Jure Stojan4. predavanje

Inhibicija - aktivacija - modulacija encimske katalizehitre kinetične metodematematično modeliranje - analiza podatkov

Inhibicija - aktivacija - modulacija

1 Reverzibilna• kompetitivna• nekompetitivna• akompetitivna

• mešana

so pojavi pri katerih snovi spremenijo encimsko aktivnost.Običajno uporabljamo izraz “encimski inhibitorji”. Kadarsnov aktivira delovanje encima to posebej povemo.

2 Ireverzibilna

1-2 Inhibicija z analogi prehodnega stanja• počasna vezava• tesna počasna vezava

3 Inhibicija - aktivacija - agregacija - inaktivacija s kovinskimi ioni

Kompetitivna inhibicija

E + S+I

ES E + P

EI

Km kcat

Ki

Afiniteta za inhibitor podobna tisti za substrat: mM

Nekompetitivna inhibicija

E + S+I

ES + I

E + P

EI + S

Km kcat

Ki

EIKiKm

Afiniteta za inhibitor: µM

Akompetitivna inhibicija

E + S ES + I

E + PKm kcat

EIKi

Afiniteta za inhibitor: µM

Mešana in parcialna inhibicija

E + S+I

ES + I

E + P

EI + S

Km kcat

Ki

EIKiiKmm

E + Pakcat

Mešana: Km = Kmm

Parcialna: a = 1

velja: Km /Kmm = Ki/Kii

Afiniteta za inhibitor: µM

Katalitična triada

Trp84

VHOD

Acetilholinesteraza iz kalifornijskega električnega skata - TorcaAChE - 1EA5

Pseudozoantoksantin

Donepezil

Tacrine Galantamin-i

Hup(rez)in-i

Dekametonij

analog prehodnegastanja (TMTFA)

Trp84

Dekametonij Acetiltioholin

Trp84

Ireverzibilna inhibicija

E + S+I

ES E + P

EI

Km kcat

kI

Dializni poskus !

katalitični strupi, ki se kovalentno vežejo z amino kislinami v aktivnem mestu

Afiniteta za inhibitor: neskončna

Ireverzibilna inhibicija

Trp84

Ala279

BTCh

Ser200-soman

ACh

vhod v akivno mesto

človeška butirilholinesteraza - HuBChE

Hitre kinetične metode in analiza podatkov

1. O hitrih kinetičnih metodah - mešalne-pretočne tehnike: continous flow, stopped flowzmešamo, opazujemo nastajanje ravnotežnih ali stacionarnih stanj

- relaksacijske tehnike: temperaturni skok T-jump, fotoliza, pressure jump, ultrazvok, električno polje zmotimo, opazujemo vračanje sistema v ravnotežno stanje

Hitre kinetične metode in analiza podatkov

continous flow - metoda stalnega pretoka

Hitre kinetične metode in analiza podatkov

stopped flow - metoda nenadne prekinitve pretoka

stopped flow - izpeljave - gašenje

Hitre kinetične metode in analiza podatkov

Temperaturni skok T - jump

Hitre kinetične metode in analiza podatkov

Fotoliza z bliskavico - flash photolysis

Hitre kinetične metode in analiza podatkov

Hitre kinetične metode in analiza podatkov

2. Analiza podatkov - matematično modeliranje: je večstopenjski postopek, s katerim želimo matematičnoformulirati zaporedje dogodkov v poteku biokemične reakcijeali zaporedja reakcij.

Rezultat so eksplicitne ali diferencialne enačbe,skupaj z njihovimi parametri, ki hkrati popisujejo podatkeiz različnih kinetičnih poskusov.

Hitre kinetične metode in analiza podatkov

Proučevanje začetnih hitrosti:1. ravnotežna in stacionarna predpostavka, (E)

Webb's model

0.0 2.5 5.0

log [S]

Activ

ity

E KS

ES

kcatP1

DSCSSBSAv++

+=][][

][][2

2

ES

SpES

SKP

PS

PS

MAXP

MAX

KKDKKC

VKBaVA

=+=

==

SpE a kcat

P1

( )( ) ( )PS

PMAX

KSKSSaKSVv

+++=][][

][][

KPS

SpES

KS

> solve( {A=a*Vmax, B=Kp*Vmax, C=Ks+Kp, D=Kp*Ks}, {Ks,Kp,a,Vmax} );

, , , = Ks − C ( )RootOf − + D _Z C _Z 2 = a

A ( )RootOf − + D _Z C _Z 2

B = Kp ( )RootOf − + D _Z C _Z 2 = Vmax

B

( )RootOf − + D _Z C _Z 2

- grafični prikazi, klasična kinetična analiza, konstrukcija mehanističnih shem - izpeljava enačb in določitev kinetičnih parametrov - ločitev med konkurenčnimi modeli

Hitre kinetične metode in analiza podatkovHomotropična parcialna nekompetitivna inhibicija - substratna inhibicija

Hitre kinetične metode in analiza podatkov

EZ ZE k-ik+iSLOW

Kp

KiL

SEZ

E-free SE

SES

ES

SEA

EA

SEAS

EAS

Kp

Kp

Kp

Kp

KLL

KL

bk2

k2 k3

ak3

P1

P1 P2

P2

Trp84

Trp279

Neproduktivno vezanje - nonproductive binding

Matjaž Zorko5. predavanje

Ponovitev predavane snovi

Kolokvij 1

Slide 1Slide 2Slide 3Slide 4Slide 5Slide 6Slide 7Slide 8Slide 9Slide 10Slide 11Slide 12Slide 13Slide 14Slide 15Slide 16Slide 17Slide 18Slide 19Slide 20Slide 21Slide 22Slide 23Slide 24