Imunofenotipizacija in spremljanje minimalne preostale bolezni pri

akutni levkemiji

Darja Žontar, KO za hematologijo, UKC Ljubljana

Imunofenotipska opredelitev levkemičnih celic I

- AL je >20% blastov v periferni krvi ali kostnem mozgu- Morfološki pojem “blast” vključuje: matične celice

usmerjene matične celicepromielocitepromonocitenezrele B-prekurzorjenezrele T-prekurzorje

Ocena števila blastov s pretočno citometrijo se zato razlikuje od morfološke ocene.

- Imunofenotipizacija omogoča: prepoznavo celične linije (B,T,M)oceno deleža levkemičnih celicopredelitev zrelostne stopnje

Imunofenotipska opredelitev levkemičnih celic II

Podobnost med levkemičnimi in normalnimi celicami:

Izražajo označevalce za celično linijo in stopnjo dozorevanja

Razlike med levkemičnimi in normalnimi celicami:

Levkemične celice kažejo odklone v intenziteti izražanja označevalcev (proteinov) kot posledice genetskih nepravilnosti

Celična vrsta Normalni KM(n=12)

% CD34+ 1.1 + 0.6 (0.3-2.6)% CD34+/CD117+ 2.2 + 1.4 (0.6-6)% Eritroblasti 4.7 + 2.1 (2-9)% Nevtrofilci 67 + 6.1 (57-80)% Monociti 4.3 + 1.4 (2-6.5)% Eozinofilci 2.5 + 1.3 (0.8-5)% Bazofilci 0.4 + 0.7 (<0.1-2.4)% Mastociti 0.02 + 0.01 (<0.03)% Plazmatke 0.2 + 0.2 (0.01-0.5)% Limfociti B 2.9 + 1.5 (1.6-6.3)% Prekurzorji B 0.9 + 0.8 (0.1-3.9)% Limfociti T 9.2 + 4.5 (2.6-18)% NK-celice 2.8 + 1.4 (0.7-5)

Razporeditev celičnih populacij v normalnem KM

103

102

101

PALIČASTI inSEGMENTIRANIMETAMIELOCITMIELOCITPROMIELOCITMIELOBLAST

CD34

HLA-DR CD117

CD13

CD33

CD11b

CD64

CD65

CD54

CD10

CD35

CD13

Spremembe imunofenotipa mieloičnih celic med dozorevanjem

MPO

CD15

CD16

Pogostost pojavljanja aberantnih fenotipov pri AML

Aberantni imunofenotip: v kostnem mozgu ga ni ali je redek (<10-4)

Najpogostejši aberantni imunofenotipi:

• Asinhronizem v izražanju antigenov 80%

• Izražanje antigenov več različnih celičnih linij 27%

• Prekomerno izražanje antigenov 20%

Asinhronizem v izražanju antigenov (80%)CD34+ HLA-DR - CD33+ 9% CD117+ CD11b+ 5.5%

CD34+ CD56+ 8% CD117+ CD33- CD34- CD15+ 4%

CD34+ CD11b+ 5% CD117+ HLA-DR - CD15+ 2.3%

CD34+ CD33++ 3% CD117- HLA-DR - CD15- 2.3%

CD34+ CD14+ 3% CD117- HLA-DR + CD33+ CD34- 0.8%

CD34+ CD117+ HLA-DR - 2.3% CD33++ HLA-DR - CD34- CD15- CD14- 17%

CD34+ CD117- CD15 + 2.3% CD33- CD13- 14%

CD34+ CD33- CD13+ HLA-DR + 1.5% CD33+ CD13- 7%

CD34+ CD33- CD13+ HLA-DR - 0.8% CD33+ HLA-DR -+CD4+ CD45š 0.8%

CD34+ CD33- CD117+ HLA-DR 0.8% CD33++ HLA-DR -+CD15- CD14- 0.8%

CD117+ CD33+ HLA-DR – 11% CD33+ CD45šCD34- CD15- 0.8%

CD117+ CD34- CD15- 6% CD33+ HLA-DR+ CD56- CD13- 0.8%

AML:aberantni imunofenotipi I

Izražanje Ag različnih celičnih linij

27%

Prekomerno izražanje Ag

20%

Nenormalno razmerje FS/SS

17%

CD2 21% CD33++ 11% CD2 2.6% CD13b 2%

CD7 9% CD34 9% CD34 2.6% CD33b 0.8%

CD19 2% CD13 2% CD7 2.6% CD15 0.8%

CD20 0.8% CD117 0.8% CD117 1.5%

CD5 0.8% CD15 0.8% CD9 1.5%

HLA-DR 0.8% CD20 0.8%

AML : aberantni imunofenotipi II

--8%4%20%--CD79a

----22%12%--CD56

--8%--8%8%CD19

----4%8%--CD7

--8%----4%CD5--------5%CD10

7%17%4%4%16%CD2

FAB podtipM0 M1 M2 M4 M4Eo

AML : Aberantni fenotipi IIIPojavljanje limfoidnih antigenov

Diagnoza Genetska sprememba Aberantni imunofenotip

AML t(15;17) CD34-/+,CD15-/š,CD2-/š,CD13m/š

Inv(16) MPOm, CD2-/š

t(8;21) CD19+, CD56+

11q23 CD56+, CD19-/š,CD2-/+

AML: Genotipske in fenotipske povezave

AML: pogostost pojavljanja levkemičnih klonov

05

101520253035404550

1klon 2 klona 3 kloni 4 kloni

%

26%

47%

21%

6%

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10277.008CD45 PERCPCY5,5 ->CD45-PC5

Normalni kostni mozeg

SS

Eritroblasti

Nevtrofilci

Monociti

CD34+ HPCBlastno okno

Eozinofilci

Limfociti

Dozorevanje v kostnem mozgu→

Spremembe imunofenotipa normalnih B-limfocitov med dozorevanjem

CD34

TdT

CD38

CD45

CD10

CD19CD22 CD20

cCD79a

LAL –B Fenotipo y citogenética:• t(9;22) CD19+ CD10+ CD34++ CD38-/š CD13š

• 11q23 CD19+ CD10- CD20-CD34+CD15+CD65+

• t(12;21) CD19+ CD10+ CD34š CD45-/š HLA-DR++

Genotipske in fenotipske povezave pri B-limfoblastih

B-ALL (98%) T-ALL (100%)

Asinhronizem:CD34+ CD10+š 54% CD5š/CD2š 60%TdT+š CD10++ 45%

Prekomerno izražanje AgCD10 32% CD7 55%

Izražanje mieloičnih Ag.CD13 32% CD13 16%CD33 17% CD33 10%

Ektopičen fenotip CD7+/Tdt+ ciCD3+

CD34+CD7+ 40%

ALL: Imunofenotip limfoblastov B in T

Spremljanje minimalne preostale bolezni

• Preverjanje uspešnosti zdravljenja : različni intervali (15. dan, 33. dan)

• Znan imunofenotip levkemičnih blastov

• Najlaže je slediti aberantnim antigenom

• Natančnost metode: 0,01% celic (ena levkemična celica na 10 000 celic); za tako natančnost je treba prešteti 1 000 000 celic

• Najmanj 10 celic v skupku, da govorimo o populaciji

Pomen ugotavljanja in spremljanja minimalne preostale bolezni

• Kljub morfološki remisiji pri 2/3 bolnikov s pomočjo pretočne citometrije najdemo levkemični klon

• Pri teh bolnikih se relaps običajno pojavi prej kot v šestih mesecih

• Pri bolnikih, kjer po zdravljenju ni ugotovljena minimalna preostala bolezen, je čas do ponovnega pojava bolezni > 36 mesecev

Stewart C., Nicholson J. Immunophenotyping