dari dalam rerigerator dan diamkan sampai

suhu kamar.• $solat bakteri murni diambil dengan jarum ose steril, kemudian

diinokulasikan ke dalam media /.

• 2ntibiotik (*3A atau 3@) ditanam di tengah goresan bakteri.

• edia / diinkubasi ke dalam inkubator suhu +=94B=94 sesuai


n) 62 1G

Prosedur kerja 62 1 G, sebagai berikut'


• 2pi unsen dinyalakan dan ose dipanaskan.

• edia 62 1G disiapkan agar dari dalam re0rigerator dan diamkan

sampai suhu kamar.

• $solat bakteri murni diambil dengan jarum ose steril dan inokulasikan

ke dalam media 62 1G.

• edia 62 1G diinkubasi ke dalam inkubator suhu +=94B=94 sesuai


;. $denti0ikasi akteri

$denti0ikasi bakteri yang dilakukan padah hari ke-1 bertujuan untuk menentukan jenis bakteri dari hasil uji biokimia dengan membandingkan

karakteristik bakteri dengan sumber yang sudah ada, berikut merupakan contoh

karakteristik bakteri Aeromonas salmonicida, dapat dilihat pada abel :.

abel :. Karakteristik akteri Aeromonas salmonicida (Jean and . 5addin "##1)

K#r#"eri$i" Aeromonas salmonicida

8Ber&e0 1664;

Aeromonas salmonicida

8M#2 F#ddin 16/9;

UJI UTAMA

!ram -, batang -, batang

Oksidase

Katalase

otility - -

O5 5 5

'+u"o$#, acid @ ()

!lukosa, gas @ ()

6$2 KE2 KE2, /+6 (@)

$ndole - -

Ornithin decarbo


33/67

K#r#"eri$i" Aeromonas salmonicida

8Ber&e0 1664;

Aeromonas salmonicida

8M#2 F#ddin 16/9;

UJI LANJUTAN

8ysine decarboreanase - -

Phenilalanine - 3A

3a4l

"G:G

2rginin @

Kanamycin aesculin

!lycerol @

3itrate reduction

8-2rabinosa @()

2donitol - -

4ellobiose -

;ulcitol - -

!alaktosa @()yo-$nositol - -

8aktosa - -

altose

;-mannitol @()

annose

elibiose

6alicin @ @

8-Ahamnosa -

Aa00inose - -

;-6orbitol - -

6ucrosa - @()rehalosa

;-ylose -

O3P! @

!2 PinkEKuning

ac conkey Kuning Kuning

a) >ji !ram

• Prosedur kerja uji gram dengan KO/ G, sebagai berikut'

43


34/67

o 6ampel bakteri diamati, apabila timbul lendir berati bakteri tersebut

adalah gram negati0 (-), sedangkan jika tidak timbul lendir maka bakteri tersebut adalah gram positi0 ().

• Prosedur kerja uji gram dengan menggunakan gram stain, sebagai berikut'

o 6ampel bakteri diamati, apabila koloni berarna ungu berati gram

positi0, dan apabila koloni berarna merah berarti gram negati0.

b) >ji Oksidase

6ampel bakteri diamati, apabila terjadi perubahan menjadi biru berarti

oksidase positi0 (), tetapi apabila tidak ada perubahan berarti oksidase

negati0 (-).

c) >ji Katalase

6ampel bakteri diamati, apabila terjadi gelembung udara (busa), berarti

bakteri katalase positi0 (), tetapi apabila tidak ada gelembung udara

(busa) berarti katalase negati0.

d) >ji Triple Sugar 6ron 2gar (6$2)

6ampel bakteri diamati, apabila perubahan arna pada slant (miring) dan

tusukan (tegak). /asil Triple Sugar 6ron 2gar (6$2), sebagai berikut'

• 6ampel bakteri berarna merah berarti alkali (K) dan jika kuning

berarti acid (2).

• 6ampel bakteri menghasilkan gas bersimbol (!).

• 6ampel bakteri diamati ada arna hitam pada media, berarti

pembentukan /+6 (/+6 positi0).

• Acid butt (kuning), acid slant (kuning), gas (), /+6 (-) M 2E2, !.

• 2b (kuning), acid slant (kuning), gas (-), /+6 (-) M 2E2.

• 2b (kuning), acid slant (kuning), gas (var), /+6 () M 2E2, !(v) /+6.

• 2b (kuning), alkalin slant (erah), gas (), /+6 () M KE2, !, /+6.• 2b (kuning), alkalin slant (erah), gas (var), /+6 (-) M KE2, !(v).

• Alaline butt (merah), alkalin slant (erah), gas (-), /+6 (-) M KEK.

e) >ji 5ermentasi Karbohidrat (>ji !ula)

2mati perubahan arna, sebagai berikut'

• 6ampel bakteri diamati berubah menjadi kuning ().

• 6ampel bakteri diamati tetap berarna merah (-).

0) >ji Methyl !ed dan 3oges 1rosauer (A@P)

Pengamatanuji Methyl !ed dan 3oges 1rosauer (A@P), sebagai berikut'

44


35/67

• >ji A, yaitu sampel bakteri diamati perubahan arnanya, apabila

berubah menjadi merah, berarti A () tetapi apabila tidak berubah arnaatau tetap kuning, berarti A (-).

• >ji @P, yaitu 6ampel bakteri diamati perubahan arna yang terjadi,

apabila setelah "9B"& menit menjadi berarna merah berarti @P () tetapi

apabila tidak berubah arna merah atau tetap kuning berarti (-).

g) >ji /idrolisa !elatin

6ampel bakteri diamati, apabila media tetap cair berarti gelatin positi0 (),

tetapi apabila media menjadi beku berarti gelatin negati0 (-).

h) >ji Motility

6ampel bakteri diamati, apabila perubahan yang terjadi pada daerah bekas

tusukan bakteri, apabila terjadi penyebaran pertumbuhan di luar garis

tusukan, media menjadi keruh dan permukaan media banyak bakteri

(terlihat berarna putih) maka bakteri dinyatakan motil () tetapi apabila

hanya tumbuh pada garis tusukan maka bakteri dinyatakan non motil (-).

i) >ji $ndol

6ampel bakteri diamati, apabila perubahan yang terjadi, apabila kultur ditetesi reagen indol (kovaks) melalui pinggir tabung (jangan dikocok) dan

terbentuk cincin merah atau lapisan merah, berarti indol positi0 (), tetapi

apabila tidak terbentuk cincin merah atau lapisan merah, berarti indol

negati0 (-).

j) >ji 8rnithin

arna tetap ungu, berarti ornithin positi0 (), tetapi apabila media berubah

menjadi arna kuning berarti ornithin negati0 (-).

k) >ji Oksidati0 dan 5ermentati0

6ampel bakteri diamati perubahan arna yang terjadi pada kedua tabung

tersebut'

• akteri bersi0at 0ermentati0 (5) jika kedua media berubah arna menjadi

kuning.

• akteri bersi0at oksidati0 (O) jika perubahan arna menjadi kuning hanya

pada media tanpa para0in cair.

45


36/67

• akteri bersi0at 3on Aeakti0 (3A) jika tidak terjadi perubahan arna pada

kedua tabung OE5 (tetap berarnna hijau).l) >ji Lysin 6ron2gar (8$2)

6ampel bakteri diamati perubahan arna yang terjadi pada media, pada

slant (miring) dan tusukan atau butt (tegak), apabila tidak terjadi

perubahan arna (berarna ungu) berarti lysine dekarboksilase positi0 ()

karena bersi0at alkali (K), tetapi apabila terjadi perubahan arna

(berarna kuning) berarti lysine dekarboksilase negati0 (-), karena bersi0at

acid (2) jika menghasilkan gas, beri simbol (!).

m) >ji >reanase

6ampel bakteri diamati perubahan arna yang terjadi, dinyatakan urease

positi0 () jika arna media berubah menjadi arna merah, jika media

tidak berubah arna berarti urease negati0 (-).

n) >ji Citrate

6ampel bakteri diamati perubahan arna yang terjadi, dinyatakan citrate

positi0 () jika arna media berubah menjadi arna biru, jika media tidak

berubah arna (tetap hijau) berarti urease negati0 (-).

o) ueler /inton (/)

6ampel bakteri diamati pada media /, apabila bakteri menjauh dari

antibiotik berarti bakteri tersebut sensiti0 terhadap antibiotik (6), namun

apabila bakteri tersebut merapat terhadap antibiotik berarti bakteri tersebut

resisten terhadap antibiotik (A).

3..3 Meodo+o&i Viru$

etodologi virus dibedakan menjadi dua bagian, berdasarkan jenis virus,

contohnya :hite Spot Syndrome 3irus (66@) dan Taura Syndrome 3irus (6@).

6ubbab metodologi virus dijelaskan bahan dan alat, prosedur, dan metode yang

digunakan (52O +99"), sebagai berikut'

") ahan dan 2lat >ji ;eteksi Penyakit 66@ pada >dang

ahan dan alat yang digunakan dalam proses ekstraksi, ampli0ikasi dan

elektro0oresis dapat dilihat pada abel = ($N +999 66@ +99:).

46


37/67

abel =. ahan dan 2lat >ji ;eteksi Penyakit 66@ pada >dang


E"$r#"$i

a. *tanol #&G a. otol tempat cairan limbah

b. Lysis buer b. !unting

c. 6ampel udang +9 mg c. $nkubasi

d. * buer d. ikropipet ukuran "99 Il

dan "999 Il

e. isu bersih e. ikrotip ukuran "99 Il

dan "999 Il

0. Microtube ukuran besar

g. 3ampanh. 1etridisc

i. Pinset

j. Aak mikropipet

k. Aak microtube

l. !erigerated microcentriuge

m. imbangan digital

n. @orteks

Am%+i!i"#$i

a. >irst P4A 1reMix a. Microtube ukuran +.9 ml˃

b. 7ested P4A 1reMix b. ikropipet ukuran "9 Il

c. P () 6tandar "91 kopi c. ikrotip ukuran "9 Ild. ;32 Template (66@) d. P4A chamber

e. ?east tA32 (kontrol negati0) e. Spin do'n

0. 6@$yme ;32 1olymerase 0. Aak mikropipet

g. Aak microtube

embuat Agarose




b. 2* #uer "

esar "99 ml

Kecil +& ml

E+e"ro!ore$i$


b. Plasmid ;32 66@ hasil

2mpli0ikasi

b. Kertas para0ilm

c. ;32 Marer %%, :9 bp,

bp

c. Microtube ukuran +.9 ml˃

d. :


38/67


h. Aak mikropipet

i. Aak microtube j. oples

k. >@$ Gel Doc (36D8C )

+) Prosedur ;eteksi Penyakit 66@

Prosedur-prosedur deteksi penyakit :hite Spot Syndrome 3irus (66@),

sebagai berikut'

2. Pra-P4A

Pra-P4A merupakan tahapan aal yang sangat penting, agar terhindar dari

kontaminasi virus lain dan organ target yang didapat tepat. Prosedur kerja Pra-

P4A dapat dilihat pada !ambar " a dan b.

'#m(#r 13. Pr#dang atau contoh uji diletakkan pada nampan bedah, dan organ target

(pleopod, periopod, atau insang) diambil menggunakan gunting dan pinset

steril, serta ditimbang sebanyak +9 mg. Jumlah contoh uji 66@ dapat

dilihat pada abel %.

d. Organ target (contoh uji) yang tidak langsung diproses, dapat disimpan ke

dalam larutan alkohol #&G dan dimasukkan ke kulkas.

48


39/67

abel %. Jumlah 4ontoh >ji 66@

:ono U5i Jum+# ##u Ber# :ono U5i

Plasmid ;32 66@ + kopi

angkai mata induk udang " tangkai

P8 "+ +&B&9 ekor

P8 "+B9 >dang tanpa hepatopancreas atau kepala

Pleopod dan periopod + potongan

Otot +9 mg

*ndapan kolam atau tambak +99 mg

2ir kolam atau tambak

$nsang

" ml

+9 g

. *kstraksi ;32 @irus dengan Lysis #uer

*kstraksi ini bertujuan untuk mengisolasi ;32 66@ dari jaringan udang

atau contoh uji. Prosedur kerja ekstraksi ;32 virus (dapat dilihat pada !ambar

+&), sebagai berikut'

a. Potongan contoh uji dimasukkan ke microtube steril ukuran + ml atau ".&

ml, ditambahkan &99 Hl lysis buer , dan contoh uji dipotong dengan

gunting, hingga halus.

b. $nkubasi pada suhu #&9

4 dilakukan selama "9 menit, kemudiandisentri0ugasi pada "+999 gravitasi atau "+999 rc0 selama "9 menit.

c. 6upernatan sebanyak +99 Hl diambil dan dipindahkan ke dalam microtube

steril baru ukuran + ml, dan ditambahkan alkohol #& G atau sebanyak 199

Hl.

d. @orteks dilakukan secara cepat, kemudian disentri0ugasi pada "+999 g atau

"+999 rc0 selama & menit, microtube ditelungkupkan pada tisu bersih

untuk dibuang cairan alkohol dan dikeringkan pellet.

e. Pelet dilarutkan dengan T9 buer sesuai dengan ketentuan, dapat dilihat

pada !ambar "1 (a, b, c, d, dan e) dan abel #.

49


40/67

'#m(#r 14. Pro$e$ E"$r#"$i #. Mi"ro%i%e, (. Men&#+u$"#n, 2. In"u(#$i

d. Vore"$ d#n e. Senri!u$i

abel #. @olume Pelarut ;32

No

.

:ono U5i Vo+ume TE u!!er

". angkai mata induk udang "99 Hl

+. P8 +99 Hl

. $nsang otot &9 Hl1. Pleopod atau Periopod +99 Hl

&. *ndapan kolam atau tambak +9 Hl

:. 2ir kolam atau tambak "9 liter

0. /asil ekstraksi (;32 template) diperlukan untuk aktu penyimpanan

yang lama (sekitar " tahun), dapat disimpan pada suhu B+9 94.

4. 2mpli0ikasi

Proses memperbanyak ;32 target virus atau ampli0ikasi sangat

diperlukan keahlian pipeting, yaitu proses menggunakan mikropipet dan mikrotip

50


41/67

ukuran kecil ("9 Hl) terutama saat mencampur beberapa reagen dan membagi ke

dalam masing-masing microtube ukuran kecil (9.+ ml) agar didapat hasil yang

tepat takarannya, dapat dilihat pada !ambar "& a dan b.

'#m(#r 1). Pro$e$ Am%+i!i"#$i #. :#m%ur#n re#&en di(u# d#+#m P:R

Chamer d#n (. Me$in P:R Thermal Cycler

a. Prosedur kerja >irst P4A pada proses ampli0ikasi, sebagai berikut'• 8ampu >@ dihidupkan, pada P4A chamber selama & menit,

selanjutnya lampu >@ dimatikan, dan lampu neon dinyalahkan.

• Microtube 9.+ ml disiapkan sesuai jumlah contoh uji, tutup ditandai

dengan spidol. Aeagen >irst P4A, ;32 template dan microtube

diletakkan pada miroplate beku di dalam P4A chamber .

• Kontrol positi0 disiapkan dengan pengenceran "9 - dan kontrol negati0

yang digunakan adalah larutan dd/+9.

•

4ampuran reagen >irst P4A 1remix dibuat per satu contoh uji yang juga untuk kontrol positi0 dengan komposisi, sebagai berikut'

o >irst P4A 1remix ' =.& Hl

o 6@$yme ;32 1olymerase + >E Hl ' 9.& Hl

o ;32 template virus atau kontrol positi0 ' + Hl

otal volume campuran reagen >irst P4A 1reMix ' "9 Hl

• @orteks dilakukan secara cepat dandilakukan spin do'n pada

campuran reagen serta kontrol positi0 selama " menit untuk

menurunkan larutan.

51


42/67

• esin P4A (Thermal cycler ) dihidupkan, dengan program siklus suhu

sebagai berikut'o #1 94 9 detikF :+ 94 9 detikF =+ 94 9 detik, diulang & siklus,

o #1 94 "& detikF :+ 94 "& detikF =+ 94 +9 detik, diulang "& siklus,

o =+ 94 9 detikF +9 94 9 detikF dan 1 94 , diakhir siklus.

• 2lat ampli0ikasi dihidupkan dengan cara menekan tombol ( >ile(9nter(

Load(9nter(Pilih 1rograms 66@ "-Start(9xit(9xit .

b. Prosedur kerja 7asted P4A pada proses ampli0ikasi, sebagai berikut'

• 4ampuran reagen dibuat dengan komposisi per contoh uji atau

microtube, sebagai berikut'

o 7ested P4A Peri< ' "1 Hl

o 6@$yme ;32 1olymerase + >E Hl ' " Hl

otal campuran reagen ' "& Hl

• 4ampuran tersebut dimasukkan ke satu microtube contoh uji

sebelumnya yang telah melalui >irst P4A (termasuk kontrol positi0).

• @orteks dilakukan secara cepat dandilakukan spin do'n pada

campuran reagen serta kontrol positi0 selama " menit untuk

menurunkan larutan.• esinThermal cycler disiapkan dengan program siklus suhu, sebagai

berikut'

o #1 94 +9 detikF :+ 94 +9 detikF =+ 94 9 detik, diulang +& siklus,

o =+ 94 9 detikF +9 94 9 detik,

o 1 94 , diakhir siklus.

• 2lat ampli0ikasi dihidupkan dengan cara menekan tombol ( >ile(9nter(

Load(9nter -Pilih 1rograms 66@ +-Start(9xit(9xit .

;. ;eteksi Produk P4A

Prosedur kerja membuat agar gel sebagai media untuk melakukan proses

elektro0oresis, dengan cara dapat dilihat pada !ambar ": (a, b, dan c), sebagai

berikut'

52


43/67

'#m(#r 1*. Pro$e$ Pem(u##n Ar #. Ar diim(#n&, (. A+# e"ro!ore$i$

dir#"i, d#n 2. :#m%ur#n diomo&en"#n d#+#m o=en

a. Agarose ".& G (Ev) ditimbang, dimasukkan ke tabung erlenmeyer,

ditambahkan buer Tris Acid *;2 (" < 2*), kemudian dipanaskan

menggunakan oven sampai larut dan mendidih.

b. 8arutan agarose didinginkan pada suhu ruang sampai suhunya mencapai

&9 94,.

c. Gel tersebut dituang pada cetakkan agar yang sudah terpasang di dalam

alat elektro0oresis, biarkan mengeras.d. 2* buer " < dituang sampai menutupi permukaan gel .

*. *lektro0oresis

*lektro0oresis adalah teknik pemisahan molekul (biomolekul) ber muatan,

apabila berada di dalam media yang diberi arus atau medan listrik. Prosedur kerja

elektro0oresis (dapat dilihat pada !ambar "=), sebagai berikut'

#. Pengenceran larutan SybrBgreen stain dibuat dari stok " ' "99, stok

disimpan pada suhu B+9

9

4. 8arutan SybrBgreen " Hl diambil dandicampuran dengan & Hl ;32 marer (yang telah mengandung

#romophenol blue) di atas plastik para0ilm atau dicampurkan " Hl larutan

SybrBgreen dengan + Hl ;32 marer dan Hl loading dye (yang tidak

mengandung #romophenol blue) di atas plastik para0ilm, dan masukkan ke

lubang pertama pada agarose secara perlahan dan hati-hati.

53

http://id.wikipedia.org/wiki/Molekulhttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Muatan&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Muatan&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Molekulhttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Muatan&action=edit&redlink=1


44/67

'#m(#r 1-. Pro$e$ Pen&&un##n A+# E+e"ro!ore$i$ #. Lu(#n& Sumur d#n

(. UVI"OC

b. 8arutan 6ybrQgreen " Hl diambil, lalu dicampurkan dengan : Hl hasil

ampli0ikasi, dan dicampurkan dengan Hl loading dye solution di atas

para0ilm hingga homogen. 4ampuran dimasukkan dengan pipet tersebut

ke dalam lubang ke dua agarose dan seterusnya, secara perlahan dan hati-

hati. 2lat elektro0oresis ditutup hingga rapat dan mesin atau po'er suplai

dihidupkan dengan kekuatan listrik #9 @, &99 2 selama 9 menit, hingga

dyne berarna biru gelap mendekati "E+ hingga "E dari panjang gel

agarose.

c. 2lat dimatikan dan gel dipindahkan ke dalam adah berisi larutan

akuades, cuci sebentar, gel dapat langsung di0oto menggunakan alat

36D8C .

d. erat molekul ;32 virus target akan terlihat dengan jelas dan berpendar

berupa garis putih atau band . !ambar didokumentasikan dengan kamera

polaroid.

e. Keterangan tambahan untuk menghidari kontaminasi, buer gel

elektro0oresis yang telah dipakai, tidak boleh dipakai kembali, kecuali

beberapa gel akan dielektro0oresis pada hari yang sama, setelah selesai

elektro0oresis dan dicuci kotak gel dengan banyak air.

5. 2nalisis /asil

2nalisis hasil sampel uji 66@ dari masing-masing eksperimen

memerlukan kontrol positi0 dan kontrol negati0, jika standard positi0 "9 + tidak

menghasilkan band pada +#: bp, berarti reaksi P4A telah gagal. Kontrol negati0

54


45/67

muncul band pada + G bp berarti terjadi kontaminasi (dapat dilihat pada !ambar

"%), sebagai berikut'

'#m(#r 1/. #$i+ SSV %#d# %#d# Produ" #ro$en Shrimp

Keterangan'

" ' 4ontoh uji Positi0 berat 66@

+ ' 4ontoh uji Positi0 sedang 66@

' 4ontoh uji Positi0 ringan 66@

1 ' 4ontoh uji Positi0 lebih ringan 66@

& ' 4ontoh uji 66@ 3egati0

: ' Kontrol 3egati0E dd/+O

= ' Positi0 6tandar ", +999 kopiEreaksi

% ' Positi0 6tandar +, +99 kopiEreaksi

# ' Positi0 6tandar , +9 kopiEreaksi

' marer , %1% bp, :9 bp, bp

/asil uji positi0 apabila terbentuk band pada + G bp dan atau &&9 bp,

sedangkan hasil uji negati0 apabila terbentuk band hanya pada %1% bp. #and tidak

muncul pada agar, menunjukkan kualitas ;32 buruk.

) ahan dan 2lat >ji ;eteksi Penyakit 6@ pada >dang

ahan dan alat yang digunakan dalam proses ekstraksi, ampli0ikasi dan

elektro0oresis deteksi penyakit 6@ dapat dilihat pada abel "9.

abel "9. ahan dan 2lat >ji ;eteksi Penyakit 6@ pada >dang


E"$r#"$i

a. Chloroorm a. otol tempat cairan limbah

b. *tanol =&G b. !unting

c. $sopropanol c. ikropipet ukuran "99 Il

55

1 2 3 4 5 6 7

550bp333296


46/67


dan "999 Il

d. A32 extraction ($N +999) d. ikrotip ukuran "99 Ildan "999 Il

e. A32 later e. Microtube ukuran besar

0. 6ampel udang +9 mg 0. 3ampan

g. isu bersih g. 1etridisc

h. Pinset

i. Aak mikropipet

j. Aak microtube

k. !erigerated microcentriuge

l. imbangan digital

m. @orteks

Am%+i!i"#$i

a. 2@ !e"ere Transriptase

(Promega)

a. Microtube ukuran +.9 ml˃

b. Kontrol () b. ikropipet ukuran "9 Il

c. Kontrol (-) c. ikrotip ukuran "9 Il

d. 7uclease ree 'ater

(Promega)

d. P4A chamber

e. 1rimer >or'ard (###+5) e. Spin do'n

0. !i"erse (#"#&A) 0. Aak mikropipet

g. A32 Access@uic A P4A

(Promega)

g. Aak microtube

h. ;32 template 6@

Agarose




b. 2* #uer "

esar "99 ml

Kecil +& ml

E+e"ro!ore$i$


b. Plasmid ;32 6@ hasil2mpli0ikasi

b. Kertas para0ilm

c. ;32 Marer "99 bp c. Microtube ukuran +.9 ml˃

d. :@$ Gel Doc (36D8C )

56


47/67

1) Prosedur ;eteksi Penyakit 6@

Prosedur-prosedur deteksi penyakit Taura Syndrome 3irus (6@), sebagai

berikut'

2. Persiapan 2lat

Persiapan alat dimulai dari sterilisasi peralatan yang akan digunakan,

contohnya peralatan gelas, gunting, pastel, microtube dan mirotip pada suhu

"+"o4 selama "9B"& menit, kemudian meja serta nampan bedah dibersihkan

dengan alkohol =9G.

. Persiapan 4ontoh >ji

Prosedur persiapan contoh uji, sebagai berikut'

a. >dang atau contoh uji diletakkan pada nampan bedah, dan diambil organ

target (urodpod, periopod, hemolimp, hepatopankreas, atau insang)

menggunakan gunting dan pinset steril, dan ditimbang sebanyak +9 mg,

dapat dilihat pada abel "".

b. Organ target atau contoh uji yang tidak langsung diproses, dapat disimpan

ke dalam larutan A32 later dan disimpan dalam kulkas.

abel "". Jumlah 4ontoh >ji 6@

:ono U5i Jum+# ##u Ber# :ono U5i

Plasmid ;32 6@ + kopi

P8 "+ "9 ekor

P8 "+B+9 & ekor

$nsang udang deasa +- potong

$nsang induk udang R bagian

$nsang P8+9-udang ukuran & g &9 mg

/epatopankreasEhemolimp +9 g

4. *kstraksi A32 virus dengan A32 9ctraction

*kstraksi ini bertujuan untuk mengisolasi A32 6@ dari jaringan udang

atau contoh uji. Prosedur kerja ekstraksi A32 virus, sebagai berikut'

a. Potongan contoh uji dimasukkan ke microtube steril + ml atau ".& ml, &99

Hl A32 ectraction ditambahkan ke dalam microtube, potongan-potongan

contoh uji digunting hingga halus, dan dibiarkan dalam suhu ruang selama

& menit.

57


48/67

b. Chloroorm "99 Hl ditambahkan dan divorteks selama +9 detik, kemudian

dibiarkan dalam suhu ruang selama menit, selanjutnya disetri0ugasi pada

"+999 g atau "+999 rc0 selama "& menit.

c. 6upernatan +99 Hl diambil dan dipindahkan ke dalam microtube steril

ukuran + ml, yang telah diisi isopropanol +99 Hl.

d. @orteks cepat, kemudian sentri0ugasi pada "+999 g atau "+999 rc0 selama

"9 menit, hati-hati buang cairan isopropanol.

e. Pelet dicuci dengan &99 Hl ethanol =& G, sentri0ugasi pada =&99 g atau

=&99 rc0 selama & menit, cairan etanol dibuang dan pelet dikeringkan.

0. Pelet dilarutkan dengan menambahkan A32 later sesuai dengan

ketentuan, dapat dilihat pada abel "+.g. /asil ekstraksi atau template digunakan untuk jangka aktu penyimpanan

yang lama (sekitar " tahun), dapat disimpan pada suhu B+9 94.

abel "+. @olume Pelarut A32

No :ono U5i Vo+ume RNA later

". P8 &99 Hl

+. $nsang +99 Hl

. /emolimp atau /epatopankreas "99 Hl

;. 2mpli0ikasi

Prosedur kerja ampli0ikasi, sebagai berikut'

a. 8ampu >@ pada P4A chamber dihidupkan selama & menit, selanjutnya

lampu >@ dimatikan, dan lampu neon dinyalahkan.

b. Microtube 9.+ ml sesuai jumlah contoh uji disiapkan (tutup ditandai

spidol) dan diletakkan di atas miroplate dingin di dalam P4A chamber .

c. Aeagen disiapkan untuk proses ampli0ikasi, reagen serta template

diletakkan pada nampan es.

d. 4ampuran reagen dibuat per satu contoh uji atau di dalam microtube, juga

untuk kontrol positi0, sebagai berikut'

o Acess @uic ' "+.& Hl

o 1rimer ###+5 (+9 p mol) ' + Hl

o 1rimer #"#&A (+9 p mol) ' + Hl

o ;32 template virus atau kontrol positi0 ' + Hl

o 2mv A ' " Hl

o 7ucleus ree 'ater ' &.& Hl

otal volume campuran reagen ' +& Hl

58


49/67

e. 6entri0ugasi dilakukan pada campuran reagen dan kontrol positi0 selama "

menit untuk menurunkan larutan pada dasar microtube.

0. Microtube diletakkan pada permukaan 1late Thermal Cycler , menutup,

dan menjalankan mesin dengan menekan tombol start dengan program

siklus suhu, sebagai berikut'

o :9 94 9 menit, #1 94 + menit, selama " siklus.

o #1 94 1& menit, :9 94 1& menit, diulang sebanyak 19 siklus.

o :9 94 = menit, dan 1 94.

*. ;eteksi Produk P4A

Prosedur kerja deteksi produk P4A 6@ (Taura Syndrome 3irus) sama

saja dengan prosedur kerja deteksi produk P4A 66@ dari pembuatan agarose

sampai elektro0oresis.

5. 2nalisis /asil

2nalisis hasil sampel uji 6@, berarti hasil positi0 apabila terbentuk band

hanya pada +" bp, sedangkan hasil uji negati0 apabila tidak terbentuk band atau

band muncul tidak sejajar +" bp, dapat dilihat pada !ambar "#.

'#m(#r 16. #$i+ TSV %#d# Produ" #ro$en Shrimp

Keterangan'

' ;32 Marer "99 bp

" ' Positi0 6tandar

+ ' 4ontoh uji Positi0 ringan 6@

' 4ontoh uji Positi0 ringan 6@

1 ' 4ontoh uji Positi0 ringan 6@

& ' 4ontoh uji Positi0 kuat 6@

: ' Kontrol 3egati0 atau dd/+O

3.3 #$i+ Ideni!i"#$i d#n Dee"$i P#r#$i, B#"eri $er# Viru$ %#d#

Komodi#$ Peri"#n#n

59

M 1 3 4 )

500231


50/67

/asil dari kegiatan identi0ikasi dan deteksi parasit, bakteri dan virus pada

komoditas perikanan di K$P Kelas " Jakarta $$, dijelaskan lebih rinci pada

subbab ini.

3.3.1 #$i+ "e&i##n di L#(or#orium P#r#$i

") /asil $denti0ikasi Parasit Pada >ro$en ish dan $kan /ias 2ir aar

Kegiatan Praktik Kerja 8apang, didapatkan hasil baha semua ikan jenis

>ro$en Macarel di dalam saluran pencernaannya, ditemukan parasit Anisais

(dapat dilihat pada !ambar +9), sedangkan ikan >ro$en 6arden tidak ditemukan.

'#m(#r 9. #. Penm##n Anisais sp. #. L#n&$un& d#n (. Mi"ro$"o%

Keberadaan Anisais sp. dalam tubuh ikan dipengaruhi oleh beberapa

0aktor, diantaranya adalah umur, panjang ikan dan letak geogra0is. 6erangan

parasit lebih sering terjadi pada ikan-ikan deasa karena mengakumulasi lebih

bayak parasit, sedangkan distribusi Anisais sp. dalam tubuh ikan adalah di mulut,

lambung, usus, hati, rongga tubuh, gonad dan ginjal serta beberapa ditemukan di

otot. Anisais sp. biasanya ditemukan pada organ pencernaan lambung dan usus.

4acing endoparasit dalam saluran pencernaan karena dalam saluran pencernaan

terdapat bahan organik yang merupakan sumber makanan dari parasite, dapat

dilihat pada abel ".

Anisais sp. merupakan endoparasit yang bersi0at $oonosis (penyakit pada

ikan dapat ditularkan ke manusia) dan menyebabkan penyakit 2nisakiasis. Kasus

2nisakiasis di $ndonesia pernah dilaporkan di 6idoarjo Jaa imur pada tahun

60

b.a.


51/67

"##:. $n0eksi Anisais sp. dapat berdampak terhadap kesehatan manusia dan

menyebabkan beberapa gejala seperti nyeri perut, mual, muntah, reaksi alergi dan

gingivostomatiti. Oleh karena itu, penelitian mengenai cacing Anisais sp. perlu

dikembangkan.

8arva Anisais sp. banyak ditemukan di organ "isceral dan musculature

dari ikan. ;esrina dan Kusumastuti ("##:) juga menyatakan baha saluran

pencernaan ikan merupakan organ yang paling banyak diserang oleh cacing

Anisais sp. >sus halus menyediakan sumber nutirisi bagi nematoda antara lain

darah, sel jaringan, cairan tubuh dan sari-sari makanan yang terkandung dalam

lumen usus halus. 6truktur dan 0isiologis usus (mikrohabitat parasit) yang dapat

mempengaruhi keberadaan dan jumlah parasit. ikrohabitat parasit merupakan

lingkungan atau tempat yang mendukung kehidupan parasit.8ingkungan atau

tempat tinggal tersebut meliputi ketersediaan makanan, oksigen dan 0aktor

lainnya, termasuk di dalamnya kompetisi antar spesies. $kan yang lebih besar

mempunyai ketersediaan makanan yang lebih banyak dibandingkan dengan ikan

yang lebih kecil, sehingga kemungkinan parasit untuk berpindah ke inang lain

kecil atau bahkan tidak ada karena berkurangnya kompetisi antar spesies parasit

dalam lingkungan mikrohabitatnya yang mengakibatkan jumlah parasit Anisais

sp. pada ikan yang lebih besar akan meningkat selama masa hidupnya.

abel ". ;ata /asil Pemeriksaan Parasit pada erbagai Jenis $kan anggal +1

Juni B +" Juli +9"1 di K$P Kelas $ Jakarta $$

T#n&+ No. S#m%e+ Jeni$ I"#n Pemeri"$##n

P#r#$i

Orn T#r&e Kondi$i

S#m%e+

+1-:-+9"1 9#=%E9+#& >ro$en 6ardine Anisais sp. usus >ro$en

9#=#E9+=1 >ro$en Pasi0icackarel

Anisais sp. usus >ro$en

9#%9E9+#% >ro$en 6ardine Anisais sp. usus >ro$en

>ro$en 6ardine Anisais sp. usus >ro$en

9#%"E9+## >ro$en 6ardine Anisais sp. usus >ro$en



Documents

Isi Bab III Pkl Fixed 2