Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Elemente de

Inginerie Metabolica Celulara

Profesor Dr. Ing. Gheorghe MARIA

Denumirea programului de studii: Chimie Alimentara

An:…2.. Sem:…3….

Adresa de contact: Universitatea Politehnica din Bucuresti, Catedra de

Inginerie Chimica si Biochimica, Str. Polizu 1, Bucuresti

E-mail: gmaria99m@hotmail.com

Tel: (021) 402 3903

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Cuprins

1. Notiuni introductive privind domeniul ingineriei metabolice celulare.

1. Formalizarea reactiilor biochimice (stoichiometrie si viteze de reactie

biochimice).

2. Modele de crestere celulara si de analiza a metabolismului celular.

3. Utilizarea bazelor de date biochimice celulare.

4. Fluxomica, analiza controlului metabolic si reglarea celulara.

5. Modele dinamice de reprezentare a procesele metabolice celulare.

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Continutul cursului

• Cap 1. Notiuni introductive privind domeniul ingineriei

metabolice celulare.

• 1.1 Structura celulelor procariote si eucariote.

• 1.2. Rolul principalilor componenti metabolici (aminoacizi, proteine,

DNA, RNA, etc.)

• 1.3. Ciclul celular. Sinteza principalelor componente celulare. Tehnici

de modificare genetica si de clonare a genelor si implicatii

industriale.

• 1.4. Metabolismul celular (carbohidrati, lipide, proteine).

• 1.5. Respiratia si eliberarea de energie celulara

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Structura celulelor procariote Structura celulelor eucariote

- Componenti metabolici:

aminoacizi, proteine,

enzime, anticorpi,

membrane, hormoni,

DNA, RNA, etc.

-- Structura proteinelor

Proiect POSDRU ID 56711

Stru

ctura

pro

tein

elo

r

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

- Ciclul celular. Sinteza principalelor componente celulare

- Sinteza (Replicarea) DNA

i1n

2Mg ,polimerazaDNA fragmenten PP (DNA) dNTP (DNA) + →+ +

+−

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

- Sinteza (Replicarea) RNA

- Metabolismul zaharidelor (Glicoliza, Glucogeneza, Metabolismul

Glicogenului).

- Metabolismul acizilor grasi, grasimilor si al colesterolului.

- Respiratia si eliberarea de energie (ciclul acidului citric si

fotosinteza).

- Metabolismul aminoacizilor (ciclul acidului uric).

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Continutul cursului

• Cap 2. Formalizarea reactiilor biochimice (stoichiometrie si

viteze de reactie biochimice).

• 2.1. Stoichiometria reactiilor biochimice celulare (determinare

experimentala).

• 2.2. Formalizarea reactiilor biochimice.

• 2.3. Factorii de dependenta ai vitezei de reactie biochimice.

• 2.4. Echilibrul chimic. Conceptul de stari stationare (homeostaza

celulara). Aplicatii.

• 2.5. Evaluarea stoichiometriei proceselor metabolice celulare

(studiu de caz - metabolismul central al Saccharomyces cerevisiae la

fermentatia alcoolica).

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Studiu de caz - metabolismul central al Saccharomyces

cerevisiae la fermentatia alcoolica).

Proiect POSDRU ID 56711

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

KEGG result: Metabolismul central al Saccharomyces cerevisiae

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Continutul cursului

Cap 3. Modele de crestere celulara si de analiza a metabolismului

celular.

• 3.1. Clasificare modele de crestere celulara.

• 3.2. Modele cinetice nestructurate, nesegregate pentru reprezentarea

proceselor enzimatice si biologice (Michaelis-Menten, Monod, etc).

• 3.3. Modele cinetice nestructurate, segregate pentru reprezentarea

cresterii celulare.

• 3.4. Modele cinetice structurate, nesegregate, pentru reprezentarea

sintezelor celulare.

• 3.5. Modele cinetice structurate, complexe, pentru simularea

metabolismului celular.

• 3.6. Interactiuni intre celule. Modele de competitie si selectie in

sisteme biologice (Biologie Sistemica).

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Continutul cursului

Cap 3. (continuare)

• 3.7. Procese metabolice oscilatorii. Ciclul celular.

• 3.8. Elemente de proiectare a micro-organismelor modificate genetic

OMG (Biologie Sintetica). Aplicatii.

• 3.9. Exemple de utilizare a simulatoarelor celulare pentru

caracterizarea metabolismului organismelor de Saccharomyces

cerevisiae, Escherichia coli, Pseudomonas putida.

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Modele

de populaţii

celule

nesegregate (celule identice, reacţionează identic

la condiţiile de mediu)

segregate (lucrează cu clase de celule, deosebite

după anumite criterii)

Modele

nestructurate (celulele nu se deosebesc între ele prin

vârstă, caracteristici fiziologice; nu se

modelează procesele interne)

structurate (celulele sunt analizate în detaliu, prin modele

compartimentate / modulare, extinse / reduse,

inclusiv procesele de biosinteză, bioreglare,

transfer de masă intra-celular)

=↑↑

n

2ttanmu

2

1ttanmu

1 X,,X,XX

L

K

=↑↑

S

2componenta

2

1componenta

1 C,,C,CX

L

K

tultanmu

CCC

CCC

X

nS2n1n

S11211

specia

↓

=

→

L

LLLL

L

celulă

X

S P

model nestructurat

I1

I2

RS P

model structurat

(X = R + I1 + I2)

Clasificare modele celulare

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

- Selectivitatea proceselor enzimatice

- Mecanismul de actiune al enzimelor

(“cheie-lacat” si “geometrie indusa”)

- Depententa de pH si Temperatura

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Reprezentarea grafica a

dependentei vitezei de reactie

enzimatice (Michaelis-Menten) cu

concentratia de substrat.

Sm

Smax

S1

21

SE2

SE2C

CK

CV

Ck

kk

CCkCk

dt

dV

0P

+

⋅=

++

⋅⋅=⋅==

−

Linearizarea Lineweaver-Burk

pentru o cinetica de tip Michaelis-

Menten

Cinetica enzimatica simpla

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Cinetica enzimatica - Inhibiţia competitiva

( )

'1

/11

S

S

I

I

II

S

S

S

EISES

K

K

K

C

KC

C

K

CkCCkr

⋅+

+⋅+

⋅=+⋅=

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Cinetica enzimatica - Inhibiţia necompetitiva

( )

Im

IS

I

I

m

S

TSm

KK

CC

K

C

K

C

ECKkr

⋅

⋅+++

⋅⋅=

1

/2

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Cinetica enzimatica - Inhibiţia incompetitiva

m

I

I

S

S

KK

CC

CVr

+

+⋅

⋅=

1

max

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Cinetica enzimatica – Inhibiţia mixta si alosterica

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Tip interacţieOrganism

A B

Neutralism 0 0

Comensalism 0 +

Naturalism + +

“Vânător – pradă” + -

“Vânător – pradă” - +

Amensalism 0 -

Amensalism - 0

Competitiv - -

Tipuri de interacţii între reactii biochimice si intre celule vii

(+) efect benefic, pozitiv; (-) efect negativ;

(0) efect neutru.

Neutralism S1 A

S2 BComensalism

S2 P (+)

S1 S2(0)

B

AS2 P2

(0)

S1 P1(+)B

A

(nitrificare, digestie

anaerobă metanogenare)

Mutualism

AS2 P2(+)

S1 S2(+)

B

S1 + PB PA(+)

S2 + PA PB(+)B

A

“Vânător-pradă”

S A (-)

A B(+)B

A

Amensalism

S2 PA (-)

S1 PB(0)B

A

Competiţie

S

PA(-)

PB(-)

A

B

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

X

Y

t

Y

Modele de competitie Lotka-Volterra (sisteme oscilante)

−=

−=

dYYXctd

Yd

YXbXatd

Xd

Modele segregate de crestere celulara (Leslie)

( )( )( )

( )

( )

( )

( )

β

β

α

=

=

−−

+

=∑

01n1n

011

pk

ki

0ii

1n

12

11

1

tx

tx

tx

tx

tx

tx

tX

LL

β

β

ααα

=

++

0000

0000

0000000

0000000

00000

2

1

pk1kk

LLLLL

LLLLL

LLLLLLLLL

L

L

L

L

( ) ( )1kk tt −⋅= XLX

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Simulator celular de tip Electronic-Cell (M. genitalium; Tomita et al., 2001)

Sunt incluse principalele procese metabolice:� transport ionic;� glicoliza;� fermentatie acid lactic (ciclul Krebs);� degradare/sinteza grasimi;� biosinteza fosfo-lipide;� transcrierea genetica;� sinteza proteine/aminoacizi;� sinteza ansamblu ribozom + polimeraza;� degradare proteine;� degradare mRNA.

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Simulator celular de tip Virtual-Cell (Hucka et al., 2003)

•• ElementeleElementele unui model “V-Cell”:

• specii (ATP, Ca2+ etc.);

• reactii (ex.: enzimatice, legare

receptor, fluxuri membranare);

• structuri (ex.: RER, citosol etc.)

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Simulator celular stocastic de tip M-Cell (Bartol & Stiles, 2002)

Platforma „M-Cell” include:

- construcţia sistemului prin includerea moleculelor de

ligand, parametrii de difuzie;

- definirea reacţiilor posibile;

- definire: Liganzi, Efectori, Reacţii, Suprafeţe 3D, Restricţii

(limbaj MDL-Biologically oriented);

- crearea de „obiecte de simulat” ;

- soluţionarea (simularea numerica) obiectelor;

- prezentarea rezultatelor în formă numerică şi vizuală.

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Continutul cursului

Cap 4. Utilizarea bazelor de date biochimice celulare.

• 4.1. Baze de date biochimice celulare: genomica, proteomica,

metabolomica, fluxomica.

• 4.2. Reprezentarea topologiei reactiilor metabolice: grupare si

modularizare.

• 4.3. Cuplarea bancilor de date biochimice cu tehnicile de modelare

celulara. Aplicatii.

• 4.4. Utilizarea bazelor de date EcoCyc, KEGG, Brenda, etc.

• 4.5. Exemplu - Simularea sintezei celulare a PHB (acid poli-beta-hidroxi-

butiric) in celula de Escherichia coli.

• 4.6. Modele cinetice simple privind reglarea homeostatica a sintezei

proteinelor (exemple cu aplicatii industriale).

Proiect POSDRU ID 56711

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Baza de date E. Coli cell (EcoCyc)( http://ecocyc.org/ )EcoCyc is a scientific database for the bacterium Escherichia coli K-12

MG1655.

The EcoCyc project performs literature-based curation

of the entire genome, and of transcriptional regulation, transporters,

and metabolic pathways.

EEcoCyc gene/protein pageTTranscription-unit pageTTranscription-factor pageGGenome browserPPathway pageRReaction pageCCompound pageTTransport-reaction page

Transporter pageMetabolic map diagramRegulatory network diagram

©2011 SRI International, Menlo Park, CA 94025-3493

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Baza de date BRENDA (http://www.brenda-enzymes.org/ )

The Comprehensive Enzyme

Information System

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Baza de date KEGG (http://www.genome.jp/kegg/ )

KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

Main entry point to the KEGG web service

Data-oriented entry pointsKEGG pathway maps BRITE functional hierarchies KEGG modules

Human diseases[Cancer | Infectious disease]Drugs [ATC drug classification]Ortholog groups [KO system]Genomes [KEGG organisms]Genes and proteins

Chemical informationHealth-related information for wider society

Organism-specific entry pointsKEGG OrganismsAnalysis toolsKEGG PATHWAY - mapping toolsNavigation tool to explore KEGG mapsKEGG automatic annotation serverSequence similarity searchChemical structure similarity search

Biodegradation/biosynthesis pathway prediction

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Baza de date CellML-JWS(http://jjj.biochem.sun.ac.za/ ). Ex. Glicoliza in

E. coli

CellML: simulator metabolism celular de baza

Main entry points:

- alege organism- Alege subsistemul metabolic celular

Rezultate:

- Fluxuri metabolice- Coeficienti MCA

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Continutul cursului

Cap 5. Fluxomica, analiza controlului metabolic si reglarea

celulara.

• 5.1. Analiza de bilant a fluxurilor metabolice celulare (FBA).

Optimizarea fluxurilor metabolice celulare cu scop industrial.

• 5.2. Analiza Controlului Metabolic (MCA) cu aplicatii la realizarea de

organisme modificate genetic cu importanta in industria alimentara si

de biosinteza.

• 5.3. Retele de reglare genetica celulara (modele de tip circuit logic).

• 5.4. Evaluarea fluxurilor metabolice celulare in regim stationar (studiu

de caz - metabolismul central al Saccharomyces cerevisiae la

fermentatia alcoolica).

• 5.5. Exemplu - Simularea metabolismului celular al Ferului cu asimilatie

mitocondriala (in celule eucariote).

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Bilantul / optimizarea fluxurilor

metabolice celulare

Metabolismul central al

Escherichia coli

(dupa Maria et al., 2011) →→→→

( )

( )

===π

α=⋅

=α⋅−=

∑∑.const

jC

1

,jC

1TR

k,Ctd

Vd

V

1

m,,1j,Ck,Ctd

Cd

j0

jjj

Kf

La homoestaza:

[ ] biomassM1 v Maxargv,...,v == Φ

∑ ==

M

1jjij 0vS max,jjmin,j vvv ≤≤

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Retele de reglare genetica celulara

PG GP

M

P

P

MP

P

MPP 3P

P

MPPP

Module G(P)1;M(P)3

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Switch genetic bistabil (modelul Jacob-Monod de biosenzor)

−+

=

−+

=

22m12

22

11m21

11

PqPB

A

td

Pd

PqPB

A

td

Pd

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

• use cascade control, multiple effectors

• allosteric enzyme activity control

Cope with complexity

& synchronization

Dyn

Senz

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Ex. Simulare metabolism Fe in miotocondrie (Hudder, Maria, 2002)

[Fe]env

k1[Fe]Cy

[Fe]mit

k2

k4

[Hem]mit

k3

(S)[Fe/S]mit

k6

k5

Mitochondria

[Fe/S]Cy Cytosol

[Hem]Cy

[Fe]env

k1[Fe]Cy

[Fe]mit

k2

k4

[Hem]mit

k3

(S)[Fe/S]mit

k6

k5

Mitochondria

[Fe/S]Cy Cytosol

[Hem]Cy

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Continutul cursului

Cap 6. Modele dinamice de reprezentare a procesele metabolice

celulare.

• 6.1. Elemente de teoria oscilatiilor in procese biochimice.

• 6.2. Procese metabolice oscilatorii. Ciclul celular. Aplicatii.

• 6.3. Testarea modelelor cinetice nestructurate pentru procese oscilante de biosinteza celulara (studiu de caz - o etapa a procesului de glicoliza).

• 6.4. Exemplu - Simularea procesului oscilant de crestere a celulelor de drojdie de bere (model cinetic structurat).

• 6.5. Simularea unor procese enzimatice industriale (studiu de caz biosinteza D-fructozei si a derivatilor sai din D-glucoza).

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Ex. Mecanismul oscilatiilor in sinteza proteinelor

Modelul Goldbeter (1995) pentru ritmurile circadiene. Proteina PER este sintetizata in

citoplasma, unde este succesiv fosforilata. A doua forma fosforilata patrunde in nucleu si

reprima transcrierea genei per.

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Lucrari de laborator de calcul (simulatoare celulare)

1. Evaluarea indicatorilor ce caracterizeaza transformarea biochimica.

2. Evaluarea stoichiometriei proceselor metabolice celulare (studiu de caz - metabolismul central

al Saccharomyces cerevisiae).

3. Evaluarea fluxurilor metabolice celulare in regim stationar (studiu de caz - metabolismul

central al Saccharomyces cerevisiae).

4. Calculul constantei de echilibru si a conversiei de echilibru (bio)chimic.

5. Simularea sintezei celulare a PHB (acid poli-beta-hidroxi-butiric) in celula de Escherichia coli.

6. Simularea metabolismului celular al Ferului cu asimilatie mitocondriala. Simularea raspunsului

celular la perturbatii externe pentru celula normala si cea mutanta. Simularea maladiei de

asimilare defectuoasa a Ferului in celula umana.

7. Modele cinetice simple privind reglarea homeostatica a sintezei proteinelor (exemple cu

aplicatii industriale).

8. Testarea modelelor cinetice nestructurate pentru procese oscilante de biosinteza (studiu de

caz).

9. Simularea performantelor unei reactii consecutive de sinteza biochimica, in sistem oscilant.

Exemplificare pentru o etapa a procesului de glicoliza (Model cinetic structurat).

10. Simularea procesului oscilant de crestere a celulelor de drojdie de bere (model cinetic

structurat).

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Bibliografie

• 1. Stephanopoulos, G.N., Aristidou, A.A., Nielsen, J., Metabolic engineering. Principles and

methodologies, Academic Press, NY, 1998.

• 2. Heinrich, R., Schuster, S., The Regulation of Cellular Systems, Chapman & Hall, New York, 1996.

• 3. The Metabolic Control Analysis Web, The University of Manchester, 2004.

http://dbkgroup.org/mca_home.htm

• 4. Mihail, R., Muntean, O., Lavric, V., Ingineria Proceselor Biochimice, Litografia Institutului

Politehnic Bucuresti, 1988.

• 5. Ofiteru, D., Lavric, V., Woinaroschy, A., Introducere in bioingineria celulelor animale, Ed. Matrix

Rom, Bucuresti, 2003.

• 6. Lavric, V., Ofiteru, D., Woinaroschy, A., Modelarea bioreactoarelor cu celule animale, Ed. Matrix

Rom, Bucuresti, 2004.

• 7. Muntean, O., Bales, V., Meszaros, A., Biochemical Technology, Ed. Printech, Bucuresti, 2003.

• 8. Vallino, J.J., Stephanopoulos, G., Flux determination in cellular bioreaction networks:

Applications to lysine fermentations, In: Frontiers in bioprocessing (Sikdar, S.K., Bier, M., Todd, P.,

Eds.), CRC Press, Boca Raton, 1990.

• 9. Maria, G., Modular-based modelling of protein synthesis regulation, Chemical and Biochemical

Engineering Quarterly 19, 213-233 (2005).

• 10. Maria, G., Application of lumping analysis in modelling the living systems -A trade-off between

simplicity and model quality, Chemical & Biochemical Engineering Q. 20, 353-373 (2006).

Pro

iect

PO

SD

RU

ID

56

71

1

Bibliografie (continuare)

• 11. Maria, G., Modelling bistable genetic regulatory circuits under variable volume framework,

Chemical and Biochemical Engineering Quarterly 21, 417-434 (2007).

• 12. Maria, G., Enzymatic reactor selection and derivation of the optimal operation policy by using

a model-based modular simulation platform, Comput. & Chem. Engineering 36(1), 325–341

(2012).

• 13. Maria, G., Xu, Z., Sun, J., Investigating alternatives to in-silico find optimal fluxes and

theoretical gene knockout strategies for E. coli cell, Chem. & Biochemical Eng. Q. 25(4), 403-424

(2011).

• 14. Maria, G., Ene, M.D., Jipa, I., Modelling enzymatic oxidation of D-glucose with pyranose 2-

oxidase in the presence of catalase, Jl. Molecular Catalysis B: Enzymatic 74, 209-218 (2012).

• 15. Rensing, L., Meyer-Grahle, U., Ruoff, P., Biological timing and the clock metaphor: oscillatory

and hourglass mechanisms, Chronobiology International 18 (2001) 329-369.

• 16. Tyson, J.J., Novak, B., Regulation of the Eukaryotic Cell Cycle: Molecular Antagonism,

Hysteresis, and Irreversible Transitions, J. theor. Biol. 210 (2001) 249-263.