45
RESUMEN Las enzimas, proteínas con la capacidad de transformar un sustrato en un producto gracias a su potencial catalítico. Realizan la reacción en razón a una velocidad de transformación del sustrato a producto traduciéndose en actividad enzimática. En este informe se da a conocer el comportamiento de la enzima “Biolactasa NTL” de acuerdo a 2 diferentes temperaturas de operación y sustrato. En la primera experiencia se da a conocer los efectos de la actividad y estabilidad de la enzima. Se obtiene que a una mayor temperatura en el medio de reacción esta actividad aumenta, donde a 55°C la actividad medida en leche semi-descremada y lactosa es de 8847 y 9987 [UI/mL] respectivamente. En cuanto a la perdida de estabilidad medida a los 10 minutos, se obtiene que a una temperatura de 45°C es de un 14,4%, mientras que a temperatura de 55°C la perdida es mayor, alcanzando un 17%. La puesta en marcha de un reactor enzimático en comparación con un reactor de cultivo celular, a modalidad por lotes, su operación y control es más simple de acuerdo al manejo de menores variables, ya que en este caso se monitorea factores como pH y temperatura. Como segunda experiencia se evalúa el comportamiento del reactor en forma teórico-práctica en relación al grado de conversión del sustrato lactosa a los monosacáridos, glucosa y galactosa, alcanzando sólo un 52,9%, transcurrida 2,3 horas de operación del reactor. En la última experiencia, correspondiente a la elaboración de manjar, donde la hidrolisis parcial de la lactosa resulta efectiva al momento de concentración de sólidos, pues por medición en refractómetro, la leche tratada con enzima, alcanza la concentración requerida de 60-70°Brix, en menor tiempo de operación. Proporcionando propiedades organolépticas, que la leche 1

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RESUMEN

Las enzimas, proteínas con la capacidad de transformar un sustrato en un producto

gracias a su potencial catalítico. Realizan la reacción en razón a una velocidad de

transformación del sustrato a producto traduciéndose en actividad enzimática. En este

informe se da a conocer el comportamiento de la enzima “Biolactasa NTL” de acuerdo a 2

diferentes temperaturas de operación y sustrato.

En la primera experiencia se da a conocer los efectos de la actividad y estabilidad de la

enzima. Se obtiene que a una mayor temperatura en el medio de reacción esta actividad

aumenta, donde a 55°C la actividad medida en leche semi-descremada y lactosa es de

8847 y 9987 [UI/mL] respectivamente. En cuanto a la perdida de estabilidad medida a los

10 minutos, se obtiene que a una temperatura de 45°C es de un 14,4%, mientras que a

temperatura de 55°C la perdida es mayor, alcanzando un 17%.

La puesta en marcha de un reactor enzimático en comparación con un reactor de cultivo

celular, a modalidad por lotes, su operación y control es más simple de acuerdo al manejo

de menores variables, ya que en este caso se monitorea factores como pH y temperatura.

Como segunda experiencia se evalúa el comportamiento del reactor en forma teórico-

práctica en relación al grado de conversión del sustrato lactosa a los monosacáridos,

glucosa y galactosa, alcanzando sólo un 52,9%, transcurrida 2,3 horas de operación del

reactor.

En la última experiencia, correspondiente a la elaboración de manjar, donde la hidrolisis

parcial de la lactosa resulta efectiva al momento de concentración de sólidos, pues por

medición en refractómetro, la leche tratada con enzima, alcanza la concentración

requerida de 60-70°Brix, en menor tiempo de operación. Proporcionando propiedades

organolépticas, que la leche sin tratamiento enzimático pierde durante el proceso, como lo

es el efecto nocivo de la cristalización de lactosa.

1

Page 2: Informe Final Biorreactores

INDICE GENERAL

1. Introducción...............................................................................................................4

2. Materiales y métodos................................................................................................5

2.1. Determinación de azucares reductores por la técnica de miller (dns)......................5

2.2. Método de glucostat..................................................................................................5

2.3. Metodología analítica................................................................................................6

2.3.1. Determinación del grado de hidrólisis de la leche.....................................................6

2.4. Metodología experimental.........................................................................................7

2.4.1. Determinación de la actividad de la enzima..............................................................7

2.4.2. Determinación de la concentración de glucosa (utilizando lactosa como sustrato). .7

2.4.3. Determinación de la concentración de glucosa (utilizando leche como sustrato).....8

2.4.4. Determinación de la estabilidad de la enzima...........................................................8

2.4.5. Puesta en marcha del reactor...................................................................................8

2.4.6. Hidrólisis enzimática de lactosa................................................................................9

2.4.7. Fabricación del manjar..............................................................................................9

3. Resultados y discusiones........................................................................................10

3.1. Caracterización del preparado enzimático..............................................................10

3.1.1. Actividad enzimática................................................................................................10

3.1.2. Estabilidad enzimática.............................................................................................11

3.2. Hidrólisis enzimática de la lactosa en un reactor por lotes.....................................14

3.3. Hidrólisis enzimática de lactosa para producción de manjar..................................16

4. Conclusiones...........................................................................................................18

5. Bibliografía...............................................................................................................19

6. Anexos.....................................................................................................................20

2

Page 3: Informe Final Biorreactores

1. INTRODUCCIÓN

Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica con capacidad catalítica,

altamente específica y activa en condiciones moderadas, lo que hace favorable su uso

como catalizadores en la industria de procesos. Los progresos que están realizando

actualmente la ingeniería genética y la biotecnología permiten augurar un desarrollo cada

vez mayor del uso de las enzimas, al disponer de un suministro continuo de materiales

con la actividad deseada a precios razonables.

En el presente informe se muestra el trabajo realizado con el preparado enzimático

Biolactasa-NLT, que actúa de forma similar a la Lactasa en la leche, la cual es una

enzima producida de forma natural en el intestino delgado, y de forma artificial como

preparado enzimático, que juega un papel vital en el desdoblamiento de la lactosa,

mediante una reacción enzimática de hidrolisis, en sus dos componentes básicos: glucosa

y galactosa.

De forma experimental se contemplan tres prácticas de laboratorio, primero se determina

la actividad y la estabilidad al preparado enzimático comercial con el cual se está

trabajando, midiendo generación de producto por el método de glucostat utilizando leche

semi-descremada y lactosa como sustratos. Luego esta enzima se incuba de forma

soluble en un reactor por lotes, con leche semi-descremada como medio de reacción, bajo

condiciones ambientales controladas, donde se determina el grado de hidrólisis de la

leche en razón del tiempo (de lactosa a glucosa y galactosa), determinándose también la

generación de producto por el método de glucostat, y la concentración de lactosa por el

método de DNS.

Finalmente utilizando dos reactores por lotes en las mismas condiciones mencionadas

anteriormente, y cambiando solo que uno contiene la enzima y el otro no, y luego de un

determinado tiempo de reacción y grado de conversión, se lleva a cabo la elaboración de

manjar, hasta llegar a un contenido de sólidos de un 65-70%.

3

Page 4: Informe Final Biorreactores

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Determinación de azucares reductores por la técnica de Miller (DNS)

El método DNS es una técnica colorimétrica que emplea 3,5-ácidodinitrosalicílico para la

hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra, seguido de la determinación

espectrofotométrica a 540 nm de los azúcares reductores.

Esta técnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una

fermentación o para cuantificar los productos de una reacción enzimática.

Reacción del método

El acido 3,5-dinitrosalicilico en presencia de azúcares reductores se reduce a acido 3-

amino-5-dinitrosalicilico.

2.2. Método de Glucostat.

La glucosa oxidasa es una flavoproteina altamente específica que cataliza la oxidación de

la glucosa a β-D-gluconolactona, sin que ningún otro azúcar natural reaccione en

extensión apreciable.

Reacción del método.

Esta reacción en la que se consume oxígeno podría seguirse manométricamente

mediante un electrodo de oxígeno. Sin embargo, para poder seguir el curso de esta

4

Page 5: Informe Final Biorreactores

reacción espectrofotométricamente es necesario acoplar a la misma una segunda

reacción enzimática indicadora adecuada. Para la determinación colorimétrica de glucosa

por el método de la oxidasa, se añade al medio peroxidasa de rábano silvestre (HRP),

que elimina el peróxido de hidrógeno a medida que se forma, a la vez que se genera un

colorante adecuado según el siguiente esquema de reacción:

Reacción del método.

Se podrían utilizar como aceptores de oxígeno benzidina, o-toluidina, o-dianisidina. Sin

embargo, la naturaleza carcinogénica de estos compuestos ha impulsado la búsqueda de

aceptores alternativos

2.3. Metodología analítica

2.3.1. Determinación del grado de hidrólisis de la leche.

Las muestras de leche (2 ml) se reciben en viales los cuales son colocados en un

baño con agua a 80°C para detener la reacción.

Se toman 0,2 ml de la muestras anterior, se le agrega 0,2 ml de una solución de

sulfato de zinc y 0,2 ml de hidróxido de bario, se centrifugan a 5000 rpm por 5

minutos y se retira el sobrenadante.

Se toman 0.1 ml del sobrenadante y se le adicionan 1 ml del reactivo enzimático

para determinar glucosa. Si fuese necesario la muestra de sobrenadante se debe

diluir con agua destilada antes de realizar la determinación de glucosa.

Se incuba la mezcla por 10 minutos a 37ºC y se determina la absorbancia a

505nm.

Se realiza un blanco utilizando tampón fosfato como muestra y una muestra

Standard con una solución de glucosa de 0.1 g/l

5

Page 6: Informe Final Biorreactores

2.4. Metodología experimental2.4.1. Determinación de la actividad de la enzima.

Se adicionan 4 mL de una solución de Lactosa (100 g/L preparada en tampón

fosfato 0.1 M pH 6), en un tubo de ensayo.

Se incuba aproximadamente por 5 minutos a 45 °C o hasta que el sustrato alcance

la temperatura de reacción.

Adiciona 0.1 mL de la muestra enzimática, previamente diluida con tampón fosfato

0.1 M pH 6.

Agitar suavemente y dejar reaccionar por 5 minutos en un baño a 45 °C.

Cumplido el tiempo de reacción, tomar la solución y colocarla en un baño con agua

hirviendo, para detener la reacción.

Realizar un blanco de reacción sin enzima.

Determinar la concentración de glucosa mediante el metodo de glucostat.

Las experiencias se realizan por triplicado.

Se repite la experiencia a 55 °C.

Se repite la experiencia también utilizando leche semidescremada.

2.4.2. Determinación de la concentración de Glucosa (utilizando lactosa como sustrato)

En un tubo de eppendorf colocar 0.1 mL de la muestra de reacción enzimática

(inactivada).

Adicionar 1 mL del reactivo de determinación de glucosa.

Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Leer la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 505 nm.

Leer contra un blanco que lleva 0.1 mL de tampón fosfato y 1 mL del reactivo, y

que también es incubado.

Interceptar en la curva de calibrado.

6

Page 7: Informe Final Biorreactores

2.4.3. Determinación de la concentración de glucosa (utilizando leche como sustrato)

En un tubo de eppendorf colocar 0,2 mL de la muestra de reacción enzimática

(inactivada), adicionar sobre este 0,2 ml de una solución de sulfato de zinc y 0,2 ml

de hidróxido de bario, agitar en un vortex y luego centrifugar a 5000 rpm por 5

minutos.

En un tubo de eppendorf colocar 0.1 mL del sobrenadante anterior y adicionar 1

mL del reactivo de determinación de glucosa.

Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Leer la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 505 nm.

Leer contra un blanco que lleva 0.1 mL de tampón y 1 mL del reactivo, y que

también es incubado.

Interceptar en la curva de calibrado.

2.4.4. Determinación de la estabilidad de la enzima.

Preparar 5 mL de una solución enzimática en tampón fosfato 0.1 M pH 6.

Tomar 0,5 mL de la muestra anterior y medir la actividad inicial (por triplicado),

como se describe previamente.

Incubar a 45ºC la solución enzimática restante (4,5 mL).

Cada 10 minutos tomar muestras de la solución enzimática (0,5 mL) y medir su

actividad enzimática residual, como se describe previamente.

Las experiencias deben ser realizadas por triplicado.

Repetir la experiencia a 55°C

2.4.5. Puesta en marcha del reactor.

Instalar el reactor.

Verificar las conexiones de las mangueras y el estado de los sellos.

Evaluar la potencia de agitación.

7

Page 8: Informe Final Biorreactores

Instalar y calibrar el electrodo de pH.

Poner en marcha el sistema de calefacción.

Adicionar al reactor el medio de reacción que es la leche a hidrolizar.

Adicionar la cantidad de enzima lactasa, calculada previamente.

Instalar el termómetro para medir temperatura.

Poner en marcha el sistema de agitación que consiste en un agitador mecánico de

hélice.

Mantener la leche bajo agitación suave y a temperatura constante durante el

tiempo necesario para alcanzar el grado de hidrólisis preestablecido.

2.4.6. Hidrólisis enzimática de lactosa.

Adicionar la leche descremada seleccionada y medir su pH.

Tomar una muestra para determinar la concentración de lactosa inicial (tiempo

cero).

Poner en marcha el sistema de agitación y calentamiento (45°C o 55°C).

Esperar que el sistema de reacción alcance la temperatura deseada.

Adicionar la enzima de acuerdo a la razón enzima sustrato entregada.

Mantener la leche bajo agitación suave y a temperatura constante durante el

tiempo necesario para alcanzar el grado de hidrólisis preestablecido.

Cada 10 minutos sacar muestras de 2 ml para determinar el grado de hidrólisis de la

lactosa.

2.4.7. Elaboración del manjar.

Una vez finalizada la etapa de hidrólisis se procede a la fabricación del manjar

Debemos:

Calentar la leche bajo agitación hasta 80ºC, en algún recipiente u olla, midiendo

temperatura constantemente.

Adicionar lentamente la cantidad de sacarosa de acuerdo a la dosificación

sugerida (200 g/l de leche).

Mantener bajo agitación hasta llegar a un contenido de sólidos de un 65-70%, el

que se determina mediante un refractómetro y corresponde a un valor de 70ºBrix.

8

Page 9: Informe Final Biorreactores

3. RESULTADOS Y DISCUSIONES

3.1. Caracterización del preparado enzimático

3.1.1. Actividad enzimática

En esta práctica se procede a determinar la actividad de la enzima a dos temperaturas,

45° y 55° Celsius, para el preparado enzimático comercial Biolactasa – NTL.

Como primera experiencia se procede a determinar la actividad de la enzima, la cual se

realiza adicionando 4 [ml] de una solución de Lactosa en un tubo de ensayo, el cual se

incuba por 5 minutos a 45°C, luego se procede a adicionar 0,1 [ml] de la muestra

enzimática previamente diluida con tampón fosfato, que en este caso la dilución aplicada

es de 1:1000, se agita suavemente y se deja reaccionar por 5 minutos en un baño

termostatizado a 45 °C. Una vez cumplido el tiempo, la muestra se lleva a un baño de

agua hirviendo para la detener la reacción. Finalmente se determina la glucosa existente

en la muestra mediante el método de glucostat.

La experiencia se realiza también para una muestra de leche descremada a la misma

temperatura (45°C) además de repetirla para 55°C junto a la de Lactosa.

Todas las muestras se realizan por triplicado. ¿ES NECESARIO QUE APAREZCA ACA

TAMBIEN?

Se desea analizar el comportamiento de la hidrólisis de la lactosa, cuantificando la

aparición de producto final en términos de concentración de glucosa. En la tabla siguiente

se muestran los datos obtenidos en laboratorio. (Ver Anexo D, Tabla D.5.)

Tabla 3.1: Datos obtenidos de actividad enzimática a dos temperaturas.

Actividad [UI/ml]Leche Lactosa

45 °C 9478,1 7894,655°C 8847,4 9987,4

De acuerdo a los datos presentados, se evidencia que el potencial catalítico de la enzima

aumenta en cuanto aumenta la temperatura del medio donde esta inserto el sustrato con

la enzima. Cabe señalar que al ser mayor esta temperatura cada vez más, llegará a un

punto donde esta última tiende a perder su conformación tridimensional por efectos

térmicos implicando que la conversión de sustrato a producto, en este caso la hidrólisis de

9

Page 10: Informe Final Biorreactores

la lactosa a glucosa más galactosa, decrezcan notoriamente. Según bibliografía este

punto máximo de capacidad catalítica bordea los 60°, punto en que no conviene realizar

esta práctica pues su estabilidad también se ve afectada en gran medida.

Analizando la actividad en cuanto a tipo de sustrato, en este caso lactosa y leche semi-

descremada a concentraciones determinada de 100[g/L] y 45[g/L] respectivamente. Se

evidencia que la enzima mantuvo una mayor actividad para la leche, aunque lo esperado

es que la enzima al estar en un medio saturado de sustrato sea más activa. Se podría

pensar que se inhibe por sustrato, pero no es el caso pues de acuerdo a lo estudiado,

esta enzima se comporta de forma distinta, inhibiéndose posteriormente de forma

competitiva.

10

Page 11: Informe Final Biorreactores

3.1.2. Estabilidad enzimática

Como segunda experiencia se procede a determinar la estabilidad de la enzima, la cual se

realiza preparando 5 [ml] de una solución enzimática en tampón fosfato, de la cual se

toma 0,5 [ml] y se procede a medir la actividad inicial, como se realizó en la experiencia

anterior. La solución enzimática sobrante se incuba en baño termostatizado a 45°C, luego

se toman muestras cada 10 minutos de esta solución y se mide su actividad enzimática

residual.

La experiencia se repite para una temperatura de 55 °C. Donde todas las muestras se

realizan por triplicado. NECESARIO DENUEVO?

Se entiende por actividad enzimática residual como la actividad a un determinado tiempo

de incubación. Y por actividad inicial la actividad a tiempo cero.

Los resultados serán expresados en actividad relativa, la cual se entiende por actividad

residual/actividad inicial.

A continuación se muestran los resultados obtenidos para la estabilidad de la enzima

respecto a la velocidad que se alcanza en la hidrólisis de la lactosa en el tiempo.

Tabla 3.2. Actividad enzimática residual y relativa a 45° Celsius.

45°C

Actividad enzimática

Tiempo Residual Relativa

[min] [UI/L] [%]

0 6,99 100

10 5,99 85,6

25 5,47 78,2

40 5,31 76,0

63 5,22 74,6

74 4,90 70,1

88 4,71 67,3

103 4,20 60,0

11

Page 12: Informe Final Biorreactores

Tabla 3.2. Actividad enzimática residual y relativa a 55° Celsius.

55°C

Actividad enzimática

Tiempo Residual Relativa

[min] [UI/ml] [%]

0 6,47 100

10 5,37 83,0

25 5,08 78,6

40 4,87 75,4

63 4,75 73,5

74 4,44 68,7

103 3,71 57,4

Observando los porcentajes de actividad relativa existentes para cada temperatura, se

puede ver que la enzima pierde estabilidad a los pocos minutos, ejemplo de ello es a los

10 minutos la perdida de actividad para 45°C es de un 14,4% y para la temperatura de

55°C la perdida de actividad de un 17%. Esta pérdida mayor a 55°C se debe a que la

enzima es termolábil, por lo cual sufre una desnaturalización por causa de la temperatura

por lo cual decrece su actividad y ocurre en menor tiempo que a 45°C.

En la siguiente grafica (grafica 3.1) se muestra la comparación de la actividad a 45° y 55°

Celsius, para poder observar el comportamiento que tiene cada una.

De la gráfica siguiente se puede decir que la enzima a la temperatura de 45° Celsius es

más estable que la de 55°C por el comportamiento apreciado.

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Page 13: Informe Final Biorreactores

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

45°C

55°C

Tiempo [min]

Act

ivid

ad

rela

tiva

[%

]

Grafica 3.1. Comparación actividad relativa a dos temperaturas de reacción.

Las fluctuaciones que se aprecian en la Grafica 3.1. de la actividad enzimática a 55°C

pueden deberse al comportamiento normal de la enzima, ya que esta no permanece

estable dentro del medio.

13

Page 14: Informe Final Biorreactores

3.2. Hidrólisis enzimática de la lactosa en un reactor por lotes.

Para comenzar esta experiencia de hidrólisis enzimática se calcula la cantidad de enzima

a agregar al reactor. De tal forma que presente una conversión del 99% en 2 horas de

operación en el reactor con leche semi-descremada (ver Anexo F), dando como resultado

a agregar 0,677 ml de enzima.

Luego de adicionar la enzima y dejar el reactor en las condiciones óptimas para operar, se

pone en marcha y se comienza experimentalmente la hidrólisis de la lactosa obteniendo el

grado de conversión de los azucares reductores en la hidrólisis enzimática, siendo los que

se muestran en el siguiente gráfico:

0 0.5 1 1.5 2 2.50

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Tiempo [h]

[%]

de

co

nv

ers

ión

Gráfica 3.2. Grado de conversión en el tiempo de operación del reactor, según

ANEXO F.

Para determinar la concentración de glucosa [g/L] se utiliza el método de glucostat, para

poder calcular los moles de glucosa, y para determinar la concentración de Lactosa [g/L]

se utiliza el método DNS, dando como resultado una concentración de lactosa inicial de

33,8 [g/L], valor que se utiliza para determinar el grado de conversión (moles de

glucosa/moles de lactosa) en función del tiempo, para poder llevar un seguimiento del

curso de la reacción. (Cálculos en ANEXO F).

14

Page 15: Informe Final Biorreactores

Experimentalmente con 1 ml de enzima agregado al reactor, solo se logró un 52,9 % de

conversión en 2.3 horas, esperándose un 99% en 2 horas de operación, esto pudo haber

sucedido porque se agregó más enzima de lo que se debía, ya que al realizar los cálculos

la cantidad de enzima a adicionar era sólo de 0,677 ml, y como la enzima posee una

inhibición competitiva por producto, al haber más cantidad de enzima y ésta al estar en las

condiciones adecuadas para reaccionar, comenzó a hidrolizar la lactosa teniendo así

glucosa y galactosa, donde al pasar del tiempo y al haber más galactosa que lactosa está

la inhibió y no se alcanzó el porcentaje de conversión en el tiempo esperado.

15

Page 16: Informe Final Biorreactores

3.3. Hidrólisis enzimática de lactosa para producción de manjar

Ésta práctica se desarrolla en dos etapas. Primero se realiza una hidrólisis parcial de

lactosa, donde se recomienda una disminución del 35%. Luego se procede a la

fabricación de manjar.

Con respecto al grado de hidrolisis de lactosa, se agrega 1 ml de enzima al reactor de

volumen de reacción de 2 litros, y temperatura de operación de 45°C, donde transcurrida

una hora de reacción se obtuvo un grado de hidrolisis de un 14%. Cabe mencionar que

para efectos de este cálculo se considera como concentración inicial de lactosa en la

leche 45 [g/L]. Luego se procede a la elaboración del manjar, y mediante un refractómetro

se determina el contenido de sólidos, finalizando con un valor de 70° Brix

aproximadamente.

Para comparar entre leche hidrolizada y sin hidrolizar, mantenidas a condiciones de

operación iguales. Se presenta el siguiente gráfico:

0 10 20 30 40 50 60 70 800

20

40

60

80

100

Chart Title

Tiempo [min]

Gra

do

s B

rix

[°B

rix]

Gráfico 3.3. Elaboración de manjar con leche hidrolizada y sin hidrolizar.

Medición de Grados Brix en el tiempo (Ver anexo E)

La leche hidrolizada presentó una mayor alza de grados Brix en menor tiempo que la

leche sin hidrolizar. Cabe mencionar que la medición de grados Brix representa la

concentración de azúcar presente en solución. Se mide con un refractómetro y la

concentración de azúcar es proporcional a su índice de refracción. Esto debido a que la

16

Page 17: Informe Final Biorreactores

enzima Biolactasa – NTL hidroliza la lactosa, generando como producto monosacáridos

tales como glucosa y galactosa.

El mayor problema que presenta el “manjar” como anomalía de producto es la sobre-

estructuración de la lactosa y su consecuente cristalización como lactosa monohidratada.

Es por esto, que la hidrólisis enzimática constituye uno de los métodos más efectivos en

la elaboración de manjar, pues logra disminuir el efecto nocivo de la cristalización

excesiva de la lactosa sobre la estabilidad organoléptica del producto.

17

Page 18: Informe Final Biorreactores

4. CONCLUSIONES

18

Page 19: Informe Final Biorreactores

5. BIBLIOGRAFÍA

Acevedo F,Gentina Juan Carlos,Illanes A,2002,Fundamentos de Ingeniería

Bioquímica,1era edición, Capitulo 4 Cinética de Fermentaciones pp.94-118,Chile.

SENATI, Elaboración de manjar blanco, Documento de Consulta, 10 Junio de

2012, www.infolactea.com

19

Page 20: Informe Final Biorreactores

6. ANEXOS

Anexo A

Curva calibrado DNS

Estándar glucosa: 1,5 [mg/ml]

Tabla A.1. Datos medidos de absorbancia a 540 [nm].

Vol. Estándar Vol. Tampón Conc. Glucosa Absorbancia [540 nm]

[ml] [ml] [mg/ml] 1 2 Promedio

0,1 0,9 0,15 0,085 0,055 0,070

0,2 0,8 0,30 0,143 0,131 0,137

0,3 0,7 0,45 0,222 0,214 0,218

0,5 0,5 0,75 0,389 0,365 0,377

0,7 0,3 1,05 0,521 0,520 0,521

0,8 0,2 1,20 0,596 0,585 0,591

1,0 0,0 1,50 0,760 0,739 0,750

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.60.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

f(x) = 0.503824786324787 x − 0.00830769230769246R² = 0.999646970244746

Concentración glucosa [mg/ml]

Ab

sorb

anci

a [5

40 n

m]

Figura A.1. Curva de calibrado de glucosa por método DNS.

20

Page 21: Informe Final Biorreactores

Anexo B

Curva calibrado para lactosa

Estándar lactosa: 1,5 [mg/ml]

Tabla B.1. Datos medidos de absorbancia a 540 [nm].

Vol. Estándar Vol. Tampón Conc. Glucosa Absorbancia [540 nm]

[ml] [ml] [mg/ml] 1 2 Promedio

0,1 0,9 0,15 0,044 0,056 0,050

0,2 0,8 0,30 0,106 0,105 0,106

0,3 0,7 0,45 0,171 0,171 0,171

0,5 0,5 0,75 0,266 0,291 0,279

0,7 0,3 1,05 0,421 0,410 0,416

0,8 0,2 1,20 0,478 0,466 0,472

1 0 1,50 0,594 0,591 0,593

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.60.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

f(x) = 0.404159544159544 x − 0.013923076923077R² = 0.999331379259486

Concentración lactosa [mg/ml]

Ab

sorb

anci

a [5

40 n

m]

Figura B.1. Curva de calibrado para lactosa por método DNS

21

Page 22: Informe Final Biorreactores

Anexo C

Curva de calibrado glucostat

Estándar glucosa: 0,25 [mg/ml]

Tabla C.1. Datos medidos de absorbancia a 505 [nm]

Volumen Absorbancia

Estánda

r Tampón Conc. Glucosa [505 nm]

[ml] [ml] [mg/ml] 1 2 Promedio

10 90 0,025 0,080 0,076 0,078

30 70 0,075 0,209 0,255 0,232

50 50 0,125 0,387 0,403 0,395

70 30 0,175 0,553 0,544 0,549

80 20 0,200 0,638 0,637 0,638

100 0 0,250 0,789 0,791 0,790

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.300.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

f(x) = 3.17795180722892 x − 0.00337650602409639R² = 0.999824841784365

Concentración de glucosa [mg/ml]

Ab

sorb

anci

a [5

05 n

m]

Figura C.1. Curva de calibrado para glucosa por método glucostat.

22

Page 23: Informe Final Biorreactores

23

Page 24: Informe Final Biorreactores

Anexo D

Determinación de actividad y estabilidad de la enzima.

Tabla D.1. Datos para estabilidad a 45° Celsius

Tiemp

o Absorbancia [nm]

Glucos

a

Actividad

enzimática

Activida

d

Muestr

a [min] a b c Promedio [g/l] [UI] Relativa

T0 0

0,49

6

0,46

7

0,49

0 0,484 0,153 6,99 1,00

T1 10

0,33

8

0,44

5

0,46

0 0,414 0,131 5,99 0,856

T2 25

0,35

6

0,39

0

0,38

8 0,378 0,120 5,47 0,782

T3 40

0,31

8

0,39

4

0,39

0 0,367 0,117 5,31 0,760

T4 63

0,35

2

0,37

0

0,36

0 0,361 0,115 5,22 0,746

T5 74

0,36

0

0,34

0

0,31

5 0,338 0,108 4,90 0,701

T6 88

0,36

0

0,31

5

0,30

0 0,325 0,103 4,71 0,673

T7 103

0,27

1

0,28

8

0,30

9 0,289 0,0921 4,20 0,600

Tabla D.2. Datos para estabilidad a 55° Celsius

Tiemp

o Absorbancia [nm]

Glucos

a

Actividad

enzimática

Activida

d

Muestr

a [min] a b c Promedio [g/l] [UI] Relativa

T0 0

0,41

6

0,43

7

0,49

0 0,448 0,142 6,47 1,00

T1 10

0,36

2

0,36

3

0,38

8 0,371 0,118 5,37 0,830

24

Page 25: Informe Final Biorreactores

T2 25 0,34

0,36

9

0,34

4 0,351 0,112 5,08 0,786

T3 40

0,33

4

0,30

1

0,37

5 0,337 0,107 4,87 0,754

T4 63

0,30

6

0,32

5

0,35

3 0,328 0,104 4,75 0,735

T5 74

0,29

4

0,30

0

0,32

5 0,306 0,097 4,44 0,687

T6 88

0,38

8 0,3

0,30

6 0,331 0,105 4,80 0,742

T7 103

0,20

4

0,31

3 0,25 0,256 0,0815 3,71 0,574

Tabla D.3. Actividad de la enzima en leche

Absorbancia

45°C 55°C

1 2 3 Promedio 1 2 3 Promedio

muestra - blanco 0,205 0,237 0,209 0,217 0,239 0,147 0,221 0,202

muestra 0,270 0,302 0,274 0,282 0,308 0,216 0,290 0,271

blanco 0,065 - - 0,065 0,0690 - - 0,0690

Tabla D.4. Actividad de la enzima en lactosa.

Absorbancia

45°C 55°C

25

Page 26: Informe Final Biorreactores

1 2 3 Promedio 1 2 3 Promedio

muestra - blanco 0,52 0,535 0,587 0,547 0,696 0,652 0,732 0,693

muestra 0,542 0,557 0,609 0,569 0,743 0,699 0,779 0,740

blanco 0,0220 - - 0,0220 0,0470 - - 0,0470

Tabla D.5. Actividad enzimática enleche y lactosa a 45° y 55°Celsius

Temperatura Promedio Glucosa FD Actividad enzimatica[°C] abs [g/L] [UI]

Leche45

0,282 0,0694 3000 9478,1Lactosa 0,569 0,173 - 7894,8

Leche55

0,271 0,0647 3000 8847,4Lactosa 0,740 0,219 - 9985,8

26

Page 27: Informe Final Biorreactores

Ejemplo calculo actividad enzimática:

Para la leche:

0,0694 [ gl ] ∙ 15 [min ] ∙

1 [molGlc ]180 [ g ] ∙

1 [mol Lac ]1 [molGlc ] ∙

106 [ μmol Lac ]1 [mol Lac ] ∙

4,1 [ml ]0,1 [ml ] ∙

1 [ l ]1000 [ml ] ∙1000=¿

¿3,159[ UImlenzima ] [¿ ] [ μmol

mlmin ]Agregando el factor de dilución de 3

3,159 ∙3=9478,1[ UIml ]

Para lactosa:

0,173 [ gl ]∙ 15 [min ] ∙

1 [molGlc ]180 [g ] ∙

1 [mol Lac ]1 [molGlc ] ∙

106 [μmol Lac ]1 [mol Lac ] ∙

4,1 [ml ]0,1 [ml ] ∙

1 [l ]100 [ml ] ∙1000=¿

¿7894,6 [ UImlenzima ] [¿ ] [ μmol

mlmin ]

27

Page 28: Informe Final Biorreactores

Anexo E

Hidrolisis enzimática de lactosa para elaboración de manjar.

Tabla E.1. Medición de absorbancia por método glucostat y cálculo del

porcentaje de conversión de lactosa

GlucosaLactosa

Absorbancias [505 nm]

Tiemp

o [min]1 2 3 Prom

concentració

n glucosa

[g/L]

mol

glucos

a

% de

conversión

Concentració

n lactosa

[g/L]

mol

lactos

a

00,02

3

0,02

8

0,03

10,027 0,029 0,000 0,122 45,000 0,132

300,01

4

0,01

3

0,01

60,014 1,674 0,009 7,068

600,03

0

0,03

4

0,03

10,032 3,310 0,018 13,977

Utilizando curva de calibrado para determinación de glucosa por método glucotat se

obtiene la concentración de glucosa transcurrido 0, 30, 60 minutos de reacción. El cálculo

a tiempo 30 minutos se presenta a continuación:

Glucosa [ gL ]= (Absorbancia promedio+0,0034 )3,178

∗fd=(1,674+0,0034 )

3,178∗3=1,674 [ g

L]

El cálculo de porcentaje de conversión se realiza con los moles de glucosa y lactosa, lo

que se presenta a continuación:

28

Page 29: Informe Final Biorreactores

%Conversi ó n=

Concentración glucosaMasamolar glucosaConcentación lactosaMasamolar lactosa

=

1,674[ gL]

180 [g

mol]

45 [ gL]

342[ gmol

]

∗100=7,07

Tabla E.2. Medición de grados Brix para leche hidrolizada y sin hidrolizar

Grados Brix [°Brix]

Tiempo

[min]

Leche

Sin Hidrolizar

Leche

Hidrolizada

0 26,2 27

15 28,2 29,2

30 32 37

40 42,6 45

50 60 66

60 63 84

75 71,4

29

Page 30: Informe Final Biorreactores

Anexo F

Hidrólisis enzimática de la lactosa en un reactor por lotes.

Para una conversión del 99% en el reactor en 2 horas de operación, utilizando para esta

enzima los valores de parámetros cinéticos de Km 20 [g/L] y la velocidad máxima de

reacción se calculó según lo obtenido en el laboratorio anterior. La expresión que se

utilizó es:

Vm∗t

Km∗V rxn

=S0K m

∗X−ln (1−X )

X: Grado de Conversión, 99%, 0,99

S0: Sustrato inicial, 40 [g/L]

t: Tiempo, 120 [min]

Vrx: Volumen de reacción, 2 [L]

Km: constante de afinidad, 20 [g/L]

Vm: Velocidad máxima.

De esto calculamos Vm = 6418,3 UI.

El Vm obtenido, lo relacionamos con la actividad de la enzima en UI/ml enzima

(determinada en la experiencia anterior) de la siguiente forma:

9478,1 UI/ml enzima * X = 6418,3 UI

X = 0,677 ml de enzima.

Por lo que la cantidad de enzima a adicionar es 0,677 ml de enzima.

30

Page 31: Informe Final Biorreactores

Determinación de lactosa por método de DNS.

Tabla F.1. Absorbancias obtenidas a diferentes intervalos de tiempo a 540 [nm].

Tiempo Absorbancia Lactosa Temperatura

[h] 1 2 Promedio [g/L] fd [g/L] *fd pH [°C]

00,179 0,157 0,168 0,450

25

33,7526,51 44

1,00,165 0,185

0,1750,423

30

38,0976,57 43

2,30,108 0,107

0,1080,230

60

41,4606,52 44

Mediante la siguiente ecuación se calculó la concentración de Lactosa en [g/L], a través del tiempo:

Lactosa [g L]= (Abs+0 ,0139 )0 , 4042

∗fd

31

Page 32: Informe Final Biorreactores

Determinación de glucosa por método de glucostat.

Tabla F.2: Absorbancias obtenidas a diferentes intervalos de tiempo a 505 [nm].

Tiempo Absorbancia Glucosa Porcentaje de

[h]1 2 Promedio [g/L] fd [g/L] *fd

mol glucosa

conversión

0 0,099 0,090 0,095 0,031 - 0,092 0,001 0,520

0,2 0,130 0,125 0,128 0,041 60 2,471 0,014 13,9

0,3 0,330 0,350 0,340 0,108 30 3,242 0,018 18,2

0,5 0,480 0,485 0,483 0,153 30 4,587 0,025 25,8

0,7 0,530 0,520 0,525 0,166 30 4,988 0,028 28,1

1,0 0,443 0,410 0,427 0,135 45 6,087 0,034 34,3

1,6 0,532 0,515 0,524 0,166 45 7,461 0,041 42,0

1,8 0,270 0,265 0,268 0,085 101 8,609 0,048 48,5

2,1 0,290 0,280 0,285 0,091 101 9,166 0,051 51,6

2,3 0,285 0,300 0,293 0,093 101 9,404 0,052 52,9

Mediante la siguiente ecuación se calculó la concentración de glucosa [g/L], a través del

tiempo:

Glucos a[g L]= (Abs+0 ,0034 )3 ,178

∗fd

Para calcular el grado de conversión en función del tiempo se utilizaron las siguientes

ecuaciones:

Grado de conversión = (moles de glucosa/moles de lactosa)

Por lo que la concentración de glucosa y lactosa en [g/L], se transformo a [moles/L] de la

siguiente forma:

32

Page 33: Informe Final Biorreactores

Moles de lactosa =

Lactosa [g L]P .M . Lactosa

Ejemplo:

Moles de lactosa =

33 ,8[ g L]342[ gmol ] = 0,099 [mol/L]

Moles de glucosa =

Glucos a[g L]P .M .Glucos a

Ejemplo:

Moles de Glucosa =

0 ,092[g L]180[ gmol ]

=0 ,0005[molL]

Luego se realiza el cálculo para el grado de conversión:

Grado de conversión =

0 ,0005[molL]

0 ,099[molL]

=5,2∗10. 3

[%] de conversión= (5,2* 10-3)* 100 = 0,516

Todos los cálculos de conversión se realizaron con los [mol/L] de la concentración de

Lactosa inicial

33