Introduzione all’analisi cromatografica

La cromatografia è un metodo analitico largamente utilizzato per la separazione,

l’identificazione e la determinazione quantitativa dei componenti di miscele complesse

I metodi cromatografici sfruttano le diverse affinità delle molecole nei confronti di due

fasi diverse: la fase stazionaria e la fase mobile che viene fatta scorrere in modo

continuo sulla fase stazionaria

I componenti della miscela sono trasportati attraverso la fase stazionaria dalla fase

mobile

La separazione dei componenti della miscela dipende dalla loro differente velocità di

migrazione. In particolare le sostanze più affini alla fase stazionaria sono più trattenute

e quindi il loro trascinamento risulta lento. Al contrario sostanze più affini alla fase

mobile sono più facilmente eluite

Fase mobile

Fase stazionaria

Da un punto di vista storico, i primi esperimenti cromatografici furono eseguiti dal botanico

russo M Tswett nel 1906 (separazione di clorofille usando etere di petrolio come fase

eluente e calcio carbonato come fase stazionaria).

Le specie separate apparvero come bande colorate e da qui il nome che scelse per la

tecnica: dal Greco chroma (colore) e graphein (scrivere)

Classificazione dei metodi cromatografici

Un metodo di classificazione dei metodi cromatografici si basa sullo stato della fase

mobile (liquido – gassoso)

cromatografia

Cromatografia liquida(fase mobile liquida)

Gas cromatografia(fase mobile gassosa)

• liquido – liquido• liquido - solida

• gas – liquido• gas - solida

Sulla base dello stato della fase stazionaria si ha una ulteriore suddivisione

Le tecniche cromatografiche vengono inoltre classificate in base al meccanismo principale

di separazione che interviene: 1) adsorbimento, 2) ripartizione, 3) scambio ionico, 4)

esclusione, 5) affinità

1. Adsorbimento: la fase stazionaria è un solido in granuli e la fase mobile può essere un

gas o un liquido. La fase stazionaria è in genere un composto inorganico o un polimero

organico. Sulla superficie dei granuli si trovano dei siti attivi che possono stabilire legami

deboli (interazioni dipolo-dipolo, legami idrogeno, interazione idrofobiche) con le molecole

della miscela

Fase stazionaria (solido)

Fase mobile

Possibili interazioni di composti organici con allumina

2. Ripartizione: la fase stazionaria è un liquido (supportato da un solido granulare inerte)

in cui le sostanze da separare si solubilizzano. La fase mobile può essere un gas o un

liquido e comunque deve essere immiscibile con la fase liquida. Durante l’eluizione le

molecole si ripartiscono dinamicamente nelle due fasi (stazionaria e mobile) sulla base

delle caratteristiche chimiche

Fase stazionaria (liquido)

Fase mobile

supporto

Fase stazionaria

3. Scambio ionico:la fase stazionaria è costituita da macromolecole con siti attivi ionizzati

(cationici o anionici) i cui controioni possono essere scambiati con ioni aventi carica dello

stesso segno ed eluiti dalla fase mobile. Durante l’eluizione gli ioni presenti nella fase

mobile vengono separati gli uni dagli altri in base alla diversa affinità di ciascuno per i siti

della fase stazionaria (cromatografia a scambio ionico)

+ + +

- - -Siti attivi

controioni

Fase stazionaria

+ + +

- - -

Fase mobile -

Fase stazionaria

+ + +

- - -

-

Fase stazionaria

+ + +

-

-

--

4. Esclusione: tecnica per la separazione di macromolecole. La fase stazionaria è un

solido poroso o, più comunemente, un gel con i pori di dimensioni variabili. Le molecole

dell’analita di una determinata dimensione molecolare, penetrano nei pori dove

permangono per un certo periodo; le molecole troppo grandi, però, vengono escluse dai

pori e perciò escono dalla colonna in tempi brevi (cromatografia di esclusione)

Tecniche cromatografiche

Cromatografia planare: la fase stazionaria è distribuita su una superficie piana. Le

tecniche principali sono la cromatografia su strato sottile (Thin Layer Chormagraphy, TLC) e

la cromatografia su carta (paper chromatography)

Cromatografia su colonna a bassa pressione : ampiamente utilizzata per separazione di miscele e non per analisi quantitativa

Cromatografia in fase liquida ad elevata prestazione (High Performance Liquid

Chromatography, HPLC): ampiamente utilizzata per l’identificazione e quantizzazione di

molecole. In pratica, la versione strumentale della cromatografia su colonna

1) Fase eluente; 3) sistema di pompaggio; 4) sistema iniezione campione; 5)

colonna cromatografica; 6) detector ; 7) scarico; 8) sistema acquisizione dati

Colonne HPLC

Gascromatografia (Gas Chromatography, GC): Tecnica ampiamente utilizzata per l’identificazione e quantizzazione di molecole volatili.

Colonna GC (capillare)

Il cromatogramma

Le separazioni cromatografiche strumentali (HPLC e GC) si concludono con la

registrazione del cromatogramma, ovvero del tracciato del segnale del rivelatore in

funzione del tempo o del volume di eluente, a partire dall’istante in cui la miscela viene

introdotta nella colonna (t=0)

Il tracciato completo che si ottiene per ciascuna sostanza eluita è detto picco

cromatografico. In condizioni cromatografiche ideali il picco cromatografico ha la forma

di una curva gaussiana. Da un punto di vista matematico una curva gaussiana viene

descritta dal punto di massimo e dalla distanza tra i punti di flesso (tale distanza diviso 2

è la deviazione std. ()

• Altezza del picco: distanza tra il punto

massimo e la tangente alla linea di base

• Larghezza della base del picco (W):

lunghezza del segmento interpolato

all’intersezione fra le tangenti ai flessi della

gaussiana e la linea di base (Wb = 4 )

• Larghezza a metà altezza: larghezza

misurata a metà altezza del picco (WH =

2.354)• Distanza fra i punti di flesso: segmento

interpolato fra i due punti di flesso

(corrsipondente al 60.7% altezza picco) (Wi =

2 )• Area totale sottesa: proporzionale alla

concentrazione

• Il picco cromatografico è inoltre identificato dal tempo di ritenzione (tR): tempo impiegato da

ciascuna sostanza per eluire dalla colonna, misurato a partire dall’istante in cui la miscela

viene introdotta nello strumento, fino all’istante in cui si registra il massimo del picco (in

alternativa si può utilizzare il volume di ritenzione).

• Il tempo morto è il tempo di ritenzione di una sostanza non trattenuta dalla fase stazionaria

• Il volume morto (VM) (detto anche volume della fase mobile) corrisponde al volume della

colonna non occupato dalla fase stazionaria.

• Il tempo di ritenzione corretto: tempo che ogni sostanza impiega per le interazioni con la

fase stazionaria (t’R = tR – tM)

Costante di distribuzione

Costante di distribuzione (Kc) = CS

CM

ove Cs= concentrazione analita nella fase stazionaria e CM = conc nella fase mobile;

Ad ogni istante del processo cromatografico le sostanze si distribuiscono fra le due fasi in modo specifico. Supponiamo che ad un tempo t si raggiunga l’equilibrio:

CM CS

La costante di distribuzione è correlata con il volume di ritenzione dalla seguente

equazione:

VR = VM + KCVS

Ove VS è il volume della fase stazionaria. Il valore KC può quindi essere determinato

sulla base di VR, VM e VS. Dato tuttavia la difficoltà di determinare in modo accurato VS,

si preferisce far riferimento al fattore di ritenzione (k)

Fattore di ritenzione

nS

nM

Fattore di ritenzione o fattore di capacità (k) =

Ove nS è il numero di moli nella fase stazionaria e nM nella fase mobile

CSVS

CMVM

k = Poiché KC= CS/CM

VS

VM

k = KC KC = VM

VS

k

Sostituendo KC nella equazione VR = VM + KCVS avremo: VR = VM + kVM

e quindi VR = VM (1 + k)

se esprimiamo tale equazione in termini di tempi di ritenzione (V= TF) si può

scrivere:

tRFC = tMFC (1+k)

e considerando il flusso costante, L’equazione si semplifica

tR = tM (1+k)

da cui

k= (tR-tM)/tM ovvero:

t’R

tM

k =

Al fine di una buona separazione è necessario che il fattore di ritenzione della sostanza eluita per prima sia maggiore di 1. k non deve inoltre essere superiore a 10-15

Risoluzione di una separazione cromatografica

Una buona risoluzione cromatografica significa una buona separazione tra i due picchi contigui

selettività

efficienza

La qualità di una separazione cromatografica (risoluzione dei picchi) dipende dalla

selettività ed efficienza: la selettività indica la capacità di un sistema cromatografico di

eluire specie chimiche a velocità il più possibili diverse ed è espressa dal

fattore di separazione = t’R2 / t’R1

La selettività non è tuttavia suff. per

una buona risoluzione cromatografica

qualora i picchi sono larghi e tali da

sovrapporsi

L’efficienza indica la capacità di un sistema cromatografico di eluire tutte le particelle di una

specie chimica con la stessa velocità, in modo da formare bande e quindi picchi stretti. Dato

che l’efficienza esprime l’allargamento del picco essa è una espressione di :

Deviazione std. relativa R = /tR, dato che tale valore è solitamente piccolo, per motivi

pratici, si preferisce calcolare N, detto numero dei piatti o numero dei piatti teorici:

Efficienza della colonna N = (tR/ )2 = 16 (tR/ wb)2

Valutazione quantitativa dell’ efficienza di una colonna cromatografica

Altezza equivalente al piatto teorico

H = L / N Ove L è la lunghezza della colonna

(una colonna è tanto più efficiente quanto più H è piccolo)

L’efficienza di una colonna dipende da fattori extra-colonna (non incidono più del 10%) e

da fattori della colonna. Dei diversi modelli utilizzati per spiegare i fattori della colonna,

quello più accreditato è il modello del non-equilibrio di Giddings che individua tre fattori

che partecipano all’allargamento delle bande:

• Percorsi multipli

• diffusione molecolare longitudinale

• distribuzione di flusso

• Trasferimento di massa tra le fasi

Percorsi multipli: dato che la porosità e l’impaccamento della fase stazionaria non sono

perfettamente uniformi, si verificano cammini diversi e non equivalenti dell’analita nella fase

mobile. Questo comporta che le molecole, pur partendo insieme, percorrano distanze

diverse e arrivano al detector a tempi diversi, provocando un allargamento della banda.

Per risolvere tale problema è necessario ottenere una distribuzione granulometrica della

fase stazionaria molto ristretta.

Diffusione di flusso: Il flusso è più veloce al centro che vicino alle particelle

L’allargamento da percorsi multipli e da diffusione di flusso è indipendente dalla

velocità della fase mobile.

Diffusione molecolare longitudinale: Le molecole della sostanza si muovono

spontaneamente in direzione longitudinale, sia nel senso di scorrimento della fase

mobile sia in quello opposto. L’allargamento della banda per effetto della diffusione

molecolare dipende dal tempo di permanenza dell’analita nella fase mobile e dalla

diffusitività del soluto.

Per minimizzare la diffusione molecolare longitudinale si può aumentare il flusso della

fase mobile e agire sulla viscosità dell’eleuente

Trasferimento di massa: All’inizio le molecole di analita più vicine alla fase stazionaria

diffondono dalla fase mobile alla fase stazionaria. La velocità di diffusione dipende dalla

diffusività dell’analita. Le molecole rimaste nella fase mobile si spostano trascinate dalla

corrente dell’eluente e diffondono nella fase stazionaria in un tratto successivo. Tale

processo crea un allargamento della banda. Lo stesso meccanismo di diffusione

asimmetrica si instaura per il procedimento inverso (dalla fase stazionaria alla fase

mobile)

Il trasferimento di massa è un processo che si riduce usando solventi a bassa viscosità

(aumento della diffusività dell’analita) ed aumenta all’aumentare della velocità della fase

mobile.

Fase mobile

Fase stazionaria

Fase mobile

Fase stazionaria

Fase mobile

Fase stazionaria

Variabili che influenzano l’efficienza della colonna: un modello matematico

Andamenti sperimentali tipici della funzione H= f(ū) ove ū = velocità lineare fase mobile (cm/s)Valore minimo di H (max di efficienza) per valori di ū bassi. H è di un unità di grandezza inferiore in a) ma le colonne non più lunghe di 25-50 cm contro 50 m di b) quindi moltopiù efficienti in b).

L’ entità di allargamento di una banda dipende dal tempo in cui fase mobile e fasestazionaria restano in contatto, quindi dipende dalla velocità del flusso. Di conseguenzatutti gli studi di efficienza determinano H in funzione della velocità della fase mobile.

L’equazione di Van Deemter

La funzione H= f(ū) può essere descritta da una equazione del tipo:

y = a+ b/x + cx

e può essere considerata la combinazione lineare di tre equazioni più semplici:

y = a

y= b/x (iperbole equilatera)

y= cx y = a+ b/x + cx

y= cx

y = a

y= b/x

H = A + B/ū + C ūEquazione di Van Deemter descrive l’ efficienzaCromatografica.

Primo termine dell’equazione (A): A è associato ai percorsi multipli e alla diffusione di

flusso (parametri indipendente dal flusso)

A= 2dp

Ove è un parametro associato alla granulometria (diametro e distribuzione)

dp = diametro medio particelle

Per minimizzare questo termine è necessario ridurre il diametro particelle e aumentarne

l’uniformità

Secondo termine dell’equazione (B/ ū): Tale termine è associato alla diffusione

molecolare longitudinale

B= 2DM

Ove è il fattore di tortuosità e dipende dall’impaccamento colonna

DM è il coefficiente di diffusione del soluto nella fase mobile (in HPLC si può trascurare

mentre è importante in GC)

Per ridurre B si può ridurre (particelle uniformi), ridurre DM e aumentare ū

Terzo termine dell’equazione (C ū): Il terzo termine è associato alla resistenza al

trasferimento di massa.

C = CS + CM

Ove CS è il contributo del trasferimento nella fase stazionaria e CM in quella mobile

qkdf2

(1+k)2 DS

CS=

q = costante di uniformità particelle fase stazionaria, k= fattore di ritenzione; df =

spessore massimo fase stazionaria; DS= coeff. di diffusione

dp2

DM

CM= dp = spessore massimo fase mobile; DM= coeff. diffusione soluto nella fase mobile

Dall’equazione di Van Deemter si devono ottimizzare i seguenti parametri:

- Flusso fase mobile : si effettua per via sperimentale e costituisce un “compromesso”;

- Caratteristiche fisiche fase mobile: importante per la GC (il termine B contribuisce

notevolmente) – la fase gassosa deve avere una elevata densità

- diametro delle particelle della fase stazionaria – importante uniformità e ridotto diametro

delle particelle

Risoluzione

La risoluzione indica il grado di separazione dei picchi e dipende dalla selettività ed

efficienza.

In termini matematici la risoluzione tra due picchi adiacenti (Rs) è espressa dal rapporto fra

le loro distanze e la semisomma delle rispettive larghezze alla base

tR2 – tR1

w1 + w2

2

Rs=

Nel caso reale di picchi asimmetrici, l’equazione deve essere modificata ponendo al denominatore la somma dei segmenti a e b, ovvero le due semibasi che si affiancano

tR2 – tR1

(a – b)Rs=

Il valore minimo di Rs è di 1 (sovrapposizione dei picchi del 4%). Per Rs= 1.5

(sovrapposizione dello 0.3%) la separazione è considerata completa.

La risoluzione può essere aumentata allungando la colonna quindi aumentando i piatti

teorici.

La risoluzione fra due picchi può anche essere posta in relazione con il numero di piatti

teorici (N), con la selettività () e con il fattore di ritenzione (k).

Rs =1

4N2

- 1

k2

1+k2

( () )

Ove N2 e k2 si riferiscono al secondo picco (più lento)

• Variazioni N

• Variazione del fattore di ritenzione (k) : per fasi mobili gassose si varia la T, per quelle

liquide la composizione dell’eluente

• Variazione del fattore selettività (): la variazione dei due parametri precedenti non è

suff. nel caso in cui =1. In tale caso si variano diversi parametri tra cui la fase

stazionaria, la fase mobile e la T

Aumento di efficienzaScarsa selettività ed efficienza

= picchi non risolti

Aumento di selettività Aumento di efficienza ma non di selettività

Il problema generale della eluizione

HPLC

Eluizione isocratica:Composizione fase mobile costante

Eluizione a gradiente:Composizione fase mobile variabile nel tempo

GC

Programmazione di temperatura:Temperatura variabile

Condizione isoterma:Temperatura costante

Asimmetria dei picchi cromatografici

I picchi cromatografici possono avere una forma gaussiana non simmetrica. Si possono

avere due tipi di deformazioni:

• tailing: il tracciato sale bruscamente per scendere lentamente

• fronting: il tracciato sale lentamente e scende rapidamente

Il fattore di simmetria viene espresso dal fattore o rapporto di asimmetria:

As= b/a

Ove a e b sono le distanze della curva dalla verticale tracciata nel punto di massimo del

picco, misurate in corrispondenza del 10% dell’altezza del picco, rispettivamente a sinistra

e destra del punto massimo.

Nel caso di tailing As>1 mentre nel caso di fronting As<1.

Le cause di fronting e tailing possono essere ricondotte ad una

di queste cause:

• Introduzione del campione lenta o comunque scorretta

• Adsorbimento irreversibile della sostanza nella fase

stazionaria

• sovraccarico

• Ridotta solubilità del campione nella fase mobile

2 mg

2 µg