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INFORME FINAL DEL PROYECTOFOR.MED.OZONEComunidad Valenciana(Consolidation du Suivi et des Effets de l’Ozone sur la
Végétation Méditerranéenne pour la Sauvegarde de
l’Environnement et la Sensibilisation des Acteurs Publics,
Interreg IIIb)
Conselleria de Terrirori i HabitatgeGeneralitat Valenciana
Fundación CEAM
Informe elaborado por:
CALATAYUD, Vicent (2)
SANZ, María José (2)
CERVERÓ, Júlia (2)
ARA, Pilar (1)
(1) Sección de Estudios y Planificación Forestal, Conselleria de Territori i
Habitatge, Francisco Cubells 7, 46011 Valencia, España. Tel.: 0034-
963865058
(2) Fundación CEAM, c/Charles R. Darwin, 14, Parque Tecnológico, 46908
Paterna, Valencia, España. Tel.: 0034-961318227.
Con la colaboración en el apartado de Anatomía de:
GARCIA-FREIJO, Francisco (3)
REIG-ARMIÑANA, José (3)
(3) Laboratorio de Anatomía e Histología Vegetal ‘‘Julio Iranzo’’, Jardín Botánico,
Universitat de València, c/Quart, 80, 46008 Valencia, España
INDICE
1.EL OZONO EN EL MEDITERRANEO: PROYECTO FOR.MED.OZONE
2.MEDIDAS DE CONCENTRACIONES DE OZONO CON DOSIMETROS PASIVOS
3. EVALUACION DE DAÑOS POR OZONO EN EL CAMPO
4. EXPERIENCIAS EN CAMARAS DE TECHO DESCUBIERTO (OPEN TOP CHAMBERS)
5. CARACTERIZACION DE DAÑOS PRODUCIDOS POR OZONO EN HOJAS DE DIVERSAS
ESPECIES CON EL MICROSCOPIO OPTICO
6. RESUMEN DE RESULTADOS
1. EL OZONO EN EL MEDITERRANEO: PROYECTO FOR.MED.OZONE
1.1. GENERALIDADES
El Mediterráneo es una área crítica para la formación de fotooxidantes. Es una zona
densamente poblada (abundan por tanto los precursores del ozono) y la intensa radiación
solar, las altas temperaturas y los procesos de recirculación de las masas de aire
contaminadas favorecen la formación de este contaminante. Por el contrario, en el norte de
Europa, los frentes atlánticos renuevan el aire con más frecuencia, eliminando el ozono. De
esta forma, existe un gradiente de concentraciones de norte a sur de Europa.
Aunque los niveles de ozono locales dependen de multitud de factores (p.e. distancia
de las fuentes de emisión, transporte, climatología, etc.), es frecuente encontrar una relación
con la altitud. En diversas zonas del mediterráneo, se ha comprobado que la concentraciones
medias de ozono aumentan con la altura. Esto se explica en parte por los diferentes ciclos
diarios del ozono.
Como ejemplo, en valles a poca altitud del este de España, los niveles de ozono son
más elevados a mediodía y por la tarde, disminuyendo notablemente por la noche. Esta
disminución es debida a que el ozono, al ser una molécula muy reactiva, se destruye al entrar
en contacto con las superficies (incluyendo la vegetación, hojas, etc), y a que por la noche no
se genera nuevo ozono, ya que las reacciones fotoquímicas necesitan de la luz para que
ocurran. Por el contrario, en zonas elevadas, los niveles nocturnos de ozono pueden ser
relativamente altos. Estas zonas suelen estar alejadas de los focos de emisión de algunas
moléculas que reaccionan con el ozono destruyéndolo (p.e. el NO que emite el tráfico) y
pueden estar inmersas en los estratos de reserva, ricos en ozono.
Figura 1.1. Ciclo diario promedio del año 2003 entres estaciones de medida de la ComunidadValenciana: las dos localidades a menor altitud(Penyeta, S. Jordi) presentan ciclos diarios conuna disminución acusada de las concentracionesde ozono por la noche, al contrario que lalocalidad a mayor altitud (Morella).
El Mediterráneo es un mar rodeado por montañas. Esta característica favorece la
formación de brisas, que intervienen en procesos de recirculación de las masas de aire y en la
formación de estratos de reserva ricos en ozono. En el este de España, se han documentado
los siguientes procesos en verano:
De día, la brisa transporta los contaminantes desde la costa, donde se encuentran la
mayoría de las fuentes de emisión (ciudades, trasporte, industria) hacia el interior, a lo largo de
los valles abiertos al mar. Durante el transporte, los contaminantes primarios (p.e. óxidos de
nitrógeno, VOCs) intervienen en reacciones fotoquímicas que producen ozono, que se acumula
en altura en "estratos de reserva". Se puede formar una célula convectiva, y estos estratos
retornan en altura hacia el mar, donde se produce una subsidencia. Al día siguiente, los
estratos acumulados sobre el mar, con aire envejecido y rico en ozono vuelven a penetrar por
los valles con la brisa y, a lo largo de los días que dura el proceso de recirculación los niveles
de ozono van aumentando progresivamente.
Figura 1.2. Recarga de los estratos de reserva durante el día y destrucción del ozono por la noche.
1.2. EL PROYECTO FOR.MED.OZONE
En el proyecto For.Med.Ozone (Consolidation du Suivi et des Effets de l’Ozone sur la
Végétation Méditerranéenne pour la Sauvegarde de l’Environnement et la Sensibilisation des
Acteurs Publics, Interreg IIIb) participan varias regiones del sur de Europa: Piamonte y Toscana
(Italia), Comunidad Valenciana (España) y Región de Provence-Alpes-Côte d’Azur (Francia).
Estas tres zonas, por estar muy pobladas e industrializadas (abundancia de precursores) y por
su situación en el Mediterráneo (fuerte radicación solar), presentan una problemática común:
niveles de ozono relativamente altos y daños a la vegetación.
Los objetivos del proyecto son:
• Determinar la distribución espacial del ozono en áreas forestales de las tres regiones,
mediante el uso de dosímetros pasivos.
• Prospectar la distribución de daños visibles en plantas forestales sensibles.
• Caracterizar, describir (a nivel macro- y microscópico), y reproducir en condiciones
controladas (validación experimental) los daños por ozono detectados en campo.
• Creación de criterios unificados de evaluación de daños foliares, y producción de
herramientas y documentación para su evaluación.
• Selección de especies en el área Mediterránea que pueden ser usadas como
bioindicadoras de contaminación atmosférica con posterioridad en la misma.
• Difusión de los resultados tanto en foros científicos como entre los ciudadanos, con la
finalidad de dar a conocer este problema.
2. MEDIDAS DE CONCENTRACIONES DE OZONO CON DOSIMETROS
PASIVOS
Los dosímetros pasivos consisten en un dispositivo que incluye un filtro impregnado
con una sustancia que, al reaccionar específicamente con un determinado contaminante,
produce otro compuesto (p.e. nitrito + ozono --> nitrato). Conociendo el tiempo de exposición, y
la cantidad del productos inicial y final, podemos calcular las concentraciones medias del
contaminante para ese periodo. Para el ozono, los dosímetros se exponen y cambian
normalmente cada 1 o 2 semanas, o cada mes. En el caso del presente proyecto, se ha optado
por periodos de exposición de 2 semanas, ya que permiten detectar bastante bien episodios de
altas concentraciones de este contaminante.
Aunque los monitores aportan una información mucho más detallada sobre las
concentraciones, los dosímetros pasivos son más sencillos, fáciles de instalar, y mucho más
baratos. Al no necesitar electricidad, son especialmente útiles para realizar medidas en zonas
rurales y remotas, como montañas, permitiendo además una cobertura espacial no posible con
los monitores. En la actualidad, por ejemplo, existen diversas redes de dosímetros en zonas
protegidas como parques nacionales de diversos países de Europa y los EEUU.
En la cuenca mediterránea, la dinámica atmosférica a nivel de mesoescala está
fuertemente ligada a la topografía, de forma que en primavera y verano tienen lugar a lo largo
casi todo el año. En base a esta información, se han situado las estaciones de muestreo, que
se encuentran a lo largo de transectos en algunos de los valles de la Comunidad, buscando
desde zonas montañosas de ámbito forestal, hasta situaciones rurales con llanuras fluviales
agrícolas (Valle del Cérvol en el Norte de Castellón) hasta llanuras fluviales donde se combinan
la industria, una gran ciudad y la agricultura intensiva (Valle del Turía), incluyendo también
diferentes condiciones climáticas (p.e. alrededores de la ciudad de Alicante). La situación de
estos transectos en valles más o menos perpendiculares a la costa nos permite disponer
además de varios transectos norte - sur a diferentes distancias de la costa (tabla 2.1, figura
2.1).
Las estaciones de muestreo situadas en Morella, Gandía, Tossal Gros y Coratxar están
ubicadas junto a cabinas de la Red de Calidad del Aire de la Comunidad Valenciana. Se
dispone por tanto de medidas de monitores activos en paralelo para la calibración de los
dosímetros. Algunos puntos de muestreo ya fueron establecidos antes del inicio del proyecto
For.Med.Ozone, y se han mantenido con la finalidad de poseer series largas de medidas con
estos dispositivos. En total hay 14 puntos de medida, desde 2 m de altitud, en pinares costeros
(El Saler, Guardamar), hasta los más de 1000 m del interior de Tossal Gros, Morella, Font Roja
y Coratxar. Sin embargo, en la Comunidad Valenciana existen otros 21 puntos de medida hasta
sumar un total de 35. En los restantes puntos se están llevando a cabo medidas 2003, en el
marco de otro proyecto. Aunque estos datos no están disponibles en la actualidad, es previsible
que cuando finalice dicho proyecto, los valores de las concentraciones medidas se puedan
contrastar con los resultados obtenidos en la evaluación de daños en la vegetación. Por este
motivo, se han situado también parcelas de evaluación de daños cerca de esos puntos de
medida.
NUM EMPLAZAMIENTO PROVINCIA ZONA COORD. X(KM)
COORD. Y(KM)
ALTURA(M)
1 GUARDAMAR Alicante Vinalopó 706.795 4220.82 22 AGOST Alicante Vinalopó 706.459 4260.926 5033 FONT ROJA Alicante Serpis 714.643 4282.784 10144 GANDÍA Alicante Serpis 745.507 4317.576 125 EL SALER Valencia Turia 731.667 4358.333 26 LA PEIRA Valencia Turia 721.07 4350.275 327 VILLAR DEL ARZOBISPO Valencia Turia 687.571 4400.292 4008 BENICARLÓ Castellón Cérvol 789.807 4480.945 309 SANT JORDI Castellón Cérvol 785.578 4494.799 14810 VALLIVANA Castellón Cérvol 755.725 4493.358 70011 TOSSAL GROS Castellón Cérvol 757.708 4499.59 125012 MORELLA Castellón Cérvol 745.805 4500.754 115613 CORATXAR Castellón Cérvol 760.751 4509.023 123114 SORITA Castellón Cérvol 738.915 4513.059 619
Tabla 2.1. Sitios de medida con dosímetros pasivos, indicando las coordenadas UTM y la altura.
Figura 2.1. Sitios de medida con dosímetros pasivos.
2.1. DESCRIPCION DE LOS DOSIMETROS DE OZONO
Existen cuatro consideraciones a tener en cuenta cuando se diseña un dosímetro pasivo:
1) Linearidad de la reacción o respuesta con respecto a la concentración en el aire del
compuesto a determinar. 2) Especificidad de la reacción del absorbente para el contaminante
de interés. 3) Efectos de la turbulencia del aire sobre la eficiencia de captura del dispositivo, y
4) Correlación de los valores obtenidos por el dispositivo con los valores obtenidos por un
muestreo en continuo.
Los dosímetros pasivos de ozono utilizados en este proyecto van montados en una
carcasa fijada a poste de 2,50 m del suelo, o bien en la propia torre meteorológica cuando la
hay. Constan de un cuerpo de polipropileno de 26 mm de largo por 15 mm de diámetro con dos
cavidades, donde se alojan entre dos mallas de acero inoxidable dos filtros de fibra de vidrio
impregnados con una disolución que contiene nitrito y sales higroscópicas que regulan la
humedad en el filtro (figura 2.2). Las cavidades se encuentran cerradas con dos tapas de
polipropileno provistas de perforaciones. Finalmente, con el fin evitar el efecto de la dirección
del viento y que halla una correcta difusión del aire hasta los dosímetros, estos van alojados en
una carcasa. El nitrito al entrar en contacto con ozono, se oxida a nitrato. Posteriormente, este
nitrato es analizado por cromatografía iónica. Inicialmente se utilizaron los dispositivos
proporcionados por Ogawa Co., actualmente estos dispositivos han sido mejorados y sólo se
utilizan los filtros de este suministrador.
Figura 2.2. Dosímetro de ozono expuesto en el campo (arrib, izq.). Dosímetro de ozono desmontado [de izquierda aderecha: tapón de polipropileno con 24 perforaciones de 1,5 mm, malla de acero inoxidable (0,3 mm de paso demalla), filtro de fibra de vidrio impregnado con la solución captadora, cuerpo de polipropileno, y a continuación otra
vez las partes mencionadas en orden inverso] (arriba, dcha.). Pack de dos dosímetros montados en una abrazaderaen el interior del envase (abajo, izq.). C) Pack con un blanco en el interior de su envase.TM y la altura (abajo, der.).
2.2. CONTROL DE CALIDAD
Los dispositivos se someten a calibraciones/validaciones con instrumentos homologados
para cada uno de los lotes (todos los envíos para cada periodo de exposición quincenal
corresponden a un mismo lote) coincidiendo con los periodos de exposición. Las validaciones
se realizan para al menos tres tipos de régimen de exposición (tres altitudes diferentes, baja,
media y alta). Para ello se utiliza un Analizador de ozono “Dasibi UV Photometric O3 analyzer,
model 1008-RS”. Método homologado por la EPA para la medida de O3 (Nº EQSA-0383-056).
Para asegurar una buena calidad de datos, se utilizan 2 réplicas en cada medida y se
los dosímetros se envían junto a blancos que nos pueden evidenciar posibles problemas de
transporte.
Ejemplo de Validación de un lote de dosímetros de ozono:
Validación Ozono
y = 0.9965xR2 = 0.8476
0.010.020.030.040.050.060.070.080.0
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0
Cdos (ppb)
Cm
on (p
pb)
Figura 2.3. En el ejemplo de validación que se adjunta se puede observar que la respuesta es lineal y la correlaciónentre los valores del monitor en continuo homologado y nuestro dispositivo es del 84%.
2.3. RESULTADOS
Aunque se dispone de datos para todo el año, y en estos puntos de muestreo existe
información desde el año 2002, nos centraremos en el periodo abril-septiembre y en los años
2003 y 2004 para este informe. Anteriormente a 2003, no se realizaron muestreos para la
detección de síntomas foliares en el campo. Fuera de este periodo, los valores son más bajos,
ya que el ozono presenta una estacionalidad, y en otoño e invierno la menor intensidad de la
radiación solar determina una menor actividad fotoquímica. Se aportan pues los valores medios
para el principal periodo de crecimiento de las plantas, desde abril a septiembre, y el valor
máximo alcanzado en las quincenas de medidas.
2.3.1. Concentraciones en Alicante (sur de la Comunidad Valenciana)
En la provincia de Alicante hay 3 puntos de medida con dosímetros. Guardamar es un
pinar costero de Pinus halepensis y Pinus pinaster. Anteriormente a 2003, no se realizaron
muestreos en el campo. Agost es una localidad a unos 500 m, posiblemente bajo la influencia
de la ciudad de Alicante, y la Font Roja se encuentra cercana a la ciudad de Alcoi, a más de
1000 m, cerca del Parque Natural. Los valores más bajos corresponden a la localidad a menor
altura, Guardamar (media del periodo abril-septiembre de alrededor de 30 ppb), que contrasta
con los valores bastante más altos (entre 38 y 49 ppb) de las otras dos localidades,
especialmente Agost. En 2003 se registraron valores algo más altos que en 2004, tanto en
primavera como en verano.
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Figura 2.4. Concentraciones quincenales de ozono medidas en el periodo abril-septiembre de los años 2003 y 2004 enla provincia de Alicante con dosímetros pasivos.
2.3.2. Concentraciones en Valencia (centro de la Comunidad Valenciana)
En la provincia de se han Valencia se han establecido 4 puntos de medida con
dosímetros. Los de menor altitud son Gandía y el Saler, ambos cercanos a la costa. En el caso
de El Saler, los dosímetros se en instalaron en la Devesa de l'Albufera, un Parque Natural
cercano a la ciudad de Valencia con una frondosa masa de pino carrasco. La Peira es una
estación rural próxima a Benifaió, en la llanura del Túria, a unos 30 m de altitud. Es el sitio
donde están las instalaciones de OTCs del CEAM. Finalmente, Villar del Arzobispo es una
localidad interior situada a mayor altitud (c. 500 m), en el valle del Túria, río que desemboca en
la ciudad de Valencia.
De igual manera que en Alicante, la localidad a mayor altitud, Villar, presenta niveles
de ozono superiores, con una media de 38 ppb en 2003 y de algo menos, 34,8 en 2004. Los
valores máximos alcanzan los 48,2 ppb en 2003 y 44,0 ppb en 2004. En La Peira y el Saler,
los valores medios del periodo abril-septiembre no alcanzaron los 30 ppb, y en Gandía se han
medido valores algo mas altos. La variación observada entre quicenas no es muy acusada, y
los picos se distribuyen entre primavera y verano.
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Figura 2.5. Concentraciones quincenales de ozono medidas en el periodo abril-septiembre de los años 2003 y 2004 enla provincia de Valencia con dosímetros pasivos.
2.3.3. Concentraciones en Castellón (norte de la Comunidad Valenciana)
Castellón es la provincia en la que hay instalados más puntos de medida con dosímetros, que
suman un total de 7. Cabe mencionar a Benicarló, por su baja altitud (32 m) y cercanía al mar, en un
entorno bastante poblado (con tráfico relativamente cerca, cuyas emisiones de NO reaccionan con el
ozono, consumiéndolo), y a Sant Jordi, en un entorno rural, a 148 m. El resto son puntos de medida más
altos a partir de los 619 m de Sorita y hasta los cerca de 1200 m de Coratxar, Tossal Gros y Morella, en el
interior de Castellón, una zona muy montañosa y cubierta de bosques con vegetación mediterránea. Los
valores más altos los presenta es Morella, que en 2003 alcanzó una media para el periodo abril-
septiembre de 61,1 ppb y de 59,5 en 2004. , Es uno de los puntos con concentraciones de ozono más
elevadas en la Comunidad Valenciana de que se tiene medidas con dosímetros o monitores en contínuo.
Los máximos de todas las medidas quincenales superaron los 78 ppb en ambos años, siendo 97,1 en
2004. Tossal Gros y Coratxar, también en zonas culminales de montañas, presentaron valores algo más
bajos, de unos 50 ppb de media. En Vallivana y Sorita, localidades situadas en valles, los valores tuvieron
un rango de entre 33 y 40 ppbs, y sus máximos fueron de casi 50 ppb. Las variaciones entre quincenas
son más marcadas que en el caso de los puntos de la provincia de Valencia. En varias de las localidades
se observa que en la primera mitad de agosto se alcanzaron valores altos, aunque también hay valores
altos en mayo-junio.
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Sant Jordi-2003
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Sant Jordi-2004
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Vallivana-2003
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Vallivana-2004
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Tossal Gros-2003
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Tossal Gros-2004
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Morella-2003
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Morella-2004
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Coratxar-2003
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Sorita-2003
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Figura 2.6 (viene de página anterior). Concentraciones quincenales de ozono medidas en el periodo abril-septiembrede los años 2003 y 2004 en la provincia de Castellón con dosímetros pasivos.
2.3.3. Comparación de las concentraciones en entre 2003 y 2004
El siguiente gráfico ilustra de forma conjunta lo comentado anteriormente por
provincias. De entre todas las localidades, destacan Morella y el Tossal Gros por sus elevados
valores promedio, que son de alrededor de 60 ppb de media en Morella. Las localidades a
menor altitud y cercanas a la costa presentan en cambio valores más bajos, no llegando a los
32 ppb de media en Guardamar, y menores de 30 en El Saler y Benicarló. Se puede constatar
que en todas las localidades, la media del año 2003 es más alta que la de 2004. El año 2003
fue excepcionalmente caluroso, con una sequía marcada en buena parte de Europa. Estas
condiciones climáticas son adecuadas para la producción de ozono. En Vallivana, Font Roja y
El Saler estas diferencias entre los dos años fueron más acusadas.
Media 2003 y 2004 Abril-Septiembre
0
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2003
2004
Figura 2.7. Comparación de la media del periodo abril-septiembre para los diferentes puntos de medida con dosímetrosen los años 2003 y 2004.
Por lo que respecta a los valores máximos medidos con los dosímetros (la quincena en
el periodo abril-septiembre con los valores más altos), destaca notablemente Morella, con
valores por encima de los 78 ppb (97 ppb en 2004), seguida de otras localidades a más de
1000 m de altitud en el interior de Castellón: Tossal Gros y Coratxar, con más de 60 ppb en al
menos una de las quincenas. Es interesante también constatar que se presentan valores
relativamente altos en dos puntos de Alicante: Agost, con cerca de 60 ppb y Font Roja, con
más de 50 ppb. Curiosamente, al contrario que lo observado en los valores medios del periodo
abril-septiembre, que de forma homogénea eran más elevados en 2003 que en 2004, hay
localidades en las que la quincena con el valor más alto (máximo) del año 2004 era mayor que
la máxima de 2003. Es el caso de Morella, Tossal Gros, Agost y El Saler. Como era esperable,
los puntos menos elevados y cercanos al mar presentaron valores máximos menos acusados.
Maximo 2003 y 2004 Abril-Septiembre
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Ago
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2003
2004
Figura 2.8. Comparación del valor máximo medido en las diferentes quincenas del periodo abril-septiembre para losdiferentes puntos de medida con dosímetros en los años 2003 y 2004.
2.4. CONCLUSIONES
Los patrones de distribución de los niveles de ozono en la Comunidad Valenciana
confirman que las concentraciones más altas se dan en las zonas montañosas del interior,
mientras que en las zonas litorales los niveles son en general bajos. Este patrón se ha
observado con una red más amplia de datos con dosímetros pasivos (datos inéditos) en la
Comunidad Valenciana, y en parte se explica porque en las zonas altas se acumulan estratos
de reserva ricos en ozono (figura 1.2), y las concentraciones por la noche no bajan tanto como
en las zonas a menor altitud. Los valores durante el día tienden a ser también más elevados
(datos de monitores, ver figura 1.1 como ejemplo).
Los valores promedio más altos se en dan en una zona montañosa interior del norte de
la Comunidad Valenciana, Morella. En 2003, por ejemplo, esta localidad presenta un valor
promedio de 61.1 ppb para el periodo abril-septiembre, y un valor máximo quincenal de 78.99
ppb, que se produjo en agosto. También en Alicante se presentaron valores promedio
relativamente altos de ozono, en localidades como Agost, donde se han medido valores
promedio de 49.41 para todo el periodo abril-septiembre, y valores máximos quincenales para
estos seis meses de más de 50 ppb. Por el contrario, los valores medios más bajos se midieron
en el Saler, un pinar costero y en La Peira, una zona rural a baja altitud.
3. EVALUACION DE DAÑOS POR OZONO EN EL CAMPO
En este capítulo, se presentan los resultados de los muestreos de daños por ozono en
el campo por todo el territorio valenciano. Se han establecido un total de 48 parcelas, en
muchas de ellas con varios transectos de vegetación diferente (p. ej. separando pinar, matorral,
etc). Doce de estas parcelas se establecieron y fueron prospectadas únicamente en el último
muestreo (septiembre 2004), y se tratan de forma separada en las tablas. En el anexo final del
capítulo se incluyen listados de especies sintomáticas y no sintomáticas en cada una de las
parcelas y transectos.
3.1. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1.1. Establecimiento de las parcelas
Las parcelas se han establecido a lo largo de los valles de los principales ríos de la
Comunidad Valenciana. Algunos de los puntos de medida con dosímetros ya se habían fijado
con anterioridad al comienzo de este proyecto (desde 2000), y se ha considerado apropiado
continuar con estos puntos en este proyecto, con la finalidad de disponer de series largas de
datos. Por ello, la elección de las parcelas para la evaluación de daños en la vegetación se
realizó en función de la localización de los puntos de medidas con dosímetros pasivos y de la
presencia de especies sensibles al ozono, como Ailanthus altissima, Pinus halepensis, o
Sambucus ebulus. Las parcelas tenían alrededor de 200 m de longitud y se examinaron todas
las especies presentes. Los puntos de medidas con dosímetros caracterizan determinadas
áreas o cuencas de ríos.
3.1.2. Tabla de las parcelas
Nº PROVINCIA ZONA LOCALIDAD NUMTRANSECTOS
UTM (X) UTM(Y) ALTITUD
1 Alicante Río Serpis Alcoi* 1 720229 4287270 5702 Alicante Río Serpis Beniarrés** 3 727539 4298191 3993 Alicante Río Serpis Font_Roja 4 714643 4282784 7574 Alicante Río Serpis Lorxa 1 731212 4302625 3095 Alicante Río Vinalopó Agost 1 706459 4260926 6276 Alicante Río Vinalopó Aspe 1 694400 4246200 2407 Alicante Río Vinalopó Beneixama** 2 694912 4285090 5938 Alicante Río Vinalopó Guardamar 1 706795 4220820 29 Alicante Río Vinalopó Monfort* 1 698324 4248388 19710 Alicante Río Vinalopó Monòver* 2 690422 4256410 34111 Alicante Río Vinalopó Novelda 1 691850 4251675 31212 Alicante Río Vinalopó Penya Rúbia* 1 690265 4274028 91713 Alicante Río Vinalopó Santa Eulàlia* 1 686839 4270479 50314 Valencia Río Albaida Agullent 1 712725 4299925 39815 Valencia Río Albaida Beniatjar 1 724075 4303125 38016 Valencia Río Albaida Bocairent 1 707775 4293626 60317 Valencia Río Albaida Fontanar 2 692175 4295275 61918 Valencia Río Albaida Moixent 1 694875 4304975 31919 Valencia Río Albaida Onteniente 1 701245 4296606 48320 Valencia Río Albaida Quatretonda 1 725350 4314450 23321 Valencia Río Albaida Ràfol_de_Salem 1 725275 4304487 37622 Valencia Río Serpis Aielo_de_Malferit 1 708725 4306100 28923 Valencia Río Serpis Gandia* 1 746473 4319629 024 Valencia Río Serpis Villalonga** 2 740136 4307823 10725 Valencia Río Turia Aras de Alpuente* 1 662583 4417099 91726 Valencia Río Turia Bugarra 1 691775 4385875 27427 Valencia Río Turia El_Saler 1 731667 4358333 228 Valencia Río Turia Marines 2 709025 4394525 23729 Valencia Río Turia Olocau 1 711575 4397325 22630 Valencia Río Turia Pedralba 1 695200 4386112 14831 Valencia Río Turia Peira 5 721070 4350275 2732 Valencia Río Turia Peña Salada* 1 687644 4418372 154733 Valencia Río Turia Villar_del_Arzobispo 1 687571 4400292 33034 Castellón Río Mijares Algar* 1 725456 4406802 19035 Castellón Río Mijares Burriana* 1 748275 4420200 1536 Castellón Río Mijares Cirat* 2 717269 4437355 41237 Castellón Río Mijares Grau_de_Castellón 1 755937 4426546 7838 Castellón Río Mijares Onda 1 734851 4428680 17039 Castellón Río Palancia Caudiel 1 707575 4423838 59340 Castellón Río Palancia Jérica* 3 707763 4420693 45641 Castellón Río Cérvol Cabanes 2 758900 4450775 28142 Castellón Río Cérvol La_Jana 1 775425 4489900 28743 Castellón Río Cérvol Morella 1 745805 4500754 90444 Castellón Río Cérvol Sant_Jordi 2 758578 4494799 14845 Castellón Río Cérvol Vallivana 1 755725 4493358 81146 Castellón Río Cérvol Vilafames 1 754600 4442000 30347 Castellón Río Cérvol Villores 1 736875 4506765 75748 Teruel Río Mijares Valbona* 1 688625 4455525 978Tabla 3.1. Localidades donde se han evaluado daños en los años 2003 y 2004, provincia y cuenca de los rios. Enalgunas de estas localidades se han establecido diversos transectos. * Parcela añadida en el último muestreo. ** Unode los transectos añadido en el último de los muestreos.
Figura 3.1. Distribución de las localidades muestreadas en la Comunidad Valenciana.
3.1.4. Imágenes de algunas de las parcelas
Figura 3.2. Aspecto general de la parcela de Bocairent_1, parcela con bastantes ejemplares de Sambucus ebulus y enla que también se encontraba Vitis vinifera (izq.). Aspecto general de la parcela de Bocairent_2, con Ailanthus altissima(dcha).
Figura 3.3. Visión general de la parcela de Font Roja_2.
Figura 3.4. Aspecto general de las parcelas de Pinus halepensis de las localidades de Sant Jordi (Izda) y Vallivana(drcha.)
3.1.3. Fechas de evaluación
Se realizaron dos muestreos anuales de evaluación de daños producidos por ozono en
la vegetación. El primero de 2003 se realizó durante los meses de mayo–junio, más tarde se
realizó otro en el mes de septiembre. En 2004 el primer muestreo se realizó en junio-julio,
realizándose el segundo en septiembre.
3.1.4. Evaluación de daños
En cada parcela se observan al menos 10 individuos de las especies arbóreas y
arbustivas; las especies herbáceas se evalúan todas. Los daños se evalúan de acuerdo con la
siguiente escala (en clases):
0: sin daño;1: 1-5% superficie dañada;2: 6-25% de superficie dañada;3: 26-50% de superficie dañada;4: 51-75% de superficie dañada;5: 76-100% de superficie dañada de la copa o de la hoja.
Para la especie Pinus halepensis, debido a la imposibilidad de observar los síntomas
producidos por el ozono en la totalidad de la copa, se observan 10 ramas por pino. Además en
Pinus halepesnis también se realiza la evaluación de la transparencia y decoloración de la
copa. Finalmente, estos datos no se han incluido por irrelevantes.
3.1.5. Recolección de semillas
Durante el transcurso de los muestreos se recogieron semillas de aquellas plantas que
mostraron o no síntomas, diferenciándolas entre sí. Éstas semillas se han utilizado y se
utilizarán también en el futuro para posteriores fumigaciones con ozono en cámaras de techo
descubierto de especies de diversas zonas del sur de Europa.
3.2. RESULTADOS
Se han muestreado un total de 65 parcelas en el total de las cuatro revisiones, 20 en la
provincia de Alicante, 27 en la provincia de Valencia y 18 en la provincia de Castellón.
Las especies más muestreadas han sido Pinus halepensis, encontrándose en 26
parcelas, Ailanthus altissima, en 23 parcelas muestreadas y Vitis vinifera en 11 parcelas
estudiadas. Estas espcies, además de tener una distribución muy amplia, son especies
sensibles al ozono y las parcelas se eligieron en parte por su presencia.
3.2.1. Daños visibles en Alicante (sur de la Comunidad Valenciana)
Parcelas del Río Vinalopó
En la zona del río Vinalopó se han establecido un total de 11 parcelas en este valle:
Guardamar, Aspe, Agost, Novelda, Beneixama_1, Beneixama_2, Monfort, Monòver_1,
Monòver_2, Peña rubia y Santa Eulalia. Es una zona seca, con vegetación adaptada a la
sequía.
Las parcelas Beneixama_2, Monfort, Monòver_2, Peña rubia y Santa Eulalia se
evaluaron únicamente en el último muestreo, el resto de las parcelas se evaluaron en todos los
muestreos a excepción de Agost que se muestreó en la primera y tercera evaluación.
Excepto la parcela de Guardamar, que es un pinar costero, el resto son localidades
interiores. En Guardamar, pese a ser una de las parcelas con valores más bajos de ozono
medidos, se encontraron síntomas en Pinus halepensis, muy escasos en 2003. En Agost se
han medido concentraciones de ozono relativamente altas en 2003 y 2004 con los dosímetros.
Sin embargo, no se encontró ninguna especie sintomática. En el resto de parcelas, de una
zonas relativamente cercanas a Agost, fueron sintomáticas Sambucus ebulus, Vitis vinifera y
Pinus halepensis. El tipo de vegetación, esclerófila mediterránea y de matorral, en principio
más resistente al ozono, no favoreció la presencia de daños en la vegetación.
Códigos: NS=No sintomática; OZ=Daños por ozono; OL=Daños <ozone-like>, semejantes a los del ozono no específicos .
PRESENCIA DE DAÑOS PORREVISIÓN
2003 2003 2004 2004
CUENCA PARCELA UTMX (30) UTMY (30) ESPECIE 1 2 3 4
Vinalopó Agost 706.45904 4260.92598 Ailanthus altissima NS - NS -
Vitis vinifera NS - NS -
Vinalopó Aspe 694.40013 4246.1998 Ailanthus altissima NS NS NS NS
Vinalopó Beneixama_1 694.91196 4285.08995 Sambucus ebulus NS NS NS OZAilanthus altissima NS NS NS NS
Convolvulus althaeoides - NS - -Vinalopó Beneixama_2 694.912 4265.09 Vitis vinifera - - - OZ
Malva sp. - - - NSPinus halepensis - - - NS
Retama sphaerocarpa - - - NSRosa sp. - - - NS
Vinalopó Guardamar 706.125 4218.525 Pinus halepensis OZ OZ OZ OZ
Vinalopó Monfort 698.324 4248.388 Asparagus horridus - - - NS
Bupleurum fruticescens - - - NSCistus albidus - - - NSDorycnium pentaphyllum - - - NS
Fumana ericoides - - - NSGlobularia alypum - - - NS
Helianthemum sp. - - - NSHelianthemum syriacum - - - NS
Juniperus oxycedrus - - - NSOlea europaea - - - NS
Pistacia lentiscus - - - NSRhamnus licyoides - - - NS
Rosmarinus officinalis - - - NSSatureja montana - - - NS
Sedum sediforme - - - NSStipa tenacissima - - - NS
Thymus vulgare - - - NSUlex parviflorus - - - NS
Vinalopó Monòver_1 690.42203 4256.41016 Ailanthus altissima NS NS NS NS
Vinalopó Monòver_2 690.422 4256.41 Pinus halepensis - - - OZ
Helychrysum stoechas - - - NSOlea europaea - - - NS
Phoeniculum vulgare - - - NSUlex parviflorus - - - NS
Vinalopó Novelda 691.84984 4251.67518 Pinus halepensis OZ OZ OZ OZAilanthus altissima NS NS NS NS
Vinalopó Penya Rúbia 690.265 4274.028 Brachypodium retusum - - - NSBupleurum fruticescens - - - NS
Cistus albidus - - - NSErica multiflora - - - NS
Helianthemum syriacum - - - NSHelychrysum stoechas - - - NS
Hypericum ericoides - - - NSJuniperus oxycedrus - - - NS
Juniperus phoenicea - - - NS
Lavandula stoechas - - - NS
Ononis sp. - - - NS
Phoeniculum vulgare - - - NSPinus halepensis - - - NS
Quercus coccifera - - - NSQuercus rotundifolia - - - NS
Rhamnus licyoides - - - NSRosmarinus officinalis - - - NSSedum sediforme - - - NS
Sonchus sp. - - - NSTeucrium poliumganaphalodes
- - - NS
Teucrium sp. - - - NSThymus vulgaris - - - NS
Ulex parviflorus - - - NS
Vinalopó Santa Eulàlia 686.839 4270.479 Ailanthus altissima - - - OZ
Amigdalus communis - - - NS
Anthyllis citysoides - - - NSCichorium intybus - - - NS
Dorycnium pentaphyllum - - - NSFicus carica - - - NSManrubium sp. - - - NS
Phoeniculum vulgare - - - NSSanguisorba ancistroides - - - NS
Santolina chamaorcparesus - - - NSScirpus holoschoenus - - - NS
Stipa tenacissima - - - NSTamarix gallica - - - NS
Parcelas del Río Serpis
En este valle se estudiaron un total de trece parcelas: Gandia, Villalonga, Aielo de
Malferit, Lorxa, Beniarrés_1, Beniarrés_2 y Beniarrés_3, Alcoi y cuatro parcelas en la Font
Roja. Las parcelas de Alcoi, Villalonga_2, Gandia y Beniarrés_3 se muestrearon únicamente en
el último muestreo, el resto de las parcelas se evaluaron en todos los muestreos. Las parcelas
3 y 4 de la Font Roja están ubicadas en un vivero forestal, teniendo más humedad edáfica. Al
ser plantas de vivero, algunas se cambiaban durante los dos años de muestreo.
En este informe (capítulo 1) se aportan medidas de ozono con dosímetros en la Font
Roja (valor medio en el periodo abril-septiembre: 44.3 ppb en 2003 y 38.4 ppb en 2004; la
quincena con valores más altos fue de poco más de 50 ppb en 2003 y 2004), que es una
localidad con valores relativamente altos, aunque más bajos que en Agost (valle del Vinalopó).
Otros dosímetros situados en este valle (datos inéditos) aportan valores similares o algo
menores a los de la Font Roja para los años 2003 y 2004.
Destacan como especies sintomáticas Ailanthus altissima, en Aielo de Malferit, Pinus
halepensis en Alcoi y Villalonga, y Sambucus ebulus en Lorxa. Mención aparte merecen los
diferentes transectos establecidos en la Font Roja, un Parque Natural con vegetación
mediterránea, pero incluyendo especies de hoja relativamente ancha propias de ambientes
más frescos. Se prospectó además la zona del vivero de este Parque, donde se encontraron
abundantes especies con síntomas de ozono y otras con síntomas no específicos o que
merecen una clarificación (ozone-like). Al ser una zona con cierto riego, se favorece el
intercambio gaseoso y por tanto la dosis de ozono que toma la planta es más alta. En la Font
Roja, destacaremos las siguientes especies sintomáticas: Acer opalus subsp. granatense,
Ailanthus altissima, Crataegus monogyna, Pinus halepensis, Prunus spinosa y Sorbus aria.
Otras especies como Colutea arborescens, Daucus carota, Fraxinus ornus, Rhamnus
alaternus, Rosa sp, Rubus ulmifolius, Silene sp, Sonchus sp, Sorbus aucuparia y Viburnum
tinus mostraron síntomas que pueden estar relacionados como el ozono pero que no fueron del
todo claros. Por ejemplo, las especies de Sonchus, Silene y Rubus sufren un enrojecimiento de
las hojas de manera natural, y el ozono puede contribuir a aumentarlo, pero en el campo es
difícil atribuir estos enrojecimientos al ozono.
Códigos: NS=No sintomática; OZ=Daños por ozono; OL=Daños <ozone-like>, semejantes a los del ozono pero no específicos .
PRESENCIA DE DAÑOS PORREVISIÓN
2003 2003 2004 2004
CUENCA PARCELA UTMX (30) UTMY (30) ESPECIE 1 2 3 4
Serpis Aielo_de_Malferit
708.72501 4306.10028 Ailanthus altissima OZ OZ OZ OZ
Rubus ulmifolius NS NS - -Vitis vinifera NS NS NS NS
Serpis Alcoi 720.22900 4287.27000 Pinus halepensis - - - OZ
Asparagus horridus - - - NSBrachypodium retusum - - - NS
Bupleurum fruticescens - - - NSHelychrysum stoechas - - - NS
Olea europaea - - - NSPhagnalon saxatile - - - NS
Quercus coccifera - - - NSQuercus ilex - - - NSSedum sediforme - - - NS
Ulex parviflorus - - - NS
Serpis Beniarrés_1 727.53897 4298.19101 Ailanthus altissima NS NS NS NS
Vitis vinifera NS NS NS NS
Serpis Beniarrés_2 727.53897 4298.19101 Solanum tuberosum NS NS OZ -Serpis Beniarrés_3 727.53900 4298.19100 Ailanthus altissima - - - NS
Ceratonia siliqua - - - NSCorylus avellana - - - NS
Ficus carica - - - NSMorus alba - - - NSPinus pinaster - - - NS
Pistacia terebinthus - - - NSPrunus sp. - - - NS
Rubia peregrina - - - NSVitis vinifera - - - NS
Ziziphus jujuba - - - NS
Serpis Font_Roja_1 714.64301 4282.78413 Ailanthus altissima NS OZ OZ OZ
Pinus halepensis OZ OZ OZ OZ
Serpis Font_Roja_2 714.64301 4282.78413 Acer opalus OZ OZ OZ NSCrataegus monogyna NS OZ NS NSPrunus spinosa NS OZ NS OZ
Fraxinus ornus - OL NS OL
Quercus pyrenaica - - NS -Rosa sp. - OL - -
Sorbus aria NS OL NS OLSorbus aucuparia NS NS NS OL
Celtis australis - NS - -Fraxinus ornus - - NS -
Juglans regia NS NS NS NSPrunus mahaleb NS NS NS NSQuercus pyrenaica - - - NS
Serpis Font_Roja_3 714.64301 4282.78413 Acer opalus - - OZ OZPrunus spinosa OZ OZ - -
Rubus ulmifolius OL OL - -Daucus carota OL NS - -
Fraxinus ornus NS NS - OLSonchus sp. - - OL -
Sorbus aria - - - OZViburnum tinus NS NS OL OL
Crataegus monogyna NS NS - -Rosa sp. NS NS - -
Serpis Font_Roja_4 714.64301 4282.78413 Acer opalus OZ OZ - -Crataegus monogyna - - OZ OZ
Colutea arborescens OL NS - -Rhamnus alaternus OL NS - -Silene sp. - - OL -
Sorbus aria - OZ - -Viburnum tinus OL OL - -
Rosa sp. - - - NSRubus ulmifolius - - - NS
Serpis Gandia 746.473 4319.629 Arundo donax - - - NS
Malva sp. - - - NSNerium oleander - - - NS
Ricinus communis - - - NS
Serpis Lorxa 731.21236 4302.62483 Sambucus ebulus OZ OZ NS OZ
Vitis vinifera NS NS NS NS
Serpis Villalonga_1 740.13599 4307.82307 Pinus halepensis NS OZ OZ OZ
Serpis Villalonga_2 740.136 4307.823 Arisarum vulgare - - - NS
Asparagus acutifolius - - - NSCitrus sp. - - - NSParietaria judaica - - - NS
Quercus coccifera - - - NSRosa sp. - - - NS
Rubia peregrina - - - NSSonchus sp. - - - NS
3.2.2. Daños visibles en Valencia (centro de la Comunidad Valenciana)
Parcelas del Río Albaida
En este valle hay un total de nueve parcelas: Quatretonda, Moixent, Ràfol de Salem,
Beniatjar, Agullent, Ontinient, Bocairent y Fontanar_1 y Fontanar_2.
En este valle Ailanthus altissima se encuentra ampliamente extendido en los márgenes
de las carreteras. También resalta la presencia de Vitis vinifera, pues es una zona de cultivo de
viñas.
Aunque no se aportan aquí valores de los niveles de ozono con dosímetros en este
valle, datos inéditos indican que los valores son menores que en la zona de la Font Roja.
Ailanthus altissima mostró sintomas en varias de las localidades, así como Pinus
halepensis, Vitis vinifera y Sambucus ebulus. Phalaris spinosa, y Partenocissus quinquefolia
mostraron enrojecimientos en las hojas que se presentan también en ausencia de ozono.
Códigos: NS=No sintomática; OZ=Daños por ozono; OL=Daños <ozone-like>, semejantes a los del ozono pero no específicos .
PRESENCIA DE DAÑOS PORREVISIÓN
2003 2003 2004 2004
CUENCA PARCELA UTMX (30) UTMY (30) ESPECIE 1 2 3 4
Albaida Agullent 712.72501 4299.92528 Ailanthus altissima NS NS NS NS
Beniatjar 724.07503 4303.1249 Ailanthus altissima NS OZ NS NS
Bocairent 707.77501 4293.62556 Ailanthus altissima NS OZ NS OZ
Sambucus ebulus NS OZ NS OZ
Rubus ulmifolius NS NS NS NSVitis vinifera NS NS NS NS
Albaida Fontanar_1 692.17497 4295.27488 Pinus halepensis OZ OZ OZ NSVitis vinifera - - NS -
Albaida Fontanar_2 692.17497 4295.27488 Ailanthus altissima OZ - OZ OZPinus halepensis OZ OZ OZ OZ
Vitis vinifera NS OZ OZ OZPhalaris spinosa OL NS - -
Ailanthus altissima - NS - -
Albaida Moixent 694.87496 4304.97524 Ailanthus altissima NS NS OZ OZ
Partenocisus quinquefolia OL OL OL OLAilanthus altissima NS NS NS NS
Albaida Onteniente 701.24498 4296.60617 Phalaris spinosa - - OL NS
Juglans regia NS NS NS NS
Albaida Quatretonda 725.35003 4314.45009 Vitis vinifera OZ OZ OZ OZ
Solanum tuberosum NS NS - -
Albaida Ràfol_de_Salem
725.27506 4304.48657 Pinus halepensis OZ OZ OZ OZ
Parcelas del Río Turia
En este valle se estudiaron un total de catorce parcelas: El Saler (a nivel del mar), cinco
parcelas diferentes en la Peira, Pedralba, Marines_1 y Marines_2, Olocau, Bugarra, Villar del
Arzobispo, Aras de Alpuente y Peña Salada (a 1547 m.).
Se dispusieron dosímetros en El Saler, un pinar de Pinus halepensis en la costa y en
una zona interior, Villar del Arzobispo. Los valores para El Saler fueron relativamente bajos, de
menos de 30 ppb de media para el periodo abril-septiembre en 2003 y 2004 (ve capítulo 1). En
Villar del Arzobispo, que es un punto más representativo de las otras parcelas de daños
establecidas, los valores promedio para estos seis meses estaban entre 30 y 40 ppb.
Las parcelas de Aras de Alpuente y Peña Salada se estudiaron en el último muestreo.
La parcelas de La Peira, zona de cultivos, únicamente se estudiaron en el primer muestreo
coincidiendo con la plantación ese año de abundantes campos de patatas. Esta especie es
muy sensible al ozono, como se pudo comprobar, ya que presentó abundantes daños. La
parcela de Pedralba se empezó a muestrear a partir de 2004. La mayoría de estas parcelas se
caracterizan por presentar Pinus halepensis como especie sensible. Convolvulus sp., Phalaris
spinosa, y Pistacia lentiscus presentaron síntomas no específicos <ozone-like>.
Códigos: NS=No sintomática; OZ=Daños por ozono; OL=Daños <ozone-like>, semejantes a los del ozono pero no específicos .
PRESENCIA DE DAÑOS PORREVISIÓN
2003 2003 2004 2004
CUENCA PARCELA UTMX (30) UTMY (30) ESPECIE 1 2 3 4
Turia Aras deAlpuente
662.58300 4417.09900 Pinus halepensis - - - OZ
Brachypodium retusum - - - NSHelianthemum origanifolium - - - NS
Juniperus oxycedrus - - - NSJuniperus phoenicea - - - NSMedicago sp. - - - NS
Phlomis lignitis - - - NSQuercus coccifera - - - NS
Robinea pseudoacacia - - - NSRosmarinus officinalis - - - NS
Santolina chamaorcparesus - - - NSTeucrium polium - - - NS
Thymus vulgare - - - NSUlex parviflorus - - - NS
Vitis vinifera - - - NS
Turia Bugarra 691.77498 4385.87504 Pinus halepensis OZ OZ OZ OZ
Phalaris spinosa NS - OL -Pistacia lentiscus NS NS NS NS
Robinia pseudoacacia NS NS NS NS
Turia El_Saler 731.66699 4358.33312 Pinus halepensis OZ OZ OZ OZ
Limonium sp. NS OL NS NS
Cistus monspeliensis NS NS NS NSMyoporum laetum NS NS NS NS
Phillyrea angustifolia NS NS NS NSPistacia lentiscus NS NS NS NS
Rhamnus alaternus NS NS NS NSRhamnus licyoides NS NS NS NS
Rubia peregrina NS NS NS NSSmilax aspera NS NS NS NS
Turia Marines_1 709.02502 4394.52514 Pinus halepensis OZ OZ OZ OZPhalaris spinosa NS - OL -
Pistacia lentiscus NS NS OL NSTuria Marines_2 709.02502 4394.52514 Convolvulus sp. - - OL -
Phalaris spinosa OL - OL NSCeltis australis NS NS NS NS
Convolvulus sp. - - - NSPistacia lentiscus NS NS NS NS
Populus nigra NS NS NS NSRobinia pseudoacacia NS NS NS NS
Rubus ulmifolius NS NS NS NSSmilax aspera - - NS NS
Sorbus aucuparia NS NS NS NS
Turia Olocau 711.57497 4397.32524 Pinus halepensis OZ OZ OZ OZ
Pistacia lentiscus NS NS NS NSRhamnus alaternus NS NS NS NS
Turia Pedralba 695.20000 4386.11200 Ailanthus altissima - - NS OZ
Partenocisus quinquefolia - - NS -Rubus ulmifolius - - NS NS
Turia Peira_1 721.07001 4350.27525 Solanum tuberosum OZ - - -
Turia Peira_2 721.07001 4350.27525 Solanum tuberosum OZ - - -
Peira_3 721.07001 4350.27525 Solanum tuberosum OZ - - -Peira_4 721.07001 4350.27525 Solanum tuberosum OZ - - -
Peira_5 721.07001 4350.27525 Solanum tuberosum OZ - - -
Turia Peña Salada 687.64400 4418.37200 Brachypodium retusum - - - NS
Euphorbia characias - - - NSHelleborus phoetidus - - - NS
Juniperus communis - - - NSJuniperus sabina - - - NS
Juniperus thurifera - - - NSManrubium sp. - - - NS
Ononis aragonensis - - - NS
Phlomis lignitis - - - NS
Pinus sylvestris - - - NSPotentilla repens - - - NS
Rosa sp. - - - NSSantolina chamaorcparesus - - - NS
Satureja montana - - - NSTeucrium chamaedris - - - NSThymus vulgare - - - NS
Villar_del_Arzobispo
687.57103 4400.29198 Pinus halepensis OZ OZ OZ OZ
Cynara scolymus - NS - -
Parcelas del Río Palancia
En el Río Palancia se evaluaron cuatro parcelas: Caudiel, Jérica_1, Jérica_2 y
Jérica_3.
Los datos inéditos de que disponemos indican que en esta zona los valores de ozono
son intermedios, semejantes a los de Villar del Arzobispo.
De nuevo Pinus halepensis y Ailanthus altissima son las especies que mostraron
síntomas. Convulvulus althaeoides, mostró unos daños semejantes a los que produce el ozono.
La vegetación de la zona, relativamente seca, es poco favorable para el desarrollo de
síntomas.
Códigos: NS=No sintomática; OZ=Daños por ozono; OL=Daños <ozone-like>, semejantes a los del ozono pero no específicos .
PRESENCIA DE DAÑOS PORREVISIÓN
2003 2003 2004 2004
CUENCA PARCELA UTMX (30) UTMY (30) ESPECIE 1 2 3 4
Palancia Caudiel 707.57482 4423.8376 Ailanthus altissima - OZ OZ OZ
Jérica_1 707.76302 4420.69318 Pinus halepensis OZ OZ OZ OZ
Ailanthus altissima NS NS NS NS
Phalaris spinosa - - NS -Robinia pseudoacacia NS NS NS NSRubus ulmifolius NS NS NS NS
Palancia Jérica_2 707.76302 4420.69318 Convolvulus althaeoides NS OL - -Ailanthus altissima NS NS NS NS
Clematis flammula NS NS NS NSMorus sp. NS NS NS NS
Rubus ulmifolius NS NS NS NSPalancia Jérica_3 707.76300 4420.69300 Pinus halepensis - - - OZ
Anthyllis citysoides - - - NSBrachypodium retusum - - - NS
Bupleurum fruticescens - - - NS
Centaureum erytrea - - - NS
Genista scorpius - - - NSOlea europaea - - - NS
Psolarea bituminosa - - - NSQuercus coccifera - - - NSRhamnus lyciodes - - - NS
Rosmarinus officinalis - - - NSThymus vulgare - - - NS
Ulex parviflorus - - - NS
3.2.3. Daños visibles en Castellón (norte de la Comunidad Valenciana)
Parcelas del Río Mijares
En el Valle del Río Mijares se estudiaron 7 parcelas, 6 en la provincia de Castellón y
una en Teruel. Las parcelas son: Grau de Castellón, Burriana, Cirat 1 y 2, Algar, Onda y
Valbona.
Las parcelas de Algar, Burriana, Cirat_2 y Valbona se evaluaron únicamente en el
último muestreo. El resto de las parcelas se eligieron en función de la vegetación y se
evaluaron en todos los muestreos.
Los valores de ozono para este valle son intermedios, menores que los medidos en el
norte de la Comunidad Valenciana (datos inéditos).
Las especies sintomáticas son: Ailanthus altissima, Pinus halepensis, e Ipomea indica,
observándose también algunos enrojecimientos en Pistacia lentiscus que sin embargo no eran
totalmente iguales a los reproducidos en condiciones experimentales (por tanto, se considera
en la categoría de <ozone-like>.
Códigos: NS=No sintomática; OZ=Daños por ozono; OL=Daños <ozone-like>, semejantes a los del ozono pero no específicos .
PRESENCIA DE DAÑOS PORREVISIÓN
2003 2003 2004 2004
CUENCA PARCELA UTMX (30) UTMY (30) ESPECIE 1 2 3 4
Mijares Algar 725.45600 4406.80200 Pinus halepensis - - - OZ
Celtis australis - - - NSCeratonia siliqua - - - NS
Foeniculum vulgare - - - NSManrubium sp. - - - NSNerium oleander - - - NS
Pistacia lentiscus - - - NSRhamnus lyciodes - - - NS
Rosmarinus officinalis - - - NSSedum sediforme - - - NS
Thymus vulgare - - - NSUlex parviflorus - - - NS
Mijares Burriana 748.27500 4420.20000 Celtis australis - - - NSCiperacea sp. - - - NSDiplotaxis erucoides - - - NS
Hyparrhenia hirta - - - NSInula viscosa - - - NS
Plantago sp. - - - NSRubus ulmifolius - - - NS
Solanum sp - - - NS
Mijares Cirat_1 717.26901 4437.35488 Pinus halepensis OZ OZ OZ OZPistacia lentiscus NS NS NS OL
Mijares Cirat_2 717.26900 4437.35500 Pinus halepensis - - - OZAnthyllis citysoides - - - NS
Brachypodium retusum - - - NSCeratonia siliqua - - - NS
Cistus albidus - - - NSDorychnium pentaphyllum - - - NS
Genista scorpius - - - NSHelychrysum stoechas - - - NSInula viscosa - - - NS
Rosmarinus officinalis - - - NSRubus ulmifolius - - - NS
Ulex parviflorus - - - NS
Mijares Grau_de_Castelló
755.93696 4426.54604 Ailanthus altissima NS OZ NS OZ
Ipomoea indica OZ - - OZPinus halepensis OZ OZ OZ OZ
Ipomoea indica - NS NS -
Mijares Onda 734.85097 4428.68007 Pinus halepensis OZ OZ OZ OZ
Mijares Valbona 688.62500 4455.52500 Brachypodium retusum - - - NS
Celtis australis - - - NSCrataegus monogyna - - - NS
Foeniculum vulgare - - - NSJuglans regia - - - NS
Manrubium sp. - - - NSQuercus faginea - - - NS
Quercus ilex - - - NSQuercus rotundifolia - - - NSRosa sp. - - - NS
Rubus ulmifolius - - - NSTrifolium repens - - - NS
Parcelas del Río Cérvol (y otras zonas del norte de la Comunidad Valenciana)
En el Valle del Río Cérvol se establecieron 7 parcelas: Cabanes, Vilafamés, Sant Jordi,
La Jana, Valivana, Morella y Villores. La parcela de Cabanes se evaluó en el primer y tercer
muestreo. La parcela de Vilafamés se evaluó en todos los muestreos, e incluía a Ailanthus
altissima. También se evaluó Pinus halepensis en el primer y segundo muestreo, pero la
presencia de ácaros hizo que no se continuara la evaluación posteriormente. En Sant Jordi
destaca la presencia de Pinus halepensis entre otras especies. La parcela de La Jana se
escogió por la presencia de ailanto. En la parcela de Vallivana destaca la presencia de
Ailanthus altissima, Sambucus nigra y Pinus halepensis. En Morella se observaron gran
cantidad de individuos de Coryllus avellana, Fraxinus excelsior y Sambucus nigra, al ser
especies que estaban formando parte de un seto que separaba un prado de una acequia. Era
pues una parcela con elevada humedad edáfica. La parcela de Villores está situada cerca de
un arroyo, en la que se pudieron observar varios cultivos de patatas, tomates o judías.
En la zona del valle del río Cérvol y áreas vecinas (comarca de Els Ports) se dispone
de 7 puntos de muestreo con dosímetros durante 2003 y 2004, existiendo también medidas de
años anteriores. En esta zona se alcanzan niveles de ozono altos, especialmente en las
estaciones situadas a mayor altitud, sobre los 1200 m, como Morella, Tossal Gros y Coratxar.
Morella tuvo una media para el periodo abril-septiembre de 61,1 ppb en 2003 y de 59,5 en
2004. El máximo de todas las medidas quincenales realizadas superó los 78 ppb en ambos
años, siendo 97,1 en 2004. En Coratxar y Tossal Gros, también en zonas culminales de
montañas, se presentaron valores algo más bajos, de unos 50 ppb de media. La parcela de
daños "Morella" se encontraba cercana a el punto de medida "Morella". En Vallivana, a 700 m,
se instalaron dosímetros y una parcela de daños, y en Villores, cercana al punto de medida de
Sorita, se prospectó la vegetación en busca de daños visibles por ozono. Los valores de las
concentraciones son algo menores en estas dos localidades, entre 33 y 40 ppbs de media en
el periodo abril-septiembre. A menor altitud encontramos S. Jordi, con medias de unos 35 ppbs
y máximos de 43 ppbs. Cabanes, La Jana y Vilafamés se encuentran a una altitud similar a
Sant Jordi, aunque no se dispone de dosímetros, posiblemente los valores sean similares. En
Benicarló las concentraciones fueron bajas, de menosde 30 ppb de media para el periodo
considerado.
Destaca la localidad de Morella, con daños en Corylus avellana y Fraxinus angustifolia,
y síntomas dudosos en F. excelsior. Ulmus minor es sintomático, con escasos daños, en
Vilafamés y Prunus spinosa en Villores. El resto de especies sintomáticas son, como en otras
zonas mencionadas anteriormente, Ailanthus altissima y Pinus halepensis. En Villores, la
patata y el tomate mostraron también síntomas en los campos . Geranium sp., Phalaris spinosa,
Rubus ulmifolius, Scorpiorus subillosus, y Sonchus sp. presentaron síntomas de ozono no
específicos, <ozone-like>.
Códigos: NS=No sintomática; OZ=Daños por ozono; OL=Daños <ozone-like>, semejantes a ozono pero no específicos .
PRESENCIA DE DAÑOS PORREVISIÓN
2003 2003 2004 2004
CUENCA PARCELA UTMX (30) UTMY (30) ESPECIE 1 2 3 4
Cérvol Cabanes 758.90031 4450.77515 Ailanthus altissima OZ OZ NS NS
Cérvol La_Jana 775.42502 4489.90004 Ailanthus altissima NS NS NS NSConvolvulus althaeoides NS NS - -Ipomoea indica NS NS - -
Rubus ulmifolius NS NS NS NS
Cérvol Morella 745.80497 4500.75397 Corylus avellana OZ OZ OZ OZFraxinus angustifolia OZ OZ OZ OZ
Fraxinus excelsior OL OL - -Juglans regia NS NS - -
Robinia pseudoacacia NS NS NS NSSambucus nigra NS NS NS NS
Vitis vinifera NS NS NS NS
Cérvol Sant_Jordi 78.51250 4493.6 Pinus halepensis OZ OZ OZ OZClematis flammula - - NS NS
Pistacia lentiscus NS NS NS NSRubus ulmifolius NS NS NS NS
Sorbus aucuparia - - NS NS
Cérvol Vallivana 755.72501 4493.35816 Ailanthus altissima NS NS NS OZPinus halepensis OZ OZ OZ OZ
Geranium sp. - - OL -Acer negundo NS NS NS NS
Prunus spinosa NS NS - -Rosa sp. NS NS NS NS
Rubia peregrina NS NS - -Rubus ulmifolius NS NS NS NSSambucus nigra NS NS NS NS
Sanguisorba minor - NS NS -
Cérvol Vilafames 754.600 4441.99953 Ailanthus altissima NS OZ OZ OZ
Rubus ulmifolius OL OL OL OLUlmus minor NS NS OZ OZPhalaris spinosa OL - - -
Scorpiorus subillosus OL - - -Sonchus sp. OL - OL -
Convolvulus althaeoides NS - - -Pinus halepensis NS NS - -
Pistacia lentiscus NS NS NS NSPsolarea bituminosa NS - - -
Rubia peregrina NS NS NS NSSalvia verbenaca NS - - -
Sanguisorba minor NS NS - -
Cérvol Villores 736.87498 4506.76515 Lycorpersicum esculentum - - - OZPrunus spinosa NS NS NS OZ
Rubus ulmifolius NS NS NS OLSolanum tuberosum NS NS OZ -
Clematis flammula OL NS NS NSCornus sanguinea OL OL OL OLLonicera etrusca NS OL NS OL
Potentilla reptans - - - OLRosa sp. - - - OL
Rubia peregrina - - - OLCeltis australis NS NS NS NS
Hypericum sp. NS NS - -Phalaris spinosa NS NS - -
Phaseolus vulgaris - NS - -Rosa sp. NS NS NS NS
Sorbus aucuparia NS NS NS NS
3.2.4. Resumen de especies sintomáticas en 2003 y 2004
JUNIO-JULIO AGOSTO-SEPTIEMBRE
ESPECIE NUMEROLOCALIDADES
PRESENTE
NUMEROLOCALIDADESSINTOMÁTICA
NUMEROLOCALIDADES
PRESENTE
NUMEROLOCALIDADESSINTOMATICA
Sintomáticas
Acer opalus 2 2 2 2Ailanthus altissima 21 3 21 8Corylus avellana 1 1 1 1Crataegus monogyna 2 2 1Fraxinus angustifolia 1 1 1 1Ipomoea indica 2 1 2Pinus halepensis 19 17 19 18Prunus spinosa 4 1 4 2Sambucus ebulus 3 1 3 2Solanum tuberosum 8 5 3Sorbus aria 1 2 1Ulmus minor 1 1Vitis vinifera 8 1 7 2
<Ozone Like>
Clematis flammula 2 1 2Colutea arborescens 1 1 1Convolvulus althaeoides 3 3 1Cornus sanguinea 1 1 1 1Daucus carota 1 1 1Fraxinus excelsior 1 1 1 1Fraxinus ornus 1 2 1Limonium sp. 1 1 1Lonicera etrusca 1 1 1Partenocisus quinquefolia 1 1 1 1Phalaris spinosa 6 3 2Pistacia lentiscus 8 8Rhamnus alaternus 3 1 3Rosa sp. 3 4 1Rubia peregrina 3 3Rubus ulmifolius 11 2 11 2Scorpiorus subillosus 1 1 0Sonchus sp. 1 1 0Sorbus aria 1 2 1Sorbus aucuparia 3 3Viburnum tinus 2 1 2 1
Tabla 3.2. Especies sintomáticas en 2003. Para cada especies se aporta el número de transectos enque la especie estaba presente y el número de transectos en que era sintomática para los dos periodosde muestreo: junio-julio y agosto-septiembre.
JUNIO-JULIO AGOSTO-SEPTIEMBRE
ESPECIE NUMEROLOCALIDADES
PRESENTE
NUMEROLOCALIDADESSINTOMATICA
NUMEROLOCALIDADES PRESENTE
NUMEROLOCALIDADESSINTOMATICA
Sintomáticas
Acer opalus 2 2 2 1Ailanthus altissima 23 6 24 11Corylus avellana 1 1 2 1Crataegus monogyna 2 1 3 1Fraxinus angustifolia 1 1 1 1Ipomoea indica 1 1 1Lycorpersicum esculentum 0 1 1Pinus halepensis 18 18 26 23Prunus spinosa 2 2 2Sambucus ebulus 3 3 3Solanum tuberosum 2 2 0Sorbus aria 1 2 1Ulmus minor 1 1 1 1Vitis vinifera 9 2 10 3
<Ozone Like>
Clematis flammula 3 3Convolvulus sp. 1 1 1Cornus sanguinea 1 1 1 1Fraxinus ornus 2 2 2Geranium sp. 1 1 0Limonium sp. 1 1Lonicera etrusca 1 1 1Partenocisus quinquefolia 2 1 1 1Phalaris spinosa 5 4 2Pistacia lentiscus 8 1 10 1Potentilla reptans 0 1 1Rhamnus alaternus 2 2Rosa sp. 2 8 1Rubia peregrina 2 5 1Rubus ulmifolius 10 1 14 2Silene sp. 1 1 0Sonchus sp. 2 2 2Sorbus aria 1 2 1Sorbus aucuparia 4 4 1Viburnum tinus 1 1 1 1
Tabla 3.3. Especies sintomáticas en 2004. Para cada especies se aporta el número de transectos enque la especie estaba presente y el número de transectos en que era sintomática para los dos periodosde muestreo: junio-julio y agosto-septiembre.
Durante el año 2003 se examinaron un total de 50 especies de las cuales 10
presentaron síntomas por ozono. Un total de 12 ó 11 especies, dependiendo del
momento de la revisión mostraron síntomas no específicos de ozono (<Ozone like>). En
el año 2004 el número total de especies examinadas fue de 46 en la primera revisión y
127 en la segunda. Las especies sintomáticas fueron 9 en Junio-Julio y 13 en Agosto-
Septiembre. En el caso de las especies que mostraron síntomas no específicos de ozono
(<Ozone like>) el total fue de 10 y 12 para la primera y segunda revisión.
Pinus halepensis y Ailanthus altissima son las especies sintomáticas más
representadas en las localidades examinadas en ambos años. El resto de las plantas
forestales sintomáticas observadas son casos aislados en cada parcela, solamente Acer
opalus, Sambucus ebulus y Prunus spinosa están presentes en más de una parcela. Las
especies Phalaris spinosa y Rubus ulmifolius presentan síntomas no específicos de
ozono con más frecuencia que el resto, sin embargo el patrón típico de coloraciones
rojizas que acompaña a estas especies dificulta la distinción con los síntomas de ozono.
Con respecto a los cultivos se han observado síntomas en patata, vid y tomate. En
la revisión de junio-julio los cultivos de patata (Solanum tuberosum) son sintomáticos en
la mayoría de las parcelas visitadas. En cinco de las ocho parcelas estudiadas, esta
especie no se evaluó en la segunda revisión por haberse eliminado el cultivo de los
campos. También se han observado plantas de vid (Vitis vinifera) sintomáticas pero con
menos frecuencia que en patata. En el caso del tomate (Lycopersicum sculentum) se
observaron síntomas en una parcela durante la segunda reivisión del 2004.
3.2.5. Fotos de especies sintomáticas en 2003
El año 2003 fue un año particularmente caluroso, y con una sequía estival muy
acusada. Debido a estas condiciones, al final del verano, en agosto-septiembre, los
síntomas de ozono fueron difíciles de interpretar al encontrarse las hojas bastante afectadas
tras la fuerte sequía estival. Algunas de las especies sintomáticas se muestran en la
siguiente colección de fotos. Los daños más extendidos fueron los de Pinus halepensis y
Ailanthis altissima. Los daños en Rubus ulmifolius y Fraxinus ornus no pueden ser atribuidos
al ozono con total seguridad, por lo que los consideramos dentro de la categoría de <ozone-
like>.
Figura 3.5. El ozono produce en Pinus halepensis (izq) un moteado clorótico característico. Ailanthus altissima es otraespecie frecuentemente sintomática (dcha, foto de Caudiel).
Figura 3.6. Especies con síntomas de ozono y con síntomas <ozone-like>. Todas las fotos excepto la última (Vitisvinifera, cuenca del Turia) proceden de la localidad en Alicante "Font Roja". Las fotos son de la revisión llevada a caboen agosto-septiembre, por lo que, tras desarrollar los daños por ozono, algunas de las hojas han sufrido un periodo desequía y los síntomas no son típicos. Especies: Columna izquierda, de arriba abajo: Sorbus aria, Acer opalus subsp.granatense, Fraxinus ornus (<ozone-like>); columna derecha, de arriba abajo: Rubus ulmifolius (<ozone-like>), Prunusspinosa, Vitis vinifera.
3.2.6. Fotos de especies sintomáticas en 2004
Figura 3.7. Especies con síntomas de ozono y con síntomas <ozone-like>. Todas las fotos son de la revisión llevada acabo en agosto-septiembre de 2004. Especies: Columna izquierda, de arriba abajo: Crataegus monogyna (Font Roja),Fraxinus ornus (Font Roja, <ozone-like>), Ipomea indica (Morella) y Vitis vinifera (Fontanars); columna derecha, dearriba abajo: Acer opalus subsp. granatensis (Font Roja), Viburnum tinus (Font Roja, <ozone-like>), Rubus ulmifolius(Morella, <ozone-like>), Sambucus ebulus , en parte con tambiénhongos (Fontanars).
3.2.7. Distribución de los síntomas en Ailanthus altissima
Figura 3.8. Distribución de la presencia de puntos con daños en Ailanthus altissima (rojo=algunas plantas condaños; azul=plantas sin daños) en los dos periodos de muestreo en 2003 (arriba): junio-julio y agosto-septiembre yen 2004 (abajo). Se observa un aumento del número de puntos con daños en el muestreo del final del verano enambos casos.
Ailanthus altissima es posiblemente la mejor especie indicadora de ozono en zonasmediterráneas secas. Su presencia en las diferentes parcelas se muestra en las figurasanteriores. Se puede observar que las localidades con daños en esta especie son
numerosas en ambos años, 2003 y 2004, y que hay un aumento del número de localidadescon plantas sintomáticas en el muestreo de agosto-septiembre, respecto al de junio-julio. Enesta especie, se presentan daños incluso en parcelas con concentraciones relativamentebajas de ozono.
3.2.8. Distribución de los síntomas en Pinus halepensis
Figura 3.9. Distribución de la presencia de puntos con daños en Pinus halepensis (rojo=algunas plantas con daños;azul claro=plantas sin daños; azul oscuro=clase 1 de daño, muy bajo) en los dos periodos de muestreo en 2003 y2004: junio-julio y agosto-septiembre. Se observa un aumento del número de puntos con daños en el muestreo delfinal del verano en ambos añps. En septiembre de 2004 se añadieron algunas parcelas más.
Como en el caso de Ailanthus altissima, Pinus halepensis presenta en lo saños 2003 y 2004
síntomas en muchas parcelas. Sin embargo, cabe destacar que en la bastantes casos los
daños eran muy bajos. Al final del verano se produce un aumento de los puntos con
síntomas, que se presentan incluso en zonas con niveles de ozono relativamente bajos.
3.2.8. Recogida de semillas y esquejes
En 2003, se recogieron semillas de diversas plantas de las parcelas muestreadas en la
Comunidad Valenciana, con la finalidad de reproducir los síntomas atribuidos al ozono en OTC
en condiciones controladas, fumigando con este gas contaminante. La recogida de semillas se
llevó a cabo tanto en los muestreos llevados a cabo como en viajes realizados a propósito, en
el caso de que las semillas no estuviesen suficientemente maduras para ser recolectadas en el
momento de la revisión para evaluar los daños. También se recibieron semillas procedentes de
Italia y de Francia, con el mismo fin (Tabla 3.4). Muchas de las plantas mostraban síntomas
<ozone-like>, semejantes a los que produce este contaminante en otras especies, pero que
habían de ser confirmados. Se eliminaron las coberturas de las semillas y se almacenaron en
nevera dentro de botes cerrados, con un producto desecante. Se buscó información sobre el
proceso de germinación en estas especies o en especies del mismo género. Esta información
determinó el proceso de germinación, que consistió en algunos casos en un tratamiento de frío,
escarificación con un ácido, etc.
En diciembre de 2003, se recogieron abundantes semillas de Ailanthus altissima,
procedentes de un único árbol que había mostrado abundantes síntomas de ozono en las
hojas, procedente de localidad de Caudiel. Las semillas se germinaron, se plantaron en
macetas y, tras brotar, en 2004, estas plantas se distribuyeron en diversos puntos de la
Comunidad Valenciana (ver apartado 3.2.10).
NOMBRE CIENTÍFICO PAÍS PROCEDENCIA RECOLECTOR FECHA DE RECOGIDASÍNTOMAS<OZONE-
LIKE>Acer pseudoplatanus Italia Piamprato Bona Gisella 18/08/03 SíAilanthus altissima España Caudiel (Castellón) Júlia Cerveró 05/12/03 SíAlnus viridis Italia Piamprato Bona Giselli 18/08/03 NoAstragalus glycyphyllos Italia Noasca Bona Giselli 03/09/03 SíCornus sanguinea España Villores (Castellón) Júlia Cerveró 28/08/03 SíCornus sanguinea Italia Borbera Valley Federica Spaziani 09/10/03 SíFraxinus excelsior Italia Turín (IPLA) Federica Spaziani 19/09/03 SíFraxinus excelsior Italia La Fornolosa Bona Giselli 21/08/03 NoGeranium sp. España Vallivana (Castellón) Júlia Cerveró 09/06/03 NoHeracleum sphondylium Italia Ceresole Bona Giselli 26/08/03 NoHypericum sp. España Villores (Castellón) Júlia Cerveró 28/08/03 NoHypericum sp. España Vilafamés (Castellón) Júlia Cerveró 09/06/03 NoIrisco sp. Italia Turín (IPLA) Federica Spaziani 09/10/03 SíLaburnum sp. Italia Ceresole Bona Gisela 26/08/03 NoLonicera etrusca España Villores (Castellón) Júlia Cerveró 28/08/03 SíLonicera etrusca España Villores (Castellón) Júlia Cerveró 28/08/03 NoMahonia aquifolia Italia Turín (IPLA) Federica Spaziani 09/10/03 SíOxyria digyna Italia Nivolet Bona Giselli 18/08/03 SíPeucedanum ostruthium Italia Nivolet Bona Giselli 11/08/03 SíPinus uncinata Italia Stura Valley Federica Spaziani 09/10/03 SíPulsatilla vernalis Italia Nivolet Bona Giselli 11/08/03 NoRobinia pseudoacacia España Bugarra (Valencia) Júlia Cerveró 22/08/03 NoRubia peregrina España Gàtova (Valencia) Júlia Cerveró 22/08/03 NoRubia peregrina España Bocairent (Alicante) Júlia Cerveró 21/08/03 NoSambucus ebulus España Bocairent (Alicante) Júlia Cerveró 04/09/03 SíSambucus ebulus Italia Turín (IPLA) Federica Spaziani 09/10/03 SíSambucus nigra Italia Rosone Bona Giselli 21/08/03 NoSambucus racemosa Italia Ceresole Bona Giselli 04/09/03 NoSonchus sp. España Vilafamés (Castellón) Júlia Cerveró 09/06/03 SíSonchus sp. España Vilafamés (Castellón) Júlia Cerveró 09/06/03 NoSymphonicarpos sp. Italia Turín (IPLA) Federica Spaziani 09/10/03 SíTeucrium sp. España Vilafamés (Castellón) Júlia Cerveró 09/06/03 No
Tabla 3.4. Especies de las que se recolectaron semillas en 2003.
NOMBRE CIENTÍFICO PAÍS PROCEDENCIA RECOLECTOR FECHA DE RECOGIDASÍNTOMAS<OZONE-
LIKE>
Sambucus ebulus Teruel Torrijas Júlia Cerveró 30/9/04 Si
Sambucus ebulus Alacant Lorxa Júlia Cerveró 7/9/04 Si
Sambucus ebulus València Bocairent Júlia Cerveró 7/9/04 Si
Sambucus ebulus Alacant Lorxa Júlia Cerveró 7/9/04 No
Tabla 3.5. Especies de las que se recolectaron semillas en 2004.
De las semillas recogidas en 2003 se germinaron algunas de las especies para su
fumigación. Otras se guardaron para fumigarlas en posteriores experiencias. Los resultados de
las especies fumigadas se pueden observar en el capítulo de "Experiencias en cámaras de
techo descubierto" (Apartado 4.5).
3.2.10. Experiencia de exposición plantas de Ailanthus altissima.
Semillas de Ailanthus altissima procedentes de una planta sintomática, fueron
recogidas en Caudiel. Se hicieron germinar y las plantas resultantes se expusieron en 5 puntos:
La Peira, El Saler (Río Turia), Benicarló, Sant Jordi y Morella (Río Cervol). Se expusieron 3
plantas por parcela desde principios de julio a finales de septiembre. Se eligieron estas
parcelas por estar dispuestas a diferentes altitudes en las cuencas de los dos ríos (bajo, medio
y alto) y por disponer de cabinas de medición de las concentraciones de ozono o de
dosímetros. Los resultados han puesto de manifiesto que las condiciones de la exposición de
las plantas ha sido determinante para el desarrollo de daños visibles por ozono. Las parcelas
en la que desarrollaron daños (El Saler y Benicarló) no se encontraban entre las de mayores
niveles de ozono, y se caracterizaban por su elevada humedad atmosférica y la exposición de
las plantas en un sitio sombreado. En las otras parcelas, las plantas sufrieron diversos tipos de
estrés (fuerte insolación, viento), lo que parece haber influido en el desarrollo de los síntomas.
La experiencia, para ser concluyente, se deberá repetir atendiendo a una mayor
homogenización en la forma de exposición de las plantas.
Figura 3.10. Plantas de Ailanthus altissima expuestas en Benicarló, procedentes de un árbol sintomático (izquierda).Las plantas poseían un sistema que les aseguraba una disponibilidad de agua durante todo el verano. Al final delverano se desarrollaron síntomas de ozono (derecha).
3.3. CONCLUSIONES
El presente proyecto ha permitido prospectar una amplia zona de la Comunidad
Valenciana con la finalidad de detectar los efectos del ozono en la vegetación. Las
características del tipo de vegetación, tanto arbórea como de matorral, típicamente
mediterránea, perenne y en muchos casos esclerófila es en principio un factor protector de los
efectos negativos del ozono. Las especies del género Quercus , por ejemplo, son poco
sensibles al ozono. Otras especies comunes del matorral mediterráneo como Rosmarinus,
Ulex, Cistus etc. no han desarrollado síntomas. Por otra parte, la sequía estival supone una
restricción importante para el intercambio gaseoso de las plantas, y consecuentemente, el
cierre de estomas por estrés hídrico va a impedir también la entrada del ozono en las hojas y
los daños. Por este motivo, los muestreos se centraron en plantas a priori más sensibles,
como es el caso de Ailanthus altissima y de Pinus halepensis principalmente. Ambas
especies se ha visto que presentan síntomas en numerosos puntos, incluyendo algunos con
valores relativamente bajos de ozono. En el caso de Pinus halepensis, los daños observados
en algunas parcelas, aunque presentes, fueron mayoritariamente escasos.
Por lo que respecta al resto de las especies y localidades, se ha detectado un mayor
número de plantas sintomáticas en zonas con riego. Es el caso de las parcelas de la Font Roja,
en la cuenca del río Serpis, dos de las cuales estaban en un vivero forestal que se utiliza para
repoblar la zona con especies autóctonas, y estaban por tanto bien irrigadas. También se
detectaron más daños por ejemplo, en la parcela de Morella, donde había una cierta
disponibilidad de agua. Por tanto, en condiciones climáticas como las de la Comunidad
Valenciana, el agua parece pues un factor fundamental a la hora de establecer las situaciones
donde la vegetación puede tener más riesgo y de detectar síntomas.
Este puede ser uno de los motivos por los que no se encuentre una relación clara
entre las concentraciones de ozono medidas y el número de especies sintomáticas en cada
parcela, o con los patrones de distribución en el territorio de los daños por ozono en Pinus
halepensis.
Con todo, este estudio ha permitido identificar numerosas especies que han
desarrollado síntomas incluso en estas condiciones, y otras con daños que podrían estar
producidos, o potenciados, por el ozono.
4. EXPERIENCIAS EN CAMARAS DE TECHO DESCUBIERTO (OPEN TOPCHAMBERS)
En las Cámaras de techo descubierto (OTC, del inglés "Open Top Chambers") las plantas se
pueden someter a diversos tratamientos: aire filtrado, aire ambiente y aire con ozono añadido. Es posible
comparar plantas que crecen sin ozono con otras cultivadas con aire ambiente o con aire con niveles
elevados de ozono. Así, se pueden reproducir los síntomas observados en el campo, y descartar posibles
daños no producidos por el ozono que pueden ser miméticos con los de este contaminante. Este tipo de
instalaciones es particularmente adecuado también para realizar estudios sobre los efectos fisiológicos y
sobre el crecimiento en especies de interés.
En 2002 se fumigaron diversas especies forestales, entre las que destacaremos dos especies de
Pistacia: P. lentiscus y P. terebinthus (ver apartado sobre anatomía, más adelante).
En 2003 se reprodujeron los síntomas en otras especies, y se hizo un seguimiento de daños en
tres especies de arce, en Ailanthus altissima y en Cornus sanguinea. Los resultados permitieron
establecer una escala de sensibilidad en estas especies en poblaciones del sur de Europa y descartar
daños no producidos por el ozono.
En 2004, se fumigaron otras especies con la finalidad de reproducir síntomas y se realizaron
estudios más detallados con Ailanthus altissima (especie introducida aunque con una gran distribución,
que se utiliza normamente como bioindicador), y en Acer monspesularum, Acer pseudoplatanus, A.
opalus subsp. granatense, A. campestre. En este año, el seguimiento de la evolución de daños se
completó y relacionó con estudios de fisiología: intercambio gaseoso y fluorescencia. Otras especies
fumigadas fueron: Betula alba, Mahonia aquifolia, Fagus sylvatica, Fraxinus angustifolia, Sorbus aria,
Sorbus aucuparia, Pinus halepensis, Pinus uncinata y Teucrium scoronia.
4.1. DESCRIPCIÓN DE LAS INSTALACIONES
4.1.1. LocalizaciónLas instalaciones se encuentran en la granja ecológica La Peira, en el término
municipal de Benifaió (prov. Valencia), partida de “La Peira” a 39º16’14.8’’N, 00º26’59’’W, a 30
m de altitud s.n.m. Está a 1 km del pueblo de Benifaió, a 20 km de la ciudad de Valencia y a 45
km de la sede principal de la Fundación CEAM en Paterna. La Peira dista 15 km en línea recta
de la costa y se establece en la llanura litoral valenciana sin la presencia de elevaciones
montañosas cercanas (fig. 1 y 2). El tamaño de la parcela es de 50 x 50 m.
4.1.2. Las Cámaras (OTC)La instalación consta de 9 invernaderos cilíndricos con el techo descubierto, OTC
(Open Top Chambers), modelo NCLAN, una unidad central de instrumentación instalada en
una caseta, una torre meteorológica de 10 m de altura y un sistema automático de fertirrigación
(fig. 4.1). El modelo consta de dos mitades cilíndricas, de 1.2 m de altura cada una, y un cono
truncado de 0.5 m de altura. La altura total del invernadero es de 3 m, con un diámetro interior
de 3 m en las circunferencias de las mitades inferiores y en la parte baja del cono truncada. En
la parte alta, la abertura es de 2.1 m de diámetro.
La estructura metálica se recubre con plástico trasparente de E.V.A. de 800 galgas
(Celloflex 4TT), con una trasmisión luminosa del 91%. En la parte inferior, tiene una doble
cubierta de plástico, cuya parte interior está perforada con agujeros de 2,5 cm de diámetro
dispuestos en 6 filas, con 50 agujeros cada una, espaciados horizontalmente 17 cm y 15 cm
verticalmente. La parte exterior sólo está perforada para permitir la entrada del conducto de
aire del ventilador. Una lámina simple de plástico recubre todo el perímetro exterior de la parte
superior, y del cono truncado.
Cada una de las cámaras dispone de una caja metálica de 0.9 x 1.2 x 2 m dispuesta en
la parte opuesta a la puerta. En la caja metálica se albergan 2 filtros de partículas, una turbina
(1.5 cv 3000 m3/h de caudal; 2.9 renovaciones de aire) y, en función del tratamiento ambiental
de la cámara, una batería de 12 filtros de carbón activo (fig. 7). Los filtros de carbón activo se
disponen en zigzag para aumentar la superficie de contacto y garantizar la mayor eficiencia en
el filtrado del aire. El ozono reacciona con las partículas de carbón activo reduciéndose hasta
en un 75% la concentración ambiental de ozono del aire en el interior de la cámara.
Dependiendo del tratamiento al que se somete el aire exterior, las cámaras pueden ser
de aire filtrado, no filtrado o enriquecidas con ozono. Aire filtrado, se refiere al aire que
atraviesa la batería de filtros de carbón activo. No filtrado, es el aire ambiente, los cajones
metálicos no disponen de filtros de carbón activo. Finalmente las cámaras con aire enriquecido
con ozono son de aire no filtrado con x ppb de ozono generado a partir de oxígeno puro.
Figura 4.1 (empieza en página anterior). Aspecto del campo experimental del CEAM en Benifaió ("La Peira", Valencia)(arriba). Estructura y partes de una cámara de techo descubierto (OTC) (centro). Aspecto del ventilador y los filtros decarbono en zig-zag, que eliminan el ozono del aire ambiente.
En cada una de las cámaras, en el mismo punto donde se encuentra la toma de
muestras de aire, se disponen sensores de temperatura (termistores LM335) y de humedad
relativa (sensor capacitivo Philips HS1100) registrando las variaciones continuamente y
recogiendo valores de todas las cámaras cada 10 minutos. El suelo de las cámaras está
cubierto con una malla antihierbas de geotextil (Horsol) de 140 g/m2 recubierta de arena. Por
encima se dispone una tubería de 2 cm de diámetro, describiendo dos circunferencias
concéntricas. La tubería está perforada a intervalos de 15 cm donde se instalan goteros
autocompensantes de 2 l/h..
Figura 4.2. Aspecto del interior de una cámara en la que se están cultivando plantas.
4.1.3. InstrumentaciónEl control del funcionamiento de la instalación, se realiza desde una caseta que alberga
toda la instrumentación. El módulo de adquisición y control está especialmente diseñado para
controlar la entrada de muestras de aire, alternar las secuencia de las cámaras y emitir una
señal al ordenador al que está conectado. Desde el ordenador se dan las órdenes y se maneja
la toma de muestras de aire de las cámaras. Asimismo, en el ordenador se recogen las
medidas de calidad del aire de las cámaras, y del ambiente, en archivos diarios de formato
texto, que se gestionan posteriormente con una hoja de cálculo.
Los tubos de teflón que conducen la muestra de aire desde las cámaras, se introducen
por una abertura en el techo de la caseta y van a parar a un sistema de electroválvulas. El
sistema está compuesto de 12 electroválvulas solenoidales cada una de ellas conectada a una
cámara. Las concentración de ozono se miden con un monitor de respuesta rápida DASIBI
1008-AH que utiliza el método de fotometría ultravioleta, que es el método de referencia
reglamentado en la directiva europea vigente para el ozono (02/03/CE). La concentración de
óxidos de nitrógeno se mide con un monitor DASIBI 2108 por el método de quimiluminiscencia,
que es el método de referencia reglamentado en la directiva europea vigente para los óxidos de
nitrógeno (99/30/CE). Este monitor posee un sistema de auto calibración cada 72 h para el cero
y el span. Las medidas de los sensores de radiación (PAR, Photosynthetic Active Radiation
LICOR tipo Quantum), temperatura ambiental (termopar tipo K) y humedad relativa (Philips
HS1100), se recogen en un acumulador de datos (Data Logger) Delta T, que registra las
medidas cada 10 minutos. El sistema generador de ozono consta de tres partes: la botella de
oxígeno puro, el generador de ozono y el sistema de distribución. A partir del oxígeno puro se
produce una reacción de oxidación propiciada por las descargas de alto voltaje (10.000-20.000
V) que se producen en el generador. Una vez se ha generado, el ozono sale por un tubo de
teflón hacia el módulo de distribución. En este módulo se alojan 4 unidades de flujo másico
(UNIT, 500 sccm) encargadas de controlar el flujo de salida y de distribuir el ozono hacia las
cámaras. En las cámaras con aire enriquecido con ozono el perfil de concentración de ozono
es semejante a la curva de niveles ambientales de ozono en la zona. El periodo de fumigación
con ozono se adapta al perfil de la curva y está programado para activarse a las 10 de la
mañana (CET) y desactivarse a las 18 h (CET).
Figura 4.3. Interior de la caseta deinstrumentación. A la izquierda elordenador desde el que se controla latoma de muestras de aire de las OTC y lagestión de los datos acerca de los nivelesde contaminantes. A la derecha de laimagen aspecto del la estructura metálicaen la que se disponen los distintosinstrumentos
4.2. EXPERIENCIAS EN 2002En 2002 se fumigaron diversas plantas forestales para reproducir los síntomas y
realizar estudios anatómicos con la finalidad de caracterizar los daños por ozono a nivel de
tejido y celular en tres tipos diferentes de plantas típicas del Mediterráneo: una conifera
ampliamente distribuida por todo el mediterráneo (Pinus halepensis), un arbusto perennifolio
(Pistacia lentiscus) y un arbusto caducifolio (Pistacia terebinthus). Los resultados obtenidos se
detallan en el capítulo 5 de esta memoria: "Caracterización de Daños Producidos por Ozono en
Hojas de Diversas Especies con el Microcopio Óptico".
4.3. EXPERIENCIAS EN 2003
En 2003 se fumigaron diversas plantas forestales y se realizó un seguimiento de la aparición de
daños visibles. En algunas espcies sólo se intentaba reproducir los daños visibles y comprobar
si las poblaciones del sur de Europa eran sensibles (ver figura 4.6, con fotos de daños de 2003
y 2004). Se establecieron 2 regimenes de fumigación, NF+30 (aire ambiente en La Peira + 30
ppb de ozono), con concentraciones de ozono moderadas, y NF+60 ppb (aire ambiente en La
Peira + 30 ppb de ozono), con concentraciones de ozono altas. En tres especies arce, se
intentó establecer una escala de sensibilidad. Se pudo comprobar que A. monspessulanum era
una especie relativamente resistente al ozono, ya que al final de la fumigación sólo 1 de las 6
plantas mostro síntomas (figura 4.4). Acer campestre fue más sensible, ya que al final del
experimento todas las plantas mostraron síntomas; y la especie más sensible de todas fue A.
pseudoplatanus, que fue la primera en mostrar síntomas y 5 de las 6 plantas presentaron
síntomas en el régimen de ozono más bajo, y a un valor de AOT401 por debajo de 10.000
ppb*h, que es el valor establecido para la protección de la vegetación. Esta experiencia sentó
la base para un estudio más detallado en 2004, incluyendo medidas fisiológicas. Ailanthus
altissima fue menos senible, mostrando síntomas ya al final de la experiencia. Se consideraron
a los enrojecimientos en las hojas de Cornus sanguinea como síntomas, pero se comprobó que
aparecian también en aire filtrado, por lo que se recomienda no usar esta planta como
indicadora en el campo.
Acer campestre
0
1
2
3
4
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NF+30
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Acer monspessulanum
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Acer pseudoplatanus
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dañ
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FNF+30
NF+60
Ailanthus altissima
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Cornus sanguinea
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1-ag
o
8-ag
o
13-a
go
19-a
go
25-a
go
1-se
p
8-se
p
19-s
ep
23-s
ep
3-oc
t
Fecha
Nº
Pla
ntas
dañ
adas F
NF+30
NF+60
AOT40 Acumulada
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
14-ju
l
21-ju
l
28-ju
l
4-ag
o
11-a
go
18-a
go
25-a
go
1-se
p
8-se
p
15-s
ep
22-s
ep
29-s
ep
6-oc
t
Fecha
AO
T40
NF OTC1F OTC4F OTC5NF+60 OTC6NF+30 OTC7NF+60 OTC8NF+30 OTC9
.
Figura 4.4.. Evolución del número de plantas con daños visibles en 2 regimenes de fumigación en 2003 en especies deAcer, Ailanthus y Cornus sanguinea. C. sanguinea no mostró daños específicos por ozono, ya que las plantas filtradas
1 AOT40 (Accumulated Over Treshold 40) es una dosis acumulada; se calcula sumando los valores horarios queexceden 40 ppb durante el día.
también mostraron "síntomas". Por tanto, el uso de esta planta como indicadora de ozono no es adecuado. La gráficade abajo derecha, muestra la evolución de los valores de AOT40 acumulados en las fechas de evaluación de daños.
4.4. EXPERIENCIAS EN 2004
En 2004 se realizaron numerosas experiencias dentro de las instalaciones OTC del
CEAM en Valencia. Se han realizado estudios con Ailanthus altissima (especie introducida
aunque con una gran distribución, siendo una de las espécies que muestra síntomas más
claros y ampliamente distribuidos en la Comunidad Valenciana), y se ha comprobado la
sensibilidad al ozono de poblaciones del sur de Europa en varias especies, incluyendo Acer
monspesularum, Acer pseudoplatanus, A. opalus subsp. granatense, A. campestre, Betula
alba, Cornus sanguinea, Mahonia aquifolia, Fagus sylvatica, Fraxinus angustifolia, Sorbus aria,
Sorbus aucuparia, Pinus halepensis, Pinus uncinata y Teucrium scoronia. En 2004, además de
la reproducción de síntomas mediante fumigaciones con ozono, se han llevado a cabo varias
experiencias con el objetico de detectar efectos a nivel fisiológico del ozono. Nos hemos
centrado en Ailanthus, en 4 especies de Acer y Sambucus ebulus. Los experimentos incluían
medidas de intercambio gaseoso y fluorescencia modulada. Durante toda la primavera y el
verano, se compararon plantas que crecían en aire filtrado con otras en aire ambiente + 30 ppb
(NF+30) de ozono. En la zona experimental los niveles de ozono son relativamente bajos, y
elevando 30 ppb las concentraciones de ozono ambientales, desde las 10 de la mañana hasta
las 6 de la tarde, se obtuvieron concentraciones más semejantes a las de las zonas
montañosas de la Comunidad Valenciana. Los experimentos comenzaron el 11 de Mayo y
finalizaron el 21 de septiembre. Las concentraciones acumuladas para las diferentes fechas se
muestran en el siguiente gráfico:
Figura 4.5. Evolución de los valores de AOT40 acumulados a lo largo del experimento para las diferentescámaras (en diferentes colores).
4.4.1. Reproducción y seguimiento de daños visibles
El ozono produce daños visibles en las hojas de especies sensibles. Los síntomas son
bastante variados. En coníferas, se produce un moteado clorótico o un amarilleamiento de las
acículas. En plantas de hoja ancha, los daños son pequeñas punteaduras blancas, negras,
pardas o rojizas, o un enrojecimiento prematuro de las hojas. Los daños visibles producidos por
el ozono, típicamente se presentan sólo en el haz de las hojas (aunque pueden alcanzar el
envés en hojas finas), y no afectan a los nervios. Al contrario que en otros contaminantes
como el SO2, las hojas más viejas están más afectadas que las jóvenes. Incluso en hojas
compuestas, las hojas basales, más viejas, suelen estar más dañadas que las apicales.
En la figura 4.6 se presentan algunas fotos de daños reproducidos en condiciones
experimentales. En las especies en las que se disponía de suficientes plantas se ha realizado
un seguimiento de los daños visibles a lo largo de la fumigación con ozono. Las plantas
fumigadas con ozono procedian de viveros y también de semillas recogidas por los
participantes en el proyecto. En este sentido, cada destacar que a veces las semillas o los
plantones no han sido viables, especialmente los procedentes de zonas de alta montaña, ya
que las condiciones de la estación experimental de Valencia eran climáticamente muy
diferentes. Por otra parte, estas experiencias de fumigación han permitido detectar especies
problemáticas, cuyo uso como indicadores de ozono no es adecuado. Es el caso de Cornus
sanguinea, Mahonia aquifolia y Teucrium scorodonium (ver figura 4.7).
Figura 4.6. Ejemplo de la reproducción de daños visibles en condiciones controladas (OTC) en plantas procedentes delas tres regiones participantes en el proyecto Interreg. Columna de la izquierda, de arriba abajo: a) Daños en Fraxinusangustifolia, Crataegus monogyna, Sambucus nigra y Sambucus ebulus (las fotos recogen un estado anterior a laaparición de necrosis en las hojas, cuando se aprecia una decoloración). Columna de la derecha, de arriba a abajo:Acer campestre, A. pseudoplatanus (las 2 centrales, la superior con más daños) y A. opalus granatense.
Figura 4.7. El cultivo de plantas en aire filtrado (niveles de ozono mínimos) dentro de las OTC ha permitido constatarque especies como Cornus sanguinea (izquierda), Teucrium scoronia (derecha, arriba) o Mahonia aquifolia (derecha,abajo), presentaban enrojecimientos en las hojas semejantes a los observados en el campo. Aunque las plantastratadas con niveles de ozono mayores que los ambientales suelen presentar enrojecimientos más acusados que lasque cecen en aire filtrado, este tipo de síntoma no específico puede llevar a la confusión en el campo, por lo que no serecomienda su uso como indicadoras de los efectos del ozono.
En aquellas especies de las que se disponía de suficientes plantas, se ha realizado un
seguimiento de la aparición de los daños visibles. Es el caso de las especies en las que se
realizaron también medidas de intercambio gaseoso: Acer campestre, A. monspessulanum, A.
opalus subsp. granatense, A. pseudoplatanus, Ailanthus altissima, y Sambucus ebulus. Las
plantas se examinaron cada 2 días y se apuntaba la fecha de la aparición de la primera hoja
con síntomas de ozono en cada planta. Complementariamente, una vez a la semana, se
apuntaba tanto el porcentaje de hojas afectadas en cada planta (LA), como el porcentaje de
área foliar (AA) afectada en las hojas con síntomas, usando una escala con pasos de un 5%.
Para evaluar la totalidad de daño en la planta, se calculó un Indice de Daño, como el producto
de LA*AA.
El caso más interesante de los estudiados es el experimento con las 4 especies de
arce. Todas las plantas procedían de España: Acer campestre, de la provincia de Valencia,
Acer opalus subsp. granatensis, de la región de Els Ports-Maestrat, provincia de Castellón
(ambas provincias pertenecen a la Comunidad Valenciana), y el origen de Acer
monspesulanum y Acer pseudoplatanus era Madrid. Las plantas que crecieron en aire filtrado
(se elimina prácticamente todo el ozono) no desarrollaron daños. Las plantas que fueron
fumigadas con ozono (aire no filtrado, ambiente, con 30 ppb añadidos de ozono [NF+30], de 10
a 18 h), mostraron síntomas, que fueron de diversa intensidad y evolucionaron de forma
distinta en las 4 especies. La aparición del primer síntoma no se puede considerar indicativa de
la evolución posterior de los daños. Dicho de otro modo, el hecho de que una especie
presentara daños visibles antes que otra no tenia por que implicar necesariamente que la
primera especie fuera la que al final tendría más superficie de planta dañada. El Indice de
Daño, que combina el porcentaje de hojas con algún daño, y la intensidad media de este daño
refleja mejor la realidad. En 2004, se pudo comprobar que las 4 especies de arce tenían
sensibilidades distintas al ozono. A. monspessulanum fue la especie menos sensible, con
apenas hojas dañadas al final del experimento, A. campestre se mostró más sensible, si bien
claramente menos que A. pseudoplatanus, con gran cantidad de hojas dañadas al final del
verano, y especialmente A. opalus subsp. granatense, que fue la especie más sensible (figura
4.8). Esta sensibilidad era coherente con las alteraciones medidas a nivel fisiológico, como es
el caso del intercambio gaseoso (ver más adelante).
0
5
10
15
20
25
0 6 15 20 28 35 42 52 58 66 72 80 87 94 100
108
122
133
Days after starting of fumigation
Inju
ry In
dex
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
AO
T40
(ppb
*h)
A. opalusA. campestre A. pseudoplatanusA. monspessulanumAOT40
Figura 4.8. Comparación de la evolución del Indice de Daño y AOT40 en 4 especies de arce procedentes de
poblaciones de España. Por lo que respecta al desarrollo de daños visibles, la sensibilidad de estas especies sigue el
siguiente orden: A. opalus subsp. granatense>A. pseudoplatanus>A. campestre>A. monspessulanum.
4.4.2. Efectos del ozono a nivel fisiológico
El ozono afecta a diversos procesos fisiológicos. Uno de las respuestas más frecuentes
es la disminución de la asimilación del CO2. La menor tasa de fotosíntesis puede finamente
repercutir el crecimiento, reproducción y capacidad de respuesta de las plantas frente a otros
estreses. En esta reducción en la asimilación pueden intervenir diversos procesos, incluyendo:
a) Disminución de la apertura de los estomas: se produce una reducción en la conductancia
estomática de las hojas; b) Reducción del contenido en clorofila; c) Efectos a nivel del
fotosistema II (e.g. con la fluorescencia se detecta reducción en la eficiencia cuántica del
fotosistema II (PSII)).
Durante la primavera y verano de 2004, además de la reproducción de síntomas mediante
fumigaciones con ozono, se han llevado a cabo varias experiencias con el objetico de detectar
efectos a nivel fisiológico del ozono. Nos hemos centrado en Ailanthus, en 4 especies de Acer y
Sambucus ebulus, por ser especies que en la región mediterránea muestran síntomas en el
campo con relativa frecuencia. Son por tanto especies sensibles. Los experimentos incluían
medidas de crecimiento, contenido en clorofila, intercambio gaseoso y fluorescencia modulada
en las plantas, aunque aquí nos centraremos en los dos últimos tipos de medidas
mencionados.
4.4.2.1. Material y métodos
Las instalaciones y sistema de fumigación se han descrito anteriormente. Se llevaron a
cabo 2 tratamientos: aire filtrado (F) y aire ambiente + 30 ppb de ozono (NF+30). La fumigación
comenzaró el 11 de mayo y finalizó el 21 de septiembre, de 10 de la mañana hasta las 6 de la
tarde.
Las plantas se cultivaron en macetas con un 50% de fibra de coco, 30% de fibra, 10%
de arena y 10% de vermiculita, con un pH del suelo cercano a . Se incorporó un fertilizante de
liberación lenta (Osmocote plus), con un NPK 20:20:20 y micronutrientes. Las plantas se
regaban con un sistema de riego por goteo, y se evitaba el estrés hídrico.
El intercambio gaseoso de las plantas se midió con sistema portatil de fotosíntesis
(LICOR-6400, LICOR Inc., Lincon, NE, USA), con un analizador de gases por infrarojos (IRGA).
La temperatura del bloque Peltier de la cubeta de medida se fijó a 25 ºC, y el flujo de fotones de
la luz (photon flux density, PFD) a 1000, un valor que se había visto previamente que era
saturante para las especies de arce. Se marcaron 6 hojas de 6 plantas filtradas (F) y de 6
plantas fumigadas (NF+30) y se realizó un seguimiento de los parámetros de intercambio
gaseoso, primero a los 15 días desde el inicio de la fumigación, y después, mensualmente,
siempre durante la mañana. A finales de agosto se realizaron unas mediadas complementarias,
para las que se seleccionaron nuevas hojas.
Las medidas de fluorescencia modulada se realizaron a temperatura ambiente en las
mismas hojas que las medidas de intercambio gaseoso, usando un fluorimetro portátil (PAM-
200, Walz, Effeltrich, Alemania). Las hojas se adaptaron a la oscuridad, al menos durante 30
minutos antes de las medidas. Tras la adaptación a la oscuridad, se determinó la fluorescencia
mínima (Fo), y aplicando un flash de luz blanca saturante (0.8 s a 8000 µmol m-2 s-1), tambien
la fluorescencia máxima (Fm). Esto permite el cálculo de la eficiencia cuántica máxima del
fotosistema II, calculada como Fv:Fm=(Fm-Fo):Fm. A continuación ,as muestras se someten a
una serie de pulsos saturantes cada 20 s, durante 5 min en presencia de luz actínica. Esto
permitió la determinación de la fluorescencia máxima en condiciones de luz (Fm’) después de
cada pulso saturante y, con la luz actínica, que activa la fotosíntesis, también se determinó la
eficiencia (yield) en ese estado estacionario (Fs); la fluorescencia mínima en condiciones de luz
(Fo’) se midió aplicando un pulso de luz en el rango del rojo lejano durante una breve
interrupción de la iluminación actínica. En cada pulso saturante, se calcula el coeficiente de
atenuación ("quenching") no fotoquímica (NPQ) de la energía absorbida, basándonos en la
ecuación NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’. El coeficiente de atenuación fotoquímico (qp), que representa el
estado redox del aceptor primario de electrones del PSII, Qa, se calcula como (Fm’-Fs)/( Fm’-
Fo). La eficiencia cuántica de la transferencia de electrones al PSII (ΦPSII) se estima como ΦPSII
= (Fm’-Fs)/ Fm’, y la eficiencia cuántica de excitación de los centros de excitación oxidados del
PSII se calcula como Φexc= (Fm’- Fo’)/ Fm’. El ratio entre la presión de excitación (1-qP) y NPQ,
considerado también un buen estimador del exceso de fotones, también se calculó.
4.4.2.2. Intercambio gaseoso y fluorescencia en 4 especies de arce
Al igual que en el caso de los daños visibles, la fumigación con ozono produjo efectos
de intensidad diferente en el intercambio gaseoso de las 4 especies de arce estudiadas. La
especie más sensible fue, de forma coherente con lo establecido en el seguimiento de daños,
A. opalus subsp. granatense. Para este estudio se marcaron 6 hojas de cada especie al iniciar
el experimento (Fig. 4.9); se observa que a principios de junio ya comienza a haber una
disminución de la asimilación fotosintética (NP) en las plantas fumigadas (NF+30), respecto a
las plantas que crecian en aire filtrado (F). Al final del verano, estas diferencias son muy
acusadas. La disminución en la asimilación (NP) está relacionada con una disminución en la
conductancia estomática (gs). Estas disminuciones en la conductancia y la asimilación se han
descrito para diversas especies, y pueden estar asociadas a una menor eficiencia del PSII,
menor contenido en clorofila, alteraciones a nivel metabólico (p. ej. el ozono afecta a la
actividad de la Rubisco, un enzima con un papel clave en la fotosíntesis), cambios a nivel
anatómico etc. Obviamente, por tratarse de un seguimiento siempre sobre las mismas hojas, al
final algunas de las hojas sobre las que se medía mostraban daños. Un estudio
complementario separando hojas sintomáticas de no sintomáticas en plantas fumigadas se
llevó a cabo al final de agosto (ver siguiente párrafo).
A. opalus-2004
0
2
4
6
8
10
12
14
7_May 27_May 9_Jun 19_Jul 26_Aug
NP
(µm
ol/m
2 s)
FNF+30
A. opalus-2004
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
7_May 27_May 9_Jun 19_Jul 26_Aug
gs (m
mol
/m2 s
)
FNF+30
Figura 4.9. Acer opalus subsp. granatense fue una de las especies estudiadas más sensibles al ozono, presentandoabundantes daños al final del periodo de fumigación en 2004. Coherentemente, fue también la especie de arce en laque se produjo un descenso más claro de la asimilación de CO2 (NP) y de la conductancia estomática (gs) a lo largo dela experiencia. [F=Aire Filtrado, NF+30=Aire Ambiente + 30 ppb de O3; n=6; media ± error estándar].
Además del seguimiento anteriormente descrito, el 27 de agosto se realizó un estudio
comparativo de diversos parámetros fotosintéticos y de fluorescencia separando: hojas
procedentes de plantas filtradas (F), hojas de plantas fumigadas sin síntomas visibles claros
(NF+30, NSL), y hojas con daños visibles (NF+30, SL) de las 4 especies de arce (Tabla 4.1).
Si bien todas las especies presentaron una disminución de la asimilación de CO2 (NP) en las
hojas dañadas, en A. opalus subsp. granatense y A. pseudoplatanus, las hojas de plantas
fumigadas pero sin daños evidentes también mostraron una disminución significativa de la
asimilación, lo que es indicativo de su mayor sensibilidad al ozono, ya puesta de manifiesto por
la mayor intensidad de daños visibles al final del experimento. La asimilación máxima medida
(Amax) era notablemente menor en el caso de las hojas con síntomas. Sólo se observó una
disminución significativa de la conductancia estomática (gs) en las hojas dañadas (excepto en
A. campestre) y, coherentemente, las hojas sintomáticas tenian una menor transpiración (Tr) y
mayores concentraciones internas de CO2 (Ci).
Amax NP gS Ci TrF 9.42 7.6±0.6a 168.1±28.0a 270.8±5.5a 2.2±0.2a
A. campestre NF+30, NSL 8.55 6.4±0.9a 186.4±21.2a 300.0±5.8b 2.3±0.1aNF+30, SL 5.51 4.5±0.3b 135.9±14.7a 301.3±4.3b 1.7±0.1bF 10.2 7.8±0.5a 154.3±13.6a 255.5±5.4a 2.1±0.1a
A. monspessulanum NF+30, NSL 9.23 6.0±1.1a 133.0±19.8a 270.0±7.0a 1.8±0.2aNF+30, SL 3.61 2.4±0.3b 075.3±14.5b 291.5±9.8b 1.2±0.2bF 9.09 7.7±0.5a 139.0±10.3a 251.5±4.6a 1.7±0.1a
A. opalus NF+30, NSL 8.01 5.7±0.6b 139.9±25.7a 271.5±9.4b 1.7±0.3aNF+30, SL 4.46 3.7±0.2c 77.2±4.8b 273.2±4.2b 1.0±0.1bF 11.3 9.5±0.5a 216.0±22.3a 263.2±3.6a 2.5±0.2a
A. pseudoplatanus NF+30, NSL 7.5 7.1±0.1b 160.5±12.9ab 267.5±5.6a 2.0±0.1aNF+30, SL 6.13 3.4±0.9c 100.6±24.3b 296.3±5.5b 1.3±0.2b
Tabla 4.1. Parámetros fotosintétios en las 4 especies de arce estudiadas, el 27 de agosto de 2004. Se comparan hojasde plantas que crecen en aire filtrado, libre de ozono (F), con hojas de plantas fumigadas con ozono (NF+30),separando hojas no sintomáticas (NSL) y hojas sintomáticas (SL). Asimilación máxima (Amax), asimilación de CO2 (NP),conductancia estomática (gs), concentración de CO2 interna (Ci), transpiración (Tr). [F=Aire Filtrado, NF+30=AireAmbiente + 30 ppb de O3; n=6; media ± error estándar; las diferencias significativas se indican con diferentes letras,p<0.05].
En paralelo con las medidas de intercambio gaseoso, se realizaron medidas de
fluorescencia modulada sobre las mismas hojas. Se detectó una disminución de la eficiencia
cuántica máxima del fotosistema II (Fv:Fm) en todas las especies, pero únicamente en las
hojas con síntomas visibles de ozono. Acer opalus y A. pseudoplatanus, las especies que
desarrollaron más síntomas, muestran una disminución coherente de este parámetro en hojas
asintomáticas de plantas fumigadas respecto a las hojas de plantas que han crecido en aire
filtrado, pero la disminución no es significativa. El análisis de los coeficientes de atenuación
("quenching") aporta mayor información. En la siguiente tabla se comparan los tratamientos tras
el último pulso saturante (nº 16). Estos resultados confirman que A. monspessulanum es la
especie menos sensible al ozono, ya que no hay diferencias significativas ni siquiera entre las
hojas marcadas (muy poco marcadas) y las de plantas en aire filtrado para ninguno de los
parámetros considerados. A. campestre ocupa una posición intermedia, ya que las hojas
sintomáticas presentan un menor qP y ΦPSII que las no sintomáticas y las filtradas. Finalmente,
la fluorescencia también confirma que A. opalus subsp. granatense y A. pseudoplatanus son
las especies más sensibles, con diferencias significativas de las hojas no sintomáticas
fumigadas respecto a las hojas de plantas en aire filtrado. Estos resultados sugieren que los
coeficientes de atenuación ("quenchings") aportan información sobre el estrés por fotooxidantes
en hojas que aún no han desarrollado síntomas visibles evidentes. Las hojas fumigadas no
sintomáticas (y también las sintomáticas) presentan una disminución del qP en paralelo con un
aumento del NPQ: la energía absorbida se disipa en mayor grado de forma no fotoquímica (p.e.
calor), frente a la via fotoquímica, lo que sugiere una menor eficiencia en la fotosíntesis. Junto
con la disminución en la conductancia estomática, que determina una disminución del flujo de
CO2 al interior de las hojas, estas alteraciones puestas de manifiesto por la fluorescencia,
contribuyen al descenso observado de la asimilación del CO2, en las especies sensibles.
Figura 4.10. Instrumentos utilizados para las medidas de intercambio gaseodo (arriba) y fluorescencia modulada
(abajo)
Fv:Fm ΦPSII Φexc qp NPQ (1-qp)/NPQF 0.788±0.005a 0.340±0.039a 0.324±0.063a 0.692±0.043a 1.482±0.291a 0.222±0.015a
A. campestre NF+30, NSL 0.787±0.008a 0.322±0.027a 0.310±0.058a 0.675±0.027a 1.532±0.218a 0.226±0.025aNF+30, SL 0.745±0.015b 0.232±0.017b 0.232±0.021a 0.546±0.033b 2.299±0.240a 0.201±0.007aF 0.783±0.007a 0.339±0.038a 0.297±0.062a 0.733±0.030a 1.447±0.264a 0.210±0.038a
A. monspessulanum NF+, NSL 0.791±0.004a 0.332±0.023a 0.278±0.026a 0.691±0.025a 1.432±0.144a 0.219±0.007aNF+, SL 0.742±0.016b 0.261±0.025a 0.248±0.025a 0.624±0.036a 1.998±0.317a 0.200±0.016aF 0.791±0.007a 0.383±0.012a 0.305±0.005a 0.750±0.014a 1.076±0.073a 0.233±0.004a
A. opalus NF+30, NSL 0.776±0.008a 0.315±0.005b 0.268±0.009b 0.681±0.009b 1.464±0.044b 0.218±0.005aNF+30, SL 0.747±0.011b 0.257±0.021c 0.218±0.012c 0.623±0.024c 2.002±0.236b 0.197±0.015aF 0.793±0.003a 0.538±0.016a 0.687±0.047a 0.823±0.015a 0.482±0.047a 0.370±0.009a
A. pseudoplatanus NF+30, NSL 0.781±0.009a 0.389±0.027b 0.366±0.041b 0.729±0.013b 1.066±0.173b 0.274±0.026bNF+30, SL 0.739±0.029b 0.300±0.037c 0.259±0.029b 0.628±0.047c 1.640±0.332b 0.241±0.016b
Tabla 4.2. Parámetros de fluorescencia las 4 especies de arce estudiadas, a final de agosto de 2004. Se comparan hojas deplantas que crecen en aire filtrado, libre de ozono (F), con hojas de plantas fumigadas con ozono (NF+30), separando hojas nosintomáticas (NSL) y hojas sintomáticas (SL). Eficiencia cuántica máxima del fotosistema II (Fv:Fm), "quenching" no fotoquímico(NPQ), "quenching" fotoquímico (qp), eficiencia cuántica de la transferencia de electrones al PSII (ΦPSII), eficiencia cuántica deexcitación de los centros de excitación oxidados del PSII (Φexc), ratio entre la presión de excitación (1-qP) y NPQ.. [F=AireFiltrado, NF+30=Aire Ambiente + 30 ppb de O3; n=6; media ± error estándar; las diferencias significativas se indican condiferentes letras, p<0.05].
4.4.2.2. Intercambio gaseoso en Ailanthus altissima
Como en el caso de los arces más sensibles, el estudio del intercambio gaeoso en
Ailanthus altissima realizado en 2004, produjo resultados similares. Se observó una
disminución de la asimilación fotosintética (NP) en las plantas fumigadas (NF+30), respecto a
las plantas que crecian en aire filtrado (F). Estas diferencias se hicieron evidentes a mediados
de julio y se intensifican al final del verano. Como en el caso anterior, la disminución en la
conductancia estomática (gs) explica en parte la menor asimilación de CO2 en plantas
fumigadas.
Ailanthus altissima-2004
0
2
4
6
8
10
12
14
16
7_May 11_Jun 1_Jul 15_Jul 27_Aug
Fecha
NP
(µm
ol/m
2 s)
FNF+30
Ailanthus altissima-2004
0
50
100
150
200
250
300
350
7_May 11_Jun 1_Jul 15_Jul 27_Aug
Fecha
gs (m
mol
/m2 s
)
F
NF+30
Figura 4.11. Seguimiento del intercambio gaseoso en Ailanthus altissima en 2004. Asimilación de CO2 (NP) yconductancia estomática (gs) a lo largo de la experiencia. [F=Aire Filtrado, NF+30=Aire Ambiente + 30 ppb de O3; n=6;media ± error estándar].
4.5. VALIDACIÓN DE ALGUNOS SÍNTOMAS
En el marco de este proyecto, se han validado los síntomas comparando con la base a
la base de datos de daños por ozono que se encuentra en el sitio web del CEAM
(www.gva.es/ceam/icp-forest), y que incluye tanto plantas fumigadas en OTCs como daños
observados en el campo en zonas con niveles altos de ozono (p. ej. sur de Suiza). Además de
esta base de datos, por experimentos anteriores, se dispone de abundante documentación
gráfica sobre un gran número de especies, que en parte ha estado publicada en el libro "La
Contaminación Atmosférica en los Bosques: Guía para la identificación de daños visibles
causados por ozono" (Sanz et al., 2001, Ministerio de Medio Ambiente, 163 p.).
Otras especies se han fumigado durante el presente proyecto. Durante el verano del
2004 se fumigaron algunas de las plantas procedentes de las semillas recogidas en 2003
(Tabla 4.3). Algunas plantas fueron problemáticas y no desarrollaron síntomas específicos de
ozono, ya que al final se presentaron enrojecimientos tanto en las plantas que crecian en aire
filtrado como en las fumigadas. Para Heracleum sphondylium, de la que únicamente germinó
una planta no se observaron ningun tipo de daño en sus hojas aciculares. Por el contrario, las
poblaciones de Sambucus ebulus y S. nigra de Italia presentaron síntomas específicos de
ozono. Aunque por razones de espacio y técnicas no se han fumigado todas las plantas de las
que se han recogido semillas en la parte de campo de este proyecto, esta labor se irá
realizando en sucesivos años, realizando estudios comparativos entre especies de diversas
procedencias.
Nombre Científico Provincia Proveedor Germinadas Síntomasespecíficos
Geranium sp. España (Vallivana,Castellón)
Júlia Cerveró >15 No
Heracleum sphondylium Italia (Ceresole) Bona Giselli 1 No
Lonicera etrusca España (Villores,Castellón)
Júlia Cerveró >15 No
Mahonia aquifolia Italia (Turín, IPLA) Federica Spaziani 2 No
Oxyria digyna Italia (Nivolet) Bona Giselli 13 No
Pulsatilla vernalis Italia (Nivolet) Bona Giselli >15 No
Sambucus ebulus Italia (IPLA) Federica Spaziani >15 Sí
Sambucus nigra Italia (Rosone) Bona Giselli >15 Sí
Sonchus sp. España (Vilafamés,Castellón)
Júlia Cerveró >15 No
Teucrium sp. España (Vilafamés,Castellón)
Júlia Cerveró >15 No
Tabla 4.3. Especies fumigadas en 2004 procedentes de diferentes zonas. Se indica la procedencia, elnúmero de plantas que germinaron (si es mayor que 15, e pone >5), y si finalmente presentaron síntomasespecíficos o no.
4.5. CONCLUSIONES
En 2002 se fumigaron diversas especies forestales, entre las que destacaremos dos
especies de Pistacia: P. lentiscus y P. terebinthus. El estudio de las alteraciones producidas por
el ozono ha permitido caracterizar la evolución de los daños en especies típicamente
mediterráneas. También se han realizado estudios sobre Pinus halepensis (ver apartado "5.
Caracterizacion de daños producidos por ozono en hojas de diversas especies con el
microscopio optico).
En 2003 se reprodujeron los síntomas en otras especies, y se hizo un seguimiento de
daños en tres especies de arce, en Ailanthus altissima y en Cornus sanguinea. Los resultados
permitieron establecer una escala de sensibilidad en estas especies en poblaciones del sur de
Europa y descartar daños no producidos por el ozono.
En 2004, se fumigaron otras especies con la finalidad de reproducir síntomas y se
realizaron estudios más detallados con Ailanthus altissima (especie introducida aunque con
una gran distribución, que se utiliza normamente como bioindicador), y en Acer
monspesularum, Acer pseudoplatanus, A. opalus subsp. granatense, A. campestre. En este
año, el seguimiento de la evolución de daños se completó y relacionó con estudios de
fisiología: intercambio gaseoso y fluorescencia. Otras especies fumigadas fueron: Betula alba,
Mahonia aquifolia, Fagus sylvatica, Fraxinus angustifolia, Sorbus aria, Sorbus aucuparia, Pinus
halepensis, Pinus uncinata y Teucrium scoronia. En estas especies, se documentaron
fotográficamente los daños visibles reproducidos. En algunas de estas especies, como es el
caso de Mahonia aquifolia, se observó un enrojecimiento en las hojas incluso en aire filtrado,
por lo que son especies problemáticas para su uso como bioindicadoras de ozono en el campo.
El caso más interesante de los estudiados es el experimento con las 4 especies de
arce procedentes del sur de Europa. Se comprobó que la aparición del primer síntoma no se
puede considerar indicativa de la evolución posterior de los daños. Dicho de otro modo, el
hecho de que una especie presentara daños visibles antes que otra no tenia por que implicar
necesariamente que la primera especie fuera la que al final tendría más superficie de planta
dañada. El Indice de Daño, que combina el porcentaje de hojas con algún daño, y la intensidad
media de este daño refleja mejor la realidad. A. monspessulanum fue la especie menos
sensible, con apenas hojas dañadas al final del experimento, A. campestre se mostró más
sensible, si bien claramente menos que A. pseudoplatanus, con gran cantidad de hojas
dañadas al final del verano, y especialmente A. opalus subsp. granatense, que fue la especie
más sensible. Esta sensibilidad era coherente con las alteraciones medidas a nivel fisiológico,
como es el caso del intercambio gaseoso.
La fumigación con ozono produjo efectos de intensidad diferente en el intercambio
gaseoso en estas 4 especies de arce. A. opalus subsp. granatense experimentó una
disminución de la asimilación fotosintética (NP) y de la conductancia estomática (gs) en las
plantas fumigadas ya a principio del verano. A finales de agosto, se realizó un estudio
complementario separando hojas sintomáticas de no sintomáticas en plantas fumigadas. Si
bien todas las especies presentaron una disminución de la asimilación de CO2 (NP) en las
hojas dañadas, en A. opalus subsp. granatense y A. pseudoplatanus, las hojas de plantas
fumigadas pero sin daños evidentes también mostraron una disminución significativa de la
asimilación, lo que es indicativo de su mayor sensibilidad al ozono, ya puesta de manifiesto por
la mayor intensidad de daños visibles al final del experimento. Igualmente, en estas especies,
los coeficientes de atenuación ("quenchings") aportan información sobre el estrés por
fotooxidantes en hojas que aún no han desarrollado síntomas visibles evidentes. Las hojas
fumigadas no sintomáticas (y también las sintomáticas) presentan una disminución del qP en
paralelo con un aumento del NPQ: la energía absorbida se disipa en mayor grado de forma no
fotoquímica (p.e. calor), frente a la via fotoquímica, lo que sugiere una menor eficiencia en la
fotosíntesis. Junto con la disminución en la conductancia estomática, que determina una
disminución del flujo de CO2 al interior de las hojas, estas alteraciones puestas de manifiesto
por la fluorescencia, contribuyen al descenso observado de la asimilación del CO2, en las
especies sensibles.
Como en el caso de los arces más sensibles, el estudio del intercambio gaeoso en
Ailanthus altissima realizado en 2004, produjo resultados similares. Se observó una
disminución de la asimilación fotosintética (NP) en las plantas fumigadas (NF+30), respecto a
las plantas que crecian en aire filtrado (F).
5. CARACTERIZACION DE DAÑOS PRODUCIDOS POR OZONO EN HOJAS
DE DIVERSAS ESPECIES CON EL MICROSCOPIO OPTICO
Los daños visibles son la manifestación externa de una serie de alteraciones
anatómicas que están desencadenadas por reacciones relacionadas con el estrés oxidativo.
Los daños en tejidos aparecen antes de que se manifiesten los daños visibles. Los estudios
anatómicos e histológicos en condiciones controladas permiten caracterizar el tipo de
alteraciones debidas al ozono y su evolución en las hojas de las plantas sensibles. Esta
información es básica para poder diferenciar los daños inducidos por este contaminante de
otros daños miméticos, como son los producidos por algunos insectos.
En el presente apartado se pretende caracterizar la evolución de las alteraciones
producidas por el ozono a nivel celular y de tejidos en tres especies típicamente mediterráneas.
Una de ellas, Pinus halepensis, es una conífera ampliamente distribuida por las zonas bajas
del mediterráneo, y es considerada una especie sensible al ozono en la literatura. Las otras dos
especies pertenecen al género Pistacia, y son arbustos típicos del Mediterráneo: Pistacia
lentiscus, un arbusto perenne de hoja ancha , y Pistacia terebinthus, también de hoja ancha
pero caducifolia, y propia de ambientes más frescos. Se pretende comprobar si los patrones
de alteraciones son comunes en tres especies tan diferentes, y establecer criterios para la
validación de daños por ozono en muestras procedentes del campo. El material procedía de la
Comunidad valenciana y fue fumigado en las Cámaras de Techo Descubierto (OTC) que el
CEAM tiene en La Peira, Benifaió (ver capítulo 4).
5.1. EFECTOS DEL OZONO EN PISTACIA LENTISCUS (VER PUBLICACIÓN EN ANEXO)
5.2. EFECTOS DEL OZONO EN PISTACIA TEREBINTHUS
5.2.1. Introducción
En las dos últimas décadas, se han multiplicado los informes de daños visibles
observados en el campo producidos por el ozono troposférico en la Cuenca Mediterránea.
Asimismo, desde hace algo menos de tiempo se han publicado también diversos
trabajos que describen daños a nivel celular e histológico en algunas especies de la misma
distribución geográfica. El ozono produce efectos fitotóxicos a concentraciones ambientales en
el sur de Europa, lo que se traduce en la presencia de daños visibles en las especies sensibles.
Sin embargo, antes de la aparición de los daños visibles ya se presentan los llamados daños
previsuales, incluyendo modificaciones a nivel histológico y celular. Los análisis anatómicos e
histológicos permiten comprender mejor los mecanismos de defensa del vegetal ante el estrés
oxidativo, explicar y complementar los estudios fisiológicos, y correlacionar los cambios
metabólicos con los cambios cito-histológicos.
Este trabajo complementa a un estudio anterior realizado en el marco del mismo
proyecto sobre los efectos de ozono en Pistacia lentiscus (ver publicación en anexo). La
especie aquí analizada, P. terebinthus, es también una planta de distribución
circunmediterránea y de alto valor ecológico, aunque caducifolia.
Queremos así comprobar si en especies cercanas, unas caducifolias y otras
perennifolias los procesos de acción del ozono son análogos y determinar si existe una
correlación entre los daños observados y la estructura anatómica de la hoja. Igualmente
veremos si la presencia de determinadas sustancias en el interior de las células (taninos,
resinas, fenoles, terpenos), influyen en los procesos de oxidación.
La metodología ha sido análoga a la utilizada con P. lentiscus, centrando nuestra
atención en los cambios sufridos por las hojas a lo largo del tiempo, y comparándolas con la
planta patrón en ambiente filtrado.
Para ello se han descrito las diferentes unidades histológicas de la hoja (epidermis del
haz y del envés, estomas, capa celular subepidérmica del envés, parénquima lagunar, zona de
transición, parénquima en empalizada, haces vasculares y canales resiníferos) y elementos
celulares diferenciales con microscopía óptica (pared, cutícula y ornamentación, disposición y
contenido vacuolar, plastos, plastoglóbulos y contenido citoplasmático denso).
5.2.2. Descripción anatomo-histológica de la hoja de Pistacia terebinthus
Pistacia terebinthus es un arbusto caducifolio con hojas divididas, imparipinnadas. Se
instala frecuentemente en zonas de carrascal poco denso y en coscojares de áreas de
ombroclima subhúmedo. Se caracteriza por su alto contenido en taninos y oleoresinas de alto
contenido en monoterpenos, sesquiterpenos y monterpenoles.
Diferenciaremos las secciones de las hojas jóvenes de las de las viejas para distinguir
el proceso natural de senescencia. Los cortes transversales de las jóvenes nos permiten
apreciar una epidermis adaxial monoestratificada, con células que poseen una vacuola
centrada, que ocupa un tercio del volumen celular, y contiene material denso de tipo tánico;
alrededor de la misma, hay una ausencia casi total de orgánulos. Esta epidermis está
recubierta por una cutícula, de poco grosor (fig. 1).
A medida que la hoja madura, desaparecen estas vacuolas densas y la célula se torna
transparente. La pared tangencial externa aumenta ligeramente su grosor y la ornamentación
de la cutícula se hace menos patente.
Por debajo de la epidermis vemos una monocapa celular de parénquima en
empalizada cuyas células aumentan en longitud con el crecimiento de la hoja. Son células
muy uniformes, cilíndricas, alargadas, perpendiculares a la superficie de la lámina y que, en
sección transversal, apenas dejan espacios entre sí. Presentan vacuolas grandes con
contenido vacuolar muy denso, que creemos de tipo tánico (debido a su afinidad por la
safranina). En hojas viejas el tamaño celular aumenta, sobretodo en longitud.
Los cloroplastos son pequeños elipsoidales y periféricos, sin apenas almidón (figs. 1 y
2)
En las hojas viejas los cloroplastos apenas cambian, sólo aumentan un poco se
tamaño y, algunos, muestran ligeras trazas de almidón. (fig. 3)
Las células del parénquima de transición se agrupan en 3 estratos y están
dispuestas de forma irregular en el mesofilo dejando entre sí grandes espacios intercelulares.
No presentan contenido vacuolar denso pero si abundantes cloroplastos de forma aplanada por
todo la periferia del citoplasma sin apenas almidón, que aumentan en tamaño y, sobretodo, en
número con la edad de la hoja. (fig. 2 y 3)
El parénquima lagunar está constituido por 2 ó 3 estratos celulares de células
lobuladas que dejan amplios espacios entre sí. Sigue una pauta de maduración y senescencia
semejante al parénquima en empalizada. Son células con contenido vacuolar denso de
naturaleza tánica, con tendencia a aumentar en las hojas viejas; el resto del material
citoplasmático, abundante en orgánulos, ocupa una posición periférica; los cloroplastos son de
pequeño tamaño y en las células viejas tienden a decrecer en número (fig. 1 y 4), no se aprecia
apenas la existencia de almidón.
Los haces vasculares de orden 1 y 2 son bicolaterales, y los de menor orden son
colaterales, con el xilema situado en posición adaxial. En los haces vasculares de mayor
calibre se sitúan, entre las células del floema, los canales secretores que constan, en general,
de células con paredes primarias, vivas unas, muertas otras y todas relacionadas con la
síntesis o la acumulación de sustancias de naturaleza muy diversa que originan resinas ricas
en monoterpenos, sesquiterpenos y monoterpenoles. Por proceso de senescencia normal, las
células que envuelven los canales van degenerando y vertiendo a los canales su denso y
resinoso contenido (fig.5)
Esta especie no presenta hipodermis, pasándose directamente del parénquima lagunar
a la epidermis del envés, que carece de tricomas pero posee abundantes estomas de tipo
anomocítico. La observación paradermal permite diferenciar un aspecto lobulado y alargado.
Las paredes aumentan su grosor, de manera considerable, con el tiempo, especialmente la
tangencial externa, provocando una reducción del contenido citoplasmático. La cutícula crece
de grosor con el envejecimiento, tiene ornamentaciones céreas que con el tiempo llegan a
desaparecer (fig. 4)
5.2.3. Modificaciones causadas por la acción del ozono
Sometidas a concentraciones de ozono de aire ambiente + 40 ppb (NF+40) y aire
ambiente + 80 ppb de ozono (NF+80) durante dos meses (julio y agosto de 2002), se ha
apreciado una enorme aceleración en los procesos de senescencia, observando las siguientes
modificaciones:
Con un mes de tratamiento se aprecia un ligero aumento de la cutícula en la epidermis
del haz, bastante menor que en P. lentiscus, y la desaparición de las ornamentaciones.
Asimismo, en esta especie apenas hay alteración de las paredes. Sólo en los largos
tratamientos (más de un mes a NF+80 ppb) se aprecia disminución de grosor de las mismas.
Se observa una desaparición, en las hojas tratadas, del contenido tánico vacuolar que se
aprecia en las hojas no afectadas.
El parénquima en empalizada pronto permite distinguir alteraciones; a las tres
semanas, en NF+40 ppb ya se distingue una clara variación en el contenido vacuolas que es
de mucha menor densidad y de coloraciones diferentes (fig. 6). Concentraciones mayores de
ozono aceleran la degradación, apareciendo una estriación semejante al que se describe para
P. lentiscus (fig. 7). Los cloroplastos disminuyen, tanto en número como en tamaño; con dosis
de 40 ppb de ozono y en muy poco tiempo (2 semanas) se produce un incremento de
amiloplastos (fig. 8) que luego desaparecen con dosis más altas (fig. 9) o tiempos más largos.
Las paredes celulares también comienzan su degeneración de manera temprana, se tornan
rugosas, por áreas, y pierden grosor. Además, se hace patente una disminución de los
espacios intercelulares por contracción celular (fig. 6).
El parénquima lagunar se caracteriza por sufrir, ya de manera temprana (menos de
dos semanas a 40 ppb) daños en las vacuolas, que sufren los característicos apilamientos
intravacuolares que también se daban en P. lentiscus (Reig et al 2004). También se produce,
aunque en menor medida que en el parénquima en empalizada, una reducción del tamaño y
número de los cloroplastos. La pared desprende microgotas y va degenerando (figs.7 y 10).
Con dosis mayores de ozono (NF+80 ppb) o tiempos de tratamiento más prolongados
(1 mes), se observan procesos degenerativos más acusados. Las vacuolas desaparecen y se
mezcla su contenido con el citoplasma. Los cloroplastos degeneran en plastoglóbulos. Las
paredes se hacen más irregulares y se deterioran. En algunas áreas es claramente visible el
desprendimiento de pequeñas vesículas del material celulósico (Fig 7). Los espacios
intercelulares se hacen mayores (Figs 7 y 10).
Al igual que ocurre en el parénquima en empalizada, los cloroplastos disminuyen, tanto
en número como en tamaño; con dosis de NF+40 ppb de ozono y en muy poco tiempo se
produce un incremento de amiloplastos (fig. 11) que luego desaparecen con dosis más altas o
tiempos más largos.
En la zona de transición apenas se aprecian variaciones, a concentraciones de altas
(80 ppb de ozono, a las dos semanas) o con tiempos largos (40 ppb 5 semanas) se aprecia
una reorganización de los amiloplastos que pasan a ocupar la zona media celular debido,
probablemente, a la desaparición de la vacuola central (Fig. 11).
En el metaxilema se aprecia un considerable aumento del grosor de la pared y una
reducción de la luz del vaso. El floema aparece irregular, aumenta el contenido interno de los
vasos en calosa, las paredes se toman sinuosas y aumentan ligeramente su grosor,
disminuyendo considerablemente la luz vascular (fig.12)
Los canales secretores también se ven afectados aunque en menor grado que en P.
lentiscus. Las células que tapizan su interior aparecen alteradas y algunas degradadas, si las
comparamos con el aspecto que presentan las células que tapizan los canales normales de las
plantas con aire filtrado (fig. 12).
5.2.4. Conclusiones y discusión
P. terebinthus es una planta caducifolia por lo que experimenta, de forma natural, un
proceso de senescencia foliar mucho más rápido que el que se desarrolla en P. lentiscus.
Aunque muchas de las alteraciones producidas por el ozono sobre los tejidos foliares de P.
terebinthus son similares a los ya descritos para P. lentiscus, hemos visto que existen algunas
diferencias que ya se han comentado en el apartado de resultados. El ozono tiende a acelerar
los procesos de senescencia foliar. En P. terebinthus, se observa una mayor rapidez en la
aparición de estos síntomas característicos (alteración de los cloroplastos, degradación de las
paredes celulares, alteraciones en el contenido y posterior degradación de las vacuolas,
incremento de los espacios intercelulares, etc) cuando la comparamos con P. lentiscus.
Tratamientos mucho más cortos en el tiempo (1 semana), con iguales concentración de ozono,
producen los mismos daños que los detectados en P. lentiscus con tiempos más largos (4
semanas).
Los cloroplastos se degradan más rápidamente que en P. lentiscus y los amiloplastos
se producen en gran cantidad con tiempos cortos de tratamiento para luego degradarse
rápidamente con tiempos más largos o concentraciones mayores.
Las paredes celulares se degradan produciendo microgotitas claramente visibles con tiempos
cortos de tratamiento a diferencia de P. lentiscus que lo hace con tratamientos más drásticos.
AbE
AdE
PP
SP
TZ
VBs
IS
SVB
AdE
PP
TZIS
PP
PP
AdE TZ
TZ
SP
IS
IS
IS SV
Columna izq, de arriba abajo, figs: 1,3,5,7 Columna der., de arriba abajo, figs: 2,4,6,8
PP
PP
AdE
IS
IS
TZ
IS
IS
AbE
SP
SP
FS
C TZIS
S
X
Sc
Sc
PhSc
PhPh
AdE
AbE
Sc
X X
AdE PP
EI
IS
TZ
SVB IS
AbE
S
SSP
Ad PP
C
TZ
IS
Columna izq, de arriba abajo, figs: 9,11 Columna der., de arriba abajo, figs: 12,13
CS
ScX
X
Ph
PhSc
S
SC
AbS
S
IS
IS
SV
TZPP
IS
C
IS
Ad
PPTZ SP
C
AbE
SIS
IS
SP
Pistacia terebinthus
Figura 1. C.S. de la lámina foliar de una hoja adulta sin tratar (x 400). Corte en parafina teñido con safranina-verderápido. En el parénquima en empalizada (PP) vemos como sus células contienen gran cantidad de taninos en susvacuolas, lo mismo que sucede en el parénquima lagunar (SP) y en la epidermis abaxial (AbE) pero no así en la zonade transición (TZ) ni en la epidermis adaxial (AdE). IS: espacio intercellular; SVB: haces vasculares secundarios.
Figura 2. C.S. del parénquima en empalizada (PP) y de la epidermis adaxial (AdE) en una hoja joven sin tratar (x1000). Corte semifino teñido con azul de cresilo. En el PP vemos el tamaño algo menor de sus células y como susvacuolas (Ü) todavía no presentan el aspecto denso característico de las células más adultas. No se observa elaspecto irregular de sus paredes, aunque si que vemos abundantes plastos (cabezas de flecha). Presenta tambiénalgunos espacios intercelulares (IS). En la epidermis observamos el grosor algo menor de sus paredes celulares y de lacutícula (flechas). Vemos también como las células epidérmicas presentan cierto material vacuolar denso que noaparece en las células más adultas. TZ: zona de transición.
Figura 3. C.S. del parénquima en empalizada de una hoja adulta sin tratar (x 1000). Corte semifino teñido con Lugol.Podemos apreciar como en algunas células del parénquima se aprecian pequeñas manchas negruzcas indicativas dela presencia de almidón en algunos plastos (flechas). PP, parenquima en empalizada; AdE, epidermis adaxial; TZ,zona de transición; IS, espacio intercellular.
Figura 4. C.S. del parénquima lagunar (SP) y de la epidermis abaxial (AbE) de una hoja adulta sin tratar (x1000). Cortesemifino teñido con azul de toluidina. Se aprecian los grandes espacios intercelulares así como el abundante contenidoen taninos de las vacuolas. Podemos observar algunos plastos comprimidos contra las paredes celulares (cabezas deflecha). IS, espacio intercelular; FS, estroma funcional; C, cuticula; TZ, zona de transición.
Figura 5. C.S. del haz vascular principal de una hoja adulta sin tratar (x 200). Corte semifino teñido con azul detoluidina. Se aprecian 3 grandes canales secretores (SC) en la zona correspondiente al floema (Ph) de la zona abaxial.El haz vascular es de tipo bicolateral ya que posee floema a ambos lados del xilema (X). El xilema aparece separadoen dos partes por una estrecha franja de esclerénquima (Scl). Se aprecian también las dos grandes zonas de fibrasesclerenquimáticas que protegen a las zonas floemáticas; AdE, epidermis adaxial; AbE, abaxial epidermis.
Figura 6. C.S. del parénquima en empalizada de una hoja adulta tratada con NF+40 ppb de ozono durante 3 semanas(x 1000). Corte semifino teñido con azul de cresilo. Se observa claramente la alteración del contenido vacuolar de lascélulas del parénquima en empalizada (PP) así como la aparición de mayores espacios intercelulares (IS) en el mismo.Las flechas señalas los plastos de pequeño tamaño desplazados hacia la periferia de las células. AdE: epidermisadaxial; SP: parenquima lagunar; SVB: haz vascular secundario; TZ: zona de transición.
Figura 7. C.S. del mesófilo de una hoja adulta tratada con NF+80 ppb de ozono durante 3 semanas (x 1000). Cortesemifino teñido con azul de cresilo. El contenido vacuolar de las células del parénquima en empalizada (PP) se disponeen bandas superpuestas. Las flechas señalas los puntos en que se observan zonas de alteración de las paredescelulares. Vemos también un incremento en el número de espacios intercelulares (IS) tanto en el PE como en ellagunar (SP). Se aprecia asimismo un incremento en las paredes tangenciales internas en las células oclusivas de losestomas (S). AdE: epidermis adaxial; AbE: epidermis abaxial; SVB: haz vascular secundario; TZ: zona de transición.
Figura 8. C.S. del mesófilo de una hoja adulta tratada con 40 ppb de ozono durante 5 semanas (x 1000). Cortesemifino teñido con Lugol. Se aprecia como ha habido un importante incremento en el número de amiloplastos(flechas ) presentes en las células del parénquima en empalizada (PP). AdE: epidermis adaxial; IS: espaciointercelular; TZ: zona de transición; C: cutícula.
Figura 9. C.S. del parénquima en empalizada de una hoja adulta tratada con 80 ppb de ozono durante 4 semanas (x1000). Corte semifino teñido con Lugol. Los tratamiento más agresivos producen una desaparición progresiva de losamiloplastos (flechas) presentes en las células del parénquima en empalizada (PP) e incluso en la zona de transición(TZ). AdE: epidermis adaxial; C: cuticula; IS: espacio intercelular; SP: parenquima lagunar.
Figura 10. C.S. del parénquima lagunar (SP) de una hoja adulta tratada con NF+80 ppb de ozono durante 3 semanas(x 1000). Corte semifino teñido con azul de cresilo. Vemos que su contenido vacuolar se hace más denso y que suforma se torna más irregular dejando mayor número de espacios intercelulares (IS). Los estomas (S) aparecen ya consus paredes muy engrosadas. TZ: zona de transición; AbE: abaxial epidermis; C: cuticula; PP: parenquima enempalizada; S: estoma; SVB: haz vascular secundario.
Figura 11. . C.S. del parénquima lagunar (SP) de una hoja adulta tratada con NF+40 ppb de ozono durante 5 semanas(x 1000). Corte semifino teñido con Lugol. Se aprecia como ha habido un importante incremento en el número deamiloplastos (flechas) presentes en las células del parénquima lagunar. IS: espacio intercelular; S: stoma; EAb:abaxial epidermis.
Figura 12. C.S. de dos canales secretores (SC) en un haz vascular presente en una hoja adulta tratada con NF+40 ppbdurante 4 semanas. Corte semifino teñido con azul de toluidina (x1000). Vemos como el floema (Ph) cambia suaspecto ya que las paredes se toman sinuosas y aumentan ligeramente su grosor, disminuyendo la luz vascular.Además su contenido se torna más denso, y aparecen, sustancias de naturaleza tánica en el interior de los mismos.Las células que tapizan los canales secretores están poco turgentes y algunas de ellas aparecen en fase dedegradación (flechas ). X: xilema; Scl: esclerenquima.
5.3. EFECTOS DEL OZONO EN PINUS HALEPENSIS
5.3.1. Introducción
En este trabajo se pretende caracterizar las alteraciones producidas por concentraciones
elevadas de ozono en una especie de conífera ampliamente distribuida en el mediterráneo: el
pino carrasco (P. halepensis). Se describen inicialmente las hojas jóvenes y viejas que se
cultivado en aire filtrado, con concentraciones de ozono inferiores a las ambientales. Estas se
comparan con hojas jóvenes y viejas crecidas en condiciones de ozono elevadas, con aire
ambiente (en Benifaió, Valencia, una zona agricola con concentraciones relativamente bajas en
la Comunidad Valenciana) al que se le han añadido 60 ppb de ozono.
5.3.2. Descripción de la hoja de Pinus halepensis en aire filtrado
Los cortes transversales de las hojas jóvenes de P. halepensis en aire filtrado
muestran una estructura muy característica, las fotos 1 y 2 nos muestran estas hojas teñidas
con azul de anilina y observadas con microscopía de fluorescencia, de esta manera se aprecia
una distribución uniforme de cloroplastos (CL) ricos en clorofila (rojo) en el parénquima y
escasa calosa en el floema que se presenta básicamente en el área más alejada del xilema
(flechas). El xilema (X) está intacto y funcional, con desarrollo normal y con abundante lignina.
Una cutícula (C) desarrollada (línea roja). Se constata una ausencia prácticamente total de
lípidos.
Utilizando lugol para hacer evidente la presencia de almidón (fig. 3) aparecen granos
de almidón en poca cantidad, dispersos por el parénquima clorofílico, muy escasos en la
endodermis y en el tejido de transmisión.
Las hojas viejas en condiciones de aire filtrado (figs. 8, 9, 10, 11, 12, 13), muestran un
proceso de senescencia bien determinado. Histológicamente se aprecia que las vacuolas de
las células parenquimáticas presenta un contenido en taninos y fenoles poco alterado, ocupan
casi todo el citosol y tienen un alto grado de turgencia (figs. 8, 9). Se distinguen unas
granulaciones esféricas refringentes en el seno de las vacuolas cuyo contenido no puede
determinarse en los cortes semifinos con azul de toluidina; el uso del lugol nos ha permitido
determinar que, al menos algunas de estas estructuras se corresponden con gránulos de
almidón (fig. 13) que aumenta hasta alcanzar tamaños considerables. Apenas hay espacios
entre las células (fig. 9).
5.3.3. Modificaciones causadas por la acción del ozono
En las hojas jóvenes sometidas a la acción del ozono, NF+60 ppb, durante dos
semanas ya se aprecian cambios significativos (figs. 4, 5, 6, 7). La calosa aumenta en el floema
de manera considerable y la encontramos en áreas cada vez más cercanas al xilema (fig 4),
ello evidencia que existe cada vez menos floema funcional, todo lo cual viene corroborado por
los cortes semifinos que nos presentan un floema con contenido en su mayor parte (7). El
almidón del parénquima sufre un proceso de degeneración y aparece como disuelto, manchas
tenues se ven en los cortes teñidos con lugol (fig. 5). Las vacuolas, con denso contenido en
taninos y fenoles se retraen en el interior celular y aparecen claramente despegadas de la zona
externa.
Las células de floema y las que se encuentran en la periferia del mismo sufren un
proceso de aplanamiento muy acusado (fig. 10). En el tejido de transmisión comienza a
evidenciarse la presencia de lípidos mezclados con almidón (figs. 11, 12), que es muy patente
usando la microscopía de fluorescencia (fig. 12).
Las hojas viejas en condiciones ozono a NF+60 ppb (figs. 15, 16, 17, 18) presentan
unos daños muy marcados a principios de la segunda semana, el proceso de senescencia se
acelera y, además, aparecen alteraciones diversas muy fáciles de determinar que no obedecen
a los procesos de senescencia normales.
Las vacuolas de contenido denso sufren un proceso claro de degeneración, se
contraen y desprenden de la pared, su contenido sufre alteraciones, presentando algunas
zonas una coloración granate al teñir con azul de toluidina (flechas rojas). Se observa un
aumento de las granulaciones refringentes en el interior de las vacuolas de contenido denso
(flechas blancas), que en muchas células parenquimáticas llegan a ocupar más del 90% del
contenido vacuolar (figs. 15, 16 y 17).
Las células sufren una contracción general, las paredes también degeneran y de ellas
se desprenden microgotas, todo ello provoca un aumento muy grande de los espacios
intercelulares (EI) que se hace mucho más acusado en las cercanías de las cámaras
subestomáticas. El aspecto de las células parenquimáticas de torna muy irregular (P).
El floema distal (más alejado del xilema) aparece totalmente colapsado y sus células
completamente aplanadas que carecen totalmente de funcionalidad (fig. 18).
5.3.4. Conclusiones y discusión
El ozono produce diversos efectos en las acículas de pino carrasco, que en parte
coinciden con una senescencia acelerada. Algunas de estas alteraciones son comunes a las
observadas en las dos especies de Pistacia estudiadas como ejemplos de los efectos del
ozono en plantas mediterráneas de hoja ancha caducas y perennes. En plantas fumigadas, de
forma similar al caso anteriormente descrito de Pistacia terebinthus, primero se acumula
almidón en las células del parenquima y después los amiloplastos sufren un proceso de
degeneración. Las vacuolas, con denso contenido en taninos y fenoles se retraen en el interior
celular y aparecen claramente despegadas de la zona externa. Como en Pistacia también se
producen microgotas en las paredes, y aumentan los espacios intercelulares, especialmente en
las cercanías de las cámaras subestomáticas. En el floema, aumentan los acúmulos de calosa,
disminuyendo la funcionalidad de este tejido, y finalmente se produce un colapso.
Todas estas alteraciones tienen implicaciones fisiológicas y funcionales para la planta,
y son coherentes con diversas estudios que ponen de manifiesto que algunas plantas que
crecen bajo concentraciones de ozono elevadas, presentan una menor asimilación de CO2, ya
que se produce una disminución del tejido asimilativo (aumento de los espacios intercelulares)
y de los cloroplastos funcionales. En diversas especies se ha detectado también que el ozono
produce un aumento de la relación entre la biomasa de la parte aérea de la planta y la parte
subterránea (parte aerea/parte subterránea), ya que las alteraciones del floema repercuten en
el transporte desde las hojas (órganos fuente) a las raíces (órganos sumidero, sin clorofila),
produciendo una disminución relativa del crecimiento de las raíces.
Pinus halepensis
1 2
3 4
5 6
X
CL
CL
X
CL
CLCL
C
CC
C
CL
CL
X
1. Hoja joven de planta mantenida en ambiente deaire filtrado. Fotografía con microscopio defluorescencia (X100)
2. Hoja joven de planta mantenida en ambiente deaire filtrado. Fotografía con microscopio defluorescencia (X200)
3. Hoja joven de planta mantenida en ambiente deaire filtrado. Tinción con lugol para evidenciarlos granos de almidón (X200)
4. Hoja joven de planta mantenida en ambiente deaire con 60 ppb de ozono. Fotografía conmicroscopio de fluorescencia (X400)
5. Hoja joven de planta mantenida en ambiente deaire con 60 ppb de ozono. Tinción con lugol paraevidenciar los granos de almidón (X400)
6. Hoja joven de planta mantenida en ambiente deaire con 60 ppb de ozono. Corte semifino teñidocon azul de toluidina (X400)
7 8
9 10
11 12
7. Hoja joven de planta mantenida en ambiente deaire con 60 ppb de ozono. Corte semifino teñidocon azul de toluidina (X1000)
8. Hoja vieja de planta mantenida en ambiente deaire filtrado. Corte semifino teñido con azul detoluidina (X1000)
9 Hoja vieja de planta mantenida en ambiente deaire filtrado. Corte semifino teñido con azul detoluidina (X1000)
10. Hoja vieja de planta mantenida en ambientede aire filtrado. Corte semifino teñido con azul detoluidina (X1000)
11. Hoja vieja de planta mantenida en ambientede aire filtrado. Corte semifino teñido con azul detoluidina (X1000)
12. Hoja vieja de planta mantenida en ambientede aire filtrado. Micrografía de corte teñido conazul de anilina y visto con microscopia defluorescencia (X1000)
13 14
15 16
17
EI EI
PP
EIEI
P P
P
13. Hoja vieja de planta mantenida en ambientede aire filtrado. Micrografía de corte teñido lugolpara evidenciar el almidón. (X1000)
14. Hoja vieja de planta mantenida en ambientede aire filtrado. Micrografía de corte teñido lugolpara evidenciar el almidón. (X1000)
15. Hoja vieja de planta mantenida en ambientede aire con 60 ppb de ozono. Corte semifinoteñido con azul de toluidina. Detalle de canalresinífero (X1000)
16. Hoja vieja de planta mantenida en ambientede aire con 60 ppb de ozono. Corte semifinoteñido con azul de toluidina. Detalle deparénquima lagunar y cámara estomática (X1000)
17. Hoja vieja de planta mantenida en ambientede aire con 60 ppb de ozono. Corte semifinoteñido con azul de toluidina. Detalle delparénquima clorofílico (X1000)
18. Hoja vieja de planta mantenida en ambientede aire con 60 ppb de ozono. Corte semifinoteñido con azul de toluidina. Detalle del hazvascular (X1000)
Pinus halepensis
Figura 1. Hoja joven de planta mantenida en ambiente de aire filtrado. Fotografía con microscopio de fluorescencia(X100).
Figura 2. Hoja joven de planta mantenida en ambiente de aire filtrado. Fotografía con microscopio de fluorescencia(X200).
Figura 3. Hoja joven de planta mantenida en ambiente de aire filtrado. Tinción con lugol para evidenciar los granos dealmidón (X200).
Figura 4. Hoja joven de planta mantenida en ambiente de aire con 60 ppb de ozono. Fotografía con microscopio defluorescencia (X400).
Figura 5. Hoja joven de planta mantenida en ambiente de aire con 60 ppb de ozono. Tinción con lugol para evidenciarlos granos de almidón (X400).
Figura 6. Hoja joven de planta mantenida en ambiente de aire con 60 ppb de ozono. Corte semifino teñido con azul detoluidina (X400).
Figura 7. Hoja joven de planta mantenida en ambiente de aire con 60 ppb de ozono. Corte semifino teñido con azul detoluidina (X1000).
Figura 8. Hoja vieja de planta mantenida en ambiente de aire filtrado. Corte semifino teñido con azul de toluidina(X1000).
Figura 9. Hoja vieja de planta mantenida en ambiente de aire filtrado. Corte semifino teñido con azul de toluidina(X1000).
Figura 10. Hoja vieja de planta mantenida en ambiente de aire filtrado. Corte semifino teñido con azul de toluidina(X1000).
Figura 11. Hoja vieja de planta mantenida en ambiente de aire filtrado. Corte semifino teñido con azul de toluidina(X1000).
Figura 12. Hoja vieja de planta mantenida en ambiente de aire filtrado. Micrografía de corte teñido con azul de anilina yvisto con microscopia de fluorescencia (X1000).
Figura 13. Hoja vieja de planta mantenida en ambiente de aire filtrado. Micrografía de corte teñido lugol para evidenciarel almidón. (X1000).
Figura 14. Hoja vieja de planta mantenida en ambiente de aire filtrado. Micrografía de corte teñido lugol para evidenciarel almidón. (X1000).
Figura 15. Hoja vieja de planta mantenida en ambiente de aire con 60 ppb de ozono. Corte semifino teñido con azul detoluidina. Detalle de canal resinífero (X1000).
Figura 16. Hoja vieja de planta mantenida en ambiente de aire con 60 ppb de ozono. Corte semifino teñido con azul detoluidina. Detalle de parénquima lagunar y cámara estomática (X1000).
6. RESUMEN DE RESULTADOS
6.1. CONCENTRACIONES DE OZONO
Los patrones de distribución de los niveles de ozono en la Comunidad Valenciana
confirman que las concentraciones más altas se dan en las zonas montañosas del interior,
mientras que en las zonas litorales los niveles son en general bajos. Este patrón se ha
observado con una red más amplia de datos con dosímetros pasivos (datos inéditos) en la
Comunidad Valenciana, y en parte se explica porque en las zonas altas se acumulan estratos
de reserva ricos en ozono, y las concentraciones por la noche no bajan tanto como en las
zonas a menor altitud. Los valores durante el día tienden a ser también más elevados.
Los valores promedio más altos se en dan en una zona montañosa interior del norte de
la Comunidad Valenciana, Morella. En 2003, por ejemplo, esta localidad presenta un valor
promedio de 61,1 ppb para el periodo abril-septiembre, y un valor máximo quincenal de 78.99
ppb, que se produjo en agosto. También en Alicante se presentaron valores promedio
relativamente altos de ozono, en localidades como Agost, donde se han medido valores
promedio de 49,41 para todo el periodo abril-septiembre, y valores máximos quincenales para
estos seis meses de más de 50 ppb. Por el contrario, los valores medios más bajos se midieron
en el Saler, un pinar costero y en La Peira, una zona rural a baja altitud.
6.2. SEGUIMIENTO DE DAÑOS EN EL CAMPO
El presente proyecto ha permitido prospectar una amplia zona de la Comunidad
Valenciana con la finalidad de detectar los efectos del ozono en la vegetación. Las
características del tipo de vegetación, tanto arbórea como de matorral, típicamente
mediterránea, perenne y en muchos casos esclerófila es en principio un factor protector de los
efectos negativos del ozono. Las especies del género Quercus, por ejemplo, son poco
sensibles al ozono. Otras especies comunes del matorral mediterráneo como Rosmarinus,
Ulex, Cistus etc. no han desarrollado síntomas. Por otra parte, la sequía estival supone una
restricción importante para el intercambio gaseoso de las plantas, y consecuentemente, el
cierre de estomas por estrés hídrico va a impedir también la entrada del ozono en las hojas y
los daños. Por este motivo, los muestreos se centraron en plantas a priori más sensibles,
como es el caso de Ailanthus altissima y de Pinus halepensis principalmente. Ambas
especies se ha visto que presentan síntomas en numerosos puntos, incluyendo algunos con
valores relativamente bajos de ozono. En el caso de Pinus halepensis, los daños observados
en algunas parcelas, aunque presentes, fueron mayoritariamente escasos.
Por lo que respecta al resto de las especies y localidades, se ha detectado un mayor
número de plantas sintomáticas en zonas con riego. Es el caso de las parcelas de la Font Roja,
en la cuenca del río Serpis, dos de las cuales estaban en un vivero forestal que se utiliza para
repoblar la zona con especies autóctonas, y estaban por tanto bien irrigadas. También se
detectaron más daños por ejemplo, en la parcela de Morella, donde había una cierta
disponibilidad de agua. Por tanto, en condiciones climáticas como las de la Comunidad
Valenciana, el agua parece pues un factor fundamental a la hora de establecer las situaciones
donde la vegetación puede tener más riesgo y de detectar síntomas. Este puede ser uno de los
motivos por los que no se encuentre una relación clara entre las concentraciones de ozono
medidas y el número de especies sintomáticas en cada parcela, o con los patrones de
distribución en el territorio de los daños por ozono en Pinus halepensis. Con todo, este estudio
ha permitido identificar numerosas especies que han desarrollado síntomas incluso en estas
condiciones, y otras con daños que podrían estar producidos, o potenciados, por el ozono.
6.3. EXPERIENCIAS EN CAMARAS DE TECHO DESCUBIERTO (OTC)
En 2002 se fumigaron diversas especies forestales, entre las que destacaremos dos
especies de Pistacia: P. lentiscus y P. terebinthus. El estudio de las alteraciones producidas por
el ozono ha permitido caracterizar la evolución de los daños en especies típicamente
mediterráneas. También se han realizado estudios sobre Pinus halepensis (ver apartado
Caracterizacion de daños producidos por ozono en hojas de diversas especies con el
microscopio optico).
En 2003 se reprodujeron los síntomas en otras especies, y se hizo un seguimiento de
daños en tres especies de arce, en Ailanthus altissima y en Cornus sanguinea. Los resultados
permitieron establecer una escala de sensibilidad en estas especies en poblaciones del sur de
Europa y descartar daños no producidos por el ozono.
En 2004, se fumigaron otras especies con la finalidad de reproducir síntomas y se
realizaron estudios más detallados con Ailanthus altissima (especie introducida aunque con
una gran distribución, que se utiliza normamente como bioindicador), y en Acer
monspesularum, Acer pseudoplatanus, A. opalus subsp. granatense, A. campestre. En este
año, el seguimiento de la evolución de daños se completó y relacionó con estudios de
fisiología: intercambio gaseoso y fluorescencia. Otras especies fumigadas fueron: Betula alba,
Mahonia aquifolia, Fagus sylvatica, Fraxinus angustifolia, Sorbus aria, Sorbus aucuparia, Pinus
halepensis, Pinus uncinata y Teucrium scoronia. En estas especies, se documentaron
fotográficamente los daños visibles reproducidos. En algunas de estas especies, como es el
caso de Mahonia aquifolia, se observó un enrojecimiento en las hojas incluso en aire filtrado,
por lo que son especies problemáticas para su uso como bioindicadoras de ozono en el campo.
El caso más interesante de los estudiados es el experimento con las 4 especies de
arce procedentes del sur de Europa. Se comprobó que la aparición del primer síntoma no se
puede considerar indicativa de la evolución posterior de los daños. Dicho de otro modo, el
hecho de que una especie presentara daños visibles antes que otra no tenia por que implicar
necesariamente que la primera especie fuera la que al final tendría más superficie de planta
dañada. El Indice de Daño, que combina el porcentaje de hojas con algún daño, y la intensidad
media de este daño refleja mejor la realidad. A. monspessulanum fue la especie menos
sensible, con apenas hojas dañadas al final del experimento, A. campestre se mostró más
sensible, si bien claramente menos que A. pseudoplatanus, con gran cantidad de hojas
dañadas al final del verano, y especialmente A. opalus subsp. granatense, que fue la especie
más sensible. Esta sensibilidad era coherente con las alteraciones medidas a nivel fisiológico,
como es el caso del intercambio gaseoso.
La fumigación con ozono produjo efectos de intensidad diferente en el intercambio
gaseoso en estas 4 especies de arce. A. opalus subsp. granatense experimentó una
disminución de la asimilación fotosintética (NP) y de la conductancia estomática (gs) en las
plantas fumigadas ya a principio del verano. A finales de agosto, se realizó un estudio
complementario separando hojas sintomáticas de no sintomáticas en plantas fumigadas. Si
bien todas las especies presentaron una disminución de la asimilación de CO2 (NP) en las
hojas dañadas, en A. opalus subsp. granatense y A. pseudoplatanus, las hojas de plantas
fumigadas pero sin daños evidentes también mostraron una disminución significativa de la
asimilación, lo que es indicativo de su mayor sensibilidad al ozono, ya puesta de manifiesto por
la mayor intensidad de daños visibles al final del experimento. Igualmente, en estas especies,
los coeficientes de atenuación ("quenchings") aportan información sobre el estrés por
fotooxidantes en hojas que aún no han desarrollado síntomas visibles evidentes. Las hojas
fumigadas no sintomáticas (y también las sintomáticas) presentan una disminución del qP en
paralelo con un aumento del NPQ: la energía absorbida se disipa en mayor grado de forma no
fotoquímica (p.e. calor), frente a la via fotoquímica, lo que sugiere una menor eficiencia en la
fotosíntesis. Junto con la disminución en la conductancia estomática, que determina una
disminución del flujo de CO2 al interior de las hojas, estas alteraciones puestas de manifiesto
por la fluorescencia, contribuyen al descenso observado de la asimilación del CO2, en las
especies sensibles.
Como en el caso de los arces más sensibles, el estudio del intercambio gaeoso en
Ailanthus altissima realizado en 2004, produjo resultados similares. Se observó una
disminución de la asimilación fotosintética (NP) en las plantas fumigadas (NF+30), respecto a
las plantas que crecian en aire filtrado (F).
6.4. CARACTERIZACION DE DAÑOS PRODUCIDOS POR OZONO EN HOJAS DE
DIVERSAS ESPECIES CON EL MICROSCOPIO OPTICO
En este proyecto, se ha caracterizado la evolución de las alteraciones producidas por el
ozono a nivel celular y de tejidos en tres especies típicamente mediterráneas. Una de ellas,
Pinus halepensis, es una conífera ampliamente distribuida por las zonas bajas del
mediterráneo, y es considerada una especie sensible al ozono en la literatura. Las otras dos
especies pertenecen al género Pistacia, y son arbustos típicos del Mediterráneo: Pistacia
lentiscus, un arbusto perenne de hoja ancha, y Pistacia terebinthus, también de hoja ancha
pero caducifolia, y propia de ambientes más frescos. Se pretende comprobar si los patrones de
alteraciones son comunes en tres especies tan diferentes, y establecer criterios para la
validación de daños por ozono en muestras procedentes del campo.
En P. lentiscus y P. terebinthus las alteraciones producidas por el ozono sobre los
tejidos foliares de son similares. El ozono tiende a acelerar los procesos de senescencia foliar.
En P. terebinthus, se observa una mayor rapidez en la aparición de estos síntomas
característicos (alteración de los cloroplastos, degradación de las paredes celulares,
alteraciones en el contenido y posterior degradación de las vacuolas, incremento de los
espacios intercelulares, etc) cuando la comparamos con P. lentiscus. Los cloroplastos se
degradan más rápidamente que en P. lentiscus y los amiloplastos se producen en gran
cantidad con tiempos cortos de tratamiento para luego degradarse rápidamente con tiempos
más largos o concentraciones mayores. Las paredes celulares se degradan produciendo
microgotitas claramente visibles con tiempos cortos de tratamiento a diferencia de P. lentiscus
que lo hace con tratamientos más drásticos. Estos resultados sugieren que las especies
perennifolias y esclerófilas, propias de los ambientes mediterráneos más secos, presentarían
una menor sensibilidad al ozono que especies caducifolias del mismo género, si bien esta
hipótesis se debería comprobar con más ejemplos.
En las acículas de pino carrasco, el ozono produce alteraciones que en parte coinciden
con una senescencia acelerada. Algunas de estas alteraciones son comunes a las observadas
en las dos especies de Pistacia estudiadas como ejemplos de los efectos del ozono en plantas
mediterráneas de hoja ancha caducas y perennes. Se acumula almidón en las células del
parenquima y después los amiloplastos sufren un proceso de degeneración. Las vacuolas, con
denso contenido en taninos y fenoles se retraen en el interior celular y aparecen claramente
despegadas de la zona externa. Como en Pistacia también se producen microgotas en las
paredes, y aumentan los espacios intercelulares, especialmente en las cercanías de las
cámaras subestomáticas. En el floema, aumentan los acúmulos de calosa, disminuyendo la
funcionalidad de este tejido, y finalmente se produce un colapso.
Todas estas alteraciones tienen implicaciones fisiológicas y funcionales para la planta,
y son coherentes con diversas estudios que ponen de manifiesto que algunas plantas que
crecen bajo concentraciones de ozono elevadas, presentan una menor asimilación de CO2, ya
que se produce una disminución del tejido asimilativo (aumento de los espacios intercelulares)
y de los cloroplastos funcionales.
Environmental Pollution 132 (2004) 321e331
www.elsevier.com/locate/envpol
Effects of ozone on the foliar histologyof the mastic plant (Pistacia lentiscus L.)
J. Reig-Arminanaa, V. Calatayudb,*, J. Cerverob,F.J. Garcıa-Breijoa,c, A. Ibarsa, M.J. Sanzb
aLaboratorio de Anatomıa e Histologıa Vegetal ‘‘Julio Iranzo’’, Jardın Botanico, Universitat de Valencia,
c/Quart, 80, 46008 Valencia, SpainbFundacion C.E.A.M., Charles R. Darwin 14, Parc Tecnologic, 46980 Paterna, Valencia, Spain
cDepartamento de Biologıa Vegetal, Escuela Tecnica Superior del Medio Rural y Enologıa, Universidad Politecnica de
Valencia, Avda. Blasco Ibanez, 21, 46010 Valencia, Spain
Received 10 February 2004; accepted 2 April 2004
‘‘Capsule’’: Ozone causes alterations in the mesophyll, the conductive tissueand the secretory channels of the mastic plant (Pistacia).
Abstract
An open-top chamber study was conducted to investigate the tissue and cellular-level foliar effects of ozone (O3) ona Mediterranean evergreen species, the mastic plant (Pistacia lentiscus L.). Plants were exposed at three different O3 levels, and leafsamples were collected periodically from the beginning of the exposure. Although no visible foliar injury was evident, alterations of
the plastids and vacuoles in the mesophyll were observed. Senescence processes were accelerated with an anomalous stacking oftannin vacuoles, and a reduction in the size and number of the chloroplasts. Overall, most of the modifications induced by O3 wereconsistent with previously reported observations on deciduous broadleaf species, with the exception of alterations in the cells
covering the secretory channels, reported here as a new finding. Comments on the feasibility of using microscopy to validate O3
related field observations and subtle foliar injury are also given.� 2004 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Keywords: Ozone; Foliar injury; Leaf anatomy; Mediterranean species; Mastic plant; Pistacia; Spain
1. Introduction
At the present time, ozone (O3) is considered to be themost important air pollutant worldwide (Krupa et al.,2001). During the past decades, a global increase in thelower troposphere O3 levels has been observed over theNorthern Hemisphere. This has been attributed primar-ily to the increases in anthropogenic O3 precursors (Volz
* Corresponding author. Tel.: C34-96-131-8227; fax: C34-96-131-
8190.
E-mail addresses: [email protected] (J. Reig-Arminana), vicent@
ceam.es (V. Calatayud), [email protected] (J. Cervero), fjgarci@bvg.
upv.es (F.J. Garcıa-Breijo), [email protected] (A. Ibars), mjose@
ceam.es (M.J. Sanz).
0269-7491/$ - see front matter � 2004 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.envpol.2004.04.006
and Kley, 1988). The Mediterranean Basin is one of thecritical areas for photo-oxidant formation (Millan et al.,1992). It is regarded as a large photochemical reactorwhere intense solar radiation, high temperatures and theparticular re-circulation dynamics of the polluted airmasses favour the formation and accumulation of O3
(Millan et al., 1996, 1997, 2002; Sanz and Millan, 1998).As a consequence, O3 concentrations reach phytotoxiclevels (Bussotti and Ferretti, 1998; Fumagalli et al.,2001; Reinert et al., 1992; Sanz and Millan, 1998, 2000;Velissariou et al., 1992).
Visible foliar injury is one of the most striking effectsof O3 on many native plant species in central andsouthern Europe (Cozzi et al., 2000; Gimeno et al., 1992;Innes et al., 2001; Novak et al., 2003; Sanz et al.,
322 J. Reig-Arminana et al. / Environmental Pollution 132 (2004) 321e331
2001a,b; Skelly et al., 1999; VanderHeyden et al., 2001).In that context, there are many studies on the effectsof O3 on conifer and deciduous broadleaf species, butfew on Mediterranean evergreens. A fumigation exper-iment with the dominant Mediterranean sclerophylloushelm oak (Quercus ilex) showed that it is tolerant atrealistic O3 concentrations, probably due to its mor-phology, anatomical structure and ecological adapta-tion (Manes et al., 1998). In contrast, others foundvisible foliar injury symptoms (dark pigmented stip-ples), and a reduction in stem diameter in Q. ilex subsp.ballota (Inclan et al., 1999). Ozone effects have beenalso reported on other Mediterranean species such asArbutus unedo, Ceratonia siliqua, Laurus nobilis, Oleaeuropaea subsp. sylvestris, Phyllirea latifolia, andQuercus coccifera, including impairment of net photo-synthesis, increased anti-oxidant levels, and reductionsin stem growth (Elvira et al., 2003, Inclan et al., 1999;Paoletti et al., 2003). Ozone-like visible injury hasbeen observed in a few evergreen species in the field(Cozzi et al., 2000; Sanz et al., 2003), and has also beeninduced in seedlings under controlled conditions inOpen-Top Chambers (OTCs) and Continuous StirredTank Reactors (CSTRs) (Skelly et al., 1999; Sanzand Millan, 2000; Sanz et al., 2001a,b, Orendoviciet al., 2003). Some of the symptomatic species found inthose fumigation experiments were C. siliqua, Fraxinusornus, Fraxinus angustifolia, Pistacia lentiscus, andPistacia terebinthus, although highly variable in theirsensitivity.
Compared to the cellular-level effects of O3 onconifers (Barnes et al., 1999; Dalstein et al., 2002; Sodaet al., 2000), and many deciduous broadleaf species suchas Betula pendula, Fagus sylvatica, Fraxinus excelsior,Prunus serotina and Sorbus aucuparia (Gunthardt-Goerget al., 2000; Oksanen et al., 2001; Paakkonen et al.,1998), very little information is available on evergreenMediterranean species. Bussotti et al. (2003) reportedsome ultra-structural changes in A. unedo following O3
fumigation, including an increase in thickness of thecuticle, degeneration of the cytoplasm in the epidermalcells and tannin deposition on the outer primary walls ofthose cells.
The present study has been carried out in connectionwith the surveys of visible injury in native plants,launched by the International Co-operative Programmeon Assessment and Monitoring of Air Pollution Effectson Forests (ICP-Forests) (Sanz et al., 2003; http://gva.es/ceam/ICP-forests). It is the first in a series onhistological and cytological effects of O3 on plants in theMediterranean Basin. P. lentiscus (mastic plant, lentisc)is distributed throughout the entire Mediterraneanbasin, being characteristic of the native shrub land (withQ. cocciferaeePistacietum lentisci Br.-Bl.). It is anevergreen bush of 1e2 m height, although it can growup to 6e7 m under favourable conditions. It is rich in
resin (mastic) and in tannins (Costa, 1999). Mastic isused in chewing gum. The berries are used for makingperfume and sometimes sweets or liqueurs.
2. Materials and methods
2.1. Experimental site
The study was conducted at ‘‘La Peira’’ (Benifaio,39(16#14.8$N, 00(26#59.6$W, 30 m MSL), 20 kmSouth of Valencia (eastern Spain), in a rural area withno important air pollutant sources in the vicinity (Sanz,1996).
2.2. Plant material
P. lentiscus saplings were obtained from a regionalnursery (Viveros Todolı, Alicante) and were kept infiltered air for 14 months before the exposures. Thesaplings were grown in 7 l containers filled with 60%peat moss, 20% coco-peat, and 20% sand (pH w7.0). Aslow release fertilizer was incorporated (Osmocote plus,N:P:K 15:12:13C additional micronutrients). Plantswere irrigated regularly to avoid any drought stress.
2.3. Ozone exposures
The experiment was conducted with three NCLAN(National Crop Loss Assessment Network, US.EPA)type Open-Top Chambers (OTCs). Air quality insideand outside the chambers was continuously measured(sharing the monitoring instruments between treat-ments, in set time cycles) with ozone (Dasibi 1008-AH,Environmental Corp.), and nitrogen oxides’ (Dasibi2108, Environmental Corp.) monitors, calibrated peri-odically. Additional metereological data (e.g. tempera-ture, precipitation, wind direction and speed) were alsorecorded. Saplings were exposed to three different treat-ments: charcoal filtered air (CF), non-filtered airC40 ppb (NFC 40), and non-filtered airC 80 ppb(NFC 80) O3. Since during the previous years severallentisc saplings were also grown in the ambient air andits O3 levels did not result in visible foliar injurysymptoms, a chamber-less, ambient air treatment wasnot established. Plants were fumigated from 29 May to7 November 2002, 8 h a day, from 10:00 to 18:00 h,7 days a week. Ozone was generated from oxygenusing a high-voltage electrical discharge generator(SIR S.A.). Leaf samples for microscopy were collectedbefore exposure (20 May 2002), and then weeklyafter the exposures started, except at the end of theexposures, when sampling was done once every 2 or 3weeks.
In addition to daily (24 h) and 12 h (8:00e20:00 hCET) mean O3 concentrations, the accumulated O3
323J. Reig-Arminana et al. / Environmental Pollution 132 (2004) 321e331
exposure over a threshold of 40 ppb (AOT40, Fuhreret al., 1997) was also calculated from hourly averages,during daylights hours with solar radiation O50 Wm�2
(Table 1).
2.4. Microscopy methods
Leaf samples were fixed in situ with FAA (formylacetic alcohol). After washing with a 0.1 M phosphatebuffer ( pH 7.4), they were dehydrated by means of anethanol series. Some of the samples were then embed-ded in paraffin wax (Histosec, Merck), with a meltingpoint of 56e58(C; isoamyl acetate was used as anintermediate solvent between ethanol and the paraffin.The infiltration time was 30 min and the tempera-ture was 60 (C. The resulting blocks were then cutin 8 mm sections with an Anglia Scientific microtomeand stained with safranin and fast green (Johansen,1940).
Other samples were embedded in LR-White mediumgrade acrylic resin (London Resin Co.). The sectioningof those blocks was done with a Sorvall MT 5000ultramicrotome (Knifemaker, Reichert-Jung) providedwith special glasscutters (45() (Leica 6.4 mm GlassStrips). This microtome allowed for semi-thin sections(1.5 mm). Those samples were stained with toluidine blue(1%).
Sections were observed and photographed with anOlympus Provis AX 70 brightfield microscope fittedwith an Olympus Camedia C-2000 Z camera. Additionalsamples to be observed through scanning electron micro-scopy were dehydrated in an ethanol series and dried tocritical point in a Denton DPC-1 apparatus, coated witha goldepalladium mixture using an Edwards S-150marker and observed under a Hitachi S-500 scanningelectron microscope (University of Valencia ElectronMicroscope Service).
3. Results
3.1. Modifications in the anatomy
3.1.1. Effects of leaf ageOver time, natural senescence processes affected the
anatomy of the leaves exposed to sub-ambient levels ofO3 (CF). Clear differences could be seen between youngand mature leaves. In young leaves (Figs. 1e4, semi-thincross sections 1.5 mm thick), a single layer of palisadeparenchyma (PP), a transition zone and a spongyparenchyma with few intercellular spaces were present.The plastids in all the parenchyma cells were small andalmost free of starch (Fig. 2). The cells showed a verythin primary wall and a transparent vacuole content.The epidermis (Ad and Ab, of the adaxial and abaxialsides of the leaves, respectively) is covered by a very thinalthough well ornamented cuticle (Fig. 3). There wasa slight difference between the sub-epidermal layer (SE)and the spongy parenchyma layer (SP), the cells of theformer being smaller in size. The transition zone (TZ)was hardly distinguishable. The stomata scarcely de-veloped upper walls, and the cytoplasm of the occlusivecells occupied more than 50% of the cellular volume(Fig. 4).
In mature leaves (Figs. 5e8, semi-thin cross sections1.5 mm thick; and Figs. 9, 10, paraffin-embedded 8 mmthick cross sections) the palisade parenchyma wasstructured in two layers, both made up of cells withvacuoles. The vacuoles showed a very dense content,most probably tannins, with an affinity for safranin(Figs. 9, 10). The plastids were large, spherical and fullof starch (Fig. 5). The cell wall was thin. The cells in thetransition zone were intermediate in size, without densevacuolar content and with abundant, large plastids(Fig. 7). The epidermis developed a much thicker cuticle,with less ornamentation than in young leaves (Figs. 5,6). The spongy parenchyma followed the same pattern
Table 1
AOT40 ( ppb h, for daylight hours with solar radiation O50 W m�2), 12-h ( from 8:00 to 20:00 CET) and daily (24-h) means for the successive plant
sampling days since the beginning of the fumigations (the first plant sampling (20 May 2002) was carried out before the beginning of the fumigations
on 29 May 2002; CFZ charcoal filtered and NFZ non-filtered air)
Plant sampling date AOT40 ( ppb h) 12-h mean ( ppb) 24-h mean ( ppb)
CF NFC 40 NFC 80 CF NFC 40 NFC 80 CF NFC 40 NFC 80
20/05/02 e e e e e e e e e
05/06/02 0 2639 4381 11.8 68.8 89.7 11.8 41.9 51.4
12/06/02 0 4688 8929 12.9 65.9 90.9 13.6 41.2 53.1
19/06/02 1 7177 13315 13.8 67.8 93.2 13.2 41.3 53.4
26/06/02 1 9788 18120 14.2 66.8 91.6 13.2 40.7 52.4
03/07/02 1 11836 21936 14.8 66.4 90.8 14.9 42.0 53.7
10/07/02 1 14169 25860 14.6 66.2 89.7 14.8 41.9 53.1
17/07/02 3 16356 30051 14.7 65.7 89.3 14.8 41.5 52.8
26/07/02 3 19458 35193 14.8 65.8 88.7 14.6 41.3 52.3
16/08/02 3 24631 46007 14.1 63.4 86.2 14.0 39.8 50.7
05/09/02 3 28827 53888 13.6 61.2 83.2 13.5 38.2 48.6
07/10/02 3 39672 64733 12.4 59.1 78.8 12.6 36.7 46.0
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as the palisade parenchyma with reduced intercellularspaces. Cells of the sub-epidermal layer also showedvacuolar content, although less dense than in the spongyparenchyma, with large and abundant plastids (Fig. 8).The stomata increased the thickness of the wall at theexpense of the cytoplasmic content, which was less than50% (Fig. 8).
3.1.2. Effects of O3
In comparison with plants grown at sub-ambient O3
levels (CF), O3 enriched treatments (NFC 40 andNFC 80) strongly accelerated leaf senescence. Further-more, O3 also induced other more characteristichistological alterations (described in the followingsection). At the beginning, plants exposed to bothNFC 40 and NFC 80 regimes exhibited similar mod-ifications, but clearly longer exposure periods resulted inmore intense effects on the tissues and cells in plantsfrom the NFC 80 treatment.
3.1.2.1. The palisade parenchyma. Figs. 11 and 12 (semi-thin sections) show initial effects of O3 on the palisadeparenchyma cells. Tannin vacuoles in the affected areaschanged, with one super-imposed on the other, givingthe cell an overall striated look (Fig. 11). Staining withtoluidine blue produced a variable coloration of thecontents of the vacuoles; some were orange while otherswere more or less intense blue. The density of thevacuolar content was notably lower. With higher O3
doses and longer exposure times, the vacuoles degen-erated completely; their tonoplast disintegrated andtheir content was mixed with the cytoplasm (Fig. 12).Chloroplasts in the affected zones tended to decrease inboth size and number. After approximately three weeksat the highest O3 treatment (NFC 80 ppb), severaldarker granulations resembling plastoglobuli appeared
in the centre of the chloroplasts (Fig. 12). During thecourse of approximately one month, there was a pro-gressive degeneration by zones, in the cell walls of thoseparenchyma cells. They become deteriorated and ac-quired a rough appearance. As a result, there was anincrease in the size of the intercellular spaces (Fig. 13).
3.1.2.2. The spongy parenchyma and transition zone. Inthe spongy parenchyma, plants from the NFC 40 ppbtreatment, showed a series of alterations with respect tothe corresponding pattern described for unaffectedleaves after a 7-day exposure (Figs. 14, 15). As was thecase with the palisade parenchyma, a stacking of thetannin vacuoles with a variable aspect was observed.There was also a reduction in the size and number ofchloroplasts, although it was less marked than in thepalisade parenchyma. Similar alterations also occurredin the sub-epidermal layer (Fig. 15), but the transitionzone was scarcely affected (Fig. 14).
At a higher O3 dose (NFC 80 ppb) and longerexposure times (1 month), the degenerative processesbecome more acute. Vacuoles disappeared, with theircontent mixed with the cytoplasm (Figs. 16, 17, semi-thin sections, and Fig. 18, in paraffin). The chloroplastsdegenerated and plastoglobuli were formed. The wallsbecame more irregular and deteriorated. In some areas,wart-like protrusions of the cell walls appeared (Fig. 16).The intercellular spaces became larger (Figs. 16, 18). Theplastids in the transition zone were reorganized,occupying the middle of the cell, probably due to thedisappearance of the central vacuole (Fig. 17). Theseplastids also showed a more irregular and less refringentappearance.
Safranin and fast green staining revealed the presenceof granulations in the chloroplasts with a high affinityfor safranin (Fig. 19). They were especially visible in
Figs. 1e15. Fig. 1. Cross section of a juvenile leaf. Ad: adaxial epidermis; Ab: abaxial epidermis; PP: palisade parenchyma; TZ: transition zone; SP:
spongy parenchyma; SE: sub-epidermal layer. (!200). Fig. 2. Detail of the transition zone showing the aspect of the plastids (arrows) and the
vacuoles ( ) in the parenchyma cells. (!1000). Fig. 3. Details of the adaxial epidermis, palisade parenchyma and transition zone. Note the
ornamentation on the thin cuticle (arrows) (!1000). Fig. 4. Details of the abaxial epidermis, spongy parenchyma and sub-epidermal layer. Two
stomata are marked with arrows (!1000). Fig. 5. Details of the adaxial epidermis and the palisade parenchyma in a mature leaf. Note the thicker
cuticle and ornamentation (arrows). Parenchyma cells ( ) showing a dense vacuolar content and plastids (!1000). Fig. 6. Details of the adaxial
epidermis and palisade parenchyma in a mature leaf. Note the thick cuticle and the ornamentation (arrows). Parenchyma cells ( ) with a dense
vacuolar content and plastids. (!1000). Fig. 7. Details of the transition zone ( ) and the spongy parenchyma, with numerous large plastids; it has
a less dense vacuolar content than the palisade parenchyma. (x1000). Fig. 8. Details of the spongy parenchyma ( ), the sub-epidermal layer ( ) and
the abaxial epidermis. In mature leaves, stomata (arrow) show a more swollen cell wall and a lower cytoplasmic content than the stomata of young
leaves (!1000). Fig. 9. An 8 mm-thick cross section of a paraffin-embedded mature leaf. Ad: adaxial epidermis; PP: palisade parenchyma; TZ:
transition zone; SP: spongy parenchyma; SE: sub-epidermal layer; Ab: abaxial epidermis. (!200). Fig. 10. Details of an 8 mm-thick cross section of
a paraffin-embedded mature leaf. Ad: adaxial epidermis; PP: palisade parenchyma; TZ: transition zone; SP: spongy parenchyma (!400). Fig. 11.
Details of a cross section of the palisade parenchyma of a leaf exposed to NFC 40 ppb O3 for a week. There is a stacking of the vacuoles ( ) and
a decrease in the number and size of the chloroplasts (arrows) (!1000). Fig. 12. Details of a cross section of the palisade parenchyma of a leaf
exposed to NFC 80 ppb O3 for a month. A degeneration of the vacuoles ( ), chloroplasts (white arrows, enlarged detail) and cell wall (arrow heads)
is observed. C: cuticle (!1000). Fig. 13. Details of a cross section of the palisade parenchyma of a leaf exposed to NFC 80 ppb O3 for a month and
then embedded in paraffin. There is a degradation of the cell walls and an increase in the intercellular spaces ( ) (!1000). Fig. 14. Details of a cross
section of the spongy parenchyma of a leaf treated with NFC 40 ppb O3 for one week. There is a stacking of the vacuoles ( ) and a decrease in the
size and number of the chloroplasts (arrows), although to a less degree than in the palisade parenchyma. TZ: transition zone (!1000). Fig. 15.Details
of a cross section of the spongy parenchyma and the abaxial epidermis of a leaf treated with NFC 40 ppb O3 for one week. Cells of the sub-
epidermal layer (SE) experienced similar changes as those of the spongy parenchyma. Stacked vacuoles ( ) (!1000).
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those cells lacking tannins, since those compounds alsoreact with safranin resulting in the masking of thegranulations. At the end of the treatment, however,granulations became denser with a higher affinity for thesafranin, thus becoming recognizable even in cells rich intannins.
3.1.2.3. The epidermis and the stomata. The cuticularornamentations that were very sharp in the controlplants (CF) (Figs. 3e6, 22) became smooth, flat andwaxy in appearance in the O3-treated plants (Figs. 20,21, 23). A thickening of the adaxial cuticle was alsoobserved (Fig. 11), due mainly to the increase in the sizeof the cuticular layer. Microscope sections of leavesexposed to the O3 enrichment showed a considerableincrease in the thickness of the external tangential wallsof the epidermal cells. The thickening was produced bythe accumulation of a dense material, with affinity fortoluidine blue (staining dark blue, in contrast with thelight blue colour of the lignified secondary walls)(Fig. 12). In the abaxial epidermis, the O3-treated plants(Figs. 20, 21) exhibited a considerable reduction incytoplasmic volume, which was about 30% after onlya month, due to a substantial increase in the thickness ofthe walls, especially the upper. Time, as it progressedaccelerated the accumulation of wall material in theO3-treated plants.
Anomocytic stomata also changed as a result of theO3 action. In the cross sections of the stomata from thecontrol-plants, the lower wall of occlusive cells wasmuch thicker than the upper. Between both walls, thecytoplasm occupied about 50% of the total cell volume(Fig. 4) in juvenile leaves, and less in mature leaves
(Fig. 8). In O3-fumigated plants, the wall thicknessof the occlusive cells increased, finally becoming in-operative (Figs. 20, 23 compared with Fig. 22).
3.1.2.4. The conductive bundles and the secretory chan-nels. In contrast to the vascular bundles in the un-affected leaves (Fig. 24), in the xylem of the O3-treatedleaves, an increase in the thickness of the lignifiedsecondary wall reinforcements was observed, resultingin a reduction of the lumen diameter of vascular ele-ments (Fig. 25) in the metaxylem area. The phloembundles in the O3-treated plants also changed in appear-ance: the walls turned sinuous and slightly thicker, thusreducing the lumen of the cells, especially in the olderleaves. In addition, the contents of some of the phloemcells became denser (Fig. 25), more visibly so in thosethat surrounded the secretory channels (Fig. 27).
The secretory channels in the O3-treated leaves alsoseemed to undergo modifications; the cells that coveredthe secretory channels seemed to be in a process ofdegradation (Fig. 27) or in some way altered when com-pared with the cells that covered the normal channels(Fig. 26).
3.2. Visible injury
During 2002, plants showed no visible injury on theleaves or only a very slight intervenial reddening(AOT40 for the entire study period in NFC 80 ppbtreatment was 64,733 ppb h, Table 1). In contrast, ina previous experiment conducted in 1998, plants de-veloped clear O3-induced foliar injury symptoms afterjust 14 days of exposure (AOT40= 8808 ppb h):
Figs. 16e28. Fig. 16. Details of a cross section of the spongy parenchyma of a leaf treated with NFC 80 ppb O3 for one month. Vacuoles ( ),
degenerated chloroplasts (white arrows), and wart-like protrusions of the cell walls (arrow heads; enlarged detail) (!1000). Fig. 17.Details of a cross
section of the transition zone (TZ) of a leaf treated with NFC 80 ppb O3 for one month. There is a degeneration of the vacuoles ( ) and
a reorganization of the TZ chloroplasts (arrows) (!1000). Fig. 18.Details of the cross section of the mesophyll of a leaf treated with NFC 40 ppb O3
for 1 week and then embedded in paraffin. With respect to control leaves, there is an enlargement of the intercellular spaces and an accumulation of
tannins in the vacuoles of the SE layer cells. SP: spongy parenchyma; PP: palisade parenchyma; TZ: transition zone; SE: sub-epidermal layer; VB:
vascular bundle; Ab: abaxial epidermis (!400). Fig. 19. Details of the cross section of the spongy parenchyma and sub-epidermal layer of a leaf
treated with NFC 80 ppb O3 for 1 month and then embedded in paraffin. Granulations with an affinity for safranin were observed in chloroplasts of
those cells not accumulating tannins (arrows) (!1000). Fig. 20. Semi-thin cross section of a leaf treated with NFC 40 ppb O3 for 1 month. Cuticle
(C) increased in thickness and the waxy ornamentation disappeared. The external tangential walls of the occlusive cells of the stomata (S) became
thickened. SP: spongy parenchyma; SE: sub-epidermal layer. (!1000). Fig. 21. Details of spongy parenchyma (SP) and abaxial epidermis (Ab) of
a leaf treated with NFC 40 ppb O3 for 1 month and then embedded in paraffin. The increase in cuticle (C) thickness and the disappearance of the
waxy ornamentation can be observed. Also apparent is the increase in the thickness of the external tangential walls of the occlusive cells in the
affected stomata (S). SP: spongy parenchyma; SE: sub-epidermal layer. (!1000). Fig. 22. Scanning electron microscope view of the abaxial epidermis
of a healthy mature leaf. One can see totally functional stomata and waxy ornamentations (OR) in the cuticle (!2000). Fig. 23. Scanning electron
microscope view of the abaxial epidermis of a leaf treated with NFC 40 ppb O3 for 1 month. The leaf shows changes in the cuticle (C) and in the
stomata (S) (!2000). Fig. 24. Details of the central vascular bundle in an unaffected leaf. X: xylem; SL: sclerenchyma; PH: phloem; SC: secretory
channel (!400). Fig. 25. Details of the xylem and the phloem in leaf treated with NFC 80 ppb O3 for 2 weeks. In the xylem, the lowered capacity of
the conductive bundles and the increased thickness of the walls can be observed. Also apparent are the alterations produced in many of the phloem
cells, with a much more irregular morphology, and accumulation of a substance with affinity for safranin. AX: altered xylem; APH: altered phloem.
(!1000). Fig. 26.Details of a secretory channel in a control leaf. The cells covering the channel are seen to be normal, as is the phloem. CS: secretory
channel; PH: phloem; X: xylem; VC: vascular cambium. (!1000). Fig. 27. Details of a secretory channel in a leaf treated with NFC 80 ppb O3 for 3
weeks. The cells covering the channel present a clearly altered appearance (arrows), as does the phloem. ASC: altered secretory channel; APH: altered
phloem; SC: sclerenchyma. (!1000). Fig. 28. Ozone-induced visible foliar injury on P. lentiscus.
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intervenial areas of the older leaves became reddish,while veins remained green (Fig. 28). Symptoms weremore intense in the oldest leaflets of the compositeleaves, but did not affect the abaxial side. Similarsymptoms were also observed during exposures in 2001,but plants developed readily visible symptoms only after141 days (AOT40 74,036 ppb h).
4. Discussion
The present study showed that under the experimen-tal conditions, O3 had a deleterious effect on the leavesof P. lentiscus. As a summary, the following anatomicaleffects have been observed. (1) Modifications in thepalisade parenchyma: (a) chloroplasts in the affectedzones tended to decrease both in size and number andfinally degenerate; plastoglobuli appeared in theirstroma; (b) vacuoles were altered and later degeneratedand their tonoplast disintegrated; (c) tannins were atfirst anomalously stacked, and later homogeneouslydistributed within the vacuoles; (d) cell walls becamethickened and developed wart-like protrusions; (e)mesophyll cells collapsed, and there was an increase inthe size of intercellular spaces. (2) Modifications in thespongy parenchyma: similar to those of the palisadeparenchyma, with a granulation of the stroma. (3)Modifications in the epidermis and stomata: externaltangential walls of the epidermal cells became thickened,consequently reducing cytoplasmic volume of the cells,and stomata finally become inoperative. (4) Modifica-tions in conductive bundles: an increase in the lignifiedsecondary wall reinforcements in the metaxylem area,and alterations of the wall and cellular content of thephloem cells were observed, resulting in a reduction ofcell lumen for both conductive tissues. (5) Modificationsin the secretory channels: the cells covering the secretorychannels partly degenerated.
These results were consistent with previous obser-vations of the O3 effects reported for several deciduoustrees and conifers. Mesophyll cells are preferentialtargets for O3 (Guderian et al., 1985). Several authorshave described modifications similar to those observedhere in the chloroplasts after O3 exposures: a reductionin size (Sutinen and Koivisto, 1995), production ofplastoglobuli (Miyake et al., 1989; Mikkelsen andHeide-Jørgensen, 1996), and granulation of the stroma(Sutinen and Koivisto, 1995; Holopainen et al., 1996).Thickened mesophyll walls and wart-like protrusions ofthe cell walls described in the previous section are alsoknown to be induced by O3, and are indicative that thepollutant had induced a slow intercellular oxidativeresponse (e.g. Gunthardt-Goerg et al., 1997). Thoseprotrusions can also be induced by other agents suchas heavy metals (e.g., zinc), and have also beeninterpreted as indicative of apoplastic oxidative burst
(Gunthardt-Goerg and Vollenweider, 2002). In severalspecies, accumulation of secondary compounds, mainlyphenols, is enhanced by O3 (Vollenweider et al., 2003).Accumulation of phenolic compounds (including tan-nins) is considered as an active response of the plant todiffering environmental stresses: O3, but also otherpollutants (Pasqualini et al., 2003), low nutrient supply,or environmental factors such as drought (Bussottiet al., 1995). That is a very important issue requiringfurther, detailed investigation under ambient condi-tions.
An increase in the cuticle thickness was observed in A.unedo after O3 fumigation (Bussotti et al., 2003). In birchleaves, O3 induced an increase in cell wall thickness in theveins, and vacuoles were filled with a coarse tanninprecipitate (Gunthardt-Goerg and McQuattie, 1998). Inthe petioles of ozonated plants of that species, the phloemtissue was deformed (Matyssek et al., 1992). In stems,a reduction in the xylem ray and tracheid cells has alsobeen reported, due to an inhibition of the cambial activityof xylem growth, and an increased number of lignifiedtracheids (Matyssek et al., 2002). All those alterations,especially in the phloem, were probably relevant fortransport and carbon allocation within the plant.However, as far as we know, the modifications in thesecretory channels as a response to O3 are reported herefor the first time. Those channels are responsible formastic secretion, a resin rich in tannins. Secretory cells ofthe channels experience similar changes in their tannincontent as those reported for the mesophyll cells, and thecells finally become deformed and partly broken. Thosealterations have also been observed in a parallel experi-ment with the congeneric plant P. terebinthus (unpub-lished).
Ozone affects the evergreen mastic at the cellular levelalong similar patterns as in deciduous plants. However,the presence of a thick epidermis and a relatively highspecific leaf area (SLA, area of leaf divided by its drymass) makes symptom expression of the injury in thisspecies less apparent than in plants with thinner leavesand epidermis. Low SLA and large intercellular spaces inthe leaves are features considered to favour symptomexpression in plants (Gravano et al., 2003). Therefore,hardening of plant leaves may be an important factoraffecting symptom onset and development in evergreenplants, and may partly explain the variation amongindividuals and years. SinceP. lentiscus is a perennial withextended foliar longevity, it would be of interest toelucidate whether the observed adverse effects of O3 arepersistent for more than a single growing season orwhether carry-over effects occur or whether repairmechanisms are able to compensate the stress duringperiods of low O3 (autumn and winter). A ‘‘memory’’effect has been suggested for conifers, where symptomdevelopment may be delayed by many months after theO3 exposure (Sandermann, 1996) and also in grape, where
329J. Reig-Arminana et al. / Environmental Pollution 132 (2004) 321e331
the response of plants toO3 at a given time depends on theprevious year exposures (Soja et al., 2003).
Caution should be used in the extrapolation of theresults from the study to field conditions. In addition tothe artificial experimental conditions, there are uncer-tainties in scaling the O3 response of seedlings andsaplings to mature plants, seedlings often having forexample, higher stomatal conductance than adult plants(Chappelka and Samuelson, 1998). Higher stomatalconductance enhances O3 uptake, and may favourdeleterious effects at the cellular level. Water availability,nutrient status of the plants, air temperature andhumidity, wind speed, and incident light levels areknown to affect gas uptake rates (US-EPA, 1996).Particularly relevant for Mediterranean conditions aresoil moisture and Vapour Pressure Deficit (VPD)governing stomatal conductance and hence, O3 uptake.Soil moisture affects the onset, development and severityof foliar O3 injury in some species, with more symptomsunder well-watered conditions (Schaub et al., 2003).P. lentiscus is a drought-avoiding species, with a promptresponse to drought stress by stomatal closure, toprevent severe tissue dehydration (Vilagrosa et al.,2003); and consequently decreased O3 flux into leaves.However, in some parts of the Mediterranean, high O3
episodes also occur during spring (Sanz et al., 2001a,b),when stomatal conductance is not impaired by the mid-summer drought. Possible effects of those O3 episodes onvegetation remain to be established under the Mediter-ranean conditions. Ozone-like foliar injury symptoms(reddening affecting the intervenial areas of the uppersurface) on P. lentiscus, have been observed sporadicallyunder field conditions (Sanz and Millan, 2000). Homo-geneous reddening, affecting also the veins, has beenobserved in the field and might be attributed to O3. It hasbeen suggested that microscopy (the presence of charac-teristic cellular alterations as those described in thisstudy) may be a complementary tool to field observa-tions in discriminating possible O3 effects (Sutinen andKoivisto, 1995; Vollenweider et al., 2003) and earlydetection, before the onset of visible injury. Froma practical viewpoint, however, in extensive monitoringstudies of the effects of O3 on natural vegetation,microscopy may be quite time consuming and may notalways be sufficiently specific to be used alone.
Acknowledgements
M.J.S. and V.C. thank the DGCN (MMA) andConselleria de Medi Ambient ( project FORMEDO-ZON, Interreg III B) for funding this study, andGeneralitat Valenciana and Bancaixa for their continu-ous support of Fundacion CEAM. We are also indebtedto Prof. Sagar Krupa for useful suggestions. We thankCarmen Martın for collecting the plant material
periodically and for taking care of the plants. JoseMartın, owner of ‘‘La Peira’’ farm, is also acknowledgedfor providing facilities to conduct our work.
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