Algoritmi določanja mutacij pri AML in nelevkemičnih MPN

Martina Fink

Specializirani hematološki laboratorij Klinični oddelek za hematologijo

Interna klinika Univerzitetni klinični center Ljubljana

Google images

* Heterogena skupina bolezni. * Posledica pridobljenih somatskih mutacij (sprememb) v multipotentni matični celici. * Levkemične celice izgube sposobnost dozorevanja, se pa lahko nenadzorovano delijo.

Akutne levkemije - AL

Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology Google images

* Podskupina akutnih levkemij. * Razraščajo se predvsem matične celice mieolične vrste. * Mutacije se pojavijo v mieloično vrsto usmerjeni matični celici. * Leta 2008 posodobljena razvrstitev levkemij je zaosnovana na določitvi imunoloških, citogenetskih in molekularno genetskih nepravilnosti – na osnovi tega se določa tudi molekularno genetske označevalce bolezni.

Akutne mieloične levkemije - AML

Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology

* APL je karakterizirana s prisotnostjo fuzijskega gena PML – RARA, ki nastane kot posledica translokacije t(15;17). * Možni so različni prelomi. Najpogostejši so prepisi bcr1, bcr2 in bcr3 * Preiskava je nujna in rezultate sporočimo najkasneje v času 24 h od sprejema vzorca ozr. sporočila, da je možna APL.

Akutna promielocitna levkemija - APL

Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology Google images

* Ob sumu na akutno promielocitno levkemijo, najprej izvedemo kvalitativni PCR za določitev prisotnosti fuzijskega gena PML – RARA. * V primeru pozitivnega rezultata izvedemo še kvantitativni PCR za določitev ravni izražanja za pri bolniku prisotno vrsto prepisa (bcr1, bcr2 ali bcr3). Uporablja se tudi za spremljanje mimimalne preostale bolezni. * Če fuzijski gen PML - RARA pri bolniku ni prisoten, bolnika obravnavamo kot ostale bolnike z AML.

Akutna promielocitna levkemija - APL

* Izvedemo presejalni test levkemij mDx (preverimo lahko prisotnost več kot 80 različnih kromosomskih nepravilnosti, občutljivost 10-2). * V vzorcu preverjamo prisotnost mutacij interna tandemska ponovitev (ITD) in D835 v genu FLT3 in mutacij v genu NPM1. * Določitev mutacij v genu CEBPA izvajamo le pri bolnikih z normalnim kariotipom in odsotnimi mutacijami FLT3 - ITD in mutacijah v genu NPM1.

Ne - APL akutne mieloične levkemije

* Pri bolnikih z ne – APL AML ob diagnozi določimo tudi raven izražanja gena WT1, katerega izražanje je pri bolnikih z AL pogosto povišano.

* Izražanje gena WT1 se lahko uporablja za spremljanje uspešnosti zdravljenja in zgodnjega ugotavljanja ponovitve bolezni v primeru če ni drugih označevalcev.

* Če je ob diagnozi bolezni raven izražanja gena WT1 povišana (NŠK vsaj 2000), se za oceno prognoze bolezni lahko uporablja padec izražanja gena.

Raven izražanja gena WT1

* Prisotni sta kromosomski nepravilnosti inv(16) ali t(8;21), ki kodirata fuzijska gena CBFB - MYH11 in RUNX1 - RUNX1T1,

* Po določitvi prisotnosti fuzijskih genov, določimo še raven njunega izražanja s kvantitativnim PCR.

* Preverimo prisotnost mutacije D816V v genu KIT.

* Core-binding factor (CBF) levkemije *

Google images

* Prisotnosti mutacij v genih FLT3 in NPM1 ter CEBPA pri teh bolnikih ne preverjamo.

* Ne določamo ravni izražanja gena WT1, kajti raven izražanja fuzijskih genov CBFB - MYH11 in RUNX1 - RUNX1T1 je primernejši in bolj občutljiv način za spremljanje uspešnosti zdravljenja in sledenja aktivnosti bolezni.

* Core-binding factor (CBF) levkemije *

Google images

Običajno molekularno - genetsko diagnostiko AML izvajamo na vzorcu kostnega mozga (2 ml), od koder izoliramo RNA iz mononuklearnih celic. V primeru, da ima bolnik 20 ali več % blastov v periferni krvi, pa je ustrezen vzorec tudi periferna kri (10 ml), kar se odvzame v epruveto z EDTA – vijolični pokrovček.

Google images

AML

Poz Presejalni test levkemij mDX

Kvantitativni PCR PML - RARA

Ne APL - AML

Poz inv 16 ali t(8;21)

Kvantitativni PCR inv 16 ali t(8;21)

neg inv 16 ali t(8;21) ali PML - RARA

Mutacije FLT3 - ITD FLT3 - D835, NPM1

Normalen kariotip + neg mutacije FLT3 – ITD in NPM1

Mutacije CEBPA

WT1 kvantitativno

APL ?

Neg

mutacija D816V v genu KIT +

+

Kronične mieloproliferativne bolezni - KMPN

* Kronične mieloproloferativne bolezni (KMPN) so klonske bolezni. * Povečano je nastajanje krvnih celic, ki pa za razliko od akutnih levkemij, dozorevajo in so tudi brez znakov displazije. * Potek je KMPN je kroničen.

* Pogosto so prisotne mutacije v genih JAK2, MPL in CALR, ali pa je prisoten fuzijski gen BCR – ABL1.

Google images

Med KMPN uvrščamo : kronično mieloično levkemijo, pravo policitemijo, esencialno trombocitemijo, primarno mielofibrozo, mastocitozo, kronično nevtrofilno levkemijo, kronično euzinofilno levkemijo.

Kronične mieloproliferativne bolezni - KMPN

Vpogled 27. 09. 2015

* Prava policitemija je klonska bolezen, kjer se razraščajo predvsem celice rdeče vrste, deloma pa tudi bela vrsta in megakariociti. * Pri bolnikih s PRV najprej preverimo prisotnost fuzijskega gena BCR - ABL1 in mutacije V617F v genu JAK2. * V primeru njune odsotnosti pa smiselna še je določitev mutacij v eksonu 12 gena JAK2, če koncentracija eritropoetina nizka.

Prava policitemija - PRV

Google images

* Pri esencialni trombocitozi (ET), se razraščajo predvsem megakariociti,

* in primarni mielofibrozi (PM) (razrast vezivnega tkiva),

* najprej preverimo ali sta prisotna fuzijski gen BCR - ABL1 in mutacija V617F v genu JAK2.

* V primeru njune odsotnosti pa lahko v vzorcu določamo še mutacije v genu CALR in mutaciji W515L/K v genu MPL.

Esencialna trombocitoza in primarna mielofibroza

Google images Google images

* Karakterizirana s prisotnostjo fuzijskega gena BCR - ABL1.

* Pri bolnikih s sumom KML, najprej izvedemo kvalitativni PCR s katerim preverimo ali je pri bolniku prisoten fuzijski gen BCR – ABL1.

* V primeru pozitivnega rezultata, pa nato izvedemo še kvantitativni PCR s katerim določimo raven izražanja pri bolniku prisotnega prepisa.

Kronična mieloična levkemija - KML

Google images

* S kvantitativnim PCR spremljamo uspešnost zdravljenja – priporočeno na vzorcu PK na 3 mesece.

* V primeru napredovane bolezni ali pa neoptimalnega odziva bolnika na zdravljenje izvedemo še določitev mutacij v genu ABL1.

* Za oceno zgodnjega odziva na zdravljenje in oceno prognoze je pomembna določitev ravni izražanja fuzijskega gena BCR – ABL1 v periferni krvi ob diagnozi in nato še po 1 – 3 mesecih.

Kronična mieloična levkemija - KML

Google images

* Preiskave za določitev prisotnosti fuzijskega gena BCR - ABL1 izvajamo na vzorcu periferne krvi (20 ml) ali kostnega mozga (2 ml) od koder izoliramo RNA. * Preiskave za določitev prisotnosti mutacij v genih JAK2, MPL in CALR pa izvajamo na vzorcu DNA, ki jo izoliramo iz granulocitov periferne krvi (10 ml) ali kostnega mozga (2 ml).

CALR

CALR

* Odvzem v epruveto z EDTA – vijolični pokrovček.

* Mastocitoza je posledica razrasti tkivnih bazofilcov. * Prisotnost mutacije D816V v genu KIT predstavlja enega od manjših diagnostičnih kriterijev. * Molekularno genetsko diagnostiko izvajamo na vzorcu kostnega mozga ali prizadetega tkiva od koder izoliramo DNA ali RNA. * Preiskavo lahko izjemoma izvedemo tudi na vzorcu periferne krvi, žal pa je preiskava bistveno manj občutljiva kot na vzorcu kostnega mozga.

Mastocitoza

Kronične mieloproliferativne bolezni KML, PRV, ET, PM, KNL

Poz Poz

Kvantitativni PCR BCR – ABL1

JAK2 V617F

PRV

BCR – ABL 1

KML PRV, ET, PM

Neg

JAK2 ex 12

ET ali PM

CALR MPL

Kronične mieloproliferativne bolezni mastocitoza

D816V v genu KIT

Pri obravnavi bolnikov z akutno mieloično levkemijo in kroničnimi mieloproliferativnimi boleznimi je potreben celosten diagnostični pristop, ko se uporablja citološke, koagulacijske, imunološke, citogenetske in molekularno genetske preiskave. Kar je potrebno za določitev diagnoze, oceno prognoze in oceno uspešnosti zdravljenja.