IMUNOLOGY LABORATORIUM TEST

Dr. Ira Arundina,drg, MSi

- Ilmu yg mempelajari tentang imunitas atau respons kekebalan tubuh

akibat rangsangan molekul asing

- Mempelajari reaksi dari tubuh terhadap invasi suatu antigen dan pembentukan

antibodi akibat antigen yang masuk

Sistem imun baik spesifik maupun non spesifik akan melindungi tubuh dan mengeliminasi agen penyakit

Diperlukan suatu cara pemeriksaan untuk memperkuat diagnostik morfologik dengan mengukur derajat imunitas

Konsep dasar adalah reaksi antigen-antibodi

Macam pemeriksaan teknik imunologi :

1. Radioimmunoassay (RIA)2. Immunohistochemistry : - direct

- indirect3. Imunofluoresense : - direct

- indirect4. ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) - Direct ELISA - Indirect ELISA - Sandwich ELISA

Jaringan segar Embeded tissue (parafin blok) Kultur sel : sel fibroblas, sel epitel, sel

hepatosit, sel odontoblas, sel endotel dll

Bahan Sitologi Saliva Cairan tubuh : darah, GCF

Radioimmunoassay (RIA)Radioimmunoassay (RIA)

Prinsip dasar :Prinsip dasar : Didasarkan pada reaksi antara antibodi Didasarkan pada reaksi antara antibodi

(dalam konsentrasi terbatas) dengan (dalam konsentrasi terbatas) dengan berbagai konsentrasi antigenberbagai konsentrasi antigen

* Digunakan untuk menemukan antigen * Digunakan untuk menemukan antigen tunggal/antibodi dalam cairan biologistunggal/antibodi dalam cairan biologis

* Tehnik pemeriksaan untuk menentukan * Tehnik pemeriksaan untuk menentukan antibodi/antigen dengan reagen yang antibodi/antigen dengan reagen yang bertanda zat radioaktifbertanda zat radioaktif

Ab + Ag berlabel + radioisotop

Ikatan Ab-Ag berlabel- radioisotop

Jumlah Ag berlabel yg terikat pd Ab diukur dg gamma counter

Untuk mendeteksi antigen seluler dengan menggunakan antibodi

Mempelajari struktur/komponen sel/jaringan yang berfungsi sebagai antigen

Identifikasi jenis sel berdasar morfofungsi

IMUNOHISTOKIMIA ADALAH METODA PEWARNAAN JARINGAN YANG MENGGUNAKAN REAKSI IMUNOLOGIK DAN REAKSI KIMIAWI

IMUNOHISTOKIMIA

1. REAKSI IMUNOLOGIK : DITANDAI DENGAN ADANYA REAKSI ANTARA ANTIGEN

DENGAN ANTIBODI

2. REAKSI KIMIAWI : DITANDAI DENGAN ADANYA REAKSI ENZYMATIK YAITU ANATARA ENZYM

DENGAN SUBSTRAT

PADA IMUNOHISTOKIMIA DIKENAL ADA BEBERAPA METODA ANTARA LAIN : METODE DIRECT, INDIRECT, METODA ABC, METODA B-SA

SEBELUM MELAKUKAN REAKSI INI HENDAKNYA DIPERHATIKAN TERLEBIH DAHULU, DARI BAHAN YANG DIWARNAI

APABILA BAHAN BERUPA HASIL SAYATAN YANG BERASAL DARI PENYAYATAN DINGIN, MAKA SEGERA DAPAT DILAKUKAN PEWARNAAN. BILA BAHAN BERASAL DARI SAYATAN YANG DIPEROSES MELALUI PARAFFIN, MAKA HARUS DILAKUKAN DEPARAFFINISASI SAMPAI PADA AIR.

SEBELUM DILAKUKAN PEWARNAAN IMUNOHISTOKIMIA, SAYATAN YANG DIPEROLEH BAIK DARI FROZEN SECTION, MAUPUN DARI SAYATAN PARAFFIN YANG TELAH DILAKUKAN DEPARAFFINISASI, TERLEBIH DAHULU HARUS DIBERIKAN PEROKSIDA. TUJUANNNYA ADALAH UNTUK MENGHILANGKAN ENDOGENUS PEROKSIDASE, KARENA ENZYM INI DAPAT MEMBERIKAN REAKSI POSITIF PALSU.

SETELAH DIBERIKAN PEROKSIDA (H202), MAKA SAYATAN JARINGAN TERSEBUT HARUS DIRENDAM DALAM LARUTAN TRYPSIN 0,025%. TUJUANNYA PEMBERIAN ENZYM KADAR RENDAH INI ADALAH UNTUK MENGHILANGKAN DEBRIS PROTEIN YANG TERBENTUK, YANG KEMUNGKINAN DEBRIS TERSEBUT MENUTUPI EPITOP DARI BAHAN YANG HENDAK DIDETEKSI. OLEH KARENA ITU HARUS DILAKUKAN PADA TEMPRATUR 37 DERAJAD CELCIUS

SELAIN YANG TELAH DIKEMUKAKAN DI ATAS, MAKA UNTUK MEMBUKA EPITOP YANG KEMUNGKINAN TERTUTUP OLEH SUATU DEBRIS, AGAR REAKSI ANTARA EPITEP DENGAN ANTIBODI YANG DIBERIKAN DAPAT BERLANGSUNG TANPA HAMBATAN, MAKA PROSES TERSEBUT DAPAT DILAKUKAN DALAM MICROWAVE.

SETELAH MEMBICARAKAN PERSIAPAN DARI PEWARNAAN IMUNOHISTOKIMIA, SEKARANG AKAN DIBICARAKAN PRINSIP DASAR DARI MASING-MASING METODA TERSEBUT

A. REAKSI IMUNOHISTOKIMIA METODA DIRECT

CUCI-PBS

CUCI-PBS

HAEMATOKSILINCUCI-AIR– DEHYDRASI–CLEARING – MOUNTING

KUNCI: APABILA ENZYM YANG DIGUNAKAN PEROKSIDASE, MAKA SUBSTRAT YANG DIPAKAI ADALAH PEROKSIDA

TIMBUL REAKSI WARNA

B. IMUNOHISTOKIMIA METODA INDIRECT

KUNCI :

CUCI PBS

CUCI PBS

CUCI PBS

HAEMATOXYLINCUCI AIR - DEHYDRASI-CLEARING - MOUNTING

TIMBUL REAKSI WARNA

B. REAKSI IMUNOHISTOKIMIA METODA BS-A (BIOTIN STREPTASVIDIN AMPLIFIED)

CUCI- PBS

CUCI-PBS

CUCI-PBS

HAEMATOK SILIN

CUCI-PBS – CUCI AIR – DEHIDRASI – CLEARING – MOUNTING

KUNCI :

1.

2.

3.

4.

5.

CUCI-PBS

Metode imunologi untuk mendeteksi Ab dari berbagai kelas imuniglobulin dalam serum, saliva, cairan otak.

Prinsip : mereaksikan Ab dg Ag spesifik dan anti-antibodi berlabel FITC (Fluoresense Isothiocyanat) hijau

Label Rhodamin merah

IMUNO FLUORESENSI

METODA IMUNO FLUORESNSI HAMPIR SAMA DENGAN METODA IMUNO HISTOKIMIA, HANYA PADA METODA INI YANG DITAMPAKKAN BUKAN REAKSI WARNA, MELAINKAN BERUPA SUATU PANCARAN FLUORESENSI

BAHAN FLUORESENSI YANG PALING SERING DIGUNAKAN ADALAH : FITC ( LFUORECENCE ISO TIO CYANAT)

PENCUCIAN

NAMPAK TERPENDAR PADA PENGAMATAN MIKROSKOP FLUORESEN

Metoda ada 2 macam :1. direct immunofluoresense : Ab langsung

dilabel2. indirect immunofluoresense : melalui Ab

sekunder (Ig fragment)

Banyak dipakai untuk menentukan Ag/bahan tertentu yg tidak diketahui, Ig atau komplemen

Aplikasi klinis :- Penentuan beberapa kuman seperti basil TB- Penentuan beberapa virus- Penentuan Parasit

Ag (yg tidak diketahui) fiksasi (aseton)

Ab yg dilabel bahan fluoresens

Inkubasi

Cuci dg PBS Keringkan

Mikroskop fluoresens

Cara:1. Sel terinfeksi difiksasi dengan

aceton-20oC2. Di blok dengan serum FCS 1%3. Direaksikan dengan Ab yang

dilabel dengan FITC dan inkubasi 45 men-1h 37oC

4. Dicuci lalu ditambahkan oil emersi 10 ul-20 ul di atas sel

5. Dianalisis dengan mikroskop fluoresen

Indirect immunofluoresenseIndirect immunofluoresense

Lebih banyak digunakan untuk menemukan Lebih banyak digunakan untuk menemukan antibodiantibodi

Aplikasi klinis :Aplikasi klinis :

1.1. Penentuan Ig terhadap basil TBPenentuan Ig terhadap basil TB

2.2. Penentuan antibodi terhadap toxoplasmaPenentuan antibodi terhadap toxoplasma

3.3. Penentuan sel imunokompeten kankerPenentuan sel imunokompeten kanker

Ag fiksasiAg fiksasi

Antibodi (serum penderita)Antibodi (serum penderita)

Inkubasi Inkubasi Ag-Ab komplekAg-Ab komplek

konjugate (anti human globulin berlabel konjugate (anti human globulin berlabel fluoresen)fluoresen)

InkubasiInkubasi

Mikroskop fluoresenseMikroskop fluoresense

Metode Imunofluoresen Metode Imunofluoresen (indirect)(indirect)

Cara:Cara:1.1. Sel terinfeksi difiksasi Sel terinfeksi difiksasi

dengan aceton-20oCdengan aceton-20oC2.2. Di blok dengan serum FCS Di blok dengan serum FCS

1%1%3.3. Direaksikan dengan Ab 1 dan Direaksikan dengan Ab 1 dan

inkubasi 45 men-1h 37oCinkubasi 45 men-1h 37oC4.4. Dicuci dengan PBS lalu di Dicuci dengan PBS lalu di

reaksikan dengan Ab2 reaksikan dengan Ab2 inkubasi 45 men-1h 37oCinkubasi 45 men-1h 37oC

5.5. Dicuci dengan PBS lalu Dicuci dengan PBS lalu direaksikan dengan direaksikan dengan konjugate Fab IgG dilabel konjugate Fab IgG dilabel FITCFITC

6.6. Dicuci lalu ditambahkan oil Dicuci lalu ditambahkan oil emersi 10 ul diatas selemersi 10 ul diatas sel

7.7. Dianalisis dengan mikroskop Dianalisis dengan mikroskop fluoresenfluoresen

Ag + Ab + Konjugate (Fab IgG dilabel FITC) – dianalisis dg Mikros. Fluoresen

Imunofluoresen (indirect)Imunofluoresen (indirect)

Cara:Cara:1.1. Sel terinfeksi difiksasi dengan Sel terinfeksi difiksasi dengan

aceton-20oCaceton-20oC2.2. Di blok dengan serum FCS 1%Di blok dengan serum FCS 1%3.3. Direaksikan dengan Ab 1 (ab Direaksikan dengan Ab 1 (ab

monoklonal) dan inkubasi 45 monoklonal) dan inkubasi 45 men-1h 37oCmen-1h 37oC

4.4. Dicuci dengan PBS lalu di Dicuci dengan PBS lalu di reaksikan dengan Ab2 reaksikan dengan Ab2 inkubasi 45 men-1h 37oCinkubasi 45 men-1h 37oC

5.5. Dicuci dengan PBS lalu Dicuci dengan PBS lalu direaksikan dengan konjugate direaksikan dengan konjugate Fab IgG dilabel RhodaminFab IgG dilabel Rhodamin

6.6. Dicuci lalu ditambahkan oil Dicuci lalu ditambahkan oil emersi 10 ul diatas selemersi 10 ul diatas sel

7.7. Dianalisis dengan mikroskop Dianalisis dengan mikroskop fluoresenfluoresen Ag + Ab + Konjugate (Fab IgG di

label Rhodamin) – dianalisis dg MF

ELISA (ELISA (Enzyme-linked Enzyme-linked Immunosorbent AssayImmunosorbent Assay))

► Salah satu metode untuk mengukur secara Salah satu metode untuk mengukur secara kualitatif maupun kuantitatif kadar antigen kualitatif maupun kuantitatif kadar antigen atau antibodi, hormon, Interleukin dengan atau antibodi, hormon, Interleukin dengan menggunakan enzim sebagai label menggunakan enzim sebagai label

► Pengembangan dari deteksi Pengembangan dari deteksi imunofluoresens dan radioaktifimunofluoresens dan radioaktif

► Dewasa ini metode ELISA merupakan Dewasa ini metode ELISA merupakan metode yang banyak digunakan di metode yang banyak digunakan di laboratorium dan dalam berbagai laboratorium dan dalam berbagai penelitian di bidang imunologi. penelitian di bidang imunologi.

1. Memiliki sensitivitas yang tinggi2. Lebih spesifik3. Peralatan yang dibutuhkan relatif

lebih sedikit

Sensitivitas uji ELISA dipengaruhi oleh :1. Sifat dan berat molekul antigen2. Afinitas reaksi antigen – antibodi3. Perbandingan kadar antigen –

antibodi

1. Direct ELISA2. Indirect ELISA3. Sandwich ELISA

Prinsip:a. Ag + Ab (dilabel alkaline phospatase/peroxydase): Directb. Ag + Ab + Konjugate (dilabel Alkaline phospatase/peroxydase): Indirect

Prinsipnya:Antigen + Antibodi yang dilabel (HRP-peroxidase, Alkaline phosphatase)

Sampel : plasma, serum, cairan cerebrospinal, liquor, cairan hibridoma, cairan ketuban, homogenat jaringan, feces, urine

Kerugian: sulit ab primer dilabel, banyak ab nonspesifik terlabel, kurang spesifik

Keuntungan: tidak diperlukan purifikasi ab primer

1. Coating antigen dengan buffer coating 4oC, 24 h

2. Cuci 3 x dengan PBS-T 0,05%3. Blocking dengan BSA 1% atau creamer 4%

dan inkubasikan 45 men pada temp 37oC4. Cuci seperti ad 2.5. Tambahkan antibodi (sampel) yang sudah

dilabel dan inkubasikan 45 men pada temp 37oC

6. Cuci seperti ad 27. Tambahkan substrat (OPD/NPP)8. Stop dengan HCL 1N/NaOH9. Baca dengan Elisa reader dg panjang

gelombang 450 (cat. Perlu optimasi)

Ag + Ab + Konjugate (dilabel Alkaline phosphatase/peroxydase)

Sampel: plasma, serum, cairan cerebrospinal, liquor, cairan hibridoma, cairan ketuban, homogenat jaringan, feces, urine

Kerugian : lebih lama, biaya tinggi Keuntungan: lebih spesifik, dan sensitif

1. Coating antigen dengan buffer coating pada temp 4oC selama 24 jam

2. Cuci 3 x dengan PBS-T 0,05%3. Blocking dengan BSA 1% atau creamer 4% dan

inkubasikan 45 men pada temp 37oC4. Cuci seperti ad 2.5. Tambahkan antibodi (sampel) dan inkubasikan

45 men pada temp 37oC6. Cuci seperti ad 2.7. Tambahkan konjugat Fab-α- IgG HRP-Peroxidase

/alakaline phosphatasedan inkubasikan 45 men pada temp 37oC

8. Cuci seperti ad 2.9. Stop dengan HCL 1N/NaOH10. Baca dengan Elisa reader dg panjang

gelombang 450 (cat. Perlu optimasi)

1. Coating pada mikroplate ab monoklonal temp. 4oC, 24 h2. Cuci 3 x dengan PBS-T 0,05%3. Blocking dengan BSA 1% atau creamer 4% dan

inkubasikan 45 men pada temp 37oC4. Tambahkan antigen dengan buffer coating pada temp 4oC

selama 24 jam5. Cuci 3 x dengan PBS-T 0,05%6. Tambahkan antibodi (sampel) dan inkubasikan 45 men

pada temp 37oC7. Cuci seperti ad 2.8. Tambahkan konjugat Fab IgG HRP-Peroxidase /alakaline

phosphatasedan inkubasikan 45 men pada temp 37oC9. Cuci seperti ad 2.10. Stop dengan HCL 1N/NaOH11. Baca dengan Elisa reader dg panjang gelombang 450

(cat. Perlu optimasi)