of 189 /189
1 Măsuri pentru protecţia muncii şi asigurarea securităţii în laboratoarele de biochimie .. 4 Recoltarea sângelui ........................................................................................................... 6 Condiţii de recoltare...................................................................................................... 6 Recoltarea sângelui capilar ........................................................................................... 7 Recoltarea sângelui venos ............................................................................................. 7 Condiţiile de conservare a probelor recoltate ............................................................... 8 Obţinerea plasmei şi a serului ....................................................................................... 9 Prepararea soluţiilor procentuale molare, normale .......................................................... 9 Noţiunea de pH ............................................................................................................... 14 Ionizarea apei şi produsul ionic al apei ................................................................... 14 Scara de pH ............................................................................................................. 15 Determinarea pH-ului cu ajutorul indicatorilor acido-bazici .................................. 15 Demonstrarea capacităţii de tamponare: ................................................................. 17 Determinarea colorimetrică a pH-ului prin metoda cu soluţii tampon ....................... 18 Volumetrie ...................................................................................................................... 19 Principiile analizei volumetrice .............................................................................. 19 Clasificarea metodelor volumetrice ........................................................................ 20 Calcule în analiza volumetrică ................................................................................ 20 Tehnica titrării......................................................................................................... 21 Erorile determinărilor volumetrice ......................................................................... 22 Surse de erori .......................................................................................................... 22 Acidimetria volumetrică ............................................................................................. 24 Titrări acido-bazice ................................................................................................. 24 Titrarea unui acid tare cu o bază tare ...................................................................... 24 Determinarea factorului unei soluţii de HCl 0,1N cu ajutorul unei soluţii etalon . 25 Dozarea unei soluţii de NaOH cu soluţia de HCl 0,1 N cu factor cunoscut ........... 26 Dozarea amoniacului prin diferenţă ........................................................................ 27 Titrarea unui acid slab cu o bază tare ..................................................................... 27 Aplicaţie: Dozarea acidului lactic cu o soluţie titrată de NaOH ............................ 28 Titrarea unei baze slabe cu un acid tare .................................................................. 29 Oxidimetria volumetrică ............................................................................................. 30 Permanganometrie ...................................................................................................... 31 Stabilirea factorului soluţiei de KMnO 4 0,1N ........................................................ 31 Determinări permanganometrice în mediu acid...................................................... 32 Dozarea acidului oxalic (micrometodă) .................................................................. 32 Dozarea apei oxigenate (macrometodă) ................................................................. 33 Iodometrie ................................................................................................................... 34 Dozarea substanţelor reducătoare ........................................................................... 35 Stabilirea factorului soluţiei de Na 2 S 2 O 3 0,01 N .................................................... 35 Dozarea substanţelor oxidante ................................................................................ 36 Dozarea K 3 [Fe(CN) 6 ] (macrometodă) ................................................................. 36 Dozarea K 3 [Fe(CN) 6 ] (micrometodă) ..................................................................... 36 Complexometria volumetrică ..................................................................................... 37 Dozarea aminoacizilor prin metoda complexonometrică (metoda Budesinsky) ... 40 Volumetria prin reacţii de precipitare ......................................................................... 41 Dozarea clorurilor prin metoda Volhard................................................................. 42 Identificarea glucidelor ................................................................................................... 43 Reacţii de reducere.................................................................................................. 43 Identificarea dizaharidelor ...................................................................................... 50 Identificarea polizaharidelor ................................................................................... 51

Indrumator Lp

  • Upload
    maria

  • View
    155

  • Download
    6

Embed Size (px)

DESCRIPTION

biochimie

Citation preview

1

Măsuri pentru protecţia muncii şi asigurarea securităţii în laboratoarele de biochimie .. 4 Recoltarea sângelui ........................................................................................................... 6

Condiţii de recoltare...................................................................................................... 6 Recoltarea sângelui capilar ........................................................................................... 7 Recoltarea sângelui venos............................................................................................. 7 Condiţiile de conservare a probelor recoltate ............................................................... 8 Obţinerea plasmei şi a serului ....................................................................................... 9

Prepararea soluţiilor procentuale molare, normale .......................................................... 9 Noţiunea de pH ............................................................................................................... 14

Ionizarea apei şi produsul ionic al apei................................................................... 14 Scara de pH............................................................................................................. 15 Determinarea pH-ului cu ajutorul indicatorilor acido-bazici.................................. 15 Demonstrarea capacităţii de tamponare:................................................................. 17

Determinarea colorimetrică a pH-ului prin metoda cu soluţii tampon ....................... 18 Volumetrie ...................................................................................................................... 19

Principiile analizei volumetrice .............................................................................. 19 Clasificarea metodelor volumetrice ........................................................................ 20 Calcule în analiza volumetrică................................................................................ 20 Tehnica titrării......................................................................................................... 21 Erorile determinărilor volumetrice ......................................................................... 22 Surse de erori .......................................................................................................... 22

Acidimetria volumetrică ............................................................................................. 24 Titrări acido-bazice ................................................................................................. 24 Titrarea unui acid tare cu o bază tare...................................................................... 24 Determinarea factorului unei soluţii de HCl 0,1N cu ajutorul unei soluţii etalon . 25 Dozarea unei soluţii de NaOH cu soluţia de HCl 0,1 N cu factor cunoscut ........... 26 Dozarea amoniacului prin diferenţă........................................................................ 27 Titrarea unui acid slab cu o bază tare ..................................................................... 27 Aplicaţie: Dozarea acidului lactic cu o soluţie titrată de NaOH............................ 28 Titrarea unei baze slabe cu un acid tare.................................................................. 29

Oxidimetria volumetrică ............................................................................................. 30 Permanganometrie ...................................................................................................... 31

Stabilirea factorului soluţiei de KMnO4 0,1N ........................................................ 31 Determinări permanganometrice în mediu acid...................................................... 32 Dozarea acidului oxalic (micrometodă).................................................................. 32 Dozarea apei oxigenate (macrometodă) ................................................................. 33

Iodometrie................................................................................................................... 34 Dozarea substanţelor reducătoare ........................................................................... 35 Stabilirea factorului soluţiei de Na2S2O3 0,01 N .................................................... 35 Dozarea substanţelor oxidante ................................................................................ 36 Dozarea K3[Fe(CN)6] (macrometodă) ................................................................. 36 Dozarea K3[Fe(CN)6] (micrometodă) ..................................................................... 36

Complexometria volumetrică ..................................................................................... 37 Dozarea aminoacizilor prin metoda complexonometrică (metoda Budesinsky) ... 40

Volumetria prin reacţii de precipitare......................................................................... 41 Dozarea clorurilor prin metoda Volhard................................................................. 42

Identificarea glucidelor ................................................................................................... 43 Reacţii de reducere.................................................................................................. 43 Identificarea dizaharidelor ...................................................................................... 50 Identificarea polizaharidelor ................................................................................... 51

2

Identificarea glucidelor ...............................................................................................52 Identificarea aminoacizilor şi proteinelor .......................................................................53

Reacţii de culoare ....................................................................................................53 Reacţii de precipitare ale proteinelor ..........................................................................57

Dozarea aminoacizilor monoamino-monocarboxilici prin metoda Sörensen .........60 Identificarea nucleoproteinelor .......................................................................................62 Vitamine ..........................................................................................................................63

Identificarea vitaminelor prin metoda cromatografică................................................63 Dozarea iodometrică a acidului ascorbic din urină (metoda Palladin)........................65

Enzime.............................................................................................................................66 Influenţa concentraţiei substratului asupra vitezei de reacţie enzimatică ..................68 Determinarea constantei lui Michaelis pentru urează .................................................69 Determinarea activităţii catalazei sanguine.................................................................72 Determinarea activităţii transaminazelor (metoda colorimetrică cu 2,4-dinitrofenilhidrazină)...................................................................................................73 Determinarea activităţii fosfatezei alcaline (Metoda Bodansky) ...............................77

Explorarea echilibrului acido-bazic ................................................................................82 Determinarea rapidă a rezervei alcaline (bicarbonat actual) ...................................83 Metoda Astrup.........................................................................................................83

Ioni anorganici.................................................................................................................84 Determinarea potasiului seric......................................................................................84

Dozarea flamfotometrică a potasiului seric.............................................................86 Dozarea calciului şi magneziului ................................................................................87

Dozarea calciului.....................................................................................................87 Determinarea cationului calciu în sânge .................................................................87 Dozarea calciului prin metoda permanganometrică................................................89 Dozarea calciului prin metoda complexonometrică................................................91 Dozarea magneziului prin metoda Mann şi Yoe.....................................................93

Dozarea ionului de clor din ser prin metoda Schales ..................................................96 Dozarea ferului seric (metoda Heilmeyer modificată) ................................................97 Dozarea fosfatului anorganic din ser prin metoda Briggs ( cu deproteinizare) .........99

Compuşi organici ..........................................................................................................103 Dozarea azotului total din ser prin metoda Kjeldahl.................................................103 Dozarea proteinelor totale din ser prin metoda biuretului.........................................106 Electroforeza proteinelor serice ................................................................................108 Dozarea azotului neproteic din ser prin metoda Kjeldahl .........................................112 Dozarea ureei din ser prin metoda cu urează ............................................................114 Dozarea ureei din ser prin metoda Kowarski ............................................................115 Dozarea acidului uric din ser.....................................................................................119 Dozarea creatininei din ser prin metoda Folin ..........................................................121 Dozarea bilirubinei din ser prin diazorecţia van den Bergh......................................122 Glucoza......................................................................................................................124

Determinarea glicemiei prin metoda Hagedorn-Jensen (titrimetrică)..................124 Dozarea glucozei prin metoda enzimatică (glucozoxidază)..................................128 Teste rapide pentru determinarea glicemiei ..........................................................129 Alte tehnici de determinare a glicemiei în laborator .............................................132

Dozarea beta-lipoproteinelor după Burstein .............................................................132 Dozarea colesterolului total din ser prin metoda enzimatică ....................................134 Dozarea colesterolului total şi liber...........................................................................135 Obţinerea, purificarea şi identificarea lecitinei (gălbenuş de ou)..............................138

3

Hemoglobina............................................................................................................. 141 Dozarea hemoglobinei in sânge ( metoda Drabkin) ............................................. 141 Dozarea hemoglobinei sub formă de oxihemoglobină ......................................... 141

Analiza urinii ................................................................................................................ 142 Examenul fizic al urinei ............................................................................................ 143 Examenul chimic al urinei ........................................................................................ 145 Analiza compuşilor patologici din urină................................................................... 146

Identificarea proteinelor urinare ........................................................................... 146 Evidenţierea puroiului........................................................................................... 149 Identificarea glucidelor urinare............................................................................. 150 Identificarea corpilor cetonici urinari ................................................................... 155 Teste rapide pentru identificarea corpilor cetonici ............................................... 156 Identificarea acizilor biliari................................................................................... 157 Identificarea pigmenţilor biliari urinari ................................................................ 157 Identificarea urobilinogenului şi stercobilinogenului ........................................... 158 Identificarea sângelui ............................................................................................ 159

Teste rapide de diagnostic din urină ......................................................................... 160 Test rapid de sarcină ................................................................................................. 160 Analiza de laborator a urinei..................................................................................... 161 Determinări în urina din 24 de ore............................................................................ 162

Dozarea clorurilor din urină (metoda Mohr) ........................................................ 162 Dozarea acidului uric din urină............................................................................. 163 Dozarea creatininei din urină ................................................................................ 163

Determinarea de clearance (coeficientul de epurare) renal....................................... 164 Analiza calculilor urinari .......................................................................................... 165

Identificarea unor componenţi prin reacţii specifice: ........................................... 165 Analiza salivei............................................................................................................... 166

Identificarea unor componenţi ai salivei................................................................... 166 Determinarea pH-ului şi a capacităţii tampon a salivei ........................................ 168

Analiza sucului gastric.................................................................................................. 169 Determinarea acidităţii gastrice ................................................................................ 169

Analiza lichidului cefalorahidian.................................................................................. 172 Examenul fizic .......................................................................................................... 172 Examenul chimic al lichidului cefalorahidian .......................................................... 173

Analiza scaunului.......................................................................................................... 174 Metode fizice de analiză folosite în laborator............................................................... 176

Fotometria................................................................................................................. 176 Spectrofotometru Spekol ...................................................................................... 178

Spectrofotometrul de absorbţie atomică ................................................................... 180 Spectrofotometrul de absorbţie atomică ............................................................... 180

Flanfotometria........................................................................................................... 181 Fotometrul cu flacără (flamfotometrul) ................................................................ 181

Potenţiometria cu electrozi cu electroni ioni - selectivi............................................ 183 Măsurarea pH-ului cu electrodul de sticlă ............................................................ 183

Valori patologice de laborator care ameninţă viaţa ...................................................... 185

4

Măsuri pentru protecţia muncii şi asigurarea securităţii în

laboratoarele de biochimie

1. Întregul personal şi studenţii, trebuie să cunoască şi să respecte regulile de protecţia

muncii şi asigurarea securităţii, pentru prevenirea accidentelor de muncă.

2. Tot personalul care lucrează în laboratoarele de analize biochimice este obligat să

poarte halate curate.

3. Aparatele electrice (centrifugă, termostate, frigidere, spectrofotometru etc.) trebuie

să aibă prizele împământate şi izolare electrică perfectă. Fixarea lor în priză se face

numai cu mâna uscată.

4. Înainte de începerea oricărei lucrări de laborator trebuiesc însuşite tehnic

problemele teoretice.

5. Toate reacţiile chimice se execută în conformitate cu condiţiile prescrise (cantitatea,

concentraţia, vesela, etc.).

6. Masa de lucru se păstrează într-o ordine şi curăţenie exemplară.

7. Nu se execută nici o operaţie în vase murdare.

8. După întrebuinţare toate vasele de laborator se spală cu apă de robinet şi cu apă

distilată.

9. Nu se aglomerează masa cu vase şi aparate inutile, pe masă se pun numai reactivii şi

vesela necesară pentru lucrarea respectivă.

10. Sticlele cu reactivi să fie întotdeauna închise cu dop. Dacă se folosesc diferiţi

reactivi trebuie avut grijă să nu se schimbe dopurile. Excesul luat dintr-un reactiv nu

trebuie turnat înapoi în sticlă.

11. Încăperea unde se prepară acizii minerali, apa de brom, solvenţii organici trebuie să

fie prevăzută cu nişă, exhaustor şi ventilaţie electrică.

12. Înainte de folosirea unor substanţe inflamabile (sulfură de carbon, benzină, eter,

etc.) se sting toate becurile de gaz.

13. Fiecare laborator trebuie să fie dotat cu extinctor, să se facă instructaj periodic de

utilizarea extinctorului şi să fie precizată o echipă care să intervină în caz de

incendiu.

14. Evaporarea solvenţilor inflamabili se va face numai pe băi de nisip sau băi de apă

electrice, sub nişe cu tiraj convenabil.

15. Trebuie să se lucreze cu mare precauţie cu metalele alcaline, fosfor, brom, clor, acid

azotic, substanţe toxice şi inflamabile.

5

16. Pipetarea produselor biologice se face cu pipete prevăzute cu filtru de vată.

17. Pipetarea acizilor concentraţi şi bazelor se face cu pipetă cu volum mai mare decât

volumul de pipetat şi prevăzute cu filtru de vată.

18. Bromul se măsoară numai sub nişă, cu pipete cu bulă, prevăzute cu o pară de

cauciuc pentru aspirare. Acidul sulfuric diluat se prepară prin turnarea acidului

sulfuric concentrat în vasul cu apă şi nu invers.

19. În timpul încălzirii unei eprubete care conţine un lichid capătul deschis al eprubetei

nu se ţine spre cel care efectuează operaţia şi nici spre vecini.

20. Nu se lasă substanţe în vase neetichetate.

21. Substanţele toxice se ţin sub cheie şi în borcane sau sticle prevăzute cu etichete cu

cap de mort.

22. Este strict oprită gustarea reactivilor deoarece majoritatea substanţelor chimice

folosite sunt toxice sau caustice.

23. Mirosirea substanţelor chimice nu se face prin apropierea nasului direct la gâtul

sticlei cu reactivi, ci prin aducerea unui curent de aer care conţine vapori ai

substanţelor de la gâtul sticlei cu ajutorul palmei în apropierea nasului.

24. Când se lucrează cu substanţe care în cursul operaţiei se pot împrăştia sau se pot

produce mici explozii, se folosesc ochelari de protecţie.

25. Tuburile de oxigen, bioxid de carbon şi azot lichid se depozitează, în afara

laboratorului. Când sunt strict necesare anumitor operaţii în laborator ele se

ancorează cu lanţ în locuri anume prevăzute.

26. Cromatografia şi electroforeza se efectuează în încăperi izolate de restul

laboratorului şi prevăzute cu ventilatoare electrice.

27. În legătură cu lucrarea practică efectuată se notează toate observaţiile precum şi

schiţa instalaţiei folosite.

28. Acizii minerali şi hidroxizii concentraţi, hârtiile şi eprubetele sparte nu se aruncă în

chiuvete.

29. După terminarea activităţii, se pun toate vasele la loc, se curăţă masa şi se

controlează dacă aparatura electrică a fost scoasă din prize şi robinetele de apă şi

gaz închise.

30. Fiecare laborator trebuie să fie dotat cu o trusă de prim ajutor care să conţină

medicamente şi material sanitar strict necesar (antinevralgice, cardiotonice,

antibiotice, antiseptice, calmante, feşi, tifon etc.).

6

31. Este interzisă păstrarea alimentelor în frigidere cu produse biologice,. pentru a evita

pericolul de infectare.

32. Este necesar ca măsurile de protecţia muncii, asigurarea securităţii, prevenirea

toxicităţii să fie prelucrate cu fiecare grupă de studenţi la începutul activităţii anului

universitar şi reamintite periodic.

33. În cazul unor accidente se va apela la conducătorul lucrării.

Recoltarea sângelui

Analizele chimice ale constituenţilor anorganici şi organici sanguini se pot

realiza pe sânge venos, capilar şi arterial (foarte rar).

Investigaţiile comparative pe sânge capilar şi venos au arătat că nu există

diferenţe dependente de modul de prelevare pentru următoarele substanţe: sodiu,

potasiu, clor, calciu, fosfor, colesterol, uree, proteine totale. În schimb pentru glucoză s-

au găsit valori mai mici în sângele venos faţă de cel arterial, pentru piruvat şi lactat

valori mai mari în sângele venos decât în cel capilar iar pentru amoniac valorile din

sângele arterial sunt mai mari decât cele din sângele venos.

Condiţii de recoltare

În mod curent, recoltarea sângelui se efectuează dimineaţa, à jeun (pe

nemâncate). Analizându-se influenţa micului dejun (masă uşoară) asupra concentraţiei

unor constituenţi sanguini, s-a găsit că recoltarea sângelui à jeun nu este obligatorie în

cazul dozării următoarelor elemente: clor, sodiu, potasiu, calciu, bicarbonat, uree,

creatinină, acid uric, proteine totale, colesterol, amilază, ceruloplasmină, fosfatază

alcalină, fosfatază acidă, transaminaze, leucinaminopeptidază, colinesterază.

În principiu, utilizarea sângelui total în cadrul diferitelor investigaţii este admisă

numai în cazul în care concentraţia substanţei urmărite este aproximativ aceeaşi în

globulele roşii şi în plasmă, aşa cum este cazul glucozei şi al azotului ureic.

Datorit] conţinutului diferit în apă al sângelui (81%) şi al plasmei sau serului

(93%), valorile glucozei din ser sunt cu 12% mai mari ca cele obţinute în sânge.

Concentraţiile medii ale unor componenţi organici şi anorganici şi activităţile medii ale

unor enzime din plasmă şi eritrocite sunt redate în tabelul de mai jos.

7

Component (concentraţie) Eritrocite Plasmă Eritrocite Plasmă Azot neproteic (mg/100 ml) 44,0 25,0 1,80Creatinină (mg/100 ml) 1,8 1,1 1,60Azot ureic (mg/100 ml) 14,0 17,0 0,82Acid uric (mg/100 ml) 2,5 4,6 0,54Glucoză (mg/100 ml) 74,0 90,0 0,82Colesterol (mg/100 ml) 139,0 194,0 0,72Potasiu (mEq/l) 100,0 4,4 22,7Sodiu (mEq/l) 16,0 140,0 0,11Clor (mEq/l) 52,0 104,0 0,50Calciu (mEq/l) 0,5 5,0 0,10Magneziu (mEq/l) 5,5 2,2 2,5Fosfor anorganic (mEq/l) 2,5 3,2 0,78Bicarbonat (mEq/l) 19,0 26,0 0,73

Utilizarea plasmei în locul serului pentru dozările diferiţilor constituenţi prezintă

un singur avantaj: hemoliza mai slabă a plasmei faţă de hemoliza produsă în timpul

obţinerii serului (recoltare, coagulare, transport).

Cu excepţia unor enzime (fosfataza acidă, lactatdehidrogenază şi aldolaza) care

se eliberează în timpul coagulării din trombocite, nu se constată diferenţe între

concentraţia plasmatică şi serică a celorlalţi constituenţi.

Recoltarea sângelui capilar

Recoltarea sângelui capilar se face din pulpa degetului, din călcâi (la nou

născuţi) sau din lobul urechii (la pacienţii în stare de şoc), după următoarea tehnică :

- se spală locul cu eter se usucă, se înţeapă suficient de adânc cu un ac steril;

- se lasă sângele să curgă spontan până când se formează o picătură apre-

ciabilă din care se recoltează cu ajutorul unei micropipete cantitatea de sânge necesară;

dacă sângele nu curge spontan în cantitate suficientă, se pot folosi manevre ajutătoare:

frecarea degetului în cazul prelevării din pulpă, a gambei în cazul prelevării din călcâi

sau aplicare de alcool 70° în cazul prelevării din lobul urechii; după prelevare se pune

pe locul înţepăturii un tampon steril.

Recoltarea sângelui venos

Recoltarea sângelui venos se efectuează din venele plicii cotului (la adult şi copii

mari), din fontanelă şi venele jugulare (la sugari şi copii mici).

8

Recoltarea din venele plicii cotului se face după următoarea tehnică:

- se fixează garoul deasupra cotului, se dezinfectează tegumentul în locul

puncţionării cu alcool 70 %;

- se puncţionează vena şi se recoltează sângele prin ac fie direct în eprubetă prin

scurgere liberă, fie prin aspirare în seringă ;

- după recoltare se îndepărtează garoul şi se tamponează locul puncţionat cu un

tampon de vata îmbibat în alcool.

Se folosesc ace şi seringi de unică utilizare s-au ace şi vase speciale pentru

recoltarea sângelui, vasele în care se recoltează trebuie să fie în perfecta stare de

curăţenie şi uscare întrucât urmele de alcool, apă etc. pot produce hemoliza sângelui, iar

diferitele impurităţi pot falsifica rezultatele dozărilor.

Poziţia corpului şi staza venoasă influenţează rezultatele obţinute în cazul

determinării elementelor figurate (eritrocitele, etc.) şi a celor cu greutate moleculară

mare (proteinele totale, fracţiunile proteice individuale, colesterolul din complexul

lipoproteinelor etc.).

De exemplu: valoarea proteinelor totale creşte de la 6,63 g/100 ml în poziţie de

deccubit la 7,65g/100 ml în ortostatism.

În cazul determinării substanţelor cu greutate moleculară mică, poziţia corpului

şi staza venoasă nu afectează valoarea rezultatelor excepţie, făcând lactatul, piruvatul şi

amoniacul.

Condiţiile de conservare a probelor recoltate

Probele de sânge total recoltat pe heparină se păstrează la 4° C, iar dozările

trebuie făcute în mai puţin de 4 ore de la recoltare. Păstrarea prea îndelungată (chiar la

4°C) este contraindicată. Conservarea probelor la temperatura camerei determină

perturbări în compoziţia electroliţilor, enzimelor şi diferiţilor metaboliţi.

În cazul plasmei sau serului, determinările metaboliţilor şi enzimelor trebuie

realizate, de asemenea, în decurs de 4 ore de la recoltare, în condiţiile păstrării la

temperatura camerei. Fără alterări importante, serul sau plasma pot fi păstrate la 4° C

timp de 24 ore. În cazul dozărilor după 24 ore de la recoltare plasma sau serul trebuie

congelat sau liofilizat, formă de conservare preferabilă adăugării de conservanţi

(amestec timol-fluoru0ră: 10 mg fluorură de sodiu + 1 mg timol/ml sânge sau

streptomicină 1 mg/l0 ml sănge).

9

Obţinerea plasmei şi a serului

Analizele biochimice se pot efectua pe sânge total, plasmă sau ser. Plasma

sanguină se obţine prin centrifugarea sângelui proaspăt recoltat pe un anticoagulant

(fluorură de sodiu, amestec de oxalaţi de potasiu şi amoniu, heparină etc.); supernatantul

este constituit din plasma sanguină, iar sedimentul din elementele figurate.

Serul sanguin se obţine prin centrifugarea sau decantarea sângelui recoltat fără

anticoagulant, după ce a fost lăsat să coaguleze la temperatura camerei timp de 30-60

minute.

Serul normal este limpede, de culoare galben pai şi se deosebeşte de plasma

sanguină prin faptul că nu mai conţine fibrinogen. În condiţii fiziologice, aspectul

serului poate fi :

- opalescent datorită particulelor de grăsime provenite dintr-un regim foarte

bogat în lipide, caz în care clarificarea se poate obţine prin deproteinizare sau

extracţia lipidelor cu amestec alcool-eter (3/1);

- galben-brun datorită substanţelor carotenoide provenite din alimentaţie excesiv

vegetariană ;

- de la roz la roşu intens datorită prezenţei hemoglobinei, rezultat al hemolizei

produsă prin greşeli în tehnica de recoltare a sângelui.

În condiţii patologice, serul poate prezenta următoarele modificări de culoare :

- opalescent în nefroza lipoidică;

- galben-brun în ictere de diferite etiologii; în contact cu aerul, bilirubina se

poate transforma în biliverdină, sângele devenind verzui.

Prepararea soluţiilor procentuale molare, normale

O soluţie este un amestec omogen de două sau mai multe substanţe inseparabile

prin mijloace mecanice ca filtrarea sau centrifugarea. La o soluţie se disting două

componente: solventul sau componenta care dizolvă şi solutul(soluţii) sau componenta

(componentele) care se dizolvă. Raportul dintre un solut şi solvent se exprimă prin

concentraţia soluţiei.

Există mai multe moduri de exprimare a concentraţiei unei soluţii:

a) Concentraţia procentuală care la rândul ei poate fi de trei feluri:

- concentraţia procentuală de masă - grame solut în 100 g soluţie, (m/m)

10

De exemplu 100 g soluţie 15% (m/m) H2SO4 conţine 15 g H2SO4 şi

85 g apă.

- concentraţia procentuală volumetrică - ml solut în 100 ml soluţie,

(v/v)

De exemplu 100 ml soluţie 4% (v/v) etanol se prepară completând 4

ml CH3CH2OH până la 100 ml cu apă. În acest caz facem abstracţie de

contracţia de volum, fenomen larg întâlnit în prepararea soluţiilor

procentuale volumetrice. Într-o expresie restrânsă acest fenomen poate

fi scris astfel: v solut + v solvent > v soluţie. Pentru soluţii diluate el poate fi

neglijat.

- concentraţia procentuală mixtă - grame solut în 100 ml soluţie, (m/v)

De exemplu 100 ml soluţie 0,8% (m/v) NaCl (ser fiziologic) conţine

în acest volum 0,8 g NaCl

b) Concentraţia molară (m, M) reprezintă numărul de moli de solut aflaţi într-un

litru de soluţie.

c) Concentraţia molală, mai rar folosită, se defineşte prin numărul de moli de

solut dizolvaţi în 1000 g de solvent.

d) Concentraţia normală reprezintă numărul de echivalenţi-gram de solut dintr-

un litru de soluţie.

Se numeşte echivalent cantitatea de substanţă în greutate care într-o reacţie

chimică dată poate înlocui sau lega 8 părţi în greutate de oxigen sau 1,008 părţi în

greutate de hidrogen. Cantitatea de substanţă în grame, egală numeric cu echivalentul,

se numeşte echivalent-gram.

Pentru calcularea echivalentului-gram se ţine cont de următoarele reguli:

• echivalentul-gram a unui acid este egal cu raportul dintre masa moleculară (M) a

acidului şi numărul de ioni H+ angajaţi în reacţie. De exemplu, într-o reacţie de

neutralizare cu HCl

EgHCl = M HCl

1 = 36,5 g HCl,

iar într-o reacţie în care H3PO4 cedează toţi cei 3 ioni H+ :

EgH PO3 4 =

M H PO3 4

3983

32 7= = , g H3PO4

11

• echivalentul-gram a unei baze este dat de masa moleculară a sa împărţită la numărul

ionilor HO- care participă la reacţie. Dacă toţi ionii HO- participă la reacţie

echivalentul-gram al bazei se poate calcula împărţind masa moleculară a acesteia la

valenţa metalului. De exemplu:

EgNaOH = M NaOH

140= g NaOH E

MgCa OH

Ca OH( )

( )

2

2

2742

37= = = g Ca(OH)2

În sensul mai larg al bazelor generalizate, echivalentul gram se calculează

cunoscând numărul de protoni care sunt legaţi.

• pentru săruri, echivalentul-gram este dat de raportul dintre masa moleculară şi

produsul dintre numărul atomilor de metal din molecula de sare şi valenţa acestui

metal, sau raportul dintre masa moleculară şi produsul dintre numărul radicalilor acid

şi valenţa acestora. De exemplu:

EM

Fe SOFe SO

2 4 3

2 4 3

2 34006

66 7( )( ) ,=

×= = g Fe2(SO4)3

Ca şi în cazul acizilor, bazelor şi sărurilor, echivalentul-gram a unei substanţe

oxidante sau reducătoare se calculează pe baza stoicheometriei redox a reacţiei la care

participă aceasta. În reacţiile de oxido-reducere atomii îşi schimbă valenţa. Echivalentul

se defineşte ca fiind raportul dintre masa moleculară a compusului chimic şi numărul de

electroni cedaţi sau primiţi în reacţie de atomul (atomii) care se oxidează sau se reduc.

De exemplu, în permanganometrie, în mediu acid ionul de mangan din KMnO4,

acceptă 5 electroni: 7+ 2+ 2KMnO4 + 3H2SO4 = 2MnSO4 + K2SO4 + 3H2O + 5[O]

Prin urmare, EM

gKMnOKMnO

4

4

531 6= = , g KMnO4

- variaţia stării de oxidaţie a ionului de mangan din KMnO4 în mediu slab alcalin

sau neutru este 3. 7+ 4+ 2KMnO4 + H2O = 2KOH + MnO2 + 3[O]

EM

gKMnOKMnO

4

4

3158

352 7= = = , g KMnO4

- variaţia stării de oxidaţie a manganului din KMnO4 în mediu puternic alcalin

este 1 +7 +6 2KMnO4 + 2KOH = 2K2MnO4 + H2O + [O]

12

EgKMnO4 = = 158g KMnO4

1. Soluţii procentuale

a) Prepararea unei soluţii de NaCl 10 % (m/m)

Conform definiţiei 100 g soluţie NaCl 10 % trebuie să conţină 10 g NaCl şi 90 g

apă. Se cântăresc 10 g NaCl la balanţa tehnică care se introduc într-un pahar Berzelius şi

se adaugă 90 ml de H2O distilată. Se omogenizează amestecul cu ajutorul unei baghete

de sticlă.

b) Prepararea unei soluţii de CH3COOH 15 % (v/v)

Conform definiţiei 100 ml soluţie CH3COOH 15 % trebuie să conţină 15 ml

CH3COOH glacial şi restul H2O distilată. Se măsoară într-un cilindru gradat 15 ml

CH3COOH glacial şi se completează volumul cu H2O distilată până la 100 ml. Se

omogenizează amestecul cu ajutorul unei baghete de sticlă.

c) Prepararea unei soluţii de Na2CO3 5%(m/v)

100 ml soluţie Na2CO3 5 % trebuie să conţină 5 g Na2CO3 anhidru şi H2O

distilată. Se cântăresc 5 g Na2CO3 anhidru la balanţa tehnică, se introduc într-un cilindru

gradat şi se completează cu H2O distilată până la 100 ml. Se omogenizează amestecul

cu ajutorul unei baghete de sticlă. În cazul în care se lucrează cu Na2CO3 . 10 H2O se

vor lua în considerare masele moleculare pentru a se determina cantitatea în grame a

sării hidratate ce corespunde greutăţii de sare anhidră.

M Na CO anh2 3106

.= M Na CO H O2 3 210 286. =

106 g Na2CO3 anh. ............... 286 g Na2CO3.10 H2O

5 g Na2CO3 anh. ............... x

x = 13,49 g Na2CO3 . 10 H2O

Se vor cântări 13,49 g Na2CO3 . 10 H2O la balanţă şi se va proceda în modul

descris mai sus.

Regula amestecurilor

Dintr-o soluţie mai concentrată se poate prepara o soluţie mai diluată cu ajutorul

regulei amestecurilor. De exemplu, având la dispoziţie o soluţie de NaCl 2 % (m/m) să

se prepare 20 ml soluţie NaCl 0,9 %(m/m). Valorile concentraţiilor celor două soluţii,

MKMnO4 1

13

având concentraţia mai mare, respectiv mai mică decât concentraţia soluţiei de preparat,

se aşează în colţurile de sus ale unui dreptunghi imaginar. Valoarea concentraţiei

soluţiei de preparat, se aşează la intersecţia celor două diagonale. Valorile numerelor ce

reprezintă concentraţiile se scad pe diagonală (numerele mai mici se scad din cele mai

mari). Rezultatele se scriu în colţurile de jos ale dreptunghiului. Aceste numere

reprezintă părţi în greutate din soluţiile respective (grame, kilograme, etc.).

2 0

0,9

0,9 părţi NaCl 2 % 1,1 părţi H2O distilată…2 părţi NaCl 0,9%(m/m)

Deci, se pot amesteca 0,9 părţi NaCl 2 % cu 1,1 părţi H2O distilată pentru a

rezulta 2 părţi soluţie de NaCl 0,9%(m/m). Având în vedere că soluţia NaCl 0,9%

(m/m) este diluată putem tolera conversia părţilor de greutate, în volume. Adică,

20 ml (soluţie) NaCl 0,9 %(m/v) ..........x ............y

x = 9 ml NaCl 2 %

y = 11 ml H2O distilată

Aproximaţia făcută este utilă deoarece este mai uşoară măsurarea volumetrică a

soluţiilor în loc de cea gravimetrică.

2. Soluţii molare

a) Prepararea unei soluţii de H2SO4 0,1 M având la dispoziţie soluţie de H2

SO4 20 % (m/m) cu densitatea 1,139 g/cm3. Conform definiţiei, 1000 ml H2SO4 0,1 M

conţin 0,1 moli H2SO4. Deci:

1000 ml H2SO4 0,1 M .................. 9,8 g H2SO4 pur

100 g sol. H2SO4 20 % .............. 20 g H2SO4 pur

x g sol. H2SO4 20 % …………..9,8 g H2SO4 pur

x = 49 g sol. H2SO4 20 %(m/m)

14

v m= = =

ρ49

113943 02

,, ml sol. H2SO4 20 %(m/m)

În balonul cotat de 1000 ml se introduce o cantitate de H2O distilată, se adaugă

43,02 ml soluţie H2SO4 20 % şi apoi se aduce la cotă cu H2O distilată după răcirea

amestecului la temperatura menţionată pe balon (20ºC). După ce se fixează dopul

balonului cotat se omogenizează soluţia prin agitare energică.

3. Soluţii normale

Prepararea unei soluţii de H2SO4 0,1 N având la dispoziţie soluţie H2SO4 20 %

(m/m) cu densitatea 1,139 g/cm3. Conform definiţiei 1000 ml sol. H2SO4 0,1 N conţin

0,1 EgH SO2 4. Deci:

1000 ml H2SO4 0,1 N .............. 4,9 g H2SO4 pur

100 g sol. H2SO4 20 % ........... 20 g H2SO4 pur

x g sol. H2SO4 20 % .......... 4,9 g H2SO4 pur

x = 24,5 g sol. H2SO4 20 %(m/m)

v m= = =

ρ24 51139

21 51,,

, ml sol. H2SO4 20 %

Noţiunea de pH

Ionizarea apei şi produsul ionic al apei

Deşi apa pură este considerată neelectrolit, ea conduce totuşi curentul electric.

Acest lucru se datorează faptului că o parte din moleculele ei sunt ionizate. Ionizarea

apei poate fi scrisă conform ecuaţiei:

H2O + H2O <---------> H3O+ + OH-

Are loc un transfer de protoni ducând la un echilibru. Constanta de aciditate a apei va fi:

Ka=[ ][ ]

[ ]22

3

OHOHOH −+

La temperatura de 25°C apa se află ionizată în proporţie de o moleculă la 555

milioane de molecule. De aceea se consideră că, prin ionizare, concentraţia apei (de la

numitor) rămâne practic constantă şi deci poate fi înmulţită cu constanta de aciditate.

15

Ka ⋅ [H2O]2 = Pi = [H3O+] [OH-]

Constanta Pi este numită produsul ionic al apei sau constanta de autoprotoliză a

apei. Deoarece la temperatura de 25°C produsul ionic al apei are valoarea de

10-14 moli2/l2, înseamnă că în apa pură la 25°C concentraţia ionilor de hidroniu, egală cu

cea a ionilor de hidroxid, este 10-7moli/l.

[H3O]+ = [OH-] = 10-7moli/l

Scara de pH

În soluţii diluate, acizii tari pot fi consideraţi practic ionizaţi complet. Astfel,

într-o soluţie apoasă 0,1N de HCl (0,1 moli/l) concentraţia ionilor de hidroniu este

practic egală cu concentraţia totală a acidului. Este comod să se exprime concentraţia

ionilor de hidroniu dintr-o soluţie apoasă în formă logaritmică. Se numeşte exponent al

concentraţiei ionilor de hidroniu sau pH logaritmul zecimal cu semn schimbat al

concentraţiei ionilor de hidroniu din soluţie (Sørensen, 1909):

pH = - lg [H3O+]

Punctul neutru: O soluţie apoasă este neutră când concentraţiile ionilor de

hidroniu şi ionilor de hidroxid sunt egale, conform ecuaţiei:

[H3O+] = [OH-] = 10-7moli/l

Punctul neutru, în soluţii apoase, este la pH = 7. O soluţie cu pH < 7 este acidă; o soluţie

cu pH > 7 este bazică.

Determinarea pH-ului cu ajutorul indicatorilor acido-bazici

Indicatori de pH (acido-bazici) sunt substanţe organice colorate (acizi sau baze

slabe) care îşi modifică culoarea în funcţie de pH. Condiţiile pe care trebuie să le

îndeplinească un indicator de pH sunt următoarele: schimbarea de culoare să fie

reversibilă, şi să se producă brusc, deci într-un interval de pH cât mai mic, să fie solubil

în apă, să aibă putere de colorare (culoare intensă), chiar la concentraţii mici;

schimbarea de culoare să se producă la adaosul unor concentraţii mici de acid sau de

bază; să fie stabil în condiţiile obişnuite de lucru.

Dacă indicatorul este un acid slab (AH), în soluţie apoasă are loc reacţia

protolitică:

AH + H2O <─────> H3O+ + A-

16

În cazul albastrului de bromtimol, acidul slab AH este galben iar baza conjugată

A- este albastră. Prin schimbarea acidităţii soluţiei indicatorului îşi schimbă culoarea

fenomen numit viraj, datorită trecerii lui din stare protonată în cea deprotonată sau

invers.

Constanta de aciditate al indicatorului va fi: [A-] Ka = [H+] ──── [AH] În forma logaritmică: [A-] [A-] lgKa = lg[H+] + lg ──── sau - lg[H+] = -lgKa + lg ─── [AH] [AH] Adică:

-lg[H+] = pH şi -lgKa = pKa, deci:

[A-] [albastru] pH = pKa + lg ─── sau pH = pKa + lg

________ [AH] [galben]

Ochiul uman nu poate distinge decât cca. 10% dintr-o culoare în prezenţa unei alte

culori. Dacă [A-] = 10[AH], soluţia va fi albastră şi pH1 = pKa + 1. Dacă 10[A-] = [AH],

soluţia va fi galbenă şi pH2 = pKa - 1. Prin urmare:

pH1 - pH2 = ΔpH = 2

Acest interval de pH se numeşte intervalul de viraj al indicatorului care înseamnă

intervalul de pH în care are loc schimbarea culorii indicatorului (de la albastru la galben

în cazul nostru) odată cu schimbarea pH-ului soluţiei. Fiecare indicator are un interval

de viraj specific. La valori de pH inferioare intervalului de viraj indicatorul îşi păstrează

culoarea, iar peste acest interval la fel. Din culoarea soluţiei unui indicator se poate

aprecia pH-ul soluţiei.

Indicatorii acido-bazici pot fi simpli, micşti şi universali. Indicatorii simpli se

caracterizează printr-un interval de viraj relativ mic (cca 2 unităţi de pH).

Indicatorii simpli se pot folosi pentru tatonarea pH-ului necunoscut. pH-ul

necunoscut se poate estima cu o eroare de un semiinterval de viraj.

Indicatorii universali sunt amestecuri de indicatori simpli ale căror intervale de

viraj sunt parţial suprapuse sau, în cazul cel mai bun, unul în continuarea celuilalt.

Indicatorii universali au intervale de viraj mai mari decât ale celor simpli. În comerţ se

găsesc hârtii indicatoare impregnate cu indicatori universali. Prin compararea culorii

17

obţinute cu o scară de culori etalon, se poate determina pH-ul unei soluţii cu o precizie

de aproximativ + 0,5 unităţi pH.

În tabelul de mai jos apar câteva exemple de indicatori simpli cu caracteristicile

lor:

Denumirea Intervalul de

viraj (ΔpH)

Sub interval

de viraj

În cadrul

intervalului de viraj

Peste

interval

Metil violet 1,0 - 3,2 verde albastru violet

Metil oranj 3,1 - 4,4 roşu portocaliu galben

Roşu metil 4,4 - 6,2 roşu roz galben

Albastru de

bromtimol 6,2 - 7,6 galben verde albastru

Fenolftaleină 8,2 - 10,0 incolor roz roşu-violet

Sistemele tampon: sunt formate dintr-o sare hidrolizabilă şi acidul slab sau baza slabă

rezultată prin hidroliză. O soluţie care îşi schimbă numai puţin pH-ul, la adăugarea unei

cantităţi mici de acid sau bază tare se numeşte soluţie tampon. O caracteristică a unei

soluţii tampon este capacitatea de tamponare.

Capacitatea de tamponare a unei soluţii este capacitatea ei de a se opune variaţiei de pH

la adaosul de acid tare sau bază tare şi se exprimă prin numărul de echivalenţi de acid

sau bază care schimbă pH-ul unui litru de soluţie cu o unitate. Ea se micşorează prin

diluare.

Demonstrarea capacităţii de tamponare:

Reactivi: Indicator Bogen (amestec de roşu metil şi albastru de bromtimol,

cu intervalul de viraj între pH 4,4-7,6)

Sol. tampon fosfat pH = 7

Sol.de HCl N/10

Sol. de NaOH N/10

18

Modul de lucru:

În două pahare Berzelius (1, 1a) se pune apă distilată şi se adaugă câte 2 ml de

indicator. Dacă apa este neutră culoarea soluţiilor este verde. În alte două pahare (2, 2a)

de aceiaşi mărime se prepară soluţie tampon cu pH = 7, la care se adaugă câte 2 ml

soluţie de indicator obţinându-se tot culoarea verde. Se adaugă câte 1 ml HCl N/10 în

paharele 1şi 2 şi se amestecă cu bagheta: se observă o puternică variaţie a culorii

soluţiei din paharul 1 ceea ce indică o mare variaţie a pH-ului. În paharele 1a şi 2a se

adaugă câte 1 ml NaOH N/10, se amestecă cu bagheta şi se observă la fel o mare

variaţie a culorii soluţiei din paharul 1a. În paharele 2 şi 2a culoarea se schimbă foarte

puţin, deoarece pH-ul s-a modificat foarte puţin.

În două pahare Berzelius (1, 1a) se prepară soluţie tampon cu pH = 7 şi se adaugă

câte 2 ml indicator. În alte 2 pahare (2, 2a) se prepară soluţie tampon cu acelaşi pH, însă

de zece ori mai diluat, adăugând câte 2 ml indicator şi în aceste pahare. Se pipetează

câte 1 ml HCl N/10 în paharele 1 şi 2, şi câte 1 ml NaOH N/10 în paharele 1a şi 2a. Se

amestecă cu bagheta. În paharele 2 şi 2a se observă schimbarea mai pronunţată a culorii

indicatorului deoarece, soluţiile tampon fiind mai diluate, li s-a micşorat capacitatea de

tamponare.

Determinarea colorimetrică a pH-ului prin metoda cu soluţii tampon

Principiu:

Se adaugă soluţiei de cercetat un anumit volum dintr-un indicator potrivit şi se

compară culoarea pe care o capătă soluţia, cu culoarea produsă de aceiaşi cantitate de

indicator adăugată unei serii de soluţii tampon cu pH-uri cunoscute. pH-ul soluţiei de

cercetat va fi egal cu pH-ul soluţiei de referinţă cu culoarea identică.

Reactivi: - Sol. de CH3COOH N/10

- Sol. de CH3COONa N/10

- Sol. de KH2PO4 M/15

- Sol. de Na2HPO4 M/15

- Indicator Bogen (amestec de roşu metil şi albastru de bromtimol)

Modul de lucru:

Se prepară în două serii de eprubete soluţii tampon cu pH diferit conform

tabelelor:

19

Tampon acetat (Walpole)

CH3COOH N/10 ml 8,2 6,3 4,0 2,1 1,0

CH3COONa N/10 ml 1,8 3,7 6,0 7,9 9,0

pH 4 4,4 4,8 5,2 5,6

Tampon fosfat (Sørensen) KH2PO4 M/15 ml 8,8 7,3 5,1 2,8 1,3 0,5

Na2HPO4 M/15 ml 1,2 2,7 4,9 7,2 8,7 9,5

pH 6 6,4 6,8 7,2 7,6 8,0

În fiecare soluţie se adaugă câte 0,2 ml indicator Bogen. Eprubetele se agită

energic pentru omogenizarea culorii. Culoarea soluţiilor va fi diferită în fiecare eprubetă

în funcţie de pH. Se adaugă 0,2 ml indicator la 10 ml din soluţia de cercetat şi se

omogenizează. Se compară culoarea obţinută cu culorile seriei. Dacă culoarea soluţiei

cercetate este identică cu culoarea uneia din soluţiile tampon (acetat sau fosfat), pH-ul

lor este identic. Dacă culoarea se încadrează între culorile a două soluţii tampon

consecutive se consideră că pH-ul soluţiei cercetate este media aritmetică a valorilor de

pH a celor două soluţii tampon.

Volumetrie

Principiile analizei volumetrice

Analiza volumetrică se bazează pe măsurarea de volume, operaţie ce se execută

comod cu vase calibrate (cilindrii gradaţi, baloane cotate, pipete, biurete). Principiul

analizelor volumetrice constă în măsurarea volumului de reactiv necesar producerii

reacţiei cantitative cu substanţa de determinat ce se află în soluţia de analizat. Operaţia

de adaos a soluţiei de reactiv se face în pică- turi, din biuretă şi se numeşte titrare.

Pot fi urmărite volumetric numai acele reacţii care au loc univoc, (fără reacţii

secundare şi cantitativ) şi cu viteză foarte mare. Pentru marcarea sfârşitului reacţiei,

respectiv a punctului de echivalenţă, se folosesc fenomene ce pot fi puse în evidenţă

prin observare vizuală (schimbări de culoare, apariţii de precipitate) sau instrumentală

(potenţiometru, conductometru, spectrofotometru). Pentru observarea vizuală a

20

sfârşitului titrării în modul cel mai obişnuit se folosesc indicatorii, substanţe care îşi

schimbă culoarea în punctul de echivalenţă.

La punctul de echivalenţă reactanţii sunt prezenţi în cantităţi echivalente, deci în

amestecul de reactivi nu se află în exces nici substanţa de dozat şi nici reactivul titrat.

Volumul de reactiv adăugat pentru atingerea punctului de echivalenţă se numeşte volum

de echivalenţă.

Spre a putea stabili concentraţia substanţei de analizat este necesar ca soluţia de

reactiv folosită la titrare să fie de concentraţie cunoscută, să fie suficient de stabilă şi să

se prepare relativ uşor.

Metodele volumetrice se caracterizează prin rapiditate, în majoritatea cazurilor o

determinare volumetrică se face în câteva minute.

Clasificarea metodelor volumetrice

Metodele volumetrice pot fi: a) directe

b) indirecte - prin retitrare

- prin intermediul unui substituent

În cazul metodelor de titrare directă, reacţia dintre componentul de determinat şi

reactivul de titrare este de echivalent la echivalent. Prin retitrare se titrează excesul unui

reactant adăugat soluţie de analizat (vezi dozarea NH3). În cazul folosirii unui

substituent, produsul de reacţie titrabil rezultat prin substituţie se formează în cantitate

echivalentă cu componentul de determinat (ex. complexometria).

În ceea ce priveşte natura reacţiilor care stau la baza metodelor volumetrice,

clasificarea acestora este:

a.) metode de titrare acido-bazică sau neutralizare

b.) metode de titrare redox (permanganometria, iodometria)

c.) metode de titrare prin formare de complecşi (complexometria)

d.) metode de titrare prin formare de precipitat (ex. argentometria)

Calcule în analiza volumetrică

Raportul de concentraţie între soluţia reală (aproximativ normală) şi cea

teoretică (exact normală) se numeşte factorul soluţiei.

Factorul exprimă numărul de ml de soluţie exact normală care echivalează cu 1

ml din soluţia preparată:

21

FVV

t

r

= unde: Vt - volumul teoretic (a soluţiei exact normale)

Vr - volumul real ( a soluţiei preparate)

Factorul soluţiilor exact normale este 1,000. Ele folosesc ca soluţii etalon şi cu

ajutorul lor se determină factorul soluţiilor aproximativ normale. Soluţiile mai diluate

au un factor subunitar, soluţiile mai concentrate au un factor supraunitar. Practic

valoarea factorului trebuie să fie între 0,8000-1,2000.

Pe lângă factor concentraţia exactă a soluţiilor se poate exprima şi cu ajutorul

titrului. Titrul unei soluţii reprezintă cantitatea de substanţă exprimată în grame din 1 ml

soluţie. De exemplu: pentru o soluţie de NaOH care conţine 4,653 g pe litru titrul are

valoarea de 0,004653.

Tehnica titrării

Pregătirea instrumentelor pentru titrare

Biureta se spală cu apă distilată şi apoi se clăteşte cu soluţia de titrare de două

ori. După utilizarea mai îndelungată a biuretei este necesară degresarea tubului gradat al

acesteia. Aceasta se poate realiza cu amestec cromic sau cu soluţie de detergent.

Se umple biureta cu soluţia de titrare peste gradaţia 0, apoi se scoate pâlnia care

a servit pentru introducerea lichidului în biuretă şi se potriveşte la zero nivelul lichidului

lăsând să cadă încet lichidul în exces într-un vas colector. Dacă robinetul se mişcă greu

sau biureta picură, se scoate robinetul, se şterge de umezeală şi se unge cu un strat

subţire şi uniform de vaselină. Partea inferioară a manşonului robinetului se usucă cu

ajutorul hârtiei de filtru şi apoi se introduce robinetul uns la locul lui. Bulele de aer

prezente în biuretă pot să cauzeze erori la titrare ceea ce impune îndepărtarea lor.

Modul de lucru:

La începutul titrării dăm drumul soluţiei din biuretă în picături repezi agitând în

continuu conţinutul flaconului Erlenmayer, în care se găsesc, exact măsurat, volumul

soluţiei de titrat plus indicatorul. De obicei se observă o schimbare temporară de culoare

a indicatorului în locul unde cad picături de reactiv în soluţie. Spre sfârşitul titrării

concentraţia substanţei de dozat scade şi la contactul picăturilor de reactiv cu soluţia de

dozat schimbarea temporară a culorii soluţiei este mai persistentă. În această fază viteza

de picurare se reduce treptat în aşa fel încât după adăugarea ultimei picături necesare, să

fie posibilă închiderea rapidă a robinetului. Picătura aderată pe vârful biuretei se

22

introduce în vasul de titrare prin atingerea de peretele interior al acestuia şi se amestecă

cu lichidul de titrat aplecând vasul în direcţia lichidului ce se prelinge pe peretele

vasului. Titrarea se consideră terminată când ultima picătură produce o schimbare slabă

dar sesizabilă şi stabilă a culorii lichidului.

Erorile determinărilor volumetrice

În analizele chimice pot interveni două tipuri de erori:

- erori sistematice

- erori întâmplătoare

Erorile sistematice au valori constante şi sunt întotdeauna pozitive sau negative.

Erorile întâmplătoare au valori şi semne diferite. Ele se pot elimina prin

efectuarea unui mare număr de determinări şi prin calcularea mediei aritmetice a

volumelor de echivalenţă cu valori apropiate. Volumele de echivalenţă ale căror valori

sunt exagerat de îndepărtate se exclud

Practic se efectuează titrarea a trei probe paralele efectuându-se media aritmetică

între volumele de echivalenţă identice sau cele cu valoare foarte apropiată. Se acceptă o

diferenţă între volumele de echivalenţă mai mică sau egală cu 0,2 ml. Să luăm un

exemplu. Volumele de echivalenţă obţinute la titrarea a trei probe paralele sunt: V1 = 7

ml; V2 = 7,1 ml; V3 = 7,4 ml. Diferenţele V3 - V1 şi V3 - V2 sunt mai mari de 0,2 ml,

deci V3 se exclude. Volumul mediu ( v−

) luat în calcul va fi în acest caz media aritmetică

dintre V1 şi V2 şi are valoarea de 7,05 ml. Dacă toate probele au valori foarte diferite

rezultatele nu sunt interpretabile iar titrările trebuie să fie repetate.

Surse de erori

Eroarea de paralaxă ( eroarea de citire) intervine la citirea incorectă a nivelului

soluţiei din vasul de măsurat. Volumul de soluţie într-un vas de măsurat este egal cu

volumul nominal al vasului în cazul în care punctul inferior al meniscului lichidului este

tangent la cota de pe vas. Pentru citirea corectă a poziţiei meniscului ochiul

observatorului trebuie să fie pe orizontală într-un plan tangent la menisc iar vasul

trebuie să aibă o poziţie verticală.

23

Vorbim despre eroarea de paralaxă în minus când ochiul observatorului este

deasupra acestei orizontale, respectiv eroare de paralaxă în plus, când ochiul se găseşte

sub nivelul orizontului. Pentru evitarea erorii de paralaxă se folosesc biuretele

Schellbach care sunt prevăzute cu o dungă albastră pe un fond alb. La nivelul

meniscului dunga albastră se întrerupe formând două vârfuri ascuţite care se ating într-

un punct. Se citeşte poziţia acestui punct de contact.

Eroarea de scurgere se datorează faptului că soluţiile apoase umezesc sticla şi, la

golirea rapidă o parte din lichid aderă pe suprafaţa biuretei, deci soluţia nu se scurge

cantitativ în vasul de titrare. Pentru evitarea acestei erori, viteza de scurgere pe

parcursul titrării trebuie să fie mică.

Eroarea de picurare

În analiza volumetrică, soluţiei de analizat i se adaugă soluţia titrată până când

ultima picătură produce o schimbare sesizabilă şi stabilă a culorii soluţiei. În cele mai

multe cazuri acest efect se datorează unui exces a soluţiei cu care se titrează. Pentru

reducerea acestui exces, ciocul biuretei trebuie să fie cât mai subţire pentru ca picăturile

de titrant să fie cât mai mici.

Eroarea de temperatură

Vasele de măsurat volume, biurete, baloane cotate, pipete sunt etalonate pentru o

anumită temperatură (200C). Diferenţa dintre temperatura de etalonare a vasului şi

temperatura reală a soluţiei de măsurat determină o diferenţă de volum, care poartă

denumirea de eroare de temperatură. Se poate evita această eroare prin respectarea

temperaturii de etalonare. Diferenţele mici de 1-20C sunt, în majoritatea cazurilor,

neglijabile.

24

Acidimetria volumetrică

Titrări acido-bazice

În titrările de neutralizare, stabilirea volumului de echivalenţă sau de

neutralizare se face cu ajutorul indicatorilor acido-bazici care, cum am arătat sunt în

formă neionizată acizi slabi (AH) sau baze slabe (B). În tabelul de mai jos sunt

exemplificaţi mai mulţi indicatori acido-bazici cu precizarea naturii lor de acid sau bază.

Sunt incluşi şi câţiva din indicatorii utilizaţi la determinarea pH-ului (vezi mai sus).

Evident, tăria acestor acizi creşte către cel al cărui interval de pH este cel mai mult sub

valoarea 7.

Pentru prepararea soluţiilor de indicatori se folosesc ca solvenţi apa, dar mai ales

alcool apos, cei mai mulţi în concentraţie de 0,1 %.

Indicatorul AH = acid; B = bază Interval de pH Culorile limită Acidă Alcalină

Albastru de timol (AH) 1,2 - 2,8 roşie galbenă Albastru de bromfenol (AH) 3,0 - 4,6 galbenă vilet-albastră Metiloranj (B) 3,1 - 4,4 roşie oranj Verde de bromcrezol (AH) 4,0 - 5,6 galbenă albastră Roşu de metil (AH) 4,4 - 6,2 roşie galbenă Purpură de bromcrezol (AH) 5,2 - 6,8 galbenă purpurie Albastru de bromtimol (AH) 6,2 - 7,6 galbenă albastră Roşu neutral (B) 6,8 - 8,0 roşie galbenă Roşu de crezol (AH) 7,2 - 8,8 galben roşie Fenolftaleină (AH) 8,0 - 10,0 incoloră roşie Albastru de timol (AH) 8,0 - 9,6 galbenă albastră Timolftaleină (AH) 9,4 - 10,6 incoloră albastră Galben de alizarină (AH) 10,0 - 12,0 galben liliachie

Titrarea unui acid tare cu o bază tare

Principiu: În cazul titrării unui acid tare, de exemplu HCl, cu o bază tare, de

exemplu NaOH, la echivalenţă se formează o sare nehidrolizabilă, în exemplul dat NaCl

şi mediul devine perfect neutru. La neutralitate avem:

[ ] [ ]H OH+ − −= = 10 7 ioni g/l pHechiv. = 7

[ ]H + pe parcursul titrării este egală cu concentraţia acidului rămas netitrat.

După echivalenţă [ ]OH − este egală cu concentraţia bazei introdusă în exces. Pentru

alegerea indicatorului adecvat, este necesară cunoaşterea pH-ului la punctul de

25

echivalenţă. La un exces (eroare) de 1% reactiv pH-ul soluţiei variază brusc. La titrarea

unui acid tare cu o bază tare intervalul de eroare corespunde aproximativ intervalului de

pH 4-10, ceea ce înseamnă că se poate folosi orice indicator care are un interval de viraj

între pH 4-10. În figura de mai jos apare curba de titrare a unui acid tare cu o bază tare

cu precizarea a doi indicatori ce permit punerea în evidenţă a punctului de echivalenţă

(P.E.) al reacţiei

Determinarea factorului unei soluţii de HCl 0,1N cu ajutorul unei soluţii

etalon

Prepararea unei soluţii de HCl aproximativ 0,1 N

Ne propunem să preparăm 1 litru sol. HCl aproximativ 0,1 N având la dispoziţie

o soluţie HCl 15% (g/100 g) cu ρ = 1,075 g/cm3.

Din definiţia concentraţiei normale:

1000 ml HCl 0,1 N conţin 0,1 Eq HCl = 3,65 g HCl

100 g HCl 15 % .............15 g HCl

x g HCl 15 %............. 3,65 g HCl

x = 24,33 g HCl 15 %

ρ = mV

V = 24 331 075

,,

= 22,6 ml HCl 15 %

Într-un balon cotat de 1000 ml se introduce o cantitate mică de H2O bidistilată,

se adaugă 22,6 ml HCl 15 % şi se completează cu H2O bidistilată până la cotă.

Omogenizarea soluţiei se realizează prin agitarea energică.

Stabilirea factorului soluţiei de HCl 0,1 N preparată

Pentru stabilirea factorului soluţiilor se folosesc soluţiile etalon, stabile din punct

de vedere chimic şi cu factor cunoscut (eventual F = 1,000). O astfel de soluţie etalon se

26

poate prepara prin cântărirea şi dizolvarea în apă a KHCO3, necesar în titrarea de mai

jos.

Pentru determinarea factorului soluţiei de HCl 0,1 N preparată anterior se

măsoară exact cu ajutorul unei pipete câte 10 ml sol. KHCO3 în 3 pahare Erlenmeyer.

Se adaugă câte 3 picături de metiloranj şi se titrează, cele trei probe paralele, până la

virajul indicatorului de la galben la portocaliu. CO2 format în urma reacţiei se

îndepărtează prin fierberea probelor 2-3 minute. În cazul în care după răcirea probelor

culoarea a revenit la galben, se continuă titrarea până la portocaliu.

Din cele 3 volume de echivalenţă se face media aritmetică şi se obţine v−

HCl . La

baza calcului stă relaţia:

v−

HCl . FHCl = VKHCO3. FKHCO3

10 x FKHCO3

de unde FHCl = ———— v

HCl

Dozarea unei soluţii de NaOH cu soluţia de HCl 0,1 N cu factor cunoscut

În trei flacoane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml sol. NaOH, se adaugă câte 3

picături de metiloranj şi se titrează cu soluţie titrată de HCl 0,1 N până la virajul

indicatorului de la galben la portocaliu. Concentraţia procentuală mixtă a soluţiei de

NaOH se exprimă în g/100 ml şi se calculează în felul următor:

- se face media aritmetică a celor trei volume de echivalenţă şi se obţine v−

HCl

- conform definiţiei concentraţiei normale, 1000 ml HCl 1 N conţin 1 EgHCl

- din ecuaţia reacţiei chimice NaOH + HCl = NaCl + H2O rezultă că 1 EqHCl

reacţionează cu 1 EqNaOH deci:

1000 ml HCl 1 N ............. 40 g NaOH

1000 ml HCl 0,1 N............ 4 g NaOH

v−

HCl × FHCl ................... x g NaOH

x = 4

1000× ×

v FHCl - reprezintă g NaOH conţinute în volumul sol. de

NaOH titrate (10 ml).

CNaOH%(m/v) = 10 • x, reprezintă concentraţia procentuală mixtă a soluţiei de

NaOH.

27

Dozarea amoniacului prin diferenţă

Principiu:

Metoda directă de dozare a amoniacului cu o soluţie titrată de HCl 0,1 N, în

prezenţă de metiloranj, este în general evitată datorită pierderilor de amoniac prin

desorbţie. Este preferată metoda dozării amoniacului prin diferenţă. Soluţia de amoniac

se tratează cu un volum de soluţie titrată de HCl, ce conţine un exces de acid şi se

determină excesul de HCl prin titrare cu o soluţie titrată de NaOH în prezenţă de

metiloranj. Reacţiile sunt următoarele:

NH3 + HCl = NH4Cl; NaOH + HCl = NaCl + H2O.

Reactivi: - Soluţie de HCl 0,1N cu factor cunoscut

- Metilorange, soluţie alcoolică 0,1%

Modul de lucru:

În trei flacoane Erlenmeyer se introduc câte 10 ml HCl 0,1 N, 5 ml soluţie de

NH3, 1-2 picături de metiloranj şi se titrează excesul de acid cu o soluţie titrată de

NaOH 0,1 N până la virajul indicatorului de la roşu la portocaliu.

Calcul:

1000ml HCl 0,1 N ................……. 1,7 g NH3

vHCl × FHCl - v−

NaOH × FNaOH ...........…x

x = g NH3/ 5 ml

vHCl × FHCl - v−

NaOH × FNaOH = volumul teoretic de HCl, obţinut pe cale

titrimetrică, ce conţine cantitatea de HCl care a reacţionat cu NH3 din

probă; vHCl = 10 ml; v−

NaOH 0,1 N = media aritmetică a volumelor de

echivalenţă obţinute la titrarea celor 3 probe paralele.

Concentraţia soluţiei de amoniac se exprimă în g/100 ml, adică C NH3 %(m/v) = 20 • x

Titrarea unui acid slab cu o bază tare

Principiu:

La titrarea unui acid slab cu o bază tare se formează o sare hidrolizabilă. De

exemplu titrarea acidului lactic cu o soluţie titrată de NaOH implică următoarele

procese chimice:

28

CH3 CH

OH

COOH + Na+ + HO- CH3 CH

OH

COO- + Na+ + H2O

H2O H+ + OH-

H+ + CH3 - CH - COO- CH3 - CH - COOH

OH OH

Din ecuaţii reiese că anionii acidului slab, rezultaţi prin ionizarea completă a

sării, se combină cu H+ rezultaţi în urma procesului de disociere a H2O . Astfel [ ]H +

descreşte, iar [ ]OH − > [ ]H + ceea ce determină reacţia alcalină a soluţiei. La punctul

de echivalenţă soluţia are un pH > 7. În general, soluţiile apoase ale sărurilor acizilor

slabi cu baze tari sunt alcaline. Se alege acel indicator al cărui interval de viraj conţine

valoarea pH-ului soluţiei sării hidrolizabile. În cazul de faţă este folosit indicatorul

fenolftaleină, al cărui interval de viraj este cuprins între 8-10 unităţi de pH. Aşa cum se

vede în figura de mai jos, în care acidul slab este CH3COOH, folosirea unui indicator cu

interval de viraj în mediul acid nu permite punerea în evidenţă cu precizie punctul de

echivalenţă al reacţiei

Aplicaţie: Dozarea acidului lactic cu o soluţie titrată de NaOH

Reactivi: - Soluţie NaOH 0,1N cu factorul cunoscut

- Soluţie alcoolică de fenolftaleină 0,1%

Modul de lucru:

În trei flacoane Erlenmayer se măsoară câte 10 ml soluţie acid lactic, se adaugă

3-4 picături de fenolftaleină şi se titrează cele trei probe cu o soluţie titrată de NaOH 0,1

N, până la virajul indicatorului de la incolor la roz slab persistent cel puţin 20 de

secunde .

29

Concentraţia acidului lactic se exprimă în procente mixte şi se calculează în felul

următor:

1000 ml NaOH 0,1 N ............... 9 g acid lactic

v−

× FNaOH ............................ x

x = g/10 ml c% (m/v) = 10 • x

Titrarea unei baze slabe cu un acid tare

Principiu:

La titrarea unei baze slabe cu un acid tare se formează o sare hidrolizabilă, pH-ul

în punctul de echivalenţă fiind mai mic decât 7. În general soluţiile apoase ale sărurilor

acizilor tari cu baze slabe sunt acide. De exemplu titrarea unei soluţii de NH3 cu o

soluţie titrată de HCl implică următoarele procese chimice:

NH3 + H2O NH4OH

NH4OH + H+ + Cl- NH4 + Cl- + H2O

H2O H+ + OH-

NH4 + OH- NH4OH

+

+

Ionii OH- rezultaţi în urma procesului de disociere a H2O au tendinţa de a

reacţiona cu o parte din ionii de amoniu formaţi. Astfel [ ]OH − descreşte, iar [ ]H + >

[ ]HO− ceea ce determină reacţia acidă a soluţiei. La punctul de echivalenţă soluţia are

un pH < 7. Prin urmare se alege acel indicator al cărui interval de viraj conţine pH-ul

soluţiei sării rezultate în urma titrării (NH4Cl). În acest caz se poate folosi metiloranjul

(figura de mai jos).

30

Titrările acizilor slabi cu baze slabe (şi invers), nu produc variaţii bruşte şi mari

a pH-ului în jurul punctului de echivalenţă. De aceea ele sunt rar utilizate în titrimetria

acido-bazică.

Oxidimetria volumetrică

Date generale

În oxidimetrie toate reacţiile chimice au loc cu transfer de electroni, ele

denumindu-se oxido-reduceri sau reacţii redox.

După reactivii utilizaţi oxidimetria se poate împărţi în:

a) Permanganometria, care foloseşte drept componentă oxidantă KMnO4.

b) Iodometrie, în care ca reactiv se foloseşte I2 sau I-, ca oxidant respectiv reducător,

după caz.

c) Alte procedee [bromatometrie(KBrO3), cerimetrie (Ce(SO4)2), bicromatometrie

(K2Cr2O7), iodatometrie (KIO3)] utilizează compuşii precizaţi între paranteze ca

oxidanţi.

Reacţiile redox pot fi utilizate în vederea unor dozări, dacă ele întrunesc anumite

condiţii:

- să fie totale în sensul dorit ( adică să fie cantitative),

- să decurgă cu viteză mare, pentru ca deteminările să se efectueze într-un timp scurt,

- să se poată observa uşor punctul de echivalenţă, care arată sfârşitul reacţiei chimice.

Grupa metodelor volumetrice bazate pe reacţii redox cuprinde procedee de

determinare cantitativă, care se realizează prin titrarea substanţelor reducătoare cu

oxidanţi şi a substanţelor oxidante cu reducători.

Majoritatea reacţiilor redox sunt reversibile, al căror echilibru dinamic poate fi

deplasat într-un sens sau altul în funcţie de condiţiile de lucru.

Ca în oricare altă metodă volumetrică şi în oxidimetrie (titrimetria redox) se

urmăreşte atingerea punctului de echivalenţă care se poate indica vizual sau

instrumental. De exemplu, în permanganometrie, permanganatul de potasiu este o

substanţă colorată ce poate să funcţioneze ca indicator, fiindcă un mic exces de reactiv

produce o schimbare de culoare uşor sesizabilă. În cazul titrărilor iodometrice, la

punctul de echivalenţă poate să apară un exces de iod molecular sau să dispară acest

exces, ceea ce se poate indica cu ajutorul amidonului ştiut fiind că amidonul formează

cu I2 un complex violet intens colorat.

31

Permanganometrie

Principii:

Permanganatul de potasiu, KMnO4, este unul dintre oxidanţii cei mai folosiţi,

datorită potenţialului de oxidare mare al sistemului MnO4-/Mn2+. Oxidarea se poate

efectua atât în mediu acid cât şi în mediu neutru sau alcalin. Puterea oxidantă a

permanganatului scade mult cu creşterea pH-lui soluţiei. Reacţiile care se petrec în

diferite medii sunt cele arătate mai înainte la calcularea echivalenţilor-gram ai KMnO4.

Rescrierea simplificată a lor pune în evidenţă numărul de electroni acceptaţi de

o moleculă de oxidant:

- în mediu acid KMnO4 acceptă 5 electroni/moleculă:

MnO4- + 8H+ + 5e- <=> Mn 2+ + 4H2O;

- în mediu neutru sau aproape neutru se transferă 3 electroni:

MnO4-+ 4H+ + 3e- <=> MnO2 + 2H2O

- în mediu alcalin, acceptă un singur electron:

MnO4- + e- <=> MnO4 2-

Permanganatul de potasiu cristalin este de culoare violetă, aproape neagră.

Lumina, creşterea temperaturii, a diluării, a acidităţii sau a alcalinităţii soluţiei, prezenţa

corpilor străini mai ales în pulbere, accelerează descompunerea permanganatului. De

aceea soluţiile de KMnO4 se păstrează în soluţie neutră, în sticle brune (la întuneric) şi

la temperatura obişnuită.

Stabilirea factorului soluţiei de KMnO4 0,1N

Având în vedere instabilitatea KMnO4 este necesară determinarea periodică a

factorului soluţiei de KMnO4 folosindu-se ca substanţă etalon acidul oxalic.

Reactivi: - Soluţie (COOH)2 0,1N cu factor cunoscut

- Soluţie H2SO4 20%

Modul de lucru:

În trei baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml soluţie de acid oxalic 0,1N cu

factor cunoscut, se adaugă câte 10 ml H2SO4 20%, se încălzeşte la 70-80°C şi se titrează

cu KMnO4 0,1N până la roz slab, persistent cel puţin 10 secunde.

Factorul soluţiei de KmnO4 se calculează după formula:

VKMnO4 ⋅ F KMnO4 = V acid oxalic ⋅ F acid oxalic unde VKMnO4 este media aritmetică a

volumelor de echivalenţă a celor trei probe paralele.

32

Vacid oxalic • Facid oxalic

FKMnO4 = ——————— VKMnO4

Determinări permanganometrice în mediu acid

Permanganatul de potasiu în mediu puternic acid (H2SO4 20%), la temperatura

de 70-80 °C, se reduce la sarea manganoasă (MnSO4) punând în libertate oxigen,

conform reacţiei cunoscute

2KMnO4 + 3H2SO4 = K2SO4 + 2MnSO4 +3H2O +5[O]

Reacţia decurge autocatalitic deoarece ionii manganoşi (Mn2+ şi Mn3+) formaţi

în primul moment catalizează reducerea în continuare a permanganatului de potasiu.

Decolorarea soluţiei se produce datorită faptului că MnSO4 format este incolor în soluţii

diluate.

Soluţia acidă de permanganat serveşte în oxidimetrie, pentru dozarea

volumetrică a acidului oxalic, a apei oxigenate şi a altor substanţe (acidului azotos, etc).

Sfârşitul titrării se recunoaşte prin dispariţia sau apariţia culorii violete determinate în

soluţie de ionul MnO4-.

Dozarea acidului oxalic (micrometodă)

Principiu:

Reacţia titrimetrică este următoarea:

5(COOH)2 +2KMnO4 +3 H2SO4 = K2SO4 +2MnSO4 +10CO2 +8H2O

Reactivi: - Soluţie H2SO4 20%

- Soluţie KMnO4 0,01 N cu factor, FKMnO4, cunoscut Modul de lucru:

În trei flacoane Erlenmeyer se măsoară câte 1 ml soluţie de acid oxalic de dozat.

Se adaugă câte 1 ml H2SO4, 2 ml apă bidistilată şi se încălzeşte până la 70-80°C. Se

titrează cu KMnO4 0,01N până când soluţia rămâne colorată în roz slab cel puţin 10

secunde.

Calcul

1000 ml KMnO4 0,01N reacţionează cu 0,01 Eq-gram de acid oxalic= 0,45 g acid oxalic

V KMnO4 F KMnO4 ............................................................ x g acid oxalic

x g (COOH)2 ………...........................…………………… 1 ml soluţie

c%(m/v) = 100•x

33

Această reacţie nu se produce direct: o picătură de soluţie de permanganat nu se

decolorează imediat când este adăugată într-o soluţie conţinând exces de acid oxalic şi

sulfuric. Culoarea roz a soluţiei (datorată prezenţei ionului MnO4-) persistă, dispărând

numai după un anumit interval de timp deoarece reacţia redox corespunzătoare are o

cinetică lentă până la formarea catalizatorului (Mn3+). Apoi ionii Mn3+ se reduc la Mn+2,

care este un proces instantaneu. În ultima etapă manganul (II) format reacţionează rapid

cu ionul MnO4- (VII), formându-se Mn (III) foarte reactiv care oxidează acidul oxalic,

finalul titrării fiind determinat de epuizarea (COOH)2 din probă şi apariţia unui mic

exces de ioni MnO4- care colorează persistent soluţia de titrat. Secvenţa de reacţii ale

procesului autocatalitic este următoarea:

(1) Mn(VII) + (COOH)2 -------> Mn(III) +CO2 (lent)

(2) Mn(III) + (COOH)2 -------> Mn(II) + CO2 (instantaneu)

(3) Mn(II) + Mn(VII) ---------> Mn(III) (rapid).

În stadiul iniţial viteza reacţiei este controlată de etapa lentă (1). De îndată ce

concentraţia ionilor Mn(II) devine apreciabilă, reducerea permanganatului poate să se

desfăşoare rapid pe calea procesului (3). Spre finalul titrării culoarea MnO4- dispare tot

mai greu datorită scăderii concentraţiei acidului oxalic. Reacţia este accelerată în final,

ca şi la început, prin încălzire la 70-80ºC .

Dozarea apei oxigenate (macrometodă)

Principiu:

Dozarea se poate face tot prin titrarea directă cu permanganat în soluţie de acid

sulfuric. Apa oxigenată (peroxid de hidrogen) funcţionează atât ca oxidant, după reacţia: H2O2+2H++2e- → 2H2O; cât şi ca reducător, după reacţia: H2O2 ⇔ 2H++O2;

În soluţie acidă permanganatul de potasiu este redus după reacţia:

5H2O2 +2KMnO4 +3 H2SO4 = K2SO4 +2MnSO4 +8H2O +5O2

Modul de lucru:

În trei flacoane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml soluţie de apă oxigenată de

dozat. Se adaugă câte 10 ml H2SO4 20%. Se titrează cu soluţie de KMnO4 0,1N cu

factor, FKMnO4, cunoscut până când soluţia rămâne colorată în roz slab.

34

Calcul:

1000 ml KMnO4 0,1N sunt echivalenţi cu ...................1,7 g apă oxigenată

V KMnO4 F KMnO4 ............................................................ x g apă oxigenată

x g H2O2………………………………………………… 10 ml soluţie

c% (m/v) = 10•x

Iodometrie

Principiu:

Metoda se bazează pe sistemul redox:

I2 + 2e- <=> 2I- al cărui potenţial redox standard biochimic este E0′ = 0,62 V (pH = 7)

În soluţii de iodură conţinând ionul I3-, reacţia redox şi valoarea potenţialului redox

standard biochimic sunt:

I3- + 2e- <=> 3 I- E0′ = 0,54 V (pH=7)

În aceste reacţii, iodul molecular este oxidant, iar substanţele care au un

potenţial redox mai mic decât + 0,54V vor fi oxidate de către iod şi se vor putea

determina uşor. Un exemplu este reacţia cu tiosulfat:

I2 + 2S2O32- → 2I- +S4O6

2- (ioni tetrationat)

Substanţele care au potenţial redox mai mare (substanţele oxidante), cum este

ionul Fe3+, pun în libertate iodul molecular conform reacţiei:

2Fe3+ + 2I- → 2Fe2+ + I2

Calculul de bază al iodometriei este deci următorul: din cantitatea de iod eliberat

de un oxidant sau din cantitatea de I2 redusă de un reducător se poate calcula cantitatea

oxidantului sau reducătorului.

Sfârşitul reacţiei dintre substanţa de analizat şi iod, în prezenţă de iodură, este

determinată cu ajutorul amidonului, care formează un compus colorat intens albastru, de

forma [(C6H10O5)4I]4 •KI. Sensibilitatea indicatorului este mare, punându-se în evidenţă

circa 1,5 mg iod la litru de soluţie, (∼10-5N) acidulată cu HCl sau H2SO4. Creşterea

temperaturii soluţiei de titrat sau prezenţa alcoolului metilic sau etilic micşorează

sensibilitatea indicatorului.

Tot ca indicator în iodometrie se poate folosi o soluţie alcoolică 0,2% de α-

naftol-flavonă, care cu iodul dă un compus colorat tot în albastru. Acest indicator este

însă mult mai sensibil decât amidonul şi se poate folosi la titrarea soluţiilor mai diluate

35

de iod (∼10-3n) sau la titrarea iodometrică a soluţiilor colorate, în lumină ultravioletă

când, la un exces de iod, fluorescenţa albastră a indicatorului dispare. În acelaşi mod se

foloseşte şi rodamina B, a cărei fluorescenţă roşie la lumina ultravioletă dispare în

prezenţa unui mic exces de iod.

Dozarea substanţelor reducătoare

Substanţele reducătoare pot fi dozate în două feluri:

- substanţa de dozat se titrează direct cu soluţie de iod,

- substanţei de dozat i se adaugă soluţie de iod în exces şi excesul de iod se titrează cu o

soluţie de tiosulfat de sodiu cu factor cunoscut. Sfârşitul acestor titrări poate fi

determinat cu unul din indicatorii prezentaţi mai sus.

Reacţia titrimetrică este: 2Na2S2O3 + I2 → 2NaI + Na2S4O6

Stabilirea factorului soluţiei de Na2S2O3 0,01 N

Principiu:

În cazul soluţiei etalon de permanganat de potasiu au loc următoarele reacţii:

10 KI + 2 KMnO4 + 16 HCl = 12 KCl + 2 MnCl2 + 5 I2 + 8 H2O

I2 + 2 Na2S2O3 = 2 NaI + Na2S4O6

Reactivi: - Soluţie de KMnO4 0,01 N cu factorul FKMnO4

- Soluţie de HCl 15%

- Soluţie de KI 0,5%

Modul de lucru:

În 3 baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml soluţie de permanganat 0,01 N,

se adaugă câte 5 ml soluţie de HCl 15% şi 10 ml soluţie de KI 0,5%.

După 5 minute de repaus se titrează cu tiosulfat de sodiu iodul pus în libertate

până la culoarea galben-deschisă a soluţiei. Se adaugă 2 ml soluţie de amidon 0,5% şi se

continuă titrarea până la albastru pal agitând puternic. O picătură de soluţie de tiosulfat

în exces decolorează complet soluţia.

Calcul:

Se foloseşte formula VNa2S2O3•FNa2S2O3 = VKMnO4•FKMnO4

VKMnO4•FKMnO4

adică FNa2S2O3 = —————— VNa2S2O3

36

Dozarea substanţelor oxidante

Din soluţia de KI oxidanţii pun în libertate iod elementar. Cantitatea de iod pus

în libertate este echivalentă cu cantitatea substanţei oxidante adăugate. Iodul elementar

pus în libertate se dozează prin titrare cu tiosulfat de sodiu care reduce iodul la ioni de

iodură conform reacţiei de mai sus.

Dozarea K3[Fe(CN)6] (macrometodă)

Principiu:

Iodul rezultat prin oxidarea ionilor I- de către ionii [Fe(CN)6]3- conform reacţiei,

2 [Fe(CN)6]3- + 2 I- ↔ 2 [Fe(CN)6]4- + I2, este titrat cu tiosulfat de sodiu în

prezenţa amidonului ca indicator. Reacţia are loc în mediu slab acid (CH3COOH) însă,

fiind reversibilă, deplasarea ei spre dreapta se realizează prin adaosul de ioni Zn2+ din

amestecul CH3COOH – ZnSO4. Are loc reacţia:

2 K4[Fe(CN)6] + 3 ZnSO4 → K2Zn3[Fe(CN)6]2 + 3 K2SO4

Ireversibilitatea acestei reacţii se datorează insolubilităţii sării duble a ferocianurii.

Reactivi: - Soluţie KI 0,5 %

- Soluţie CH3COOH - ZnSO4 (3% fiecare)

- Soluţie Na2S2O3 0,01 N cu factor cunoscut

- Soluţie amidon 0,5 %

Modul de lucru:

În 3 baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml fericianură de potasiu. Se adaugă

câte 10 ml soluţie de KI şi 15 ml CH3COOH - ZnSO4. După 5 minute se titrează cu

soluţie de tiosulfat de sodiu 0,01N iodul pus în libertate până la decolorarea aproape

completă a soluţiei. Se adaugă 2 ml soluţie de amidon şi se continuă titrarea până la

dispariţia culorii albastre.

Calcul:

1000 ml Na2S2O3 0,01N ……………………………..3,29 g K3[Fe(CN)6]

V•FNa2S2O3.......................................…………....x g

x g K3[Fe(CN)6]……………………………….10 ml sol

c%(m/v) = 10 • x

Dozarea K3[Fe(CN)6] (micrometodă)

Principiu şi reactivi: sunt aceeaşi ca şi la macrometodă.

37

Modul de lucru:

În 3 baloane Erlenmeyer se măsoară câte 2 ml apă bidistilată. Se adaugă cu

ajutorul micropipetei câte 0,10 ml fericianură de potasiu. Se adaugă câte 1 ml soluţie de

KI şi 1,5 ml CH3COOH - ZnSO4. După 5 minute se titrează iodul eliberat cu soluţie de

tiosulfat de sodiu 0,01N în prezenţa de 0,2 ml amidon până la dispariţia culorii albastre.

Calcul:

1000 ml Na2S2O3 0,01N ……………………………..3,29 g K3[Fe(CN)6]

V•FNa2S2O3.......................................…………....x g

x g K3[Fe(CN)6]……………………………….0,1 ml sol

c%(m/v) = 1000 • x

Sistemul I2/I- se găseşte în concentraţie foarte mică în apa de mare (0,05 mg/l), deoarece

iodul este legat în cea mai mare parte sub formă organică. Plantele marine extrag iodura

din apa de mare. Iodura se regăseşte în cenuşa acestor plante. Se mai găseşte iodură în

cantităţi variabile (7-46 g/m3) în apele fosile care însoţesc petrolul şi, în concentraţii mai

mici, în unele ape minerale.

Iodul apare, în concentraţii foarte mici, în toate vieţuitoarele şi este indispensabil

pentru viaţa acestora. La animalele superioare, iodul este concentrat în glanda tiroidă

într-o proteină numită tireoglobulină. Lipsa de iod în apa de băut, în special în unele

regiuni muntoase, determină apariţia, la populaţia acelor regiuni, a unor maladii ale

glandei tiroide (guşă).

Complexometria volumetrică

Metodele complexometrice servesc la dozarea cationilor prin titrare cu soluţia

agentului complexant. Prin metodele indirecte se pot doza complexometric şi anioni,

precum şi substanţele organice. Din numărul mare de reactivi unul frecvent folosit este

complexonul III (EDTA Na2) utilizat spre exemplu pentru titrarea ionilor Ca2+.

38

CH2

CH2

N

N

CH2

CH2

CH2

CH2

COOH

C

C

COOH

O

O

O-

O-Na+

Na++ Ca2+

CH2

CH2

N

N

CH2CH2

COO-

C O

OCa

CH2 CH2 C

COO-O

O

2-

+ 2 Na+ + 2H+

complexon III complexonat de

(etilendiamino-tetraacetatul disodic) calciu

Existenţa mai multor cicluri pentaatomice imprimă moleculei o mare stabilitate.

Stabilitatea complexului format este una din condiţiile pe care trebuie să o îndeplinească

o reacţie care stă la baza unei metode complexometrice. Stabilitatea se exprimă

cantitativ prin constanta de stabilitate KMY. Dacă notăm cu M ionul de metal şi cu Y

agentul de complexare, reacţia de complexare este următoarea:

M + Y M Y Constanta de stabilitate este exprimată prin relaţia:

[ ][ ] [ ]

KMY

M YMY =⋅

Valoarea constantei de stabilitate depinde de natura complexului şi de o serie de alţi

factori, cum ar fi pH-ul soluţiei.

Indicatorii folosiţi în complexometrie sunt indicatorii metalocromici, coloranţi

organici, care formează complecşi interni cu cationii metalici, de altă culoare decât

aceea a indicatorului liber.

Indicatorul trebuie să fie ales în aşa fel încât stabilitatea complexului format de

el cu ionii de metal să fie mai mică decât stabilitatea complexului format agentul de

complexare cu ionii metalici. În tabelul de mai jos sunt prezentaţi principalii indicatori

metalocromici, cationii pentru care sunt folosiţi şi logaritmul constantelor de stabilitate

ale lor în mediile precizate.

39

Indicator

metalcromic Cationi Mediu lg KMY

Eriocrom negru T Cd2+

Co2+

Cu2+

Mg2+

Pb2+

Zn2+

NaClO4 0,3N

-

NaClO4 0,3N

-

NaClO4 0,3N

NaClO4 0,3N

12,74

20,00

21,38

7,00

13,19

12,31

Murexid Ca2+

Cu2+

Ni2+

-

-

KNO3 0,1N

2,68

3,50

3,36

Acid sulfosalicilic Al3+

Cu2+ Fe3+

NaClO4 0,2N

NH4ClO4 0,2N

-

10,01

9,04

14,05

Ftaleincomplexon Ba, Sr, Ca

Xilenoloranj Be2+

Bi3+

La3+

Pb2+, Zn2+,

Hg2+, Sn2+

NaClO4

NaNO3 0,2N

NaClO4 0,2N

-

-

3,92

75,60

11,67

-

-

Acid

calconcarbonic

Ca2+ - -

Cromazurol S Al3+

Cu2+

Fe3+

Ni2+

KCl 0,2N

NaClO4 0,1N

KCl 0,1N

-

4,32

4,10

15,60

9,30

α, α`- Dipiridil Fe2+

Zn2+

KCl 0,1N

KCl 0,1N

3,70

4,35

40

Dozarea aminoacizilor prin metoda complexonometrică

(metoda Budesinsky)

Principiu :

Fosfatul cupric, greu solubil în apă, reacţionează în mediu neutru cu aminoacizii

formând complecşi de tipul chelaţilor. Un aminoacid monoamino-monocarboxilic

complexează ionii Cu2+ în raport de 2:1 formând un complex solubil în apă. Reacţia este

următoarea:

6 HC

COOH

R

NH2 +Cu3(PO4)2 3HC

COO

R

NH

H

Cu NH

H

CH

OOC

R

+ 2PO43- + 6H+

Excesul de fosfat cupric nedizolvat se poate separa prin centrifugare sau filtrare.

Prin adăugare de HCl la filtrat se eliberează ionii cuprici din complex conform reacţiei:

HC

COO

R

NH

H

Cu N

H

HC

OOC

R

H + 2HCl Cu2+ + 2 Cl- + 2 HC

COOH

R

NH2

Ionii cuprici eliberaţi se dizolvă prin titrare cu complexon III în prezenţa

indicatorului metalocromic piridilazonaftol (PAN). Reacţia titrimetrică de complexare

este următoarea:

CH2

CH2

N

N

CH2 COOH

CH2 C O

CH2

CH2 COOH

C O

OO

--Na+

Na++ Cu2+

CH2

CH2

N

NCH2

CH2

CH2

CH2

Cu

COO-

COO-

C

C

O

O

O

O + 2Na+ + H+

2-

Reactivi: - soluţie complexon III 0,01N cu factor cunoscut

- soluţie HCl 0,01N

- indicator PAN 0,1 % în soluţie etanolică

- suspensie de Cu3(PO4)2

41

Modul de lucru:

În trei flacoane Erlenmeyer se pipetează câte 5 ml soluţie aminoacid, 5 ml

suspensie agitată de Cu3(PO4)2, se agită bine şi apoi se lasă 5 minute în repaos.

Amestecul se filtrează şi din filtrate se pipetează câte 5 ml în trei flacoane Erlenmeyer

curate. Se adaugă către 1 ml soluţie HCl, 3 picături indicator PAN şi se titrează ionii Cu 2+ eliberaţi cu o soluţie de complexon III 0,01 M până la virajul indicatorului de la roşu

violet la galben-verzui.

Calcul:

Dacă se cunoaşte natura aminoacidului prezent se ia în calcul masa moleculară a

lui. Dacă este vorba de un amestec de aminoacizi monoamino-monocarboxilici

rezultatul se exprimă în mg N α-aminic/100 ml sau mmoli N α-aminic/l.

1000 ml sol. complexon III 0,01 M ....................0,01 × 2 × 14 g N

v−

× FComplexon III ................................... .............................. x

x = .......g/ 2,5 ml c% (m/v) = 40 • x

Volumetria prin reacţii de precipitare

Principii:

Soluţia de reactiv formează cu componentul de dozat un precipitat insolubil. Din

volumul reactivului folosit pentru precipitarea completă a componentului de dozat se

calculează cantitatea componentului respectiv. Pot fi utilizate numai acele reacţii, la

care precipitatul format are compoziţie constantă, reacţia decurge rapid şi punctul de

echivalenţă poate fi indicat. Fiecare metodă necesită indicator aparte. Dacă în cursul

titrării se formează precipitat alb sau de culoare deschisă, putem folosi un indicator care

cu ionul de dozat sau cu excesul reactivului dă reacţie de culoare sau precipitat colorat.

Dintre metodele bazate pe reacţii de precipitare cea mai des utilizată este argentometria,

în care se întrebuinţează ca reactiv AgNO3. Azotatul de argint (ionii de Ag+ ) formează

cu ionii Cl-, Br-, I-, SCN- precipitate practic insolubile.

Prepararea unei soluţii de AgNO3 0,01N

Azotatul de argint chimic pur se deshidratează la 210-250ºC. După răcire se

cântăreşte cantitatea necesară (1,6989 g/l) se dizolvă şi se completează cu apă distilată

42

la volumul necesar. Dacă nu se măsoară exact cantitatea teoretică de AgNO3, soluţia va

avea factorul: Cantitatea măsurată

F AgNO3 = ———————— 1,6989

Soluţia se păstrează în sticlă brună.

Stabilirea factorului soluţiei de NH4SCN 0,01 N

Principiu:

În vederea determinării, un volum precis de AgNO3 0,01 N (cu factorul

cunoscut) se titrează cu NH4SCN. Are loc reacţia:

AgNO3 + NH4SCN = AgSCN + NH4NO3

Drept indicator serveşte alaunul feric. Indicarea sfârşitului titrării are loc prin

următoarea reacţie: Fe3+ + 3 SCN- = Fe(SCN)3

Formarea sulfocianurii de fer, substanţă intens colorată în roşu, indică un mic

exces de NH4SCN.

Modul de lucru:

În trei baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml soluţie 0,01 N AgNO3 cu

factorul cunoscut. Se adaugă 5 ml HNO3 10% şi 2 ml alaun feric ca indicator. Se

titrează cu soluţia de NH4SCN 0,01 N, agitând puternic, până la roz pal persistent. Se

calculează factorul din relaţia:

VSCN¯•F SCN¯ = VAgNO3•F AgNO3

Dozarea clorurilor prin metoda Volhard

Principiu:

Dozarea indirectă a ionului de clor după Volhard constă în următoarele etape. La

soluţia de analizat, acidulată cu HNO3, se adaugă în exces o soluţie titrată de AgNO3.

Are loc reacţia:

AgNO3 + Cl¯ = AgCl + NO3¯ Excesul de azotat de argint se titrează cu sulfocianură în

prezenţă de Fe3+ ca indicator. AgNO3 + SCN¯ = AgSCN + NO3¯

Modul de lucru:

În 3 baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10 ml soluţie care conţine ionii de Cl¯,

se adaugă 20 ml soluţie 0,01N de azotat de argint 10 ml acid azotic 10% se aduce la

43

fierbere, se adaugă 2 ml alaun feric 20%. Se titrează cu o soluţie 0,01 N de NH4SCN

agitând puternic, până la roz slab, persistent timp de 5 – 10 secunde.

Calcul:

Rezultatul se va exprima în mM/l. Fiind vorba de o titrare prin diferenţă,

raţionamentul este identic cu cel din cazul determinării amoniacului.

Identificarea glucidelor

Reacţii de reducere

Reacţiile de reducere nu sunt specifice doar glucidele reducătoare, ele fiind date

şi de alte substanţe neglucidice cu caracter reducător. Caracterul reducător al

monozaharidelor şi a unor dizaharide este datorat prezenţei în molecula lor a funcţiunii

carbonilice, care se poate oxida, reducând la cald şi în mediu alcalin cationii metalelor

grele: Cu, Ag, Bi, precum şi unele substanţe organice ca acidul picric, indigoul, etc.

1. Reacţia Fehling

Principiu:

Gruparea carbonil din glucidele reducătoare reduce la cald Cu2+ până la Cu+ din

complexul solubil format în mediu alcalin cu sarea Seignette (tartrat dublu de sodiu şi

potasiu). Se formează Cu2O, pulbere de culoare roşie-cărămizie, conform reacţiilor:

CuSO4 + 2KOH → Cu(OH)2 + K2SO4

C6H12O6 + 2 Cu(OH)2 → C6H12O7 + Cu2O + 2 H2O acid gluconic

Reactivi: - Reactivul Fehling se obţine în urma amestecării soluţiei I şi II în

volume egale, operaţie ce se desfăşoară în momentul

întrebuinţării.

- Soluţia I: CuSO4 35 g/1000 ml soluţie

- Soluţia II: 150 g sare Seignette şi 90 g NaOH la 1000 ml soluţie

- Soluţii 2% de glucoză, fructoză, lactoză.

Modul de lucru:

Se amestecă într-o eprubetă 1 ml reactiv Fehling I cu 1 ml reactiv Fehling II se

adaugă 2 ml soluţie de glucid şi se încălzeşte până la fierbere agitând continuu. În

prezenţa unui glucid reducător se formesază un precipitat roşu-cărămiziu de Cu2O.

44

2. Reacţia Benedict

Principiu:

Glucidele reducătoare reduc la cald în mediu alcalin hidroxidul de cupru de

culoare albastră în oxid de cupru (I) de culoare roşie-cărămiziu. Reacţia Benedict

prezintă avantajul că se foloseşte un singur reactiv, ionul de Cu2+ fiind complexat în

soluţie de către citratul de sodiu.

Reactivi: - Reactivul Benedict: 173 g citrat de sodiu şi 100 g Na2CO3

anhidru se dizolvă în 800 ml H2O distilată fierbinte, se filtrează şi

se aduce volumul la 850 ml. Se dizolvă separat 17,3 g CuSO4• 5

H2O în 100 ml H2O distilată, se adaugă sub agitare primei soluţii

şi se completează volumul soluţiei finale la 1000 ml.

- Soluţii 2% de glucoză, fructoză, lactoză.

Mod de lucru:

Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluţie de glucid şi 3 ml reactiv Benedict, se

încălzeşte până la fierbere agitând continuu. Apariţia unui precipitat roşu-cărămiziu

implică existenţa în soluţie a glucidului reducător.

3. Reacţia Tollens

Principiu:

Glucidele reducătoare reduc la cald Ag+, din azotatul de argint amoniacal, la Ag

metalic care se depune pe pereţii eprubetei sub forma unei oglinzi (oglinda de argint),

conform reacţiilor:

AgNO3 + NaOH → AgOH + NaNO3

AgOH + 2 NH3 → [Ag(NH3)2]OH

C6H12O6 + 2 [Ag(NH3)2]OH → C6H12O7 + 2 Ag + 4NH3 + H2O

Reactivi: - soluţie AgNO3 5% în apă distilată

- soluţie NH4OH 20%

- soluţii 2% de glucoză, fructoză, lactoză.

Modul de lucru:

Într-o eprubetă se introduc 1 ml AgNO3, se adaugă picătură cu picătură soluţie

de amoniac până la dizolvarea precipitatului format iniţial. Se adaugă 1 ml soluţie

glucidică şi se introduce eprubeta într-o baie de apă încălzită la fierbere. În cazul

45

existenţei unui glucid reducător în soluţia glucidică se formează oglinda de argint.

Încălzirea eprubetei se poate face şi direct la flacără sub agitare blândă.

4. Reacţia Nylander

Principiu:

Gruparea carbonil din glucidele reducătoare reduce azotatul de bismut în bismut

metalic de culoare neagră.

Reactivi: - Reactivul Nylander: 20 g azotat bazic de bismut, 40 g sare

Seignette şi 100g NaOH se dizolvă în apă pentru 1000 ml soluţie.

- Soluţii 2% de glucoză, fructoză, lactoză.

Modul de lucru:

Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluţie glucidică şi 1 ml reactiv Nylander, se

încălzeşte până la fierbere agitând continuu. În prezenţa unui glucid reducător în soluţie

apare un precipitat negru-brun.

5. Reacţia Barfoed

Principiu:

Reacţia Barfoed permite diferenţierea monozaharidelor reducătoare, pentru care

reacţia este pozitivă, de dizaharidelor reducătoare pentru care reacţia este negativă.

Principiul reacţiei constă în reducerea în mediu acid a ionilor de Cu2+ la Cu+ din Cu2O,

care se depune pe fundul eprubetei sub forma unui precipitat roşu-cărămiziu. De fapt

reacţia este potrivită atât pentru monozaharide cât şi pentru dizaharide reducătoare.

Diferenţa constă în vitezele de reacţie foarte diferite: mari pentru monozaharide; mici

pentru dizaharidele reducătoare.

Reactivi: - Reactivul Barfoed: 13,3 g acetat de cupru se dizolvă în 200 ml

H2O distilată, se filtrează şi se adaugă 1,8 ml acid acetic glacial.

- Soluţii 2% de glucoză, fructoză

Modul de lucru:

Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluţie glucidică şi 2 ml reactiv Barfoed, se

încălzeşte până la fierbere agitând continuu timp de 1-2 minute. Apariţia unui inel de

precipitat roşu-cărămiziu la suprafaţa soluţiei şi depunerea de precipitat roşu-cărămiziu

pe fundul eprubetei pune în evidenţă prezenţa monozaharidelor.

46

6. Reacţia cu acidul picric

Principiu:

Glucidele reducătoare reduc una din grupările nitro ale acidului picric (de

culoare galbenă) la grupare amino, cu formare de acid picramic (de culoare brun-roşie).

Această reacţie poate servi la dozarea colorimetrică a glucidelor reducătoare (metoda

Crecelius-Seifert).

Reactivi: - acid picric 0,5%

- glucoză 1%

- NaOH 10%

Modul de lucru:

Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluţie de glucoză, 2 ml acid picric şi 1 ml

NaOH. Se încălzeşte până la fierbere, agitând continuu până la apariţia unei coloraţii

roşii-brune.

Reacţii de culoare

Reacţiile de culoare sunt specifice monozaharidelor care sub acţiunea acizilor

minerali concentraţi se deshidratează şi se transformă în furfurol sau în derivaţi ai lui.

HO - C - C - OH

H

H2C CH - CHOO O

H

H H 3 H2O O

CHO

pentoză

furfurol

CHO

O3 H2OH H

H

OOCH - CHOHC

H

HO - C - C - OH

HO - CH2 - HO - H2C -

hexozăhidroximetil - furfurol

47

Furfurolul şi derivaţii lui pot reacţiona cu fenolii, în urma reacţiei rezultând

compuşi coloraţi.

1. Reacţia Molisch

Principiu:

În prezenţa acidului sulfuric concentrat, monozaharidele (pentozele, hexozele) se

transformă în furfurol (hidroximetil furfurol) care reacţionează cu α-naftolul în raportul

1:2 formând produşi de condensare de culoare violetă. Această reacţie o dau la cald

toate glucidele deorece, sub acţiunea H2SO4 conc. ele hidrolizează punând în libertate

monozaharidele.

R C H O +

O H

O H

H

HH 2 OO

O

O H

O H

C HR

Reactivi: - reactivul Molisch: soluţie alcoolică 5% de alfa-naftol

- H2SO4 conc.

- soluţie de glucoză 1%

Modul de lucru:

Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluţie glucoză 1%, se adaugă 1-2 picături din

soluţia de alfa-naftol şi apoi se toarnă cu precauţie pe peretele înclinat al eprubetei

48

H2SO4 conc. La suprafaţa de contact a celor două straturi de lichide cu densităţi diferite

se formează un inel violet.

2. Reacţia Bial

Principiu:

Reacţia Bial serveşte la identificarea pentozelor, pentru care reacţia este

pozitivă, faţă de hexoze, ea fiind negativă.

În prezenţa acizilor minerali tari, pentozele reacţionează cu orcina (5-metil-

rezorcina) formând produşi de condensare de culoare violetă sau albastru-verde în

funcţie de natura acidului folosit.

Reactivi: - reactivul Bial: 6 g orcină se dizolvă în 200 ml alcool etilic 96%

şi se adaugă 40 picături sol. FeCl3 10%

- HCl conc.

- soluţie 1% de fructoză, arabinoză, glucoză

Modul de lucru:

Într-o eprubetă se introduc 2 ml sol. de pentoză, iar în altă eprubetă 2 ml soluţie

de glucoză. Se adaugă în fiecare eprubetă 10 picături reactiv Bial şi câte 2 ml HCl conc.

Se agită conţinutul eprubetelor, se astupă cu dopuri de vată şi se lasă într-o baie de apă

ce fierbe timp de 10 minute. Conţinutul eprubetei în care se găseşte soluţia de pentoză

devine albastru-verzui.

3. Reacţia Seliwanoff

Principiu:

Reacţia Seliwanoff serveşte la diferenţierea cetozelor de aldoze. Monozaharidele

în prezenţa HCl conc. reacţionează cu rezorcina (sau alţi polifenoli) formând produşii

de condensare coloraţi. Reacţia este mai rapidă şi mai intensă în prezenţa cetozelor,

când se obţin produşi coloraţi în roşu decât în prezenţa aldozelor, când se obţin produşi

coloraţi în roz deschis.

Reactivi: - reactivul Seliwanoff: 0,15 g rezorcină, 100 ml HCl conc., 200

ml H2O distilată.

- soluţie de fructoză, glucoză 2%

Modul de lucru:

Într-o eprubetă se introduce 1 ml soluţie fructoză şi în altă eprubetă 1 ml soluţie

de glucoză. Se adaugă în ambele eprubete câte 2 ml reactiv Seliwanoff şi se încălzesc

49

probele până la fierbere. După răcire, conţinutul eprubetei cu fructoză se colorează în

roşu, iar a celei cu glucoză în roz slab.

Reacţia cu fenilhidrazina

Reacţia este specifică glucidelor reducătoare şi are ca rezultat formarea

osazonelor. Osazonele diferitelor glucide se deosebesc între ele prin structura cristalină

ceea ce determină imagini microscopice diferite, aşa cum se vede în figura de mai jos.

De asemenea ele se deosebesc prin solubilitate, puncte de topire.

Principiu:

Reacţia glucidelor reducătoare cu fenilhidrazina decurge în două etape:

- la rece, se formează fenilhidrazina

- la cald, în prezenţa unui exces de reactiv, se formează osazona specifică

glucidului folosit. Cetonele reacţionează ca şi aldozele. Prin RMN s-a

dovedit că osazonele au o structură chelatică ciclică.

Reactivi: - fenilhidrazină solidă

- CH3COONa •H2O

- acid acetic glacial

- soluţii 10% de glucoză, lactoză, maltoză

Modul de lucru:

Se introduc câte 5 ml soluţie de glucoză, lactoză şi maltoză în câte o eprubetă, se

adaugă 0,5 ml acid acetic glacial, puţină fenilhidrazină şi o cantitate dublă de acetat de

sodiu. Se agită şi se introduc eprubetele într-o baie de apă la fierbere timp de 1/2 de oră.

50

După răcire apar cristalele galbene specifice, care se vor examina la microscop, punând

1-2 picături din fiecare probă pe o lamelă de sticlă.

H

C = O

H C - O H

R

+ H 2 N - N H - C 6 H 5

H 2 OR

H C - O H

C = N - N H - C 6 H 5

H

g lu c id r e d u c ă to r

fe n ilh id r a z in ă

fe n ilh id r a zo n ă

H

C = N - N H - C 6 H 5

H - C - O H

R

+ H 2 N - N H - C 6 H 5

N H 3C 6 H 5 - N H 2

R

C = O

C = N - N H - C 6 H 5

H

H

C = N - N H - C 6 H 5

C = O

R

fe n ilh id r a z in ăH 2 O

+ H 2 N - N H - C 6 H 5

R

C = N - N H - C 6 H 5

C = N - N H - C 6 H 5

H

o s a zo n ă

Identificarea dizaharidelor

Dizaharidele pot fi reducătoare - maltoză, lactoză sau nereducătoare - zaharoza.

După o prealabilă hidroliză a legăturii glicozidice şi cele nereducătoare vor da reacţiile

caracteristice de reducere şi culoare ale monozaharidelor.

51

Reactivi: - reactiv Benedict

- reactiv Barfoed

- acid clorhidric 10%

- hidroxid de sodiu 10%

- soluţii 2% de zaharoză, lactoză, maltoză

Modul de lucru:

Se introduc câte 2 ml soluţie maltoză, zaharoză şi lactoză în câte o eprubetă, se

adaugă 2 ml reactiv Benedict şi se încălzesc soluţiile pănâ la fierbere. Reacţia este

pozitivă în cazul maltozei şi a lactozei care sunt dizaharide reducătoare. Într-o altă

eprubetă se introduc 2 ml zaharoză, 3 picături HCl 10% şi se aduce soluţia la fierbere.

După răcire se neutralizează cu 3 picături de NaOH 10%, se adaugă apoi 2 ml reactiv

Benedict şi se încălzeşte din nou la fierbere. Reacţia va fi pozitivă pentru că în urma

hidrolizei au rezultat două monozaharide reducătoare.

Identificarea polizaharidelor

Principiu:

Polizaharidele cu importanţă biologică - amidonul, dextrinele, glicogenul -

formează cu iodul la rece combinaţii colorate diferit:

- amidonul cu iodul - albastru

- dextrinele cu iodul - brun-roşu clar

- glicogenul cu iodul - cărămiziu opalescent

Aceste combinaţii sunt termolabile, la cald culoarea dispare şi reapare la răcire

ceea ce sugerează termodisocierea lor.

Reactivi: - soluţie apoasă de iod: se amestecă 0,2 g I2 cu 1 g KI şi 2 ml apă

distilată. După dizolvare se completează la 100 ml cu apă

distilată.

- soluţii 2% de amidon, dextrine, glicogen

Modul de lucru:

Se introduc câte 2 ml soluţie amidon, dextrină, glicogen în câte o eprubetă. Se

adaugă apoi 1-2 picături soluţie de iod şi se observă culorile obţinute. Se verifică

dispariţia culorilor prin încălzirea eprubetelor şi reapariţia lor la răcire.

52

Identificarea glucidelor

1. Reacţia cu iod

incolor roşu-brun albastru amidon monozaharide clar opalescent dizaharide dextrine glicogen sol.fără glucid

2. Reacţia Benedict (sau Fehling)

pozitivă negativă glucid reducător glucid nereducător soluţie fără glucid 3. Reacţia Barfoed pozitivă negativă 3'.Hidroliză acidă monozaharid dizaharid 4.Reacţia Bial 4".Reacţia de formare a osazonelor 4'.Reacţia Benedict pozitivă negativă maltosazona lactosazona pentoze hexoze pozitivă negativă zaharoza sol.fără glucid 5. Reacţia Selivanov pozitivă negativă fructoză glucoza

53

Identificarea aminoacizilor şi proteinelor

Reacţii de culoare

Reacţiile de culoare nu sunt specifice moleculei proteice ca un tot, ci sunt date

de prezenţa în molecula proteică a unor componente structurale, cum ar fi legăturile

peptidice în cazul reacţiei biuretului sau prezenţa unor anumiţi aminoacizi în cazul

celorlalte reacţii.

Reacţia biuretului

Principiu:

Substanţele care conţin legături peptidice (începând cu tripeptidele) reacţionează

cu Cu2+ în soluţie puternic alcalină dând o coloraţie caracteristică violetă, purpurie,

datorită formării unui complex colorat în care ionul Cu2+ este unit prin legături

coordinative cu heteroatomi ai aminoacizilor angajaţi în legătura peptidică. Această

reacţie se foloseşte şi pentru dozarea substanţelor proteice prin metodă

spectrofometrică.

Simbolizând cu Ri respectiv Ri+1 radicali ai aminoacizilor legaţi prin legătura

peptidică, această legătură se poate reprezenta în felul următor:

Cel mai simplu compus care dă această reacţie este biuretul, de unde şi numele

reacţiei. Formula biuretului este:

Reactivi: - Sol. CuSO4 1%

- Sol. NaOH 10%

Mod de lucru:

La 1-2 ml soluţie de cercetat se adaugă un volum egal de NaOH şi 3-5 picături

de soluţie de CuSO4. Se obţine o coloraţie albastră - violetă, fotometrabilă.

54

Reacţia ninhidrinei

Principiu:

Ninhidrina (tricetohidrindenhidrat) reacţionează cu aminoacizii în soluţie

apoasă, neutră sau slab alcalină şi la cald, cu formarea unui compus colorat. Coloraţia

variază pentru diverşii aminoacizi de la roz, roşu la albastru-violet (purpura lui

Ruhemann) şi este galbenă pentru prolină, galben-brun pentru hidroxiprolină. Această

reacţie este dată nu numai de aminoacizi, ci şi de peptide şi proteine. Reacţia cu

ninhidrină este una din reacţiile generale folosite pentru identificarea şi dozarea

aminoacizilor în special la metoda cromatografică.

Reactiv: - Sol. de ninhidrină 0,1% cu adaos de piridină.

Mod de lucru:

La 2-3 ml soluţie de cercetat se adaugă 0,5 ml soluţie de ninhidrină, se încălzeşte

soluţia la fierbere cca 30 secunde, apoi se răceşte. Se observă formarea unei coloraţii

albastru-violet (fiindcă se lucrează cu un amestec de aminoacizi).

Reacţia xantoproteică

Principiu:

Această reacţie este caracteristică aminoacizilor aromatici. Astfel fenilalanina,

tirozina, triptofanul dau o coloraţie galbenă la încălzire cu acidul azotic concentrat.

Reacţia este datorată nitrării nucleului benzenic, respectiv imidazolic. Se poate da ca

exemplu reacţia fenilalaninei cu acidul azotic:

Reactivi: - HNO3 conc.

- Sol. NaOH 5%

Mod de lucru:

La 1 ml soluţie de cercetat se adaugă câteva picături de HNO3 concentrat. Apare

un precipitat alb sau o tulburare. După fierberea conţinutului 1-2 minute apare o culoare

55

galbenă. La fierbere precipitatul se poate dizolva parţial sau complet. Dacă după răcire

soluţia se alcalinizează, culoarea se intensifică, se schimbă în galben portocaliu.

Apariţia petelor galbene pe piele în urma acţiunii acidului azotic concentrat se explică

tot prin reacţia xantoproteică.

Reacţia Adamkiewicz-Hopkins-Cole (reacţia triptofanului)

Principiu:

Triptofanul (aminoacid care se găseşte în aproape toate proteinele) dă cu acidul

glioxilic (OHC-COOH) o coloraţie violetă. Se foloseşte ca reactiv acidul acetic glacial,

care conţine ca impuritate acid glioxilic.

Reacţia este specifică nucleului indolic, astfel produşii obţinuţi prin

descompunerea triptofanului (indolul şi derivaţii săi) dau şi ei reacţia pozitivă.

Reactivi: - Acid acetic glacial

- Acid sulfuric concentrat

Mod de lucru:

La 2 ml soluţie de cercetat se adaugă 2 ml acid acetic glacial, se amestecă şi se

introduc pe fundul eprubetei 2 ml H2SO4 concentrat. La suprafaţa de separaţie se

formează un inel violet. Reacţia se foloseşte în laboratoarele clinice pentru diferenţierea

meningitei tuberculoase de meningitele de altă etiologie, această reacţie fiind pozitivă

numai din lichidul cefalo-rahidian al pacienţilor cu meningită tuberculoasă. Meningita

este inflamaţia membranelor care învelesc creierul şi măduva spinării.

Reacţia tioaminoacizilor (reacţia cisteinei, cistinei)

Principiu:

Prin fierberea unei soluţii alcaline conţinând tioaminoacizi sau proteine ce conţin

în moleculă aminoacizi cu sulf, sulful se eliberează ca sulfură de sodiu (Na2S). Sulfura

de sodiu rezultată se tratează cu acetat de plumb şi se formează un precipitat negru-brun

de sulfură de plumb.

Reactivi: - Sol. de NaOH 30%

- Sol. de acetat de plumb 10%

Mod de lucru:

La 1 ml soluţie de cercetat se adaugă acelaşi volum de NaOH 30% şi se fierbe 3-

5 minute. După fierbere se adaugă 1-2 ml soluţie de acetat de plumb şi se fierbe din nou.

Se obţine un precipitat sau numai o coloraţie brun-neagră.

56

Reacţia Pauli (reacţia histidinei şi tirozinei)

Principiu:

Tirozina, histidina şi proteinele conţinând aceşti aminoacizi, formează prin

cuplare cu acidul diazobenzensulfonic, un colorant azoic roz care se intensifică la roşu

prin alcalinizare. Sinteza sării de diazoniu are loc prin reacţia:

Reacţia de cuplare este următoarea (se ia în considerare şi alcalinizarea):

Sarea de diazoniu + tirozină + NaOH

Reactivi: - Sol. de acid sulfanilic 1% în HCl 10%

- Sol. de NaNO2 5%

- Sol. de Na2CO3 30% sau NaOH 10%

Mod de lucru:

Se diazotează 1 ml soluţie de acid sulfanilic adăugând 1 ml soluţie de nitrit de

sodiu. Se amestecă acidul diazobenzensulfonic obţinut cu 1 ml soluţie de cercetat şi

după neutralizare cu 3-4 ml soluţie de Na2CO3 (sau câteva picături de NaOH) se obţine

o coloraţie roşie.

O-Na+

CH2 I H - C - NH2 I COO-Na+

N=N SO3-Na+ + H2O

Colorant azoic

57

Reacţia Sakaguchi (reacţia argininei)

Principiu:

Soluţiile care conţin substanţe cu radicalul guanidinic în moleculă, dau în mediu

alcalin în prezenţa alfa-naftolului şi a hipocloritului sau hipobromitului de sodiu

combinaţii colorate în roşu.

Reactivi: - Soluţie de hipoclorit de sodiu

- Soluţie alfa-naftol: se dizolvă 0,1 g alfa-naftol în aprox. 25 ml

alcool etilic şi se diluează cu apă la 100 ml.

- Soluţie de NaOH 10%

Mod de lucru:

Se ia într-o eprubetă 1 ml soluţie proteică diluată şi se alcalinizează cu 1 ml

soluţie NaOH 10%. Se adaugă 1 ml soluţie alfa-naftol şi soluţia de hipoclorit de sodiu

picătură cu picătură până la apariţia unei culori vişinii. Culoarea dispare la cald.

Reacţii de precipitare ale proteinelor

Principiu:

Proteinele sunt precipitate de acizi minerali (H2SO4, HNO3, HCl) sau organici

(acid tricloracetic, tanic, ferocianic, sulfosalicilic), soluţii concentrate de săruri (sulfat

de sodiu, sulfat de amoniu, etc.), alcooli (metanol, etanol, etc.), acetonă, ioni de metale

grele (săruri de argint, mercur, cupru, plumb), încălzire. Precipitarea poate fi reversibilă

sau ireversibilă.

Precipitarea salină

Principiu:

Proteinele sunt macromolecule hidratate în soluţie apoasă. Dacă sărurile

metalelor uşoare sau de amoniu (sulfat de amoniu, sulfat de sodiu, clorură de sodiu,

sulfat de magneziu) adăugate soluţiilor proteice ating o anumită concentraţie,

deshidratează particulele proteice, care precipită. Precipitatul de proteină obţinut prin

precipitare salină poate fi redizolvat prin micşorarea concentraţiei sării (prin dializă,

diluare), deci este o precipitare reversibilă.

Deoarece proteinele precipită la concentraţii diferite de săruri, precipitarea salină

(salting-out) poate fi folosită şi pentru fracţionarea proteinelor. Astfel globulinele

58

precipită în soluţii semisaturate de sulfat de amoniu, iar albuminele numai în soluţii

saturate de sulfat de amoniu.

Reactivi: - Sol. de proteină (ser sanguin uman, bovin sau cabalin)

- Sol. saturată de (NH4)2SO4

- (NH4)2SO4 solid

- NaCl solid

- MgSO4 solid

- Acid acetic glacial

Mod de lucru:

Într-o eprubetă se toarnă 3 ml soluţie de proteină. Se adaugă acelaşi volum de

soluţie saturată de sulfat de amoniu. Astfel obţinem o soluţie semisaturată de

(NH4)2SO4. După câteva minute precipită globulinele. Precipitatul se separă prin

filtrare. Filtratul conţine albuminele. Se pune în filtrat sulfat de amoniu solid până la

saturare (când noi cantităţi de sare nu se mai solvă). În această soluţie vor precipita

albuminele.

În două eprubete se toarnă câte 3 ml soluţie de proteină. Într-una din eprubete se

adaugă NaCl, în cealaltă MgSO4, până la saturare. După câteva minute în ambele

eprubete precipită globulinele. Precipitatul se filtrează. Filtratul conţine albuminele

deoarece sărurile adăugate nu precipită albuminele în soluţie neutră. Filtratul se

acidulează cu câteva picături de acid acetic glacial. În această soluţie slab acidă

precipită albuminele.

Precipitarea cu ionii metalelor grele

Principiu:

Proteinele cu sărurile metalelor grele (plumb, cupru, mercur, argint, etc.)

formează combinaţii greu solubile. Precipitarea se produce deja la concentraţii mici de

săruri şi precipitatul obţinut în acest caz nu se mai dizolvă după micşorarea

concentraţiei sării prin diluare sau dializă, deci este o precipitare ireversibilă.

Reactivi: - Sol. de HgCl2 10%

- Sol. de CuSO4 10%

- Sol. de Pb(CH3COO)2 10%

- Sol. de AgNO3 5%

59

Mod de lucru:

În 4 eprubete se toarnă câte 1 ml soluţie de proteină. În fiecare eprubetă se

adaugă picătură cu picătură soluţie din fiecare reactiv. În toate eprubetele se formează

precipitate. Acetatul de plumb şi sulfatul de cupru nu trebuiesc adăugate în exces,

deoarece precipitatul format se solvă în exces de reactiv (salting-in).

Precipitarea cu acizii minerali

Reactivi: - HNO3 conc.

- HCl conc.

- H2SO4 conc.

Mod de lucru:

În 3 eprubete se toarnă câte 1 ml de acid azotic, clorhidric respectiv sulfuric. În

fiecare eprubetă se stratifică cu precauţie câte 1 ml din soluţia de proteină. La suprafaţa

de separare dintre cele două soluţii se obţin precipitate albe sub formă de disc (inel).

Apoi eprubetele se agită. Precipitatele formate se dizolvă în exces de acid clorhidric şi

sulfuric, dar nu şi în exces de acid azotic. Precipitarea proteinelor cu acid azotic

concentrat serveşte pentru punerea în evidenţă a proteinelor din urină patologică.

Precipitarea cu acizi organici

Acidul tricloracetic şi acidul sulfosalicilic sunt reactivii specifici pentru

precipitarea proteinelor. Acidul tricloracetic este foarte adecvat pentru deproteinizarea

lichidelor biologice (de ex. ser sanguin), deoarece precipită numai proteinele din soluţie,

nu şi produşii de degradare ai acestora. Se mai foloseşte ca precipitant amestecul de acid

picric cu acid citric (reactiv Esbach), util în determinarea cantitativă a proteinelor.

Reactivi: - Sol. de acid sulfosalicilic 20%

- Sol. de acid tricloracetic 10%

- Sol. de acid picric 1,2%

Mod de lucru:

Într-o eprubetă la 1-2 ml soluţie de proteină se adaugă câteva picături de reactiv.

Se formează un precipitat abundent.

60

Precipitarea prin încălzire

Principiu:

Proteinele la încălzire coagulează. Coagularea este cea mai rapidă la punctul

izoelectric. În mediu puternic acid sau bazic proteinele nu coagulează la încălzire,

deoarece sarcina electrică le conferă o mai mare stabilitate în stare dizolvată.

Reactivi: - Sol. de CH3COOH 1%

- Sol. de CH3COOH 10%

- Sol. de NaOH 10%

- NaCl crist.

Mod de lucru:

În 5 eprubete se toarnă câte 1-2 ml soluţie de proteină. Se adaugă reactivi

conform tabelului.

Nr. eprubetei Adaos 1. …………………………. - 2. …………………………. 2-3 pic. acid acetic 1% 3. …………………………. 10-15 pic. acid acetic 10% 4. …………………………. 10-15 pic. acid acetic 10% + NaCl (câteva cristale) 5. …………………………. 10-15 pic. NaOH 10%

Aceste eprubete se supun încălzirii şi se observă apariţia precipitatelor.

Dozarea aminoacizilor monoamino-monocarboxilici prin metoda Sörensen

Principiu:

Aminoacizii au o structură amfiionică. Din această cauză soluţiile lor, datorită

capacităţii de tamponare, micşorează saltul de pH la adaosul de acid sau bază sare. În

consecinţă aminoacizii nu pot fi titraţi prin metode acidimetrice sau alcalimetrice

curente.

Adăugându-se soluţiei de aminoacid un exces de formaldehidă, se blochează

gruparea amoniu. Rezultă o bază Schiff, care se comportă ca un acid slab (carboxilic).

Aciditatea grupării carboxilice se titrează cu NaOH, în prezenţa fenolftaleinei ca

indicator.

R - CH - COO- + H2C = O R - CH - COO- + H2O + H+ I I NH3

+ N = CH2

Bază Schiff

61

R - CH - COO- + H+ + NaOH R - CH - COO-Na+ + H2O I I N = CH2 N = CH2 Reactivi: - Sol. de NaOH N/10 cu factorul FNaOH

- Fenolftaleină 0,1% în soluţie alcoolică

- Formaldehidă (substanţa este foarte reactivă, se autooxidează,

deci conţine şi acid formic ca impuritate. Prezenţa acestui acid ar

da eroare la titrare. Din acest considerent formaldehida este

alcalinizată cu NaOH în prezenţă de fenolftaleină până la virajul

indicatorului).

Mod de lucru:

În 3 baloane Erlenmeyer se măsoară câte 10,0 ml soluţie probă de aminoacid

(pH ≈ 6). Trebuie adusă şi această soluţie la pH = 9, de aceea se pun câte 3 picături de

fenolftaleină şi se adaugă picătură cu picătură sol. de NaOH până la apariţia culorii roz.

Acest volum de NaOH folosit nu se ia în considerare la calcul. În fiecare balon se

adaugă câte 2 ml soluţie de formaldehidă, sub acţiunea căreia soluţia devine acidă (pH ≈

3). Astfel dispare culoarea roz, soluţia devenind incoloră. Fiecare soluţie se titrează cu

soluţie de NaOH până la virajul indicatorului. Variaţiile de pH sunt reprezentate pe

următoarea schemă:

pH 14 9 6 3 0

Alcalini-zare

+CH2O Titrare cu NaOH

62

Calcul:

Întrucât se lucrează cu un aminoacid oarecare monoamino-monocarboxilic sau

cu un amestec de aminoacizi monoamino-monocarboxilici, nu putem folosi greutatea

moleculară la calcul. Din acest considerent rezultatul se exprimă în mg % azot alfa-

aminic sau în mmoli N aminic/l. Dacă volumul mediu de titrare a probelor se notează cu

Vm, calculul este următorul:

1 ml NaOH 0,1 N . . . . . . . . . . . .1,4 mg N aminic

Vm × FNaOH . . . . . . . . . . . . . . X mg . . . . . . 10 ml probă

Y mg . . . . . .100 ml probă

100 Y = 10 × X mg N % = × X mmoli N aminic/l. 14

Identificarea nucleoproteinelor

Principiu:

Scheletul structural al acizilor nucleici este construit din baze azotate, pentoze şi

acid fosforic. Prin hidroliză acidă aceste aceste subunităţi se eliberează şi pot fi puse în

evidenţă

Reactivi: - Sol de H2SO4 5%

- Sol. de NH3 10%

- HNO3 conc.

- Sol. de molibdat de amoniu

- Sol. amoniacală de AgNO3

- Reactiv Bial

- HCl conc.

Modul de lucru:

a) Hidroliza: într-un balon cu fund rotund se introduc 5-10 g drojdie de bere, la

care se adaugă 40 ml H2SO4 5%. Se astupă balonul cu un dop prevăzut cu un refrigerent

ascendent şi se fierbe 60-90 minute. O parte din hidrolizat se filtrează şi se împarte în 3

eprubete în care se identifică părţile componente ale acizilor nucleici.

b) Identificarea pentozelor: în prima eprubetă se adaugă 10 picături reactiv Bial

şi 2 ml HCl conc. Se agită conţinutul eprubetei se astupă cu un dop de vată şi se lasă pe

o baie de apă ce fierbe timp de 10 minute. Conţinutul eprubetei se colorează în albastru

verde.

63

c) Identificarea H3PO4: In a doua eprubetă se adaugă soluţie de NH3 până la

reacţia slab alcalină, apoi câteva picături de HNO3 conc., 1 ml soluţie de molibdat de

amoniu. La încălzire se obţine un precipitat galben de fosfomolibdat de amoniu.

d) Identificarea nucleobazelor: în a treia eprubetă se adaugă soluţie de NH3 până

la reacţia alcalină, se filtrează şi se adaugă cca. 1 ml soluţiei amoniacală de AgNO3.

După câtva timp se formează un precipitat floconos galben-brun de săruri ale bazelor

purinice. Identificarea bazelor purinice din hidrolizat se poate face şi cu ajutorul reacţiei

murexidului. Murexidul este un colorant provenit din produsul de oxidare cu HNO3

conc. a bazelor purinice şi amoniac.

Modul de lucru:

1-2 picături din soluţia de analizat se usucă pe o placă de porţelan pe baie de

apă. Cu baghetă se adaugă o picătură de HNO3 conc. După evaporare se atinge cu o

baghetă înmuiată în amoniac. Apare o coloraţie roşie care se schimbă spre albastru

violaceu când se adaugă o picătură de NaOH.

Vitamine

Identificarea vitaminelor prin metoda cromatografică

Principiu:

Cromatografia este o metodă fizico-chimică de separare a componenţilor unui

amestec, care utilizează fenomenele ce au loc la interfaţa a două faze. Ea poate fi

folosită în scopuri analitice sau preparative. Pe suprafaţa dintre două faze dintre care

una este staţionară (faza solidă sau lichidă adsorbită pe un material poros) şi una

mobilă (solvent lichid sau gaz) pot avea loc fenomene de adsorbţie, schimb de ioni sau

partiţie între două faze lichide nemiscibile.

Faza staţionară la cromatografia în strat subţire este constituită dintr-un strat de

silicagel sau oxid de aluminiu în stare dispersă depus pe o lamă de sticlă. Developarea

se face cu un solvent apolar (benzen, toluen, petrol) sau un amestec de solvenţi apolari.

Dacă substanţele cromatografiate sunt incolore, decelarea petelor (spoturilor)

formate pe placa cromatografică se face cu ajutorul unor reactivi care dau reacţii de

culoare cu substanţele amintite.

Identificarea componenţilor se poate face:

64

- prin decuparea spoturilor şi analiza lor ulterioară prin metode chimice sau fizice.

- prin aplicarea simultană pe placă a substanţelor etalon, spotul format de o anumită

substanţă cunoscută se va găsi după developare la aceeaşi distanţă de punctul de start ca

şi acela dat de componentul identic din amestec.

- prin determinarea valorii (raportul dintre distanţa parcursă de spot şi de frontul

solventului în acelaşi interval de timp) Rf este caracteristic pentru fiecare substanţă în

condiţii de lucru standardizate.

Modul de lucru:

a) Pregătirea plăcii cromatografice

Se prepară prin agitarea silicagelului în alcool etilic (2 g silicagel, 6 ml alcool) o

suspensie care se toarnă pe suprafaţa unei plăci de sticlă. Prin mişcarea plăcii se întinde

cât mai uniform suspensia şi se continuă mişcarea plăcii până când prin evaporarea

alcoolului mobilitatea suspensiei scade şi suspensia rămâne nemişcată. După uscarea

completă a plăcii laturile longitudinale se şterg pe o lăţime de 0,5 cm.

b) Aplicarea amestecului de analizat

La o distanţă de 1 cm de la unul din capetele plăcii, cu ajutorul unei capilare se

aplică soluţia de cercetat precum şi soluţiile etalon din vitamine urmărite. Diametrul

maxim admis al probelor aplicate este cca. 5 mm. Cantitatea minimă de vitamină

aplicată este aproximativ 3 μg.

c) Developarea

Plăcile se introduc într-un vas cu toluen cu capătul pe care s-au aplicat soluţiile,

aşezat în solvent. Placa în timpul developării are o poziţie înclinată la 20-30º faţă de

orizontală. Solventul migrează prin capilaritate de-a lungul stratului de adsorbant.

Pentru a împiedica evaporarea, cromatografia se face într-o atmosferă saturată cu

vaporii solventului, adică vasul este ermetic închis.

d) Localizarea petelor

După uscarea plăcilor, componentele migrate sunt evidenţiate cu ajutorul unui

strat subţire de H2SO4 98% turnat pe placă cu ajutorul unei pipete în aceeaşi parte în

care au fost aplicate probele. Poziţia plăcii trebuie să asigure deplasarea acid sulfuric în

sensul în care s-a făcut developarea. Vitaminele liposolubile în contact cu acid sulfuric

se colorează astfel: vitamina A – albastru-violet, β - carotenul – albastru, vitamina D2 –

galben-portocaliu, vitaminele E, K1, K2, K3 – brun.

65

Dozarea iodometrică a acidului ascorbic din urină

(metoda Palladin)

Principiu:

Acidul ascorbic este oxidat în mediu acid de I2 la acid dehidroascorbic

Iodul necesar oxidării rezultă din interacţiunea KIO3 cu KI în mediu acid.

După oxidarea completă a vitaminei C iodul în exces dă o culoare albastră în

prezenţa amidonului.

Reactivi: - soluţie HCl 2%;

- soluţie KI 0,1N;

- soluţie KIO3 0,004N;

- soluţie amidon 0,5%.

Modul de lucru:

Se cântăreşte 1 g din produsul vegetal de analizat (ace de brad, fructe de măceşe,

etc.) şi se triturează cu o soluţie de HCl 2% şi 5g nisip de cuarţ spălat prealabil cu HCl.

Triturarea începe cu o mică cantitate de HCl. După aceea masa omogenă se pune într-un

vas de 50ml, se spală mojarul cu acid clorhidric 2% şi după introducerea soluţiei de

spălare în vasul cotat, se aduce la semn cu HCl 2%. Lichidul se lasă să se limpezească,

decantează şi se filtrează prin vată. Primii 10ml se aruncă.

Când se lucrează cu urină se iau 10ml urină în vasul gradat, se aduce la cotă cu

HCl 2%, se amestecă şi se filtrează.

10 ml din filtrat se pun într-un flacon conic, se adaugă 30ml apă distilată, 5ml

soluţie de iodură de potasiu şi 5ml HCl 2%. Se titrează cu o soluţie de iodat de potasiu

0,004N folosind ca indicator amidon. Culoarea albastră trebuie să se menţină 30

secunde.

OC

HC

+ I2

HO C

CHO

HO CH

CH2OH

O O

CH2OH

CHHO

C

C

HC

CO

O

O + 2HI

66

Calculul: se efectuează ţinând cont de faptul că 1ml soluţie KIO3 0,004N

corespunde la 0,352mg acid ascorbic (M. acid ascorbic =176). Rezultatul se raportează

la 100g produs analizat sau la cantitatea de urină eliminată in 24 ore.

Valori normale 50-150 μmol/zi (10-30mg/zi). Variaţiile lor nu sunt concludente

din punct de vedere clinic. De aceea se foloseşte proba încărcării cu acid ascorbic.

Se administrează intravenos 1000mg acid ascorbic şi după ce se colectează urină

timp de 5 ore, adăugând la fiecare fracţiune de urină câte 10% acid acetic glacial.

În mod normal se elimină in 5 ore cel puţin 400mg acid ascorbic. O eliminare

mai scăzută pledează pentru hipovitaminoză sau avitaminoză C.

Enzime

Introducere

Enzimele, biocatalizatori proteici, sunt produse de materia vie şi prezenţa lor

este necesară pentru desfăşurarea reacţiilor chimice în toate sistemele biologice.

Enzimele au şi însuşiri ale catalizatorilor utilizaţi în reacţiile chimice din lumea nevie.

Ele sunt însă superioare acestor catalizatori în mai multe privinţe:

a) Asigură reacţiilor chimice pe care le catalizează viteze cu câteva ordine de

mărime mai mari,

b) Reacţiile pe care le catalizează au loc în condiţii blânde: temperatură sub

50°C, presiune atmosferică, pH în jurul valorii 7, forţă ionică moderată. Comparativ,

catalizatorii chimici acţionează la temperaturi ridicate, presiuni mari şi valori extreme

de pH;

c) Au specificitate foarte mare ceea ce asigură ca în reacţiile pe care le

catalizează să nu participe decât substraturile pentru care enzimele sunt specifice.

Multe enzime au şi însuşiri neîntâlnite la catalizatorii chimici cum sunt:

a) Activitatea lor poate fi reglată (mărită sau micşorată) de anumiţi efectori;

b) Catalizează reacţii endergonice imposibile d.p.d.v. termodinamic prin

transferul energiei libere necesare de la reacţii exergonice.

Cinetica enzimatică studiază viteza reacţiilor catalizate de enzime în funcţie de

concentraţia substratului [S], de concentraţia enzimei [E] şi de influenţele unor factori

fizico-chimici cum sunt: temperatura, pH-ul, cofactori, etc. Concepţia unanim admisă în

enzimologie că formarea din substrat a produsului de reacţie implică existenţa

complexului enzimă-substrat (ES), redată prin ecuaţia:

67

K1 K3 E + S ⇔ ES ------> E + P,

K2 a fost statuată în primul rând ţinând cont de alura dependenţei vitezei reacţiilor

catalizate de enzime de concentraţia de substrat (Leonor Michaelis şi Maud Menten,

1913).

Din punct de vedere al localizării enzimele se clasifică în:

Enzimele secretate cu rol activ în plasmă, ca de exemplu:

a) enzimele plasmatice funcţionale, produse în special în ficat (ceruloplasmina)

b) enzimele coagulării, lipoproteinlipaza (LPL), lecitin-colesterol-aciltransferaza

(LCAT).

Nivelul lor plasmatic scade cu lezarea celulelor producătoare.

Enzimele secreto-excretate, provenind din glandele exocrine şi pancreas. Ele

sunt excretate şi acţionează la nivelul tubului digestiv, de exemplu amilaza, lipaza,

tripsina. Activităţile lor cresc în plasmă prin lezarea celulelor de origine sau prin

prezenţa unui obstacol la nivelul căilor excretorii precum şi prin creşterea

permeabilităţii membranei celulelor secretorii;

Enzimele celulare cu loc de acţiune în celulele din care provin, a căror activitate

plasmatică creşte prin lezarea celulelor de origine. Exemple sunt glutamic-oxalacetic

transaminaza (GOT), glutamic-piruvic transaminaza (GPT), lactat dehidrogenaza

(LDH), fosfataza alcalină şi acidă, creatin kinaza (CK), etc.

Concentraţia majorităţiilor enzimelor celulare este constantă în timp. Fac

excepţie enzimele inductibile/represibile şi enzimele plasmatice funcţionale intracelular

cum ar fi CK (creatin kinaza), GOT, LDH, GPT, GDH (glutamat dehidrogenaza), γGT

(γ-glutamil-transaminaza), SDH (sorbitoldehidrogenaza), OTC (ornitin transcarba-

milaza) fosfatazele acidă şi alcalină, ale căror concentraţii cresc sau scad în anumite

stări patologice (leziuni de ţesut).

Din punct de vedere medical, enzimologia contribuie astăzi în măsură

hotărâtoare la cunoaşterea cauzelor a numeroase boli, diagnosticul şi urmărirea evoluţiei

acestora, elaborarea pe baze ştiinţifice a medicamentelor.

68

Influenţa concentraţiei substratului asupra

vitezei de reacţie enzimatică

Concentraţia substraturilor celor mai multe enzime variază destul de mult în

funcţia de starea metabolică a ţesutului şi de alţi factori. Dependenţa vitezei de reacţie

de concentraţia substratului constituie aspectul cel mai important al cineticii enzimatice.

Una din principalele mărimi ale cineticii enzimatice este activitatea enzimatică.

Pentru exprimarea activităţii enzimatice se folosesc în prezent mai multe sisteme

de unităţi ceea ce îngreunează interpretarea rezultatelor. Uniunea Internaţională de

Biochimie recomandă exprimarea activităţii enzimelor în mod unitar, în ”unităţi

internaţionale” (UI sau U). Unitatea internaţională de activitate enzimatică reprezintă

cantitatea de enzimă care transformă un μmol de substrat într-un minut, la 25 ºC, în

condiţii optime (concentraţia maximală a substratului, forţa ionică a tamponului, pH

optim).

1UI = 1 μmol substrat /min.

Conform SI unitatea de măsură a activităţii enzimatice este katalul.

1 katal = 1 mol substrat / sec

Se folosesc subunităţile ( m, μ, n, p) katalului. În determinările pe lichide

biologice se raportează activitatea enzimei la 1000 ml (vezi tabelul „limitele valorilor

normale. Se foloseşte de asemenea exprimarea şi în miliunităţi internaţionale pe

mililitru (mU/ml) ceea ce de fapt nu modifică valorile numerice respective. Chiar şi

atunci când se utilizează UI, apar diferenţe ale valorilor limitelor normale, datorită

varietăţii metodelor folosite pentru determinări.

Principiu:

Pentru o cantitate dată de enzimă, viteza,v, a reacţiei enzimatice creşte odată cu

creşterea concentraţiei substratului [S], până când întreaga cantitate de enzimă se

saturează cu substrat. Se atinge astfel viteza

maximă,vmax, care nu va fi depăşită chiar dacă

în continuare concentraţia substratului va

creşte, în cazul în care substratul în exces nu

inhibă propria enzimă. Acest principiu este

descris de ecuaţia Michaelis-Menten (pentru

deducere vezi cursurile de biochimie):

69

[ ][ ]SK

SvvM +

= max unde KM, constanta lui Michaelis.

Reprezentarea grafică a lui v în funcţie de [S] (temperatura, pH-ul şi [E] fiind

constante) este o curbă cu alură hiperbolică. Din analiza curbei reiese că v creşte liniar

cu creşterea [S] numai pentru valori mici ale acesteia, apoi creşterea se face tot mai lent

pentru ca la concentaţii mari de substrat, viteza reacţiei să rămână constantă. Fiecare

enzimă se caracterizează prin valorile particulare KM şi vmax ale lor.

Determinarea constantei lui Michaelis pentru urează

Principiu:

În determinarea experimentală se va folosi ca substrat ureea şi ca enzimă ureaza

din boabe de soia. Ureaza catalizează următoarea reacţie:

Viteza de reacţie este proporţională cu cantitatea de amoniac eliberat în unitatea de timp

(1min). Aceasta se determină prin titrare cu o soluţie de HCl cu factor cunoscut.

HCl + NH3 ---------> NH4Cl

Cunoscând concentraţiile substratului din probe care se consideră constante pe parcursul

fazei de incubaţie şi calculând vitezele de reacţie, exprimate în μmoli uree transformaţi

într-un minut, pe baza datelor titrimetrice se face reprezentarea grafică (v, [S]) din care

se poate calcula KM pentru urează.

Reactivi: - Soluţie de uree 0,1 M - Soluţie de uree 1,0 M

- Soluţie de urează: fie o soluţie de enzimă cristalizată, fie o

suspensie de făină de soia. Se păstrează în frigider.

- Soluţie de tampon fosfat 0,1 M, pH=7

- Soluţie de CuSO4 5%

- Indicator roşu de metil 0,1% în soluţie alcoolică

O=CNH2

H2O CO2+ 2NH3ureazã

+NH2

70

Modul de lucru:

Conform tabelului se prepară o serie de 6 probe introducându-se în toate aceeaşi

cantitate de enzimă şi soluţii de concentraţii crescătoare ale substratului. În tabel vor fi

consemnate pe baza datelor experimentale (titrimetrice) şi a efectuării calculelor,

valorile ai , m şi vi (i=1,6).

În proba martor se inactivează enzima, înainte de a se introduce substratul,

adăugând 5 picături soluţie CuSO4 5%. Reacţiile chimice (în cazul probelor 1-6),

declanşate în momentul amestecării enzimelor cu substratul, sunt lăsate să se

desfăşoare timp de 25 min., apoi sunt întrerupte prin adaosul inhibitorului, adică a câte 5

picături soluţie CuSO4. Se măsoară în fiecare probă cantitatea de NH3 format, prin

titrarea cu soluţie de HCl în prezenţa indicatorului roşu metil (3 picături) care virează de

la galben la roşu. Culoarea galben dată de indicator, înaintea virajului, se datorează

amestecului coloristic cu culoarea albastră dată de ionii Cu2+ hidrataţi.

Calculul:

1mol HCl........................................1 mol NH3..................1/2moli uree

1000 ml HCl N/20............................................. ........._____1_____moli uree 2.20

(ai-m) ml..............................................................................xi____________

xi = (ai-m)•25 μmoli uree transformaţi în 25 minute

vi = (ai-m)•25/25 = ai-m μmoli uree/ 1 min.

Reprezentarea grafică

Pe un sistem rectangular de axe de coordonate trasat pe hârtie milimetrică se

aplică pe ordonată o scară a valorilor vitezelor de reacţie. Pe abscisă se trec

concentraţiile molare ale ureei din cele şase probe menţionate în tabel. Se reprezintă

grafic punctele (vi, [S]). Curba hiperbolică se trasează printre punctele experimentale.

Porţiunea dreaptă, paralelă cu abscisa (corespunzătoare saturării E cu S), se prelungeşte

până la intersecţia cu ordonata, intersecţia corespunzând valorii vmax. La valoarea vmax/2,

se duce o dreaptă paralelă cu abscisa până la intersecţia cu curba şi de la această

intersecţie se duce o dreaptă paralelă cu ordonata până la intersecţia cu abscisa. Acest

punct corespunde valorii KM (concentraţia de substrat corespunzătoare semi-vitezei

maxime). Ea este într-o primă aproximaţie constanta de disociere a complexului

enzimă-substrat (urează-uree). Deci, se stabilesc (1) vmax, (2) vmax/2 şi (3) KM.

71

72

Interpretarea rezultatelor

Valorile mari ale KM corespund unei legături slabe între E şi S iar valorile mici

ale KM corespund unei legături puternice între E şi S. Valorile lui KM pentru diverse

enzime sunt cuprinse între 10-1- 10-6 moli/litru. În cazul ureazei, KM∼10-2 moli/litru

ceea ce plasează această enzimă în rândul celor cu afinitate (constantă de stabilitate a

complexului E-S) mică faţă de substrat.

Determinarea activităţii catalazei sanguine

Principiu: Catalaza din sânge este o oxidoreductază foarte activă, care

descompune apa oxigenată, în apă şi oxigen molecular: 2 H2O2 → 2 H2O + O2

Activitatea ei se determină prin dozarea apei oxigenate rămasă nedescompusă

într-un sistem cu concentraţia iniţială a H2O2 cunoscută. Este o metodă indirectă:

catalaza dintr-un microlitru de sânge acţionează asupra unei cantităţi determinate de apă

oxigenată; excesul de apă oxigenată se dozează prin titrare cu KMnO4 în mediu acid;

din diferenţă se calculează numărul catalazic. +7 -1 +2 0

2 KMnO4 + 5 H2O2 + 3 H2SO4 → 2 MnSO4 + K2SO4 + 8 H2O + 5 O2

+7 + 5e +2 Mn ―――→ Mn -2 - 2e 0 O2 ―――→ O2

Reactivi: - Sânge diluat 1‰ (v/v)

- Soluţie de H2O2 2%

- Soluţie de H2SO4 20%

- Soluţie de KMnO4 N/10 cu factorul FKMnO4 cunoscut

Mod de lucru: În patru flacoane Erlenmeyer se pipetează: Proba 1 Proba 2 Martor 1 Martor 2

Apă distilată (ml) 2 2 2 2 Sânge diluat (ml) 1 1 1 1

- - se fierbe şi se răceşte Apă oxigenată (ml) 2 2 2 2

Repaus 30’ la temperatura camerei Acid sulfuric (ml) 5 5 5 5

Titrare cu KMnO4 până la roz slab stabil (ml)

b1

b2

a1

a2

Media =b1 +b2 / 2 = bm Media =a1 +a2 / 2 = am

x 2 x 5

73

Calculul:

Volumul mediu de titrare pentru probe (bm) este mai mic decât cel pentru martori (am) deoarece catalaza descompune o parte din apa oxigenată din probe.

1ml KMnO4 N/10----------------------------------------------------------1,7 mg H2O2 (am-bm)FKMnO4 --------------------------------------------------------------x x = (am-bm)FKMnO4 • 1,7 mg H2O2 descompuse de catalaza din 1 ml sânge diluat

1/1000 (1μl sânge integral). Această valoare se numeşte număr catalazic.

Interpretarea rezultatelor

Valorile normale ale numărul catalazic (cifre catalazice) sunt cuprinse înte 14-18.

Acatalazemia este o deficienţă înnăscută, a catalazei din eritrocite şi alte ţesuturi,

având ca principal simptom gangrena cavităţii bucale. Dacă se face concomitent şi

hemograma, se poate calcula şi Indicele catalazic = (am-bm)FKMnO4 • 1,7 / nr. globule

roşii (în milioane).

Indicele catalazic este cel care are valoare de diagnostic. Este scăzut în cancer,

anemie, caşexie şi în 80 % din afecţiunilor hepatice.

Determinarea activităţii transaminazelor

(metoda colorimetrică cu 2,4-dinitrofenilhidrazină)

Principiu:

Transaminazele catalizează reacţia de transfer a grupării amino de la un alfa-

aminoacid la un alfa-cetoacid. Transaminazele cu cea mai mare importanţă clinică sunt:

glutamic-oxalacetic-transaminaza (GOT, aspartat aminotransferaza-AST) şi glutamic-

piruvic-transaminaza (GPT, alanin aminotransferaza-ALT). Acestea catalizează

următoarele procese reversibile:

oxaloacetat

aspartat

glutamat

α cetoglutarat

piruvat

alanină

GOT(AST)

GPT(ALT)

74

GOT este o enzimă localizată în proporţie de 60% în citoplasmă şi 40% în

mitocondrii, în special în muşchiul scheletic, miocard şi ficat. În reacţia catalizată de

GOT se foloseşte ca substrat amestecul aspartat-α-cetoglutarat din care rezultă

oxalacetat şi glutamat. Oxalacetatul se decarboxilează spontan trecând în piruvat.

Piruvat rezultă şi din reacţia catalizată de GPT având ca substrat amestecul

alanina-α-cetoglutarat Piruvatul rezultat din aceste reacţii reacţionează cu 2,4-dinitro-

fenil-hidrazina în mediu alcalin dând dinitro-fenil-hidrazona corespunzătoare de culoare

roşie, care se determină fotometric:

Datorită faptului că şi ceilalţi alfa-cetoacizi prezenţi (alfa-cetoglutarat) formează

fenil-hidrazone, cu absorbţii la diferite lungimi de undă, se măsoară extincţia dinitro-

fenil-hidrazonei piruvatului la lungimea de undă de 520 nm unde fenil-hidrazona alfa-

cetoglutaratului absoarbe slab.

Intensitatea coloraţiei produse este proporţională cu intensitatea activităţii

enzimei. Activitatea transaminazelor se calculează în funcţie de cantitatea de acid

piruvic care se formează într-un minut.

Reactivi: - Substrat GOT: 1,50 g K2HPO4, 0,20 g KH2PO4, 0,039 g alfa-

cetoglutarat de sodiu (sau 0,030 g acid alfa-cetoglutaric) şi 1,57 g

aspartat de sodiu (sau 1,32 g acid aspartic) se dizolvă în aproximativ

80 ml apă bidistilată. Se ajustează cu NaOH 0,4N pH-ul soluţiei la

7,4 apoi se completează volumul la 100 ml cu apă bidistilată.

- Substrat GPT: 1,50 g K2HPO4, 0,20 g KH2PO4, 0,030 g acid alfa-

cetoglutaric (sau 0,039 g alfa-cetoglutarat de sodiu) şi 1,78 g alanină

se dizolvă în aproximativ 80 ml apă bidistilată, se aduce pH-ul la 7,4

cu NaOH 0,4N, apoi se completează la 100 ml cu apă bidistilată.

- Soluţie de 2,4-dinitro-fenil-hidrazină 1 mM în HCl 2M: se dizolvă

19,8 mg dinitro-fenil-hidrazină în 10 ml HCl (d = 1,19 g/cm3) şi se

completează la 100 ml cu apă bidistilată.

75

- Soluţie standard de piruvat de sodiu 2 mM: se dizolvă în 100 ml apă

bidistilată 22 mg piruvat de sodiu (1 ml soluţie conţine 2 µmoli

piruvat). Se adaugă 0,3 ml cloroform pentru conservare.

- Soluţie NaOH 0,4N

Modul de lucru: Atât pentru GOT cât şi pentru GPT se pregătesc câte trei eprubete: probă (P),

standard (S) şi blanc (B).

GOT GPT

P S B P S B Sol.substrat GOT (ml) 0,5 0,5 0,5 - - - Sol.substrat GPT (ml) - - - 0,5 0,5 0,5

Se incubează 5 minute la 37°C Ser (ml) 0,1 - - 0,1 - - Sol.standard PIR (ml) - 0,1 - - 0,1 - Se incubează la 37°C 60 minute 30 minute Sol.2,4-dinitrofenilhidrazină (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Ser (ml) - - 0,1 - - 0,1 Sol.NaOH 0,4 N (ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

Se omogenizează conţinutul eprubetelor şi după 5 minute se citeşte extincţia

probelor (EP) şi a standardului (ES) faţă de blanc, la 520 nm, în cuva de 1 cm.

Calcul:

Ştiind că soluţia standard conţine 0,2 μmoli piruvat /0,1 ml se calculează

cantitatea de piruvat rezultat din reacţia pentru fiecare enzimă şi se exprimă activitatea

enzimatică în μmoli piruvat format/min./1000 ml ser (în condiţiile de lucru) şi se

notează cu X:

Pentru GOT: X=(EP/EB) • 0,2 • (1/60) • (1/0,1) • 1 000 μmoli piruvat

Pentru GPT: X=(EP/EB) • 0,2 • (1/30) • 1 000 μmoli piruvat

Activitatea enzimatică reală nu este dată direct de valoarea obţinută colorimetric,

deoarece hidrazona colorată se formează şi cu alfa-cetoglutarat din substrat, iar pe de

altă parte, condiţiile nu sunt cele optime (37°C în loc de 25°C şi prezenţa alfa-

cetoglutaratului care formează hidrazonă). S-au calculat tabele de corecţie prin

76

comparaţie cu datele obţinute cu metoda de referinţă, care exprimă activitatea

enzimatică reală, măsurând spectrofotometric în UV transformarea NADH + H+ in

NAD+, în prezenţa enzimelor indicatoare: malat-dehidrogenaza (MDH) în amestec cu

GOT şi lactat-dehidrogenaza (LDH) în amestec cu GPT.

Reacţiile enzimatice sunt următoarele:

GOT

alfa-cetoglutarat + L-aspartat --------------> L-glutamat + oxalacetat

MDH

oxalacetat + NADH + H+ ----------------> L-malat + NAD+

GPT

alfa-cetoglutarat + L-alanina --------------> L-glutamat + piruvat

LDH

piruvat + NADH + H+ ----------------> L-lactat + NAD+

Din tabelul de corecţie se citeşte activitatea enzimatică reală (determinată prin metoda

enzimatică) exprimată în Unităţi Internaţionale (UI = μmoli/min./l, 25°C) care

corespunde valorilor X calculate.

UI UI UI UI

X GOT GPT X GOT GPT X GOT GPT X GOT GPT 2 2 1 26 23 9,5 54 60 23 80 38 4 3 2 28 25 10 56 24 82 39 6 5 2,5 30 27 11 58 25 84 40 8 6 3 32 29 12 60 26 86 42 10 7 4 34 31 13 62 27 88 44 12 9 4,5 36 33 14 64 29 90 46 14 11 5 38 35 15 66 30 92 48 16 13 6 40 37 16 68 31 94 50 18 15 7 42 39 17 70 33 96 52 20 17 7,5 44,46 41,44 18,19 72 34 98 54 22 19 8 48 47 20 74 35 100 56 23 20 8,5 50 51 21 76 36 102 60 24 21 9 52 55 22 78 37

Observaţii:

1. Dacă activitatea enzimatică depăşeşte 60 UI se va repeta determinarea cu incubaţie

scurtă: 20 de minute pentru GOT si 10 minute pentru GPT. Rezultatele obţinute se

vor înmulţi cu 3. Este de preferat ca în locul scurtării timpului de incubaţie să se

77

facă diluţii ale serului 1:5, 1:10, 1:20 în apă distilată şi se reia cu fiecare diluţie

tehnica de lucru de la început. La calcul se ţine seama de diluţie.

2. Sticlăria utilizată trebuie să fie perfect curată, spălată în final cu multă apă distilată,

deoarece urme de detergenţi pot inhiba considerabil activitatea enzimatică.

Interpretarea valorilor obţinute

Valori normale: GOT: Adulţi: 2-20 UI. Copii sub 3 luni: până la 40 UI

GPT: Adulţi: 2-16,5 UI. Copii până la 5 ani: 0,2-13 UI

Valori patologice: În cazul leziunilor celulare mai uşoare creşte activitatea GPT,

ea fiind o enzimă citoplasmatică, iar în cazul leziunilor mai grave creşte şi activitatea

GOT (GOT este prezentă şi în microsomi)

GOT : - creşteri marcate ( 10-100 ori ) în: infarct miocardic, hepatită virală acută,

necroza toxică a ficatului

- creşteri moderate în: hepatite cronice, icter mecanic, mononucleoza infecţioasă,

anemii hemolitice, boli ale musculaturii striate

GPT: - creşteri marcate ( ~ 100 ori ) în: hepatita virală acută, necroza toxică a ficatului

- creşteri moderate în: hepatite cronice, ciroză, mononucleoza infecţioasă,

hepatita de stază cardiacă.

Raportul de Ritis: GOT/GPT ~ 1,2-1,3. În leziunile inflamatorii ale ficatului

acest raport scade datorită creşterii mai mari ale activităţii GPT. În leziunile necrotice

raportul creşte datorită creşterii mai marcate a activităţii GOT.

Determinarea activităţii fosfatezei alcaline

(Metoda Bodansky)

Fosfatazele sunt un grup de enzime cu rol important în metabolism, capabile să

hidrolizeze esterii fosforici, eliberând acid ortofosforic. În sânge întâlnim în special un

grup de fosfomonoesteraze care acţionează diferit, în funcţie de pH-ul mediului şi de

prezenţa unor efectori (ionul de Mg2+).

Cele mai importante enzime din grupa fosfomonoesterazelor sanguine sunt:

fosfatază alcalină - acţionează la pH 8,4 - 9,1

fosfatază acidă - acţionează la pH 5,1 - 6,0

78

Fosfatazele alcaline sunt foarte răspândite în corpul animal. Cele mai bogate

surse sunt: epiteliul intestinal, părţile în creştere ale oaselor, rinichi, glandele mamare,

leucocite.

Principiu:

Sub acţiunea catalitică a fosfatazei alcaline serice β−glicerolfosfatul de sodiu

este hidrolizat eliberându-se fosfat monosodic.

CH2

CH

CH2

OH

OH

CH2

CH

CH2

OH

OH

O P OH

O

O-Na+

+ HOH OH + NaH2PO4

Activitatea enzimei se determină dozând cantitatea de ioni fosfat eliberat, printr-

o metodă colorimetrică.

Ionul fosfat reacţionează cu acidul molibdenic rezultând un complex

fosfomolibdenic care este redus de sulfitul de sodiu şi hidrochinonă la albastru de

molibden, care este alcătuit dintr-un amestec de oxizi de molibden în stări de oxidare

diferite.

HPO42- +12 MoO4

2- + 23 H+ + 3 NH4+ → (NH4)3PMo12O40 + 12H2O

Oxizii de molibden sunt atât de fin dispersaţi încât intensitatea culorii obţinute

este proporţională cu cantitatea de molibden din fosfomolibdat, deci cu cantitatea de

fosfor din probă. Deci global, procesul respectă legea Lambert – Beer în ce priveşte

concentraţia fosforului.

Reactivi: - soluţie de substrat de β glicerolfosfat de sodiu pH -9,6, 0,5g

β glicerolfosfat de sodiu la care se adaugă 0,425 g veronal sodic, totul se dizolvă în cca

50 ml de apă, în balon cotat de 100 de ml Se adaugă 2,2 ml NaOH 0,1 N. Se

completează la 100 ml cu apă distilată şi se ajustează la pH 9,6

- NaOH N/10

- Hidrochinonă 1%

- Sulfit de sodiu 20%

- Acid tricloracetic 10%

- Molibdat de amoniu 2,5%

- Soluţie etalon de fosfat: KH2PO4 p.a. se usucă câteva zile în

exicator. Se cântăresc 4,3866 g, se dizolvă în puţină apă şi cu apă, se aduce la semn la

79

balon cotat de 1000 ml, se adaugă câteva picături de cloroform drept conservant.

Această soluţie conţine 1 mg de fosfor / 1 ml.

Curba de etalonare

Pentru realizarea curbei de etalonare, se diluează de 50 de ori soluţia etalon,

astfel 1ml soluţie conţine 20 μg fosfor. Se măsoară într-o serie de eprubete 0,5; 1; 2; 3;

4 şi 5 ml din această soluţie standard. La fiecare probă se adaugă câte 2 ml acid

tricloracetic 20% şi apă până la 10 ml. După amestecare, din acest amestec se măsoară

câte 5 ml într-o alta eprubetă, după care se adaugă 2 ml molibdat de amoniu 2,5%, 1 ml

hidrochinonă şi 2 ml sulfit de sodiu. După 5 minute se citeşte exticţia şi se reprezintă

grafic luând pe ordonată extincţia la λ=610 nm în cuvă de 1 cm, iar pe abscisă cantitatea

de fosfor în μg (adică 5, 10, 20, 30, 40, 50 μg)

Modul de lucru:

În două eprubete se măsoară câte 5 ml substrat (pH = 9,6). Prima eprubetă se

menţine timp de 5 minute la 37º C după care se introduce 1 ml ser şi se lasă astupată

jumătate de oră la 37º C.

În eprubeta a doua se măsoară 1 ml ser şi deoarece acesta constituie martorul, se

introduc 4 ml acid tricloracetic 10% pentru inactivarea enzimei. După incubarea de o

jumătate de oră, prima eprubetă se tratează cu 4 ml acid tricloacetic 10%. Atât proba

cât şi martorul se agită energic 1-2 minute şi se filtrează, iar din filtrat se iau câte 5 ml

în două pahare Erlenmeyer şi se dozează cantitatea de fosfat anorganic după cum

urmează.

Se adaugă în fiecare pahar, în ordine, 1 ml molibdat de amoniu, 1 ml sulfit de

sodiu, 1 ml hidrochinonă şi 2 ml apă bidistilată. După 20 de minute de repaus se citeşte

extincţia probei faţă de martor la λ = 610 nm.

Calcul:

Se face pe baza curbei de etalonare. Rezultatul se exprima în unităţi Bodansky

(UB). O unitate Bodansky este activitatea fosfatazică pentru care 1 mg fosfor este

eliberat într-o oră la 37º C şi pH = 9,6 de 100 ml ser din substratul de β−glicerolfosfat.

Valori normale: Adulţi: 2 - 4 U.B. / 100 ml ser

Copii: 2 - 8 U.B. / 100 ml ser

Sugari: 3 – 10 U.B. / 100 ml ser

Transformarea unităţilor Bodansky, în unităţi internaţionale (mU/ml sau UI/l) se

face înmulţind cu factorul de conversie 8,3.

80

Modificările patologice apar în două mari categorii de afecţiuni: osoase şi

hepatobiliare. Astfel creşte mult în boli în care există o activitate crescută a

osteoblastelor: Boala Paget (osteodistrofie deformentă), hipoparatiroidismul primar şi

secundar, rahitism infantil, osteomalacie, metastaze osoase ale unor tumori maligne,

icter prin obstrucţie (dozarea fosfatazei constituind în acest caz un mijloc biochimic de

diagnostic diferenţial al icterelor).

O creştere fiziologică se observă în sângele matern aproximativ în trimestrul trei

al sarcinii şi atinge maximumul în timpul travaliului. La făt, concentraţia serică a

fosfatazei creşte, dar este sub valoarea maternă şi se însoţeşte de fixarea ionilor Ca2+ şi −3

4PO . Concentraţia mai mare în sângele matern se explică printr-o trecere

transplacentară de la făt la mamă.

Scăderea fosfatazei alcaline apare în ciroză hepatică, hepatită cronică.

Fosfataza acidă are valori normale cuprinse în intervalul 4,5 – 13,5 UI/l (enzimă

totală) şi 0,05 – 3,6 UI/l (fracţiunea prostatică). Valorile cresc în carcinomul de prostată

(cu metastaze osoase), boala Gaucher, prostatită acută şi cronică, necroză hepatică

datorată hepatitelor acute şi cornice.

Determinarea activităţii amilazei serice prin

metoda Wohlgemuth.

Prin acţiunea amilazei salivare (α-amilaza) asupra amidonului, în cavitatea

bucală, se rup legăturile 1,4-glicozidice. Cum legăturile 1,6 ca şi cele 1,4 din vecinătatea

ramificaţiilor, nu pot fi desfăcute de către α-amilază, produşii de digestie a amidonului

vor fi, pe lângă maltoză, fragmente oligozaharidice de dimensiuni variabile - dextrine

limită. Dextrinele limită sunt hidrolizate ulterior, sub acţiunea unei hidrolaze, amilo-1,6-

glucozidaza, la maltoză care, în intestin este hidrolizată la glucoză de maltază.

Activitatea amilazică a intestinului se datorează trecerii amilazelor pancreatice şi

salivare în sânge. pH-ul optim al amilazei salivare este aproape de neutralitate,

cofactorul fiind ionul Cl-.

Prin adăugarea de iod, amidonul rămas după reacţia enzimatică dă un compus de

adiţie iod-amidon, de culoare albastră a cărei intensitate este proporţională cu

concentraţia amidonului rămas după incubaţie şi invers proporţională cu activitatea

enzimatică. Coloraţia roşie care poate să apară în soluţiile cu amidonul parţial hidrolizat

se datorează complexelor iod-dextrine.

81

Principiu:

Se determină cantitatea minimă de amilază serică necesară pentru a hidroliza

complet 2 mg amidon, în 30 minute la 38°C.

Reactivi: - Soluţie de NaCl 0,9%

- Soluţie de amidon 0,1%

- Soluţie de KI3 N/10

Modul de lucru:

Se iau 8 eprubete care se numerotează de la 1 la 8. În fiecare se introduce câte un

ml soluţie NaCl 0,9%. În prima eprubetă se adaugă 1 ml ser. Pipeta se spală de 3 ori

prin aspirare în amestecul din prima eprubetă şi cu aceeaşi pipetă se trece 1 ml din

amestec în a doua eprubetă. Din nou se spală pipeta prin aspirare în a doua eprubetă şi

se trece 1 ml în a treia. Operaţia se repetă până la ultima eprubetă din care se aruncă 1

ml din amestec. În acest mod se obţine următoarea serie de diluţii succesive ale serului:

1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, adică 1/2n unde n este numărul de ordine al

eprubetei.

Se adaugă apoi în fiecare eprubetă câte 2 ml soluţie amidon. Se agită şi se

aşează în baie de apă la 38ºC. După 30 de minute se scot, se răcesc repede la un curent

de apă, apoi în fiecare se introduc câte 1-2 picături de soluţie de iod. Se agită şi se

observă culoarea formată. Culoarea galbenă indică lipsa amidonului, cea roşie arată

prezenţa produşilor intermediari de hidroliză (dextrine), iar cea albastră semnalează

prezenţa amidonului nehidrolizat. Se notează ultima eprubetă în care amidonul a fost

hidrolizat.

Cu această metodă nu se poate face diferenţă între amilaza salivară şi cea

pancreatică. Există, însă, metode electroforetice pentru a diferenţia cele două izoenzime:

migrarea electroforetică a amilazei salivare este mai rapidă decât a celei pancreatice.

Calcul:

Rezultatul se exprimă în unităţi Wohlgemuth (UW). Unitatea amilazică Wohlgemuth

reprezintă cantitatea de enzimă necesară pentru a hidroliza un mg amidon în 30 minute

la 38ºC. Pentru calcul se consideră ultima diluţie în care nu apare culoarea albastră.

Rezultatul în unităţi Wohlgemuth se obţine înmulţind diluţia cu 2. De exemplu, dacă

coloraţia albastră apare în eprubeta a 5-a înseamnă că amidonul a fost hidrolizat până la

a 4-a eprubetă. Calculăm diluţia acestei eprubete care este 1/16 faţă de serul iniţial.

Dacă: 1/16 ml ser hidrolizează 2ml sol. amidon 0,1% atunci, 1 ml ser hidrolizează x ml

sol. amidon 0,1% sau x mg amidon.

82

1•2 x = ─── = 32 UW 1/16 Interpretarea valorilor obţinute:

Valori fiziologice: în sânge: 8-32 U.W.

în urină : 8-64 U.W.

Valori patologice: - activitatea amilazică scăzută apare în afecţiunile

pancreatice, gastrice şi duodenale.

- activitatea amilazică crescută apare în afecţiuni ale

ficatului, vezicii biliare, în alterări ale funcţiei renale, afecţiuni ale glandei salivare

(parotidită acută, sialadenită), sarcină extrauterină, fiindcă cantităţi mici de amilază

există în trompele uterine, infarct intestinal. Valoarea diagnostică a amilazemiei se

corelează cu tulburările digestive, pancreatita acută, parotidita epidemică.

Observaţii:

1. Amilaza serică este stabilă timp de o săptămână dacă serul se ţine la frigider sau

congelator.

2. Saliva conţine de 1000 ori mai multă amilază decât serul de aceea este necesar ca

pipetările să se facă cu atenţie evitându-se scurgerea salivei în pipetă.

3. Eprubetele vor fi bine spălate cu apă distilată, de asemenea şi pipetele, înlăturându-

se urmele de detergent care ar putea influenţa reacţia enzimatică.

Explorarea echilibrului acido-bazic

Modificările echilibrului acido-bazic a lichidelor din organismul viu, duc la

acidoză sau alcaloză. pH-ul sângelui este cuprins în intervalul 7,35-7,45. În mod

normal, raportul echivalenţilor de HCO3- şi H2CO3 este de 20/1, de exemplu 24 mEq

bicarbonat şi 1,2 mEq acid carbonic. În locul raportului [HCO3-]/[H2CO3], un raport mai

practic este [HCO3-]/pCO2 unde pCO2 este presiunea parţială a CO2 din sânge.

Scăderea acestui raport duce la acidoză, iar creşterea lui la alcaloză. Dacă scade

numărătorul, este vorba de acidoză respiratorie (reducerea eliminării prin expiraţie a

CO2) sau metabolică. Creşterea raportului datorită creşterii numărătorului indică o

alcaloză metabolică. Scăderea raportului [HCO3-]/pCO2 datorat creşterii pCO2 produce

acidoză respiratorie. Creşterea raportului determinat de scăderea pCO2 produce alcaloză

83

respiratorie. În funcţie de modificările pH-lui se realizează acidoza sau alcaloza

compensată sau decompensată. Când pH-ul nu este modificat este vorba de acidoză sau

alcaloză compensată. Când pH-ul scade sub 7,35 este vorba de acidoză decompensată,

iar când pH-ul creşte peste 7,45 se poate vorbi de alcaloză decompensată. Valori ale pH-

ului sângelui sub 6,9 sau peste 7,9 sunt incompatibile cu viaţa. Cele mai importante

sisteme tampon care funcţionează permanent în organism sunt: sistemul bicarbonat/acid

carbonic, sistemul fosfaţilor (HPO42-/H2PO4

-), sistemul proteinelor si sistemul

hemoglobinei (deprotonată/protonată).

Determinarea rapidă a rezervei alcaline (bicarbonat actual)

Principiu:

Bicarbonaţii din ser sunt descompuşi cu acid azotic, cu degajare de CO2, iar

excesul de acid azotic se titrează în prezenţă de roşu de fenol cu soluţie de hidroxid de

sodiu.

Reactivi: - soluţie acid azotic 0,1 N cu factorul FHNO3

- soluţie roşu de fenol 0,04% în alcool etilic de 60%;

- soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 N cu factorul FNaOH

Modul de lucru: La 1 ml ser nehemolizat se adaugă 1 ml soluţie acid azotic 0,1N şi 4 picături

soluţie roşu de fenol 0,04%. Se agită timp de 2 minute pentru îndepărtarea dioxidului de

carbon. Se microtitrează cu v ml soluţie de hidroxid de sodiu 0,1N până la primul viraj

portocaliu.

Calcul:

1 ml NaOH 0,1N ..................................................0,1mEq −3HCO

NaOHHNO FvF ⋅−3

................................................... x mEq −3HCO

x = rezerva alcalină dintr-un ml ser.

Obsevaţie: Factorul soluţiei de HNO3 0,1N se determină prin titrare cu soluţia de

NaOH 0,1N cu factor cunoscut, folosind roşu de fenol ca indicator.

Metoda Astrup

Spre deosebire de măsurătorile de bicarbonaţi şi de pH efectuate în plasmă,

metoda Astrup ţine cont şi de rolul tamponului de hemoglobină şi de intervenţia

anhidrazei carbonice din eritrocite. Metoda se bazează pe relaţia invers proporţională

dintre pCO2 şi valorile de pH din sânge. Este o micrometodă în care se utilizează un

84

electrod capilar de sticlă pentru măsurarea pH-ului (dozarea potenţiometrică a pH-ului

cu electrod de sticlă, pag.183). Determinările se fac din sânge capilar. Se măsoară trei

valori de pH (în condiţii anaerobe, în condiţii de pCO2 scăzut şi pCO2 crescut). Cu

ajutorul acestor trei valori se pot calcula factorii principali ai echilibrului acido-bazic

dintr-o nomogramă.

Ioni anorganici

Determinarea potasiului seric

Potasiul este un important cation intracelular pentru organism. În celulă, parţial,

el este slab legat cu proteinele şi cu ionul fosfat. În tulburările metabolice celulare

însoţite de o scădere a potenţialului energetic (diabet zaharat, acidoze, hipertiroidism

etc.) celula pierde din acest motiv şi potasiul care este ulterior eliminat. Cation principal

în fluidul intracelular, K+ este implicat în funcţia nervoasă şi musculară, în funcţionarea

Na+/K+-ATP-azei. În timpul contracţiei musculare, potasiul din spaţiul intracelular trece

în cel extracelular, iar în locul lui în celulă intră sodiul. Supradozarea cu ioni K+

determină scăderea (oprirea) activităţii cardiace, ulcerul intestinului subţire. Necesarul

zilnic de potasiu este de 1,875-5,625 g /kilocorp

Sursele: vegetale, fructe (nuci, banane, mere, struguri, portocale) boabe de cereale

seminţe de floarea soarelui, carne slabă.

Principiu:

Hexanitrocobaltiatul (ΙΙΙ) trisodic (Reactiv Konninck) formează cu ionul K+ în

soluţii neutre, un precipitat galben cristalin de hexanitrocobaltiat (ΙΙΙ) dipotasic-

monosodic. Grupările nitro din compus se oxidează în mediu acid cu KMnO4 în exces.

Excesul de KMnO4 se titrează iodometric cu tiosulfat de sodiu.

Na3[Co(NO2)6] + 2 KCl-------------> NaK2[Co(NO2)6] + 2NaCl

5 NaNO2 + 2 KMnO4 + 3 H2SO4 ----> 5 NaNO3 + 2 MnSO4 + K2SO4 +3 H2O

2 KMnO4 + 10 KΙ + 8 H2SO4 ------------> 5 Ι2 + 2 MnSO4 + 6 K2SO4 +8 H2O

Ι2 + 2 Na2S2O3 --------------------------------> Na2S4O6 + 2 NaΙ

Reactivi: - Reactiv Konninck (hexanitrocobaltat (ΙΙΙ) trisodic). Prepararea

reactivului Konninck:

85

- Soluţia A: Se dizolvă 1,25 g Co(NO3)3 în 2,5 ml H2O. După dizolvare se adaugă

0,0625 ml CH3COOH glacial.

- Soluţia B: Se dizolvă 56 g NaNO2 în 9 ml H2O bidistilată, prin încălzire.

Soluţia A se amestecă cu soluţia B. Pentru îndepărtarea vaporilor nitroşi se

trece prin soluţie un curent de aer timp de 60 minute (trompă de vid). Se lasă

în repaus 2 ore după care se filtrează. Dacă culoarea se închide din nou se

trece din nou un curent de aer.

- Alcool etilic 70°

- Soluţie fosfat disodic 5%

- H2SO4 20%

- KMnO4 0,01N

- KΙ 10%

- Amidon 1%

- Na2S2O3 0,05N

Modul de lucru:

Într-o eprubetă de centrifugă se măsoară:

- 1 ml reactiv Konninck (Sol.A + B), apoi 1 ml ser. Se agită şi se lasă în repaos

20 minute. Eprubeta se supune centrifugării la 2000 rpm timp de 10 minute. După

decantarea lichidului supernatant, precipitatul sedimentat se spală cu 5 ml etanol iar

dispersia etanolică se supune din nou centrifugării şi decantării

Precipitatul rămas se dizolvă cu 5 ml fosfat disodic, prin fierbere 5 minute.

Soluţia se goleşte într-un flacon Erlenmeyer de 100 ml iar eprubeta se spală în flacon cu

1 ml H2SO4 20%. În tabel apar cantităţile de reactivi care se introduc în flaconul

Erlenmeyer cu probă şi în unul cu martor.

Probă Martor

Precipitat dizolvat -

H2O bidistilată (ml) - 5

H2SO4 20% (ml) 1 2

KMnO4 0,01N (ml) 20 20

Repaus 20 minute (ml)

KΙ 10% (ml) 3 3

Amidon 1% (ml) 2 2

86

Proba şi martorul se titrează cu Na2S2O3 0,05N până la dispariţia culorii albastre

determinate de prezenţa I2.

Calcul:

1 ml Na2S2O3 0,05N corespunde la 0,065 • 5 mg K

mg K% = (v1 - v2) • 5 • 0,065 • 100; unde v1 = nr. ml Na2S2O3 folosiţi la titrarea

martorului şi v2 = nr. ml Na2S2O3 folosiţi la titrarea probei

Valori normale: 13-21 mg/100 ml ser; 3,3-5,4 mmol/l

Variaţii patologice: - Hiperpotasemii: arsuri intense, hemoragii, infarct

miocardic, sindroame maligne, pancreatite acute hemoragice, necroze viscerale,

insuficienţă suprarenală acută sau cronică, sindrom hemolitic, nefrită acută sau cronică.

- Hipopotasemii: diaree, vomismente, nefropatii tubulare, acidoze diabetice, comă

diabetică, administrare prelungită de diuretice, hipercorticism suprarenal, boala

Cushing, tumoră suprarenală, tratament cortizonic.

Deficienţa de potasiu apare după răniri sau terapie cu diuretice. Deficienţa de potasiu

determină slăbirea tonusului muscular, paralizii, confuzii mentale.

Dozarea flamfotometrică a potasiului seric

În ultimul timp, metodele chimice de determinare ale potasiului au fost înlocuite

prin analiza flamfotometrică. Factorii care au favorizat utilizarea flamfotometriei ca

metodă uzuală în laboratoarele clinice pentru determinarea în lichidele biologice a

metalelor alcaline (Na+ şi K+) şi metalelor alcalino-pământoase (Ca2+ şi Mg2+), au fost:

simplitatea metodei, rapiditatea metodei, consumul minim de substanţe, limita de eroare

(2-3%) apropiată de limita de eroare din determinările chimice.

Principiu:

Serul nehemolizat se diluează cu apă bidistilată, apoi se pulverizează într-un

dispozitiv special cu ajutorul unui curent de gaz purtător. Aerosolii formaţi în urma

pulverizării se amestecă cu unul din amestecurile de gaze: metan-aer, propan-aer sau

acetilenă-aer care arde într-un arzător special (Brenner), dând naştere la spectre

caracteristice. Liniile spectrale ale potasiului pot fi selecţionate cu ajutorul unui filtru.

Lumina flăcării este proiectată cu ajutorul unei oglinzi concave, prin filtrul de selecţie,

pe o celulă fotoelectrică, ceea ce produce un fotocurent, care se poate măsura cu ajutorul

87

unui galvanometru. Intensitatea fluxului luminos este proporţională cu concentraţia

ionilor K+ din ser. Alte detalii privind această analiză instrumentală sunt cuprinse în

capitolul privind unele aparate de analiză fizică de la sfârşitul îndrumătorului.

Dozarea calciului şi magneziului

Dozarea calciului

Rolul calciului în organism

Calciu este cel mai abundent mineral din organismul uman. Un adult de 70 kg

conţine în ţesuturi aproximativ 1,2 kg calciu. Aportul zilnic necesar de calciu este 1

gram, din care se absorb doar 10-20%. Calcemia (concentraţia plasmatica a calciului)

normală este 9-11 mg%, 4,5-5,5 mEq/l sau 2,25 -2,75 mmol/l. Calciul îndeplineşte în

organism un rol plastic participând prin combinaţiile sale insolubile la structura

scheletului osos a cărui principală componentă minerală este hidroxiapatita,

3Ca3(PO4)2•Ca(OH)2 şi un rol dinamic sub formă de ioni Ca2+ prezenţi în fluidele, cum

ar fi plasma sau urină, sub forma a trei fracţiuni:

1. Calciu legat de proteine (proteinate de calciu) aproximativ 1 mmol/l. Această formă

depinde de concentraţia relativă a proteinelor şi calciului din plasmă. Pe baza acestei

dependenţe se poate aprecia fracţiunea de calciu ionizat, cunoscând calciul total din

ser sau plasmă şi nivelul proteinei din ser sau plasmă. Tehnica constă în folosirea

nomogramei MacLean şi Hastings, cunoscând cei doi parametri amintiţi anterior se

citeşte direct valoarea calciului ionizat de pe nomogramă.

2. Calciul legat de molecule mici (complecşi de calciu sau chelaţi) acizi organici,

numit şi calciu complexat dializabil. Acesta poate străbate membranele

semipermeabile (celofan) spre deosebire de calciul legat de proteine.

3. Calciul liber, forma biologică activă ce intervine în coagularea sângelui în activarea

enzimelor (proteaze), în buna funcţionare a inimii, muşchilor şi nervilor.

Determinarea cationului calciu în sânge

Calciul este cationul prezent predominant în spaţiul extracelular. În laboratoarele

de analize clinice, calciul din sânge se poate doza prin diferite metode. Metodele fizice

folosite sunt: fotometria de flacără, spectroscopie de absorbţie atomică, folosirea

electrozilor ion-selectivi. Metodele chimice folosite sunt precipitarea calciului sub

88

formă de oxalat şi apoi dozarea oxalatului de calciu format cu ajutorul permanganatului

de potasiu şi metoda complexonometrică. Metodele optice sunt descrise în principiu la

sfârşitul îndrumătorului. Metodele potenţiometrice cu electrod pentru Ca2+ utilizează un

milivolmetru cu impedanţă de intrare mare similar cu pH-metrului care în locul

electrodului de sticlă utilizează electrodul selectiv pentru ionii de Ca2+.

Metodele chimice (volumetrice) sau fizice cu excitare (flamfotometrie,

spectroscopie de absorbţie atomică) permit determinarea concentraţiei totale a calciului.

Singurele metode care pot determina calciul ionizabil (singurul care este biologic activ)

sunt metodele nernstiene, adică cele care folosesc electrozi selectivi.

Toţi electrozii selectivi au ca particularitate o parte care este numită în mod

curent “membrană”. Această membrană conferă selectivitatea electrodului. Membranele

sunt de mai multe tipuri: membrane de sticlă (pentru măsurarea pH-ului), membrane

solide (pentru măsurare concentraţiei F-, CN-) şi membrane lichide (pentru măsurarea

Ca2+, Mg2+).

Electrodul membrană-lichidă pentru Ca2+ este constituit din următoarele

componente principale:

- Un fir de argint metalic acoperit cu clorură de argint, scufundat într-o soluţie de

CaCl2

- Un rezervor central în care se află CaCl2 şi firul de argint

- O membrană poroasă “millipor” de PVC care joacă rolul unui suport inert,

impregnat cu o soluţie organică compusă din sarea de calciu a acidului

didecilfosforic dizolvată într-un solvent nemiscibil cu apa (de exemplu: di – n -

octil fenil fosfat).

Ionul de calciu este comun atât soluţiei apoase (soluţie a cărei concentraţie vrem

s-o determinăm) cât şi soluţiei organice cu care este impregnată membrana “millipor”.

În această soluţie organică se va reţine ionul de calciu de către un contraion (ion cu

semn opus), în cazul de faţă didecil fosfatul, care fiind insolubil în apă nu poate părăsi

soluţia organică. Între cele două soluţii (apoasă şi organică) apare o diferenţă de

potenţial nernstiană (respectă legea lui Nernst).

Diferenţa de potenţial este măsurată cu ajutorul instrumentului, care este gradat

direct în unităţi de concentraţie a ionilor de Ca2+ (pCa). Concentraţia ionilor de calciu,

poate fi apreciata şi indirect folosindu-se nomograme. Sunt două tipuri de nomograme

utilizate în acest scop. Nomograma MacLean-Hastings cu ajutorul căreia se poate

89

deduce concentraţia calciului ionizat, cunoscând calciu total din ser sau plasmă şi

concentraţia totală a proteinelor din ser sau plasmă.

Cea de a doua nomogramă utilizabilă pentru deducerea concentraţiei Ca2+, se

bazează pe faptul că ionizarea ionilor de calciu variază linear în funcţie de pH-ul

serului sau plasmei. Acest tip de extrapolare se poate face numai între limitele variaţiei

pH-ului fiziologic (6,8 - 7,8), pentru că numai în această plajă de pH variaţia este lineară

(vezi figura de mai jos).

În diagrama pH-Ca2+ liber prezentată, ordonata (concentraţia ionilor de Ca2+)

este divizată nelinear. Cunoscând valorile pCa şi pH (măsurate cu electrozii selectivi

corespunzători) se poate stabili natura tulburării de care suferă pacientul

(hiper/hipoparatiroidism primar, acidoză/alcaloză acută, etc.).

Dozarea calciului prin metoda permanganometrică

Principiu

Se precipită ionul de calciu sub formă de oxalat de calciu. Precipitatul format se

dizolvă în acid sulfuric, iar acidul oxalic eliberat se va titra cu o soluţie de permanganat

de potasiu, până la apariţia unei coloraţii slab roz.

90

CaCl2 + (COONH4)2 → (COO)2Ca + 2NH4Cl

(COO)2Ca + H2SO4 → (COOH)2+ CaSO4

5(COOH)2 + 2KMnO4 + 3H2 SO4 → 2MnSO4 + K2SO4 + 10CO2 + 8H2O

Reactivi: - soluţie de oxalat de amoniu 4% (soluţie saturată)

- soluţie de hidroxid de amoniu 2%

- soluţie de acid sulfuric 1N

- soluţie de permanganat de potasiu 0,01 N cu factorul FKMnO4

Modul de lucru:

Se pipetează 1 ml ser, 1 ml soluţie saturată de oxalat de amoniu şi 2 ml de apă

bidistilată într-o eprubetă de centrifugă. Se amestecă prin agitare şi se lasă minim 30 de

minute în repaus. Se centrifughează timp de 10 minute la 4000 turaţii pe minut.

Supernatantul se îndepărtează printr-o singură răsturnare a eprubetei şi peste precipitat

se adaugă 4 ml din soluţia de hidroxid de amoniu 2%, se agită, apoi se centrifughează.

Se îndepărtează supernatantul cum s-a arătat mai sus şi se mai face o spălare cu soluţia

de hidroxid de amoniu, se centrifughează şi se elimină supernatantul. Peste precipitatul

astfel spălat se adaugă 2 ml acid sulfuric 1N şi se ajută dizolvarea prin încălzire pe o

baie de apă la 60-70ºC. Se recomandă ca temperatura să nu depăşească 70°C pentru a

se evita descompunerea acidului oxalic. Se titrează cu soluţia de permanganat de potasiu

la cald până la apariţia unei coloraţii roz palid care trebuie să persiste minimum un

minut. În paralel se face şi o probă martor. Tot într-o eprubetă de centrifugă, se introduc

2 ml acid sulfuric 1 N, se încălzeşte pe o baie de apă la 70°C şi se titrează cu soluţia de

permanganat de potasiu la cald până la apariţia unei coloraţii roz palid care trebuie să

persiste minimum un minut.

Calcul:

1 ml soluţie KMnO4 0,01 N conţine 0,01 miliechivalenţi de KMnO4.

Stoichiometric 0,01 miliechivalenţi de KMnO4 vor reacţiona cu 0,01 miliechivalenţi de

Ca ceea ce reprezintă 0,2 mg de calciu.

x = (a-b) • F KMnO4 • 0,20 (mg Ca /1ml ser)

x•100 = mg Ca /100 ml ser sau

(a-b) • F KMnO4 • 5 (mmol Ca /l)

în care: a = număr de ml soluţie KMnO4 0,01 N utilizaţi la titrarea probei de analizat iar

b = număr de ml soluţie KMnO4 0,01 N utilizaţi la titrarea martorului.

Valori normale: ser 9-11 mg / 100 ml la adulţi sau

91

2,2-2,8 mmol / l

7-14 mg / 100 ml la copii sau

1,8-3,5mol / l

Valori scăzute: - hipofuncţie paratiroidiană

- avitaminoză sau hipovitaminoză D

- uremie

La valori de sub 1,7 mmol / l (6,8 mg%) apar fenomene de tetanie.

Valori crescute: - hiperfuncţie paratiroidiană

- neoplazii osoase (osteosarcom, mielom multiplu, unele

leucemii)

- hipervitaminoză D

- deshidratare

Dozarea calciului prin metoda complexonometrică

Eliminarea calciului în urină este în funcţie de conţinutul de calciu din alimente

şi de rata de absorbţie digestivă.

Principiu:

Ionii de calciu din urină în mediu puternic alcalin se vor titra cu EDTANa2,

adică complexon III (sarea de sodiu a acidului etilendiaminotetraacetic) în prezenţa

murexidului (purpurat de amoniu) ca indicator. Indicatorul va fixa ionii de calciu

(culoarea soluţiei va fi roz) care prin titrare vor fi apoi complexaţi cu EDTA. Indicatorul

eliberat va colora soluţia în violet. Murexidul, indicator metalocromic (pentru calciu şi

alţi cationi) are gradul de ionizare în funcţie de pH-ul mediului. Reacţiile prin care ionii

Ca2+ sunt complexaţi de indicator şi de complexon sunt:

Ca2+ + Ind3- ↔ CaInd- roz

Ca2+ + Y4- ↔ CaY2- complexonul deprotonat

Reacţia titrimetrică care produce virajul indicatorului este:

CaInd- + Y4- → CaY2- + Ind3-

violet

92

Reactivi: - soluţie complexon III 0,001 N .

- soluţie de NaOH 9 N

- soluţie indicator murexid 0,1%

Modul de lucru:

Se foloseşte urină proaspătă, fără conservanţi. Se pregătesc două pahare

Erlenmeyer de câte 100 ml şi se pipetează în fiecare următoarele:

Exprimarea

cantităţilor Proba Martor

Urină ml 2 -

Apă bidistilată ml 50 52

Soluţie de NaOH 9 N ml 0,2 0,2

Indicator murexid pic. 1 1

Culoare roz roz-violaceu

Se titrează cu EDTA 0,01N până la violet A ml B ml

Se execută o probă şi un martor, martorul se titrează dacă este necesar până la

culoarea violet stabilă, pentru a se lua în calcul şi urmele de calciu din reactivi.

Calcul:

În calcularea rezultatelor se are în vedere că complexul din 1 ml soluţie

complexează 0,2 mg Ca2+:

1ml EDTA 0,01N-----------------------------------------------0,2 mg Ca

(A-B)•FEDTA------------------------------------------------------x

x= (A-B)• FEDTA•0,2 mg Ca / 2ml

Considerând că urina de 24 ore are volumul de 1500 ml:

g Ca în urina de 24 de ore = (A-B)• FEDTA•0,2 • 1500 / 2 • 1000

g Ca în urina de 24 de ore = (A-B)• FEDTA•0,15

93

Valori normale:

- sugari 0,01 - 0,14 g/24 ore - copii şi adulţi 0,1 - 0,2 g/24 ore

sau 0,25 - 3,5 mmol/24 ore sau 2,5 - 5,0 mmol/24 ore

Valori crescute apar în boala Recklinghausen, osteoporoze, după fracturi,

intoxicaţii cu vitamina D, hipercalciurie ideopatică.

Valori scăzute apar în spasmofilie, tetanie infantilă, osteomalacie, rahitism,

hipopara-tiroidism.

Dozarea magneziului prin metoda Mann şi Yoe

Un adult de 70 kg conţine aproximativ 24 g de magneziu, care este distribuit

inegal în organism, având o concentraţie mai mare în ţesuturile cu activitate metabolică

mai intensă, cum ar fi creierul, inima, ficatul, rinichii, tiroida. Totuşi scheletul conţine

60% din magneziu. Muşchii scheletici şi miocardul conţine 35%, iar 1% se găseşte în

compartimentul extra-celular, din acesta aproximativ două treimi fiind sub formă

ionizată, restul fiind legat de albumine. Principalele organe implicate în metabolismul

Mg sunt intestinul şi rinichii.

Magneziul are un rol cheie în numeroase funcţii mediate enzimatic, fiind

implicat în formarea de substrate enzimatice (ATP Mg, GTP Mg) precum şi în activarea

directă a enzimelor. Funcţiile membranare care sunt influenţate de magneziu includ

conducerea impulsului nervos şi modularea activităţii canalelor de calciu.

Principiu:

Colorantul Mann şi Joe (1- azo - 2 – hidroxi – 3- (2,4 – dimetil carboxamilido)

naftalin – 1’ (2 - hidroxibenzen) – 4 – sulfonat de sodiu) este albastru. În mediu

alcoolic, la pH 9-10, acesta formează cu Mg2+ (în cantităţi de ordinul microgramelor) un

complex de culoare roşie, iar intensitatea coloraţiei este proporţională cu concentraţia

cationului.

Materiale necesare: - spectrofotometru

- micropipete de 20μl (0,02ml)

94

Reactivi: - Reactivul Mann şi Yoe: se dizolvă 8 mg colorant în 75 ml

alcool absolut (eventual prin fierbere cu reflux) şi după dizolvare

se aduce la 100 ml cu alcool absolut.

- Soluţie tampon (pH 9-10): 20 g tetraborat de sodiu cristalizat cu

10 molecule de apă, se dizolvă la cald în 500 ml apă bidistilată,

apoi se completează cu apă bidistilată la 1000 ml.

- Soluţie standard de Mg2+ 2 mg/ 100ml: se dizolvă 203 mg

MgSO4 cristalizat cu 7 molecule de apă în 500 ml apă bidistilată,

se adaugă 1 ml cloroform (conservant), apoi se completează la

1000 ml cu apă bidistilată

- Soluţie acid percloric 0,33 N: se dizolvă 2,85 ml HClO4 70% în

100 ml apă distilată

Modul de lucru:

Se pregătesc în trei eprubete următoarele mixturi:

Probă Blanc Standard

Soluţie tampon (ml) 1,0 1,0 1,0

Ser (ml) 0,02 - -

Standard de Mg2+ (ml) - - 0,02

Apă bidistilată (ml) - 0,02 -

Se amestecă bine

Reactiv Mann şi Yoe (ml) 1,0 1,0 1,0

Se agită bine mixturile şi după 15-30 de minute se citeşte exticţia probei şi a

standardului faţă de blanc în cuva de 1cm la λ = 505 nm.

Calcul:

Ep/Es x 2 = mg Mg% Ep/Es x 1,64 = mEq/l

Valori normale

nou născuţi: 1,6 - 2,3 mg% sau 1,32 -1,90 mEq/l sau 0,66-0,95 mmol/l

adulţi: 1,6 - 2,4 mg% sau 1,56-2,38 mEq/l sau 0,8-1,2 mmol/l

Modificări patologice

În practica medicală deficitul de magneziu este întâlnit relativ frecvent, dar el nu

este întotdeauna identificat deoarece are expresie medicală mai puţin specifică

95

comparativ cu carenţa altor elemente (exemplu ferul) şi apare într-un context complex

în asociere cu alte afecţiuni care pot domina tabloul.

Deficitul de magneziu apare în următoarele cazuri:

Aport deficitar, alimentaţie parenterală, cure drastice de slăbire, alcoolismul

cronic, vărsături datorate alimentaţiei dezechilibrate, hipersudoraţie, eliminarea crescută

a magneziului prin urină (etanolul antrenează diureza osmotică). Afecţiunile care

evoluează cu malabsorbţie, rezecţiile intestinale, enteropatiile acute sau cronice, diarea,

steatoreea, terapia cu diuretice, provoacă de asemenea depleţia de magneziu. În practica

pediatrică, deficitul poate apărea din următoarele cauze: disgravidia - sărăcire a

organismului matern cu repercusiuni asupra capitalului de magneziu al nou născutului,

creşterea rapidă a copilului în primele luni, lapte matern sărac în magneziu, tulburări

gastrointestinale la această vârstă. Terapia cu calciu şi vitamina D în doze mari

favorizează pierderile urinare de magneziu. În diabetul zaharat apare hipomagnezemia

datorită pierderilor urinare de magneziu antrenate de diureza osmotică. Stresul fizic şi

psihic favorizează depleţia de magneziu.

Manifestări clinice ale deficitului de magneziu (hipomagnezemie) sunt

polimorfe şi nespecifice. Ele pot fi: insomnie, anxietate, depresie , cefalee, slăbiciune

musculară, crampe, parestezii, hiperreflexe, dificultăţi de înghiţire, senzaţie de

constricţie toracică, tulburări de adaptare a vederii.

Supraîncărcare de magneziu se constată la nou născuţii ai căror mame au fost

tratate cu sulfat de magneziu în contextul eclampsiei de sarcină. În insuficienţa renală,

în special concomitent cu medicaţia pe bază de Mg2+ (antacizi, laxative), se produce

hipermagnezemie. Simptomele hipermagnezemiei sunt: hipotensiune, greţuri, vărsături,

bradicardie, hiporeflex osteotendinos, hipotonie musculară.

96

Dozarea ionului de clor din ser prin

metoda Schales

Principiu:

Ionul Cl-, principal anion al plasmei sanguine, în mediu acid se titrează cu

Hg(NO3)2 formând HgCl2, moleculă nedisociată. Se foloseşte ca indicator

difenilcarbazona care formează un compus de culoare violet cu ionii Hg2+ în exces. Nu

este necesară deproteinizarea, cu excepţia serurilor puternic icterice.

Reactivi: - Soluţie de azotat mercuric 0,01 N

- Soluţie indicator de difenilcarbazonă 0,01 M

- Soluţie H2SO4 2/3 N

- Soluţie standard de clorură de potasiu 0,1 N

Modul de lucru:

În două flacoane Erlenmeyer de 25 ml se pipetează:

Probă Standard

Apă distilată ml 1,0 1,0

Ser ml 0,1 -

Standard KCl ml - 0,1

H2SO4 2/3 N 1 pic. 1 pic.

Indicator difenilcarbazonă 2 pic. 2 pic.

Ambele probe se titrează până la aceiaşi culoare violet cu Hg(NO3)2 0,01 N. Se notează

volumul în ml folosit la titrarea probei (v1) şi cel folosit la titrarea standardului (v2). Calcul:

1 ml Hg(NO3)2 0,01 N corespunde la______________________________0,355 mg Cl-

v1 / v2 ________________________________________________________ x

x = mg Cl-/0,1 ml ser = v1 / v2 • 0,355

mg Cl- / 100 ml ser = v1 / v2 • 355

mEq Cl- / l = v1 / v2 • 100

97

Observaţii: În cazul serurilor puternic icterice se efectuează deproteinizarea.

După deproteinizare, culoarea indicatorului la viraj tinde spre albastru, pe când la ser

neproteinizat spre violet.

Valori normale pentru adulţi:

340 – 390 mg clor/100 ml ser

96 – 110 mEq clor/ litru de ser

Valori scăzute până la 250 mg/100 ml ser se întâlnesc în insuficienţă corticosuprarenală

(boala Addison), în diaree sau vărsături prelungite, când organismul pierde pe lângă apă

şi o cantitate apreciabilă de NaCl.

Valori crescute se întâlnesc în stări de sete, în hiperfuncţia corticosuprarenală şi în

insuficienţa renală.

Dozarea ferului seric (metoda Heilmeyer modificată)

Principiu:

Se tratează serul sanguin cu acid clorhidric când se eliberează Fe3+ din legătura

sa cu proteinele (transferina). Se precipită proteinele serice cu acid tricloracetic, după

filtrare Fe3+ din filtrat este redus cu hidrochinonă la Fe2+. Ionii de Fe2+ formează cu

ortofenantrolina şi, mai specific, cu α,α’-dipiridil, un complex colorat în roşu.

Intensitatea coloraţiei roşii va fi proporţională cu concentraţia ferului din probă.

Reactivi: - Soluţie HCl 1N;

- Soluţie CCl3COOH 20%;

- Soluţie hidrochinonă 2%;

98

- Soluţie ortofenantrolină clorhidrică 1% (se poate utiliza şi

ortofenantrolină, iar pentru dizolvare se acidulează iniţial cu 2-3

picături de HCl concentrat)

- Soluţie semisaturată de CH3COONa. Se diluează extemporaneu o

soluţie saturată (la temperatura camerei cu apă bidistilată) în proporţie

de 1:1

- Soluţie standard concentrată de fer 10 mg%: 0,0497 g FeSO4· 7H2O, ad

100 ml cu apă bidistilată sau 0,0702 g Fe(NH4)2(SO4)2· 6H2O, ad 100

ml cu apă bidistilată. Standardul concentrat se păstrează la frigider. Se

diluează extemporaneu 1 ml la 100 ml cu apă bidistilată obţinându-se

un standard de lucru de 100 µg Fe % cu stabilitate limitată la 1-2 luni.

Modul de lucru:

În trei eprubete se pipetează conform tabelului:

Probă (ml) Standard (ml) Blanc (ml) sol. HCl 1 N 1 1 1 ser (nehemolizat) 2 - - apă bidistilată - - 2 sol. standard de fier (100 μg%) - 2 -

Agitare, 10 min. repaus acid tricloracetic 20% 2 2 2

10 min. repaus, filtrare şi apoi în eprubete filtrat 2 2 2 sol. hidrochinonă 2% 0,2 0,2 0,2 sol. o-fenantrolină 1% 0,1 0,1 0,1 sol. acetat de sodiu 2 2 2

Fiecare eprubetă se agită şi după 5 minute se citeşte extincţia probei (Ep) şi a

standardului (Es) faţă de blanc, în cuva de 1 cm, la λ = 510 nm.

Calcul:

Sideremia se calculează cu următoarea formulă:

Fe μg% = Ep/Es•Cst = Ep/Es•100 (Cst = concentraţia standardului de fer = 100

μg%)

Valori normale: - femei: 80-130 μg% (14,3-23,3 μmoli/l)

- bărbaţi: 90-160 μg% (16,1-28,6 μmoli/l)

99

Valori crescute: creşterea reabsorbţiei (absenţa blocadei mucoasei), depozitarea

excesivă a ferului în organism (hemosideroză, hemocromatoză), tratament cu fer în

exces, etc.

Valori scăzute: scăderea aportului (dietă inadecvată, regim făinos-lactat),

scăderea absorbţiei (rezecţii de stomac/intestin, diaree cronică, sindrom de

malabsorbţie), aclorhidrie, pierderi mari de sânge.

Proteina plasmatică transportoare de fer este transferina (siderofilina) sintetizată în

ficat. Capacitatea totală de fixare a ferului (CTFFe) corespunde cantităţii totale de

siderofilină şi se exprimă în μg Fe/100 ml plasmă. Valorile normale ale CTFFe se

încadrează între 250-420 μg% Fe. În deficitul de transferină sunt scăzute atât sideremia

cât şi, evident, CTFFE. În anemia feriprivă sideremia este mult scăzută, în timp ce

CTFFe este mult crescută, cauza fiind utilizarea ferului plasmatic pentru producţia de

hemoglobină. La rândul ei producţia accelerată de hemoglobină poate fi cauzată de

pierderile cronice de sânge, sarcini repetate, hemoragii puternice.

Dozarea fosfatului anorganic din ser prin

metoda Briggs ( cu deproteinizare)

În serul sanguin şi alte lichide biologice fosforul se găseşte sub trei forme:

1. Combinat în proteine (a) sau acizi nucleici (b) ca:

(a) fosfoproteine ( cazeina din lapte, vitelina din gălbenuşul de ou)

(b) nucleoproteine (mediul intracelular animal, etc.).

2. Sub formă acidosolubilă, adică neprecitabilă cu acid tricloracetic:

a. fosfor anorganic ( acid ortofosforic (H3PO4), H2PO4-, HPO4

2-,

Me4P2O7), b. nucleotide, c. esteri fosforici ai glucidelor, d. acid fosfogliceric, e. acid

fosfopiruvic, f. acid creatinfosforic, g. acizi trifosforici

3. Fosfolipide: lecitine, cefaline, sfingomieline etc.

Fosfaţii anorganici îndeplinesc unele roluri în lichidele şi ţesuturile biologice:

a) Sistemul tampon al fosfaţilor (H2PO4-/ HPO4

2-). În organismul uman mediul

intern are bazicitatea uşor crescută peste neutralitate, pH = 7,35 -7,45. Menţinerea

constantă a pH-ului în mediu intern este realizată, alături de alte sisteme tampon, prin

sistemul tampon al fosfaţilor. Acest sistem poate fi alcătuit din două săruri: fosfat

monoacid (Na2HPO4 sau K2HPO4) - care constituie componenta bazică a sistemului - şi

100

fosfatul diacid (NaH2PO4 sau KH2PO4) care este componenta acidă. De fapt,

componentele funcţionale în cursul tamponării sunt anionii acestor săruri: HPO42- şi

H2PO4-. La pH-ul normal (7,4), concentraţia anionului HPO4

2- este aproximativ de 5 ori

mai mare decât cea a anionului H2PO4-.

Componenta bazică, HPO42-, tamponează aciditatea mediului prin reacţia:

HPO42- + H+ ---------> H2PO4

-

Componenta acidă, H2PO4-, eliberează protoni care neutralizează ionii OH- ai

bazelor:

H2PO4- + OH- ------------> H2O + HPO4

2-

După cum se observă, produşii rezultaţi în ambele cazuri sunt componentele

sistemului tampon.

Sistemul tampon al fosfaţilor este operant în special în hematii, dar şi în celulele

tubulilor renali.

b) În sânge există un raport aproximativ invers proporţional între ionii fosfat şi

calciu. La nivel renal, hormonul paratiroidian creşte reabsorbţia calciului şi inhibă

reabsorbţia ionilor fosfat (acţiune fosfaturică). Efectele la nivelul oaselor şi rinichilor,

ale hormonului cresc calcemia, fără o creştere echivalentă a concentraţiei fosfatului,

împiedicându-se astfel atingerea unor concentraţii critice la care aceşti ioni să formeze

fosfat tricalcic insolubil. De fapt concentraţiile serice ale acestor ioni depăşesc pragul de

solubilitate al fosfatului tricalcic. Totuşi, conţinutul în proteine şi alţi metaboliţi din ser

previne precipitarea sării tricalcice.

Principiu:

Se precipită proteinele cu acid tricloracetic şi se separă prin filtrare. În filtratul

acidulat fosfatul anorganic, împreună cu molibdatul de amoniu, formează

fosfomolibdatul de amoniu ( un complex de culoare galbenă):

12 (NH4)2MoO4 + H3PO4 + 21H+-----> (NH4)3PO4 ⋅ 12MoO3 + 21NH4+ +12H2O

(galben) HPO4

2- + 12MoO42- + 3NH4

+ +23H+ → (NH4)3[P(Mo3O10)4].6H2O + 6H2O

Aceasta este redus la albastru de molibden (un amestec de oxizi de molibden,

(MoO2)2.MoO4, fin dispersaţi în apă) de către hidrochinonă şi apoi sulfit de sodiu.

Intensitatea culorii albastre este proporţională cu concentraţia complexului, deci cu

101

cantitatea de fosfat anorganic din probă, adică culoarea produsă de oxizii de molibden

este fotometrabilă (se supune legii Lambert-Beer).

Aparatură: - Spectrofotometru Spekol.

Reactivi: - Acid tricloracetic 20%

- Soluţie de molibdat de amoniu în mediu acid obţinut prin dizolvarea

a 25g molibdat de amoniu în 300ml H2O la care se adaugă 75ml

H2SO4 concentrat iar apoi se completează la 500ml cu apă.

- Soluţie de hidrochinonă 1% acidulată cu o picătură de H2SO4

concentrat.

- Soluţie sulfit de sodiu 20% care se împrospătează la fiecare serie de

determinări.

- Soluţie standard stoc de fosfat (2 mgP/ml) preparată folosind ca

substanţă etalon KH2PO4.

- Soluţie standard de lucru (20 μgP/ml) obţinută prin diluarea soluţiei

stoc de fosfat.

Curba de calibrare

1 2 3 4

În baloane Erlenmeyer se măsoară:

Sol. Standard de lucru de P (1ml=20μgP), ml

0,5

1

3

5

Acid tricloracetic 20%, ml 2 2 2 2

Apă bidistilată, ml 7,5 7 5 3

Din acest amestec se măsoară în baloane Erlenmeyer:

5

5

5

5

Molibdat de amoniu, ml 1 1 1 1

Sulfit de sodiu 20%, ml 1 1 1 1

Hidrochinonă 1%, ml 1 1 1 1

Apă bidistilată, ml 2 2 2 2

Se omogenizează conţinutul baloanelor şi după 30 min. se citeşte extincţia faţă de blanc

la λ=600 nm.

Modul de lucru:

Se prepară o probă şi un blanc în conformitate cu tabelul de mai jos:

102

Proba Blanc

În baloane Erlenmeyer se măsoară:

Ser, ml 2 -

Apă bidistilată, ml 4 5

Acid triloracetic 20%, ml 4 -

Agitare energică şi repaus 10 min

Filtrare în eprubete + -

În baloane Erlenmeyer se măsoară:

Din filtrat, ml 5 -

Molibdat de amoniu, ml 1 1

Sulfit de sodiu 20%, ml 1 1

Hidrochinonă 1%, ml 1 1

Apă bidistilată, ml 2 2

Se omogenizează conţinutul baloanelor şi după 30 min se citeşte extincţia probei

faţă de blanc la λ = 600 nm.

Determinarea fosfatemiei se face raportând extincţia probei citită faţă de blanc la

curba de etalonare.

Valori normale: - adulţi:2,5-4,5 mg/100 ml ser (0,8-1,5 mmol/l)

- copii: 4-6 mg/100 ml ser (1,3-1,9 mmol/l)

Variaţii patologice:

Valori scăzute: Hipofosfatemii apar în hiperparatiroidism, rahitism, osteomalacie.

Valori crescute: Hiperfosfatemii apar în hipoparatiroidism, acromegalie,

hipervitaminoză D, tubulopatii renale, insuficienţe renale acute

şi cronice.

103

Compuşi organici

Dozarea azotului total din ser prin metoda Kjeldahl

Principiu:

Dozarea azotului din materiale biologice se face după metoda pusă la punct de

către Kjeldahl în 1883. Componentele organice azotate din ser se transformă prin

mineralizare în săruri de amoniu care în aparatul Wagner-Parnas eliberează amoniac.

Amoniacul este captat într-o soluţie de H2SO4 în exces iar excesul de H2SO4 se titrează

cu o soluţie de NaOH în prezenţa indicatorului Groak.

Reactivi: - H2SO4 conc.

- Amestec catalizator CuSO4 . 5 H2O şi K2SO4 (1:3), (m:m)

- H2O2 3 %;

- NaOH 30 %;

- H2SO4 N/100;

- NaOH N/100;

- Indicator Groak: la 100 ml sol. alcoolică saturată de roşu metil

se adaugă 4 ml sol. de albastru de metilen 1 %;

Dozarea decurge în trei faze: mineralizarea, antrenarea cu vapori şi titrarea

Mineralizarea pentru distrugerea materiei organice se face cu H2SO4 conc., la

temperatură ridicată şi în prezenţa ionilor de cupru:

2 N + 3 C + 3H2SO4 → 2 NH3 + 3 CO2 + 3 SO2

Sulfatul de potasiu ridică temperatura de fierbere la 350-4000 C iar ionii de

cupru, din sulfatul de cupru, au rolul de a cataliza reacţia. În cazul mineralizării NH3

reacţionează cu H2SO4 prezent, transformându-se în sulfat de amoniu, conform reacţiei:

2 NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4

Înaintea antrenării cu vapori, NH3 se eliberează din sulfatul de amoniu cu NaOH

concentrat:

(NH4)2SO4 + 2 NaOH → Na2SO4 + 2 NH3 + 2 H2O

şi se antrenează cu vapori în aparatul Wagner-Parnas, într-un volum cunoscut de H2SO4

N/100. Excesul de H2SO4 N/100 se titrează cu NaOH N/100 în prezenţă de indicator

Groak.

104

Aparatură: Aparatul Wagner-Parnas este alcătuit din balonul A (generator de

vapori) în care se formează vaporii de apă, care prin vasul B (deflegmator) trec în

balonul de antrenare C antrenând de aici amoniacul. Aburii sunt condensaţi în

refrigerentul descendent D, iar soluţia apoasă de amoniac se colectează în flaconul

Erlenmayer E care conţine soluţia de H2SO4 N/100.

Modul de lucru:

1) Mineralizarea :

Într-un balon Kjeldahl de mineralizare se introduc 1 ml H2O distilată, 0,1 ml

ser, 2 ml H2SO4 conc., un vârf de spatulă amestec catalizator şi 2-3 picături soluţie de

H2O2. Mineralizarea are loc pe flacără mică sub nişă. După 10 minute balonul Kjeldahl

se răceşte la temperatura camerei fiind lăsat în repaos sub nişă (atenţie, emană vapori

corozivi de H2SO4 !).

.

2) Spălarea aparatului Wagner-Parnas:

Înaintea acestei distilări aparatul Wagner-Parnas, cu reziduuri de la antrenarea

precedentă se spală. Pentru aceasta se procedează în felul următor: Se înlocuieşte

flaconul E cu un pahar Berzelius care conţine apă distilată. Se spală pâlnia F cu H2O

distilată, apoi se închide din nou robinetul ei. Prin răcirea şi condensarea vaporilor de

apă presiunea din aparat scade sub cea atmosferică şi astfel conţinutul vasului de

distilare C este aspirat în vasul B, din care apa se îndepărtează prin robinetul H în

paharul Berzelius. Se răceşte balonul A cu ajutorul unei cârpe ude până când apa

distilată din pahar este aspirată până în vasul B de unde se îndepărtează prin robinetul H

iar după terminarea spălării se deschide robinetul de siguranţă G şi se poate pregăti

distilarea.

105

3) Antrenarea NH3 cu vapori de apă.

Într-un flacon Erlenmeyer (E) de 100 ml se pipetează 20 ml H2SO4 N/100, se

adaugă 2-3 picături de indicator Groak şi flaconul se aşează sub refrigerentul D în aşa

fel încât capătul acestuia să fie introdus în soluţie. Conţinutul mineralizat al balonului

Kjeldahl se diluează cu precauţie cu 2 ml H2O distilată şi se introduce prin pâlnia F în

vasul de distilare C. Balonul Kjeldahl se spală de 3 ori cu câţiva ml de apa distilată iar

aceasta se colectează tot în pâlnia F.

Se adaugă prin pâlnia F 20 ml NaOH 30%. Se închide robinetul pâlniei F, se

introduce flacăra sub balonul A şi apoi se închide robinetul de siguranţă G se aşteaptă

până când vaporii antrenatori ajung la nivelul refrigerentului D, toate robinetele fiind

închise. Distilarea se face 3 minute, din acest moment, mai precis, după ce prima

picătură de condens cade pe tubul refrigerentului descendet D. În acest timp amoniacul

trece cantitativ în flaconul E.

După terminarea distilării se coboară flaconul în care s-a colectat condensul şi se

lasă să mai picure câteva picături. Cu ajutorul unei pisete se spală capătul refrigerentului

D în acest flacon. Numai după aceasta se scoate becul de gaz de sub balonul A. După

aceasta se poate trece la spălarea aparatului prin procedeul descris mai sus. Conţinutul

flaconului Erlenmayer E se supune titrării.

4) Titrarea

Excesul de H2SO4 N/100 din flaconul Erlenmeyer se titrează cu NaOH N/100 în

prezenţa indicatorului Groak.

Calcul :

1 ml sol. H2SO4 N/100 ................. 0,14 mg N

a F b FH SO NaOH⋅ − ⋅2 4

................... x

x = ( a F b FH SO NaOH⋅ − ⋅2 4

) × 0,14 mg N/0,1 ml sol.

a = 20 ml H2SO4 N/100

b = volumul de NaOH N/100 consumat la titrare.

106

Dozarea proteinelor totale din ser prin metoda biuretului

Principiu:

Proteinele reacţionează cu ionii de cupru în soluţie alcalină formând un complex

proteic de culoare violetă. Avantajul constă în faptul că se foloseşte un singur reactiv în

care hidroxidul de cupru este menţinut în soluţie sub formă de complex format cu

tartratul dublu de sodiu şi potasiu, stabilizat cu iodură de potasiu. Reacţia de complexare

cu ionii Cu2+ este dată de compuşi care conţin în molecula lor cel puţin două legături

peptidice.

Cel mai simplu compus care dă această reacţie este biuretul, compus care ia

naştere prin încălzirea ureei.

2 O CNH2

NH2

t0

NH3

O

O C

CNH2

NH2

NHCuSO4NaOH

biuret

H N C

C

O

O

N

N

H

H

( - ) CuN

N(-)

H

H

C

C

O

O

NH

2-

+ 2 Na+

Aparatura: Spectrofotometru sau fotometru cu filtre

Reactivi: - Soluţia A: 4,5 g tartrat de sodiu şi potasiu se dizolvă în 40 ml

NaOH 0,2 N. Se adaugă sub agitare 1,5 g CuSO4.5 H2O dizolvat

în 10 ml H2O, apoi 0,5 g KI şi se completează cu NaOH 0,2 N

până la 100 ml. Se conservă în sticlă brună timp nelimitat.

- Soluţia B: se dizolvă 5 g KI în 1000 ml de NaOH 0,2 N. Se

conservă în sticlă brună timp nelimitat.

- Soluţia de lucru: se diluează 1 volum soluţie A cu 4 volume

soluţie B. Se poate utiliza o săptămână, păstrându-se în sticlă

brună.

- NaCl 0,9 %.

107

Modul de lucru: Se lucrează în 2 eprubete conform tabelului:

Proba Blanc Sol. de lucru ml 5,0 5,0 NaCl 0,9% ml - 0,1

Ser ml 0,1 - Se omogenizează conţinutul eprubetelor şi după 30 de minute se măsoară

extincţia probei (E) faţă de blanc, la λ = 546 nm, folosind cuva de 1 cm.

Calcul:

c (g/100ml) = EE

VV

E

cm

F

P11% 2 77

5 10 1

× = ×,

,,

E × 18,4 = g proteine/100 ml ser; VF -volumul final; VP -volumul serului; E cm11% -coeficientul de

extincţie procentual

Valori normale:

6,5 - 8,2 g/100 ml Valori crescute se întâlnesc în: deshidratări acute produse de vărsături, diaree,

diabet, diabet insipid, poliurie; Hiperproteinemii apar şi în: mielom multiplu

macroglobulinemia Waldenstrőm, boala Osler, boala Besnier-Boeck-Schaumann,

anemie pernicioasă, infecţii acute şi cronice

Valori scăzute: se întâlnesc în: afecţiuni hepatice, ciroze hepatice, intoxicaţii cu

benzen, CCl4; Proteinemia scade şi în stări de şoc produse de arsuri, hemoragii;

Hipoproteinemii se întâlnesc în: afecţiuni renale, tumori maligne, inaniţie.

Hiperproteinemie relativă apare în deshidratări acute produse de vărsături,

diaree, poliurie care apare la pacienţii cu diabet insipid şi diabet zaharat. În cazurile

enumerate nu creşte de fapt cantitatea de proteine circulante ci creşte doar concentraţia

lor din cauza pierderii de lichid din organism.

Hiperproteinemie absolută apare în boli inflamatorii cronice (tuberculoză

pulmonară, lupus eritematos sistemic, sarcoidoză). În mielomul multiplu (plasmocitom)

se produce proliferarea canceroasă a unei clone de plasmocite producătoare de

imunoglobuline al căror nivel creşte în sânge. Macroglobulinemia Waldenström este un

108

limfom malign cu hipergamaglobulinemie. Apare hiperproteinemie şi în unele forme de

leucemie.

Hipoproteinemie relativă apare în cadrul diluării sângelui circulant prin

administrare de perfuzii sau prin ingerare excesivă de lichide.

Hipoproteinemie absolută apare în deficitul genetic de anticorpi sau albumină,

afecţiuni hepatice grave (ciroză cu evoluţie spre insuficienţă hepatică, intoxicaţii cu

benzen, CCl4) în care este compromisă funcţia hepatică de sinteză a proteinelor.

Pacienţii cu tumori maligne prezintă hipoproteinemie datorită catabolismului proteic

accentuat. În inaniţie şi sindrom de malabsorbţie apare carenţă de proteine datorită

aportului insuficient, sau datorită tulburării de absorbţiei intestinală. Se pot pierde

cantităţi însemnate de proteine în sindromul nefrotic (prin filtrul renal lezat trec

numeroase molecule de proteină şi se elimină prin urină), sau poate avea loc pierdere

de proteine pe cale intestinală (enterocolită). Hipoproteinemie mai apare în arsuri

extinse, hemoragii, ascită (lichid bogat în proteine apărut în cavitatea abdominală în

cadrul insuficienţei hepatice).

Electroforeza proteinelor serice

Principiu:

Electroforeza se bazează pe proprietatea particulelor încărcate electric de a

migra spre polul pozitiv sau negativ sub acţiunea tensiunii electrice. În funcţie de pH

proteinele se comportă ca anioni şi vor migra spre anod (+), sau ca şi cationi şi vor

migra spre catod (-). În cursul electroforezei componenţii amestecului de analizat se vor

separa datorită vitezelor de deplasare diferite. În funcţie de mediul în care are loc

migrarea există două tipuri de electroforeză: electroforeza în fază liberă şi electroforeza

zonală. În cazul electroforezei în fază liberă migrarea are loc în fază lichidă.

Electroforeza zonală foloseşte o fază solidă sau un gel de amidon, agar, agaroză etc.

pentru migrare. Electroforeza zonală este tipul cel mai folosit în laborator.

Aparate şi materiale: - Sursă de curent continuu: redresor (0-500 V, 0-50 mA)

- Cameră de electroforeză confecţionată din material

plastic care conţine două cuve prevăzute cu electrozi de

109

platină, şi o punte mobilă pe care se vor pune lamele cu

probele de analizat. În camera de electroforeză închisă cu

un capac se realizează echilibrul lichid (tampon)-vapori

de apă.

Schema aparatului de elecroforeză.

a) plăcuţă de sticlă acoperită cu gel de agaroză; b) suport; c) benzi de hârtie de filtru;

d) soluţie tampon; e) electrozi.

Reactivi:

- Soluţie tampon: tampon Tris-barbital [tris-hidroximetil-

aminometan 7,2 g/l; acid dietilbarbituric (veronal) 1,82 g/l;

dietilbarbiturat de sodiu (medinal) 10,2 g/l; etiltiosalicilat de

mercur (conservant) 0,02 g/l], pH = 8,6

- Gel de agaroză: se prepară o soluţie de agaroză 1% în soluţia

tampon, prin încălzire la fierbere, care se toarnă pe plăcuţe de sticlă

degresate anterior cu alcool. Gelurile se pot păstra în frigider 2-3

zile în cutii umede de plastic.

- Soluţie de fixare: se amestecă 90 ml metanol cu 20 ml acid acetic

glacial şi cu 90 ml apă bidistilată. Compoziţia ei este metanol 45%

şi acid acetic 10%.

- Colorant: roşu de Ponceau 0,1% în soluţie de acid tricloracetic

10%.

Modul de lucru:

a.) În camera umedă se introduc în cele două cuve laterale volume egale de soluţie

tampon, măsurate cu cilindrul gradat. Aceste două compartimente nu comunică între

ele, deoarece numai în felul acesta curentul electric trece numai prin gel.

b.) Se scoate lama de sticlă cu gel din cutia de plastic. Se aşează o bandă de hârtie de

filtru pe o zonă a gelului unde urmează să fie depusă proba. După umectare se

d

110

îndepărtează imediat hârtia de filtru şi se pune în locul ei o matriţă pentru probe.

Matriţa trebuie să adere la gel. Cu o seringă cu Hamilton se introduce 1 µl de ser în

şanţul creat de matriţă şi se aşteaptă 5 minute pentru absorbţia serului în gel. După 5

minute se îndepărtează excesul de ser cu o bandă de hârtie de filtru. Se scoate

matriţa şi se pune lama pe puntea care se află în mijlocul camerei de electroforeză.

La extremităţile lamelor se aplică două hârtii de filtru Whatman îmbibate cu soluţie

tampon. Aceste hârtii de filtru sunt îndoite la capete astfel încât cu un capăt să

acopere aproximativ 1/2 cm din lungimea lamei (gelului), iar celălalt capăt să facă

legătura cu soluţia tampon din cuvele cu electrozi.

c.) Se închide etanş aparatul, se conectează cuvele la redresor şi se lasă probele la

migrat 1 h la 170 V.

d.) După migrare se scot lamele din camera de electroforeză şi se introduc 10 minute în

soluţia de fixare, aflată într-o cutie Petri.

e.) Colorarea se face prin îmbibare timp de 5 minute într-o soluţie de colorant aflat

într-o cutie Petri. Excesul de colorant de pe plăcuţe se îndepărtează prin spălare cu

apă distilată.

f.) Uscarea se poate face la termostat sau la temperatura camerei. Gelul uscat va avea

consistenţa unui film.

g.) Determinarea cantitativă a fracţiunilor proteice se face cu ajutorul unui densitometru

optic. Acesta trasează automat curba de extincţie (reflexie optică), care prezintă

atâtea maxime câte fracţiuni sunt. Aparatul calculează valorile procentuale ale

fracţiunilor proteice. În cazul serului normal, prin electroforeza în gel de agaroză,

rezultă următoarele 6 fracţiuni:

Fracţiunea Valoarea procentuală g/100ml

Albumine 50-59 3,50-4,20

α1 - Globuline 3-5 0,25-0,40

α2 - Globuline 7-9 0,50-0,65

β1 + β2- Globuline 11-14 0,80-1,02

γ - Globuline 16-20 1,10-1,40

Interpretarea valorilor fracţiunilor proteice.

111

1. Hiperalbuminemiile apar în puţine stări patologice, mai importante fiind leucozele

limfatice cronice.

2. Hiperglobulinemie globală (α, β, γ) se întâlneşte în cazul tumorilor maligne, bolilor

infecţioase acute sau cronice, afecţiunilor hepatice cronice, nefropatiilor cronice.

3. Hiperalfaglobulinemia asociată sau nu cu hiperbetaglobulinemia se întâlneşte în

inflamaţii acute (reumatism poliarticular acut, boli infecţioase acute, infarct

miocardic), sindrom nefrotic (cresc îndeosebi α2 – globulinele), tumorile maligne,

poliartrita reumatoidă.

4. Hiperbetaglobulinemia izolată se întâlneşte în β - plasmocitom, hepatite acute

virotice sau toxice, diabet zaharat, sindrom nefrotic, icter obstructiv prelungit.

5. Hiperalfa şi hipergamaglobulinemia sunt întâlnite în inflamaţiile acute şi cronice, în

tumori maligne.

6. Hipergamaglobulinemie izolată se întâlneşte în afecţiunile cu implicaţie

imunologică cum sunt:

- boli infecţioase acute sau cronice: hepatită virotică, mononucleoză infecţioasă;

- limfogranulomatoză benignă, tuberculoză, sifilis, stafilococi, streptococi

endocardită bacteriană subacută;

- colagenaze: poliartrită reumatoidă, lupusul eritematos diseminat, sclerodermie;

- afecţiuni hepatice: hepatite cronice, ciroze;

- afecţiuni neoplazice de sistem: boala Hodkin, leucemii.

7. Hipogamaglobulinemia se întâlneşte în :

- agamaglobulinemie şi hipogamaglobulinemie congenitală;

- afecţiuni digestive: inflamaţia mucoasei digestive, neoplasm digestiv;

- sindrom nefrotic;

- insuficienţă cardiacă;

- arsuri întinse;

- eczeme generalizate.

112

În figură sunt prezentate proteinogramele obţinute prin citirea

electroforegramelor la densitometru optic, în câteva cazuri patologice precum şi în

cazul normal. a) Normal (vezi tabelul de mai sus), b) Inflamaţie acută, c) Inflamaţie

cronică, d) Sindrom nefrotic, e) Enteropatie exudativă, f) Ciroză hepatică, g) Mielom

multiplu, h) Hipogamaglobulinemie.

Dozarea azotului neproteic din ser prin metoda Kjeldahl

Principiu:

Azotul neproteic reprezintă azotul din substanţele ce rămân în soluţie după

deproteinizarea serului (uree, acid uric, creatină, creatinină, aminoacizi, amoniac, etc.).

Dintre acestea azotul ureic reprezintă mai mult de 50 %. Diferenţa dintre azotul total

neproteic şi azotul ureic se numeşte azot rezidual.

După precipitarea şi îndepărtarea proteinelor conţinutul de azot neproteic se

determină după acelaşi principiu ca şi în cazul dozării azotului total din ser prin metoda

Kjeldahl.

Aparatură: Aparatul Wagner-Parnas.

Reactivi: - Fosfowolframat de sodiu 10 %

- H2SO4 0,58 N

- H2SO4 conc.

113

- Amestec catalizator CuSO4.5H2O şi K2SO4 (1:3)

- H2O2 3 %

- NaOH 30 %

- H2SO4 N/100 cu factorul FH2SO4

- NaOH N/100 cu factorul FNaOH

- Indicator Groak

Modul de lucru:

1) Deproteinizarea serului: Într-un flacon Erlenmeyer se introduc 2 ml ser, 4 ml

H2O bidistilată, 2 ml soluţie de fosfowolframat de sodiu şi 2 ml H2SO4 0,58 N. Se

agită energic şi după 10 minute proba se filtrează.

2) Mineralizarea : Într-un balon Kjeldahl se introduc 2 ml filtrat, 2 ml H2SO4

conc., 2-3 picături soluţie de H2O2 şi un vârf de spatulă de amestec catalizator.

Mineralizarea are loc pe flacără mică sub nişă. După 10 minute balonul Kjeldahl se

răceşte la temperatura camerei.

3) Spălarea aparatului Wagner-Parnas: se face ca mai sus.

4) Antrenarea NH3 cu vapori de apă : Se efectuează după modul descris la

dozarea azotului total, cu excepţia faptului că amoniacul pus în libertate se va capta în

10 ml H2SO4 N/100.

5) Titrarea: Excesul de H2SO4 se titrează cu o soluţie de NaOH N/100 în

prezenţa indicatorului Groak.

Calcul :

1 ml sol. H2SO4 N/100 ................. 0,14 mg N

a F b FH SO NaOH⋅ − ⋅2 4

.................. x

x = ( a F b FH SO NaOH⋅ − ⋅2 4

) × 0,14 mg N/0,4 ml ser

a = 10 ml H2SO4 N/100

b = volumul NaOH N/100 consumat la titrare

Rezultatul se exprimă în mg N neprot./100 ml ser.

Având în vedere că 50% din azotul neproteic este reprezentat de azotul ureic,

interpretarea ese aceeaşi cu cea de la uree.

Valori normale : 20 - 40 mg N neprot./ 100 ml ser

Valori crescute: se întâlnesc în afecţiuni renale ca insuficienţa renală cronică sau

în obstrucţii ale căilor urinare. Aceste valori se mai întâlnesc în arsuri, hemoragii

digestive, boala Addison.

114

Dozarea ureei din ser prin metoda cu urează

Principiu:

Ureea din ser este hidrolizată sub acţiunea unei enzime specifice, ureaza, şi se

descompune în amoniac şi dioxid de carbon. Amoniacul eliberat este determinat apoi pe

baza reacţiei pe care o dă cu fenolul şi hipocloritul de sodiu în mediu alcalin. (Reacţia

Berthelot).

parachinoncloroimina formată astfel, reacţionează cu o altă moleculă de fenol pentru a

forma indofenol care dezvoltă în mediu alcalin o intensă culoare albastră. Reacţia este

catalizată de nitroprusiatul de sodiu.

NO O-

Reactivi:

- urează tamponată: se dizolvă 1 g EDTA în 80 ml apă bidistilată şi se

ajustează, pH-ul la 6,5 cu NaOH diluat. Se adaugă apoi 150 mg urează şi se

completează volumul la 100 ml cu apă bidistilată. Se agită bine şi se

păsrează într-un vas de plastic.

- soluţie etalon de uree: 40 mg uree pură, uscată în prealabil în exicator, se

dizolvă în apă bidistilată aducându-se la 100 ml.

- reactiv fenolic. Se dizolvă 25 g fenol chimic pur în 400 ml apă bidistilată.

Separat se dizolvă 125 mg nitroprusiat de sodiu în 50 ml apă distilată. Se

amestecă cele două soluţii şi se aduce volumul la 500 m1.

- reactiv hipoclorit. Într-un balon de 500 ml se dizolvă 12,5 g NaOH în 400

ml apa bidistilată. Se adaugă apoi un volum de hipoclorit comercial

conţinând 1,10 g hipoclorit de sodiu (de regulă 20 ml soluţie). Se aduce

volumul la 500 ml.

Modul de lucru:

Se pipetează 0,2 ml suspensie urează într-o serie de eprubete. Se adaugă apoi cu

o pipetă câte 0,02 ml ser în probele de analizat, 0,02 ml apă distilată pentru proba oarbă

şi 0,02 ml soluţie de uree 40 mg% pentru proba standard. Se incubează eprubetele la

37°C pe baia de apa timp de 15 minute. Se scot eprubetele de la incubat şi se adaugă 1

ClO- +OH NH3 Cl+ O N

115

ml reactiv fenolic, se agită uşor şi se adaugă 1 ml reactiv hipoclorit alcalin. Se

incubează din nou la 37°C timp de 15 minute pentru dezvoltarea culorii. Se scot din

baie eprubetele şi se diluează prin adăugarea a 10 ml apă distilată. Se amestecă continuu

eprubetele şi se citeşte extincţia la 630 nm fată de proba oarbă.

Calcul: uree mg% = (E probei / E standardului )• 40

Dozarea ureei din ser prin metoda Kowarski

Principiu: Ureea este descompusă în mediu alcalin cu ajutorul soluţiei de

hipobromit de sodiu rezultând azot molecular, dioxid de carbon şi apă. Soluţia de

hipobromit de sodiu se prepară din Br2 şi NaOH .

Br2 + 2NaOH → NaOBr + H2O

O C NH2NH2

+ 3NaOBr + CO2 + 3 NaBr + 2 H2ON2

Dioxidul de carbon este fixat de către NaOH, aflat în exces în soluţia de

hipobromit de sodiu, sub formă de Na2CO3 conform reacţiei:

CO2 + 2NaOH → Na2CO3 + H2O

Azotul molecular degajat este măsurat volumetric în aparatul Kowarski.

116

Aparatură : Aparatul Kowarski are forma unui tub în formă de "U". Ramura

stângă (A) este prevăzută în partea superioară cu un robinet (a) şi este gradată atât

deasupra cât şi dedesubtul robinetului. Ramura dreaptă (B) nu este gradată şi are în

partea inferioară un robinet (b) cu trei căi în formă de T. De aici se ramifică şi tubul de

scurgere (C). Pe robinetul cu trei căi (b) direcţia căii verticale a T-ului este evidenţiată

de obicei ca o umflătură sau adâncitură (semn). Prin răsucirea acestui robinet se obţin

trei poziţii în funcţie de poziţia umflăturii robinetului: 1) semnul în spate : comunică A

cu B. 2) semnul în jos : comunică A cu C. 3) semnul în sus : comunică B cu C. 4)

semnul în faţă : comunică A şi B cu C

117

Reactivi: - Acid tricloracetic 10 %.

- Soluţie Kowarski : 350 g NaCl şi 150 g K2SO4 se dizolvă la

fierbere în 1000 ml H2O, se răceşte şi se filtrează.

- Soluţie NaOBr : se prepară proaspăt, adăugând sub nişă, sub

agitare, 12 picături de brom la 6 ml NaOH 33 %. Se păstrează

la gheaţă cel mult o săptămână.

Modul de lucru:

Deproteinizarea serului: într-un flacon Erlenmayer se pipetează 2,5 ml ser şi 2,5

ml acid tricloracetic 10 %. Se agită şi după 10 minute se filtrează.

Manipularea aparatului : Se umple aparatul cu soluţie Kowarski. Pentru aceasta se

stabileşte legătura între ramurile A şi B, se deschide robinetul "a" şi se toarnă soluţia

Kowarski în aparat prin ramura B până când lichidul depăşeşte nivelul robinetului "a"

cu 1-2 ml. Dacă rămâne aer în aparat, el se îndepărtează prin tubul de scurgere C

(semnul în jos), apoi se completează lichidul până la nivel. Se închide robinetul "a", se

îndepărtează cu o pipetă lichidul de deasupra şi se usucă cu o fâşie de hârtie de filtru.

Robinetul "b" se aşează cu semnul în jos. În ramura A se toarnă aproximativ 3,5 ml

filtrat. Se lasă să pătrundă în aparat, prin deschiderea robinetului "a", exact 2,5 ml

filtrat. Excesul de soluţie Kowarski se va scurge prin tubul C. Se îndepărtează cu o

pipetă restul filtratului, se spală cu H2O distilată şi se usucă din nou cu hârtie de filtru.

Se introduc apoi, prin ramura A, 6 ml soluţie de NaOBr. Se lasă să intre în aparat cca. 5

ml. Degajarea azotului începe imediat împingând în jos soluţia Kowarski care se scurge

prin tubul C. După 10 minute se aduce la nivelul ramurei A soluţia din ramura B, lăsând

să curgă din ramura B lichidul în exces (semnul în sus). Apoi se stabileşte comunicarea

între ramurile A şi B (semnul în spate). În acest fel azotul din aparat va avea aceiaşi

presiune cu cea a mediului înconjurător. Se citeşte volumul azotului degajat (vN2)

precum şi temperatura şi presiunea atmosferică. După dozare aparatul Kowarski se

goleşte şi se spală cu apă distilată pentru a evita blocarea robinetelor.

Calcul:

v FN2100× × = mg uree/100 ml ser

vN2 - volumul de azot degajat

F - factor de conversie din ml N2 în mg uree

118

Se caută în tabelul Kowarski factorul F care corespunde temperaturii şi

presiunii barometrice din timpul determinării. Această valoare se introduce în formula

de mai sus.

Baro-

metru 10º C 12º C 14º C 16º C 18º C 20º C 22º C 24º C 25º C

710 1,91 1,90 1,88 1,86 1,84 1,83 1,81 1,80 1,79

720 1,94 1,92 1,91 1,89 1,87 1,85 1,84 1,82 1,80

725 1,95 1,93 1,92 1,90 1,89 1,87 1,85 1,83 1,82

730 1,97 1,94 1,93 1,91 1,90 1,88 1,87 1,85 1,83

735 1,98 1,96 1,94 1,93 1,91 1,89 1,88 1,86 1,84

740 1,99 1,97 1,96 1,94 1,92 1,90 1,89 1,87 1,86

745 2,01 1,99 1,98 1,96 1,94 1,92 1,91 1,89 1,87

750 2,02 2,00 1,99 1,97 1,95 1,93 1,92 1,90 1,88

755 2,04 2,02 2,00 1,98 1,96 1,95 1,93 1,92 1,90

760 2,05 2,03 2,01 2,00 1,98 1,96 1,95 1,93 1,91

765 2,06 2,05 2,03 2,01 1,99 1,97 1,96 1,94 1,92

770 2,08 2,06 2,04 2,02 2,00 1,98 1,97 1,95 1,93

Valori normale : 21 - 54 mg uree/100 ml ser sau 3,5 – 9,0 mmoli/l

Valori crescute : Patologic creşterea ureei poate fi de origine renală sau

extrarenală.

Cauze de origine renală: insuficienţă renală acută sau cronică; (eliminare scăzută),

glomerulonefrită acută sau cronică, nefroangioscleroză

benignă sau malignă, tuberculoză renală, tumori renale,

rinichi polichistic, calculoză.

Cauze de origine extrarenlă: stări de exsicoză şi şoc provocate de hemoragii, arsuri,

traumatisme;

Valori scăzute : - insuficienţă hepatică gravă (ciroză)(sinteză scăzută)

119

Dozarea acidului uric din ser

Principiu:

Acidul uric (catabolitul final al nucleotidelor purinice) reduce în mediu alcalin

reactivul fosfowolframic până la un produs de culoare albastră. Intensitatea culorii este

proporţională cu concentraţia acidului uric în proba de analizat.

Reactivi: - Acid tricloracetic 20%

- Reactiv fosfowolframic: într-un balon de 1000 ml prevăzut cu

refrigerent cu reflux, se introduc 50 g wolframat de sodiu, 40

ml H3PO4 85% (d = 1,71 g/cm3) şi 350 ml apă bidistilată. Se

fierbe lent aproximativ 6 ore. Se răceşte balonul şi conţinutul

său se trece cantitativ într-un balon cotat de 500 ml. Se aduce

la semn cu apă bidistilată. Dacă reactivul este verde se adaugă

1-2 picături de brom şi se fierbe câteva minute fără refrigerent

pentru îndepărtarea excesului de brom. Reactivul are culoarea

galben-verde deschis, păstrat în sticlă brună, el nu se alterează.

Reacţia este următoarea:

12 Na2WO4 + 9 H3PO4 = P(W2O7)6H7 + 8 Na3PO4 + 10 H2O

- Na2CO3 crist 22%

- Soluţie stoc de acid uric: se introduc în aproximativ 60 ml apă

bidistilată caldă (60°C) 100 mg acid uric, 200 mg fosfat disodic,

100 mg fosfat monosodic şi se agită până la dizolvare completă.

După răcire se completează la 100 ml cu apă bidistilată într-un

balon cotat. Soluţia stoc, închisă ermetic prin parafinare (după

adăugare de 3-4 picături de cloroform) se poate păstra 4-5 luni la

temperatura de +4°C.

- Soluţia standard de acid uric se prepară prin diluarea soluţiei

stoc: 1 ml se aduce la 100 cu apă bidistilată.

Modul de lucru:

a) Deproteinizarea serului: Într-un balon Erlenmeyer se introduc 2 ml ser, 4 ml apă

bidistilată si 2 ml acid tricloracetic 20%. Se agită puternic şi după 10 minute se

filtrează.

b) Reducerea reactivului fosfowolframic se realizează efectuând următoarele

amestecuri în eprubete care apoi se agită energic:

120

Probă Standard Blanc

Filtrat, ml 2,0 - -

Sol. standard, ml - 2,0 -

Apă distilată, ml - - 2,0

Na2CO3 22%, ml 0,9 0,9 0,9

Reactiv fosfowolframic, ml 0,1 0,1 0,1

Se lasă eprubetele în repaus 10 minute la temperatura camerei, apoi se măsoară

extincţia probei şi a standardului faţă de blanc la λ=610 nm în cuva de 1 cm.

Observaţie: În cazul că proba prezintă opalescenţă, ea se centrifughează înainte

de măsurarea estincţiei.

Calcul:

concentraţia standardului = 1 mg%

2 ml filtrat corespunde la 0,5 ml ser ( diluţia serului= 2/0,5 = 4)

Ep/Es x 1 x 4 = mg acid uric/100 ml ser iar mg % x 60 = μmoli/l

Valori normale: 2-8 mg acid uric/100 ml ser ( 119 - 476 μmoli/l )

Valori crescute: fiziologic: după efort fizic accentuat sau după ingestia unor

cantităţi crescute de alimente bogate în acizi nucleici (ficat,

testicule).

patologic: a) hiperuricemie primară (biosinteză crescută sau

eliminare renală scăzută)

b) hiperuricemie secundară, destrucţie celulară

accentuată în tumori maligne, anemie hemolitică,

pneumonie severă etc.; eliminare renală scăzută

(insuficienţă renală, acidoză metabolică si

respiratorie)

Hiperuricemia de durată determină acumularea acidului uric în organism şi apariţia

gutei.

Valori scăzute: mai rar întâlnite, apar în urma administrării unor medicamente, defecte

enzimatice (xantinurie ereditară), afecţiuni hepatice grave.

121

Dozarea creatininei din ser prin metoda Folin

Principiu:

Creatinina reacţionează cu acidul picric (galben) în mediu alcalin dând naştere

unui produs a cărui coloraţie poate fi de la orange la roşu aprins. Intensitatea coloraţiei

roşii este proporţională cu concentraţia creatininei din probă. Coloraţia se datorează

formării unor tautomeri coloraţi ai creatininei, unul din ei fiind stabilizat prin

complexare de un mezomer al acidului picric (reacţia Jaffé).

Reactivi: - Wolframat de sodiu 10%.

- H2SO4 2/3N.

- Soluţie saturată de acid picric.

- NaOH 10%.

- Soluţie picrat alcalin; se prepară înainte de utilizare prin

amestecarea unui volum de soluţie de acid picric cu 2 volume

NaOH 10%

- Soluţie stoc de creatinină: se dizolvă în HCl 0,1N 100 mg

creatinină pură sau 160,2 mg clorură de zinc creatinină şi se

aduce volumul la 100 ml cu HCl 0,1N

- Soluţia standard de creatinină se obţine diluându-se 1 ml din

soluţia standard stoc la 100 ml cu apă bidistilată. Această soluţie

conţinând 0,01 mg creatinină/ml trebuie reînnoită săptămânal.

Modul de lucru:

Într-un balon Erlenmeyer se introduc 2 ml de ser şi 6 ml acid picric saturat şi se

agită energic. Se introduce balonul pentru 15-20 secunde într-o baie de apă fierbinte.

După răcire se filtrează într-o eprubetă iar din filtrat se măsoară 5 ml. Se adaugă 0,25 ml

soluţie de NaOH 10% se agită şi peste 15 minute se citeşte extincţia probei (Ep) faţă de

martor la λ = 530 nm. Martorul este soluţia de picrat alcalin, căreia în loc de ser i s-au

adăugat 2 ml apă bidistilată. În paralel se efectuează aceleaşi operaţii, în locul serului

folosindu-se soluţie standard de creatinină. Extincţia obţinută este Es.

Complex roşu portocaliu de titrat de creatinină

122

Calcul:

Ep/Es = mg creatinină/100ml ser.

Valori normale: 0,6-1,8 mg/100ml ser sau 53-159 μmoli/l.

Variaţii fiziologice: nivelul seric al creatininei suferă doar foarte mici variaţii în

condiţii fiziologice. El poate creşte în condiţiile unei diete foarte bogate în proteine.

Clearance-ul endogen de creatinină (fără aport exogen de creatinină) este un indicator al

filtrării glomerulare la subiecţii normali.

Valori patologice crescute: se întâlnesc în insuficienţă renală cronică (este ultima

substanţă azotată care creşte în sânge în aceste condiţii, ca şi în condiţiile fiziologice),

distrofia musculară progresivă, eclampsie, acromegalie.

Dozarea bilirubinei din ser prin diazorecţia van den Bergh

Principiu:

Bilirubina reacţionează cu diazo-reactivul Ehrlich (acid sulfanilic diazotat) şi

formează azopigmenţi, care au culoare roşie în mediu slab acid sau neutru (reacţia van

den Bergh). Azopigmentul A este un fragment de bilirubină cuplată cu sarea de diazoniu

a acidului sulfanilic iar azopigmentul B este un fragment de bilirubină conjugată cuplată

cu aceiaşi sare de diazoniu. Intensitatea coloraţiei este proporţională cu concentraţia

bilirubinei din ser.

Bilirubina + 2 NN SO3

Azopigmnet A (B)

CH3

2

CHO N NH H

CH=CH2 CH3 CH2 CH2 COOH(R)

N=N SO3

+

H

R: radical de acid glutaric

Ionul de diazoniu

Reactivi:

- Soluţie HCl 1N;

- Soluţie de cofeină-benzoat-acetat: se cântăresc şi se amestecă 20 g

cofeină pură, 30 g benzoat de sodiu, 50 g acetat de sodiu. Se adaugă 400

ml apă bidistilată şi se dizolvă încălzind uşor. După răcire se filtrează.

- Reactiv diazo: Sol.A: se măsoară 0,5 g acid sulfanilic într-un balon

cotat de 500 ml, se adaugă 125 ml HCl 1N şi se completează până la

semn cu apă bidistilată

123

Sol.B: NaNO2 0,5%

Înainte de întrebuinţare se amestecă 10 ml soluţie A cu 0,3 ml soluţie B.

- NaCl 0,9%

Bilirubina neconjugată (bilirubina indirectă) în stare liberă nu este hidrosolubilă,

este menţinută în soluţie apoasă prin legarea sa strânsă pe albumină. Această bilirubină

nu reacţionează direct cu reactivul diazo ci doar în prezenţă de acceleratori (alcooli

inferiori, cofeină, etc.), care o eliberează din legătura cu albumina şi o menţin în soluţie.

Nu se filtrează la nivel glomerular, deci în mod normal nu apare în urină.

Bilirubina conjugată (bilirubina directă) hidrosolubilă reacţionează direct cu

reactivul diazo. Se filtrează la nivel glomerular şi apare în urină.

Se dozează paralel bilirubina totală (directă + indirectă) si bilirubina directă.

Modul de lucru: Se lucrează în trei eprubete după tabelul de mai jos:

Bilirubina totală Bilirubina directă Blanc

reactiv Ehrlich ml 0,5 0,5 -

sol. de cofeină ml 3,5 - -

NaCl 0,9% ml - 3,5 4,0

ser ml 1,0 1,0 1,0

După amestecarea reactivilor se agită energic eprubetele iar după 5 minute se

citesc extincţiile la λ = 530 nm, în cuva de 1 cm faţă de blanc.

Calcul:

Rezultatul se calculează cu ajutorul coeficientului de extincţie specific

procentual (a) al azopigmentului la λ = 530 nm:

1g% 1mg% a = E1cm = 943, de unde E1cm = 0,943

Volumul final (Vf ) = 5,0 ml; volumul probei (Vp) = 1,0 ml; diluţia probei =

Vf/Vp = 5

Ep = extincţia citită

Concentraţia bilirubinei (bilirubinemia) se calculează cu formulele:

mg bilirubină/100 ml ser = 3,5×× p1mg%1cmp Esau 5/EE

μmoli bilirubină/l ser = Ep x 91 ştiind că Mbilirubină = 584

124

Se calculează separat valoarea bilirubinemiei totale şi a celei directe iar diferenţa

între aceste două valori reprezintă bilirubinemia indirectă.

Valori normale: Circa 1 mg% (cca.17 μmoli/l) bilirubină totală, din care

bilirubina directă cca. 0,25 mg% (4,3 µmoli/l).

Valori crescute: Bilirubina se va infiltra determinând apariţia unei coloraţii

gălbui a scleroticelor şi a tegumentelor (icter) la valori de peste 3 mg% (51μmoli/l).

Hiperbilirubinemiile pot fi cauzate de:

- creşterea vitezei de formare a bilirubinei în urma degradării excesive

a hemoglobinei (hemoliză) în icterul hemolitic;

- scăderea capacităţii de conjugare a ficatului cauzează

hiperbilirubinemia indirectă (10-40mg%) la homozigoţi (sindromul

Crigler-Najjar de tip I);

- scăderea capacităţii de eliminare a bilirubinei de către ficat (boala

Gilbert);

- perturbarea eliminării prin bilă a bilirubinei în urma blocării căilor

biliare (calculi, tumori cum ar fi neoplasmul de cap de pancreas) în

icterul mecanic;

- deficitul intrahepatic de eliminare activă a bilirubinei conjugate de la

nivelul microsomilor hepatici în canaliculele biliare (sindrom Dubin-

Johnson) determină hiperbilirubinemie directă (2-10 mg%);

- icterul neonatal, datorat imaturităţii sistemelor de epurare a

bilirubinei la nou născut când bilirubinemia este crescută (4-5 mg%)

temporar (1-2 zile) după care revine la normal.

Glucoza

Determinarea glicemiei prin metoda Hagedorn-Jensen (titrimetrică)

Glucoza este repartizată în mod inegal şi variabil între plasmă şi eritrocite, de

aceea dozarea ei se face din sângele total, recoltat pe florură de sodiu. Aceasta previne

coagularea sângelui şi inhibă glicoliza.

125

Principiu:

Glucoza prezentă în filtratul de sânge (deproteinizat), reduce cantitativ

fericianura de potasiu în ferocianură de potasiu.

K3[Fe(CN)6] + glucoză K4[Fe(CN)6] + acid gluconic

Excesul de fericianură eliberează iodul din iodura de potasiu în mediu acid.

2 K3[Fe(CN)6] + 2 KI CH

3COOH 2 K4[Fe(CN)6] + I2

Această reacţie fiind reversibilă, deplasarea ei spre dreapta se realizează prin

precipitarea ferocianurii sub formă de sare dublă de zinc şi de potasiu. Acelaşi rol are şi

asigurarea mediului acid (CH3COOH).

2 K4[Fe(CN)6] + 3 ZnSO4 K2Zn3[Fe(CN)6] ↓ + 3 K2SO4

Iodul pus în libertate se titrează cu tiosulfat de sodiu, în prezenţa amidonului ca

indicator.

2 Na2S2O3 + I2 Na2S4O6 + 2 NaI

Reactivi: - NaOH N/10

- ZnSO4 0,45 % (se păstrează aproximativ trei săptămâni)

- K3[Fe(CN)6] N/200 (într-un balon cotat de 1000 ml se măsoară

1,65 g fericianură de potasiu pură, 10,6 g carbonat de sodiu pur

anhidru şi apă distilată până la semn)

- ZnSO4 - NaCl (se măsoară 100 g sulfat de zinc, 500 g clorură

de sodiu şi apă distilată până la 1600 ml)

- KI 2,5 %

- CH3COOH 3 % (3 ml acid acetic glacial, H2O distilată până la

100 ml)

- Reactivul KI – ZnSO4 – NaCl: 5 ml KI 2,5% + 20 ml sol.

ZnSO4 – NaCl

- Amidon 1%

- KIO3 N/200 F KIO3= 1,000

- Na2S2O3 N/200 (factorul soluţiei se verifică prin titrare cu

soluţia de KIO3 N/200)

126

Modul de lucru:

Se lucrează cu 4 eprubete, din care primele două vor fi pentru probe, celelalte

două pentru blancul reactivilor.

Deproteinizarea: În fiecare eprubetă se măsoară1 ml NaOH N/10 + 5 ml ZnSO4

0,45 %. Se formează un precipitat gelatinos de hidroxid de zinc care serveşte la

deproteinizarea prin adsorbţie a proteinelor coagulate ale sângelui. Se adaugă apoi

numai în primele două eprubete, pentru probe câte 0,1 ml sânge. În continuare nu există

nici o deosebire între prelucrarea probelor şi a blancului. După agitare se pun toate

eprubetele pe un stativ, se introduc într-o baie de apă clocotind şi se fierb 5 minute.

După fierbere se filtrează conţinutul eprubetelor prin filtrele pregătite în prealabil, în

tuburi Hagedorn (sau baloane Erlenmeyer de 50 ml). Pentru a evita pierderi de glucoză

se spală eprubetele, de 2 ori cu câte 3 ml apă distilată fiartă trecând şi această apă

distilată prin filtru.

Reducerea fericianurii: Se adaugă la filtratul din fiecare balon câte 2 ml

fericianură de potasiu N/200 (măsuraţi foarte exact). Se agită uşor şi se introduc

baloanele pentru 15 minute într-o baie de apă în fierbere. După răcirea baloanelor într-

un curent de apă, se introduc câte:

- 2 ml din reactivul KI - ZnSO4 - NaCl.

- 2 ml acid acetic 3 %

- 2 picături amidon 1 %.

Se titrează soluţiile din tuburile Hagedorn (baloane Erlenmeyer) cu tiosulfat de

sodiu N/200 până la dispariţia culorii albastre.

Calcul:

Calculul se face cu ajutorul unui tabel care dă echivalenţa dintre numărul de ml

de tiosulfat folosit la titrare şi concentraţia glucozei în mg/100 ml. Se ia media probelor

paralele şi cifra obţinută se înmulţeşte cu factorul tiosulfatului. Se procedează la fel şi în

cazul blancurilor, care ne oferă o măsură a impurităţilor reducătoare din reactivi. Se

caută în tabelul dat concentraţiile de glucoză corespunzătoare. Din "glicemia" probei se

scade "glicemia" blancului. Diferenţa obţinută exprimă concentraţia de glucoză în

mg/100 ml de sânge analizat.

127

TABEL

Relaţia dintre ml de Na2S2O3 N/200 consumat la titrare şi glicemia în mg %

Na2S2O3 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09

0,0 385 382 379 376 373 370 367 364 361 358

0,1 355 352 350 348 345 343 341 338 336 333

0,2 331 329 327 325 323 321 318 316 314 312

0,3 310 308 306 304 302 300 298 296 294 292

0,4 290 288 286 284 282 280 278 276 274 272

0,5 270 268 266 264 262 260 259 257 255 253

0,6 251 249 247 245 243 241 240 239 236 234

0,7 232 230 228 226 224 222 221 219 217 215

0,8 213 211 209 208 206 204 202 200 199 197

0,9 195 193 191 190 188 186 184 182 181 179

1,0 177 175 173 172 170 168 166 164 163 161

1,1 159 157 155 154 152 150 148 146 145 143

1,2 141 139 138 136 134 132 131 129 127 125

1,3 124 122 120 119 117 115 113 111 110 108

1,4 106 105 102 101 99 97 95 93 92 90

1,5 88 86 84 83 81 79 77 75 74 72

1,6 70 68 66 65 63 61 59 57 56 54

1,7 52 50 48 47 45 43 41 39 38 36

1,8 34 32 31 29 27 25 24 22 20 19

1,9 17 15 14 12 10 8 7 5 3 2

Exemplu: media volumelor soluţiei de tiosulfat întrebuinţată pentru titrare

celor 2 probe să o presupunem 1,53. Aceasta se înmulţeşte cu factorul pe care îl

presupunem 0,9660.

1,53 × 0,9660 = 1,47798 ≈ 1,48 ml tiosulfat N/200

Media probelor în alb (blancuri) să fie 1,85 care se înmulţeşte cu factorul, adică,

1,85 × 0,9660 = 1,7871 ≈ 1,79 ml tiosulfat N/200.

La 1,48 ml tiosulfat corespund în tabel 92 mg glucoză/100 ml, iar la 1,79 ml, 36

mg %.

128

Rezultatul este dat de diferenţa: 92 - 36 = 56 mg/100 ml.

Mmoli/l = (mg/100 ml) × 10/180 = (mg/100 ml) × 0,055; (M glucoză = 180)

În condiţiile de mai sus, mmoli/l = 56 x 0,055 = 3,08. Valoarea obţinută indică

hipoglicemie.

Valori normale: 4,4 - 6,6 mmoli/l (80 - 120 mg %)

Dozarea glucozei prin metoda enzimatică (glucozoxidază)

Principiu:

Glucoza, sub acţiunea glucozoxidazei, se transformă în acid gluconic. H2O2

rezultată va fi descompusă de peroxidază, în urma reacţiei la care participă şi indicatorul

Trinder (fenol şi 4-aminoantipirină), rezultând un produs de condensare colorat în roşu

cu absorbţie maximă la λ = 505 nm. Extincţia este direct proporţională cu concentraţia

glucozei. Reacţiile care stau la baza metodei sunt următoarele:

glucozoxidază Glucoză + O2 + H2O acid gluconic + H2O2

peroxidază 2 H2O2 + Fenol + 4-Aminoantipirina Chinonimină + 4 H2O

(roşu)

Reactivi: 1). Reactiv 1 conţine: tampon TRIS-Cl sau Sörensen 90 mmoli/l şi

fenol 0,3 mmoli/l (pH = 7,5 ).

2). Reactiv 2 conţine: glucozoxidază 10000 U/l, peroxidază 1000 U/l

şi 4-aminoantipirină 2,6 mmoli/l

3). Reactiv 3 conţine: standard de glucoză 5,56 mmoli/l (1g/l sau 100

mg %)

Probe: ser nehemolizat, plasmă heparinată, sânge deproteinizat, LCR

(lichid cefalorahidian).

Modul de lucru:

Se amestecă conţinutul unei sticluţe de reactiv 2 cu conţinutul unei sticluţe de

reactiv 1, obţinând astfel reactivul de lucru. Stabilitatea soluţiei la 20 - 25 oC este 2

săptămâni, iar la 2 - 8oC este de o lună.

Se prepară următoarele soluţii:

129

Blanc Standard Probă

H2O distilată 10 μl - -

Standard - 10 μl -

Probă - - 10 μl

Reactiv de lucru 1 ml 1 ml 1 ml

Se agită conţinutul eprubetelor şi se incubează timp de 10 minute la 37 oC sau 30

minute la temperatura camerei (20 - 25 oC). Se măsoară extincţia probei faţă de blanc la

505 nm (490 - 550 nm). Culoarea formată este stabilă 30 minute.

Calcul:

E probă Cprobă = × Cstandard E standard

Cstandard este 5,56 mmoli/l, sau 100 mg %, în funcţie de unităţile de măsură

folosite la exprimarea concentraţiei glucozei din soluţia standard.

Linearitate: Extincţia este direct proporţională cu concentraţia glucozei până la

22,22 mmoli/l (sau 400 mg %). Dacă concentraţia glucozei depăşeşte această valoare, se

diluează proba cu ser fiziologic şi se repetă determinarea. La calcularea rezultatului se ia

în considerare diluţia.

Valori normale: ser, plasmă: 3,9 - 5,8 mmoli/l (70,2 – 104,45 mg %)

LCR: 2,8 - 3,9 mmoli/l (50,4 – 70,2 mg %)

Teste rapide pentru determinarea glicemiei

În practica medicală curentă se folosesc tot mai des glucometrele (aparate mici,

asemănătoare cu un calculator de buzunar), care determină glicemia prin metodă

enzimatică specifică pentru glucoză. Determinarea se face cu ajutorul unor stripsuri

(kituri, benzi de hârtie impregnate cu reactivi).

Mod de utilizare:

Efectuăm pregătirile pentru prelevarea sângelui din pulpa degetului, apoi pornim

aparatul, care începe numărătoarea inversă. Înţepăm un deget şi punem o picătură de

sânge pe strips. Peste un minut, la semnalul sonor al aparatului, înlăturăm prin

tamponare cu hârtie excesul de sânge de pe banda cu reactivi. Introducem kitul în aparat

130

şi, la unele tipuri, apăsăm butonul de măsurare. Peste câteva momente apare pe ecran

valoarea glicemiei în unitatea de măsură folosită de aparatul respectiv.

Avantajele metodei: - Este o metodă rapidă, precisă şi specifică pentru glucoză

- Se poate folosi în dispensare medicale şi la domiciliu,

fiind foarte utilă în monitorizarea glicemiei la bolnavii diabetici

- Unele aparate au şi memorie în care sunt păstrate

ultimele valori ale glicemiei

- Necesită o cantitate foarte mică de sânge (o picătură).

Valori normale: 70 - 110 mg % (3,89 - 6,11 mmoli/l)

Valorile obţinute la determinarea glicemiei depind de metoda folosită.

În sânge, alături de glucoză, sunt şi alte substanţe reducătoare (glutation, acid

ascorbic, acid uric, cisteină). Din acest motiv valorile glicemiei obţinute prin metode

chimice, care se bazează pe proprietatea reducătoare a glucozei (metoda Hagedorn-

Jensen, colorimetrie cu reactiv arseno-molibdenic) sunt mai ridicate decât cele obţinute

prin metoda enzimatică specifică cu glucozoxidază. Metoda colorimetrică cu o-toluidină

dă rezultate mai apropiate de valorile obţinute prin metoda enzimatică.

Interpretarea medicală a valorilor glicemiei

Valori crescute: Hiperglicemia trecătoare poate fi de origine alimentară sau în

legătură cu stări emoţionale. Postprandial glicemia creşte uşor, în cazul consumului

excesiv de glucide chiar până la instalarea unei glicozurii.

Hiperglicemia de durată este caracteristică în primul rând pentru diabetul zaharat

(diabetes mellitus). În formele de diabet asimptomatic (diabet chimic) glicemia este

adesea normală şi tulburările metabolice (insuficienta de insulină) pot fi stabilite numai

prin proba de încărcare cu glucoză (proba hiperglicemiei provocate).

Proba numită test oral de toleranţă pentru glucoză (TOTG) constă din

administrarea orală la pacient a unei cantităţi de aproximativ 70 g glucoză (1 g/kg corp).

Se urmăreşte din jumătate în jumătate de oră variaţia glicemiei faţă de valoarea iniţială

măsurată pe nemâncate (vezi schema). În cazuri fiziologice, creşterea maximă a

glicemiei după încărcare nu depăşeşte valoarea de 8,8 mmoli/l (160 mg %) în prima oră,

iar după 2 ore revine sub 6,6 mmoli/l (120 mg %), şi atinge nivelul iniţial la cca. 3 ore .

131

În cazurile uşoare de diabet, când glicemia nu depăşeşte valoarea de 180 mg %

(10 mmoli/l), glicozuria este absentă. În cazuri de gravitate medie valoarea glicemiei

este de 200-300 mg %, iar în cazuri grave poate creşte până la 39 mmoli/l (702 mg %)

sau mai mult, fiind însoţită de glicozurie masivă. Evidenţierea accidentală a glicozuriei

este uneori semnul care atrage atenţia asupra unui diabet asimptomatic.

Sarcina este o stare care scade toleranţa la glucoză şi produce diabet gestaţional

la aproximativ 3 % din gravide, uneori cu repercusiuni grave asupra fătului.

Monitorizarea glicemiei şi glicozuriei este foarte importantă în aceste cazuri pentru

stabilirea dozelor de insulină.

Informaţii suplimentare asupra valorilor retroactive ale glicemiei ne furnizează

nivelul hemoglobinei glicozilate. Valorile crescute ale acesteia se corelează bine cu

nivele mari de glicemie pe perioade lungi.

Creşteri ale glicemiei apar în diferite disfuncţii endocrine cum ar fi hipersecreţia

de adrenalină, glucagon, ACTH (hormon adrenocorticotrop), STH (hormon

somatotrop), cortizol - hormonii enumeraţi având acţiune antagonistă cu cea a insulinei.

Ei stimulează adenilat ciclaza cu formare de AMP ciclic, care intensifică glicogenoliza

şi gluconeogeneza. Persoanele care sunt tratate timp îndelungat cu corticosteroizi (astm

bronşic, poliartrită reumatoidă) pot dezvolta aşa numitul diabet steroid. Hormonii

tiroidieni (T3, T4) au acţiune hiperglicemiantă prin creşterea absorbţiei glucidelor la

nivel intestinal, stimularea gluconeogenezei şi a secreţiei de adrenalină.

Valori scăzute ale glicemiei survin în primul rând după administrarea de doze

excesive de insulină. La valori sub 40 mg % apar simptome hipoglicemice manifestate

prin stări convulsive în urma deficienţei de aport glucidic la nivelul celulelor cerebrale.

Hipoglicemie apare şi în cazul insulinomului (adenomul insulelor Langerhans), tumoră

132

care secretă cantităţi mari de insulină. Disfuncţii endocrine cum ar fi insuficienţa

hipofizară, tiroidiană, corticosuprarenală precum şi afecţiunile hepatice grave şi

tulburări de absorbţie pot induce stări hipoglicemice. O uşoară şi trecătoare

hipoglicemie poate să fie de origine alimentară.

Alte tehnici de determinare a glicemiei în laborator

Metoda cu o-toluidină

Principiu:

Glucoza, în mediu de acid acetic, formează la cald cu o-toluidină un produs

colorat în verde, care se fotometrează.

Metoda Nelson-Somogyi

Principiu:

Glucoza reduce la cald soluţia bazică a complexului cupri-tartric. Ionii cuproşi

formaţi reduc în mediu acid ionul complex arsenomolibdenic cu formarea de substanţe

de culoare albastră fotometrabilă.

Metoda enzimatică cu hexokinază şi glucozo-6-fosfat dehidrogenază

Principiu:

hexokinază Glucoză + ATP Glucozo-6-fosfat + ADP

G-6-P DH Glucozo-6-fosfat + NADP+ Gluconat-6-P + NADPH + H+

Se măsoară extincţia în UV a probei şi a soluţiei standard cu concentraţie

cunoscută, şi se calculează glicemia.

Dozarea beta-lipoproteinelor după Burstein

Principiu:

Beta-lipoproteinele din ser sunt precipitate selectiv de heparinatul de calciu în

soluţie de clorură de calciu cu forţă ionică joasă. Se măsoară turbiditatea soluţiei şi se

exprimă în unităţi arbitrare.

Reactivi: - Clorură de calciu 0,025 M

- Sol. heparină 0,2%

133

Modul de lucru:

Se pipetează în două erubete, proba (P) şi blanc (B), următoarele soluţii:

P B Clorură de calciu ml 5,0 5,0 H2O bidistilată ml - 0,1 Sol. de heparină ml 0,1 - Ser ml 0,1 0,1

Se agită şi se lasă în repaus 5 minute la temperatura camerei. Apoi se măsoară

extincţia probei (EP) şi a blancului (EB), faţă de H2O bidistilată la λ =6 45 nm în cuva de

1 cm. Turbiditatea serului depinde de numărul de chilomicroni şi de conţinutul în

grăsimi neutre. Din această cauză serul trebuie să provină din sânge recoltat pe

nemâncate. Determinarea trebuie să se facă în ziua recoltării sângelui.

Calcul:

Rezultatele sunt exprimate direct în unităţi de extincţie:

1) Turbiditatea serului: E = EB ⋅ Vfinal/Vser = EB ⋅ 52

2) Conţinutul în beta lipoproteine:

E = (EP - EB) ⋅ 52

Valori normale: 1) Turbiditatea serului: 0-0,1 U. extincţie

2) Beta-lipoproteine: 4,0-10,0 U. extincţie

Fracţionarea electroforetică a lipoproteinelor în gel de agaroză produce

următoarele fracţiuni care sunt în următoarea corespondenţă aproximativă cu fracţiunile

separabile în câmp centrifugal: chilomicronii corespunzători alfa2 – lipoproteinelor şi

care rămân pe linia de start, beta-lipoproteinele care corespund LDL, pre-beta

lipoproteinele care corespund VLDL şi alfa1-lipoproteinele care corespund HDL.

Tipurile de dislipidemie: Pe baza modificărilor cantitative ale fracţiunilor

lipoproteice şi ale conţinutului acestora în colesterol, fosfolipide şi trigliceride,

Fredrickson a stabilit 5 fenotipuri de dislipidemie:

Tipul I.: chilomicronemie şi hiper-VLDL, cu creşterea trigliceridelor şi

cu ser lactescent datorate deficitului de lipoproteinlipază sau de apoCII. Se mai numeşte

hipertrigliceridemie familială.

Tipul II.a: creşterea colesterolului şi a LDL, cu ser clar datorată

deficitului în receptori apoB100. Se mai numeşte hipercolesterolemie familială.

134

Tipul II.b: creşterea concomitentă a colesterolului şi a trigliceridelor, ser

clar, sau opalescent. Cresc concomitent LDL şi VLDL. Se mai numeşte hiperlipidemie

combinată familială.

Tipul III.: anomalie ereditară rar întâlnită (boala "betei late") cu creştera

concomitentă a colesterolului şi a trigliceridelor, ser lactescent. Se datorează deficitului

de clarificare hepatică a IDL şi chilomicronilor remanenţi. Este cauzat de lipsa de apoE

şi de lipoproteinlipază hepatică.

Tipul IV.: creşterea trigliceridelor endogene (VLDL), ser clar sau

opalescent.

Tipul V.: creşterea chilomicronilor endogeni şi exogeni, a colesterolului,

cu LDL şi VLDL crescute, HDL scăzute, ser opalescent sau uneori lactescent.

Dozarea colesterolului total din ser prin metoda enzimatică

Principiu:

Kit-ul enzimatic conţine următoarele enzime care catalizează reacţiile indicate

mai jos:

Colesterol esteraza catalizează reacţia de hidroliză a esterilor de colesterol

rezultând colesterol liber şi acizi graşi:

colesterol-estează

esteri de colesterol + H2O <-----------------> colesterol + acizi graşi

În prezenţa colesterol oxidazei colesterolul suferă o reacţie de oxidare cu

formarea a 4-Δ colestenonei şi a apei oxigenate:

colesterol-oxidază

colesterol + O2 --------------> 4-Δ colestenona + H2O2

Sub acţiunea peroxidazei apa oxigenată reacţionează cu fenolul şi 4-amino

antipirina formând un compus chinonic de culoarea roşie, fotometrabilă:

peroxidază

2 H2O2 + fenol + 4-amino-antipirină ----------------> compus chinonic + 4H2O

Reactivi: Reactivul pentru colesterol conţine în soluţie tampon: colesterol

esteraza, colesterol oxidaza, peroxidaza, fenol, 4-amino-antipirină.

Mod de lucru:

Se pregătesc 3 eprubete în care se pipetează:

135

P S B

Reactiv pt. colesterol 2 ml 2 ml 2 ml

H2O bidistilată - - 20 μl

Sol. standard de colesterol (200 mg%) - 20 μl -

Ser 20 μl - -

Se agită şi se incubează 5 minute la 37°C. Apoi se citeşte extincţia probei (P) şi

a standardului (S) faţă de blanc (B) la λ = 500 nm în cuva de 1 cm.

Calcul: mg colesterol/100 ml ser = Ep/Es ⋅ 200

Valori normale: 150-250 mg%

Dozarea colesterolului total şi liber

Principiu:

Colesterolul liber din ser se extrage cu etanol şi apoi se precipită cu digitonină.

Diferenţa dintre colesterolul total şi colesterolul liber reprezintă colesterolul esterificat.

Reactivi: - Soluţie de clorură ferică: se prepară din 2,5g FeCl3. 6H2O în

urma adăugării a 100ml H3PO4 85%.

- Reactivul de culoare: 4ml soluţie de clorură ferică se dizolvă în

50ml H2SO4 concentrat.

- Soluţie de digitonină 1%: se dizolvă 1g digitonină în 50ml

etanol 95% şi se aduce la 100ml cu apă bidistilată. Se păstrează la

întuneric max. timp de 6 luni.

- Standard de colesterol (0,2%): se dizolvă 2000mg colesterol pur

în 100ml acid acetic glacial şi se diluează de 10 ori (1ml în 10ml)

cu acid acetic glacial.

Observaţii: 1. Eprubetele şi pipetele trebuie să fie perfect curate şi uscate,

reacţia fiind influenţată de urmele de apă.

2. Puritatea acidului sulfuric şi a acidului acetic este o condiţie

indispensabilă pentru dozare. În particular, acidul acetic nu

trebuie să conţină acid glioxilic. Pentru îndepărtarea acidului

glioxilic, eventual prezent, se recomandă distilarea acidului acetic

în prezenţa anhidridei cromice.

136

Dozarea colesterolului total

Modul de lucru:

Proba: Într-o eprubetă de centrifugă se introduc 6ml acid acetic glacial şi 0,1ml

ser. Se agită. Se adaugă 4ml reactiv de culoare şi se agită bine. Se citeşte extincţia

probei după 10 min. de aşteptare la λ = 550 nm în cuva de 1 cm faţă de blanc

(prepararea acestuia apare mai jos). Rezultă extincţia Ep.

Soluţia standard: Într-o eprubetă de centrifugă se introduc 6ml acid acetic glacial

şi 0,1ml standard de colesterol. Se agită. Se adaugă 4ml reactiv de culoare şi se agită

bine. Se citeşte extincţia standardului la λ = 550 nm în cuva de 1 cm faţă de blanc.

Rezultă extincţia Es.

Blanc: Într-o eprubetă de centrifugă se introduc 6ml acid acetic glacial şi 0,1ml

apă bidistilată. Se agită. Se adaugă 4ml reactiv de culoare şi se agită bine.

Calcul: mg% colesterol total = (EP/ES) x conc. standard

Dozarea colesterolului liber

Se pipetează în eprubete de centrifugă o probă P, un standard S şi un blanc B.

P S B

Ser ml 0,1 - -

Standard de colesterol ml - 0,1 -

Apă bidistilată ml - - 0,1

Acetonă-95% etanol (1:1,v/v) ml 1 - -

Sol. digitonină ml 1 1 1

Se amestecă, se lasă în repaus 10min şi apoi se centrifughează (la 3000 rpm,

5min). Se aruncă supernatantul. Se usucă precipitatul timp de 5 min. în curent de N2.

Resuspendarea rezidiului se face cu 4 ml acetonă, apoi se agită cu Vortexul. Se

centrifughează, se decantează (cu grijă) supernatantul, se usucă precipitatul timp de

5min.

Precipitat + + -

CH3COOH glacial ml 6 6 6

Se agită, se adaugă 4ml reactiv de culoare şi se agită energic cu Vortexul.

După 10 minute de repaus se citeşte extincţia probei la λ = 550 nm în cuva de 1 cm faţă

de blanc. Blancul constă doar din 6 ml CH3COOH glacial.

137

Calcul:

mg% colesterol liber = (EP/ES) x conc.standard

mg%colesterol esterificat = mg% colesterol total - mg% colesterol liber

Valori normale: 60-80% din colesterol total. Prin urmare, raportul colesterol

esterificat/colesterol total se încadrează în mod normal în intervalul 0,60-0,80.

Variaţii fiziologice: Colesterolemia este strâns corelată cu lipidemia şi prezintă,

în mare, aceleaşi variaţii fiziologice. Valoarea nivelului colesterolului seric la naştere

este scăzută, începe să crească în câteva ore sau zile şi variază în funcţie de vârstă, sex,

rasă, alimentaţie, echilibru neuro-endocrin, profesie.

Există diferenţe ale colesterolemiei în funcţie de sex şi de vârstă. De exemplu: la

bărbaţi valoarea medie este de 250mg/100ml la vârsta de 50 de ani, după care scade

uşor; la femei valorile cresc odată cu vârsta atingând valoarea maximă de 280

mg/100ml în jurul vârstei de 50 ani, după care scad uşor.

Cea mai mare parte a colesterolului seric este de origine endogenă, aportul de

colesterol exogen influenţând în mică măsură colesterolemia.

Variaţii patologice: Acest raport este scăzut în afecţiuni hepatice grave (comă

hepatică).

Raportul dintre colesterolul esterificat/colesterolul total permite diferenţierea şi

diagnosticul icterelor şi este:

- normal în icterele obstructive

- moderat scăzut în icterele catarale

- scăzut în icterele parenchimatoase grave.

Valori crescute (hipercolesterolemii) se întâlnesc în: hipercolesterolemie

esenţială, hiperlipemie esenţială, hipotiroidism, diabet zaharat, obezitate, sindrom

nefrotic (nefroze lipoidice), ateroscleroză, intoxicaţii cu fosfor, CCl4, alcool, morfină,

icter obstructiv (calea de excreţie a colesterolului fiind cea biliară), pancreatite,

alcoolism.

Valori scăzute (hipocolesterolemii) se întâlnesc în: afecţiuni genetice ca:

analfalipo proteinemia (boala Tangier), abetalipoproteinemia; hepatite acute, hepatite

cronice şi ciroze decompensate (numai colesterolul esterificat), hipertiroidism; infecţii

bacteriene: pneumonie, tuberculoză, difterie, lepră; hemopatii severe: leucemii.

138

Obţinerea, purificarea şi identificarea lecitinei (gălbenuş de ou)

Obţinerea lecitinei purificată

Reactivi: 1 gălbenuş de ou

75 ml acetona (reactiv)

75 ml cloroform (reactiv)

Modul de lucru:

Se separă într-un mojar gălbenuşul de ou în aşa fel încât să nu se amestece cu

albuşul. Se adaugă peste gălbenuş amestecând 25 ml acetonă. Solventul deshidratează

gălbenuşul şi dizolvă grăsimile cu excepţia lecitinei. După ce a rămas în repaus câteva

minute acetona se decantează sau se filtrează. Se repetă operaţia de trei ori, ultima

cantitate de acetonă adăugată nu se mai lasă în contact cu materialul din mojar şi este

rapid decantată. Reziduul obţinut se întinde pe o hârtie de filtru. Pudra obţinută după

uscare se trece într-un balon Erlenmeyer şi se agită cu 25 ml amestec cloroform şi

alcool metilic ( 2:1). Se filtrează lichidul. Pudra rămasă pe hârtia de filtru este reluată cu

aceiaşi cantitate de amestec cloroform-alcool, repetându-se operaţia anterioară. Se

obţine astfel o soluţie cloroformică-alcoolică de lecitină. Pentru obţinerea substanţei

pure filtratul se concentrează prin încălzirea amestecului la 63°C. Produsul obţinut în

urma extracţiei cu solvenţi organici se prezintă ca o masă galbenă de consistenţă moale

care poate fi uscată prin evaporare în vid.

Purificarea lecitinei se face prin cromatografie pe coloană de celuloză pentru

îndepărtarea impurităţilor azotate nelipidice, urmată de cromatografia pe alumină, care

reţine cefalinele, şi apoi pe coloană de Silicagel, echilibrată cu soluţia CHCl3-CH3OH

(2:1; v:v), pentru separarea lizofosfatidelor şi sfingolipidelor.

Caracterizarea fizico - chimică a lecitinei

Lecitina formează o masă alb-gălbuie, higroscopică, alterabilă, se brunifică după

păstrare. Este solubilă în eter, cloroform, uleiuri, alcool concentrat. ( 1p. lecitina: 20 p.

alcool concentrat; 1p. lecitină; 9,8p. eter de petrol).

Identificarea lecitinei

Identificarea lecitinei se face astfel:

- adăugarea 2 ml de acid sulfuric concentrat la 2 ml de soluţie de molibdat de

amoniu 0,1% care conţine câteva picături de soluţie eterică de lecitină, la încălzire

determină formarea unei zone de separaţie colorată în albastru;

139

- o soluţie alcoolică de lecitină la care se adaugă o soluţie alcoolică de aloxan se

colorează în roz, apoi în roşu şi în final formează un precipitat de culoare roşie.

- dacă se adaugă cu precauţie la 2 ml de acid sulfuric concentrat, 2 ml alcool

conţinând urme de lecitină şi 4 picături de soluţie alcoolică 0,01% de benzaldehidă,

furfurol sau vanilină, apare la suprafaţa de separare a lichidelor o coloraţie roşie-brună.

Hidroliza lecitinei şi observarea microscopica a cristalelor de colina

Lecitinele prin hidroliză se descompun într-o moleculă de glicerol, 2 molecule

de acid gras, o molecula de acid fosforic şi o moleculă de colină.

Reactivi: - soluţie de hidroxid de sodiu 10%

- soluţie de acid acetic 10%

- soluţie de iod 5% ( 1 g iod, + 2 g KI, + 20 ml apă)

- hârtie de turnesol

Modul de lucru:

Lecitina obţinută din gălbenuşul de ou se trece într-un pahar Erlenmeyer, se

tratează cu 20 ml NaOH 10%. Se fierbe 10 min. Lichidul obţinut se neutralizează în

prezenţa hârtiei de turnesol cu acid acetic. Se adaugă apoi în exces o picătură de acid. Se

răceşte, se filtrează. Pe o lamă de sticlă se ia o picătură din soluţia obţinută, se adaugă o

picătură de iod, se acoperă cu lamela. Se observă apariţia cristalelor de periodură de

colină (cristale Florence).

Imaginea la microscopul optic a cristalelor de colină (desen).

Stabilitatea lecitinei

Stabilitatea lecitinei include determinarea indicelui de aciditate, a indicelui de

peroxid, şi a indicelui de iod.

1. Determinarea indicelui de aciditate (Ia): Prin indice de aciditate se înţelege numărul

de miligrame de hidroxid de potasiu necesare pentru neutralizarea acizilor graşi liberi

conţinuţi într-un gram de lecitină

140

Modul de lucru:

5 g lecitină se dizolvă în 50 ml amestec preparat în părţi egale din alcool şi eter

neutralizat în prezenţa fenolftaleinei ca indicator (0,1g fenolftaleină dizolvate în 100 ml

alcool din care se folosesc 3 picături) şi se titrează cu KOH 0,1 N până la coloraţie roz

care trebuie să persiste minimum 30 de secunde.

Ia = 5,61 v / G unde v = ml KOH 0,1 N folosiţi la titrare şi G = grame substanţă

luată în lucru

2. Determinarea indicelui de peroxid (Ip): Indicele de peroxid reprezintă numărul de

miliechivalenţi oxigen activ din 1000 g lipid (lecitină), respectiv numărul de mililitri de

tiosulfat de sodiu 0,01 N oxidaţi de iodul eliberat din acidul iodhidric prin acţiunea

peroxizilor din 1g lipid.

Modul de lucru:

5 g lecitină (G) se dizolvă într-un flacon cu dop rodat într-un amestec de 18 ml

acid acetic şi 12 ml cloroform. Se adaugă o soluţie proaspăt preparată dintr-un gram de

iodură de potasiu şi un ml apă şi se agită puternic. După un minut se adaugă 30 ml apă,

2 ml soluţie de amidon 0,1% şi se titrează cu tiosulfat de sodiu 0,01 N (v2). În paralel se

efectuează titrarea unui martor fără lecitină (v1).

Ip = 10 ( v2 - v1 )/ G

3. Determinarea indicelui de iod: Indicele de iod reprezintă numărul de grame de iod

fixat de 100g lipid nesaturat.

Modul de lucru:

Intr-un flacon cu dop rodat de 300 ml se întroduc 0,15 g de lecitină (G) şi se

dizolvă în 20 ml de cloroform, se adaugă 25 ml soluţie monobromură de iod 0,2N, se

închide flaconul şi se lasă la întuneric 30 min, agitând din 5 în 5 minute. Se adauga 15

ml iodură de potasiu 10% ,10 ml apă şi se titrează cu tiosulfat de sodiu 0,1N (v1) până la

decolorare adăugând 2 ml soluţie de amidon spre sfârşitul titrării. Se face o probă

martor cu aceleaşi cantităţi de reactivi în aceleaşi condiţii, fără lecitină, care se titrează

(v2).

Indice de iod = (v1 - v2) 1,269 / G

141

Hemoglobina

Dozarea hemoglobinei in sânge ( metoda Drabkin)

Principiu:

Fericianura de potasiu oxidează Fe2+ din hemoglobina la Fe3+. Astfel

hemoglobina se transformă în methemoglobină. Methemoglobina în prezenţa cianurii de

potasiu trece în cianmethemoglobină, derivat de hemoglobină stabil, fotometrabil la

λ = 540 nm.

Materiale: - pipetă de hemoglobină de 0,02 ml.

Reactiv Drabkin: - 50 mg KCN, 1 g NaHCO3 şi 200 mg fericianură de potasiu se

dizolvă în apă bidistilată şi se aduce volumul la 1000 ml cu apă bidistilată. Atenţie!

Reactivul Drabkin este extrem de toxic.

Modul de lucru:

În două eprubete se pipetează câte 5 ml de reactiv Drabkin. În una din eprubete

se pipetează cu o micropipetă 0,02 ml soluţie standard de hemoglobină (preparat

comercial), iar în cealaltă se pipetează 0,02 ml sânge în prealabil agitat pentru

resuspendarea celulelor sanguine. Se omogenizează eprubetele prin agitare, apoi după

20 de minute se citeşte extincţia probei de analizat şi a probei standard faţă de apă

distilată la λ = 540 nm în cuvă de 1 cm.

Calcul:

g hemoglobină/100 ml sânge=Ep/Es x Cst (Cst = concentraţia standardului în g%)

Observaţie: Metoda cu cianmethemoglobină detectează toate formele de

hemoglobină şi permite determinări foarte precise.

Dozarea hemoglobinei sub formă de oxihemoglobină

Principiu:

În prezenţă de amoniac globulele roşii se hemolizează şi hemoglobina se

transformă în oxihemoglobină care prezintă un maxim de absorbţie la λ = 540 nm.

Reactivi şi materiale: - soluţie de amoniac 0,1%

- pipetă de hemoglobină de 0,02 ml

Modul de lucru:

Într-o eprubetă se măsoară 5 ml de soluţie de amoniac. În acesta se introduc cu

pipeta de hemoglobină 0,02 ml de sânge în prealabil agitat. După agitare se citeşte

142

extincţia probei faţă de apă distilată la λ= 540 nm în cuva de 1 cm.Rezultatul se

raportează la o curbă de calibrare obţinută cu diluţii dintr-o probă de concentrat de

eritrocite cu concentraţia hemoglobinei cunoscută.

Valori normale: femei: 14-17 g/100 ml sânge

bărbaţi: 15-20 g/100 ml sânge

Dozarea hemoglobinei din sângele total prezintă importanţă pentru diagnosticul unor

forme de anemii.

Observaţie: Ca metodă de referinţă (pentru obţinerea unei curbe de calibrare în

absenţa unui standard de hemoglobină) se poate folosi metoda bazată pe dozarea ferului

eritrocitar.

Analiza urinei

Urina este un produs de filtrare, reabsorbţie şi excreţie, reprezentând exercitarea

funcţiei renale. Este un lichid biologic uşor accesibil, care dă multe informaţii utile în

diagnostic.

Urina "de dimineaţă" serveşte la determinări calitative (albumină, glucoză, pH,

acetonă şi sediment urinar). Se goleşte vezica de urina acumulată în timpul nopţii şi se

colectează urina proaspătă de dimineaţă, care este mai concentrată.

Urina de 24 ore se foloseşte la determinările cantitative. Este necesar să se

măsoare volumul diurn de urină fiindcă rezultatele dozărilor se raportează la acest

volum. Se goleşte vezica de urina "de dimineaţă" şi se începe la oră fixă recoltarea urinii

în intervalul de 24 de ore.

Pentru prevenirea contaminării probelor de urină cu microorganisme se

recomandă efectuarea analizelor în cel mult 2-3 ore de la recoltare. Păstrarea nealterată

se poate realiza la rece (+4oC) sau prin tratare cu substanţe conservante, de preferat cu

timol (0,1 g la 100 ml de urină). Nu se recomandă folosirea de cloroform, fenol, formol

fiindcă acestea falsifică rezultatele obţinute.

143

Examenul fizic al urinei

Volumul. Cantitatea de urină emisă în 24 ore depinde de ingestia de lichide, de

pierderile de apă (piele, intestin, plămâni) şi de cantitatea de substanţe excretate prin

urină. Volumul se măsoară cu cilindrul gradat.

Valori normale: 1500 - 2000 ml/24 ore (bărbaţi); 1000 - 1500 ml/24 ore (femei).

Valori patologice: - sub 200 ml/24 ore (anurie)

- între 200-800 ml/24 ore (oligurie)

- peste 2000 ml/24 ore (poliurie)

Oligo-anuria este semnul cel mai important al insuficienţei renale acute. Cauzele

acesteia se pot clasifica în trei grupe:

- Cauze prerenale: hipovolemie (diaree severă, stare de şoc cu prăbuşirea

presiunii arteriale), insuficienţă cardiacă stângă - în aceste cazuri nu se

realizează presiunea hidrostatică necesară funcţiei de filtrare a rinichiului.

- Cauze renale: boli inflamatorii ale rinichiului (glomerulonefrită acută),

necroză tubulară acută (ischemică, toxică), boli autoimune cu afectare renală.

- Cauze postrenale: obstrucţia mecanică a căilor urinare (calculi, malformaţii).

Se formează urină, dar nu se poate elimina.

Poliuria se întâlneşte în: diabet zaharat, diabet insipid (se constată o poliurie

extremă de 5-20 l/24 ore, cauza fiind lipsa secreţiei de hormon antidiuretic-ADH;

poliuria este însoţită de polidipsie, adică consumul excesiv de lichide), alcoolism cronic

(inhibarea secreţiei de ADH), hiperparatiroidism (se elimină cantităţi mari de calciu prin

urină care antrenează eliminarea unui volum mare de lichid), insuficienţă renală cronică

(capacitatea de concentrare a rinichilor este alterată).

Alte noţiuni patologice legate de distribuţia volumului urinar sunt:

- Polakiurie: micţiuni dese cu eliminarea unor cantităţi mici de urină (apare în

cistită, hipertrofie de prostată, tumori ale vezicii urinare). Deseori este

însoţită de disurie (durere sau senzaţie de arsură la emisia de urină).

- Nicturie: urinare nocturnă (diabet insipid, insuficienţă cardiacă dreaptă -

semnalează evoluţia spre decompensare).

Aspectul. În condiţii fiziologice urina proaspătă este limpede şi transparentă. Urina

tulbure în momentul emisiei poate fi datorată conţinutului excesiv de săruri

(uraţi, fosfaţi, carbonaţi), mucusului, puroiului, celulelor epiteliale, grăsimilor

sau microbilor. Dacă într-o urină clară în momentul eliminării după un timp se

144

formează un depozit în formă de nor, el se datorează unui proces de

descuamare epitelială a căilor urinare. Acest depozit nu are nici o valoare

diagnostică.

Situaţiile patologice se diferenţiază în felul următor:

a). Dispariţia tulburării prin încălzire indică prezenţa uraţilor, oxalaţilor şi a

acidului uric.

b). Dispariţia tulburării care a devenit mai abundentă în urma încălzirii, prin

adăugare de acid acetic 10 % indică prezenţa fosfaţilor şi carbonaţilor (dacă se produce

efervescenţă).

c). Dacă tulburarea apare la cald şi se intensifică prin adăugare de acid acetic,

urina conţine albumină.

d). Dispariţia tulburării numai la adaus de HCl 12,5 % după încălzire prealabilă,

indică prezenţa oxalatului de calciu.

e). Din urina tulbure, chiar în momentul emisiei, puroiul, hematiile sau celulele

epiteliale se pot îndepărta prin centrifugare.

f). Dispariţia tulburării după adăugarea unui amestec de etanol-eter (1:1; v:v)

indică prezenţa grăsimilor.

Culoarea. Urina normală are culoare galben-deschisă până la galben-aurie. Urina din

timpul nopţii fiind mai concentrată, are o culoare mai închisă. Culoarea urinii

poate fi modificată de diferite substanţe pe care le conţine.

Substanţe endogene: sângele imprimă urinii culoare roşie, brună sau maronie;

porfirinele dau o culoare roşie sau brun-roşcată; pigmenţii biliari conferă

culoare galben verzuie; alcaptonul (compus apărut în urină datorită dereglării

catabolizării Phe şi Tyr) dă în contact cu aerul o culoare brună-neagră.

Substanţe exogene: albastrul de metilen colorează urina în verde-albăstrui; piramidonul

în roşu-cărămiziu; fenolul îi dă o coloraţie brună.

Mirosul. Mirosul urinii proaspete se datorează acizilor volatili din compoziţia sa. În

urinile concentrate mirosul este mai accentuat. În cazurile de acidoză apare un

miros de fructe sau cloroform. Urinile infectate au un miros amoniacal datorită

descompunerii ureei de către ureaza bacteriană. Mirosul fecaloid al urinii poate

atrage atenţia asupra existenţei unei fistule (comunicare patologică între tubul

digestiv şi urinar). Miros fecaloid apare şi în infecţiile cu Escherichia coli (E.

145

coli este o componentă a florei intestinale saprofite, dar poate cauza frecvent

infecţii urinare).

Densitatea. Greutatea specifică sau densitatea urinii se măsoară cu un densimetru

special numit urodensimetru, format dintr-un tub de sticlă care se termină la

partea inferioară printr-un rezervor cu mercur. În partea superioară se află o tijă

pe care este înscrisă scara gradată pentru intervalul 1,000 - 1,040 g/cm3 la 15 oC, fiind anexată şi o scală termometrică, pentru că densitatea urinii variază în

funcţie de temperatură. Densitatea depinde de substanţele dizolvate: sărurile în

general şi ureea la indivizi sănătoşi; glucoza şi albumina în cazurile patologice.

Densitatea este de obicei invers proporţională cu diluţia urinii şi direct

proporţională cu intensitatea culorii. Excepţie face diabetul zaharat, când, cu

toate că volumul urinar este mare, ceea ce ar determina o diluţie mare,

densitatea este mare datorită prezenţei glucozei.

Modul de lucru:

Urina de 24 ore se amestecă pentru omogenizare, apoi se toarnă într-un cilindru

gradat, evitându-se formarea spumei. Se introduce urodensimetrul care trebuie să

plutească fără a atinge pereţii cilindrului. Se citeşte diviziunea care este tangentă la

meniscul inferior al suprafeţei urinii. Valoarea citită trebuie corectată prin mărire cu

0,001 pentru fiecare depăşire cu 3oC respectiv prin micşorare cu 0,001 pentru fiecare

scădere cu 3oC sub 15oC. Când urina conţine cantităţi mari de proteine, peste 7 g%, se

vor scădea câte 0,03 pentru fiecare gram de proteină în plus.

Valori: 1,015 - 1,025 g/cm3, putându-se modifica fiziologic la valori extreme de

1,001 - 1,035 g/cm3 în funcţie de aportul sporit sau de eliminarea abundentă de lichide.

Scăderea densităţii urinare se întâlneşte în diabet insipid (se elimină o cantitate mare de

urină foarte diluată), insuficienţă renală cronică (datorită incapacităţii de concentrare a

rinichiului). Creşterea densităţii urinare apare în diabetul zaharat, nefroză (boală renală

în care se elimină o cantitate mare de proteine prin urină).

Examenul chimic al urinei

pH-ul urinei. Valoarea pH-ului urinei normale depinde de dietă. O alimentaţie

bogată în proteine produce aciditate urinară, pe când un regim vegetarian determină

alcalinizarea urinei. Aciditatea urinei provine din acizi organici (uric, hipuric, citric,

acetic, oxalic) şi din sărurile acide (fosfaţi primari de Na+, K+, NH4+). Regimul carnat

146

determină o creştere a acidităţii urinei datorită eliminării crescute de acid uric, uraţi şi

fosfaţi acizi. Un regim alimentar vegetarian determină o alcalinizare a urinei prin

excesul de săruri minerale şi organice.

Măsurarea pH-ului se face prin folosirea benzilor de hârtie indicator universal

sau cu pH-metrul.

Modul de lucru:

Se introduce în urina proaspătă, pentru câteva secunde, o bucată de hârtie

indicator. Se stabileşte valoarea pH-ului după 30 de secunde comparând culoarea hârtiei

cu cea a scalei de culori care însoţeşte fiecare pachet de hârtie indicator.

Prin metoda potenţiometrică (cu pH-metrul), după calibrarea aparatului cu

soluţii standard de pH, se introduc cei doi electrozi (de pH şi de referinţă) într-un volum

adecvat de urină a cărei temperatură se cunoaşte şi se citeşte valoarea pH-ului.

Valorile: pH-ul urinei este slab acid, cu variaţii în jurul valorii de 6 (4,8 - 7,4) la

un individ cu alimentaţie mixtă. Urini puternic acide se produc în cursul proceselor

maligne datorită distrugerii crescute de proteine, în febră, diaree abundentă şi acidoză

metabolică. pH puternic alcalin se constată în infecţii urinare (prin fermentare

microbiană) şi în alcaloză metabolică. pH-ul se măsoară din urina proaspăt emisă,

deoarece în timp se produce contaminarea produsului cu bacterii, care determină

schimbarea reacţiei în sensul alcalinizării urinei.

Analiza compuşilor patologici din urină

Identificarea proteinelor urinare

Urina normală conţine doar urme de proteine (albumine şi globuline provenite

din plasmă), în cantitate de 20-40 mg%o, care nu se pot decela prin tehnici uzuale.

Proteinurii apar în stări patologice cum ar fi:

- afecţiuni renale: filtrul renal lezat nu mai poate reţine moleculele proteice şi

acestea ajung în urină în cantitate mare. Proteinuria poate fi selectivă (numai

albuminurie) de exemplu în glomerulonefrite, sau neselectivă în cazuri mai grave

(albuminurie şi globulinurie) cum ar fi glomerulonefrozele. În afară de bolile

inflamatorii renale enumerate, leziuni ale nefronului pot apare şi în intoxicaţii sau în

rinichiul de şoc. Proteinuria este pusă în evidenţă şi în leziuni mai grave ale filtrului

glomerular, caz în care se pune în evidenţă chiar hematuria.

147

- afecţiuni postrenale: leziuni ale mucoasei căilor urinare (litiază, inflamaţie,

tumori, etc). În aceste cazuri proteinuria se asociază obligatoriu cu hematurie (apariţia

sângelui în urină).

- afecţiuni prerenale: stări febrile, boli cardiace, ictere, leucemie, apariţia în

urină a proteinelor Bence-Jones (provenite din imunoglobuline patologice) în mielomul

multiplu (plasmocitom). Datorită hiperproteinemiei (creşterea cantităţii proteinelor în

sânge), se saturează capacitatea maximă de transport a celulelor mucoasei tubulare

renale, şi proteinele care nu s-au reabsorbit se elimină prin urină.

În mod fiziologic, în cursul efortului fizic are loc o creştere a proteinuriei care

poate atinge de 5 ori valoarea normală. Cantitatea de proteine eliminată variază în

timpul zilei, de aceea trebuie să se facă analiza pe urina de 24 ore (valori normale: 30-

40 mg/1500 ml).

Procedeul cu acid acetic la cald

Principiu:

Proteinele precipită prin încălzirea şi acidularea urinei îmbogăţite cu săruri de

sodiu.

Reactivi: - Acid acetic 10%

- NaCl cristale

Mod de lucru:

În 10 ml de urină filtrată se adaugă câteva cristale de NaCl şi se încălzeşte

eprubeta în flacără pentru aducerea la fierbere doar a părţii superioare a coloanei de

lichid. Se adaugă câteva picături din soluţia de acid acetic. Apariţia unui precipitat

persistent indică prezenţa albuminei.

Aprecieri semicantitative asupra cantităţii de albumină:

- opalescenţă, urmată de sedimentare la câteva minute . . . . cca 10 mg%

- precipitare şi sedimentare imediată . . . . . . . . . . . . . . . . . . cca 50 mg%

Înălţimea coloanei de precipitat raportată la înălţimea coloanei de urină după

staţionarea amestecului timp de 30 secunde:

- 1 : 4 . . . . . . . . . . . . cca 250 mg%

- 1 : 3 . . . . . . . . . . . . cca 500 mg%

- 1 : 2 . . . . . . . . . . . . cca 1000 mg%

Proba cu acid sulfosalicilic la rece

Principiu:

Proteinele sunt precipitate în mediu de acid sulfosalicilic.

148

Reactiv: Sol. acid sulfosalicilic 20%

Mod de lucru:

La 5 ml urină filtrată se adaugă 10-15 picături din soluţia de acid sulfosalicilic.

Se agită şi se apreciază reacţia ţinând eprubeta pe un fond negru. Rezultatele posibile

sunt:

- urina rămâne limpede . . . . . . . albumină absentă

- uşoară opalescenţă . . . . . . . . cca 15 mg% albumină

- opalescenţă apreciabilă . . . . . cca 20 mg% albumină

- floculare abundentă . . . . . . . . > 20 mg% albumină

Reacţii fals pozitive se observă în terapia diabetului cu antidiabetice orale

(tolbutamid), după administrare de antibiotice din familia cefalosporinelor, etc.

Reacţia cu acid azotic (proba Heller)

Reactiv: Acid azotic concentrat

Mod de lucru:

În cca. 1-2 ml acid azotic concentrat se lasă să se prelingă pe peretele eprubetei

1-2 ml urină. Apariţia unui precipitat sub formă de inel la zona de contact dintre cel

două soluţii indică prezenţa proteinelor.

Reacţii fals pozitive pot fi date de urina conservată cu timol sau care conţine

uree şi uraţi în cantitate mare. Mucoproteinele secretate de mucoasa căilor urinare pot

da numai o tulbureală care nu este delimitată sub formă de inel.

Proba cu acid tricloracetic

Reactiv: Acid tricloracetic 15%

Mod de lucru:

La 5 ml urină se adaugă 1 ml acid tricloracetic. Formarea unui precipitat alb

floconos arată prezenţa proteinelor.

Evidenţierea proteinelor Bence-Jones (termosolubile)

Principiu:

În urina slab acidă proteinele Bence-Jones precipită între 45-55 oC şi se

redizolvă în apropiere de 100 oC.

Reactiv: Tampon acetat 2 N (pH=4,9)

Mod de lucru:

Se lucrează din urinele la care am obţinut rezultat pozitiv la reacţiile de

precipitare a proteinelor. Într-o eprubetă se pun 4 ml de urină, se adaugă 1 ml tampon

acetat şi se incubează în baie de apă la 56 oC până la apariţia unui precipitat. Apoi se

149

introduce eprubeta în apă la fierbere timp de 3 minute. Descreşterea cantităţii de

precipitat, clarificarea tulburării, confirmă prezenţa proteinelor Bence-Jones. Prin răcire

la 56 oC reapare precipitatul iniţial.

Proteinele Bence-Jones sunt lanţurile uşoare ale imunoglobulinelor. Ele apar în

60% din cazurile cu mielom multiplu (multiplicarea canceroasă a unei clone de

plasmocite care produce imunoglobuline) şi ocazional în alte boli care afectează

măduva osoasă: leucemii, osteosarcoame (tumori canceroase ale ţesutului osos),

metastaze osoase, unele disproteinemii.

Test rapid pentru detectarea proteinelor urinare

Principiu:

Hârtia reactivă impregnată cu albastru de tetra-bromfenol este colorată în galben

deschis în mediu acid (pH ≈ 3). În prezenţa proteinelor urinare, culoarea virează spre

verde, verde-albăstrui, albastru sau violet, nuanţa depinzând de tipul de proteină şi de

concentraţia acesteia în urină.

Mod de lucru:

Se înmoaie capătul benzii în urina de analizat. După 2 minute se apreciază

prezenţa proteinelor urinare prin compararea culorii obţinute cu o scală de etalonare.

Cantitativ urmele de proteine corespund la aproximativ 5-20 mg% de albumină. Testul

are valoare orientativă.

Evidenţierea puroiului

Proba Donné

Principiu:

Cu ajutorul NaOH se lezează membrana leucocitară din care astfel se eliberează

mucină, care măreşte vâscozitatea urinei şi împiedică ridicarea imediată a bulelor de aer.

Reactiv: Sol. NaOH 20%

Mod de lucru:

Se iau într-o eprubetă 5 ml urină, se adaugă câteva picături de NaOH 20%, se

astupă eprubeta şi se răstoarnă brusc, apoi se readuce în poziţia iniţială. Apariţia unor

bule de aer în lichid, care rămân mai mult timp în suspensie şi se ridică încet la

suprafaţă denotă prezenţa puroiului.

În cazul în care bulele de aer se ridică rapid, testul este negativ. Dacă toate

bulele de are se ridică încet la suprafaţă rezultatul se notează cu +. În cazul în care

bulele mici rămân pe fundul eprubetei, rezultatul este ++. Dacă nici bulele mai mari nu

se ridică datorită prezenţei unei cantităţi mari de mucină, proba se notează cu +++.

150

Interpretare: Puroiul este constituit din leucocite degenerate care apar în urină în

urma proceselor inflamatorii ale tractului urinar (pielonefrită, cistită, uretrită). Probe fals

pozitive pot apare în albuminurie masivă, datorită prezenţei polizaharidelor, a mucinei,

etc. Testele pozitive trebuie întotdeauna verificate prin examenul microscopic al

sedimentului urinar.

Identificarea glucidelor urinare

În mod normal, urina nu conţine decât cantităţi mici de glucide. În mod

patologic însă, glucoza poate apărea în cantităţi apreciabile, prezenţa ei în urină fiind

denumită glicozurie şi este caracteristică diabetului zaharat. În anumite stări patologice

particulare, urina mai poate conţine în afară de glucoză şi alte glucide: fructoză,

galactoză, lactoză, maltoză şi pentoze.

Fiziologic poate apare glicozurie după ingerarea unor cantităţi mari de glucide.

De asemenea, lăuzele şi 40% din gravidele în a doua jumătate a sarcinii prezintă

lactozurie.

Evidenţierea glucidelor urinare se face pe baza proprietăţii reducătoare a

acestora faţă de sărurile unor metale (Cu, Bi). Pe lângă glucide, în urină pot exista şi alte

substanţe reducătoare care pot da rezultate fals pozitive (cantităţi mari de creatinină,

acid ascorbic, acid uric, fenoli, etc.). Unele medicamente eliminate prin urină cum ar fi

penicilina, streptomicina, dextranul pot reduce sărurile metalice. Din acest considerent,

înaintea cercetării calitative a diferitelor tipuri de glucide urinare, se efectuează operaţia

de defecare - adică înlăturarea substanţelor reducătoare neglucidice din urină.

Defecarea urinii

Defecarea urinii se efectuează cu reactivul Courtonne, care se prepară în felul

următor: se dizolvă 100 g acetat de plumb în apă distilată, se neutralizează cu acid acetic

glacial (control cu hârtie indicator), se filtrează într-un balon cotat de 1000 ml şi se

completează cu apă distilată până la semn.

Mod de lucru:

Se iau într-un cilindru 45 ml urină şi 5 ml reactiv Courtonne, se amestecă cu o

baghetă, se lasă să se depună precipitatul şi se filtrează.

Majoritatea reacţiilor de reducere nu sunt considerate suficient de specifice

pentru a fi utilizate pentru depistarea glicozuriei. Mai specifice sunt reacţiile Nylander şi

Benedict, ultima având avantajul de a da indicaţii orientative asupra cantităţii de

151

substanţă reducătoare din urină. O metodă specifică de evidenţiere a glucozei este

metoda cu glucozoxidază.

Reacţia Nylander

Principiu:

Glucidele reducătoare reduc în mediu bazic ionii de Bi3+ la Bi metalic.

Reactivi: 20 g azotat de bismut, 40 g sare Seignette (tartrat dublu de sodiu şi

potasiu) şi 100 g NaOH se dizolvă în apă până la 1000 ml soluţie.

Mod de lucru:

Într-o eprubetă, la 5 ml urină se adaugă 1 ml reactiv Nylander şi se încălzeşte la

flacără timp de 4 minute.

În prezenţa glucozei apare un precipitat brun până la negru. Reacţii fals pozitive

pot exista în proteinurie masivă, când apare un precipitat brun de sulfură de bismut

datorită reacţiilor de reducere date de unele grupări funcţionale ale radicalilor

aminoacizilor.

Reacţia Benedict (semicantitativă)

Principiu: Gruparea carbonil din glucidele reducătoare reduce la cald Cu2+ din

reactivul Benedict la Cu+ (menţinerea în soluţie a Cu2+ se face prin complexare cu citrat

de sodiu). În urma reacţiei se formează Cu2O de culoare roşie-cărămizie. Reacţia este

pozitivă pentru toate glucidele reducătoare. Reactivul Benedict are compoziţia

prezentată la pag. ??

Mod de lucru:

Se pun într-o eprubetă 0,5 ml urină şi 5 ml reactiv Benedict. Se amestecă şi se

pune într-o baie de apă la fierbere timp de 5 minute. Se răceşte la temperatura camerei şi

se interpretează rezultatul astfel:

Culoare Rezultat Substanţe reducătoare g‰

albastru - absente

albastru-verzui urme urme

verde + cca 0,5

brun-verzui ++ cca 1,0

galben +++ cca 1,5

roşu-cărămiziu ++++ cca 2,0

152

Reacţia Barfoed

Principiu:

Reacţia de reducere a Cu2+ la Cu+ din Cu2O în mediu slab acid este pozitivă

numai în prezenţa monozaharidelor şi ea serveşte la identificarea acestora în prezenţa

dizaharidelor reducătoare (lactoză, maltoză), pentru care această reacţie este negativă în

condiţiile de lucru. În mediu slab acid viteza reducerii Cu2+→ Cu+ este mult mai mică

decât în mediu alcalin (se formează un precipitat roşu-cărămiziu), totuşi mecanismul

reacţiei Barfoed încă nu este pe deplin cunoscut.

Reactiv: Reactiv Barfoed: 13,3 g acetat de cupru se dizolvă în 200 ml apă

distilată, se filtrează şi se adaugă 1,8 ml acid acetic glacial.

Mod de lucru:

Se pun într-o eprubetă 2 ml urină şi 2 ml reactiv Barfoed. Se amestecă şi se

încălzeşte eprubeta la fierbere timp de 5 minute. Pozitivitatea acestei reacţii, adică

apariţia pulberii roşii de Cu2O la suprafaţa şi la fundul eprubetei, indică existenţa

monozaharidelor reducătoare.

Reacţia Wöhlk

Se foloseşte tot în scopul diferenţierii glucozei de lactoză.

Principiu:

Urina care conţine lactoză, încălzită la 60 oC în prezenţa NH3 şi KOH, se

colorează în roşu.

Reactivi: - Sol. NH3 25%

- Sol. KOH 20%

Mod de lucru:

Într-o eprubetă, la 5 ml urină, se adaugă 3 ml soluţie NH3 şi 5 pic. soluţie KOH.

Eprubeta se agită şi se introduce în baie de apă la 60 oC, 30 minute. Prezenţa lactozei

determină apariţia coloraţiei roşii. Galactoza produce culoare galben deschisă, iar

glucoza în concentraţii ridicate dă o coloraţie brună.

153

Interpretare: Lactozuria este un fenomen inofensiv care poate apare în ultimele

luni de sarcină sau la începutul alăptării.

Reacţia Seliwanoff

Se foloseşte pentru identificarea fructozei urinare.

Principiu:

Monozaharidele în prezenţa acidului clorhidric concentrat reacţionează cu

rezorcina (sau alţi polifenoli) formând produşi de condensare coloraţi. Reacţia este mai

rapidă şi intensă în prezenţa cetozelor, când se obţin produşi coloraţi în roşu. În prezenţa

aldozelor, în aceleaşi condiţii, coloraţia este slab roză. Această reacţie serveşte la

diferenţierea aldozelor de cetoze.

Reactivi: - Reactivul Seliwanoff: 0,15 g rezorcină şi 100 ml acid clorhidric

concentrat se dizolvă în apă distilată până la 200 ml.

- Soluţie fructoză 1%

Mod de lucru:

Se pun într-o eprubetă 0,5 ml urină şi 5 ml reactiv Selivanoff. În paralel se

execută doi martori, unul cu 0,5 ml urină normală şi celălalt cu 0,5 ml urină normală

care conţine fructoză 1%. Se aduc la fierbere cele trei eprubete.

Prezenţa fructozei este indicată de apariţia unei coloraţii roşu intens. Prin răcire

se poate depune un precipitat roşu care se dizolvă în alcool.

Interpretare: Fructozuria esenţială este o boală ereditară rară datorată blocării

conversiei normale a fructozei în glucoză în ficat (deficit de fructokinază). Se poate

produce o fructozurie alimentară în diabet şi în unele boli hepatice.

Reacţia Bial

Se foloseşte pentru identificarea pentozelor urinare.

Principiu:

În mediu puternic acid pentozele dau reacţie de culoare cu orcina

(metilrezorcina).

154

Reactivi: - reactivul Bial: 6 g orcină se dizolvă în 200 ml alcool etilic 96%

şi se adaugă 40 picături sol. FeCl3 10%

- HCl conc.

- soluţie 1% de fructoză, arabinoză, glucoză

Mod de lucru:

Se iau într-o eprubetă 5 ml reactiv Bial şi 0,5 ml urină. Se execută în paralel doi

martori, unul cu urină normală şi altul cu o urină normală la care se adaugă 1 ml soluţie

de pentoze 0,1% (arabinoză sau xiloză). Se aduc la fierbere cele trei eprubete, apoi se

lasă în repaus 15-20 minute. Pentozele dau culoare verde, sau dacă sunt prezente în

cantităţi mari, un precipitat de culoare verzuie. Culoarea poate fi extrasă prin agitare în

alcool amilic.

Interpretare:

Pentozuria alimentară apare după un consum substanţial de fructe bogate în

pentoze. Pentozele sunt adesea excretate în urina diabeticilor. Pentozuria esenţială (în

care se elimină xiluloza) este o boală ereditară rară în care apar cantităţi considerabile

de L-xiluloză în urină datorită deficitului de reductază care converteşte pentoza în

xilitol.

Reacţia cu fenilhidrazina

În laboratorul clinic formarea glucosazonei şi a lactosazonei este utilizată ca test

pentru diferenţierea glucozei de lactoză în urina femeilor gravide.

Reactivi: - Soluţie fenilhidrazină în acid acetic glacial 10%;

- Soluţie acetat de sodiu 25%;

- Acid acetic glacial;

- Reactiv Patein: se dizolvă 200 g acetat de mercur în 600 ml apă

distilată, se alcalinizează (indicator hârtie de turnesol) cu soluţie

de hidroxid de sodiu 10%. Se trece într-un balon cotat de 1000 ml

şi se completează cu apă distilată la semn. Reactivul nu se

alterează.

Mod de lucru:

Într-o eprubetă se pipetează 1 ml soluţie fenilhidrazină, 1 ml acid acetic glacial

şi 1 ml soluţie acetat de sodiu 25%, apoi se adaugă 10 ml urină defecată cu reactiv

Patein. Prin defecare se elimină celelalte substanţe reducătoare pe care le-ar putea

155

conţine urina trecând în filtrat numai glucidele. Se filtrează şi eprubeta cu filtrat se ţine

o oră în baia de apă la fierbere, apoi se filtrează imediat la cald într-o altă eprubetă care

se lasă să se răcească.

În prezenţa glucozei (în cantitate mai mare de 4 g%o) se obţine glucosazonă

insolubilă la cald care rămâne pe al doilea filtru şi care examinată la microscop, se

prezintă sub formă de ace galbene aurii dispuse în snopi (vezi pag. 49). Fructosazona

are aspect asemănător. Dacă urina conţine şi lactoză sau maltoză, osazonele acestora se

vor cristaliza în ultima eprubetă, la rece. Cristalele de lactosazonă apar la microscop

sub formă de rozete, iar cele de maltosazonă au formă de lame aproape rectangulare

unite prin una din extremităţi.

Identificarea corpilor cetonici urinari

Corpii cetonici (acetona, acidul acetoacetic şi acidul β-hidroxibutiric) sunt

implicaţi în metabolismul lipidic. În condiţii patologice de dereglare a catabolismului

acizilor graşi se excretă prin urină în special acidul β-hidroxibutiric şi acidul

acetoacetic, ultimul fiind convertit în acetonă prin decarboxilare dacă urina este păstrată

la temperatura camerei.

Reacţia Legal

Serveşte la identificarea acetonei. În scop diagnostic este suficientă identificarea

acesteia, fiindcă acetona, acidul acetoacetic şi β-hidroxibutiratul sunt întotdeauna

prezenţi împreună.

Reactivi: - Sol. nitroprusiat de Na 10% (proaspătă)

- Acid acetic glacial

- NaOH 10%

Mod de lucru:

Se iau într-o eprubetă 3 ml urină, se adaugă 5 picături de soluţie de nitroprusiat

de Na 10% şi 2-3 pic. de NaOH 10% până la reacţie alcalină. Apariţia unei culori roşii

sau portocalii se datorează acetonei sau creatininei urinare. Se adaugă apoi 1-2 ml acid

acetic glacial. Dispariţia culorii indică absenţa acetonei, iar intensificarea culorii cu

virare spre roşu-violet indică prezenţa acetonei. Intensitatea culorii variază în raport

direct cu concentraţia corpilor cetonici din urină.

156

Reacţia poate fi dată şi de unele medicamente (salicilaţi - de ex. aspirina).

Diferenţierea se face fierbând în prealabil câteva minute urina, operaţie prin care

acetona se îndepărtează. O reacţie pozitivă iniţială, care nu mai apare după fierberea

unei alte probe din urina respectivă, indică prezenţa acetonei.

Reacţia Lieben

Principiu:

În reacţia dintre acetonă şi iod în mediu alcalin, ia naştere iodoformul care poate

fi recunoscut prin miros.

H3C - CO - CH3 + 3I2 + 3NaOH CH3 - CO - CI3 + 3NaI + 3H2O

CH3 - CO - CI3 + NaOH CH3 - COONa + CHI3

tri-iod-acetona iodoform

Reactivi: - Sol. de iod - iodură de potasiu 0,1 N

- Sol. NaOH 10%

Mod de lucru:

Într-o eprubetă se iau 5 ml urină, se adaugă 1-2 ml NaOH 10% şi 1-2 ml iod 0,1

N. Apariţia unui precipitat galben şi a mirosului de iodoform indică prezenţa acetonei.

Interpretare: Corpii cetonici apar în urină în diabetul zaharat netratat (datorită

lipsei de insulină, celulele nu pot internaliza glucoza din sânge. Acizii graşi vor fi

principala sursă de energie, ceea ce intensifică exagerat cetogeneza hepatică. Ficatul

exportă mari cantităţi de corpii cetonici care sunt folosiţi în scop energetic de ţesuturile

extrahepatice). Acetonurie apare în toate cazurile în care aportul de glucide sau

utilizarea lor este deficitară: înfometare, regim alimentar dezechilibrat (bogat în lipide şi

proteine, sărac în glucide), diaree, vărsături (accentuate de sarcină), malabsorbţie

intestinală, boli metabolice.

Teste rapide pentru identificarea corpilor cetonici

Corpii cetonici se pot evidenţia cu pulbere reactivă sau cu tablete "Acetotest"

sau baghete "Ketostix" care conţin nitroprusiat de sodiu şi substanţe alcalinizante, care

se colorează în roşu în cazul reacţiei pozitive. Aceste teste rapide se bazează pe reacţia

Legal clasică. Cu ajutorul lor putem detecta corpii cetonici chiar în concentraţii de 0,5-1

mmol/l, prin apariţia culorii roşii la 15 secunde de la contactul urinei cu bagheta cu

reactivi.

157

Identificarea acizilor biliari

Eliminarea acizilor biliari în urină se mai numeşte colalurie. Apare în special în

caz de icter mecanic (din cauze obstrucţiei tubului coledoc, sărurile acizilor biliari nu

mai sunt excretate în bilă. Datorită presiunii ele trec în curentul sanguin şi se elimină în

urină). Colaluria mai apare în ictere date de hepatită, când celula hepatică bolnavă nu

mai poate excreta acizii biliari.

Proba Hay

Principiu:

Sărurile acizilor biliari scad tensiunea superficială a urinei permiţând

sedimentarea florii de sulf.

Reactiv: Sulf sublimat (floare de sulf).

Mod de lucru:

Se presară floarea de sulf pe suprafaţa urinei pusă într-o eprubetă. Dacă urina

conţine acizi biliari, sulful sedimentează în 5 minute. În absenţa acizilor biliari sulful

pluteşte câteva ore.

Reacţia Pettenkoffer

Principiu:

Acidul sulfuric transformă glucidele în derivaţi furfurolici care se condensează

cu acizii biliari dând produşi coloraţi.

Reactivi: - Acid sulfuric concentrat

- Zaharoză 10%

Mod de lucru:

Într-o eprubetă se iau 1 ml apă distilată, 1-2 ml urină, 5-6 picături zaharoză 10%

şi se agită. Se adaugă cu grijă, prelingându-se pe peretele eprubetei ţinută într-o poziţie

înclinată, 1-2 ml acid sulfuric. Apariţia unui inel roşu-violet la limita de separaţie a

reactivului cu proba indică prezenţa acizilor biliari. În paralel se execută o probă martor

în aceleaşi condiţii, înlocuind urina cu apă. Inelul obţinut are o nuanţă brună cărămizie.

Identificarea pigmenţilor biliari urinari

Pigmenţii biliari sunt derivaţi pirolici care provin din catabolismul hemului.

Principalii reprezentanţi sunt biliverdina, bilirubina, urobilinogenul, urobilina,

stercobilinogenul, stercobilina. Urobilinogenul şi stercobilinogenul, rezultaţi prin

reducerea bilirubinei, sunt compuşi incolori, care în contact cu aerul se oxidează parţial,

trecând în urobilină, respectiv stercobilină, care sunt compuşi coloraţi.

158

Identificarea bilirubinei

După cantitatea de bilirubină eliminată, culoarea urinei variază între galben şi

brun-închis, cu nuanţă verzuie. Bilirubina eliminată în urină, fiind instabilă, reacţiile de

identificare trebuiesc făcute în timp cât mai scurt de la emisie. Bilirubina fiind

fotosensibilă, urina trebuie conservată la întuneric.

Urina normală conţine doar urme de bilirubină, care nu dă reacţia de identificare

pozitivă. Creşterea eliminării urinare a bilirubinei apare, ca şi în cazul acizilor biliari, în

icterele prin obstrucţia căilor biliare şi în icterele prin hepatită.

Proba Popper

Principiu:

Oxidarea bilirubinei în biliverdină (de culoare verde) cu ajutorul iodului.

Reactivi: - Reactiv Popper: Se amestecă 525 ml apă distilată, 125 ml alcool 95o,

3,5 ml tinctură de iod 10% şi se adaugă 12 g KI şi 27 g NaCl.

Mod de lucru:

Se pun 5 ml urină într-o eprubetă. Se adaugă cu precauţie, cu o pipetă, 2 ml

reactiv, astfel ca cele două lichide să nu se amestece. Reactivul fiind mai dens, se

introduce la fundul eprubetei. În prezenţa bilirubinei apare un inel verde la suprafaţa de

contact dintre coloanele celor două lichide.

Reacţii fals pozitive: după consum de antipirină (analgetic) şi piramidon.

Testele rapide de determinare a bilirubinei din urină au la bază reacţia de

condensare a bilirubinei cu un alt compus în mediu puternic acid, cu apariţia unei

coloraţii maronii de intensitate diferită. Reacţia completă necesită 20 de minute.

Identificarea urobilinogenului şi stercobilinogenului

Urobilinoizii sunt derivaţii hidrogenaţi ai bilirubinei: urobilinogenul,

stercobilinogenul, urobilina şi stercobilina. Reducerea bilirubinei se produce în intestin

sub influenţa bacteriilor. O parte din urobilinoizi este reabsorbită şi ajunge din nou la

ficat prin vena portă (circuitul hepatoenterohepatic al pigmenţilor biliari). Cea mai mare

parte este metabolizată, în timp ce 35-140 mg sunt excretate în urina de 24 de ore.

159

Identificarea urobilinoizilor urinari

Reacţia Ehrlich

Principiu:

În prezenţa p-dimetilaminobenzaldehidei în mediu puternic acid, urobilinogenul

şi stercobilinogenul dau o coloraţie roşie intensă prin formarea unui compus chinoid.

Reactivi: - Reactiv Ehrlich: se dizolvă 2 g p-dimetilaminobenzaldehidă în 100

ml HCl 20%.

- Cloroform

Mod de lucru:

La 3 ml de urină se adaugă 2-3 picături reactiv Ehrlich. Se lasă în repaus un

minut. Apariţia unei coloraţii roşii intense la temperatura ambiantă denotă o eliminare

crescută de urobilinogen. Colorantul se poate extrage în cloroform. Porfobilinogenul

intermediar al sintezei hemului, care apare în urină în porfiria intermitentă acută, dă o

coloraţie asemănătoare. El nu este însă solubil în cloroform. Dacă după agitare cu

cloroform acesta rămâne incolor, reacţia pozitivă se datoreşte prezenţei

porfobilinogenului.

Observaţie: Urina de analizat trebuie să fie rece. În urina caldă indolul eliberat în

condiţiile de reacţie poate da şi el culoare roşie cu reactivul Ehrlich. Sulfamidele dau o

coloraţie galbenă care poate masca reacţia bilinogenilor.

Interpretare: Eliminarea crescută a urobilinoizilor apare în următoarele situaţii:

1). Hemoliză exagerată: funcţia hepatică este în general intactă, dar posibilităţile

de glucuronoconjugare ale ficatului sunt depăşite.

2). Tulburarea funcţiei hepatice: ictere hepatocelulare, hepatite, ciroză sau

intoxicaţii chimice cu cloroform şi în special cu tetraclorură de carbon.

3). Icter prin obstrucţie, în stadiile precoce, de obstrucţie incompletă.

Identificarea sângelui

În urină apare fie hemoglobina liberă (hemoglobinurie), fie hematii (hematurie).

Diferenţierea se poate face numai prin examenul microscopic al sedimentului urinar, şi

anume în primul caz în sediment nu se observă hematii.

Se foloseşte urina proaspătă fiindcă majoritatea testelor se bazează pe acţiunea

pseudoperoxidazică a hemoglobinei: leucoderivatul unui colorant (benzidina,

fenolftaleină redusă în mediu alcalin, etc.) este oxidat cu apă oxigenată, în prezenţa

hemoglobinei, în colorantul respectiv. Întrucât leucocitele dau o reacţie peroxidazică

160

adevărată (enzimatică) este necesar să se fiarbă urina câteva minute, după acidularea

prealabilă cu acid acetic.

Reacţia cu benzidină

Reactivi: - Sol. benzidină: 5 g benzidină se dizolvă în 50 ml acid acetic

glacial şi se completează cu apă distilată la 1000 ml.

- Apă oxigenată 3%

Mod de lucru:

Se iau 3 ml urină, 2-3 pic. sol. benzidină şi 2 ml apă oxigenată 3%. Se agită,

reacţia pozitivă prezintă o culoare albastră. Ordinea de adăugare a reactivilor este

esenţială.

Interpretare:

Hematuria macroscopică (vizibilă cu ochiul liber) apare în caz de: calculi renali,

tumori renale sau ale căilor urinare (cancerul renal deseori are ca primă manifestare

hematuria), tuberculoză urogenitală, traumatisme, chisturi renale, diateză hemoragică

(sângerări multiple, în diferite ţesuturi), cistită hemoragică. Hematuria microscopică,

deseori renală apare în caz de: calculi ureterali care produc leziuni ale mucoasei,

pielonefrită, nefrită interstiţială, în colagenoze (boli autoimune cu frecventă afectare

renală), de însoţire în boli infecţioase, efort fizic, glomerulonefrită (lezarea gravă a

filtrului glomerular face posibilă traversarea lui de către hematii) .

Teste rapide de diagnostic din urină

Stripsurile pentru analiza urinei sunt plăci de celuloid care conţin mai multe

benzi de hârtie impregnate cu reactivi. Parametri cei mai importanţi care se analizează

sunt: densitatea, pH-ul, bilirubina, urobilinogenul, proteinele, glucoza, corpii cetonici,

leucocitele, nitriţii şi sângele. Stripsul se introduce în proba de urină pentru câteva

secunde, timp în care au loc reacţiile corespunzătoare. Culoarea se compară cu o scală

de culori care arată aproximativ cantitatea de substanţe conţinute, pH-ul, etc, sau se

introduce stripsul într-un aparat special care citeşte rezultatele.

Test rapid de sarcină

Se bazează pe determinarea hormonului coriogonadotrop uman (hCG). Dacă

acesta se găseşte în urină în cantitate mare (peste 800 U/l), testul este pozitiv, iar la

161

valori sub 500 U/l testul este negativ. Principiul de determinare se bazează pe latex-

aglutinare, hemaglutinare, sau o metodă imunoenzimatică, în funcţie de testul folosit.

La metoda de latexaglutinare elementele de latex ale plăcii de reacţie a kitului

sunt acoperite cu hCG. Antiserul folosit conţine anticorpi monoclonali specifici pentru

beta-hCG. În caz pozitiv (dacă este sarcină) hCG din urină în concentraţie de peste 800

U/l se leagă de anticorpii monoclonali ai antiserului, împiedicând astfel aglutinarea

elementelor de latex acoperite cu anticorpi. În caz negativ, dacă nivelul hCG în urină

este sub 500 U/l, atunci hCG de pe suprafaţa elementelor de latex se poate lega de

anticorpii monoclonali cu locusurile de legare libere, astfel se produce aglutinarea.

În cadrul metodei imunoenzimatice în prima etapă se adaugă într-o eprubetă

proba de urină la anticorpul anti-hCG legat de o enzimă, apoi acest amestec este pus pe

o placă de reacţie. Dacă proba conţine hCG, acesta se leagă de anticorpul monoclonal şi

complexul se leagă de un alt anticorp (anti-hCG) legat de placa de reacţie. În a doua

etapă se adaugă un substrat care este transformat de către enzima din complex într-un

compus colorat. Această reacţie este foarte sensibilă, fiind pozitivă peste valoarea de 25

U/l hCG.

Analiza de laborator a urinei

Analiza de rutina evidenţiază: Aspect: clar. Cilindri: absenţi, eventual prezenţa

cilindrilor hialini. Culoare: galben pai. Cristale: prezente. Celule epiteliale: absente.

Miros: uşor aromatic. pH: 4,5-8,0. Densitate: 1,025-1,030g/cm3. Glucide: absente.

Hematii: 2-3/câmp vizual. Leucocite: 0-4/câmp vizual.

Proba de concentrare pune în evidenţă: Densitatea: 1,025-1,032g/cm3.

Osmolaritatea: > 800 mOsm/kg apă

Proba de diluţie pune în evidenţă: Densitatea: < 1,003. Osmolaritatea: < 100

mOsm/kg apă.

162

Determinări în urina din 24 de ore.

Dozarea clorurilor din urină (metoda Mohr)

Principiu.

Azotatul de argint precipită cantitativ ionul clor din urină sub formă de clorură

de argint, iar excesul de azotat de argint dă cu cromatul de potasiu folosit ca indicator,

cromat de argint de culoare roşie, care indică sfârşitul reacţiei.

NaCl + AgNO3 → AgCl + NaNO3

K2CrO4 + 2AgNO3 → Ag2CrO4 + 2KNO3

Reactivi: - soluţie de acid acetic 10% ;

- carbonat de calciu pulbere ;

- soluţie cromat de potasiu10%;

- soluţie azotat de argint 0,1N.

Modul de lucru:

Într-un vas Erlenmeyer se pipetează 10 ml urină de analizat, se adaugă 5 picături

din soluţia de acid acetic 10% pentru a dizolva precipitatul de fosfaţi neutri care ar

împiedica observarea sfârşitului reacţiei şi 1 g de carbonat de calciu pulbere pentru

neutralizarea completă a amestecului deoarece cromatul de argint care se formează şi

care indică sfârşitul reacţiei este solubil în mediu acid.

La acest amestec se mai adaugă 50 ml de apă distilată şi 5-6 picături din soluţia

de cromat de potasiu. Se titrează cu soluţia de azotat de argint 0,1 N până la apariţia

unei coloraţii roşu-cărămiziu a precipitatului.

Calcularea rezultatelor

1 ml AgNO3 0,1 N corespunde la 0,00585 g NaCl

g/l NaCl = n x 0,00585 x 100

n = ml soluţie AgNO3, 0,l N folosiţi la titrare.

Variaţii patologice

Rezultatul se poate raporta la cantitatea de urină emisă în 24 de ore. În mod

normal urina din 24 de ore conţine 9-12 g NaCl.

- valori crescute: regim hiperclorurat, insuficienţă suprarenală, nefropatii tubulare sau

interstiţiale:

- valori scăzute: retenţii tisulare, nefrite, transpiraţii excesive, vomă, maladii cardiace,

dietă fără sare.

163

Persoana la care se face analiza clorurilor în urină nu trebuie ca înaintea analizei

să consume bromuri sau ioduri, deoarece şi acestea precipită cu azotatul de argint şi

rezultatele nu vor fi concludente.

Analiza chimică a urinei evidenţiază:

- Amilază: 10-80 UI/oră

- 17 cetosteroizi: - bărbaţi: 6-21 mg/24 ore

- femei: 4-17 mg/24 ore

- Clearance de creatinină: - bărbaţi (20 ani): 90 ml/min/1,73 m2

- femei (20 ani): 84 ml/min/1,73 m2

- Proteine: < 150 mg/24 ore. Acid uric: 250-750 mg/24 ore. Glucozoxidază: negativ.

Corpi cetonici: negativ

- Calciu: - bărbaţi: < 275 mg/24 ore

- femei: < 250 mg/24 ore

- Fosfat: < 1000 mg/24 ore. Sodiu: 30-290 mEq/24 ore. Clor: 110-250 mEq/24 ore

Dozarea acidului uric din urină

Recoltarea urinii de 24 ore se face într-un recipient de sticlă cu 10 ml NaOH 5%

pentru a preveni precipitarea uraţilor.

Modul de lucru:

În loc de 2 ml filtrat se lucrează cu 2 ml urină diluată 1:100.

Calcul:

Ep/Es x 100 x 15 = mg acid uric/1500 ml urină (pe 24 de ore)

Valori normale:

0,25 - 1,00 g acid uric eliminat/24 h

Valori crescute: În gută (după puseuri), tumori maligne

Valori scăzute: în gută (înainte si în cursul puseurilor), boli renale

Dozarea creatininei din urină

Principiu şi reactivii: acelaşi ca pentru ser

Modul de lucru:

Se diluează urina de 50 ori. Din această soluţie se pipetează 1,5 ml, se adaugă

4,5 ml acid picric saturat şi se introduce vasul pentru 15-20 secunde în baie de apă

fierbinte. Dacă soluţia rămâne limpede, după răcire se scot 5 ml de probă la care se

adaugă 0,25 ml NaOH 10%. După 15 minute se citeşte extincţia probei faţă de martor la

164

530 nm. Martorul va conţine 2 ml de apă bidistilată, 6 ml acid picric saturat şi 0,25 ml

NaOH 10%. În paralel se execută aceleaşi operaţii folosind în locul urinei diluate o

soluţie standard de creatinină de concentraţie cS = 10 μg/ml pentru care se obţine

extincţia Es.

Calcul: 1000

150cE

E creatinină mg S

S

urină ⋅⋅⋅=

Determinarea de clearance (coeficientul de epurare) renal

Pornind de la faptul că constituenţii urinii provin din sânge, cunoscând cantitatea

lor în sânge şi în urină, putem calcula volumul de sânge epurat de aceste substanţe.

Pentru orice substanţă din sânge, care se elimină în urină, putem scrie formula: mp = mu

unde: mp = cantitatea absolută a substanţei dintr-un volum de plasmă care va fi epurată

de aceea substanţă. mu = cantitatea absolută a substanţei ajunse prin epurare în urină.

mp = Vp ⋅ cp/100. mu = Vu ⋅ cu/100. Vp ⋅ cp = Vu ⋅ cu

cp, cu = concentraţiile plasmatică şi urinară a substanţei. Vu = volumul de urină eliminat

în ml/min. Vp = C (clearance = coeficient de epurare) = acel volum virtual de plasmă

care este epurat într-un minut de această substanţă (ml/min) pe cale renală. Deci

coeficientul de epurare este exprimat prin raportul dintre debitul urinar al unei substanţe

pe minut şi concentraţia sa în plasmă:

cu C = ---- ⋅ Vu cp

La nivelul nefronului au loc 3 procese importante: filtrarea glomerulară,

reabsorbţia tubulară şi secreţia tubulară. Clearance-ul este egal cu volumul filtrării

glomerulare pe minut în cazul substanţelor care se filtrează liber, adică nu sunt

reabsorbite şi secretate la nivel tubular, nu se transformă, nu se depozitează, nu

influenţează funcţia renală, nu sunt toxice. Astfel de substanţe pot fi endogene

(creatinină) şi exogene (inulină, manitol-polizaharide cu masă moleculară mare etc.).

Astfel determinarea clearance-ului de creatinină endogenă permite explorarea filtrării

glomerulare. Clearance-ul de creatinină endogenă este egal cu 120 ml/min pentru o

suprafaţă corporală medie de 1,7 m2 şi o greutate medie de 70 kg.

165

Fiecare substanţă din plasmă are un coeficient de epurare indiferent de

concentraţia sa în urină. Majoritatea constituenţilor obişnuiţi ai urinei au un coeficient

de epurare mai mic de 120 ml/min, datorită reabsorbţiei tubulare parţiale sau totale (de

ex. Cglucoză = 0). O altă categorie de substanţe au un clearance superior filtratului

glomerular, deoarece ele ajung în urina finală şi printr-un proces de secreţie tubulară.

Determinarea clearance-ului de creatinină permite deci explorarea capacităţii de filtrare

glomerulară.

Calcul:

Calculul clearence-lui de creatinină (C) se poate face cu următoarea formulă

C = Eurină/Eser ⋅ 50 ⋅ 1500/24 ⋅ 60

unde: Eurină şi Eser sunt extincţiile optice citite pentru probele de urină, respectiv

ser în metodele de dozare descrise la pag. 121.

Valori normale: 80-120 ml/min

Analiza calculilor urinari

Calculii urinari se formează prin precipitarea unor substanţe organice şi

anorganice des întâlnite în sedimentul urinar: oxalat de calciu, acid uric, uraţi, fosfaţi de

calciu şi magneziu, xantina, colesterolul. Acestea se depun sub formă de straturi

alternante în jurul unui nucleu sau sunt amestecate intim. Calculi omogeni se întâlnesc

rar.

Identificarea unor componenţi prin reacţii specifice:

1) CO32-: Pulberea de calcul urinar se dizolvă cu efervescenţă în soluţie de HCl 2N la

cald.

2) PO43-: Într-o eprubetă se introduce un vârf de cuţit de pulbere de calcul, se adaugă

câteva picături de HNO3 concentrat (d = 1,42 g/ml) şi 1-2 ml soluţie de molibdat de

amoniu 5%. Se încălzeşte şi se lasă în repaus. Apariţia unei coloraţii sau precipitat

galben de fosfomolibdat de amoniu indică prezenţa fosfatului.

3) (COO)22-: Într-o eprubetă se introduc un vârf de cuţit de pulbere de calcul, 1 ml

H2SO4 5% şi 2 picături KMnO4 1%o. Se încălzeşte eprubeta. Dacă oxalatul este

prezent, va reduce KMnO4 producând decolorarea soluţiei.

166

4) Cistină: Într-o eprubetă se introduc un vârf de cuţit de pulbere, 1 ml soluţie de

NaOH 10% şi 2-3 picături soluţie de Pb(CH3COO)2 saturată. Eprubeta se încălzeşte

la fierbere 1-2 minute. Prezenţa cistinei duce la formarea PbS (precipitat negru).

5) Urat (reacţia murexidului): Într-o capsulă de porţelan se introduce un vârf de cuţit

de pulbere care apoi se umectează cu 2-3 picături HNO3 concentrat (d = 1,42 g/ml)

şi se evaporă pe flacără la sec. Apariţia unei culori roşii indică formarea acidului

purpuric prin oxidarea acidului uric de către HNO3. Adăugând o picătură de soluţie

NH3 25% şi o picătură soluţie NaOH 10% apare o culoare violetă datorită

murexidului (purpurat de amoniu).

6) Xantina: Se face reacţia cu HNO3 concentrat ca şi în cazul evidenţierii uratului.

Prezenţa xantinei determină un reziduu galben care nu-şi schimbă culoarea la

adăugarea soluţiei de NaOH. Adăugând soluţie de NH3 culoarea virează spre roşu.

7) Colesterolul: (reacţia Liebermann-Burchardt): Într-o eprubetă se introduc 1 vârf de

cuţit de pulbere, 1 ml cloroform, 4 picături H2SO4 concentrat (d = 1,92 g/ml) şi 2

picături anhidridă acetică.

Prezenţa colesterolului determină formarea dicolestendienei de culoare ce variază de la

roz la verde, extractibilă în cloroform.

Calculii urinari apar în litiaza urinară cu următoarea frecvenţă relativă: Oxalat

de Ca 34,2%. Oxalat de Ca + fosfat de Ca 26,2%. Acid uric 18,8%. Fosfat de Ca 9,7%.

Oxalat de Ca + acid uric 4,5%. Fosfat amoniaco-magnezian 2,2%. Carbonat de Ca

2,2%. Cistină 1,7%.

Analiza salivei

Identificarea unor componenţi ai salivei

Saliva – reprezintă produsul de secreţie al glandelor salivare. Este un lichid

incolor, transparent, insipid, având densitatea între 1,002-1,006g/cm3 şi pH în jur de 6,8

în momentul secreţiei, devenind mai alcalin în timpul masticaţiei.Volumul salivar

mediu zilnic este de aproximativ 800 ml.

167

Compoziţia salivei diferă în funcţie de următorii factori: perioada de zi în care se

face recoltarea; înainte sau după mese; alimentele consumate; igiena bucală; stimulul

aplicat la recoltare.

Compoziţia chimică a salivei este următoare:

- apă: 99,4%

- substanţe anorganice 0,2%: Na+, K+, Ca2+, Mg2+, HCO3-, Cl-, SCN-, PO4

2-

- substanţe organice 0,4%: proteine, enzime salivare (amilază, lizozim),

mucine (glicoproteine), micromolecule azotate (uree, creatină, etc.),

micromolecule neazotate (acid lactic, acid citric).

Reactivi: - CH3COOH 5%.

- NaOH 5%.

- Reactivul biuret - Soluţia A: 4,5 g tartrat de sodiu şi potasiu se

dizolvă în 40 ml NaOH 0,2 N. Se adaugă sub agitare 1,5 g CuSO4•5H2O dizolvat în 10

ml apă, apoi se adaugă 0,5 g KI şi se completează cu NaOH 0,2 N până la 100 ml. Se

conservă în sticlă brună timp nelimitat.

- Soluţia B: se dizolvă 5 g KI în 1000 ml de

NaOH 0,2 N. Se conservă timp nelimitat, în sticla brună.

- Soluţia de lucru: se dizolvă 1 volum soluţie A

cu 4 volume soluţie B. Se poate utiliza o săptămână, păstrându-se în sticlă brună.

- HCl 5%.

- Na2CO3 20%.

- Reactivul Benedict ( 173 g citrat de sodiu şi 100 g carbonat de

sodiu anhidru se dizolvă în 800 ml apă distilată fierbinte, se filtrează şi se aduce

volumul la 850 ml. Se dizolvă apoi separat 17,3 g sulfat de cupru cristalizat în 100 ml

apă distilată, se adaugă sub agitare în prima soluţie şi se completează volumul soluţiei

finale la 1000 ml.

- HNO3 5%.

- AgNO3 5%.

- HNO3 concentrat.

- (NH4)2MoO4 5%.

- BaCl2 5%.

- (COO NH4)2 5%.

- FeCl3 5%

168

Identificarea mucinei: Mucinele au ca grupare prostetică compuşi din clasa

glucidelor ce derivă de la aminozaharuri.

a) Precipitarea mucinei: la 5 ml salivă se adaugă 1 ml acid acetic 5%. Mucina

precipită, se filtrează. Filtratul se păstrează pentru identificarea altor

componenţi, iar din precipitat se pune în evidenţă partea proteică şi cea glucidica

a mucinei.

b) Identificarea părţii proteice: o parte a precipitatului se dizolvă în 1 ml NaOH 5%

şi se adaugă 1 ml din reactivul biuret. Datorită componentei proteice se

formează complexul de culoare violetă.

c) Identificarea părţii glucidice: partea ce rămâne din precipitat se fierbe câteva

minute în 5 ml HCl 5%. Se răceşte, se alcalinizează cu Na2CO3 20% şi se

efectuează reacţia Benedict. Reacţia va fi pozitivă datorită apariţiei glucidelor

reducătoare în urma hidrolizei părţii glucidice.

Identificarea Cl-: La porţiunea de filtrat de salivă (lipsită de mucină) se adaugă

HNO3 5% ş AgNO3 5%. Formarea unui precipitat alb de clorură de argint indica

prezenţa ionilor Cl-

Identificarea PO43-: Filtratul de salivă se acidulează cu HNO3 conc., se adaugă

câteva picături de molibdat de amoniu 5% şi se încălzeşte. Prezenţa ionilor de PO43-

este indicată prin apariţia unui percipitat galben sau o coloraţie galbenă.

Identificarea SO42-: Se acidulează filtratul de salivă cu HCl 5% şi se aduga

BaCl2 5%. În prezenţa ionilor SO42- apare un precipitat alb de sulfat de bariu.

Identificarea Ca2+: Se adaugă la filtratul de salivă oxalat de amoniu 5%. În

prezenţa ionului de Ca2+ apare un precipitat alb de oxalat de calciu.

Identificarea SCN-: La filtratul de salivă se adaugă 1-2 picături de HCl 5% şi 1-

2 picături FeCl3 5%. În prezenţa ionilor de SCN- se formează Fe(SCN)3 de culoare

roşie. La fumători, în general, concentraţia ionului SCN- este mai mare ca la nefumători.

Determinarea pH-ului şi a capacităţii tampon a salivei

Determinarea pH-ului: Se face cu hârtie de indicator universal sau mai exact

prin metoda electrometrică. În mod normal, pH-ul salivei (salivă proaspătă) este de

6,5-7,0 deci neutru.

Scăderea pH-ului salivei (până la valori slab acide 6,0), ca şi creşterea (până la

valori slab bazice 7,9) poate apărea în anumite stări fiziologice

- scăderi în timpul nopţii

169

- scăderi după mese

- scăderi la gravide

cât şi în unele stări patologice - tulburări sanguine acido-bazice

- leziuni ale cavităţii bucale

În timpul păstrării salivei recoltate, pH-ul iniţial neutru devine alcalin, din cauza

pierderii de CO2.

Determinarea capacităţii tampon:

Principiu: Saliva dispune de un important efect tampon exercitat de următoarele

sisteme tampon: dicarbonat, fosfat şi proteină (mucină)

Capacitatea sistemelor tampon se exprimă prin numărul de echivalenţi de acid

sau bază care schimbă pH-ul unui litru de soluţie tampon cu o unitate. În scopuri

practice capacitatea poate fi exprimată şi prin numărul mililitrilor de acid sau bază de

concentraţie cunoscută, tamponate de un anumit volum de soluţie tampon.

Reactivi: - HCl 0,01 N;

- NaOH 0,01 N;

- Metilorange (soluţie de indicator) 0,1%;

- Fenolftaleină (soluţie de indicator) 0,1% în alcool.

Modul de lucru:

6 ml salivă se diluează cu 14 ml apă distilată. Saliva diluată se împarte în două

probe de câte 10 ml. Într-una din probe se pune 3 picături de metilorange, iar în cealaltă

3 picături de fenolftaleină. Cu ajutorul microbiuretei se adaugă primei probe HCl N/100

iar celei de-a doua probă NaOH N/100, până la virajul indicatorilor. Se notează volumul

de HCl N/100 şi de NaOH N/100 consumate. Aceste volume se înmulţesc cu factorii

soluţiilor respective şi se raportează la 1000 ml salivă.

Analiza sucului gastric

Determinarea acidităţii gastrice

Sucul gastric provine din secreţia unui mare şi variat număr de celule ale

mucoasei gastrice. Zona glandelor fundice elaborează secreţia primară acidă (secreţie

parietală) care este de fapt o soluţie apoasă de acid clorhidric. Zona antropilorică

170

elaborează secreţia primară alcalină (secreţia neparietală), care este un amestec de

proteine, mucus, ioni de sodiu, potasiu, calciu, clorură şi bicarbonat. Secreţia alcalină

are rolul de a reduce aciditatea gastrică prin neutralizare şi diluţie.

Sucul gastric rezultă deci din amestecul celor două secreţii parietale şi

neparietale din care rezultă lichidul intens acidulat (pH = 1-2).

Principiu:

În laborator se determină aciditatea totală, liberă şi legată. Aciditatea liberă

reprezintă concentraţia ionilor de hidroniu proveniţi din acidul clorhidric liber.

Aciditatea legată reprezintă concentraţia ionilor de hidroniu legaţi de proteine, fosfaţi

acizi, acizi carboxilici şi alte substanţe. Aciditatea totală este dată de însumarea celor

două acidităţi (liberă şi legată) şi se poate defini ca fiind suma ionilor de hidroniu

titrabili cu NaOH 0,1 N.

Sucul gastric filtrat se titrează cu NaOH 0,1 N în prezenţă de indicator Tőpfer.

Figura redă curba de titrare (variaţia pH-ului în funcţie de NaOH 0,1N adăugat)

în cazul unui suc gastric normal.

Indicatorul Tőpfer este un indicator universal preparat din p-

dietilaminoazobenzen şi fenolftaleină. În tabel este prezentat virajul indicatorului Tőpfer

în funcţie de pH (vezi curba de titrare de mai sus).

Indicator Tőpfer pH Culoarea

p-dimetilaminoazobenzen 0 - 2,9

2,9 - 4,1 4,1 - 14

roşu portocaliu

galben

fenolftaleină 0 - 8 8 - 10 10 - 14

incolor roz roşu

171

Reactivi: - Indicatorul Tőpfer : p-dimetilaminoazobenzen 0,25 g

fenolftaleină 2 g

alcool etilic 96%. 100 ml

- Sol. NaOH 0,1 N cu factorul FNaOH

Modul de lucru:

În trei flacoane Erlenmeyer de 100 ml se măsoară câte 10 ml suc gastric şi se

adaugă 1-2 picături de indicator Tőpfer. Soluţia se titrează cu NaOH 0,1 N până la

portocaliu şi se notează cantitatea de NaOH 0,1 N folosită. Această cantitate reprezintă

volumul folosit pentru dozarea acidităţii libere şi se notează cu v. Se continuă titrarea

trecând prin culoarea galbenă până la apariţia culorii roşii. Totalul mililitrilor de NaOH

0,1 N consumaţi de la începutul titrării se notează cu v' şi vor fi luaţi în considerare

pentru calculul acidităţii totale.

Calcul: Rezultatul se exprimă în unităţi clinice (UC, numărul de ml de NaOH

0,1 N folosiţi la titrarea a 100 ml suc gastric).

aciditatea liberă = v × FNaOH × 10 UC

aciditatea totală = v' × FNaOH × 10 UC

Valoarea acidităţii legată se obţine făcând diferenţa dintre aciditatea totală şi cea

liberă.

Valori normale: aciditatea liberă = 30 UC; aciditatea totală = 50 UC.

Valori patologice:

Valori crescute: Hiperaciditate se întâlneşte în stări de stres (stimulul simpatic

induce creşterea secreţiei de HCl în mucoasa gastrică), în gastrite hiperacide, ulcer

gastric şi duodenal. În tumori pancreatice secretoare de gastrină (gastrinoame), se

produc ulceraţii multiple datorită hiperstimulării secreţiei de HCl de către gastrină

(sindromul Zollinger-Ellison).

Valori scăzute: Hipoaciditatea apare în unele tipuri de gastrită. Aclorhidria, lipsa

totală de HCl se datorează atrofiei mucoasei gastrice sau proliferării ei tumorale

(celulele canceroase îşi pierd funcţiile fiziologice). O stare şi mai gravă este aclorhidria

histamino-refractară, când nici la stimulare cu histamină nu se secretă HCl. În afară de

HCl, celulele parietale ale mucoasei gastrice mai secretă şi o glicoproteină numită factor

extrinsec care leagă vitamina B12 şi o transportă la celulele intestinale pentru a se

absorbi. În cazul atrofiei mucoasei sau proliferării ei canceroase, nu se secretă acest

factor intrinsec şi apare anemia pernicioasă (prin deficitul de absorbţie a vitaminei B12).

172

Analiza lichidului cefalorahidian

Componentele lichidului cefalorahidian (LCR) provin din plasmă prin difuzie

liberă şi printr-un proces de secreţie. Aceasta se observă comparând compoziţia chimică

a lichidului cefalorahidian cu aceea a plasmei:

Componente LCR (mg%) Plasmă (mg%)

sodiu 325 325

potasiu 10 20

calciu 5 10

magneziu 3 3

Cl- 449 360

HCO3- 40 60

HPO42- 2 1

SO42- 0,5 1

proteine 30 7000

uree 24 30

acid uric 0,5-2,6 4

glucide reducătoare 72 90

bilirubină 0,2 0,8

acizi organici urme urme

Recoltarea lichidului cefalorahidian se face prin puncţie lombară, suboccipitală

sau ventriculară, în eprubete perfect curate şi sterilizate. După recoltare, în primul rând

se efectuează examenul microbiologic şi citologic, iar restul probei se foloseşte pentru

examenele fizice şi chimice.

Examenul fizic

Culoarea: LCR normal este incolor şi limpede. În unele afecţiuni este colorat în

galben, roz sau verzui. Această culoare se datorează prezenţei bilirubinei sau

biliverdinei şi este indiciul unei hemoragii la nivelul sistemului nervos central. LCR

173

poate fi colorat în roşu datorită sângelui care poate proveni fie în mod accidental

datorită unei puncţii greşit efectuate, fie datorită unei afecţiuni.

Transparenţa: În mod normal, LCR este transparent. În unele afecţiuni poate fi

opalescent datorită prezenţei în cantitate mare a leucocitelor, albuminei sau

microorganismelor. LCR este tulbure în meningitele purulente. Un aspect particular îl

prezintă în cazul meningitei tuberculoase când probele vor forma o peliculă de fibrină la

suprafaţă.

Densitatea: Densitatea normală a LCR este foarte apropiată de aceea a apei:

1,006-1,008 g/cm3. Densitatea creşte în unele afecţiuni patologice. Ea se determină cu

areometre speciale de dimensiuni mici.

Examenul chimic al lichidului cefalorahidian

Examenul chimic se face numai pe un LCR centrifugat. Cele mai frecvente

determinări care se efectuează pe lichidul cefalorahidian şi care prezintă interes pentru

diagnostic sunt: determinarea proteinelor, a glucozei, a clorurilor, al ureei, a

permeabilităţii faţă de nitraţi (această reacţie este utilizată pentru decelarea unei

permeabilităţi menigiene alterate). Dintre aceste metode vom descrie doar o metodă de

determinare orientativă a hipo- şi hiperglicorahiei.

Cercetarea hipo- şi hiperglicorahiei:

Principiu:

Alegând în mod convenabil diluţiile LCR şi ale reactivului Fehling se poate

obţine o reducere uşoară sau nulă a reactivului. La aceste diluţii LCR cu concentraţii

scăzute, normale şi crescute de glucoză se comportă diferit.

Modul de lucru:

În două eprubete (I pentru cercetarea hipoglicorahiei şi II pentru cercetarea

hiperglicorahiei) se măsoară:

I II

L.C.R. ml 2,0 0,6

H2O dist. ml - 2,0

Reactiv Fehling ml 0,2 1,0

174

Fierbere 5 minute în baie de apă

Interpretarea: - I şi II negativ (albastru) - hipoglicorahie

- I negativ (albastru) şi II pozitiv (roşu) - normoglicorahie

- I şi II pozitiv (roşu) - hiperglicorahie

Dozarea glucozei din LCR se poate efectua prin metoda enzimatică cu glucozo-oxidază.

Valorile fiziologice ale glicorahiei: 55-70 mg/100 ml, sunt valoari cuprinse între

jumătate şi 2/3 din glicemie. Acest raport, în cazuri normale, rămâne constant, iar

variaţiile glicorahiei sunt aceleaşi cu ale glicemiei.

Valori patologice: Valori crescute numai pentru glicorahie se întâlnesc în

tumori, encefalite, abcese cerebrale. Glicorahia scade mult în meningita tuberculoasă.

Analiza scaunului

Identificarea sângelui din scaun (Proba Gregersen)

Reactivi: - acid acetic glacial;

- eter etilic;

- H2O2 10%.

- soluţie de benzidină 2% în acid acetic glacial.

Mod de lucru:

Se zdrobeşte o bucată din scaunul de analizat cu puţină apă, se adaugă acid

acetic glacial (raport 2:1) şi se agită cu cantitate egală de eter într-o pâlnie de agitare.

După scurgerea fazei apoase (inferioare) se lucrează mai departe cu faza eterică

(superioară): se adaugă câteva picături de soluţie de H2O2 la 2 ml soluţie de benzidină şi

în această soluţie punem o cantitate din extractul obţinut. În caz pozitiv proba se va

colora în verde.

Identificarea se poate efectua şi fără etapa de extracţie eterică. Se toarnă un

amestec de soluţie de benzidină în acid acetic glacial cu apă oxigenată peste scaunul de

analizat. Lichidul care se scurge de pe probă este verde în caz de prezenţă a sângelui.

Această analiză se efectuează după trei zile de regim strict: pacientul trebuie să

evite carnea şi alimentele bogate în clorofilă, deoarece această probă este pozitivă şi în

cazul prezenţei mioglobinei şi clorofilei.

Există şi un test specific care identifică doar hemoglobina umană din scaun prin

latexaglutinare. Acest test imunologic nu necesită dietă specială.

175

Patologie: Sângele apare în scaun cel mai frecvent datorită lezării hemoroizilor

în timpul defecării. Tumorile colonului (benigne şi maligne) pot determina o sângerare

de obicei ocultă (invizibilă cu ochiul liber), care se poate decela cu această probă.

Uneori chiar sângerările gastrice se pot exterioriza pe cale fecală prin sânge proaspăt

(când tranzitul intestinal este accelerat sângele nu are timp să fie digerat), dar cel mai

frecvent în caz de hemoragie digestivă superioară apare melena (scaun negru, ca

păcura).

Semnele de malabsorbţie/maldigestie în scaun

Evidenţierea glucidelor din scaun

- În scaun pot apare glucide reducătoare (glucoză, fructoză, lactoză) detectabile

cu reacţiile Benedict, Barfoed, etc. (v. cap. Analiza glucidelor). Aceste glucide sunt

eliminate prin scaune diareice în caz de malabsorbţie glucidică.

- Se pot detecta şi polizaharidele nedigerate din materiile fecale.

Mod de lucru:

Se adaugă câteva picături de soluţie Lugol (cu conţinut de iod) la scaunul

proaspăt eliminat. Amidonul nedigerat dă o coloraţie albastră cu iodul, iar în caz de

digestie incompletă compuşii intermediari de degradare (dextrinele) dau o coloraţie

roşie.

Patologie: În cazul secreţiei deficitare de amilază pancreatică apar amidonul şi

dextrinele în materiile fecale.

Evidenţierea lipidelor din scaun

În condiţii normale materiile fecale conţin o cantitate foarte mică de lipide. Dacă

creşte această cantitate (steatoree), scaunul capătă un luciu caracteristic şi, prin

amestecarea fecalelor cu apă, apar pete de grăsime pe suprafaţa apei.

Mod de lucru:

Scaunul proaspăt eliminat se colorează cu Sudan III (roşu Sudan). Cu acest

colorant se pot evidenţia lipidele nedigerate, deoarece trigliceridele şi esterii

colesterolului se colorează în roşu.

Patologie:

În scaun apar lipide nedigerate în secreţia insuficientă de lipază pancreatică şi în

deficitul de acizi biliari datorat obstrucţiei cailor biliare sau incapacităţii hepatice de

secreţie a acestora, stări care au consecinţă malabsorbţia lipidică.

176

Evidenţierea proteinelor din scaun

Mod de lucru:

Se examinează la microscop preparatul nativ (fără coloraţie) al probei de scaun.

Se pot recunoaşte uşor mai ales fibrele musculare nedigerate, care arată deficitul

digestiei proteice.

Patologie: Maldigestia proteică este datorată secreţiei insuficiente de proteaze

pancreatice.

Metode fizice de analiză folosite în laborator

Fotometria

Principiu:

Fotometria se bazează pe excitarea luminoasă a electronilor moleculelor

substanţei.

După lungimea de undă, exprimată în nanometri (nm) sau în Ångströmi (Å),

spectrul undelor electromagnetice folosite în fotometrie se împarte în 3 regiuni:

- ultraviolet 200 - 450 nm,

- vizibil 400 - 800 nm,

- infraroşu 800 - 20000 nm,

Metoda spectrofotometrică de analiză se bazează pe determinarea extincţiei unui

strat de soluţie colorată cu grosimea de 1 cm, la diferite lungimi de undă

Pentru obţinerea radiaţiilor de diferite lungimi de undă spectrofotometrele conţin

trei tipuri de monocromaoare: prisme, reţele de difracţie sau filtre.

Lungimile de undă corespunzătoare diferitelor culori sunt redate în tabelul de

mai jos:

Culoarea Domeniul lungimilor de undă Violet 400 - 450 nm Albastru 450 - 500 nm Verde 500 - 570 nm Galben 570 - 590 nm Portocaliu 590 - 620 nm Roşu 620 - 760 nm

177

Efectuarea analizelor prin metoda colorimetrică prezintă avantajul că necesită

cantităţi mici de substanţă şi un timp relativ redus în comparaţie cu analizele chimice.

Legea Bouguer-Lambert-Beer, lege fundamentală a colorimetriei

În condiţii similare, straturile de substanţă colorată de aceeaşi grosime absorb

aceeaşi cantitate de lumină incidentă, absorbţie ce se exprimă matematic prin ecuaţia: lKeII ⋅−⋅= 0

în care I este intensitatea fluxului luminos după trecerea prin soluţie; I0 - intensitatea

fluxului luminos incident; e - baza logaritmilor naturali; l - grosimea stratului; K -

coeficient de absorbţie optică.

Dacă se ia ca bază zecimală de logaritmare, rezultă ecuaţia:

I = I0 • 10 –k•l

Din această ecuaţie, în care coeficientul k reprezintă coeficientul de extincţie, rezultă că:

a. Raportul între intensitatea luminii care a trecut prin stratul de soluţie şi

intensitatea luminii incidente nu depinde de intensitatea absolută a luminii incidente.

b. Când grosimea stratului de soluţie se măreşte în progresie aritmetică,

intensitatea luminii care trece prin aceasta descreşte în progresie geometrică.

c. Coeficientul de extincţie k, depinde numai de natura substanţei dizolvate şi

lungimea de undă a luminii incidente şi este valabilă numai pentru lumină

monocromatică. Această lege a fost stabilită de către P.Bouguer şi I.Lambert.

Beer a stabilit că, coeficientul de extincţie k este liniar proporţional cu concentraţia

substanţei absorbante, adică :

k = ε • C

în care C este concentraţia substanţei colorate iar ε este un coeficient care nu depinde de

concentraţie.

Legea lui Beer stabileşte dependenţa absorbţiei luminii de către stratul cu

grosime constantă de concentraţia substanţei colorante.

Din ultimele două ecuaţii rezultă ecuaţia legii fundamentale a colorimetriei -

legea Bouguer-Lambert-Beer:

I = I0 • 10 –ε•C•l

Raportul dintre intensitatea luminii, I, care a trecut printr-o soluţie şi intensitatea

luminii incidente, I0, poartă denumirea de transparenţă sau transmisie şi se notează cu

litera T:

T = I/I0 = 10 –ε•C•l

178

Valoarea T pentru un strat de 1 cm grosime se numeşte coeficient de transmisie.

Logaritmul mărimii inverse transmisiei se numeşte extincţie, E, sau densitate

optică, D.O.:

E = D.O. = lg 1/T = lg I0/I = ε • C • l

Din această ecuaţie rezultă că extincţia E este liniar proporţională cu

concentraţia substanţei colorate din soluţie.

Spectrofotometru Spekol

Spectrofotometrul Spekol constă dintr-un monocromator, care este o reţea de

difracţie, un fotoelement şi echipamentul de măsurarea fotocurentului (amplificator +

galvanometru).

Lumina emisă de sursa (1) după colimare cade pe reţeaua de difracţie optică

reflectantă (2) şi formează spectrul de difracţie care, în planul fantei de ieşire (3), se

poate plimba cu ajutorul dispozitivului micrometric (4), gradat în nm ce corespund

lungimii de undă a luminii emergente.

Aceasta trece prin cuva (5, 5') ce conţine lichidul de măsurat şi cade pe

fotoelementul (6). Fotocurentul obţinut este amplificat de amplificatorul (7) şi este

indicat de instrumentul (8). Calea luminii monocromatice se poate deschide sau închide

cu ajutorul obturatorului (9). Cuvele cu soluţia de compensare şi cea de măsurat se pot

introduce alternativ în calea luminii cu ajutorul port-cuvei glisante (10). Punctul 0 şi

sensibilitatea amplificatorului se reglează cu butoanele 0 şi 100. Aparatul se alimentează

de la reţea prin transformatorul (11).

Schema de principiu al unui spectrofotometru

179

Spectrofotometru Spekol

Îndreptar pentru folosirea aparatului

1) Se verifică dacă maneta obturatorului (9) se găseşte în poziţia 0.

2) Aparatul se conectează la reţea cu ajutorul întrerupătorului (12). Se aşteaptă

aproximativ 10 min. până la prima citire.

3) Se alege lungimea de undă prevăzută în metodă prin rotirea tamburului

micrometrului (4).

4) Se aşează cuvele în glisorul (10).

5) Cuva cu proba martor se va muta în dreptul fantei.

6) Acul galvanometrului se aduce în poziţia 0 pe scara inferioară cu ajutorul

butonului 0. Pentru a evita eroarea de paralaxă, capul se aduce în poziţia în care

acul şi imaginea lui în oglinda instrumentului se suprapun.

7) Obturatorul se va aduce în poziţia I (deschis). Indicatorul galvanometrului se va

mişca spre dreapta.

8) Cu ajutorul butonului 100 acul galvanometrului se potriveşte la diviziunea 100 a

scării inferioare.

9) Se închide fanta (obturatorul în poziţia 0). Acul indicator trebuie să revină la

poziţia 0. În caz contrar se repetă operaţiile de la punctul 6-9.

10) Se va muta proba în faţa fantei şi se deschide obturatorul.

11) Se citeşte extincţia (E) pe scara superioară. Se apreciază şi fracţiunile de

diviziune.

12) Se închide obturatorul.

180

Recomandări:

• Fotoelementul îşi pierde din sensibilitate dacă este expus luminii timp îndelungat. De

aceea timpul de iluminare a fotoelementului va fi redus la minimul posibil.

• Pentru a evita spargerea cuvelor se va lucra cu ele exclusiv deasupra mesei, la mică

înălţime.

• Suprafeţele optice ale cuvelor trebuie să fie perfect curate, de aceea se va evita

atingerea pereţilor transparenţi.

• Umplerea cuvei se va face ţinând cuva înclinată la aproximativ 45º şi turnând lichidul

până la circa 2/3 din înălţime.

• Cuva se va goli prin răsturnare bruscă în poziţia cu gura în jos şi păstrând această

poziţie se va aşeza pe o hârtie de filtru curată.

• După folosirea cuvelor se spală cu apă distilată şi se aşează cu gura în jos pe o hârtie

curată.

Spectrofotometrul de absorbţie atomică

Principiu:

O parte din atomii speciei ce urmează a fi analizaţi sunt excitaţi în fllacără la un

nivel energetic superior emiţând apoi prin revenirea la nivelul iniţial o radiaţie

corespunzătoare liniei de rezonanţă. Dar majoritatea atomilor rămân în starea

fundamentală. În spectroscopia de absorbţie atomică se trece prin flacără o radiaţie

având frecvenţa liniei de rezonanţă. Atomii rămaşi în starea fundamentală absorb

această radiaţie (pe care ar emite-o dacă ar fi excitaţi) şi absorbţia este proporţională cu

concentraţia atomilor în flacără şi grosimea stratului străbătut de radiaţia

monocromatică.

Spectrofotometrul de absorbţie atomică

Spectrofotometrul de absorbţie atomică se compune din:

1. Sursa de radiaţie care emite linia de rezonanţă a elementului de determinat. Emisia

lămpii este modulată pentru ca detectorul să înregistreze doar lumina emisă de lampă nu

şi cea emisă din flacără (de către atomii excitaţi). Se folosesc în general lămpi de,

descărcare cu catod tubular. Catodul trebuie să fie făcut din elementul pe care vrem să-l

181

determinăm. Sunt şi lămpi care au catozi făcuţi din aliaje astfel că pot fi folosite pentru

determinarea tuturor elementelor din care este făcut aliajul.

2. Atomizorul are rolul de a trece elementul de analizat sub formă de atomi. Se folosesc

atomizoare de flacără sau cu cuptor de grafit.

a) Atomizoarele de flacără sunt alimentate cu amestecuri de gaze cum ar fi:

aer-acetilenă; aer-hidrogen; aer-propan; N2O-acetilenă etc. Proba de analizat este

introdusă în atomizor prin aspirare şi pulverizare.

b) Atomizorul cu cuptor de grafit este încălzit cu curent electric după un

program reglabil. Pentru a feri cuptorul (tubul de grafit), de ardere se folosesc gaze de

protecţie. În general, ca gaz de protecţie se foloseşte argonul sau azotul. La aparatele

dotate cu atomizor cu cuptor de grafit se pot analiza probe lichide sau solide. Probele

lichide se introduc cu ajutorul unor seringi iar probele solide cu ajutorul unor pensete.

3. Monocromatorul izolează linia de rezonanţă şi o focalizează asupra detectorului.

4. Fotomultiplicatorul detectează şi amplifică intensitatea luminii care cade asupra sa.

Practic, aparatul este ajustat la extincţia zero când o soluţie martor este

vaporizată în probă şi lumina lămpii ajunge la fotomultiplicator. Când se introduc soluţii

conţinând specii absorbante o parte din lumină este absorbită şi rezultă o diminuare a

intensităţii luminii ce ajunge la fotomultiplicator. Se determină extincţiile obţinute cu

soluţii standard ale elementului de analizat cu care se construieşte o curbă de etalonare a

aparatului. Se introduc apoi probele de analizat prelucrate în mod corespunzător iar din

compararea extincţiilor probelor cu curba de etalonare se calculează concentraţia

elementului de analizat.

Flamfotometria

Fotometrul cu flacără (flamfotometrul)

Principiu:

Soluţia de analizat este pulverizată automat într-un dispozitiv, numit

pulverizator şi se introduce sub formă de aerosoli in flacăra unui arzător special

(Brenner). Soluţia, sub formă de aerosoli, ajunsă în flacără suferă diferite transformări:

apa în care este dizolvată sarea se evaporă, componentele dizolvate sunt excitate de

temperatura ridicată a flăcării, reîntoarcerea electronilor din starea excitată pe un nivel

182

energetic inferior eliberează energia absorbită sub formă de lumină cu lungime de undă

caracteristică elementelor chimice ai cărui atomi sunt excitaţi.

Prin excitarea în flacără a acestui amestec complex iau naştere diferite spectre de

emisie. Radiaţia emisă este focalizată pe o celulă fotoelectrică, după ce au trecut prin

filtre optice de selecţie. Ia naştere astfel un fotocurent care se măsoară cu ajutorul unui

galvanometru. În cazul determinării unui anumit element (sodiu, potasiu, calciu etc.),

intensitatea fotocurentului este proporţională cu concentraţia elementului respectiv din

soluţie.

Pulverizatorul pulverizează automat în picături foarte fine soluţia de analizat. El

este confecţionat din sticlă, cuarţ sau material plastic. Pulverizarea se realizează în felul

următor: gazul purtător comprimat, care iese cu viteză mare în apropierea tubului cu

soluţie, antrenează soluţia de analizat şi o pulverizează în particule foarte fine. Soluţia

pulverizată ajunge in flacăra arzătorului, unde se vaporizează iar ionii absorbiţi se

excită. Pentru ca analiza să se desfăşoare în condiţii optime este necesară menţinerea

unei presiuni constante atât pentru aer cât şi pentru gazul de ardere. Reglarea presiunii

se realizează cu ajutorul unor reductoare de presiune şi se măsoară cu manometrul.

Gazul purtător poate fi aerul sau oxigenul.

În figura de mai sus apar principalele componente ale unui flamfotometru.

Arzătorul este dispozitivul cu flacără în care substanţa de analizat se vaporizează

şi se excită, emanând radialii luminoase. Pentru întreţinerea flăcării, care se aprinde

automat, se utilizează diferite amestecuri de gaze în funcţie de temperatura necesară

pentru excitarea substanţei de analizat.

183

Amestec de gaze Temperatura flăcării măsurată în ºC Gaz de iluminat – aer 1700 –1840 Propan – aer 1925 Hidrogen – aer 2000 – 2045 Acetilenă – aer 2125 – 2397 Hidrogen – oxigen 2550 – 2660 Propan – oxigen 2850 (calculată) Acetilenă – oxigen 3100 – 3137

În tabelul de mai sus sunt redate câteva amestecuri de gaze folosite în

flamfotometrie precum şi temperaura flăcării acestora. În funcţie de potenţialul de

ionizare al elementului care urmează a fi determinat se alege şi temperatura dorită şi

deci gazul combustibil capabil să o realizeze. Pentru a fi activaţi, sodiul şi potasiul

necesită o temperatură relativ joasă cum ar fi cea a amestecului: propan-aer (1925°C),

iar calciul şi magneziul o temperatură mult mai ridicată (flacără de acetilenă-oxigen).

Determinarea cantitativă a elementelor din soluţia de analizat se face după mai

multe metode: metoda curbei de calibrare, metoda soluţiilor limitative, metoda

adaosurilor, etc.

Soluţiile de analizat şi standardele respective (soluţiile etalon) trebuie să posede,

pe cât posibil, aceleaşi proprietăţi fizice, în aşa fel încât condiţiile de pulverizare sa fie

identice.

Potenţiometria cu electrozi cu electroni ioni - selectivi

Măsurarea pH-ului cu electrodul de sticlă

Metoda necesită un pH-metru şi doi electrozi: unul selectiv pentru ionii de

hidroniu - electrodul de sticlă şi unul de referinţă. Acesta din urmă este un electrod

metalic de speţa a II-a în contact cu o soluţie saturată a anionului sării metalice,

Ag/AgCl/KClsat. sau, în cazul celui de calomel, Hg/Hg2Cl2/KClsat. Electrodul de sticlă

este confecţionat din sticlă specială care se comportă ca o membrană permeabilă pentru

ionii de hidroniu. Acest electrod în formă de balonaş sferic este umplut cu o soluţie

tampon cu pH dat care nu-şi schimbă compoziţia (pH-ul) în timpul măsurătorilor. El se

cufundă în soluţia probă cu pH necunoscut. Diferenţa de potenţial dintre aceste soluţii

este dată de relaţia lui Nernst. Rescrisă în termeni de pH această relaţie devine: RT ΔE = ——— ( pHelectrod – pHprobă ) 2,303 F

184

Această diferenţă de potenţial este, cum se vede, într-o relaţie lineară cu pH-ul soluţiei

probei, deoarece pHelectrod = constant. Ea se poate măsura cu pH-metrul. Acesta este un

milivoltmetru cu impedanţă de intrare mare, datorită rezistenţei electrice mari a

electrodului de sticlă, cu scală de pH, numit pH-metru. Pentru măsurarea pH-ului unei

soluţii necunoscute este necesară în prealabil calibrarea pH-metrului cu ajutorul a două

soluţii tampon cu pH cunoscut.

Avantajele pe care le prezintă metoda potenţiometrică faţă de cea colorimetrică

sunt:

- exactitate mare, ± 0,01 în cazul pH-metrelor obişnuite ca de exemplu

cel de tip MV-84, sau chiar ± 0,001 în cazul pH-metrelor

performante ca de exemplu cel de tip Radiometer-Copenhagen.

- pot fi analizate soluţii colorate, vâscoase, cu proprietăţi redox

- timp de măsurare foarte scurt (1-2 minute)

Schema de principiu al unui pH – metru

185

Valori patologice de laborator care ameninţă viaţa

Na seric sub 120 mmol/l peste 160 mmol/l

K seric sub 3 mmol/l peste 8 mmol/l

Ca seric sub 1 mmol/l peste 4 mmol/l

Cl seric sub 80 mmol/l peste 120 mmol/l

HCO3- seric sub 10 mmol/l peste 40 mmol/l

pH sub 7,00 peste 7,7

PCO2 sub 20 mmHg peste 80 mmHg

PO2 sub 40 mmHg peste 400 mmHg

Glicemie sub 2,5 mmol/l peste 56 mmol/l

Hematocrit sub 20% (pierdere acută)

Indice de protrombină sub 20%

Limitele valorilor normale

St – sânge total U - urină Pl – plasmă SG – suc gastric Se – ser FBG - fibrinogen L – LCR GC – greutate corporală

Acid uric Se Bărbaţi 4,3 – 8 mg/100 ml (256 – 476 μmol/ l)

Femei 2,3 – 6 mg/100 ml (137 – 357 μmol/ l)

2 - 8 mg/100 ml (119 –476 μmol/ l)

U 400 – 1000 mg/ 24 ore (2,4 – 6 mmol/24 h)

L 0,5 – 2,6 mg/100 m (29 – 155 μmol/ l )

Aminoacizi Se 35 – 55 mg N /l (3,5 – 5,5 mg N/100 ml)

U 0,5 g/24 ore

186

Amoniac Se 50 – 80 μg/100 ml (29 – 47 μmol/l) U 0,3 – 1,2 g/24 ore (17,6 – 71 mmol/24 ore)

Bilirubina Se totală cca. 1mg/100ml (17μmol/l);

directă cca. 0,25 mg/100ml (4,3μmol/l)

Calciu (total) Se Copii 7 – 14 mg/100ml (1,8 - 3,5 mmol/l; 3,5–7 mEq/l)

Adulţi 9– 11 mg/100ml (2,2 - 2,8 mmol/l; 4,5-5,5 mEq/l)

U Sugari 0,01 - 0,14 g/24 ore (0,25 - 3,5 mmol/24 ore)

Copii 0,10 - 0,14 g/24 ore (2,5 - 3,5 mmol/24 ore)

Adulţi 0,10 - 0,40 g/24 ore (2,5 - 10,0 mmol/24 ore)

L 4 – 6 mg/100ml (1 - 1,5 mmol/l)

Clor St 280 – 320 mg/100ml (79 – 90 mmol/l)

Se 340 – 390 mg/100ml (96 – 110mmol/l)

L 410 – 460 mg/100ml (115 – 130mmol/l)

U 600 – 900 mg/100ml (169 – 254mmol/l)

SG 300 – 530 mg/100ml (85 – 149mmol/l)

Colesterol Se total 150 – 250 mg/100ml (3,9 - 6,5 mmol/l)

esterificat 60 – 80% din colesterolul total sau

colesterol esterificat / colesterol total = 0,6 - 0,8

Creatinină Se Bărbaţi 0,8 - 1,8 mg/100ml (71 –159 μmol/l)

Femei 0,6 - 0,9 mg/100ml (53 –80 μmol/l)

0,6 – 1,8 mg/100 ml (53 - 159 μmol/l)

U Bărbaţi 26 mg/kg GC (230 μmol/kg GC)

Femei 22 mg/kg GC (190 μmol/kg GC)

Fer Se Bărbaţi 90 – 160 μg/ 100ml (16,1 – 28,6 μmol/l)

Femei 80 – 130 μg/ 100ml (14,3 – 23,3 μmol/l)

Fosfatază alcalină Se Sugari 3 – 10 UB/100 ml (25 – 83 UI/l)

Copii 2 – 8 UB/100 ml (16,6 – 66,4 UI/l)

Adulţi 2 – 4 UB/100 ml (16,6 – 33,2 UI/l)

Fosfatază acidă

totală

prostatică

Se

4,5 – 13,5 UI/l

0,05 – 3,6 UI/l

187

Glucoză St Iodo-

metric

80 –120 mg/100ml (4,4- 6,6 mmol/l)

o-tolu-

idină

70 –100 mg/100ml (3,9- 5,5 mmol/l)

Se

Pl

Glocoz-

oxidază

70 –104 mg/100ml (3,9 - 5,8 mmol/l)

L 50 - 70 mg/100ml (2,8 – 3,9 mmol/l)

U <30 mg/100ml (<1,7 mmol/l)

GOT Se adulţi 2 - 20 UI/l

copii sub

3 luni → 40 UI/l

GPT Se Adulţi 2 – 16,5 UI/l

Copii sun

5 ani 10,2 – 13 UI/ l

Hemoglobină St Bărbaţi 15 – 20 g/100ml (9,3 - 12,4 (Hb/4) mmol/l)

Femei 14,0 – 17,0 g/100ml (8,7 - 10,5 (Hb/4) mmol/l

Potasiu Se 13– 21mg/100ml (3,3 -5,4 mmol/l)

L 8 – 11 mg/100ml (2,0 -2,8 mmol/l)

U 1,9 – 3,9 mg/100ml (0,5 –1,0 mmol/l)

Lipide Se totale 400 – 700 mg/100ml

fosfolipide 150 – 250 mg/100ml

trigliceride 80 – 200 mg/100ml

Magneziu St 3,7- 4,7 mg/100ml(1,5-1,9 mmol/l; 3,0-3,9 mEq/l)

Se Nou

născuţi

1,6-2,3mg/100ml(0,66-0,95mmol/l; 1,3-1,9mEq/l)

Adulţi 1,9-2,9 mg/100ml (0,8-1,2 mmol/l; 1,6-2,4 mEq/l)

L 2,5 mg/100ml (1,0 mmol/l; 2,0 mEq/l)

Azot neproteic Se 20 – 40 mg/100ml (14,3 - 28,6 mmol/l)

L 15 – 18 mg/100ml (11 - 13 mmol/l)

Sodiu Se 315-350mg/100ml(137-152mmol/l)

L 300-340mg/100ml(130-148mmol/l)

U 4 – 6 g/24 ore (174 – 261 mmol/24 ore)

188

Fosfor anorganic St 30 –50 mg/100ml (9,7 – 16,1 mmol/l)

Se Copii 4 –6 mg/100ml (1,3 – 1,9 mmol/l)

Adulţi 2,5 –4,5 mg/100ml (0,8 – 1,15 mmol/l)

L 1 –1,8 mg/100ml (0,3 – 0,6 mmol/l)

Proteine totale Se 6,5 - 8,2 g/100ml

Pl Copii 5 – 7,5 g/100ml

Adulţi 6,5 - 8,5 g/100ml

L 10 – 30 mg/100ml

Fracţiuni proteice Se Alb. 3,50-4,20 g/100ml

α1 0,25-0,40 g/100ml

α2 0,50-0,65 g/100ml

β1+ β2 0,80-1,02 g/100ml

γ 1,10-1,40 g/100ml

FBG 0,2 – 0,4 100 g/100 ml

Uree Se 21 – 54 mg/100ml (3,5 – 9 mmol/l)

U 20 – 30 g/24 ore (0,33 - 0,50 mol/24 ore)

L 20 – 60 mg/l (0,33 - 1,00 mmol/l)

Sistemul internaţional de unităţi

Cantitatea fizică Unitatea de măsură Simbol

lungime metru m

masă kilogram kg

timp secundă s

intensitatea c. electric amper A

intensitate luminoasă candelă cd

cantitate de subst. mol mol

temp. termodinamică Kelvin K

189