Denumirea proiectului

„Influenţa agenţilor microbieni imunosupresori (PRRS, Circovirus, Mycoplasma etc.) asupra eficienţei programelor de imunoprofilaxie aplicate în unităţile de creştere a porcilor”

Anul începerii 15.11.2011 Anul finalizării 15.11.2014 Durata (luni): 36

RAPORT DE FAZA(studii si analize documentare)

FAZA 1

Existenta unor agenti patogeni, recunoscuti a avea activitate imunosupresoare, in populatiile porcine, pot determina slabirea capacitatii de aparare a organismului, dar mai ales pot contribui la cresterea riscurilor de aparitie si evolutie grava a unor boli.

Inducerea unei imunitati protectoare contra diferitelor infectii la porcine depinde de cativa factori. Unii patogeni (PRRS, circovirusul porcin, Mycoplasma etc.), micotoxinele si chimicalele sunt cunoscute a modula negativ sistemul imun si astfel, pot interfera semnificativ cu eficacitatea oricarui protocol de vaccinare. Cele mai multe informatii cu privire la mecanismele imunologice implicate in protectia contra infectiei cu diferite virusuri au aratat ca, in unele cazuri, protectia indusa prin vaccinare a fost atinsa in absenta anticorpilor neutralizanti la momentul infectiei cu o tulpina virulenta. Aceste observatii implica rolul vital al imunitatii mediate celular in protectia virala in timpul fazei timpurii a imunitatii.

Imunitatea mediata celular este cunoscuta a avea un rol efector si de reglare asupra sistemului imun si se crede ca este esentiala pentru imunitatea contra agentilor patogeni, inclusiv virusurile. Informatiile anterioare cu privire la rolul imunitatii mediate celular in protectia virala indusa de vaccinuri la porci sunt foarte limitate, datorita faptului ca tehnicile conventionale sunt impracticabile pentru detectia imunitatii mediate celular la porcine. Mai mult, s-a demonstrat activitatea limfoproliferativa specifica fata de un antigen in limfocitele din sangele periferic de la porci vaccinati care au fost protejati contra infectiei cu virus PPC. A fost demonstrata existenta limfocitelor T citotoxice pentru PPC (CTL) in celulele mononucleare din sangele periferic (PMBC) de la porci imunizati.

In vivo, virusul PRRS se replică în macrofagele alveolare pulmonare, celulele dendridice din amigdale, limfonoduli, timus, splină, plăci Peyer, ficat, rinichi, cord. Diagnosticul de certitudine se realizează prin izolare virală sau, recent, prin utilizarea testului PCR (detecţia genomului viral in probele biologice).

Testele serologice, bazate pe detecţia anticorpilor faţă de virus, realizate prin metode imunoenzimatice şi testele de imunofluorescenţă,, directă sau indirectă, sunt utilizate în programele de supraveghere a efectivelor porcine de reproducţie. Indiferent de testul utilizat, pot fi inregistrate erori de diagnostic datorate variabilităţii antigenice şi genetice (virusul PRRS fiind se pare virusul cu cea mai înaltă rată de mutageneză, de 10-2 /situs / an, faţă de alte virusuri ARN, la care evoluţia inregistrează indici de 10-3 / situs / an; Laboratorul de referinţă OIE, Canada, nu a stabilit inca un protocol de diagnostic genetic standardizat). În ceea ce priveşte combaterea şi controlul bolii, în zonele cu prevalenţă ridicată şansele de eliminare a infecţiei sunt minime.

Nici una dintre metodele de eradicare utilizate (depopularea secvenţială a adăposturilor, înţărcare precoce, cu transfer în alte adăposturi, vaccinare) nu a dat rezultate pozitive în totalitate. Vaccinurile inactivate existente nu conferă protecţie decât asupra manifestărilor de reproducţie, iar cele vii doar asupra manifestărilor respiratorii. Virusul PRRS / infecţiile asociate acestuia fac obiectul unor cercetări intense. Tulpinile tip EU nu induc manifestări respiratorii in infecţii unice. Nivelul răspunsului mediat celular (evidenţiat prin detecţia gIF) protejează faţă de manifestările respiratorii in cazul tulpinilor NA. In răspunsul imun la nivelul ţesutului pulmonar un rol major il au limfocitele T citotoxice.

In model celular s-a constatat că induce apoptoză, iar in model animal s-a inregistrat creşterea citokinelor pro-inflamatorii (IFNa şi TNFa), asociată unui aspect sever al leziunilor pulmonare. Numeroase studii sunt dedicate tehnicilor de detecţie, epidemiologiei moleculare (prezenţa concomitentă in anumite regiuni a ambelor tipuri virale, absenţa clusterilor pe criterii geografice sau temporale, ca şi corelaţia negativă intre evoluţia genetică a virusului si presiunea selectivă datorată vaccinărilor).

Au fost construite variante ELISA cu peptide sintetice iar in prevenţia / controlul bolii sunt incercate vaccinurile ADN cu secvenţe izolate din tulpini sălbatice sau cu secvenţe sintetice in care s-au introdus substitutii, si chiar serumizări.Un alt virus implicat în infecţiile respiratorii la porc, adeseori asociat cu PRRS este circovirusul porcin 2 (PCV- 2), considerat în prezent ca agent etiologic al sindromului caşectizant multisistemic al purceilor înţărcaţi (Postweaning multisystemic wasting syndrom - PMWS), al sindromului tremurului congenital al purceilor nou-născuţi şi implicat în infecţiile respiratorii la porc. CVP2 are ca celule ţintă monocitele şi

macrofagele, având de asemenea efect supresor, iar la nivel celular, efect apoptotic. Date experimentale arată că vaccinările pot exacerba agresivitatea PCV 2.

Circovirusul porcin (PCV) a fost descris pentru prima data in urma cu peste 20 de ani ca fiind un contaminant picornavirus-like permanent al liniei celulare renale de porc PK15 (ATCC-CCL 33). Dupa cativa ani, s-a raportat ca PCV este un virus mic, fara anvelopa, icozaedric, continand un genom ADN monocatenar circular. Dupa aceasta PCV a fost atribuit familiei Circoviridae.

Recent, aparitia unui virus PCV distinct antigenic si genomic in populatiile de porcine ce a fost asociat cu un numar de stari clinice a crescut interesul pentru studierea PCV. Virusul descoperit nou a fost denumit PCV2, iar contaminantul original PCV al celulelor PK15 a fost denumit PCV1. Diferenta antigenica a acestor izolate noi fata de PCV1 a fost confirmata cu anticorpi monoclonali si policlonali.

Virusurile PCV2 au fost izolate de la porci bolnavi in America de Nord, Europa, Taiwan si Coreea de Sud. PCV1 si PCV2 sunt virusuri mici (17 nm), icozaedrice, fara anvelopa, continand un genom ADN monocatenar circular. Densitatea PCV1 in CsCl a fost raportata a fi de 1.37 g/cm3 de catre Tischer si de 1.33-1.34 g/ml de catre Allan et al., iar coeficientul de sedimentare de 57S comparativ cu coeficientul de sedimentare cunoscut al enterovirusului bovin. PCV1 nu hemaglutineaza eritrocitele de la o gama de animale si este rezistent la inactivare dupa expunere la pH 3, cloroform, 56oC si 70oC. Secventa nucleotidica completa (1759 nt) a genomului circular al contaminantului PCV1 al celulelor PK15 este cunoscuta si PCV1 poate replica printr-o forma replicata dublucatenara (RF).

S-a demonstrat o forma RF PCV1 si ambele catene ale RF PCV1 sunt transcrise si proteinele de codificare sunt cunoscute. Sunt recunoscute cateva cadre de citire deschise (ORF) pentru PCV1 cu un potential de a codifica proteine mai mari de 5 kDa, codificate pe una dintre catenele RF PCV. Analiza secventei de proteine codificate de catre ORF1 a indicat un grad de omologie cu nanovirusul plantelor ORF cunoscut a codifica proteinele asociate replicarii. Intr-adevar, infectia cu PCV la porci poate fi initiata de catre un nanovirus al plantelor care isi schimba gazda pentru a infecta o vertebrata si apoi se recombina cu un virus infectant al vertebratelor. Aceasta omologie cu nanovirusurile plantelor si similaritatea inalta a secventei de aminoacizi intre un produs proteic potential al ORF1 al virusului bolii ciocului si penelor si produsul ORF1 al PCV1 a fost raportata.Micoplasmele sunt cele mai mici si cele mai simple organisme ce pot sa se multiplice singure si se disting fenotipic de alte bacterii prin marimea lor si lipsa unui perete celular. Ele sunt caracterizate prin marimea mica si un continut mic in G+C ale genomului. In timpul evolutiei, Mycoplasma spp a pierdut toate genele implicate in biosinteza de acizi grasi si aminoacizi. M. hyopneumoniae, cea mai importanta specie de Mycoplasma la porcine, este agentul primar al pneumoniei enzootice porcine si, in asociere cu unele virusuri respiratorii, joaca un rol important in complexul de boli respiratorii porcine (PRDC). Ambele afectiuni cauzeaza pierderi economice majore pentru industria de crestere a porcului in intreaga lume datorita scaderii performantei si cresterii susceptibilitatii la alte infectii. Alte micoplasme patogene importante la porcine includ M. hyorhinis, ce produce poliserozita si artrita, M. hyosynoviae, o cauza a artritei la porcii in crestere si M. suis care este asociata in principal cu anemia.

Aceste date conduc la necesitatea stabilirii implicatiilor agentilor microbieni imunosupresori asupra eficientei programelor de imunoprofilaxie aplicate in unitatile de crestere a porcilor pentru a se obtine date care sa fundamenteze masuri adecvate de control care sa limiteze pierderile economice si care sa aiba un impact pozitiv asupra sanatatii si bunastarii efectivelor de porcine si asupra cresterii calitatii si sigurantei alimentare prin obtinerea si aplicarea unor metode de profilaxie eficiente.

Obiectivul etapei I a fost:Studiul epidemiologic privind tipurile de microorganisme circulante in unitatile de crestere a porcilor

in tara noastra.Atingerea acestui obiectiv s-a realizat prin indeplinirea urmatoarelor activitati:Activitatea I.1.: Studii privind stadiul actual al cunoasterii privind germenii circulanti patogeni in

populatiile porcineActivitatea I.2.: Studii privind stadiul actual al cunoasterii privind implicatiile germenilor cu efect

imunosupresor in populatiile porcineActivitatea I.3: Studii privind stadiul actual al cunoasterii privind tipurile de vaccinari si schemele de

vaccinare practicate in unitatile de crestere a porcinelor.Activitatea I.1.: Studii privind stadiul actual al cunoasterii privind germenii circulanti patogeni in

populatiile porcineIn urma investigatiilor efectuate privind circulatia germenilor patogeni in populatiile de porcine in anul

2011, s-au observat urmatoarele:Ferme de reproductie:

Indiferent de dimensiunea efectivului, cele mai des semnalate probleme, in efectivele de reproductie, au fost ascaridoza si PRRS. Totusi, PRRS a fost semnalat mult mai putin la efectivele mici (15,1%) decat la cele mari (58,3%). In afara de acestea, s-au intalnit infectii cauzate de micoplasme, infectii gripale, dizenteria porcina, precum si infectii cu streptococi, acarieni si paduchi.

Tabelul nr. 1: Frecventa agentilor patogeni circulanti in efective de porcine de reproductie din Romania:

Boala

Dimensiunea fermei

Toate fermele

Mica(Mai putin de 250

scroafe)

Medie(250-499 scroafe)

Mare(500 sau mai multe

scroafe)Procent % Procent % Procent % Procent %

APP (Actinobacillus pleuropneumoniae) 2,0 8,1 7,2 3,4PRRS (Sindrom respirator si reproductiv porcin) 15,1 36,8 56,3 21,4Mycoplasma pneumoniae 11,0 20,5 34,9 14,2

Infectii gripale 6,1 38,2 27,2 11,2

Infectii cu Salmonella 1,4 3,7 8,8 2,3Dizenteria porcina 1,3 1,1 0,7 1,3

GET (Gastroenterita transmisibila) 2,0 3,8 4,7 2,4

Ulcer gastric 8,6 21,3 17,4 10,7

Aujeszky 0,0 3,2 4,7 0,7

Leptospiroza 2,8 5,5 4,1 3,2

Parvovirus 2,5 8,3 15,9 4,4

Boala Glasser (Haemophilus parasuis) 1,7 13,1 12,4 3,7

Ascarizi 25,3 46,7 21,2 31,8

Alte boli 7,2 20,2 13,7 9,1

Purcei sugari:Primele trei infectii diagnosticate la purceii sugari au fost cu E. coli, streptococi si stafilococi, prezente in cel putin jumatate dintre fermele investigate, iar sindromul respirator si reproductiv porcin (PRRS) a fost identificat la porci, inainte de intarcare, in 10,7% dintre ferme.Tabelul nr. 2: Frecventa agentilor patogeni circulanti in efective de porci inainte de intarcare (sugari) din Romania:

Boala

Dimensiunea fermei

Toate fermele

Mica(Mai putin

de 250)

Medie(250-499)

Mare(500 sau mai mult)

Procent % Procent % Procent % Procent %PRRS (sindrom respirator si reproductiv porcin) 8,2 20,3 22,2 10,7GET (gastroenterita transmisibila) 2,8 6,2 4,2 3,2Rotavirus 3,8 8,8 19,0 5,7Escherichia coli (colibaciloza) 35,4 47,5 58,8 45,2Coccidioza 6,0 15,2 25,2 8,6Clostridium 6,1 16,2 19,0 9,0Streptococcus spp. 24,1 45,7 42,6 29,8Staphylococcus spp. 19,6 52,7 52,4 25,9Alte boli 6,3 1,3 4,8 5,7

Purcei intarcati Indiferent de marimea fermei, cea mai extinsa infectie diagnosticata la purceii intarcati a fost cu Streptococcus spp.. Infectia cu Staphylococcus spp. si cea cu virusul PRRS au reprezentat alte doua infectii intalnite frecvent in populatiile de porcine. Tabelul nr. 3: Frecventa agentilor patogeni circulanti in efective de porci intarcati din Romania:

Boala

Dimensiunea fermei

Toate fermele

Mica(Mai putin

de 250)

Medie(250-499)

Mare(500 sau mai mult)

Procent % Procent % Procent % Procent %

APP (Actinobacillus pleuropneumoniae) 5,2 11,6 13,4 6,4Boala Glasser (Haemophilus parasuis) 3,7 22,5 29,4 7,3Mycoplasma pneumoniae 14,6 41,5 52,7 19,6Infectii gripale 4,9 15,9 36,9 7,2PRRS (Sindrom respirator si reproductiv porcin) 13,4 33,8 58,0 17,5Salmonella 5,5 12,2 8,4 6,6Dizenteria porcina 2,8 5,3 1,9 3,2GET (Gastroenterita transmisibila) 0,8 2,0 4,5 1,0Diaree E.coli 22,1 32,1 38,7 26,0Circovirus 4,4 10,4 20,9 5,7Stafilococcus spp. 21,3 43,9 34,2 25,3Streptococcus spp 24,0 64,9 76,7 31,6Ascarizi 18,9 4,5 6,9 18,0Alte boli 3,1 7,2 8,3 3,9

Porci grasi:Principala infectie diagnosticata la porcii grasi a fost cea cu Lawsonia intracellularis, urmata de infectiile respiratorii cu Mycoplasma pneumoniae si virusul PRRS. Tabelul nr. 4: Frecventa agentilor patogeni circulanti in efective de porci grasi din Romania:

Boala

Dimensiunea fermei

Toate fermele

Mica(Mai putin

de 250)

Medie(250-499)

Mare(500 sau mai mult)

Procent % Procent % Procent % Procent %

APP (Actinobacillus pleuropneumoniae) 6,5 14,9 21,0 8,1

Boala Glasser (Haemophilus parasuis) 4,3 8,8 34,0 5,4Mycoplasma pneumonia 22,8 55,7 45,0 29,0Infectii gripale 8,9 21,5 25,5 12,3PRRS (Sindrom respirator si reproductiv porcin) 12,7 32,4 50,7 16,6Salmonella 6,6 16,8 8,6 8,4Aujeszky 0,8 2,7 2,5 1,1Rinita atrofica 10,5 12,3 9,3 14,0Ileita (Lawsonia intracellularis) 32,7 53,7 75,0 36,9Dizenteria porcina 1,5 3,0 0,0 1,7Circovirus 2,3 8,8 12,4 3,6Ascarizi 21,7 10,4 8,2 19,6Alte boli 7,9 6,1 2,3 7,5

In cadrul investigatiilor efectuate, in fermele de porcine din Romania, privind agentii patogeni circulanti, au rezultat urmatoarele:

- la purceii sugari, principalele infectii diagnosticate au fost cu E. coli, streptococi si stafilococi, urmate de infectia cu virusul PRRS;

- la porcii intarcati, principalele infectii diagnosticate au fost cu Streptococcus spp., Staphylococcus si virusul PRRS;

- la porcii grasi, cel mai frecvent au fost diagnosticate infectia cu Lawsonia intracellularis, urmata de cea cu Mycoplsma spp. si virusul PRRS;

- la efectivele de reproductie, s-au diagnosticat infectia cu virusul PRRS, cu micoplasme, cu streptococi si infestatia parazitara cu ascarizi.

- in toate efectivele investigate, infectiile cu virusul PRRS, circovirus si Mycoplasma spp. au fost prezente in procente diferite.

Activitatea I.2.: Studii privind stadiul actual al cunoasterii privind implicatiile germenilor cu efect imunosupresor in populatiile porcine

Virusul PRRS:Anul 1998 marcheaza diagnosticul PRRS si in efectivele de suine din Romania. Initial, acest virus a fost

diagnosticat in doua ferme, dar apoi acest fenomen s-a extins destul de repede, surprinzand fermierii si patologii veterinari care nu dispuneau de suficiente date pentru orientarea diagnosticului si aplicarea unor masuri care sa reduca riscurile diseminarii virale.

Monitorizarea unei unitati de crestere a porcilor din Romania in perioada de evolutie a PRRS a demonstrat ca natalitatea a scazut la 55.5% (la 3 luni de la diagnostic), procentul de intoarceri la estru a crescut la 23% (in lunile 3 si 4 de la debut), prolificitatea a scazut la 6.4 purcei pe scroafa (in prima luna de evolutie), prelungirea duratei gestatiei cu 3-5 zile fata de normal, iar pierderile prin mortalitate au cunoscut o crestere de 65.6%, pe primele 4 luni de la diagnostic.

Studiile privind efectul imunosupresor general al virusului PRRS nu sunt pe deplin concludente. In timpul fazei viremice, virusul nu determina modificari ale celulelor imunocompetente, nici diminuarea activitatii fagocitelor in prezenta antigenului si nici o productie de citokine imunodepresive sau inhibarea citokinelor imunostimulante.

Dimpotriva, se stie ca, prin mecanisme care sunt deocamdata necunoscute, virusul PRRS evita temporar raspunsul imun. Printre acestea, inhibarea prezentarii antigenelor virale de catre moleculele de clasa I si II ale complexului major de histocompatibilitate este de o importanta deosebita. Acest fenomen ar putea explica intarzierea in dezvoltarea raspunsului imun fata de virus (anticorpi neutralizanti si celule citotoxice).

In scop diagnostic, in Romania, este utilizată o variantă de test PCR multiprimer pentru detecţia discriminatorie a tulpinilor EU şi NA de virus PRRS pe baza secvenţelor înalt conservate din gena orf1b, din probe biologice (lavaj bronho-alveolar, ser, material seminal). Rezultatele inregistrate până in prezent au semnalat prezenta tulpinilor de tip EU in efectivele de suine controlate. Electronomicroscopic au fost evidenţiate fenomene de transcitoză la nivelul celulelor endoteliale insoţite de hiperplazia pneumocitelor de tip II şi prezenţa în cisternele dilatate ale REN din citoplasma macrofagelor alveolare numeroase particule electronodense (virioni) de cca 20-25 nm.

De asemenea, s-au efectuat studii privind modalitatile de detectie a virusului PRRS prin tehnici imunologice (IFI, imunoperoxidaza si imunofosfataza alcalina, varianta indirecta), in scop de diagnostic, rezultatele fiind spectaculoase si usor de aplicat in laboratoarele de diagnostic, intrucat permit identificarea virusului inainte a putea fi decelati anticorpii.Investigaţiile efectuate prin ELISA in ferme de ingrasare a porcilor, privind infecţia cu virusul PRRS, au aratat procente diferite de infectie, in functie de varsta porcilor examinati: 75% la vârsta de 2 luni, 70% la vârsta de 3 luni şi 91% la vârsta de 5 luni. Pentru evaluarea anticorpilor fata de virusul PRRS, au fost recoltate probe de ser din ferme de îngrăşare de la porci în vârstă de 2, 3 şi 5 luni, probe care au fost testate cu un kit ELISA comercial. Rezultatele obtinute sunt prezentate in tabelul de mai jos:

vârsta 2 luni vârsta 3 luni vârsta 5 luniProbe negative 4 6 1Probe pozitive 11 14 11Total 15 20 12Infecţie (%) 75 70 91

Identificarea din timp a efectivelor infectate cu PRRS este esenţială pentru supravegherea epidemiologică şi controlul bolii. Transferul de animale este necesar să se facă numai între efective cu acelaşi status imun, pentru limitarea răspândirii acestei boli.

In continuare, prezentam cateva aspecte intalnite in efective de porci infectati cu virusul PRRS (leziunile prezentate sunt cauzate de virusul PRRS in asociere cu alti agenti patogeni bacterieni).

Figura. 1: Scroafa cu respiratie dispneica si vergeturi pe piele

Figura. 2: Scroafa sacrificata. Evidentierea vergeturilor dupa sacrificarea scroafei

Figura. 3: Purcel cu cianoza extremitatilor si respiratie dispneica

Figura. 4: Pulmon de porc: Pneumonie hemoragico-necrotica

Figura. 5: Pulmon de porc: Zone de hepatizatie rosie.

.

Figura. 6: Cadavru de tineret porcin: Linfonoduri ingvinali mãriti.

Figura. 7: Pulmon de porc: Pleuritã fibrinoasã

Figura. 8: Pulmon de porc: Pneumonie hemoragico-necroticã

Circovirus porcin:In România, cercetarile efectuate in ferme de crestere a porcinelor au confirmat prezenta infectiei cu

virusul PCV2 (circovirusul porcin 2), implicat in evolutia sindromului casectizant multisistemic la porcine (PMWS). Examinarile epidemiologice au confirmat ca infectia cu virusul PCV2 a fost introdusa prin importul de animale de reproductie. Prezenta infectiei cu virus PCV2 a fost confirmata prin examinarile anatomopatologice efectuate care au relevat existenta de leziuni macroscopice caracteristice.

Leziunile histopatologice tipice ale PMWS precum depletia limfoidă, limfadenita histiocitara si/sau granulomatoasa, au fost observate in tesuturile limfoide ( amigdale, splina, limfonodul, placile Peyer) de la toti porcii. S-au observat cheaguri intracitoplasmatice extensive sau corpusculi de incluziune unica in macrofagele sau celulele multinucleate gigante ale acestor tesuturi limfoide. Incluziunile au fost rotunde, omogene, amfofilice, de dimensiuni variate (4-25 μm). Colorarea imunohistochimica (IHC) a dezvaluit prezenta antigenului CVP2 in tesuturile limfoide in toate cazurile. Prezenta antigenului CVP2 a fost observata in primul rand in foliculii limfoizi, cu extindere la sinusul paracortical la porcii grav afectati. In cele mai multe cazuri, colorarea pozitiva de culoare maro inchis a fost observata in citoplasma. Cu toate acestea, colorarea nucleara pozitiva a putut fi vazuta, de asemenea, in celulele compatibile morfologic cu limfoblastele sau histiocitele in cazurile grave. Trebuie observat ca antigenul CVP2 a putut fi vazut si in citoplasma celulelor in absenta corpului de incluziune. Cel mai des, a fost observata o colorare citoplasmatica difuza in histiocite infiltrand lamina propria a ileonului. In pulmoni, colorarea citoplasmatica pozitiva a fost detectata in epiteliul bronhiolar, celulele musculare netede din jurul bronhiolelor si bronhiilor si macrofagele alveolare. Numarul si intensitatea imunocolorarii in ficat si rinichi a depins de gravitatea cazului. Rinichii, epiteliul tubular renal si in ficat, au fost colorate pozitiv mai multe tipuri de celule, printre care hepatocite, celulele Kupffer, epiteliul biliar si histiocitele infiltrante.Alte tipuri de celule precum epiteliul si celulele mezenchimale au fost de asemenea colorate pozitiv. Diferentele in intensitata si distributia antigenului CVP2 printre tesuturi s-au datorat probabil gravitatii si patogenezei agentului.

PCV2 a fost asociat cu mai multe sindroame ale porcilor. S-a raportat o asociere a PCV cu pneumonie interstiţială şi limfadenopatie la porci de 6 săptămâni. Frecvent porcii afectaţi cu PMWS au între 5-12 săptămâni. Semnele clinice comune prezente includ slăbirea, dispneea, mărirea vizibilă a limfonodurilor şi mai puţin frecvente paliditate, diaree şi icter. Mortalitatea şi morbiditatea asociată PMWS variază în funcţie de stadiul focarului şi de managementul în interiorul unităţilor afectate. Într-un episod acut, mortalitatea totală poate atinge 10%, în timp ce morbiditatea şi mortalitatea în grupurile endemice este mai mică. Animalele individuale se pot însănătoşi după PMWS, dar informatiile provenite din teren sunt contradictorii. Factorii de mediu cum ar fi suprapopularea, slaba calitate a aerului, convieţuirea mai multor grupe de vârstă şi alţi factori stresanţi pot exacerba severitatea bolii.

Interrelatia intre PCV2 si alte microorganisme (PRRS, parvovirusul porcin, M. hyopneumoniae. etc.) pare a actiona in ambele sensuri: PCV2 potenteaza asemenea infectii, prin efectul sau imunosupresor si, pe de alta parte, infectia cu PCV2 este potentata de asemenea infectii. Mai mult decat atat s-a ajuns la concluzia ca si vaccinurile contra pleuropneumoniei porcului si pneumoniei enzootice cu Mycoplasma exacerbeaza, intr-o oarecare masura, agresivitatea PCV2.

Leziunile macroscopice la porcii cu PMWS sunt destul de variate. Histologic, există pneumonie multifocală limfohistiocitară până la pneumonie interstiţială granulomatoasă diseminată, frecvent cu prezenţa celulelor gigant. Frecvent se întâlnesc necroze şi desprinderea epiteliului căilor aeriene care poate progresa până la bronşiolite obliterante. Schimbările histologice sunt asociate cu antigenul PCV2, care se găseşte uneori intranuclear în celulele epiteliale şi mai frecvent intracitoplasmatic în fagocitele mononucleare.

În mod obişnuit la porcii afectaţi există o limfadenopatie sistemică marcantă, în care sunt implicaţi în special limfonodurile inghinal, mezenteric, bronhial şi mediastinal, care sunt albi şi omogeni pe secţiune. Tipic, în limfonodurile afectate există pierderi timpurii a foliculilor celulelor B şi mărirea zonelor paracorticalei (celulele T) prin infiltrarea unor celule mari histiocitare şi celule gigant multinucleare. În stadiile primare şi de mijloc ale bolii grupuri de mărimi variabile, intens bazofile, sub formă de corpusculi intracitoplasmatici sunt frecvent observaţi în ariile dependente de celule B ale ţesutului limfoid sau împrăştiate la întâmplare prin limfonod.

Aceste schimbări sunt asociate deseori cu cantităţi mari de antigen PCV2 intracitoplasmatic în celulele liniei monocit-macrofag care şi include şi diferite celule dendritice. Schimbări similare au fost găsite şi în splină şi în plăcile PEYER. Macroscopic, ficatul poate fi uşor icteric către deosebit de atrofic cu proeminenţa ţesutului conjunctiv interlobular.

Leziunile histologice timpurii cuprind infiltraţia limfohistiocitară a zonelor portale ţi necroza hepatocitelor. În stadiile finale ale bolii hepatice se observă umflarea şi vacuolizarea hepatocitelor rămase cu cariomegalie şi înlocuirea progresivă a hepatocitelor de către celule histiocitare. Antigenul PCV2 este detectabil timpuriu intranuclear în hepatocite şi pe măsură ce boala avansează intracitoplasmatic în celulele KUPFER şi infiltrarea fagocitelor mononucleare.

Leziunile macroscopice renale variază de la focare albe împrăştiate sau difuze la rinichii de dimensiune normală, deseori cu edem peripelvin, la mărire considerabilă şi edem. Histologic există infiltraţii limfohistiocitare şi eozinofilice multifocale către difuze ale ţesutului conjunctiv peripelvin cu edem şi

desmoplazie. Vasculitele nonsupurative multifocale sunt frecvent întâlnite în aceste zone. Leziunile corticale sunt de la atrofie tubulară multifocală şi regenerare până la necroze tubulare cu edem, nefrite interstiţiale şi fibroplazie. În mod uzual, intranuclear se găseşte antigen PCV2 în celulele epiteliale tubulare afectate şi împrăştiate în fagocitele mononucleare.

În cazul implicării tractului gastrointestinal, se poate întâlni paliditate, edem, şi ulcerarea nehemoragică a esofagului şi stomacului care sunt pline cu conţinut fluid, subţierea pereţilor intestinelor, în special a ileumului şi colonului spiralat. Histologic, există atrofie viloasă de la uşoară până la severă, adesea transmurală, infiltrare limfohistiocitară, cu distrugerea variabilă şi/sau regenerarea celulelor epiteliale glandulare şi criptale. Antigenul PCV2 poate fi găsit în celulele epiteliale în mucoasa implicată şi în fagocitele mononucleare din mucoasă, submucoasă şi limfatice.

Deşi leziunile macroscopice sunt rare în pancreas, poate exista atrofie multifocală sau regenerare în epiteliul acinar sau ductal care adesea este asociată cu infiltrarea interstiţială limfohistiocitară. Aceste schimbări pot fi în mod obişnuit asociate direct cu predominanţa antigenului intranuclear PCV2 în epiteliul acinar şi ductal. Factorii care determină variaţia în organul infectat nu sunt pe deplin înţeleşi, dar pot fi asociaţi cu prezenţa infecţiilor ‘’ secundare ’’, diferenţe între izolate în ceea ce priveşte virulenţa sau tropismul PCV, stadiul infecţiei sau gazda genetică sau răspunsul imun.

Observaţii experimentaleAu fost raportate leziuni macroscopice şi histologice la porcii gnotobiotici după inoculare la 3 zile de

viaţă cu o cultură celulară crescută cu izolat PCV2 şi tratată cu cloroform. Mai târziu s-a arătat că acest inocul conţinea un titru scăzut de PPV. Leziunile observate includ limfoadenopatie generalizată, hepatite, nefrite, pneumonie interstiţială, miocardite şi gastrite şi au fost descrise ca fiind la fel de tipice ca şi cele din cazurile de teren de PMWS.

Într-un studiu similar efectuat pe purceluşi convenţionali privaţi de colostru, nu s-a observat clinic boala şi au fost observate leziuni minime la porcii inoculaţi doar cu PPV. Boala clinică severă şi moartea cu leziuni severe, tipică PMWS, au fost observate la porci inoculaţi cu PCV2+PPV. Imunocolorarea ţesuturilor de la aceste animale au evidenţiat cantităţi minime de antigen PPV în ţesuturi, în special în rinichi şi cantităţi mari de antigen PCV2 asociate cu leziuni tipice de PMWS. În orice caz, folosirea aceluiaşi inocul la porcii gnotobiotici nu a produs leziuni sau a produs leziuni blânde la porcii inoculaţi doar cu PCV2, dar au produs boală clinică severă şi leziuni tipice ale PMWS după inocularea porcilor cu PCV2+PPV. Autorii au concluzionat din aceste rezultate că expunerea purceluşilor la factori de mediu nedefiniţi şi/sau agenţi infecţioşi care facilitează stimularea răspunsului imun al purceluşilor pot fi necesari, în corelaţie cu expunerea la PCV2 pentru a produce boala clinică.

Un studiu recent demonstrează că reproducerea leziunilor tipice ale PMWS la porci de 8 săptămâni crescuţi convenţional care au fost inoculaţi cu un omogenat de ţesut ce conţine PCV2 derivat din cazurile de teren de PMWS. Nu au fost observate leziuni sau au fost leziuni uşoare la aceste animale. În aceste experimente implicarea altor agenţi infecţioşi, în plus faţă de PCV2, nu au putut fi pe deplin stabilite. Sunt necesare studii suplimentare pentru o mai bună înţelegere a patogenezei bolilor asociate PCV2, în special cu privire la identificarea co-factorilor infecţioşi şi neinfecţioşi şi determinarea stadiilor timpurii ale infecţiilor cu PCV2 inclusiv celulele primare ţintă in vivo.

Mycoplasma spp.Incidenta acestei boli este crescuta in fermele de porci, fiind maxima la varsta de 16-20 de saptamani.

Leziunile pulmonare caracteristice sunt prezente la 40-80% dintre porcii abatorizati. Mycoplasma hyopneumoniae ajunge in caile respiratorii o data cu aerul inspirat. Are tropism pentru

epiteliul ciliat al mucoasei respiratorii si o data cu inceperea multiplicarii adera la celulele ciliate, producand ciliostaza, deciliere, moartea celulelor si descuamarea lor, datorita efectului citopatic si citotoxic . Concomitent, multiplicarea micoplasmelor afecteaza si sinteza glicoproteica in celulele caliciforme, exprimata prin scaderea mucinelor totale.

Micoplasmele ajung si se multiplica si in endoteliul vascular si peretele alveolar. Procesul inflamator induce o hiperplazie limforeticulara peribronhica, o hiperplazie limfoida perivasculara si o acumulare de mononucleare in lamina propria. Aceste modificari produc in final obliterarea lumenului bronhiolelor. Glandele mucoasei respiratorii se hipertrofiaza, iar in lumenul bronhiolelor si alveolelor se acumuleaza polimorfonucleare si macrofage. In timp, procesul inflamator se extinde si la tesutul interlobular. Consecutiv acestor modificari locale este alterata functia respiratorie, scazand astfel cantitatea de oxigen din sangele arterial.

Mycoplasma hyopneumoniae produce si un efect imunosupresor asupra macrofagelor alveolare ceea ce permite florei bacteriene secundare sa se multiplice, complicand astfel leziunile initiale.

Leziunile macroscopice sunt localizate mai frecvent in lobii apicali si cardiaci, fiind bine delimitate de tesutul normal si sunt mai bine evidentiate in pulmonul drept decat in pulmonul stang. initial, focarele sunt mici, de culoare rosie-violacee cu extensiune lobulara, apoi cuprind lobii apicali si cardiaci in totalitate. Ulterior, zonele afectate au o culoare cenusie albicioasa si o consistenta crescuta (hepatizatie). Limfonodurile mediastinale si traheobronhice sunt marite si suculente pe sectiune.

Leziunile histologice, la inceputul bolii, sunt specifice bronhopneumoniei cataral-purulente. Aceasta leziune este inlocuita rapid printr-o inflamatie limfohistiocitara de tip mansonal, exprimata prin proliferari perivasculare, peribronhice, noduli limfoizi si infiltratii difuze ale septelor alveolare. Obstruarea bronhiolelor este urmata de atelectazie mai mult sau mai putin extinsa, care scoate din functie zonele afectate. Reactia limfoida pulmonara are la baza limfocitele B ca urmare a activarii tesutului limfoid asociat bronhiilor.

Inflamatiile de tip fibrinos sau purulent sunt consecinta bacteriilor de asociatie si mascheaza leziunile macro si microscopice specifice acestei boli.

Activitatea I.3: Studii privind stadiul actual al cunoasterii privind tipurile de vaccinari si schemele de vaccinare practicate in unitatile de crestere a porcinelor.( in Romania)

Investigatiile privind tipurile de vaccinuri si schemele de vaccinare practicate in unitatile de crestere a porcilor in Romania s-au efectuat in cinci ferme din judetele Calarasi, Ialomita si Teleorman, pe efective de dimensiuni variabile (intre 15 000 si 30 000 porci/ferma).

In marea majoritate a cazurilor, vaccinurile utilizate sunt inactivate, vaccinurile vii fiind utilizate intr-un procent foarte mic.

Inventariind tipurile de vaccinuri utilizate in ferme de porcine la ora actuala, s-a constatat ca acestea sunt:

- vaccin inactivat contra infectiei cu Leptospira spp.;- vaccin inactivat contra infectiei cu Escherichia coli;- vaccin inactivat contra infectiei cu clostridii;- vaccin inactivat contra infectiei cu Erysipelothrix rhusiopathiae (rujet);- vaccin inactivat contra infectiei cu virusul Parvo;- vaccin inactivat contra infectiei cu Circovirus;- vaccin inactivat contra infectiei cu Mycoplasma spp.;- vaccin inactivat contra infectiei cu virusul PRRS.Cele mai frecvente scheme de vaccinare aplicate pe categorii de animale, in unitatile de crestere a porcinelor, in Romania, sunt urmatoarele:1. vaccinari la efective de reproductie (scroafe si scrofite) in perioada de gestatie: - vaccin contra infectiei cu Leptospira spp.;- vaccin contra infectiei cu Escherichia coli;- vaccin contra infectiei cu clostridii;- vaccin contra infectiei cu Erysipelothrix rhusiopathiae (rujet);- vaccin contra infectiei cu virusul Parvo;- vaccin contra infectiei cu Circovirus;- vaccin contra infectiei cu Mycoplasma spp.;- vaccin contra infectiei cu virusul PRRS.2. vaccinari la efective de purcei sugari: - vaccin contra infectiei cu Circovirus;- vaccin contra infectiei cu Mycoplasma spp..Celelalte categorii de animale, in conditii epidemiologice normale, nu se vaccineaza, in Romania.

CONCLUZII In aceasta faza s-au realizat :

1. Studii privind structura si ponderea germenilor patogeni circulanti in populatiile de porcine din Romania, pe categorii de varsta si in ferme de dimensiuni diferite;

2. Studii privind implicatiile patogenetice in populatuiile de porcine a germenilor patogeni cu efect imunosupresor;

3. Studii privind tipurile de vaccinuri si schemele de vaccinare ce se aplica in fermele de crestere a porcilor din Romania.

In etapa urmatoare, vom incepe lucrarile privind procedura de detectie a microorganismelor imunosupresoare in unitatile de crestere a porcinelor si la porcii din mediul silvatic in vederea elaborarii de metodologii eficiente de vaccinare si control a efectivelor de porci din Romania.

6. Rezultate, stadiul realizării obiectivului, concluzii şi propuneri pentru continuarea proiectului:

6.1. Rezultate:

Nr.crt.

Parteneri /acronim(cf. Formular A –

Informaţii)

Rezultate preconizate(cf. Planului de realizare al proiectului)

Rezultate obţinute

1 -- Raport de fază - cercetare - Studii şi analize documentare

- Raport de fază - cercetare - Studii şi analize documentare

6.2. Stadiul realizării proiectului:6.2.1. S-a încheiat prima fază a proiectului Studiul epidemiologic privind tipurile de microorganisme circulante în unităţile de creştere a porcilor în ţara noastră.

6.3. Concluzii:In aceasta faza s-au realizat :

1. Studii privind structura si ponderea germenilor patogeni circulanti in populatiile de porcine din Romania, pe categorii de varsta si in ferme de dimensiuni diferite;

2. Studii privind implicatiile patogenetice in populatuiile de porcine a germenilor patogeni cu efect imunosupresor;

3. Studii privind tipurile de vaccinuri si schemele de vaccinare ce se aplica in fermele de crestere a porcilor din Romania.

6.4. Propuneri pentru continuarea proiectului.In etapa urmatoare, vom incepe lucrarile privind procedura de detectie a microorganismelor

imunosupresoare in unitatile de crestere a porcinelor si la porcii din mediul silvatic in vederea elaborarii de metodologii eficiente de vaccinare si control a efectivelor de porci din Romania.