IMMUNOPATOLOGIA 1)E LES MALALTIES

AMPUL•LOSES

Conlunicacio prescntada cl dia 18 do dcscmbic dc lg(ig pcl doctor

JOSEP M. DE MORAGAS

Collaborador del Scrcci do Dcrmatologia do I'llospital do la Santa Crcui de Sant Pau de Barcelona

* Trcball efectuat at ,Scrxci do Dermatologian (Director ac(idental, Di. F. Solduga)de l'Hospital de la Santa Crcu i de Sant Pau. Unicersitat Autonoma dc Barcelona.

INTRODUCCI6

Els estudis immunologics de BEUTNER i JORDON a (1964) semblen indi-

car una patogenia autogressiva (autoimmune) per a les lesions ampulloses

caracteristiques del pemfig. El 1967, els mateixos autors troben un meca-

nisme semblant en el pemfigoide ampul•16s (LEVER),'. Hom visualitza els

anticossos trobats en el serum dels individus afectats de pemfig o pemfi-

goide mitjancant tecniques d'immunofluorescencia (IF); apareixen a la

substancia intercellular de 1'estrat mucos de Malpighi al pemfig, o a

la membrana basal dermoepidermica en la malaltia ampullosa subepi-

dermica, pemfigoide. La IF, a mes de posseir un extraordinari valor diag-

nostic, es emprada per a seguir el curs de la malaltia i controlar els re-

sultats del tractament.

Creiem d'interes de descriure la nostra experiencia amb tecniques d'IF

en les malalties ampul•loses.

MATERIAL I METODES *

Devem a COONS 6 fits de fluoresceIna per a marcar proteines i poder

detectar-ne la presencia als teixits mitjancant 1'6s d'un inicroscopi dotat

de Hum ultraviolada. I)es del 1958, el metode ha estat ampliament emprat

i ha demostrat la seva especificitat i la seva sensibilitat. No obstant aixo,

pateix de l'inconvenient de la manca de permanencia de les preparations

i del fet que la presencia de substancies naturalment fluorescents al teixit

fan a vegades dificil la lectura, especialment en tcixits rics en tcixit elastic.

Dos tipus de tecniques han estat cmprats per a 1'estudi de les malalties

ampulloses.

a) Immunofluoresccucia indirecla (IFI). Horn ciupra corn a substra-tum poll humana normal', o esofag de conill d'indies (fig. 1), de conillo dc Simi. El substratum, quc ha estat convenientment congelat amb ni-

* Agrairn als Drs. R. K. Winkclmann i R. E. Jordon (Ma)o Clini(, Minnesota)hors ensen)aments que permeteren de posar a punt les tecniques a que ens referim enaquest treball.

3

4 JOSI-:P Al. D!; ,1IOR.4GAS

trogen liquid a r^lo °C„ cs conservat en un refrigerador a -70 'C-A aquesta temperatura pot conservar-se unes dues o tres setmanes com

a maxim; si hom el guarda ruts temps, aparcixen fenomens autolitics

que desnaturitzen cl substratum i l'inutilitzen per a 1'cstudi imrnunofluo-

rescent. Hom talla el substratum a un gruix de 4 microns en un criostat

a -30 °C, i cl col•loca en un porta. Horn prepara cl serum del ma-

lalt a dilutions progressives amb serum fisiologic a partir de la dilu-

cio T/io. El resultat numeric es refereix a la dilucio ins alta del serum

que dona una tinci6 d'IF positiva.

El substratum cobert per una o dues gotes de la dilucio del serum

es incubat durant trenta minuts en una cambra hurnida. Si hi ha anti-

cossos antiepitelials per a la substancia intercellular o la membrana basal,

aquests es fixaran a les zones respectives, per la qual cosa el segUcnt rentat

durant quaranta-cinc minuts no aconseguira de desplacar-los. A continua-

66, el substratum cs recobert amb immunoglobulina antihumana mar-

cada amh isotiocianat de fluorescencia i incubat a la cambra humida

durant quaranta-cinc minuts ruts. La immunoglobulina pot esser mono-

valent, o sigui anti -IgG o anti-IgA o anti-B (re-ia) (complement-c3), o be

pot esser global. Si l'anticos s'ha fixat al seu corresponent antigen, 1'anti-

globulina marcada amb fluoresceina en revelara la presencia. El subs-

tratum es rentat per segona vega(la durant quaranta-cinc minuts, cobert

amb glicerina amortida i examinat al microscopi amb alum ultraviolada

(figures 3, 4 i 5. Taula I).

b) Lnznunofluorescencia directa. En aquesta tecnica horn empra corn

a substratum peal normal o malalta procedent de l'individu afectat. El

teixit es incubat am]) 1'antiglobulina humana marcada amb fluoresceina

durant quaranta-cinc minuts; despres, horn procedeix a rentar-ho. Seguint

les mateixes normes que en la immunofluorescencia indirecta, hom 1'exa-

mina amb el microscopi, amb alum ultraviolada. Si hi ha anticossos fixats

a la substancia intercellular epidermica o a la membrana basal dc l'epi-

dermis, apareixera en una localitzacio o altra la tipica fluorescencia groc-

verdosa dc la fluoresceina (fig. 2).

RESU LTATS

a) Teenica indirecta d'inimunofluorescencia

Pemfig

Les quatre varictats cliniques de pemfig han demostrat la presencia

en serum d'anticossos que es fixen especificament a la substancia inter-

cellular de 1'epidermis La intensitat de la fluorescencia es debil a nivell

4

Ih1h1UNOPATOLOGIA DE LES A1AL.9LTI/^:S A^ti1PULLOSlSS

I;^IbIUNOFLUORESC^NCIA INDIRECTA

^^^^^^e

s : to z : ao t : 4o r : So r : t6o r : 3.o Substr:^tum cpitclinl amb unadiluciG del serum

i ^

^`

5ubstrltum cpitelisl ambantiglobulinl Lumana mar-

cada

Renter

Renter

lli,io,copi anib Ilumultraviolada

T.4u[.^ I. - Fases tecniques de la immunofluore,ccnria indire^ra (,eons KATZ t')

5

6 JOSEP M. DE MORAGAS

de les cellules basals, es fa intensa a 1'estrat espin6s i desapareix per

sota de la capa granulosa. La valoraci6 de la intensitat de la fluorescencia

requereix experiencia per part de l'observador; horn li dona arbitraria-

ment una positivitat d'un a quatre. L'anticos no es especffic de l'especie,

puix que existeixen teixits procedents d'animals que serveixen perfectament

per a substratum de la reacci6. De tota manera, en alguns casos, especial-

ment de pemfig oral, no ha estat possible d'obtenir respostes positives

emprant pelf de procedencia animal o humana, i horn ha obtingut resultats

positius solament quan ha estat emprat cone a substratum mucosa oral

humana. Hi ha d'altres casos de reaccions negatives falses degudes a fe-

nbmens de prozona, especialment frequents en malalts afectats de (fogo

selvagem)) (pemfig foliaci endemic del Brasil). Una altra causa de nega-

tivitats falses pot esser produida per la interferencia amb altres anticossos,

els quals es fixen preferentment a l'antiglobulina marcada perque en son

mes apetents. Entre aquests cal comptar anticossos antinuclears i els anti-

cossos especifics d'organ. El pemfig eritematos mostra, a mes dels anticossos

propis del pemfig, una taxa elevada d'anticossos antinuclears i amb molta

frequencia anticossos antimusculars 8.

Han estat estudiats milers de malalts amb altres dermatosis amb el fi

de descobrir altres afeccions que presentessin anticossos contra la subs-

tancia intracellular epidermica similars als del pemfig. Solament en un

vint per cent de malalts afectats de cremades extenses u i en dos malalts

afectats de la necrolisi toxica de Lyell15 ha estat possible de trobar po-

sitivitats debils semblants a les del pemfig. En alguns inalalts ha estat

possible de visualitzar positivitats falser, degudes a la presencia d'anti-

cossos per als grups sanguinis A i B, que en el cas de tenir un tftol molt

alt poden fixar-se a les cellules epidermiques i donar imatges semblants

a les del pemfig. Aquests exeulples son 1'excepcfo i, mitjancant 1'absor-

ci6 d'aquests anticossos, ha estat possible demosti al ne la natura dis-

tinta.

Hi ha una estreta correlaci6 entre la taxa d'anticossos en sang i 1'evo-

luci6 clfnica del pemfig. En els casos de pemfig extens actiu, els tftols dels

anticossos en el serum acostumen a esser superiors a l' i /8o, i es mes aviat

rar de trobar encara positivitats a la diluci6 de 1'i/6io. Els anticossos

trobats en el pemfig pertanyen generalment al grup dels IgG, i fixen

complement'. MitjanSant la medicacio corticoidea la taxa d'anticossos

en sang davalla paral-lelament a la millora clfnica del malalt i constitueix

una bona guia per al control dels resultats terapeutics en el malalt. Abans

de suspendre la terapeutica cal que la taxa d'anticossos hagi estat reduida

a zero. Un cop suspes el tractament es de bon pronbstic observar la per-

sistencia de la negativitat en una serie de proves repetides d'IF indirecta.

La recidiva clfnica de la lesio del pemfig va precedida do 1'aparici6 dels

6

Fie. i 1?siifag plc car

nill il'fndics. Cunuul.

l.c^ i^nu^ ^ittres tlc I'chi-

dcrmi, c^n^reslx>ncn a la

Hu^nc,^cn^^ia nurinal ^Ic

la ceratina. I.es fibres

cla,ti^lucs c+ dcstaqucn

cn is dormis f ^i v c a

(X _ ;ol

I H.. 2. [111 In 11 lioll I Iol c,

(^,ll( ia d i Ic( I a positiN a ('11

pc I I hiopsiadil (1,111) Illa-

Ialt ;Ilc( tal (it, pCilifig. S(')n

( I'll'allicill iahics CIS

tcliolliclis d'mjlII6Iisi i h

ilitells'l fliloics(cmia d c

Ll 111)Sl "Im i^l ifilul ( clItilm

dc 1,cpidc) III i S. I "allf igmil

Iwiglobll I i 11^1 III tl ( ada a In 1)

I I I I o I c q c i I I ^ I foil c1lipla(L)

It Ll d i I It( i(,) I So ( x -, -io)

ilidirc(ta positiNa

Cillpralit (olli a

111111 cs6fag de (oilill (I'll)-(lies. El sCium (lei nialaltal,c(tat (IC pCII)Iig [oil C-111-plat a la diltici(l I / 1 --8.Les /oncs que apareixcrih1aliques A (cliti-c (oil-csI"wn a Hmwmb&a in-cSI)C(ifi(a dc la (cratilia.Lis "pais inter(el-lulars de1'epi(Ici'mis aparcis:cti hcndelimitats pcr la II[loIC,^-ll( ia c,pu( ifl(a dc Ll

filloic,(cilla (x loo)

h(;. 1. - - Inummofluores(i,mia indire(ta positi%^icn pCII noillial 11-mulda allib S^.rlllll (1,1111 Inalallalc(tat dc pcnifigoide a la dilu(i() 1 16o. El hinitdcimocpi&rnii( apareix (larament delimitat pcr

la handa fftiorcs(cnt (X 2.-)0)

Iniumnofluorcs(i^n(ia inclire(ta positiNa, empiant (oni a sub,cs6lag de (ollill Whidics i s&imn (I'mi nuttalt alc(tat de pcnifi-

gOidC ^l ki dilLI(i6 i^!po (x ioo)

IMMUNOPATOLOGIA DE LES MALALTIES AMPUL•LOSES

anticossos en el serum; per aixd es convenient de practicar determinationsseriades a fi de poder preveure el possible rebrot (taula II).

Pemfigoide ampullos

En el pemfigoide ampul•16s l'anticos es fixa en algun antigen presenten la membrana dermoepidermica. Aquesta apareix corn una estreta idensa banda fluorescent molt ben limitada, situada al limit dermoepi-dermic. Aix6 la distingeix de la banda pitjor definida, generalment mesampla, subepidermica, present en el lupus eritemat6s. En el pemfigoideno hi ha una correlaci6 entre l'estat clinic del malalt i la taxa d'anti-cossos en serum. Hi ha malalts que presentee un titol alt d'anticossossense lesions clfniques, i viceversa; es possible de trobar malalts ambactivitat clinica sense anticossos que siguin demostrables pel metode IFindirecte (aproximadament en un 15 % de casos). En aquests malalts es,uialgrat tot, possible de trobar-ne mitjancant el metode directe d'IF.

La taxa d'anticossos en el pemfigoide pot esser molt alta: poden esserobtingudes reaccions positives amb dilutions del serum fins a i/2ooo0.Ws d'un 50 % de serums procedents de malats de pemfigoide contenenanticossos antinuclears. En alguns casos la IF amb aquests anticossos esencara positiva a dilucions a l'i/8o o mes, i suggereix l'associaci6 del pemfi-goide amb una inalaltia del teixit connectiu. En aquests casos hi ha inter-ferencies entre els factors antinuclears amb major apetencia per a 1'anti-gaminaglobulina marcada que no pas els anticossos del pemfigoide.

En ocasions nombroses els anticossos del pemfigoide s6n fixadors decomplement amb positivitats en la IF emprant anti B/ic-ia. A mesuraque els casos estudiats augmentin en nombre, sera possible d'aclarir elpaper del complement en el desenvolupament de la lesi6 ampullosa cli-nica. Desconeixem actualment si els anticossos fixadors de complementcomporten una major gravetat en el curs clinic del pemfigoide am-pul-l6s.

b) Tecnica directa d'immunofluorescencia

El metode directe d'IF revela la presencia d'anticossos fixats en lasubstancia intercellular de 1'epidermis en les lesions i pell clinicamentnormal dels inalalts afectats de pemfig. En els patients amb pemfigoide1'antic6s apareix fixat a la membrana basal dermoepidermica. Es de granajuda en el diagnostic d'aquest darrer proces, en aquells casos en queel metode indirecte no ha revelat la presencia d'anticossos circulants en elserum.

7

8 JOSEP Al. DE MORAGAS

La IF directa te, no obstant aixo, la seva major utilitat en 1'estudi

del lupus eritematos, on descobreix l'ampla zona de diposit d'iinmuno-

globulina per sota la basal dermoepidermica.

DiscussiO I CONCLUSIONS

La immunofluorescencia observada en el pemfig o pemfigoide ampullos

sembla esser immunohistologicament valida. Is clarament distingible de

controls negatius, es compartida per immunoglobulines serologicament

reactives, i posseeix un alt grau de sensibilitat i un espectre d'especificitat

conegut. Els anticossos presents en el pemfig reaccionen en 1'epidermis

de diverses especies amb un grup d'antigens heterogenis que es relacionen

entre ells per llur localitzacio intercellular epidermica. Be que general-

ment l'anticos pertany al grup de les IgG, es possible de trobar casos en

els quals les Ig-A i Ig-M son tambe presents. Son autoanticossos, es a dir,

capacos de reaccionar amb antigens presents en el mateix productor de

1'antic6s: la mateixa pell del malalt reacciona amb anticossos continguts

en el seu rnateix serum. L'acces als sous antigens homolegs sembla sola-

nrent estar limitat per la manca de vascularitzacio de 1'epidermis i pel

possible paper de barrera de la basal dermoepidermica. No hi son presents

en altres malalties ampulloses o afins, tals corn la malaltia de Duhring,

pemfigoide de membranes mucoses, penrfigoide anrpullos infantil, ((herpes

gestationis)), liquen pla i malaltia de Degos. Els anticossos es troben pre-

sents en el liquid de la butllofa, en una concentracio aproxinradament

igual a la del serum en el pemfig i aproximadament a la meitat en el

pemfigoide 1.

La presencia dels anticossos en serum i teixit biopsiat es el criteri mes

solid que posseim per al diagnostic i la classificacio correcta de les ma-

lalties ampulloses. La taxa d'anticossos en el pemfig serveix de norma per

a jutjar 1'efectivitat del tractament, guiar la dosificacio de corticoides o, i

tambe, antagonistes de l'acid folic i per a establir el pronostic un cop

desapareguda la simptomatologia clinica. Aquesta correlacio entre taxa

d'anticossos i evolucio clinica no es presenta en el pemfigoide arnpullos.

El pemfig eritematos apareix en cls estudis amb IF amb unes carac-

teristiques que el diferencien de les altres formes de pemfig. Posseix els

mateixos anticossos intercellulars, pero, a mes, to una taxa elevada d'anti-

cossos antinuclears i antimusculars i diposits en banda d'inununoglobu-

lines per rota la basal dermoepidermica en el lupus eritematos. Hi ha

casos de pemfig eritematos, associats a timona, miastenia greu, hipersen-

sibilitat a la llum, anticossos antinuclears i antimusculars 2. Aquestes con-

comitancies parlen a favor d'un trastorn autoimmunitari corn a denorni-

8

U)V

CX bnH E

0C

0

OV'

y

0X E U)E^ Lo _^ 9)

•

0

0

O

O

O

O

O

0

0

0

•

•

O

O

0

O

0

0

XX

XXXX

H

XH

XH

XH

N

H E

N

H OELf)Cl

G

000000 a ++++ r U) X 0 0 0 0 0 0N co 00 'IT N .ti 0) Cl rl O C H C' N 0 00 O(`7 rl 41 O T rl -I r1

0 m Nv Y

WOC 1'

S O J i I U u i 3 W J d Ul v

exej, IP4aAPJD > 41 PTp /PUOSlupJad •Idt¢0 0z

y

N

IHC-

U)

O

r O

-a G u

r V

VU

m0

OU

10 JOSEP M. DE MORAGAS

nador comu de totes les alterations clinico-immunologiques presents en

aquests casos. Aquests trastorns mai no ban estat observats associats al

pemfig vulgar.

En el pemfigoide ampullos es possible d'observar l'associacio del brot

ampullos amb neoplasies internes o amb malalties del teixit connectiu

o colitis ulcerosa. El serum d'aquests malalts conte anticossos antinuclears,

i en alguns casos s'acompanya del fenomen de les cellules LE.

Es dificil de definir el paper d'aquests anticossos en la patogenia

d'aquestes malalties. Apareixen en tots els malalts, i hom n'ha aconseguit

la transmissio passiva a simis o conills amb produccio de lesions acanto-

litiques, especialment despr(s d'aplicacio d'un irritant per a facilitar la

penetracio de l'anticos a traves de la barrera dermoepidermica. Ha estat

possible de provocar l'aparicio d'anticossos contra la substancia intercel-

lular epidermica, en conills, mitjancant les injections repetides d'epiteli

pavimentos esofagic dels mateixos animals 9.

No son coneguts els factors que puguin provocar la formacio dels anti-

cossos. En el pemfig endemic brasiler (ufogo selvagemn) hom ha suggerit

la possibilitat d'un agent infeccios del tipus dels mixovirus que compar-

teixen antigens comuns amb les membranes cellulars. La infeccio per un

agent d'aquesta natura pot induir a la formacio d'anticossos per a aquests

antigens.

No hi ha cap evidencia que apunti cap a una etiologia similar en casos

de pemfig no endemic. En aquests casos algun cop l'aparicio del brot

inicial ha estat atribuida a reaccio medicamentosa (butazolidina, pirami-

don, irgapirina, penicillamina), perb aquests casos constitucixen sues 1'ex-

cepci6 que no pas la regla.

BIBLIOGRAFIA

1.

3.

4.

5-

6.

7.

BEAN, S. F. - Blister Fluid in pernphigus. ((J. Invest. Derm.», 53: 187 (1969).

BEUTNER, E. If., CHORZFLSKI, T. 1'. i co!.. - Autoimmunity in a case with con-

current myasthenia gravis and pcrnphigus erithewntosus. aJAAMAs, 203: 10

(1968).BEUTNER, E. H. i JORDON, R. E. - Dernostration of skin antibodies in sera of

pemphigus vulgaris patients by indirect immunofluorescent staining. ((Prot. Soc.

Exp. Biol. Bed.)), 717: 505 (1864).

BEUTNER, E. H., JORDON, R. E. i eoL. - The immunopathology of penwphigus

and bullons pemphigoid. (J. Invest. Derm.)), 51: 64 (1968).

BEUTNER, R. Ff., LEVER, IV. F. i COL. - Autoantibodies to pemphigus vulgaris.

aJAAMA)), 192: 682 (1965)-COONS, A. H. - Fluorescent antibody methods. ((General cNtochemical methods)),

vol. 1, 399-422..1. F. Danielli. Academic. Press Inc. New York 1958.

CORMANE, R. H. i CHORZELSKI, T. P. - "Bound" complement in the epidermis

of patients with pewphigus vulgaris. <<Dermatologiass, 134: 463 (1967).

10

1.11M11UNOPATOLOGIA DE LIE DIALALTIES AMIPUL.LOSES 11

8. CHORZELSKI, T. P., JABLONSKA, S. i BLASZCZYK, M. - Immunopathologic in8esti-

gation in the Senear-Usher Syndrome. Coexistence of pemphigus with lupus

erythematosus. aBrit. J. Derm.)) (en premsa).

7. GROB, P. J. i INDE.RBITZIN, T. M. - Experimental production in rabbits of anti-

epithelial autoantibodies. ((J. Invest. Derm.)), 49: 637 (1967).

10. INDERBITZIN, T. M. i GROB, P. J. - Destruction of epithelial cells "in vivo" by

antiepithelial autoantibodies. ((J. Invest. Derm.)), 49: 642 (1967).

11. JORDON, R. E., BEUTNER, E. H. i COL. - Basement zone antibodies in bullons

pemphigoid. ((jAMA)), 200: 751 (1967)-12. KATZ, S. I., HALPRIN, K. M. i COL. - The use of human Skin for the detection

of antiepithelial autoantibodies. ((J. Invest. Derm.)), 53: 390 (1967).

13. LEVER, W. F. - Pemphigus. ((Medicine)), 32: 1 (1953).14. THIVOLEr, J. i BEYRIN, A. J. - Recherche par immunofluorescence d'autoanticorps

scrigues vis-a-vis des contituents de l'epiderme chcz les brilles. ((Experientia)),

24: 945 (1968).15. THIVOLET. J. - aBull. Soc. Franc. Dcrm.n, 75: 639 (1968).

11