of 29/29
INISIASI INDUKSI KALUS NYAMPLUNG (Calophyllum inophyllum Linn) SECARA IN VITRO Oleh: DIAN ANGGRAENI M111 13 009 PROGRAM STUDI KEHUTANAN FAKULTAS KEHUTANAN UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2017

INISIASI INDUKSI KALUS NYAMPLUNG

  • View
    1

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of INISIASI INDUKSI KALUS NYAMPLUNG

Oleh:
Dian Anggraeni( M111 13 009 ). Inisiasi Induksi Kalus Nyamplung Calophyllum
inophyllum Linn secara in vitro di bawah bimbingan Muhammad Restu dan Siti
Halimah Larekeng.
Linn secara in vitro bertujuan mengevaluasi pengaruh konsentrasi 2.4-D
(Dichlorophenoxyacetic acid), TDZ (Thidiazuron) dan kombinasi keduanya
dengan penambahan ke tiga jenis asam amino yang optimal untuk menginduksi
kalus Nyamplung (Calophyllum inophyllum Linn). Penelitian ini telah dilakukan
pada bulan Agustus sampai oktober 2017 di Laboraturium Bioteknologi dan
Pemuliaan Pohon Fakultas Kehutanan, Universitas Hasanuddin, Makassa. Kalus
diinduksi dari eksplan daun nyamplung. Desain ini menggunakan rancangan acak
lengkap dengan 12 perlakuan dengan 5 ulangan. Kombinasi yang dicobakan yaitu
M1 = TDZ 1 ppm + asam amino Asparagin 0.0015 g/150 ml , M2 = TDZ 1 ppm +
asam amino Glutamin 0.0015 g/150 ml, M3 = TDZ 1 ppm + asam amino Ekstrak
Ragi 0.0015 g/150 ml, M4 = TDZ 1 ppm + asam amino Asparagin +
GlutaminEkstrak Ragi 0.0015 g/150 ml, M5 = 2,4 D 1 ppm + asam amino
Asparagin 0.0015 g/150 ml, M6 = 2,4 D 1 ppm+ asam amino Glutamin 0.0015
g/150 ml, M7 = 2,4 D 1 ppm + asam amino Ekstrak Ragi 0.0015 g/150 ml, M8 =
2,4 D 1 ppm + asam amino Asparagin 0.0015 g/150 ml + Glutamin 0.0015 g/150
ml + Ekstrak ragi 0.0015 g/150 ml, M9 = TDZ 1 ppm + 2,4 D 1 ppm + asam
amino Glutamin 0.0015 g/150 ml, M10 = TDZ 1 pm + 2,4 D 1 ppm + asam amino
Asparagin 0.0015 g/150 ml, M11 = TDZ 1 ppm + 2,4 D 1 pmm + asam amino
Ekstrak Ragi 0.0015 g/150 ml,M12 = TDZ 1 ppm + 2,4 D 1 ppm + asam amino
Asparagin 0.0015 g/150 ml + Glutamin 0.0015 g/150 ml + Ekstrak Ragi 0.0015
g/150 ml. Parameter yang diamati adalah waktu muncul kalus, warna kalus,
tekstur kalus, jumlah eksplan berkalus, persentasi browning, persentasi
kontaminasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kombinasi ZPT 2,4-D 1 ppm,
TDZ 1 ppm dan Asam Amino (Asparagin 0.0015 g/150 ml, Glutamin 0.0015
g/150 ml dan Yeast Ekstract 0,0015g/150 ml) menunjukkan kombinasi media
yang baik untuk menginduksi yang ditandai dengan warna kalus putih, dan tekstur
kalus remah.
Kata kunci: 2,4-D, TDZ, kalus, Calophyllum inophyllum Linn, kultur in vitro
v
KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Allah SWT karena atas limpahan rahmat dan hidayah-
Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “ INISIASI
INDUKSI KALUS NYAMPLUNG (Calophyllum inophyllum Linn) SECARA IN
VITRO”, dibawah bimbingan Prof. Dr. Ir. H. Muhammad Restu, M.P dan Dr. Siti
Halimah Larekeng, SP.,MP. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk
memperoleh gelar sarjana pada jurusan Kehutanan Universitas Hasanuddin.
Dengan segala kemampuan yang dimiliki, penulis mencoba menyajikan
karya penulisan, tetapi disadari bahwa hasil yang dicapai masih jauh dari
kesempurnaan. Penulis telah memberikan segala kemampuan dalam skripsi ini
dan diharapkan bermanfaat bagi perkembangan Ilmu Pengetahuan. Berbagai ide
telah tertuang dengan segala jerih payah yang tak akan lapuk oleh pemikiran dan
pencarian yang tak terbatas namun hanya Allah pemilik segala kesempurnaan.
Penulis pada kesempatan ini, juga menyampaikan rasa terima kasih dan
penghargaan yang tak terhingga kepada:
1. Bapak Prof. Dr. Ir. H. Muhammad Restu, M.P dan Dr. Siti Halimah
Larekeng, SP.,MP selaku dosen pembimbing atas petunjuk, arahan dan
bimbingan serta dengan penuh pengertian telah meluangkan waktunya untuk
memberikan arahan kepada penulis sejak awal penyusunan hingga
penyelesaian skripsi ini.
2. Bapak Prof. Dr. Ir. Musrizal muin, M.Sc. , Syahidah, S.Hut, M.Si.Ph.D
dan Gusmiaty, S.P, M.P, selaku dosen penguji yang telah meluangkan waktu
dan pemikirannya atas semua saran dan kritiknya serta pengetahuan demi
penyempurnaan skripsi ini .
3. Ibu Gusmiaty, S.P, M.P, Kak Mirza A. Arsyad, SP., M.Si.,M.Si., Kak
Harlina, S.Si., Kak Yuni Fitri Cahyaningsih,SP., dan Kak Siti Aminah,
S.P., yang telah bersedia membatu penulis selama melaksanakan penelitian di
Laboratorium Bioteknologi dan Pemuliaan Pohon.
vi
Universitas Hasanuddin.
5. Teman-teman seperjuangan Sri Wahyuni Jufri., A. Sri Nurul Fahmi S.Hut.,
Indriyani Astuti B.K., Asmawati., Nur Reski Immalasari., Kevin
Falensia., Khodijah Nurutami., Andis., Jefrianto Sapan L., Andi Fahriadi
dan adik-adik di Laboratorium Bioteknologi terima kasih telah membantu
penulisan dan tak henti-hentinya memberikan motivasi kepada penulis dalam
menyelesaikan skripsi ini.
6. Terima kasih untuk sahabatku tersayang Regita Cahyani., Syarifah Majnah
Ruslan., Regita Cahyani S.Hut., dan Renti Wahyuni Nurdin atas doa dan
semangatnya kepada penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.
7. Teman-teman seperjuangan kelas A dan Gemuruh 2013, terima kasih atas
kerjasamanya dan motivasinya selama ini.
8. Kepada sahabat-sahabat penulis diluar sana Dian Andika Putri Amd, St.
Saarah Umar S.pd dan Arini Amin S.pd atas doa dan semangatnya kepada
penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.
9. Saudara-saudara seatap di Pondok Arham,. Terima kasih telah memberikan
semangat dan motivasi yang luar biasa.
10. Terima kasih untuk teman-teman seposko KKN Gel.93 Kelurahan Mataran
Kecamatan Anggeraja Kabupaten Enrekang Ruth Rante Labbi, Awalia
Febrinovita P, Erni Damayani, Ghita, Andis Kapati, Ibrahim dan Reifan
Fahrisyah.
Rasa hormat dan terima kasih yang sedalam-dalamnya saya persembahkan
kepada kedua Orang tua tercinta, Hasna dan Hj. Hasnani, yang telah
memberikan segala pengorbanannya dan cinta kasihnya yang tak pernah lelah
memberikan dorongan semangat, doa serta materi yang memudahkan penulis
dalam menyelesaikan pendidikan, serta untuk Saudara-saudariku, Lilis Syahyani,
Ahmad Husein, Fatimah Zahra, dan Muhammad Radit Mubaraq berkat doa
mereka penulis dapat menyelesaikan pendidikan ini.
Makassar, November 2017
1.3. Hipotesis ............................................................................................. 3
2.1. Nyamplung ........................................................................................ 4
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................... 19
3.2. Alat dan Bahan .................................................................................. 19
3.3. Pelaksana Kegiatan ............................................................................ 19
3.4. metode percobaan .............................................................................. 23
4.2. Warna Kalus .................................................................................... 27
4.3. Tekstur Kalus ................................................................................... 29
viii
6.1. Kesimpulan ....................................................................................... 36
6.2. Saran ................................................................................................. 36
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 37
Tabel 3. Uji lanjut Duncan Eksplan yang Berkalus ………………... 31
x
Gambar 2. Warna kalus ……………………………………………. 28
Gambar 3. Tekstur Kalus …………………………………………... 30
Gambar 4. Persentasi Browning …………………………………… 33
Gambar 5. Persentasi Kontaminasi ………………………………... 34
xi
Lampiran 2. Warna kalus ……………………………………………. 43
Lampiran 3. Tekstur kalus …………………………………………… 44
Lampiran 4. Jumlah eksplan yang berkalus ………………………….. 45
Lampiran 5. Persentasi browning ……………………………………. 47
Lampiran 6. Persentasi kontaminasi ………………………………… 48
Lampiran 7. Proses sterilisasi eksplan ………………………………. 49
Lampiran 8. Proses penanaman Lamina Air Flow Cabinet …………… 49
Lampiran 9. Eksplan yang belum ditumbuhi kalus …………………… 50
Lampiran 10. Eksplan yang berkalus ………………………………….
xii
4. Karakteristik Makroskopis dan Mikroskopis Cendawan Tanaman Uru di
Kabupaten Tana Toraja, Mahoni di Kabupaten Takalar, dan Eboni di
Kabupaten barru ............................................................................................. 40
Kabupaten Tana Toraja, Mahoni di Kabupaten Takalar, dan Eboni di
Kabupaten barru ............................................................................................. 42
6. Panduan Identifikasi Bakteri Laboratory Guide for identification of Plant
Pathogenic Bacteria ....................................................................................... 44
penghasil bahan bakar nabati (biofuel), dan kayunya dapat dimanfaatkan sebagai
bahan baku pembuatan perahu, balok, bahan kontruksi ringan lainnya, serta kulit
bijinya dapat dijadikan sebagai bahan pembuatan brikat arang. Energi dari biji
nyamplung juga dapat mengurangi penggunkaan bahan bakar fosil dan bahan bakar
kayu. Bagi masyarakat yang tinggal di sekitar pantai tanaman nyamplung juga dapat
berfungsi sebagai tanaman pelindung dan pemecah angin (wind breaker) (Leksono,
dkk., 2014).
yang insentif mutlak dilakukan dan juga diperlukan ketersediaan benih/bibit yang
berkesinambungan, tetapi penyediaan bibit secara konvensional dianggap tidak
efektif karena membutuhkan waktu yang lama dan ditentukan oleh musim. Salah
satu metode yang dapat digunakan untuk menyediakan benih/bibit secara
berkesinambungan yaitu budidaya menggunakan metode kultur jaringan (in vitro).
Prinsip kultur jaringan yaitu semua bagian tanaman baik berupa sel, jaringan, dan
organ tanaman, dapat menjadi tanaman baru apabila ditumbuhkan dalam kondisi yang
aseptik dengan cara steril.
jaringan menawarkan peluang besar untuk menghasilkan jumlah bibit tanaman yang
banyak dalam waktu relatif singkat sehingga lebih ekonomis. Teknik perbanyakan
tanaman ini dapat dilakukan sepanjang waktu tanpa tergantung musim, selain itu,
perbanyakan tanaman dengan teknik in vitro mampu mengatasi kebutuhan bibit yang
dihasilkan lebih sehat serta seragam. Oleh sebab itu, kini perbanyakan tanaman secara
kultur jaringan merupakan teknik alternatif yang tidak dapat dihindari bila
penyediaan bibit tanaman harus dilakukan dalam skala besar dan dalam waktu yang
relatif singkat.
Syarat-syarat tersebut meliputi beberapa hal yaitu pemilihan eksplan atau bahan
tanaman, penggunaan media yang cocok dan keadaan yang aseptik dan pengaturan
udara yang baik (Nugroho dan Sugito, 1996). Disamping hal-hal tersebut di atas,
faktor lain yang ikut menunjang keberhasilan pertumbuhan tanaman yang dikulturkan
adalah zat pengatur tumbuh dan kandungan hormon pada tanaman juga harus
diperhatikan. Hormon pada tanaman disebut juga fitohormon. Menurut Pierik (1987)
dalam Andriyana, S., (2010) fitohormon adalah senyawa-senyawa yang dihasilkan
oleh tanaman tingkat tinggi secara endogen. Senyawa tersebut berperan merangsang
dan meningkatkan pertumbuhan serta perkembangan sel, jaringan, dan organ tanaman
menuju arah diferensiasi tertentu. Senyawa-senyawa lain yang memiliki karakteristik
yang sama dengan hormon, tetapi diproduksi secara eksogen, dikenal sebagai ZPT.
Kultur kalus merupakan salah satu metode yang dapat diterapkan untuk kultur
jaringan. Kalus adalah massa sel yang tidak terorganisir, pada mulanya sebagai
respon terhadap pelukaan (wounding). Induksi kalus merupakan salah satu langkah
penting karena dapat menghasilkan banyak tanaman dari satu eksplan yang dapat
diregenerasikan. Penggunan ZPT dan asam amino dalam menginduksi kalus suatu
tanaman sangat bervariasi. Inisiasi kalus embriogenik pada jabon merah
menggunakan ZPT 2,4 D, BAP dan NAA (Restu dkk 2016). Berdasarkan informasi
tersebut dan kurangnya informasi mengenai pembentukan kalus pada nyamplung
sehingga perlu dilakukan penelitian inisiasi induksi kalus Nyamplung secara in vitro.
1.2. Tujuan dan Kegunaan
Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh konsentrasi 2.4-D
(Dichlorophenoxyacetic acid), TDZ (Thidiazuron) dan kombinasi keduanya dengan
penambahan ke tiga jenis asam amino yang optimal untuk menginduksi kalus
Nyamplung (Calophyllum inophyllum Linn). Kegunaan dari penelitian ini adalah
sebagai bahan informasi bagi peneliti Nyamplung mengenai pengaruh konsentrasi
15
2.4-D , TDZ dan kombinasi keduanya dengan penambahan ke tiga jenis Asam Amino
yang optimal untuk menginduksi kalus Nyamplung (Calophyllum inophyllum L.).
1.3 Hipotesis
1. Terdapat salah satu kombinasi ZPT dan Asam Amino yang memberikan respon
tercepat terhadap induksi kalus Nyamplung secara in vitro.
2. Terdapat salah satu kombinasi ZPT dan Asam Amino yang memberikan respon
terlambat terhadap induksi kalus Nyamplung secara in vitro.
3. Terdapat satu kombinasi ZPT dan Asam Amino yang memberikan respon
seimbang terhadap induksi kalus Nyamplung secara in vitro.
16
2.1.1. Sistematika
adalah sebagai berikut :
Pohon nyamplung bertajuk rimbun menghijau dengan akar tunjang. Tinggi
pohon dapat mencapai 25 m dengan tinggi bebas cabang 4 – 10 m, diameter dapat
mencapai 150 cm (Leksono, dkk., 2014). Nyamplung termasuk jenis pohon keras,
batang nyamplung sangat kuat didaerah pantai bermanfaat sebagai penahan
datangnya arus tsunami. Berbatang besar, kokoh dan tegak tetapi cenderung miring,
jika terpelihara dengan baik diameter batang dapat mencapai 1 – 1,5 m (Masyud,
2010). Batang berkayu dengan percabangan mendatar dan jarang berbanir, kulit
batang bagian luar berwarna kelabu dan putih, beralur dangkal dan mengelupas, pada
kulit kayu terdapat saluran getah berwarna kuning (Bustomi, dkk., 2008).
Daun nyamplung termasuk pohon berdaun lebat. Tumbuhan ini berdaun tunggal
(folium simplex) yang tidak lengkap (incompletes), bersilang berhadapan bulat
memanjang atau bulat telur, ujung tumpul, pangkal membulat, tepi rata, pertulangan
17
menyirip , panjang 20-21 cm, lebar 6 – 11 cm,tangkai 1,5 -2,5 cm, daging daun
seperti kulit/belulang, warna hijau (Leksono, dkk., 2014).
Bunga majemuk, bentuk tandan di ketiak daun yang teratas, berkelamin dua,
diameter 2 – 3 cm, tujuh sampai tiga belas, daun kelopak empat tidak beraturan,
benang sari banyak, tangkai putik membengkok, kepala putik berbentuk perisai, daun
mahkota empat, lonjong, putih (Masyhud, 2010).
Nyamplung mulai berbuah pada umur 7 tahun, berbuah sepanjag tahun dan
dapat dipanen 3 kali dalam setahun. Buah muda berwarna hijau dan yang sudah tua
berwarna kekuning-kuningan, apabila dibiarkan lama buah berwarna seperti kayu,
buah termasuk kategori buah batu, bulat seperti peluru dengan mancung kecil di
depannya, diameter antara 2,5 – 5 cm. Biji berbentuk bulat tebal dank keras,
berukuran relative besar berdiam 2,5 – 4 cm, daging biji tipis dan biji yang telah
kering dapat tahan disimpan selama 1 bulan, inti biji mengandung minyak berwarna
kuning kecoklatan (Leksono, dkk., 2014).
2.1.3. Penyebaran
Nyamplung atau sebagian masyarakat menyebutnya dengan bintagur, umumnya
tumbuh pada hutan daerah rendah, bahkan ada pula jenis yang tumbuh dekat laut.
Tanaman ini umumnya menyukai tanah pasir berlempung (Sandy loam) (Masyhud,
2010). Nyamlung mempunyai sebaran cukup luas di dunia yaitu Madagaskar, Afrika
Timur, Asia Selatan dan Tenggara, Kepulauan pasifik, Hindia Barat, dan Amerika
Selatan. Di Indonesia nyamplung tersebar mulai dari Sumatera Barat, Riau, Jambi,
Sumatera Selatan, Lampung, Jawa, Kalimantan Barat, Kalimantan Tengah, Sulawesi ,
Maluku, hingga Nusa Tenggara Timur dan Papua. Selain itu, pohon tersebut juga
ditemui di wilayah Malaysia, Filipina, Thailand, dan Papua Nugini dengan nama
local yang berbeda-beda (Departemen Kehutanan, 2011).
Persyaratan tumbuh tanaman nyamplung menurut Leksono, dkk., (2014) adalah
sebagai berikut :
a. Pada tanah mineral dan pantai berpasir marginal, tanah yang mengandung liat
berdrainase baik dan toleran terhadap kadar garam.
18
b. Tumbuh baik pada ketinggian : 0-200 m dpl.
c. Tipe curah hujan A dan B (1000 – 3000 mm/tahun dengan 4 – 5 bulan kering).
d. Temperatur rata-rata 18-33 0 C.
e. pH antara 4 – 7,4
Tegakan nyamplung pada umumnya tumbuh dan ditanam di daerah pantai
berpasir (0 m dpl) juga pada tanah mineral sampai ketinggian 150 m dpl. Tegakan
nyamplung pada umumnya tumbuh pada tipe hutan campuran, di hutan alam dengan
jenis ketapang, malapari, waru laut, keben, pandan laut, dan lain-lain. Di hutan
tanaman dengan akasia, mahoni, kayu putih, malinjo, nangka, duku, durian, dan ain-
lain. Nyamplung tumbuh paling dekat pada posisi 50 -1000 m dari bibir pantai
dengan kerapatan pohon sangat bervariasi. Peta sebaran nyamplung dari 6 populasi di
Jawa pada umumnya berdekatan dengan pantai selatan dan pantai barat pulau Jawa,
yang mempunyai karakteristik fisik lahan dalam klasifikasi system daratan laut dan
pantai, sistem daratan aluvial sampai dengan system bukit kapur, dengan sub sistem
pesisir pantai yang bergelombang, sub sistem rivene plains dan sub sistem kipas
alluvial, tipe bantuan sedimen pasir tipe batuan kapur yang berbentuk dari endapan
muara dan endapan volkanik (Leksono, dkk., 2014).
2.1.4. Manfaat Nyamplung
Nyamplung merupakan tanaman yang mempunyai banyak manfaat dan
keunggulan dari segi bagian tanaman baik kayu, daun getah maupun bijinya. Kayu
nyamplung mempunyai kelas awet II-IV , klas kuat II-III dengan berat jenis 0,69
.Kayu nyamplung termasuk kayu komersial, dapat digunakan utuk bahan pembuatan
perahu, balok, tiang, papan lantai dan bahan kontruksi ringan. Getah dan daun
nyamplung dapat digunakan sebagai bahan aktif pembuatan obat. Getah nyamplung
diindikasikan untuk menekan pertumbuhan virus HIV, sedang daunnya dapat
digunakan sebagai bahan komestik dan menyembuhkan luka. Beberapa hasil
penelitian telah menemukan bahwa biji nyamplung digunakan sebagi bahan baku
biofuel (Prasetyawati, 2011).
dapat dikombinasikan dengan tanaman lain, termasuk dengan tanaman pertanian.
Dengan kemampuan hidupnya hidup dalam salinitas yang tinggi dan mudah
dibudidayakan, maka nyamplung banyak digunakan untuk rehabilitas kawasan
pesisir. Sebagai salah satu spesies pantai, tanaman nyamplung juga bermanfaat
sebagai pemecah angin (wind breaker) (Prasetyawati, 2011).
2.2. Kultur Jaringan
Kultur jaringan dalam bahasa asing disebut sebagai tissue culture, weefsel
cultuus atau gewebe kultur. Kultur adalah budidaya dan jaringan adalah sekelompok
sel yang mempunyai bentuk fungsi yang sama, sehingga kultur jaringan berarti
membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai
sifat seperti iduknya (Suryowinoto, 1991).
Kultur jaringan sering disebut juga perbanyakan tanaman secara in vitro, yaitu
budidaya tanaman yang dilaksanakan dalam container, botol-botol dengan media
khusus dan alat-alat yang serba steril. System perabanyakan tanaman dengan kultur
jaringan ini dapat menghasilkan tanaman baru dalam jumlah yang banyak dan dalam
waktu yang sangat singkat. Tanaman baru yang dihasilkan mempunyai sifat-sifat
keturunan atau sifat-sifat biologis yang sama dengan sifat induknya. System budidaya
jaringan juga memiliki keuntungan lain yaiutu penghematan tenaga, waktu, tempat
dan biaya (Hendaryono dan Wijayani, 1994).
Teknik kultur jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi (mengambil)
bagian tanaman seperti protoplasma, sel, jaringan dan organ. Bagian-bagian tanaman
tersebut dapat memperbanyak diri dan menjadi tanaman lengkap yang mempunyai
sifat sama dengan induknya dalam suatu lingkungan yang aseptic (bebas hama dan
penyakit) (Nugroho dan Sugito, 2001).
Teknik kultur jaringan berdasarkan teori sel dikemukakan oleh Schleiden dan
Schwann, bahwa sel mempunyai kemampuan autonomy. Kemampuan tersebut adalah
mempunyai kemampuan totipotensi yaitu kemampuan setiap sel, dari mana saja sel
20
tersebut diambil, apabila diletakkan dalam lingkungan yang sesuai akan dapat tumbuh
menjadi tanaman yang sempurna (Suryowinoto, 1991).
Manfaat yang biasa didapatkan dari kultur jaringan adalah sebagai berikut:
a. Bibit dapat diperbanyak dalam jumlah besar dan relatif cepat.
b. Efisiensi tempat dan waktu.
c. Bibit uggul, cepat berbuah serta tahan hama dan penyakit.
d. Tidak bergantung musim, dapat diperbanyak secara kontinyu.
e. Cocok untuk tanaman yang sulit bergenerasi.
f. Kultur jaringan sesuai dengan pemuliaan konvensional.
g. Seragam atau sama dengan induknya.
Menurut Sridianti (2014), tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman
dengan teknik kultur jaringan adalah :
a. Inisiasi
Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan.
Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas.
Tipe jaringan adalah jaringan muda dan parenkim. Jaringan muda adalah yang belum
mengalami diferensi dan masih aktif membelah sehingga memiliki kemampuan
regenerasi yang tinggi, ditemukan pada tunas apical, tunas aksiler, bagian tepi daun,
ujung akar, maupun cambium batang. Jaringan parenkim, yaitu jaringan penyusun
tanaman muda yang sudah mengalami diferensiasi dan menjalankan fungsinya,
terdapat pada jaringan daun yang sudah berfotosintesis dan jaringan batang atau akar
yang berfungsi sebagai tempat cadangan makanan.
b. Multiflikasi
Multiflikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam
eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari
adanay kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Botol kultur
yang telah ditanami eksplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang
steril dengan suhu kamar.
21
akar yang menandai bahwa proses kultur jaringn yang dilakukan mulai berjalan
dengan baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan
perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun
jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukka gejala seperti berwarna putih
atau biru (disebabkan oleh jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).
d. Aklimatisasi
Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic
ke bedengan yang telah disediakan (penyesuaian dengan kondisi lapangan).
Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan
sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan
hama penyakit dan udara luar. Bibit yang mampu beradaptasi dengan lingkungan
barunya, memungkinkan secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit
dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif.
e. Faktor-faktor yang Mempengaruhi Keberhasilan teknik Kultur Jaringan
Menurut Zulkarnain (2009), ada beberapa variable utama yang harus
dipertimbangkan, yaitu seleksi bahan tanaman, teknik sterilisasi eksplan, komposisi
medium dasar, keterlibatan zat pengatur tumbuh, serta faktor-faktor lingkungan di
mana kultur ditempatkan
Sterilisasi adalah segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di
tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril.
Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang
disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan
kultur jaringan juga harus steril (Sridianti, 2014).
Seleksi bahan eksplan yang cocok merupakan faktor penting yang menetukan
keberhasilan program kultur jaringan. Sitem kultur jaringan yang baru dimulai
dengan spesies tanamn yang baru pula, seringkali menghendaki analisis yang
sistematis terhadap potensi eksplan dari setiap tipe jaringan (Zulkarnain, 2009).
Tanaman dapat diperoleh dari sejumlah besar genotip dengan kemampuan
regenerasi sangat berbeda. Pengaruh genotip pada proliferasi sel dapat dilihat pada
22
kultur in vitro daripada tanaman monokotil. Selain itu, tanaman gymnospermae
memiliki kapasitas regeneratif yang lebih terbatas dibandingkan dengan tanaman
angiospermae (Zulkarnain, 2009).
Kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kultur in vitro yang optimal bervariasi
antar varietas. Jaringan yang berasal dari bagian tanaman yang berbedapun akan
berbeda kebutuhan nutrisinya. Medium dasar yang tidak berlaku universal untuk
semua jenis jaringan dan organ.
Sukrosa merupakan sumber karbon yang baik bagi proses kultur. Konsentrasi
yang tepat dari sukrosa dan garam-garam mineral merupakan faktor yang penting
untuk diperhatikan supaya mendapatka laju mikropropagasi yang optimum.
Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.
Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan
diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan
hormone. Selain itu di perlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain.
Zat pengatur tumbuh (hormone) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya
maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang
dilakukanMedia yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol
kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara atau botol-botol kaca.
Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskan dengan
autoclaf (Sridianti, 2014).
Media tumbuh dapat digolongkan yaitu media padat dan media cair. Media
padat umumnya berupa padatan gel, seperti agar. Penggunaan media padat hanya
yang dapat dicampur dengan nutrisi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan. Media cair
adalah nutrisi yang dilarutkan di air. Media cair dapat bersifat tenang atau dalam
kondisi selalu bergerak, tergantung kebutuhan (Sridianti, 2014)
c. Zat HormonTumbuh
dihasilkan oleh tanaman tingkat tinggi secara endogen. Senyawa tersebut berperan
23
merangsang dan meningkatkan pertumbuhan serta perkembangan sel, jaringan dan
organ tanaman menuju arah diferensiasi tertentu. Senyawa-senyawa lain yang
memiliki karakteristik yang sama dengan hormone, tetapi diproduksi secara oksogen,
dikenal sebagai zat pengatur tumbuh. Kehadiran zat pengatur tumbuh dalam kultur
jaringan sangat berpengaruhnya, bahkan sulit untuk menerapkan teknik kultur
jaringan pada upaya perbanyakan tanaman tanpa melibatkan zat pengatur tumbuh.
e. Lingkungan
ruang kultur yang baik. Lingkungan kultur merupakan hasil interaksi anatara bahan
tanaman, wadah kultur, dan lingkungan eksternal ruang kultur, memiliki pengaruh
sangat besar terhadap suatu system kultur jaringan. Secara teoritis, semua variable di
dalam setiap wadah kultur pada ruang kultur yang sma adalah seragam. Pertumbuhan
kultur yang seragam membutuhkan keseragaman faktor lingkungan, tidak hanya di
dalam ruang kultur, tetapi juga di dalam semua wadah kultur dengan cara
meggunakan wadah yang seragam.
kultur adalah suhu, cahaya, karbondioksida, oksigen, etilen, dan kelembapan.
Masing-masing faktor tidak bekerja sendiri-sendiri, tetapi saling berinteraksi satu
sama lain dalam memengaruhi pertumbuhan dan perkembangan eksplan yang
dikulturkan
Temperatur ruang kultur terdiri dari suhu dan kelembapan relatif. Suhu kultur
biasanya dijaga berkisar antara 20 0 -28
0 C. pada beberapa tanaman, temperature
ruanagan berpengaruh pada pada proses morfogenesis yang terjadi dari jaringan
tanaman. Keadaan udara ruang kutur berpengaruh terhadap perkembangan jaringan
yang dilakukan. Gas-gas yang dikeluarkan oleh jaringan tanaman misalnya etilen,
akan berkumpul dalam botol kultur dan dapat menghambat pertumbuhan jaringan.
Sedangkan keadaan udara ruang kultur diluar botol kultur jika tidak bersih dapat
menyebabkan terjadinya kontaminasi pada kutur yang disimpan. Udara dalam ruang
kultur perlu dijaga supaya tetap bersih dan bebas dari debu, terutama karena adanya
pertukaran udara dalam wadah kutur dengan udara dalam ruang kultur. Supaya dapat
24
terjadi pertukaran udara yang bebas dari debu, maka diperlukan terjadinya aliran
uadar yang bertekanan dari dalam ke luar karena tanaman in vitro sangat peka
terhadap polusi, gas-gas dan lain-lain (Gunawan, 2007).
f. Zat Pengatur Tumbuh (ZPT)
Tubuh tanaman terdapat hormone tumbuh yaitu senyawa organic yang
jumlahnya sedikit dan dapat merangsang ataupun menghambat berbagai proses
fisiologi tanaman. Tubuh tanaman terdapat senyawa organic yang jumlahnya hanya
sedikit, sehingga diperlukan penambahan hormone dari luar. Hormon sintesis yang
ditambahkan dari luar tubuh tanaman disebut zat pengatur tumbuh.
Perbanyakan melalui kultur jaringan merupakan upaya untuk memecahkan
masalah tersebut. Salah satu komponen yang menentukan pola pertumbuhan tanaman
pada kultur jaringan adalah zat pengatur tumbuh. Zat pengatur tumbuh atau hormon
tumbuh menggunakan kelompok hormone sitokin dan auksin. Zat pengatur tumbuh
yang berfungsi untuk pertumbuhan tanaman maupun pembentukan anakan serta
perpanjangan akar tergelong kedalam kelompok auksin, diantaranya Indole Acetic
Acid (IAA), 2,4-D (Dichlorophenoxyacetic acid) . Zat pengatur tumbuh yang
berperan dalam menstimulasi pembelah sel, menginduksi pembentukan tunas dan
poliferasi tunas aksiler termasuk golongan sitokin, contohnya Benzyl amino purun
(BAP) dan Thidiazuron (TDZ) (Suryowinoto, 1996)
Zat pegatur tumbuh adalah senyawa organik kompleks alami yang disentesis
oleh tanaman tingkat tinggi, yang berpengaruh pada pertumbuhan dan perkembangan
tanaman. ZPT yang sering digunakan pada kultur jaringan yaitu ausin dan sitokinin.
Konsentrasi auksin lebih besar dari pada sitokin menyebabkan akar akan tumbuh, dan
bila konsentrasi sitokin lebih besar dari pada auksin maka tunas akan tumbuh.
Interaksi dan perimbangan antara zat pengartur tumbuh yang di berikan dalam media
dan yang diproduksi oleh sel secara endogen, menentukan arah perkembangan suatu
kultur (Gunawan, 1995).
mempengaruhi keberhasilan kultur jaringan. Salah satu faktor berpengaruh adalah zat
pengatur tumbuh, yaitu merupakan senyawa organik bukan hara, yang dalam jumlah
25
sedikit dapat mendukung, menghambat, dan dapat mengubah proses fisiologi
tumbuhan. Fungsi ZPT tersebut adalah untuk merangsang pertumbuhan morfogenis
dlam kultur sel, jaringan, dan organ (Purwani, dkk., 2012).
Sitokinin adalah jenis ZPT yang sering digunakan dalam kultur jaringan berupa
BAP dan TDZ , karena lebih tahan terhadap degradasi dan harganya lebih murah.
Penggunaan Zat Pengatur Tumbuh tersebut bila digunakan dengan konsentrasi rendah
akan merangsang dan mempercepat proses pertumbuhan tanaman, dan sebaliknya
bila digunakan dalam jumlah besar/ konsentrasi tinggi akan menghambat
pertumbuhan bahkan dapat mematikan tanaman (Raharja, 1990).
Hormon tumbuhan adalah zat pengatur yang dibuat dalam bentuk tubuh tumbuh-
tumbuhan sendiri dan dalam konsentrasi rendah dapat mengatur proses-proses
fisologis pada tumbuhan. Secara alamiah hormone tumbuhan dibuat dalam tubuh
tumbuhan itu sendiri. Kemajuan ilmu kimia menyebabkan orang mengenal susunan
molekul hormone tumbuhan, sehingga hormon tumbuhan dapat dibuat secara sintesis
(Raharja, 1990).Zat pengatur tumbuh dapat dibagi menjadi beberapa golongan, yaitu
golongan auksin, sitokinin, dan giberelin.
Auksin adalah salah satu hormon tumbuh yang tidak terlepas dari proses
pertumbuhan dan perkembangan suatu tanaman. Pengaruh auksin terhadap
perkembangan sel menunjukkan adanya indikasi bahwa auksin dapat menaikkan
tekanan osmotik, meningkatkan sintesa protein, menigkatkan permeabilitas sel
terhadap air, dan melunakkan dinding sel yang diikuti menurunnya tekanan dinding
sel sehingga air dapat masuk kedalam sel yang disertai dengan kenaikan volume sel
(Hendaryono,1994 dalam Purwani dkk, 2012).Zat pengatur tumbuh yang tergolong
dalam kelompok auksin adalah 2.4 Dichlorophenoxyacetic acid (Rahardja, 1990).
Sitokinin merupakan nama kelompok hormon tumbuh yang sangat penting
sebagai pemacu pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur jaringan. Bentuk dasar
dari sitokinin adalah “adenin” (6-amino purin). Adenine merupakan bentuk dasar
yang menentukan terhadap aktivitas sitokinin. Panjang rantai dan hadirnya suatu
double bond senyawa sitokinin. Panjang rantai dan hadirnya suatu double bond
senyawa sitokinin, akan meningkatkan aktivitas zat pengatur tumbuh ini (Abidin,
26
1985 dalam purwani dkk, 2012). Giberelin diketahui berkat penyelidikan seorang ahli
patologi tumbuhan Jepang bernama Kurosawa, terhadap padi yang terserang penyakit
bakanae.Padi yang terserang bakanae tumbuh raksasa, tetapi produksi buahnya
berkurang. Penyakit bakanae disebabkan oleh jamur yang dalam fase seksual disebut
Giberella Fujikurii dan dalam fase aseksual disebut Fusarium moniliformae. Jamur
tersebut menghasilkan zat yang akhirnya disebut giberelin (Rahardja, 1990).
Asam amino merupakan bagian struktur protein dan menentukan banyak sifatnya
yang penting. Glisin merupakan asam amino pertama yang telah diisolasi dari
hidrolisat protein, sedangkan treonin adalah asam amino pembentuk protein yang akh
ir dapat diisolasi, yaitu dari hidrolisat fibrin . Ke-20 macam asam amino yaitu Alanin,
Asparagin, Asam aspartat , Sistein, Glutamin, Asam glutamate, Glisin , Histidin,
Isolesin, Lesin, Metionin, Fenilalanin, Prolin , Serin, Treonin, Triptofan, Tirosin,
Valin, Lisin, Yeast eksract. Penelitian ini menggunakan tiga jenis asam amino
diantaranya sebagai berikut :
Asparagin adalah analog dari asam aspartat dengan penggantian gugus karboksil
oleh gugus karbosamid. Asparagin bersifat netral (tidak bermuatan) dalam pelarut air.
Asparagin merupakan asam amino pertama yang berhasil diisolasi. Namanya diambil
karena pertama kali diperoleh dari jus asparagus. Fungsinya diperlukan oleh sistem
saraf untuk menjaga keseimbangan dan dalam transformasi asam amino, berperan
pula dalam sintesis aminia.
Glutamin merupakan bagian penting dari asmilasi nitrogen yang berlangsung
pada tumbuhan. Ammonia yang diserap tumbuhan atau hasil reduksi nitrit diikat oleh
asam glutamate menjadi glutamine dengan bantuan enzim glutamin sintetase atau GS.
c. Yeast Ekstract
Yeast extract adalah bahan alami yang terbuat dari yeast saccharomyces
cerevisiae. Yeast jenis ini biasa dipakai untuk membuat roti, bir, wine. Dalam
pembuatan yeast extract ditambahkan enzim untuk memecah protein dan
menguraikan dinding sel ragi menjadi komponen-komponen kecil. Singkatnya, yeast
27
extract terdiri dari protein, asam amino, karbohidrat, vitamin dan mineral yang adalah
isi sel ragi.
2.3. Kalus
Kalus adalah suatu kumpulan sel amorphous yang terjadi dari sel-sel jaringan
awal yang membelah diri secara terus menerus dalam keadaan in vivo, kalus pada
umumnya terbentuk pada bekas-bekas luka akibat serangan infeksi mikroorganisme:
Agrobacterium tumefaciens, gigitan atau tusukan serangga dan nematoda. Kalus juga
dapat terbentuk sebagai akibat serangan bakteri Agrobacterium tumefaciens sering
disebut sebagai tumor (Gunawan,1992).
Kultur kalus bertujuan untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan
ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali. Kalus diharapkan memperbanyak dirinya.
(massa selnya ) secara terus menerus. Sel-sel penyusun kalus adalah sel-sel
parenkhim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain. Dalam kultur
in vitro, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang telah steril dalam media
yang mengundang auksin dan kadang-kadang juga sitokinin. Bila eksplan yang
digunakan mengandung kambium, maka kalus dapat terbentuk tanpa perlakuan zat
pengatur tumbuh. Pembentukan kalus pada eksplan yang ada kambium ini serupa
dengan kejadian pencangkokan dan penyetekan (Gunawan,1992).
Berdasarkan kebutuhannya akan zat pengatur tumbuh untuk membentuk kalus.
Jaringan tanaman digolongkan dalam 4 grup (Gunawan,1992) :
a. Jaringan tanaman yang membutuhkan hanya auksin selain gula dan garam-garam
mineral untuk dapat membentuk kalus seperti : umbi artichoke.
b. Jaringan yang memerlukan auksin dan sitokinin selain gula dan garam-garam
mineral seperti : empulur tembakau.
c. Jaringan yang tidak perlu auksin dan sitokinin, gula dan garam-garam mineral
seperti : parenkhima xylem dari akar turnip.
Pada umumnya, kemampuan pembentukan kalus dari jaringan tergantung juga
dari:
28
c. Bagian tanaman yang dipakai
d. Jenis tanaman.
Kalus dapat diinisiasi dari hampir semua bagian tanaman, tetapi organ yang
berbeda menunjukkan kecepatan pembelahan sel yang berbeda pula. Jenis tanaman
yang menghasilkan kalus meliputi dikotil berdaun lebar , monokotil gymnospermae,
dan pakis. Bagian tanaman seperti embrio muda, hipokotil, kotilidon, dan batang
muda, merupakan bagian yang mudah untuk dediferensiasi dan menghasilkan kalus.
Suatu sifat yang diamati dalam jaringan yang membentuk kalus adalah bahwa
pembelahan sel tidak terjadi pada semua sel dalam jaringan asal, tetapi hanya sel di
lapisan periphery yang membelah terus-menerus, sedangkan sel-sel di tengah tetap
quiescent. Inisiasi pembelahan sel yang hanya terbatas di lapisan luar dari jaringan
berkemungkinan di sebabkan oleh faktor-faktor (Gunawan, 1992) :
a. Ketersediaan oksigen yang lebih tinggi .
b. Keluarnya gas CO2.
d. Penghambat yang bersifat folatik lebih cepat menguap.
e. Cahaya
Dalam mempelajari pembentukan kalus sebagai akibat perlukaan, mengamati 4
lapisan sel yang berbeda dalam wortel yang dikultur pada berbagai media. Lapisan-
lapisan sel yang berbeda terlihat jelas tiga hari setelah kultur terdiri dari (Gunawan,
1992) :
b. Lapisan kedua terdiri dari dua lapisan sel dorman.
c. Lapisan dengan sel yang aktif membelah, terdiri dari 1-6 lapis.
Induksi Kultur kalus dapat dihasilkan dari sejumlah besar organ tanaman yang
beragam seperti akar, tunas, dan daun, atau tipe spesifik sel seperti endosperm dan polen.
Untuk inisiasi kalus, secara aseptik transfer eksplan ke dalam media semi solid dan
secara halus menekan eksplan ke dalam medium agar sehingga tercipta suatu kontak
29
yang baik. Produksi kalus pada medium agar juga dapat diinduksi dengan penggunaan
auksin tunggal, seperti 2,4-D. Walaupun begitu penambahan sitokinin ke medium juga
dapat mendorong proliferasi tunas. Suatu kombinasi konsentrasi auksin yang tinggi dan
konsentrasi sitokinin yang rendah dapat mendorong terbentuknya kalus. Kalus
morfogenik yang dihasilkan tanaman tahunan sering menginginkan penggunaan organ sel
yang aktif secara mitotic seperti tunas pucuk ataupun bagian meristem yang diisolasi .
Pemanfaatan teknik kultur jaringan dengan kultur kalus adalah salah satu cara untuk
menghasilkan senyawa metabolit sekunder. Pengaruh ZPT dalam pembentukan kalus
telah banyak dibuktikan oleh banyak hasil penelitian, selain itu pengaruh ini juga telah
terbukti dalam produksi metabolit sekunder (George dan Sherrington) 1984. Eksplan
yang telah dipilih dan diisolasi dari tanaman induk dikulturkan dalam medium semi padat
yang ditambahkan auksin dengan konsentrasi yang relatif cukup tinggi, dengan atau
tanpa sitokinin. Kalus yang terbentuk selanjutnya dipindahkan ke medium dengan auksin
rendah untuk merangsang pembentukan struktur yang terorganisir. Tunas dan akar akan
terbentuk dari bagian meristematik, pada bagian permukaan dari kalus. Sebelum
dilakukan regenerasi kalus, kadangkala dilakukan pemecahan kalus untuk dikulturkan ke
medium baru dengan tujuan meningkatkan pembelahan sel. Apabila kalus sudah
mencukupi, kemudian diregenerasikan membentuk tunas. Perbanyakan tanaman melalui
kalus ini akan menghasilkan tanaman dengan genetik yang bervariasi (Wattimena 1992).
Kalus primer merupakan kalus yang terbentuk dari eksplan pada tahap inisiasi.
Kalus embriogenik umumnya diperoleh dari embrio benih, nuselus, atau jaringan
meristematik lainnya seperti primordia bunga. Kalus umumnya mudah terbentuk pada
media semi padat dengan tambahan auksin pada konsentrasi yang relatif tinggi, salah satu
yang banyak digunakan adalah 2,4-D. Perkembangan kalus menjadi embriogenik tidak
memerlukan auksin dan bahkan dapat menghambat pada beberapa jenis jaringan yang
memiliki kemampuan embriogenetik tinggi.
Kalus yang dihasilkan ada yang memiliki kemampuan embriosomatik dan ada yang
sama sekali tidak memiliki kemampuan morfogenetik karena eksplan yang dikulturkan
juga mengandung sel atau jaringan yang mampu mengadakan morfogenesis (disebut
sebagai sel yang kompeten) dan ada yang tidak (sel tidak kompeten). Sel yang kompeten
menjadi sel embriogenik ini bergantung pada kesesuaian medium yang digunakan
30
terutama jenis dan konsentrasi ZPT yang tepat. Faktor genotipe secara keseluruhan
mempengaruhi pola pembentukan organ adventif dari kalus. Kemampuan membentuk
tunas dan akar secara terpisah atau embriogenesis dari kalus berbeda antar famili maupun
generasi. Pembentukan embrio (embriogenesis) dan pengembangan dari embrio pada
umumnya memerlukan taraf auksin yang berbeda. Embrio terbentuk dari sel meristematic
yang mempunyai isi sitoplasma yang penuh (tanpa vakuola).