• Expression; Inclusion bodies – was nun

• Löslich, aber auch gefaltet?

Inclusion bodies

• Intrazelluläre Aggregate von missgefaltetemProtein

• Bilden sich bei Expression, wenn Protein sich nicht richtig faltet.

Inclusion bodies, im Mikroskop erkennbar

Inclusion bodiesEM Bild

Inclusion bodies• Proteine teils gefaltet; oder IB enthalten auch gefaltetes Protein; Bsp

Green Fluorescent Protein GFP, leuchte nur wenn es gefaltet ist. Bild C, E, die Punkte sind Inclusion bodies, die gefaltetes GFP enthalten. Cytoplasmatische Expression als lösliches Protein z.B. in Bild B.

Inclusion BodiesSind also eine Mischung aus ungefaltetem Protein, teilgefaltetemProtein und auch gefaltetem Protein.

Inclusion bodies vermeiden• Richtiges Expressionskompartiment ?

BspExpression einer Ig Domäne mitessentiellem Disulfid in Origami Stamm(erlaubt Disulfide im Cytoplasma) in Bild A, Gelspur 1, Gesamtzellprotein, Protein wird exprimiert.Gelspur 3, Lösliche Proteine

=> Protein ist löslich

In Bild B, Expression in normalen Stämmen: Gelspur 1 und 3 Gesamtzelllprotein, eswird also Zielprotein exprimiert.Aber die Fraktionen mit löslichemProtein in Gelpsur 2 und in 4 zeigen kein

Zielprotein

=> Inclusion bodies

Inclusion bodies vermeiden

Optimierung Expressionskonstrukt

Verkürzung / Verlängerung um wenige Aminosäuren kann Faltung extrem beeinflussen

Verminderung Protein de Novo Synthese durch

• Induktionsstärke / Tuner B StrainsErniedrigen der IPTG Konzentration

• ExpressionstemperaturVermindern der Expressionstemperatur auf 30 oder 20 °C

Inclusion bodies vermeiden

• Durch Chaperone Induktion

Ethanol 3%

Zugabe von EthanolInduziert Expression vonHeat Shock Proteinen=Chaperonen=Faltunsghelfern

Inclusion bodies vermeiden• Chaperone Co-expression seit ca 20 Jahren

bekannt.

Inclusion bodies vermeiden

• Chaperone Co-expression

Inclusion bodies vermeiden• Chaperone Co-expression

Inclusion bodies vermeiden

• Chaperone Co-expression

Kombination von Chaperonenermöglicht auch Expression von “Schwierigen Proteinen”

Refolding

Unfolding

Chaotrope Substanzen – stören die geordnete Wasserstruktur, => vermindern den hydrophoben Effekt. Dadurch wird der hydophobe Corevon Proteinen zerstört, => das Protein entfaltet sich.

Kosmotrope Substanzen – fördern die geordnete Wasserstruktur, => verstärken den hydrophoben Effekt; z.B. Ammoniumsulfatfällung.

Refolding

=> Es sollten verschiedene Refoldingpuffer probiert werden. Man kann hier auf eien Reihe von Publikationen zurückgreifen.

Bsp

Refolding

Refolding

Während dem Refolding können teils gefalteteIntermediate aggregieren und die vollständige Faltung ins Native Protein verhindern.

Abhilfe: Zugabe von Aggregationshemmern, z.B.Arginin, Glycerin

CD Spectroscopy

Optisch aktive Substanzen können polarisiertes Licht drehen

PolarisationsfilterPolarisationsfilterLicht besteht aus E-Vektor und H-vektor.Bei Polarisation werden E-Vektoren ausgeblendet.

Proteine sind optisch akive Substanzen

Jeder Sekundärstrukturtyp hat charakteristisches CD Spektrum.

Aus Kombination von den drei Grundtypen lassen sich CD Spektren von Proteinen fitten => Gehalt an α-Helix, β-Sheet, random coil.

Beispiele

Overlay and elimination of CD bands => β-sheets diffcult to predict

Co-factors contribute to CD spectrum => wrong prediction

Far UV CD So weit wie möglich

•CD Spektren sollten soweit wie möglich ins kurzwellige UV aufegnommen werden.

•Anteile der Spektren mit hohem Anteil and struktureller Informationen befindensich gerade auch zwischen 200 und 180 nm.

•Problem: Viele Puffersubstanzen, Salze, etc absorbieren sehr stark ab ca. 210 nm und maskieren so das Spektrum des Peptidbindungen des Proteins.

Bsp. Prion Protein imVergleich zu Mutante: Strukturelle Änderungen erstunter 200 nm im Spektrumdutlich erkennbar.

CD: Nahes und fernes UV

Fernes UV: Bereich zwischen250 und 180 nm

Nahes UV zwischen 350 und 250 nm.

“Nah”, wegen Nähe zumsichtbaren Bereich (ca 380 -780 nm).

CD Signale im nahen UVvon den Aromaten istFingerprint für gefalteteProteine

FTIR of ProteinsFourier Transformierte InfraRot Spektroskopie

Infrared bands of peptide bond (s) : stretch ; (b): bend; (t): torsion

Band Wavenumber /cm-1 Origin

A 3300 N-H (s)B 3100 N-H (s)I 1690-1600 C=O (s) 80%, N-H (b) 10%, C-N (s) 10%II 1575-1480 N-H (b) 60%, C-N (s) 40%III 1301-1229 C-N (s) 30%, N-H (b) 30%, C=O (s) 10%

O=C-N (b) 10%,

O

N

H

(s)

(s)(s)

Bands cm-1 secondary structure

in D2O

1620-1635 β-sheet, 310 helix, α-helix,unordered

1648-1657 α-helix

1644 unordered

1659-1683 turn, β-sheet

FTIR spectra of model peptides

M. Holtzhauer, „Methoden in der Proteinanalytik“ p. 145; p. 150;

IR Absorption of H2O

Wellenzahl / cm-1

Experimental setup

Measurement in H2O

=> 6-10 µM cell path 10 mg/ml

Measurement in D2O

=> 100µM (= 0.1 mm) cell path 1 mg/ml

-> complete exchange of H2O to D2O

-> complete exchange of N-H to N-D

-> no H2O in atmosphere (dry N2 chamber)

-> time expense ~ like in CD spectroscopy

Advantage of FTIR over CD:

no contribution from cofactors like flavins, heme, Zn2+, other metals ... In region for secondary structure analysis.

Analyse FTIR

Analyse mittels Fit derKurve durch ein Set vonGausskurven.

Die Lage der Maxima, die im Gesamtspektrumnur als Schulternsichtbar sind, lässt sichdurch die zweiteAbleitung der Spektrenbestimmen.

Analyse FTIR

Je mehr Maxima erkennbar sind, destomehr Gausskurven lassensich fitten. Der Gesamtfirwird dadurch besser und zuverlässiger.

Analyse FTIR

Bsp. Anwendung von FTIR bei Prion Protein Mutante: Die MutanteΔTM zeigt etwas mehr ß-sheet als der Wildtyp, was zu einerStabilisierung führt. Thaa et al. BBA Mol Cell Res. 1783, 1076-84.