INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO (CROSSLINKING) Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO(CROSSLINKING)

Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM



MODIFICACIÓN UNIPUNTUAL

RESIDUOS ÁCIDOS (Glu, Asp)

OH

O

N C N RRO

O HN

NR

RNH2R

NH

O

R

O

O

R

OH

O

OH

O

R-OH

BF3.OEt

OH

O

SO3

NO

Et

Reactivo K deWoodward

O

O

OHN

Et

SO3



LISINA

NH2

NO2

NO2O2N

SO3

NH

O2N

O2N

NO2TNBS

NH2

O C N K

NHNH2

O

NH2

N

OH

OH

CH3

OP

O

HOHO

N

N

H

CH3

OH

OP

O

HOOH

PLP

HISTIDINA

N NH

O O

O

O

O

EtEt

N NO

O

Et

ARGININA

HN NH2

NH

RR

O

O N N

NH

RR

fenilglioxal, butanodiona

CISTEÍNA

SH

I

O

OR

S

O

OR

N

O

O

Et

SH SN

O

O

Et

SH S

CO2H

O2N

S

CO2H

NO2

S

CO2H

NO2

SDTNB

METIONINA

SCH3

[O]

SCH3

O

SCH3

O

[O][O]

OI

O

OR

S

O

OR

CH3



TIROSINA

OHTNM

NO2

NO2NO2

O2N

OH

NO2

SERINA

OH

F P

O

OROR

O P

O

OROR

F P

O

ORR

OH O P

O

ORR

TRIPTÓFANO

HN

NBS

HN

Br

[O]

HN

O

dimerizacíon, ruptura anillo

[O]

luz, O2


Modificaciones unipuntuales de interésObjetivo: hacer a la enzima insoluble en disoluciones acuosas.Uno de los métodos más tradicionales: UNIÓN COVALENTE DE UN POLÍMERO ANFIPÁTICO.El más habitual: monometoxipolietelienglicol (mPEG)

OMeO O

OOH

nPeso molecular variable. El mas usado: sobre 5 kDa.Dependiendo del grado de modificación, se consigue la total insolubilidad en agua.Este grado debe ser controlado cuidadosamente, pues puede conducir a la pérdida de actividad.La unión se suele hacer sobre lisinas.


Uno de los más empleados.A través de TCT (cloruro cianúrico)Debe controlarse bien

Copolímero con anh. succínicoEnlace amida estable

A través de un carbamatoSe sigue fácilmente la activación.

Oxidación del mPEGSe activa el grupo ácido con N-hidroxisuccinimda.


Otra característica interesante de esta metodología:

SE OBTIENEN DERIVADOS SOLUBLES EN CIERTOS DISOLVENTES ORGÁNICOS:

Benceno, tolueno y clorados (cloroformo, 1,1,1-tricloroetano, tricloroetileno)

LA CATÁLISIS SE HACE HOMOGÉNEA.

Inmovilización en disolventes orgánicos?Siempre que se pueda recuperar el derivado.Recuperación:

Añadiendo disolv. muy apolares (hexano, éter de petróleo) se produce la pptación.




H

O

H

O

Glutaraldehido

NH2

NC

O

NC

O

hexametilenbisisocianato

NH2

N

O

O

N

O

O

N,N-hexametilen-bismaleimidaSH

O On

bis-oxiranos

NH2

OH

n

NH2

MeO

NH2

OMe

bisimidatos

NH2

O

I

HN

NH

I

O

hexametilenbisiodoacetamida

SH

N NNN

SO3

O3S

2,2'-disulfonato de bisdiazobencidina

OH

SO O

divinilsulfonaNH2

SH

F

F

NO2

NO2

NH2

OH

N

N

N

Cl

ClCl

NH2

OH

OH

SS ClCl

O

O O

ONH2

REACTIVOS ENTRECRUZANTESDIFUNCIONALES


Cross-Linked Enzyme Crystals

Cross-Linked Enzyme Aggregates

Crosslinked Spray-Dried Enzymes

Cross-Linked Enzymes


Cross Linked Enzymes (CLE)

A comienzos de los años 60 se describe por primera vez que el tratamiento de enzimas con reactivos difuncionales (fundamentalmente glutaraldehído) originaba derivados insolubles con retención de actividad (CLEs)

Al mismo tiempo, se aumentaba la termoestabilidad (sobre todo en enzimas multiméricas), pero se necesitan unas condiciones muy delicadas (cantidad crosslinker, T, pH, fuerza iónica).

El material obtenido era gelatinoso, y se intentó el entrecruzamiento con otras moléculas para aumentar propiedades mecánicas,


Centro activo

Enzima nativa

Enzima desplegada(desnaturalizada)

Enzima estabilizada por un entrecruzamiento

intramolecular

ENTRECRUZAMIENTO INTRAMOLECULAR


Cross Linked Enzyme Crystals (CLECs)


Proceso de cristalización


Entrecruzamientosmás habituales


Ventajas 1. Mayor actividad por unidad de volúmen (partículas uniformes, microporosas,

formadas por sólo moléculas de enzima pura, lo que implica la máxima posible concentración de enzima)

2. Gran actividad específica3. Fácil separación del medio de reacción, lo que facilita su reutilización.4. Buenas propiedades mecánicas y termoestabilidad, así como resistencia a

disolventes orgánicos.5. No producen contaminación medioambiental.6. No requieren soportes muy caros7. Resistentes a la proteolisis

Desventajas

1. Dificultad de cristalización2. Problemas de difusión (debe miminizarse el tamaño del cristal)3. Alto precio


Prof. J.M. Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid, España

CLECS


CLECS


Cross Linked Enzyme Agreggates (CLEAs)


POSIBILIDADESPOSIBILIDADES

CLECsCLECs

Enzimas puras y cristalinasEnzimas puras y cristalinas

Necesidad de enzima puraNecesidad de enzima pura

Estabilización de proteinas Estabilización de proteinas multiméricasmultiméricas

CLEAsCLEAs

Enzimas con trazas de impurezasEnzimas con trazas de impurezas

Coagregación de enzimasCoagregación de enzimas

Agregación de enzima y polímeroAgregación de enzima y polímero

Estabilización de enzimasEstabilización de enzimasmultiméricasmultiméricas

Crosslinked Enzyme Crystals Crosslinked Enzyme Aggregates


CLEAsCLEAs

ESQUEMA DE CLEAsESQUEMA DE CLEAs

entrecruzante

+ + precipitanteprecipitante

PEGPEGSales, disolventesSales, disolventes



rápido lento

Muy lento

Enzima multiméricaEnzima disociada

(reversible)

Enzima desnaturalizada

(irreversible)

Enzima multimérica entrecruzada

Enzima desnaturalizada entrecruzada(irreversible)

ENTRECRUZAMIENTO INTERMOLECULAR


INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN

Es el método más sencillo y antíguo (células de acetobacter

adsorbidas sobre palos de madera para obtener vinagre por

fermentación-1815)Se puede emplear tanto para células como para enzimas.Las fuerzas de unión son débiles:

Van der WaalsInteracciones iónicasEnlaces de hidrógeno.

Se producen fácilmente desorciones debido a:variaciones concentración de sustrato.Cambios de pHcambios de Talteración de la fuerza iónica.



Soportes típicos:carbón activosílice, alúmina, titania, ...Tierra de diatomeas (Celite)celulosaresinas sintéticasCPG (controlled pore glasses).

La mayoría de las enzimas se unen mejor a soportes polaresLas lipasas se unen mejor a superficies hidrofóbicasMÉTODO MUY RECOMENDADO PARA ENZIMAS EN

DISOLVENTES ORGÁNICOS (NO DESORCIÓN)



Unión iónica es bastante habitual.Se usan a nivel industrial resinas intercambiadoras :

catiónicascarboximetilcelulosaamberlite IRA

aniónicasdietilaminoetilcelulosa (DEAE-celulosas)resinas Sephadex

Se precisa un exquisito control del pH de la inmovilización :

Coherencia con la carga neta enzimática como consecuencia del

pKa.



Metodologías empleadas:métodos en batch

ayuda de precipitación (ej acetona, isopropanol)métodos en columna

plug flowlecho fluidizado

REGLA DEL DIÁMETRO DE GIRO (spin diameter)



EHN

O

O

O

HN

(S) (R)

O

O

O

HN

(R) (S)

OH

O

+

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