INŻYNIERIA GENETYCZNA• narzędzia i techniki:

enzymy restrykcyjne, wektory, transformacja, PCR, klonowanie

• transgeniczne rośliny i zwierzęta

• znakowanie GMO

Prowadzący wykład: dr Artur Dzialuk

INŻYNIERIA GENETYCZNA

Zespół technik umożliwiających:

• izolowanie,

• identyfikację,

• charakterystykę

• i przenoszenie gengenóóww między genomami

• oraz wprowadzanie do nich zmian.

INŻYNIERIA GENETYCZNA• silnie związana z genetyką molekularną,

która koncentruje się na celach poznawczych

• stosuje ten sam warsztat i metody

• silny związek z praktyką – przemysłem, medycyną, farmacją

• jej praktyczne wykorzystanie doprowadziło do rozwoju przemysłu biotechnologicznego

PODSTAWOWE TECHNIKI

PCRKlonowanie DNA

KLONOWANIE DNA

wektor fragment DNA

zrekombinowanywektor

bakteria

transport do komórek gospodarza

bakteria nios ąca zrekombinowanywektor

powielanie zrekombinowa-nego wektora

podziałkomórek gospoda-rza

liczne podziały komórkowe

kolonie bakteryjne

System / układ restrykcji i modyfikacji

mechanizm obronny w komórce bakteryjnej zakażonej bakteriofagami (wirusami bakteryjnymi)

System restrykcji i modyfikacji EcoRI

endonukleazy restrykcyjne = enzymy restrykcyjne =

restryktazy

EcoRI

EcoRI

• wysoka specyficznośćsubstratowa

• hydrolizują wiązania fosfodiestrowe w DNA

Tępe i lepkie końce

TĘPE KOŃCE LEPKIE KOŃCE

LIGACJA DNA

nietrwałe parowanie zasad między lepkimi końcami

dwa wiązania syntetyzowane przez ligazę DNA

LIGAZA DNA

Trawienie enzymem EcoRI

źródło: DNA Learning Center, www.dnalc.org

Nazewnictwo

Trójliterowe skróty:1. Od rodzaju bakterii

lub sinic2 i 3. od gatunku

Następna wielka litera oznacza szczep lub typ

Liczby rzymskie to numer enzymy z danego szczepu lub typu

ENZYMY RESTRYKCYJNE

• znanych ponad tysiąc enzymów restrykcyjnych

• firmy biotechnologiczne oferują w sprzedaży ponad sto

Wykorzystanie enzymWykorzystanie enzymóów w restrykcyjnychrestrykcyjnych

1.1. Technika Technika rekombinowaniarekombinowania i klonowania DNAi klonowania DNA2.2. sporzsporząądzania fizycznych map genomdzania fizycznych map genomóów,w,3.3. izolacji i identyfikacji genizolacji i identyfikacji genóów,w,4.4. sekwencjonowaniasekwencjonowania DNA,DNA,5.5. porporóównywania DNA z rwnywania DNA z róóżżnych organizmnych organizmóów,w,6.6. diagnostyki chordiagnostyki choróób genetycznych,b genetycznych,7.7. diagnostyki niektdiagnostyki niektóórych typrych typóów chorw choróób b

nowotworowych,nowotworowych,8.8. diagnostyki chordiagnostyki choróób infekcyjnych,b infekcyjnych,9.9. w transplantologii do ustalania zgodnow transplantologii do ustalania zgodnośści tkankowej,ci tkankowej,10.10. w medycynie sw medycynie sąądowej do ustalania pokrewiedowej do ustalania pokrewieńństwa.stwa.

WEKTORY

WEKTOR

DNA DO SKLONOWANIA

GENLIGAZA DNA

GEN

ZREKOMBINOWANA CZĄSTECZKA DNA

• plazmidy

• bakteriofagi

• kosmidy

• sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC)

• sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC)

Matura 2010 PR

F

P

P ?

F

F

P

P ?

F

m.in.

PRAWDA:

większość genów oporności na antybiotyki kodowanych jest na plazmidach

???:

Lekooporność nie jest jedynym przykładem fenotypów zależnych od obecności plazmidów

BUDOWA PLAZMIDU

• ori – miejsce startu replikacji

• promotor – miejsce inicjacji transkrypcji

• MCS (multiple cloningsite) = miejsce wielokrotnego klonowania, polilinker

• gen markerowy – np. oporności na antybiotyk lub białka fluorescencyjnego GFP

Gen kodujący GFP (Green Fluorescent Protein)

Białko fluoryzujące w zakresie barwy zielonej.

Białko to jest izolowane z meduz morskich.

Najwyższe wzbudzenie luminescencji GFP występuje przy λ=395 nm(bliski ultrafiolet) lub λ=475 nm (światło widzialne), emisja światła następuje przy λ=508 nm(barwa zielona).

źródło: DNA Learning Center, www.dnalc.org

Matura 2010 PR

popośśredniredniąą obserwacjobserwacjęę czasu i miejsca powstawania czasu i miejsca powstawania „„pewnego pewnego

biabiałłkaka””

kiedy (czas) i gdzie (miejsce) kiedy (czas) i gdzie (miejsce)

pojawia sipojawia sięę nowotwnowotwóór ?r ?

powyżejponiżej

jednostka transkrypcyjna

sekwencja kodująca

promotor

GFP

TRANSFORMACJA

źródło: DNA Learning Center,

www.dnalc.org

wektorchromosom gospodarza

EKSPRESJA TRANSGENU

białko plazmid

natychmiast po transformacji

po inkubacji 1h w 37ºC

PCRCykl:Cykl:1.1. denaturacjadenaturacja2.2. przyprzyłąłączanie czanie

starterstarteróóww3.3. wydwydłłuużżanieanie

Matura 2011 PR

kryminalistyka – identyfikacja sprawców przestępstw na podstawie

analizy DNA ze śladów biologicznych

identyfikacja ofiar katastrof i zbrodni wojennych

Osiągnięcia w zakresie transgenizacji

Matura 2007 PR

Transgeniczne rośliny

Komórki roślinne sątotipotentne, czyli mająnieograniczoną zdolnośćdo dzielenia się oraz odtwarzania poszczególnych organów i całego organizmu.

TotipotencjaTotipotencja

Metody wprowadzania „obcego DNA”do genomu roślin

1. Metody z wykorzystaniem wektora:• bakterie z rodzaju Rhizobium• wirusy roślinne np. wirus mozaiki kalafiora (CaMV)

2. Metody bez wykorzystania wektora.

Agroinfekcja = agrotransformacja

Wykorzystuje się bakterie z rodzaju Rhizobium: Agrobacterium tumefaciens i Agrobacteriumrhizogenes, które posiadają naturalną zdolnośćdo wprowadzania swojego DNA do roślin.

Agroinfekcja

Agroinfekcjapoważne ograniczenie

- można ją stosowaćwyłącznie do roślin dwuliściennych, ponieważ tylko one ulegają zarażeniu przez Agrobacterium.

Rośliny jednoliścienne, do których należązboża, nie mogąbyć transformowanetym sposobem.

Metody bezwektorowe

Fizyczne

• Elektroporacja

• Mikrowstrzeliwanie

• Mikroiniekcja

Chemiczne

• PEG

• Fuzja liposomów

Elektroporacjaseria impulsów elektrycznych, które naruszają strukturę błony, powodując powstanie w niej porów, przez które DNA może przeniknąć do wnętrza komórki

Mikrowstrzeliwanie(metoda biolistyczna)

Mikroskopijne kulki złota lub wolframu zostają opłaszczone DNA a następnie wstrzeliwane do komórek roślinnych za pomocą „armatki genowej”

Matura 2010 PR

Po co tworzy sięrośliny transgeniczne?

1. nauka2. praktyka

Ekspresja białka GFP w komórkach korzenia transgenicznego rzodkiewnika

Rośliny GM w nauce

• modele w poznawaniu funkcji genów

• głównie rośliny modelowe np. rzodkiewnik (Arabidopsisthaliana), tytoń (Nicotianatabacum) – ich genom dobrze poznany i łatwo je transformować

• Uzyskujemy informacje uniwersalne – umożliwiająpoznanie i zrozumienie świata żywego

Transgeniczny tytońzawierający gen lucyferazy pochodzący ze świetlika.

Pomidor Flavr Savr

Pomidor Flavr Savr

• pierwsza komercyjnie zmodyfikowana genetycznie roślina uprawna i jadalna, dopuszczona do spożycia przez ludzi

• wprowadzona do sprzedaży w USA w 1994, pozostał na rynku zaledwie przez kilka lat, zanim wstrzymano jego produkcję.

Strategia antysensowna

• wprowadzono antysensowny gen, którego produkt interferował i powstrzymywał produkcję enzymu – poligalakturonazy.

• poligalakturonaza jest enzymem odpowiedzialnnym za rozkład ściany komórkowej (a zatem mięknięcie tkanki), podczas dojrzewania, starzenia i w końcu psucia się owocu.

Przyczyny niepowodzeń

• wysokie koszty produkcji i spedycji

• zmodyfikowano genetycznie nie najlepszą odmianę

• niskie plony - 25-50% w porównaniu do upraw tradycyjnych

• jedynie połowa owoców była wystarczająco duża i dojrzała, by być sprzedawana jako "McGregors" – docelowy produkt o wyższej cenie.

• wiele uszkodzeń mechanicznych• konkurencja z właśnie

wprowadzoną tradycyjnąodmianą pomidorów - LSL (ang. long shelf life)

ANI ZAPACH ANI ZAPACH ANI TRWAANI TRWAŁŁOOŚĆŚĆ

DZIKIE

FLAVR SAVR

Złoty ryż (Golden rice)Złoty ryż (Golden rice)

Skala niedoboru witaminy A

• Problem dotyczy 250 mln ludzi, w tym 100 – 140 mlndzieci

• Rocznie ślepnie 250 – 500 tys., w ciągu roku umiera połowa z nich

Złoty ryż 1 - 1.6 1.6 µµgg karotenoidów na gram suchej wagi

Złoty ryż 2 – 37 37 µµgg karotenoidów na gram suchej wagi. (23 x więcej niż ZR1)

Odporność na herbicydy• Zmodyfikowane rośliny

posiadają geny, odpowiedzialne za produkcję enzymów, które rozkładają herbicydy, dzięki czemu stają się na nie odporne.

• Wprowadzenie do rośliny cechy odporności na działanie herbicydu o działaniu totalnym pozwala na łatwą kontrolęchwastów na polu uprawnym.

GMOnie GMO GMOnie GMO GMOnie GMO

Modyfikacja typu Roundup Ready

• glifosat – aktywny składnik herbicydu Roundup®hamuje działanie syntazy EPSPS - enzymu, który bierze udział w syntezie aminokwasów aromatycznych

• Do roślin GMO wprowadza się gen kodujący enzym syntazę EPSPS niewrażliwą na działanie glifosatu lub gen odpowiedzialny za powstanie enzymu (oksydoreduktazy glifosatu) rozkładającego glifosat

• koncerny biotechnologiczne oferują jednocześnie herbicyd i nasiona genetycznie zmodyfikowane, z cechą odporności.

Nazewnictwo

• geny cry (od crystal protein)

• Białka Cry to toksyny Bt

• Rośliny Bt, np. kukurydza Bt (Bt-maize)

Odporność na szkodniki

Omacnica prosowianka (Ostrinia nubialis)

• Powoduje straty na ponad 40% ogólnej powierzchni zasiewów kukurydzy w Polsce.

• Kolejny szkodnik to zachodnia stonka kukurydziana

Matura 2005 PP

Modyfikacja polega na wprowadzeniu do rośliny genu kodującego białko Cry z

bakterii glebowej Bacillus thuringiensis, co powoduje, że roślina GM staje się

toksyczna dla wybranych szkodników owadzich, ale nie dla ludzi i zwierząt.

Szkodliwe jest jedynie spożycie przez owada części rośliny GM.

Preparaty oparte na bakterii glebowej Bacillus thuringiensis w formie

zarodników stosuje się w uprawach polowych, lasach i miejscach wylęgania się

komarów. Pokrywają one cały teren, gdzie zostały zastosowane. Nawet

przebywanie owadów w środowisku tak skażonym stanowi dla nich zagrożenie.

Odporność na choroby powodowane przez grzyby,

wirusy i bakterie

Papaja odporna na wirusa pierścieniowej plamistości papai

(PRSV)

• PRSV łatwo przenoszony przez mszyce.

• Na Hawajach, gdzie papaja jest podstawowąrośliną uprawną, 80% plantacji to odmiany transgeniczne UH Rainbow z tą odpornością.

dzika transgenicznadzika transgeniczna

Ulepszanie cech jakościowych

Matura 2010 PR

sukces wprowadzenia genu LEAFY do komórek drzew (przykład osiki) wskazuje

na możliwości uzyskania genetycznie zmodyfikowanych odmian drzew owocowych

(np. jabłoń, grusza, śliwa), które będą kwitły znacznie wcześniej a zbiór ich

owoców będzie ułatwiony z uwagi na niski wzrost drzew

Przydatność wysoka bo:

Krzewiące się drzewa to niższe koszty zbiorów owoców

Łatwiejszy dostęp do koron drzew owocowych w celach pielęgnacji

Więcej odgałęzień to wyższy plon, zbiór

Łatwiejsza uprawa

FITOREMEDIACJA

Tolerancja stresów środowiskowych

• wysoka temperatura,

• zasolenie,

• zalewanie,

• susza,

• stresy oksydacyjne

• i substancje chemiczne

TRANSGENICZNE ROŚLINY W MEDYCYNIE

Dieta prozdrowotna• złoty ryż• zmiany struktury kwasów tłuszczowych w

roślinach oleistych (zdrowsze oleje spożywcze)• odmiany ryżu i orzeszków ziemnych wolnych od

alergenówSzczepionkirośliny GM jako biofabryki wytwarzające

szczepionki wolne od ryzyka przenoszenia ludzkich lub zwierzęcych chorób.

SZCZEPIONKI

87-krotny wzrost od 1996 r. do 2010 r., rok do roku wzrost o ok.9 mln ha, czyli ok.7%

1

23

4

5

6

7

8

91011

12

13

14

15

16

17

UPOWSZECHNIENIE UPRAW GMO

Transgeniczne zwierzęta

METODY TRANSGENIZACJI ZWIERZĄT

Po co tworzy sięzwierzęta transgeniczne?

1. nauka2. praktyka

Zwierzęta GM w nauce

• modele do badań nad rozwojem, zachowaniem, pamięcią

• w medycynie, transgeniczne myszy służą jako modele chorób człowieka, takich jak np. otyłość, karłowatość, przyspieszone starzenie, choroby układu krążenia, cukrzyca, i in. oraz jako obiekty do testowania nowych, obiecujących metod leczenia

• badania funkcji genów

1

2

mRNA kodujące białko sygnałowe determinujące rozwój osi ciała wstrzykiwano w brzuszną częśćblastomeru żaby szponiastej, co spowodowało rozwój drugiej osi ciała

Wykorzystanie techniki transgenezyzwierząt gospodarskich

• Uzyskanie zwierząt o przyspieszonym tempie wzrostu (wzrost produkcji mięsa) przez wprowadzenie do ich genomu genów kodujących np. gen hormonu wzrostu

• Zwiększenie masy mięśni u zwierząt rzeźnychRyby zawieraj ące ssaczy gen hormonu

wzrostuRyby zawieraj ące ssaczy gen hormonu wzrostu

Wykorzystanie techniki transgenezyzwierząt gospodarskich

• Uzyskanie zwierząt o przyspieszonym tempie wzrostu (wzrost produkcji mięsa) przez wprowadzenie do ich genomu genów kodujących np. gen hormonu wzrostu

• Zwiększenie masy mięśni u zwierząt rzeźnych

Podwójnie umięśniona krowa

Poprawa jakoPoprawa jakośści produktuci produktu: np. poprzez obniżenie zawartości cholesterolu w mięsie, mleku i jajach, obniżenie zawartości laktozy w mleku, zmniejszenie zawartości tłuszczu w mięsie i modyfikacje jego składu

Modyfikacje cech biochemicznych• np. poprawy jakości i tempa wzrostu wełny

poprzez wprowadzenie do genomu owiec genów białek keratynowych

• zwiększenie produktywności: np. zwiększenie mleczności krów, nieśności kur niosek

Uzyskanie zwierząt wykazujących tolerancję lub odporność na patogenne wirusy i bakterie

Wykorzystanie techniki transgenezyzwierząt gospodarskich

ZWIERZĘTA JAKO BIOREAKTORY

Wytwarzanie biofarmaceutyków

Roczne światowe zapotrzebowanie na czynnik VIII

(leczenie hemofilii A)

• 354 transgenicznych szczurów

• 217 transgenicznych królików

• 2 transgeniczne świnie

• po jednej transgenicznej kozie, owcy lub krowie

• Humanizacja ekspresji genów człowieka w organizmie zwierzęcym – modyfikacja zmian potranslacyjnych tak, aby uzyskać białko identyczne jak w organizmie człowieka

• ksenotransplantacje genetycznie zmodyfikowane organy zwierzęce nadające sięna przeszczepy u ludzi, zniesienie immunologicznej bariery międzygatunkowej i zapewnienie organów do transplantologii.

Matura 2009 PR

Produkcja leków i szczepionek wolnych od ryzyka przenoszenia chorób ludzkich lub zwierzęcych

„Złoty ryż” może zlikwidować problem niedoboru witaminy A

mniejsze zużycie herbicydów

fitoremediacja

Matura 2006 PP

DNA jest trawiony w przewodzie pokarmowym człowieka.

Czy ktoś obawia się schabowego z kapustą?

Obowiązek znakowania GMO w UE

W przypadku gdy cały produkt jest genetycznie zmodyfikowany oznakowanie powinno być uzupełnione informacją: produkt genetycznie zmodyfikowany.

Jeśli tylko niektóre składniki są genetycznie zmodyfikowane, obok nazwy składnika należy umieścić napis: genetycznie zmodyfikowany.

Napis i informacja powinny być czytelne i zapisane czcionkątej samej wielkości co nazwa składnika lub produktu.

„NIE MODYFIKOWANY GENETYCZNIE”

„MODYFIKOWANY GENETYCZNIE”

JAK ROZUMIEĆ ETYKIETĘ?

1.2 % GM

<0.9%

<0.9%0.6+0.6=1.2%

1.2% > 0.9%

źródło: European Commission, Joint Research Centre

Matura 2007 PP

Dziękuję za uwagę