immunogenicite de la mort cellulaire induite par les chimiotherapies

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UNIVERSITE PARIS XI FACULTE DE MEDECINE PARIS-SUD

THESE

pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PARIS XI

Champ disciplinaire : Immunologie

Ecole doctorale de rattachement : Cancérologie, Biologie, Médecine, Santé

Présentée et soutenue publiquement par

Laetitia AYMERIC

Le 08 juillet 2011

IMMUNOGENICITE DE LA MORT CELLULAIRE INDUITE

PAR LES CHIMIOTHERAPIES ANTI-CANCEREUSES

Directeur de thèse : Pr. Laurence ZITVOGEL Composition du jury : Président Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur Directeur de thèse

Pr. Eric SOLARY Pr. Muriel MOSER Pr. Nicolas GLAICHENHAUS Dr Jenny VALLADEAU Dr Kamel BENLAGHA Pr. Laurence ZITVOGEL

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REMERCIEMENTS Je tiens à remercier ma directrice de thèse, le professeur Laurence ZITVOGEL, pour m’avoir accueillie dans son laboratoire, pour sa présence et son dynamisme moteur au quotidien. Merci également aux docteurs Evelyn ULLRICH, Magali TERME, Grégoire MIGNOT et Mathieu BONMORT, pour m’avoir aidée à faire mes premiers pas dans le laboratoire, en ayant pris le temps de m’enseigner le fonctionnement de celui-ci et quelques bases expérimentales. Un merci particulier à Sophie VIAUD, aussi serviable que compétente, qui a su m’apporter de précieux conseils techniques tout au long de ma thèse. Merci également aux docteurs Nathalie CHAPUT, Sylvie RUSAKIEWICZ et Dalil HANNANI pour les discussions scientifiques passionnantes que nous avons eues ensembles. Merci à tous mes collègues qui savent travailler dur dans la bonne humeur et avec un bon état d’esprit, sans lesquels ma thèse n’aurait pas été la même. Je tiens à remercier très sincèrement les responsables de l’animalerie de l’IGR (SCEA), M. Patrick GONIN et Mme Karine SER LE ROUX, pour leur compétence et leur ouverture d’esprit. Ils ont toujours su concilier au mieux les exigences de leur structure avec nos travaux scientifiques. Merci à tous nos collaborateurs pour leur générosité. Un merci particulier au docteur Kamel BENLAGHA, pour m’avoir fait profiter de son expertise sur les NKT à un moment de ma thèse. Enfin, je remercie chacun des membres de mon jury pour avoir accepter d’apporter leur jugement éclairé à mon travail. Je remercie sincèrement les professeurs Muriel MOSER et Nicolas GLAICHENHAUS pour avoir accepté la tâche d’évaluer mon rapport de thèse.

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RESUME

Le développement d’un cancer chez un individu immunocompétent témoigne de l’inefficacité de ses défenses immunitaires naturelles à entraver la progression tumorale. La restauration ou l’induction de réponses immunitaires anti-tumorales efficaces sont des enjeux majeurs des stratégies thérapeutiques actuelles. En plus des immunothérapies classiques, visant à activer le système immunitaire des patients contre leurs tumeurs, les thérapies conventionnelles, telles que les chimiothérapies et la radiothérapie, peuvent avoir des effets immunostimulants, en parallèle de leur effet directement cytotoxique sur les cellules tumorales. Parmi celles-ci, les anthracyclines, l’oxaliplatine et la radiothérapie sont notamment capables d’induire une mort cellulaire immunogène. L’efficacité thérapeutique de ces traitements dépend de l’activation de lymphocytes T (LT) CD8 anti-tumoraux, producteurs d’interféron-gamma (IFN-γ). En utilisant des modèles murins de tumeurs transplantées, nous montrons que le traitement des cellules tumorales par des drogues immunogènes induit la libération d’adénosine triphosphate (ATP) dans le milieu extra-cellulaire. Ce signal de danger endogène se lie à son récepteur P2RX7 sur les cellules dendritiques et permet la formation de l’inflammasome NLRP3/ASC/pro-caspase 1, conduisant à l’activation protéolytique de la caspase 1, qui active la pro-interleukine-1β (pro-IL-1β) en interleukine-1β (IL-1β). L’IL-1β peut directement agir sur les LT CD8 pour faciliter leur polarisation vers un phénotype de lymphocytes T cytotoxiques de type 1 (Tc1). De plus, le traitement de tumeurs établies par des drogues immunogènes induit une production d’IL-17A (IL-17) dans le lit tumoral, au cours de la première semaine suivant le traitement. Les LT gamma delta (LTγδ) sont les principaux producteurs de cette cytokine dans nos modèles. Ces cellules s’accumulent transitoirement dans la tumeur dès le troisième jour suivant le traitement et leur taux est parfaitement corrélé à celui des LT CD8 producteurs d’IFN-γ tumoraux. Comme l’IFN-γ, l’IL-17 et les LTγδ sont nécessaires à l’efficacité thérapeutique des drogues immunogènes. L’IL-1β produite par les cellules dendritiques exposées à des corps apoptotiques immunogènes stimule directement la production d’IL-17 par les LTγδ. Ces travaux ont contribué à identifier l’ATP extra-cellulaire comme un déterminant moléculaire de l’immunogénicité des cellules tumorales exposées à certaines thérapies anti-cancéreuses conventionnelles. De plus, nous montrons que les traitements cytotoxiques classiques peuvent moduler l’environnement immunitaire dans le lit tumoral, et contribuer à remplacer une inflammation chronique et immunosuppressive en une inflammation aigüe et immunogène. L’étude des interactions entre le système immunitaire et les thérapies anti-cancéreuses conventionnelles est nécessaire pour utiliser ces traitements de manière plus rationnelle, en les combinant par exemple à des immunothérapies plus classiques.

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ABREVIATIONS

ADN : acide désoxyribonucléique

ARN : acide ribonucléique

ASC : “apoptosis-associated speck-like protein”

ATP : adénosine triphosphate

BM-DC : cellules dendritiques dérivées de la moëlle osseuse

CD : “cluster of differentiation”

CMH : complexe majeur d’histocompatibilité

COX-2 : cyclo-oxygénase 2

HMGB1 : ”high mobility group box 1”

IFN : interféron

IL: interleukine

IL-1R : récepteur à l’interleukine 1

IL-1RA : antagoniste naturel du récepteur à l’interleukine 1

IL-17 : interleukine 17A

LB : lymphocyte(s) B

LT : lymphocyte(s) T

LTγδ : lymphocytes T gamma delta

MDSC : cellules myéloïdes immatures immunosupressives

NFκB : “nuclear factor-κB”

NLRP3 : “NLR family, pyrin domain-containing 3”

NO : oxyde nitrique

pDC : cellules dendritiques plasmocytoïdes

TAM : macrophages associés aux tumeurs

Tc : lymphocytes T cytotoxiques

TGF-β : “transforming growth factor-β”

Th : lymphocyte T CD4 auxiliaire

TLR : récepteur de type Toll

Treg : lymphocytes T régulateurs

VEGF : “vascular endothelial growth factor”

WT : non mutées

5

SOMMAIRE

REMERCIEMENTS ............................................................................................................... 2

RESUME .................................................................................................................................. 3

ABREVIATIONS ..................................................................................................................... 4

SOMMAIRE ............................................................................................................................. 5

INTRODUCTION.................................................................................................................... 6 1 La présence d’un danger : une condition nécessaire à l’activation du système immunitaire ? ............................................................................................................................................................ 6

1.1 La théorie du danger et les signaux de danger ................................................................................... 6 1.2 Les réponses immunitaires au danger ................................................................................................. 9

2 Les réponses immunitaires naturelles dans le cancer ............................................................... 19 2.1 Les tumeurs : tolérance ou immunité ? ............................................................................................. 19 2.2 Environnement tumoral et immunosuppression .............................................................................. 31

3 Les solutions thérapeutiques pour activer des réponses immunitaires anti-tumorales efficaces ............................................................................................................................................ 39

3.1 L’utilisation de ligands de TLR en immunothérapie anti-cancéreuse ........................................... 39 3.2 Effets immunostimulants des thérapies anti-cancéreuses conventionnelles ................................... 43

4 Contexte d’étude et objectifs de la thèse .................................................................................... 51 4.1 Les mécanismes moléculaires de l’immunogénicité de la mort cellulaire induite par certaines thérapies anti-cancéreuses conventionnelles ........................................................................................... 51 4.2 Problématiques de la thèse ................................................................................................................. 53

MATERIEL ET METHODES ............................................................................................. 54

RESULTATS .......................................................................................................................... 57 1 Rôle de l’activation de l’inflammasome NLRP3 et de la production d’IL-1β par les cellules dendritiques dans l’efficacité des chimiothérapies immunogènes .............................................. 57

2 Rôle des LTγδ producteurs d’IL-17 dans l’efficacité thérapeutique de thérapies anti-cancéreuses conventionelles ........................................................................................................... 60

DISCUSSION ......................................................................................................................... 62 1 Importance des modèles de tumeurs établies ............................................................................ 62

2 Rôle de l’ATP extra-cellulaire dans le développement de réponses immunitaires spécifiques .......................................................................................................................................................... 63

3 Rôle de l’IL-1β dans le développement de réponses Th1 et Tc1 spécifiques .......................... 65

4 Rôle de l’IL-17 dans le développement de réponses Th1 et Tc1 spécifiques .......................... 66

5 Rôle de l’IL-17 et de l’IL-1β dans la progression tumorale ..................................................... 69

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ................................................................................. 70

REFERENCES ....................................................................................................................... 73

ANNEXES .............................................................................................................................. 88

6

INTRODUCTION

1 La présence d’un danger : une condition nécessaire à l’activation du système

immunitaire ?

1.1 La théorie du danger et les signaux de danger

1.1.1 Présentation de la théorie du danger

Initialement, la reconnaissance de structures moléculaires étrangères à l’organisme

était considérée comme la principale condition d’activation du système immunitaire.

Cependant, la seule dichotomie entre le « soi » et le « non soi » ne permet pas d’expliquer

toutes les situations d’activation ou de non activation du système immunitaire. Celui-ci est en

effet capable de s’activer dans des conditions exemptes d’agents étrangers, dans certaines

maladies auto-immunes par exemple. A l’inverse, il peut être tolérant à la présence

d’organismes étrangers, tels que les bactéries de la flore commensale. Dans les années 1990,

P Matzinger propose que l’activation du système immunitaire soit déterminée par la

reconnaissance d’un danger pour l’intégrité de l’organisme, lié ou non à la présence d’un

agent étranger 1. Ainsi, les situations de stress ou de destruction tissulaire non contrôlée

mèneraient à la production de signaux de danger, servant d’alerte pour le système

immunitaire. Cette théorie pourrait notamment expliquer pourquoi l’organisme tolère un

fœtus en bonne santé, alors qu’il peut rejeter un greffon, deux entités qui font pourtant partie

du « non soi ».

1.1.2 Les signaux de danger

1.1.2.1 Les signaux de danger liés à une infection par un

microorganisme

Certains signaux de danger sont des molécules de l’organisme (signaux endogènes) et

d’autres viennent de l’extérieur (signaux exogènes). Au cours d’une infection, l’intrusion

d’un microorganisme pathogène constitue un danger exogène. Les signaux de danger liés à

une infection sont appelés PAMPs (« Pathogen Associated Molecular Patterns ») 2. Parmi

ceux-ci, se trouvent des molécules glycolipidopeptidiques des enveloppes microbiennes, des

7

protéines et des acides nucléiques (Tableau 1) 2. Les PAMPs sont des structures moléculaires

spécifiques à des classes de microorganismes et ne font en général pas partie du « soi ».

Types de molécules Exemples Microorganismes

structures glycolipidopeptidiques

de l'enveloppe

acide lipotéichoïque bactéries gram + (ex: Staphylococcus) lipopolysaccharide (LPS) bactéries gram - (ex : Salmonella)

peptidoglycane bactéries gram + et gram - lipoarabinomannanes et lipomannanes bactéries du genre Mycobacterium

zymosan (polysaccharide) levures (Saccharomyces) lipoproteines and lipopeptides bactéries du genre Mycoplasma

protéines flagelline bactéries motiles porines certaines bactéries (ex : Neisseria)

acides nucléiques

ADN non méthylé bactéries, virus à ADN, protozoaires

ARN db virus à ARN (ex : reovirus, VRS, WNV)

ARN sb riche en GU certains virus (ex : VIH) ARN et ADN dans les endosomes bactérie ou virus endocytés ARN db et ADN db cytosoliques bactérie ou virus intra-cellulaires

Tableau 1 : Exemples de signaux de danger liés à une infection microbienne (ADN : acide désoxyribonucléique ; ARN : acide ribonucléique ; sb : simple brin ; db : double brin ; VRS : virus respiratoire syncytial ; WNV : virus du Nile occidental ; VIH : virus de l’immunodéficience humaine).

Les PAMPs sont capables de signaler la présence d’un danger en activant des cellules de

l’immunité innée par l’intermédiaire de récepteurs spécifiques (cf 1.2.1).

1.1.2.2 Les signaux de danger non microbiens

Dans des conditions stériles, exemptes de pathogènes, des signaux de danger exogènes

et endogènes peuvent alerter le système immunitaire (Tableau 2). Alors que les signaux

exogènes proviennent de l’environnement, les signaux endogènes sont libérés dans des

conditions de destruction tissulaire massive et non contrôlée. Parmi les signaux endogènes,

certains sont libérés par les cellules nécrotiques et d’autres résultent de la dégradation de la

matrice extra-cellulaire. Les signaux de danger liés à une destruction tissulaire sont

collectivement appelés « DAMPs » (« Dammage Associated Molecular Patterns ») 3.

8

Type de danger Provenance Exemples

endogène

molécules intra-cellulaires libérées par les cellules

nécrotiques

HMGB1, ATP, acide urique, ADN, ARN, HSP (HSP70, HSP90, GP96),

protéines S100, SAP130, IL-1α, IL-33

dégradation de la matrice extra-cellulaire

biglycan , hyaluronane, heparane sulphate, peptides formylés, versican

exogène environnement silice, amiante, irritants cutanés (ex dinitrofluorobenzene), UVB

Tableau 2 : Exemples de signaux de danger non microbiens (HSP : protéines de choc thermique ; IL : interleukine ; HMGB1 : high mobility group box 1) (d’après Chen GY, 2010 3).

Différentes agressions extérieures, de nature microbiennes, chimiques ou physiques,

peuvent être à l’origine de dommages tissulaires. Certains irritants chimiques, tels que

l’amiante ou la silice, sont des signaux capables d’activer directement les récepteurs de

danger (cf 1.2.1) (Tableau 2) 4. Des stress endogènes, liés par exemple à une insuffisance

métabolique comme au cours de l’ischémie de reperfusion, peuvent également être à l’origine

d’une destruction tissulaire importante. Dans tous les cas, les protéases libérées par les

cellules mourantes ou impliquées dans le remodelage tissulaire peuvent dégrader la matrice

extra-cellulaire et libérer des signaux de danger, comme le biglycan ou le hyaluronane par

exemple (Tableau 2) 3. Une destruction tissulaire importante est en général associée à un fort

taux de nécrose cellulaire. Ce type de mort se caractérise par une augmentation du volume

cellulaire et de celui des organelles et par la perte de l’intégrité de la membrane plasmique,

entrainant la libération du contenu cellulaire dans le milieu extra-cellulaire, et notamment de

molécules pouvant signaler un danger, comme par exemple HMGB1, l’ATP ou l’acide urique

(Tableau 2). Les cellules nécrotiques peuvent aussi libérer des cytokines inflammatoires

préformées et stockées dans leurs organelles, comme l’IL-1α et l’IL-33 (Tableau 2).

Contrairement à la nécrose, la mort par apoptose se caractérise par la diminution du volume

cellulaire avec condensation de la chromatine, fragmentation nucléaire et bourgeonnement de

la membrane plasmique en petites vésicules appelées corps apoptotiques. La mort par

apoptose est un phénomène programmé impliquant différentes voies de signalisation

cellulaire dont celles utilisant les caspases. Classiquement, l’apoptose est considérée comme

une mort non inflammatoire et non immunogène, surtout impliquée dans des conditions

9

physiologiques liées au développement et à l’homéostasie tissulaire 5. Cependant, la

dichotomie entre nécrose et apoptose a été remise en question par l’observation que des

cellules nécrotiques peuvent induire une tolérance et que des cellules en apoptose peuvent

induire un état inflammatoire et une réponse immunitaire 6 ;7. De plus, il se peut qu’un fort

taux d’apoptose dans un tissu surpasse les capacités d’élimination du système phagocytaire.

Dans ce cas, les cellules peuvent entrer dans un état de nécrose secondaire, avec libération de

signaux de danger inflammatoires dans le milieu.

1.2 Les réponses immunitaires au danger

1.2.1 Les principales familles de récepteurs des signaux de danger

Les récepteurs des signaux de danger peuvent être classés en quatre grandes

catégories : les récepteurs de type Toll (TLR), les récepteurs de type NOD (NLR), les

hélicases de type RIG (RLR) et les lectines de type C 8. Les TLR et certaines lectines de type

C sont des protéines transmembranaires, alors que les NLR et les RLR sont essentiellement

cytosoliques. Ces récepteurs sont exprimés dans différentes cellules de l’immunité innée ainsi

que dans d’autres cellules comme les cellules épithéliales ou endothéliales.

Les TLR font partie d’une famille de molécules phylogénétiquement conservées, dont

le premier membre a été découvert chez la drosophile pour son implication dans le

développement et l’immunité de cet organisme 9. Il existe 10 membres connus de cette

famille chez l’Homme. Certains TLR (TLR-1, -2, -4, -5 et -6) se trouvent sur la membrane

plasmique et d’autres sont présents au niveau de la membrane des endosomes (TLR-3, -7, -8

et -9). Tous les TLR possèdent un domaine de reconnaissance des PAMPs ou des DAMPs qui

est un domaine riche en motifs à répétition de leucines (LRR). Le domaine effecteur des TLR

(domaine TIR), se trouve sur la face cytosolique. Les TLR endosomaux reconnaissent

essentiellement des acides nucléiques, tels que les ARN simple brin pour les TLR-3, -7, -8 et

l’ADN non méthylé pour le TLR-9. En revanche, les TLR de la membrane plasmique

reconnaissent plutôt des ligands présents à la surface des pathogènes, tels que le LPS, la

flagelline ou l’acide lipotéichoïque pour les TLR-4, -5 et -2 respectivement. Les TLR-2 et -4

sont également impliqués dans la reconnaissance de nombreux signaux de danger endogènes,

comme HMGB1, les protéines de choc thermique, le hyaluronane ou le biglycan 3.

10

Les NLR sont une grande famille de protéines comprenant 23 membres chez

l’Homme et 34 chez la souris. Comme les TLR, ces protéines possèdent un domaine de

reconnaissance des DAMPs ou des PAMPs, également caractérisé par la présence de

répétition de leucines (LRR). Le domaine central de la protéine est très conservé au sein de la

grande famille des NLR et constitue une caractéristique de ces molécules. Ce domaine central

est un domaine d’oligomérisation dépendant de l’ATP (NBD). Enfin, les NLR possèdent un

domaine effecteur dont la nature permet de classer les NLR en quatre catégories : les NLRA,

les NLRB, les NLRC et les NLRP. Ces derniers sont une grande famille de 14 protéines, dont

le domaine effecteur est un domaine pyrine (PYD) d’interaction homophilique. L’activation

de certains NLR, comme NLRP3, NLRC4 et NLRP1, induit la formation de grosses

structures moléculaires, appelées inflammasomes. Les inflammasomes sont composés des

NLR et de protéines adaptatrices, telle que la protéine ASC (apoptosis-associated speck-like

protein) pour les NLRP1 et 3, qui permettent le recrutement et l’auto-activation de la pro-

caspase 1 en caspase 1. Une fois activée, la caspase 1 catalyse le clivage des pro-cytokines :

pro-IL-1β et pro-IL-18, en leurs formes matures et actives (Figure 1). Certains NLR sont

activés par un nombre limité de ligands. Ceci est le cas de NOD-1 et NOD-2 (respectivement

NLRC 1 et NLRC 2) qui sont activés par des dipeptides exprimés par différentes bactéries.

En revanche, NLRP3 répond à une grande variété de signaux de danger, parmi lesquels des

activateurs endogènes (ex : ATP, acide urique) et des activateurs exogènes (ex : silice,

amiante, ARN bactérien ou viral) (Figure 1). Les modalités de reconnaissance de tous ces

signaux ne sont pas complètement élucidées mais il est probable que ces activateurs génèrent

un intermédiaire commun reconnu par NLRP3 10.

11

Figure 1 : Structure de l’inflamasomme NLRP3/ASC/caspase 1 et diversité des signaux de danger activateurs (d’après Davis BK, Ann Rev Immunol, 2011 10).

Les RLR sont une petite famille comprenant notamment les deux protéines

cytosoliques RIG-I et MDA5. Les RLR possèdent un domaine de reconnaissance des ARN

viraux, qui est un domaine hélicase à ARN dépendant de l’ATP. Le domaine effecteur des

RLR est un domaine d’interaction homophilique CARD. Enfin, les lectines de types C sont

une très grande famille de protéines possédant toutes au moins un domaine lectine de type C,

spécialisé dans la reconnaissance des structures glucidiques. Parmi tous les membres de cette

famille, certains sont impliqués dans la reconnaissance des signaux de danger. Par exemple,

la dectine 1 est une protéine transmembranaire exprimée majoritairement sur les cellules

inflammatoires (monocytes, macrophages, neutrophiles, cellules dendritiques) et qui

reconnait les β glucanes de la paroi des champignons et des bactéries. Mincle (CLEC4A), un

autre membre de cette famille présent sur les macrophages activés et sur les cellules

dendritiques, est capable de reconnaitre la protéine SAP130 libérée par les cellules

nécrotiques 11.

12

1.2.2 Signaux de danger et inflammation

1.2.2.1 Principales voies de signalisation des récepteurs des signaux

de danger

L’inflammation est une réponse physiologique à un stimulus perçu comme dangereux

par l’organisme (ex : infection, destruction tissulaire). Cette réponse se caractérise par le

recrutement de cellules de l’immunité innée, le plus souvent les neutrophiles et des

macrophages, dans les tissus. Ceci s’accompagne de la production de cytokines, de

chimiokines et d’autres molécules inflammatoires qui entretiennent ou amplifient le

recrutement des leucocytes. L’activation des récepteurs des signaux de danger mène à

l’expression de gènes de l’inflammation au niveau des cellules immunitaires et d’autres

cellules comme les cellules épithéliales. Les voies de signalisation en aval de la plupart des

récepteurs de signaux de danger convergent vers l’activation des facteurs de transcription

NFκB (nuclear factor-κB) et IRF-3 et -7 8. NFκB induit la transcription de nombreux gènes de

l’inflammation (cytokines, chimiokines, molécules d’adhésion) et IRF-3 et IRF-7 activent la

synthèse d’ARNm d’interferon (IFN) de type 1 (Figure 2).

L’activation et la dimérisation des TLR induisent le recrutement de molécules

adaptatrices, appartenant à 4 grandes familles : Myd88, TRIF, TIRAP et TRAM (Figure 2).

Dans les cellules dendritiques myéloïdes et les macrophages, l’activation de MyD88 et de

TRIF conduit respectivement à l’activation de NFκB et d’IRF-3. Dans les cellules

dendritiques plasmocytoïdes (pDC), l’activation de MyD88 par les TLR-7 et -9 aboutit à la

phosphorylation activatrice d’IRF-7. De même, l’activation de NOD-1 et NOD-2 induit leur

oligomérisation dépendante de l’ATP et le recrutement de la protéine adaptatrice RICK, qui

active NFκB (Figure 2). Les RLR RIG-I et MDA5 recrutent une molécule adaptatrice

mitochondriale présentant un domaine CARD : IPS 1 (également appelée MAVS ou Cardif).

IPS1 peut ensuite activer NFκB et le complexe IRF3/7 (Figure 2). Enfin, certains membres

des lectines de types C, comme les dectines 1 et 2 et Mincle, activent une voie de

signalisation dépendante de Syk et de CARD9, qui aboutit à l’activation de NFκB.

13

mb plasmique

cytosol

mitochondrie

TLR

RLR

NLR

INFLAMASOMME

Figure 2 : Convergence des voies de signalisation des TLR, RLR et NLR, vers l’activation des facteurs de transcription NFκB et IRF3/7 (seules les molécules adaptatrices et les facteurs de transcription terminaux sont représentés) (d’après Kumar H, 2011 8).

Les voies de signalisation en aval des récepteurs de signaux de danger convergent

donc vers la production de cytokines inflammatoires. Chaque situation dangereuse pour

l’intégrité de l’organisme déclenchera une réponse inflammatoire particulière, qui dépend de

la nature des signaux de danger, ainsi que de leur intégration par les cellules du tissu. Des

interactions entre ces différentes voies de signalisation peuvent mener à des synergies. Ceci

est notamment le cas pour la production d’IL-1β par l’intermédiaire de l’inflammasome

NLRP3. L’activation de l’inflammasome nécessite en effet une étape de « priming » par un

ligand de TLR, augmentant la synthèse de NLRP3 et de pro-IL-1β 12. Enfin, certains

récepteurs n’appartenant pas aux catégories décrites ci-dessus sont capables de reconnaitre

des signaux de danger. Parmi ceux-ci, RAGE, qui reconnait HMGB1 ou les protéines S100,

favorise la production de cytokines inflammatoires, alors que CD24, un récepteur de HMGB1

et des HSP, joue un rôle dans le contrôle négatif de l’inflammation 13 ; 14

14

1.2.2.2 Inflammation et danger : entre destruction et préservation

tissulaire

L’inflammation est donc déclenchée lorsque des signaux de danger sont perçus par

l’organisme, et notamment par les cellules de l’immunité innée. En raison de leur manque de

spécificité, les réactions inflammatoires peuvent induire des dommages tissulaires. En effet,

des études chez la souris ont montré que l’activation de certains TLR et NLR pouvait induire

une réponse inflammatoire délétère pour les tissus de l’organisme. Par exemple, les TLR-2 et

-4 ont été impliqués dans la destruction des tissus suite à des ischémies de reperfusion dans de

nombreux organes (foie, rein, cœur, cerveau) 15.

Dans des situations non pathologiques, la réaction inflammatoire est transitoire. A la

fin d’une inflammation aigüe, des mécanismes de réparation et de préservation tissulaires se

mettent en place. Des études chez la souris ont montré qu’au cours d’une inflammation,

l’activation des TLR et des NLR par les signaux de danger peut permettre de limiter la

destruction tissulaire, en favorisant des phénomènes de préservation tissulaires. Les TLR-4 et

-2 et NLRP3 ont tous été impliqués dans la réparation tissulaire de l’épithélium intestinal

suite à des dommages causés par des agents chimiques irritants 16 ; 17. Au niveau pulmonaire,

TLR-2 et -4 sont impliqués dans la résistance des cellules épithéliales à l’apoptose suite à

l’administration de bléomycine 18. De même, au cours d’une infection par le virus de la

grippe, l’activation de NLRP3 par l’ARN viral semble importante pour limiter la nécrose

tissulaire initiale, pouvant entrainer des complications respiratoires à long terme 19. Enfin, les

TLR sont impliqués dans la formation de tissus fibreux, signe d’un processus de cicatrisation

exacerbé et défectueux, impliquant les fibroblastes et la synthèse de collagène. Chez

l’Homme, un polymorphisme de TLR4 associé à une plus faible activation du récepteur, a

notamment été associé à un risque amoindri de fibrose hépatique chez les patients atteints

d’hépatite C chronique 20. L’induction d’une réponse inflammatoire favorisant la réparation

tissulaire est notamment importante dans des situations de nécrose tissulaire stérile. Ainsi, les

cellules nécrotiques induisent l’expression de molécules impliquées dans l’inflammation et la

réparation tissulaire dans les macrophages et les fibroblastes, selon un mécanisme dépendant

de TLR2 21. De même, lorsqu’ils sont exposés au hyaluronane, un signal de danger endogène,

les monocytes sécrètent des cytokines impliquées dans la réparation tissulaire comme TGF-β2

(transforming growth factor-β2) et MMP-13 (matrix metalloproteinase-13), et présentent

15

donc une réponse différente de celle au LPS. Bien que le LPS et le hyaluronane se lient tous

les deux au TLR4, ces deux signaux de danger utilisent des corécepteurs différents : MD2 et

CD44 pour le hyaluronane et CD14 pour le LPS 22. Ainsi, bien que pouvant utiliser les

mêmes récepteurs principaux, les signaux de danger exogènes et endogènes ne sont pas

toujours qualitativement identiques et pourraient même conduire à des résultats opposés sur la

réponse inflammatoire.

1.2.3 Reconnaissance du danger et immunité adaptative

Dans des situations non pathologiques, la réaction inflammatoire permet l’élimination

du stimulus déclencheur et est donc transitoire. Dans certains cas, comme au cours d’une

infection, le système immunitaire inné peut coopérer avec le système adaptatif pour éliminer

le danger. Les cellules dendritiques sont des cellules de l’immunité innée ayant un rôle

important dans l’activation de l’immunité adaptative. L’intégration de différents signaux de

danger par ces cellules est déterminante pour leur activation, leur migration et leur fonction

de présentation antigénique. Des études ont montré que la présence d’un antigène et d’un

ligand de TLR-2 ou -4 dans un même phagosome influençait la maturation de ce dernier et

facilitait la présentation des antigènes sur les complexes majeurs d’histocompatibilité de

classe 2 (CMH II) à la surface des cellules dendritiques. En revanche, les antigènes

phagocytés en l’absence d’un signal TLR sont dégradés par les enzymes lysosomales sans

être présentés par les cellules dendritiques 23. La nature des signaux de danger joue également

un rôle dans le type de cytokines sécrétées par les cellules dendritiques, impliquées dans la

différenciation des lymphocytes T (LT) CD4 auxiliaires (Th) vers un profil Th1, Th2 ou

Th17. Le développement d’une réponse adaptative est favorisé par la présence de signaux de

danger mais dépend également de la nature des antigènes associés à ces signaux de danger.

Ainsi, dans des cas d’inflammation stérile, déclenchée par un fort taux de nécrose tissulaire,

les antigènes potentiels appartiennent au « soi » et sont donc moins susceptibles de

déclencher une réponse immunitaire, en raison des différents mécanismes de tolérance

centrale et périphérique existants 24. Cependant, dans des cas pathologiques, la présence de

signaux de danger peut favoriser une rupture de tolérance et le développement de pathologies

auto-immunes. Ceci est le cas dans le lupus érythémateux, caractérisé par la présence d’auto-

anticorps dirigés notamment contre des acides nucléiques 25. Des modèles animaux ont

montré qu’un défaut d’élimination des corps apoptotiques pouvait favoriser le développement

de la maladie. Ceci suggère que les signaux de danger endogènes libérés par les cellules en

16

nécrose secondaire pourraient jouer un rôle dans la rupture de la tolérance. De plus, les TLR-

7 et -9 ont respectivement été impliqués dans l’apparition d’auto-anticorps contre l’ARN et

l’ADN endogène (Figure 3). D’autres études indiquent que les acides nucléiques endogènes

peuvent être endocytés par les lymphocytes B (LB) (via leur BCR) et activer ces cellules en

se liant aux TLR-7 et -9 des endosomes. De plus, les complexes immuns formés par ces auto-

anticorps se déposent au niveau des articulations et du rein et entrainent une inflammation

délétère pour l’intégrité des tissus. Les TLR-7 et -9 sont aussi impliqués dans l’entretien de

cet état inflammatoire (Figure 3). Chez l’Homme, des études in vitro ont montré que les

complexes immuns présents dans le sérum des patients pouvaient stimuler la production

d’IFN-α par les pDC, suite à leur endocytose par le récepteur FcγRII 26.

Figure 3 : Implication des TLR-7 et -9 dans l’activation des LB et des pDC par des acides nucléiques endogènes (d’après Krieg AM, Immunity, 2007 27).

17

Comme les TLR, certains NLR ont un rôle dans l’induction de réponses immunitaires

spécifiques. Ceci est notamment le cas de NOD-2, important pour l’effet adjuvant du MDP

(muramyl dipeptide) 28. L’effet de l’activation du NLR NLRP3 sur l’induction de réponses

immunitaires spécifiques est controversé. Par exemple, NLRP3 semble important dans

l’induction de LT spécifiques dans la réaction d’hypersensibilité de contact induite par le

trinitrochlorobenzène 29. De même, NLRP3 est impliqué dans l’induction d’une immunité

cellulaire spécifique par les adjuvants particulaires de type PLG (poly(lactide-co-glycolide) 30. L’acide urique, un activateur de NLRP3 libéré par les cellules nécrotiques a une fonction

d’adjuvant pour le développement de réponses CD8 spécifiques 31. De plus, certaines études

ont montré que l’induction de réponses humorales par l’alun, un des adjuvants les plus utilisé

chez l’Homme, nécessitait l’inflammasome NLRP3 32. En revanche, d’autres études ont

montré qu’en dépit de la capacité de l’alun à activer l’inflammasome NLRP3, ce dernier

n’était pas indispensable à son effet adjuvant 33. De même, l’activation de NLRP3 au cours

d’une infection par le virus Influenza A entraine une inflammation pulmonaire mais ne

semble pas importante pour le développement d’une réponse cellulaire anti-virale 34 19 35.

Chez l’Homme, les cryopyropathies (CAPS) sont des pathologies caractérisées par une

mutation gain de fonction dans le gène codant pour NLRP3, ce qui résulte en une sur-

production d’IL-1β. Ces pathologies font partie des pathologies auto-inflammatoires,

caractérisées par des phases de réactions inflammatoires imprévisibles. Par définition, ces

maladies ne sont pas associées au développement d’une auto-immunité spécifique 36. La

goutte est une autre pathologie auto-inflammatoire causée par le dépôt de cristaux d’urate de

sodium au niveau des articulations. Bien que ceci active l’inflammasome NLRP3 et soit à

l’origine d’une sur-production d’IL-1β, aucune immunité adaptative n’est détectée 36. Ainsi,

la détection de signaux de danger ne mène pas toujours à l’activation de réponses

immunitaires spécifiques. Dans certains cas, les mécanismes de tolérance contre des antigènes

du soi expliquent l’absence de réponse adaptative.

18

► Conclusion de la partie 1 :

La présence d’une situation dangereuse pour l’intégrité de l’organisme déclenche une

réaction inflammatoire, impliquant le recrutement de cellules de l’immunité innée dans le

tissu menacé, et la production de facteurs solubles, comme des cytokines et des chimiokines.

L’induction d’une réponse inflammatoire implique la reconnaissance de signaux de danger

par des récepteurs innés, présents à la fois sur les cellules immunitaires, et sur d’autres

cellules, comme les cellules épithéliales, fibroblastiques ou endothéliales. Les signaux de

danger sont des molécules qui témoignent d’une agression extérieure (pathogène, irritant

chimique) ou d’une destruction anormale des tissus de l’organisme. La réponse inflammatoire

est impliquée dans l’élimination du danger ainsi que dans la réparation tissulaire qui suit.

Bien qu’étant associée au déclenchement d’une réponse immunitaire innée, la présence d’un

danger n’est pas toujours à l’origine de l’induction de réponses spécifiques. Ceci dépend des

caractéristiques des antigènes présents, ainsi que de la nature des signaux de danger et des

récepteurs impliqués.

19

2 Les réponses immunitaires naturelles dans le cancer

2.1 Les tumeurs : tolérance ou immunité ?

2.1.1 Les tumeurs sont-elles tolérées par le système immunitaire ?

Les cellules tumorales, qui dérivent des cellules de l’organisme, se développent dans

la majorité des cas chez des individus immunocompétents. Ce constat a amené l’hypothèse

que les tumeurs pourraient être tolérées par le système immunitaire, au même titre que les

tissus de l’organisme non altérés. La tolérance immunitaire peut résulter de l’absence de

reconnaissance de l’antigène (ignorance), ou bien de l’élimination (délétion) ou de

l’inactivation (anergie) des lymphocytes spécifiques ayant rencontré l’antigène.

2.1.1.1 Les tumeurs sont-elles ignorées par le système

immunitaire ?

Bien que les tumeurs dérivent des cellules du « soi », elles sont caractérisées par une

grande instabilité génétique à l’origine de la formation de nouvelles protéines (néoantigènes)

ou de l’expression ectopique ou anormalement élevée de molécules, ce qui les rend

différentes du « soi ». Il est ainsi possible de trouver des LT ayant une forte avidité pour les

néoantigènes tumoraux dans la circulation, puisque ces antigènes ne sont pas exprimés dans

le thymus, et qu’ils ne participent donc pas à la sélection négative des LT 37. Malgré la

présence de LT ayant une avidité importante pour certains antigènes tumoraux, certaines

études chez la souris indiquent que les tumeurs sont parfois ignorées par le système

immunitaire, c'est-à-dire que les lymphocytes spécifiques ne rencontrent pas les antigènes.

Différents paramètres pouvant expliquer cet état d’ignorance ont été proposés, tels que la

localisation de la tumeur et la quantité d’antigènes 38. Ainsi, en utilisant plusieurs modèles de

tumeurs injectées en sous-cutané (fibrosarcomes, lymphomes, carcinomes pulmonaires,

mélanomes, mastocytomes) et exprimant différents néoantigènes viraux, une étude a montré

que la progression tumorale était associée à l’absence de réponse CD8 spécifiques et que ceci

était dû à l’absence de pénétration des cellules tumorales dans les organes lymphatiques

secondaires 39. Dans ces modèles, le développement tumoral ne s’accompagne pas de

l’anergie ou de la délétion des LT spécifiques. En effet, même en présence d’une grosse

tumeur, ces derniers répondent normalement à une stimulation antigénique. De plus, les

20

auteurs montrent que même au sein des organes lymphatiques, certaines tumeurs peuvent

rester invisibles au système immunitaire en étant histologiquement séparées de celui-ci par la

présence d’une capsule fibreuse. De même, contrairement à une injection sous forme de

suspension cellulaire, l’injection de cellules tumorales sous forme de fragments contenant des

cellules stromales empêche leur accès aux organes lymphatiques et ne permet pas le

développement de réponses immunitaires spécifiques 40.

L’ignorance des tumeurs par le système immunitaire pourrait également s’expliquer

par la faible quantité d’antigènes qu’elles expriment, en tous cas à des stades précoces de

développement. Des études ont montré que des tumeurs solides exprimant faiblement un

antigène, bien que pouvant être reconnues par des LT préalablement activés, ne permettaient

pas d’activer des LT anti-tumoraux spécifiques 41. Les auteurs ont montré que les cellules

dendritiques permettaient la présentation croisée des antigènes tumoraux, à condition que

ceux-ci dépassent un certain seuil d’expression. Cette étude est en accord avec une étude

montrant l’importance de la destruction tissulaire dans la libération d’une quantité suffisante

d’antigènes, pour leur présentation croisée aux LT CD8 42. Cette théorie expliquerait que le

développement d’une immunité anti-tumorale augmente avec la progression tumorale, celle-

ci étant associée à une augmentation de la quantité d’antigènes tumoraux 43.

Chez l’Homme, la question de l’ignorance des tumeurs par le système immunitaire est

difficile à appréhender, puisqu’il s’agit par définition d’étudier une absence de réponse

immunitaire à des stades très précoces voire infra-clinique de cancer. Bien que les tumeurs

constituent un danger pour l’intégrité et la survie de l’organisme sur le plan clinique, il se

peut que sur le plan moléculaire, aucun signal de danger ne soit présent au cours des premiers

stades de leur développement. Ceci ne s’applique pas à des tumeurs induites par des agents

pathogènes, mais pourrait concerner certaines tumeurs solides, dont le développement

précoce n’est probablement pas associé à une destruction tissulaire massive et incontrôlée.

21

2.1.1.2 Le développement tumoral est-il associé à l’induction d’une

tolérance immunitaire ?

Chez les patients atteints de cancers à des stades cliniquement visibles, il est possible

de mettre en évidence des LT anti-tumoraux. Dans certains cas, des LT spécifiques de

néoantigènes tumoraux sont détectés, ce qui suggère que la tumeur a été reconnue par le

système immunitaire 44. Bien que présents, ces LT spécifiques ne sont pas toujours efficaces.

Par exemple, les LT CD8 anti-tumoraux, directement isolés de patients atteints de mélanome

ne sont pas fonctionnels in vitro 45. En effet, ces lymphocytes ne présentent pas d’activité

cytotoxique spécifique, ne sont pas capables de sécréter des cytokines (TNF-α et IFN-γ) en

réponse à des mitogènes et ne présentent pas de phénotype d’activation (CD69) suite à une

stimulation antigénique. Chez ces mêmes patients, les LT CD8 spécifiques du virus Epstein-

Barr (EBV) sont tout à fait fonctionnels, ce qui suggère que le déficit est spécifique des

réponses anti-tumorales. Dans cette étude, les auteurs ont caractérisé la fonction des

lymphocytes anti-tumoraux directement après leur isolement, sans amplification ou

restimulation lourde in vitro, ce qui permet de rendre compte de l’état d’activation réel des

lymphocytes in vivo. D’autres études ont montré que les LT infiltrant des carcinomes rénaux

chez l’Homme peuvent présenter un défaut de prolifération en réponse à différents stimuli

(IL-2, IL-2 et α-CD3, mitogènes) 46. Enfin, différentes études ont mis en évidence un défaut

d’expression de la sous-unité ζ du récepteur CD3 dans les LT infiltrant des carcinomes

colorectaux et rénaux chez l’Homme 47 48.

Des travaux chez la souris ont montré que la progression tumorale pouvait être

associée à l’induction active d’une tolérance immunitaire, par délétion des LT spécifiques 49

ou par induction de LT anergiques 50 51 52 53. Dans ces cas, les LT spécifiques rencontrent les

antigènes tumoraux et entrent en apoptose ou deviennent fonctionnellement inactifs sans être

nécessairement éliminés. La réversibilité potentielle de l’état anergique expliquerait la

nécessité de restimuler très lourdement les LT anti-tumoraux chez l’Homme, avant de réaliser

des tests fonctionnels 54. L’induction de LT anergiques anti-tumoraux a été montrée pour les

LT CD8 52 et CD4 50. De nombreuses études ont montré que l’inactivation des LT CD4

nécessitait les cellules présentatrices de l’antigène de l’hôte 55 56. Concernant les LT CD8, il

semble qu’en plus de la présentation croisée des antigènes tumoraux par les cellules

dendritiques 57, la présentation directe des antigènes tumoraux par les cellules tumorales en

l’absence de co-stimulation puissent induire une tolérance 58 59.

22

Ainsi, il existe un certain nombre d’arguments montrant que les tumeurs peuvent être

activement tolérées par le système immunitaire. Bien que certaines études indiquent que des

cellules dendritiques matures puissent induire une tolérance 60, d’autres études montrent que

l’induction d’une tolérance immunitaire résulte de la présentation des antigènes par des

cellules dendritiques immatures 61 62. L’induction d’une tolérance immunitaire contre les

antigènes tumoraux pourrait donc s’expliquer par l’absence d’une quantité suffisante de

signaux de danger capables d’activer les cellules dendritiques au niveau de la tumeur. Ceci est

en accord avec les études montrant que les cellules dendritiques infiltrant les tumeurs peuvent

présenter un phénotype immature 63 64. De plus, comme nous le verrons en détails dans la

troisième partie, une immunité anti-tumorale peut être restaurée ou induite par

l’administration de signaux de danger, tels que des ligands de TLR (Figure 4).

ligands de TLR

Absence de signaux de danger

Restauration thérapeutique des signaux de danger

Figure 4 : L’absence de signaux de danger au niveau de la tumeur pourrait expliquer l’induction d’une tolérance immunitaire par les cellules dendritiques immatures (d’après Rabinovich GA, Ann Rev Immunol, 2007 65).

23

2.1.2 Les tumeurs sont-elles naturellement immunogènes ?

2.1.2.1 Immunodéficiences et incidence de cancer

Le concept d’immuno-surveillance anti-tumorale est né d’une hypothèse spéculative

de Paul Ehrlich en 1909 et a été réénoncé par Burnet et Thomas dans les années 1970. Ce

concept stipule que le système immunitaire est capable de prévenir l’apparition de tumeurs en

éliminant les cellules tumorales au moment de leur apparition. Ainsi, en cas de déficits

immunitaires, ce modèle prédit que la probabilité de développer un cancer sera plus

importante. A cette époque, le manque de preuves expérimentales et notamment l’observation

que les souris athymiques ne développaient pas plus de cancers induits que les souris

immunocompétentes a conduit au rejet de ce concept par la communauté scientifique. A partir

des années 1990, de nouvelles données expérimentales ont contribué à ressusciter ce concept.

En effet, des souris présentant des déficits dans différents acteurs de l’immunité innée ou

adaptative sont plus sensibles au développement de cancers induits ou spontanés que les

souris immunocompétentes (Tableau 3).

Bien que très utiles, ces modèles animaux pourraient ne pas représenter strictement la

réalité complexe de la carcinogenèse chez l’Homme. La question de l’immuno-surveillance

anti-tumorale naturelle chez l’Homme est beaucoup plus difficile à résoudre. En effet, les cas

d’immunodéficience primaire chez l’Homme sont rares et touchent surtout des enfants dont

l’espérance de vie est largement amoindrie sans l’administration de traitements

immunoréparateurs. De ce fait, les études épidémiologiques de l’apparition de cancers sont

difficiles à réaliser. Par exemple, une mutation biallélique du gène de la perforine est associée

au développement de la lymphohistiocytose hémophagocytique familiale (LHF), maladie

inflammatoire entrainant rapidement le décès du patient sans greffe de moelle autologue.

Chez certains patients présentant la mutation, la LHF ne se développe que plus tard ou bien

pas du tout. Ces patients ont un risque accru de développer des lymphomes 67. Les études des

patients présentant une immunodéficience secondaire (patients infectés par le VIH ou ayant

reçu une greffe) donnent des résultats mitigés et peu d’études sur l’impact de polymorphismes

de gènes de l’immunité sur le développement de cancers ont été réalisées à ce jour (Tableau

4).

24

Souche de souris Déficit immunitaire Incidence de cancers

Rag2 -/- absence de LT, de LB et de NKT ↑ sarcomes induits par le MCA

↑ cancers intestinaux et pulmonaires spontanés

Tcrd -/- absence de LTγδ ↑ sarcomes induits par le MCA ↑ tumeurs cutanées induites par

DMBA/TPA Tcrb -/- absence de LTαβ

↑ sarcomes induits par le MCA

α asialo-GM1 déplétion des cellules NK

Cd1d -/- absence de LT dépendant du CD1d

Ja18 -/- absence de NKT invariants ΔdblGATA et CD11-/- IL5-/- absence d'éosinophiles

Ifngr1 -/- insensible à l'IFN-γ Ifnar1 -/- ou Ifnar2 -/- pas de réponse à l'IFN-α et IFN-β

Pfp -/- absence de perforine ↑ sarcomes induits par le MCA ↑ lymphomes B spontanés

Ifng -/- absence d'IFN-γ

↑ sarcomes induits par le MCA ↑ lymphomes induits par le MNU

↑ lymphomes (C57Bl6) et adénocarcinomes pulmonaires (Balbc) spontanés

Il12a -/- absence d'IL-12 ↑ lymphomes induits par le MNU ↑ tumeurs cutanées induites par DMBA/TPA

Cd80 -/- ou Cd86 -/- absence de CD80 et CD86 ↑ cancers de la peau induits par les UV

Tableau 3 : Incidence de cancers induits ou spontanés chez des souris présentant différents déficits immunitaires (MCA : méthylcholantrène ; DMBA/TPA :7,12 dimethylbenz(a)anthracene /12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate ; MNU : N-Methyl-N-nitrosourea ; NK : cellules Natural Killer) (d’après Vesely MD, Ann Rev Immunol, 2011 66).

25

Individus Caractéristiques immunitaires Incidence de cancers

patients infectés par le VIH

déficit immunitaire lié à l'apoptose des LT CD4 • ↑ incidence de cancers viro-induits 68

patients ayant reçu une transplantation (cœur, foie ou rein)

immunodéficience secondaire liée à l'administration de différents agents

immunosuppresseurs

• pas de risque accru de développer certains cancers non viro-induits et qui prédominent dans la population générale (ex : sein, prostate) 68

patients présentant une mutation

biallélique du gène de la perforine

immunodéficience primaire (cellules NK et LT CD8 peu

fonctionnels)

• ↑ risque de développer des lymphomes non nécessairement viro-induits 67

population générale

faible activité cytotoxique des cellules NK liée à un

polymorphisme du gène du récepteur activateur NKG2D

• ↑ risque de développer des cancers non viro-induits (poumons, intestins) 69 70

Tableau 4 : Influence de déficits immunitaires sur l’incidence de cancers chez l’Homme.

2.1.2.2 Détection de réponses immunitaires à des stades précoces de

cancers

Une façon d’étudier la question de l’immunogénicité naturelle des tumeurs chez

l’Homme est d’essayer de détecter des réponses spécifiques de certains antigènes tumoraux

chez des patients atteints de stades précoces de cancer. Concernant les réponses humorales, il

est possible de détecter des anticorps dirigés contre des antigènes tumoraux dans le sérum des

patients. Par exemple, des anticorps dirigés contre p53 sont présents dans 46% des cancers de

l’ovaire et 35% des cancers de l’œsophage, des proportions largement supérieures à celles

trouvées chez des sujets sains (Tableau 5). Un taux sérique anormalement élevé d’anticorps

spécifiques de p53 muté ou natif est également détecté dans beaucoup d’autres types de

cancers, comme les cancers de la bouche, du foie, du sein, du poumon et du colon 71 72. Bien

que plus de 100 antigènes tumoraux aient été identifiés comme cibles de réponses humorales

chez l’Homme, seulement certains d’entre-eux ont particulièrement été étudiés, comme c-

myc, NY-ESO-1, MUC1, la cycline B1, p62 et la survivine. Des réponses humorales ont été

observées contre ces antigènes dans différents types de cancers (Tableau 5). A part pour

MUC1, la fréquence d’anticorps contre ces antigènes chez les individus non atteints de

cancers est très faible 72.

26

Antigène Types de cancers Fréquence d'IgG

chez les sujets sains (fréquence de détection d'IgG)

p53 ovaire, œsophage (30-50 %)

2% bouche, foie, sein, poumon, colon (5-30 %)

c-myc foie, sein, poumon, colon (5-30 %) 1% NY-ESO-1 poumon, foie, sein (5-30 %) 1% Her2/neu sein, poumon (10-30 %) 2% MUC1 sein, poumon, colon (30-50 %) 23%

cyclin B1 colon, poumon (30-50 %) 1%

foie, sein (5-30 %) p62 poumon, foie (5-30 %) 1%

survivine poumon, sein, foie, colon (5-30 %) 1%

Tableau 5 : Diversité des types de cancers associés au développement de réponses humorales spécifiques contre certains antigènes tumoraux chez l’Homme (d’après Reuschenbach M, 2009 72).

Certaines études ont montré qu’il était possible de détecter des anticorps contre les

antigènes tumoraux à des stades précoces du développement de la tumeur. Par exemple, des

anticorps contre p53 ou Her2/neu peuvent être détectés au moment du diagnostique dans des

cancers du poumon et du sein respectivement 73 74. De même, des anticorps contre p53

peuvent être détectés à des stades prénéoplasiques dans des cancers de l’œsophage et de la

bouche 75 76. Enfin, près de 60% de patients atteints de cancers colorectaux à un stade précoce

(stade II) peuvent présenter des anticorps contre MUC1 77. Il est donc possible de détecter des

réponses humorales anti-cancéreuses au début de la progression tumorale. Des études ont

montré que ces réponses augmentaient au cours de la progression tumorale 78 79. Ces

observations ont amené l’idée d’utiliser la détection d’anticorps anti-tumoraux comme un

facteur diagnostique. Bien que les réponses anticorps contre un antigène tumoral donné ne

constituent pas une méthode diagnostique suffisamment sensible, il est possible d’utiliser un

ensemble bien choisi d’antigènes tumoraux 80 81. La valeur pronostique des réponses

humorales ne fait pas l’objet d’un consensus. En effet, la présence d’anticorps contre MUC1

est associée à une meilleure survie des patients atteints de cancers du sein, de l’estomac, du

poumon, de l’ovaire et du pancréas. En revanche, la détection d’anticorps contre p53 et NY-

ESO-1 dans les cancers de sein et de la prostate respectivement, est corrélée à un mauvais

pronostic 72.

27

Concernant les réponses cellulaires, quelques études ont mis en évidence des réponses

spécifiques précoces chez les patients. Par exemple, il existe des antigènes tumoraux qui sont

normalement exprimés par des neurones de diverses régions du système nerveux central.

Certains patients présentent des maladies neuro-dégénératives liées au développement de

réponses CD8 contre ces antigènes onco-neuronaux. La grande majorité de ces patients (90%)

présente une tumeur exprimant ces antigènes onco-neuronaux. Dans 2/3 des cas, ces cancers

sont diagnostiqués après la maladie neuro-dégénénérative, ce qui suggère que le

développement des réponses CD8 anti-tumorales coïncidait avec un stade tumoral infra-

clinique. En générale, les cancers de ces patients sont moins agressifs que dans la population

générale et il existe un certain nombre de cas d’apparentes régressions spontanées 82. De

même, des LT CD8 spécifiques ont été détectés dans la moëlle osseuse de patients atteints de

gammapathie monoclonale bénigne, alors que ces réponses étaient absentes chez les patients

ayant progressé vers une néoplasie de type myélome multiple 83.

2.1.2.3 Nature des réponses immunitaires anti-tumorales efficaces

L’étude de l’incidence de cancers spontanés ou induits chez des souris invalidées pour

différents acteurs du système immunitaire a permis de montrer que de nombreuses cellules et

molécules étaient impliquées dans l’immuno-surveillance anti-tumorale 66 (Tableau 3). Parmi

celles-ci, on trouve des cellules de l’immunité innée, telles que les cellules NK, NKT et les

LTγδ, ainsi que des cellules de l’immunité adaptative, surtout représentées par les LTαβ. En

plus des complexes CMH I-antigènes, les cellules tumorales expriment d’autres ligands

permettant leur reconnaissance par les effecteurs immunitaires. Par exemple, MICA et MICB

(Major histocompatibility complex class I Chain-related gene A et B), normalement

exprimées uniquement sur les cellules épithéliales du tractus gastro-intestinal chez l’individu

sain 84, sont exprimées par plusieurs tumeurs épithéliales dont les mélanomes 85. MICA et

MICB activent les cellules exprimant leur récepteur NKG2D, telles que, chez l’Homme, les

cellules NK, les LTγδ périphériques et intestinaux (surtout en IL-15), les LT CD8 naïfs et

mémoires et une population de LT CD4 86. Un autre ligand de NKG2D chez l’Homme est

ULBP-1 (UL16 binding protein-1), également sur-exprimé par certaines tumeurs, comme les

carcinomes 85. De même, CD122 et CD155, sur-exprimés sur de nombreuses tumeurs

humaines, comme les tumeurs de l’ovaire et les neuroblastomes, permettent l’activation des

cellules NK et des LT via une interaction avec leur récepteur DNAM1 87 88 89.

28

Suite à leur activation, certaines cellules immunitaires, telles que les cellules NK, les

LTγδ, les LT CD8 et les macrophages, peuvent avoir un effet directement cytotoxique sur les

cellules tumorales 90 85. Le mécanisme de lyse des cellules tumorales peut impliquer les

granules cytotoxiques de perforine/granzyme ou bien des récepteurs de mort membranaires,

tels que FasL, TRAIL ou TNF-α. Outre cette activité cytotoxique, les cellules NK, NKT et les

LT peuvent produire des cytokines ayant une action anti-tumorale plus ou moins directe.

Parmi ces cytokines, l’IFN-γ est reconnue depuis longtemps comme une cytokine majeure de

l’immunité anti-tumorale naturelle 91. Cette cytokine peut en effet avoir une action anti-

proliférative 92 ou pro-apoptotique 93 directe sur les cellules tumorales. De plus, l’IFN-γ

augmente l’expression des molécules de CMH I sur les cellules tumorales et facilite ainsi leur

reconnaissance par les LT CD8 effecteurs 91. L’IFN-γ peut également avoir un effet

angiostatique, limitant l’angiogenèse nécessaire à la progression tumorale. Cet effet

s’explique en partie par la capacité de l’IFN-γ à induire la production de la chimiokine

angiostatique CXCL10 94. Cette chimiokine limite l’angiogenèse par un mécanisme

impliquant notamment l’apoptose des cellules endothéliales exprimant CXCR3 95 96. Il est

intéressant de noter que CXCL10 et CXCL9, cette dernière étant également induite par l’IFN-

γ, permettent le recrutement de LT activés CXCR3+ 97. L’effet anti-tumoral de l’IFN-γ peut

également passer par son action positive sur la différenciation des LT Th1. En effet, l’IFN-γ

peut favoriser la production d’IL-12 par les cellules dendritiques tout en augmentant

l’expression de l’IL-12Rβ sur les LT CD4 98. Quelques études mettent aussi en évidence le

rôle de l’IFN-γ dans l’activation des LT CD8 in vivo 99. L’IFN-γ peut aussi activer les

cellules NK ou les macrophages, en augmentant par exemple, l’expression de molécules

cytotoxiques, comme TRAIL 98. Enfin, il est intéressant de noter que dans certains cas, l’IFN-

γ peut avoir un effet pro-tumoral. Ceci a notamment été montré dans un modèle murin de

cancer cutané induit par un traitement DMBA/TPA, dans lequel l’IFN-γ favorise une

inflammation pro-tumorale de nature Th17 100. De même, l’IFN-γ peut induire l’apoptose de

LT CD4 induits par un protocole d’immunothérapie anti-cancéreuse, et avoir ainsi un effet

inhibiteur des réponses anti-tumorales à long terme 101. D’autres cytokines très importantes

pour les réponses anti-tumorales naturelles sont les IFN-α et β 102. L’IFN de type I peut être

produit aussi bien par des cellules immunitaires que par toute autre cellule en réponse à des

signaux TLR, impliquant par exemple une infection virale. Dans un contexte tumoral, l’IFN-

α/β semble particulièrement important pour son action sur les cellules immunitaires 103.

Ainsi, il est capable d’agir sur les cellules dendritiques pour faciliter la présentation croisée

29

des antigènes104 ainsi que la genèse de réponses humorales 105. De plus l’IFN-α/β augmente la

survie des LT activés 106 et favorise l’expression de TRAIL sur les cellules NK 107. De plus,

l’IFN-α/β peut aussi avoir un effet angiostatique, en limitant entre autres, la motilité des

cellules endothéliales 108. Il est important de noter que l’IFN-α/β est utilisé en clinique pour le

traitement de différents cancers tels que les leucémies et les mélanomes 103.

Les réponses cellulaires de type Th1/Tc1 sont donc particulièrement efficaces pour

limiter le développement de tumeurs. Bien que peut être moins importantes dans un contexte

d’immunité anti-tumorale naturelle, il est intéressant de noter que les réponses humorales

peuvent être très efficaces dans un contexte thérapeutique. Ceci est appuyé par le succès des

immunothérapies anti-cancéreuses basées sur l’utilisation d’anticorps monoclonaux, comme

l’anti-CD20 ou rituximab, utilisé dans le traitement de lymphomes 109.

2.1.2.4 Signaux de danger et immunogénicité des tumeurs

Le développement de certaines tumeurs s’accompagne donc du développement de

réponses immunitaires spécifiques. Ceci indique que des signaux de danger inflammatoires

peuvent alerter le système immunitaire dans un contexte tumoral. Ceci est notamment le cas

de cancers induits par des agents pathogènes, dont l’incidence est nettement augmentée dans

des cas d’immunodéficiences chez l’Homme. Par ailleurs, des signaux de danger endogènes,

tels qu’HMGB1 ou certaines protéines S100 sont sur-exprimés dans différents types de

cancer humains 110. Ces signaux de danger pourraient être libérés par les cellules nécrotiques

présentes dans les zones hypoxiques de certaines tumeurs solides chez l’Homme 111 112. Dans

certains cas, ces signaux de danger pourraient favoriser une rupture de tolérance. Dans le

psoriasis par exemple, le peptide anti-microbien LL37 sécrété par les cellules épithéliales a

été impliqué dans la rupture de tolérance, grâce à sa capacité à rendre l’ADN endogène libéré

par les cellules mourantes capable de stimuler les pDC par l’intermédiaire du TLR9 113. Nous

pouvons imaginer un scénario similaire dans un contexte tumoral, d’autant plus qu’une sur-

expression de LL37 a été mise en évidence dans des tumeurs de l’ovaire, du sein, du poumon

et de l’estomac chez l’Homme 114. Une étude chez la souris a également montré que le taux

d’acide urique présent dans la tumeur était associé au développement de réponses

immunitaires anti-tumorales 115. En plus de la nature et de la quantité des antigènes, le taux de

signaux de danger présent dans la tumeur pourrait être un facteur important dans l’induction

d’une tolérance ou d’une immunité anti-tumorale (Figure 5).

30

signaux de danger

antigène

Tumeur Ganglion drainant

Figure 5 : Importance des signaux de danger dans les relations entre système immunitaires adaptatif et tumeur (d’après Spiotto MT, Curent Opin Immunol, 2003 38).

31

2.2 Environnement tumoral et immunosuppression

2.2.1 Signaux de danger, inflammation et progression tumorale

Comme nous venons de le voir, une tumeur peut être ignorée par le système

immunitaire adaptatif ou induire un état de tolérance immunitaire. Dans certains cas, la

présence de signaux de danger exogènes ou endogènes favorise le développement d’une

réponse immunitaire anti-tumorale efficace. Cependant, beaucoup d’études ont montré qu’un

taux important de nécrose tumorale, à l’origine de signaux de danger endogènes, était corrélé

à un mauvais pronostic. Ceci a par exemple été montré chez l’Homme, dans des cancers

pulmonaires 116, gastro-intestinaux 112, ainsi que dans les cancers du sein 117. La nécrose

cellulaire dans les tumeurs peut résulter d’une privation métabolique des cellules se trouvant

dans les zones hypoxiques 117. Par ailleurs, le niveau d’expression du signal de danger

HMGB1 et de son récepteur RAGE dans des tumeurs de la prostate et du colon chez

l’Homme a été associé à un mauvais pronostic 118 119. De même, certaines protéines S100,

constituant d’autres signaux de danger endogènes, sont sur-exprimées dans de nombreux

cancers chez l’Homme, incluant les cancers du sein, du poumon et de la prostate 120. Enfin,

des études chez la souris ainsi que des polymorphismes chez l’Homme indiquent que les TLR

peuvent favoriser la progression tumorale 121.

Ainsi, la présence de signaux de danger dans la tumeur n’est pas toujours associée à

l’induction d’une réponse anti-tumorale spécifique, celle-ci dépendant également de

caractéristiques antigéniques. En revanche, la présence de signaux de danger est à l’origine

d’une réaction inflammatoire, caractérisée par le recrutement de leucocytes dans les tissus et

par la production de différents médiateurs solubles. Les relations entre inflammation et cancer

sont complexes. Des états d’inflammation chronique sont associés au développement de

cancers 122 123 124 et à l’inverse, la progression tumorale s’accompagne souvent du

développement d’une composante inflammatoire 125. Historiquement, la présence d’infiltrat

leucocytaire dans des tumeurs solides humaines a été mise en évidence par Rudolph Virchow

en 1863. Des études ultérieures ont montré que dans certains cas, cette inflammation tumorale

ressemblait au processus physiologique de cicatrisation 126, et était donc plus tournée vers la

préservation du tissu tumoral que vers sa destruction, une dichotomie simplificatrice que nous

avons évoquée en première partie. En effet, les processus qui contribuent à la réparation et à

la régénération tissulaires, tels que la production de facteurs de croissance, l’induction de la

32

migration cellulaire, l’angiogenèse et la résistance à l’apoptose peuvent favoriser la

progression tumorale 127. Des signatures génétiques caractéristiques du processus de

cicatrisation ont été identifiées dans des tumeurs humaines et sont souvent associées à un

mauvais pronostic 128. Contrairement au processus de réparation tissulaire physiologique qui

est transitoire, la progression tumorale pourrait être caractérisée par des cycles sans fin de

nécrose et de réparation tissulaire, évoquant l’idée que la mort cellulaire pourrait être un

moteur de la croissance tumorale 129 (Figure 6).

Tissu réparéDommages tissulaires, nécrose tumorale

Programme de réparation tissulaire

Progression tumorale

TLR / N

LR

Figure 6 : La progression tumorale : une cicatrisation sans fin ? 130 Schéma théorique des relations entre réparation tissulaire et progression tumorale (d’après Rakoff-Nahoum S, Nat Rev Cancer, 2009 121).

Les processus physiologiques de réparation tissulaire sont souvent associés à une

immunosuppression 131. Dans cette partie, nous allons décrire certains acteurs immunitaires

de l’inflammation pro-tumorale, et décrire quelques mécanismes d’immunosuppression liés à

l’environnement tumoral.

33

2.2.2 Les principales cellules immunosuppressives associées à la

progression tumorale

2.2.2.1 Les macrophages

Les macrophages sont très souvent les cellules immunitaires les plus fréquentes parmi

l’infiltrat leucocytaire des tumeurs solides. Ils sont présents dans une diversité de cancers

chez l’Homme, dont les cancers du colon, les mélanomes, les cancers du rein, du poumon, de

l’ovaire et du sein 132. Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) se différencient à partir

des monocytes du sang et sont attirés dans les tissus tumoraux par des chimiokines ou des

cytokines. Parmi celles-ci, CCL2 (MCP-1) et CSF-1 (M-CSF), qui se lient à CCR2 et à M-

CSFR respectivement, sont les plus fréquentes. Dans le cancer du sein, les niveaux

d’expression de MCP-1 et de CSF-1 dans les tumeurs ont été corrélés au nombre de TAM 133 134. De nombreuses études, notamment dans les cancers du sein, du col de l’utérus et de la

vessie, ont montré que le degré d’infiltration des tumeurs par les TAM était corrélé à un

mauvais pronostic. Il est cependant important de noter que d’autres études, concernant les

cancers de l’estomac par exemple, ont donné le résultat opposé 135. Les macrophages activés

avec du LPS par exemple peuvent présenter des fonctions cytotoxiques contre les cellules

tumorales. En revanche, l’étude des macrophages infiltrant les tumeurs a montré que très

souvent, ceux-ci présentent un phénotype pro-tumoral 136. Les TAM ont une faible activité

cytotoxique anti-tumorale et sont de faibles cellules présentatrices d’antigène. Les

macrophages tumoraux ne sécrètent pas beaucoup de molécules pro-inflammatoires comme

l’IL-1β, l’IL-6 ou le TNF-α, ce qui est en relation avec la faible activité du facteur de

transcription NFκB dans ces cellules 137. De même, l’expression de molécules oxydées de

l’oxygène ou de l’azote est faible dans les macrophages tumoraux 138. En revanche, les TAM

sécrètent des molécules anti-inflammatoires, comme l’IL-10 et le TGF-β, qui inhibent les

réponses Th1 anti-tumorales 139. Les TAM ressemblent donc aux macrophages anti-

inflammatoires de type « M2 », impliqués dans la cicatrisation et le remodelage tissulaire. Les

TAM, concentrés au niveau des zones hypoxiques des tumeurs, favorisent l’angiogenèse, ce

qui a été associé à un mauvais pronostic dans le cancer du sein 140. De même, les TAM

favorisent la survie des cellules tumorales, leur prolifération et leur migration, notamment par

la sécrétion de facteurs de croissance (ex : FGF, EGF) et de dégradation de la matrice extra-

cellulaire (MMP) 137. Les TAM sont donc fortement impliqués dans le phénomène de

perpétuelle cicatrisation qui caractérise certaines tumeurs 130.

34

2.2.2.2 Les cellules myéloïdes immatures

La progression tumorale peut s’accompagner de l’accumulation de cellules myéloïdes

immatures dans le sang des patients. Ces cellules ne sont pas des cellules dendritiques

fonctionnelles, comme l’atteste leur faible capacité à présenter les antigènes et à stimuler des

LT 141. L’accumulation de ces cellules dans le sang périphérique est associée à la progression

tumorale 141. En effet, des patientes atteintes de cancer du sein métastatique présentent

davantage de cellules myéloïdes immatures que les patientes atteintes de cancer non

métastatique. La présence de VEGF (vascular endothelial growth factor) dans le sang des

patients a été associée à l’accumulation des cellules myéloïdes immatures 142. Des études in

vitro ont montré que le VEGF pouvait inhiber la différenciation des cellules dendritiques à

partir de progéniteurs médullaires 143. L’étude ultérieure de ces cellules myéloïdes a révélé

qu’il s’agissait d’un mélange hétérogène de cellules hématopoïétiques plus ou moins

différenciées. Une partie d’entre elles sont des macrophages et des cellules dendritiques

immatures, d’autres sont des cellules à des stades plus précoces de la différenciation

myéloïde. Ces cellules sont directement capables d’inhiber la stimulation antigénique de LT

CD8 in vitro 144. Chez la souris, une population hétérogène de cellules myéloïdes immatures

immunosupressives (MDSC) s’accumulant dans les organes lymphatiques de souris porteuses

de tumeurs a été mise en évidence 145. Ces cellules sont définies par l’expression des

marqueurs CD11b et Gr1 et comprennent des précurseurs de macrophages, de cellules

dendritiques et de neutrophiles. Les MDSC inhibent l’activation des LT par des mécanismes

impliquant le contact cellulaire direct ou la sécrétion de facteurs solubles tels que des espèces

oxydantes toxiques (H2O2, NO).

2.2.2.3 Les LT régulateurs

Chez les patients, la progression tumorale peut être associée à l’accumulation de LT

CD4 régulateurs (Treg), exprimant le facteur de transcription FoxP3. Ceci a par exemple été

montré dans les cancers du poumon, du pancréas et du sein 146 147. La fréquence de Treg

infiltrant les tumeurs a été corrélée à un mauvais pronostic dans les cancers de l’ovaire, du

sein et du foie 148 149. Chez les patients atteints de cancer de l’ovaire, des Treg CD3+ CD4+

CD25+ sont présents dans l’ascite et dans la tumeur, en proportion plus importante dans les

stades avancés de la maladie 150. Les auteurs ont montré que les Treg ne s’accumulaient pas

beaucoup dans les ganglions drainant la tumeur et étaient directement attirés à la tumeur par

35

la chimiokine CCL22, sécrétée par les macrophages de l’ascite et les cellules tumorales

(Figure 7). L’étude fonctionnelle de ces Treg a montré qu’ils étaient capables d’inhiber

l’activation de LT autologues spécifiques des antigènes tumoraux. En plus des Treg CD4+

CD25+, des Treg de type Tr1, sécréteurs d’IL-10, infiltrent les lymphomes Hodgkiniens 151.

Ces cellules inhibent les réponses antigéniques des autres lymphocytes de la tumeur. Des LT

Tr1 peuvent être induits par des cellules dendritiques produisant de l’IL-10 en présence de

lysat de cellules de myélome multiple 152.

2.2.3 Les déficits immunitaires associés à la progression tumorale

2.2.3.1 Déficits numériques et fonctionnels des cellules dendritiques

au cours de la progression tumorale

Les cellules dendritiques sont des cellules de l’immunité innée qui peuvent induire

une réponse immunitaire spécifique. L’activation des cellules dendritiques stimule

l’apprêtement et la présentation des antigènes, l’expression de molécules de co-stimulation

(ex : CD80, CD86, CD40) et la sécrétion de cytokines polarisantes (ex : IL-12, IL-23), trois

signaux nécessaires pour la stimulation de LT naïfs 153. Chez les patients atteints de cancer, il

est fréquent d’observer une diminution du nombre total de cellules dendritiques. Ceci a par

exemple été mis en évidence dans le sang périphérique de patients atteints de cancer du sein,

du poumon, de la tête et du cou, de la prostate ou de gliome 154 141. Le déficit numérique en

cellules dendritiques est associé à la progression tumorale. Une étude a en effet montré que

les patients atteints de stades tardifs (stades 3 et 4) de cancers de la tête et du cou présentaient

deux fois moins de cellules dendritiques que les sujets atteints de stades précoces de la

maladie (stades 1 et 2) 142. Des déficits fonctionnels sont également observés au niveau des

cellules dendritiques infiltrant les tumeurs. Dans les tumeurs du rein chez l’Homme, les

cellules dendritiques ne représentent que 10% de l’infiltrat leucocytaire. La grande majorité

de ces cellules (90%) expriment faiblement les molécules de co-stimulation et ne sont pas

capables de stimuler des LT allogéniques 63. Dans certains cas, les cellules dendritiques

situées au centre de la masse tumorale sont moins matures et moins fonctionnelles que les

cellules localisées dans les zones péri-tumorales 64. De plus, certaines études ont montré que

la résection chirurgicale de la tumeur permettait la restauration partielle des fonctions des

cellules dendritiques 154. Ces observations suggèrent que la tumeur a un rôle actif dans

36

l’inhibition des fonctions des cellules dendritiques. Une étude sur le mélanome a en effet

montré que la sécrétion d’IL-10 par les cellules tumorales était associée à la présence de

cellules dendritiques tolérogènes dans les lésions métastatiques en progression 155. De même,

de nombreuses tumeurs sur-expriment l’enzyme COX-2 qui catalyse la formation de

prostaglandine E2. Ce facteur favorise la production d’IL-10 par les cellules dendritiques et

diminue leur production d’IL-12. Ces cellules dendritiques tolérogènes stimulent la

différentiation des LT CD4 en Treg de type Tr1, qui produisent de IL-10 et du TGF-β 156. En

plus de son rôle dans la néoangiogenèse tumorale, le VEGF sécrété par les cellules tumorales

a été impliqué dans l’induction de l’expression de la molécule inhibitrice B7-H1 par les

cellules dendritiques myéloïdes chez les patientes atteintes de cancer de l’ovaire 157 (Figure

7).

2.2.3.2 Inhibition de la phase effectrice des LT anti-tumoraux

En plus de perturber les fonctions activatrices des cellules dendritiques,

l’environnement tumoral peut inhiber la phase effectrice des réponses anti-tumorales

spécifiques. Par exemple, le TGF-β sécrété par différentes cellules de l’environnement

tumoral (TAM, Treg), inhibe les fonctions effectrices des LT chez l’Homme 158. La présence

de TGF-β dans le sérum de patients atteints de cancers de la prostate, de l’estomac ou de la

vessie a été corrélée à un mauvais pronostic 159. De même, beaucoup de tumeurs humaines

expriment la forme sous-glycosylée de la protéine MUC1, qui inhibe de manière réversible la

prolifération des LT humains 160. L’enzyme IDO catalyse le catabolisme du tryptophane et est

exprimée au niveau tumoral dans de nombreux cancers humains, dont les cancers de la

prostate, du colon, du pancréas, du poumon et de la vessie 161. Exprimée également au niveau

de la barrière placentaire, cette enzyme protège les tissus de l’attaque par les LT effecteurs,

probablement par un mécanisme impliquant la déplétion en tryptophane 162. Dans certains

cas, les cellules tumorales peuvent directement induire l’apoptose des LT effecteurs. Plusieurs

molécules exprimées par les cellules tumorales ont été impliquées, comme par exemple, B7-

H1, FasL, RANTES, RCAS1, TRAIL ou CD70 163 164 165 166 167 168 (Figure 7).

Dans certains cas, les tumeurs qui se développent sont caractérisées par une plus faible

antigénicité, c'est-à-dire une capacité amoindrie d’être reconnue par les effecteurs de

l’immunité adaptative. Un des mécanismes les plus rapporté est la faible expression des

molécules de CMH de classe 1 (CMH I) à la surface des cellules tumorales. Ceci a été décrit

37

pour une grande variété de cancers chez l’Homme, dont les cancers du sein, de la prostate, du

poumon et du colon 169. La fréquence des tumeurs sous-exprimant les molécules de CMH I

peut atteindre 96% et 87% dans les cancers du sein et du colon respectivement 170 171.

Certaines études ont montré une corrélation entre la perte de CMH I par les cellules tumorales

et l’agressivité des tumeurs 172. Ceci n’est cependant pas généralisable 173 et il arrive que le

niveau d’expression de CMH I sur la tumeur soit positivement corrélé à un mauvais pronostic

malgré la présence d’un infiltrat lymphocytaire plus important 174. La perte d’expression de

CMH I sur des tumeurs viro-induites, comme celles du col de l’utérus par exemple, est en

revanche très souvent associée à une progression tumorale avec invasion ganglionnaire 175. La

diminution de l’expression des molécules de CMH I devrait rendre les cellules tumorales plus

sensibles à la lyse par les cellules NK. Dans certaines situations, les tumeurs peuvent aussi

présenter une faible expression des ligands de récepteurs activateurs des cellules NK 176.

Enfin, l’instabilité génétique des cellules tumorales peut être à l’origine de la perte ou de la

modification du niveau d’expression de certains antigènes tumoraux 177.

Figure 7 : Exemples de mécanismes immunosuppresseurs induits par les cellules tumorales (d’après Rabinovich GA, Ann Rev Immunol, 2007 65).

38


Dans certains cas, la naissance d’une tumeur semble être ignorée ou tolérée par le

système immunitaire adaptatif. Ces états immunitaires pourraient s’expliquer par des

caractéristiques antigéniques, ainsi que par le manque de signaux de danger dans

l’environnement tumoral. Dans d’autres cas en revanche, des réponses anti-tumorales peuvent

se développer. Ceci est notamment illustré par la présence de réponses humorales et

cellulaires spécifiques à des stades très précoces voire infra-cliniques de certains cancers.

L’efficacité de ces réponses est cependant limitée par l’apparition de mécanismes

immunosuppresseurs, liés à la présence d’un environnement inflammatoire pro-tumoral

associé à de nombreuses tumeurs solides. Cette inflammation est entretenue par la libération

chronique d’une faible quantité de signaux de danger par les cellules tumorales nécrotiques.

Dans ce contexte, nous allons maintenant discuter les moyens thérapeutiques ayant pour

objectif de restaurer une réponse immunitaire anti-tumorale efficace. Deux mécanismes

principaux vont être discutés : 1) l’utilisation de molécules adjuvantes mimant les signaux de

dangers faisant défaut dans la tumeur ; 2) l’utilisation de thérapies conventionnelles, telles

que la chimiothérapie et la radiothérapie, visant à dévier la réponse inflammatoire « pro-

tumorale » vers un profil « anti-tumoral ».

39

3 Les solutions thérapeutiques pour activer des réponses immunitaires anti-tumorales

efficaces

3.1 L’utilisation de ligands de TLR en immunothérapie anti-cancéreuse

Au début du 20ème siècle, le chirurgien William Coley observa des réponses anti-

tumorales importantes en administrant à ses patients un mélange d’extrait de deux bactéries :

Streptococcus pyogenes et Serratia marcasens, une bactérie à gram négatif. Des études

ultérieures montrèrent que le LPS, composant de la paroi des bactéries à gram négatif,

pouvait entrainer une régression tumorale dans des modèles animaux. Bien que controversés,

les travaux de W. Coley ont inspiré les thérapies cancéreuses actuelles basées sur l’utilisation

de ligands de TLR. Ces ligands sont utilisés et/ou évalués en monothérapies ou en tant

qu’adjuvant dans des protocoles de vaccination.

3.1.1 Les ligands de TLR comme monothérapies anti-cancéreuses

Les ligands de certains TLR, comme les TLR-2, -4, -7, -8 et -9, peuvent présenter des

activités immunostimulantes anti-tumorales. Deux traitements s’appuyant sur ces propriétés,

le BCG et l’imiquimode, sont actuellement utilisés en clinique.

Le BCG est un mélange de souches de Mycobacterium bovis atténuées, utilisé dans le

traitement des carcinomes de la vessie in situ et des cancers superficiels de la vessie. Le BCG

contient des ligands de TLR-2, -4 et -9 et est injecté localement dans la vessie 178. Ce

traitement présente une efficacité thérapeutique supérieure à celle des chimiothérapies

conventionnelles, comme l’épirubicine ou l’adriamycine 179. En effet, sur un ensemble

d’environ 300 patients dans chaque groupe, 68% de ceux traités par le BCG présentent une

réponse complète, contre 52% pour les patients ayant reçu une chimiothérapie. De même, le

suivi des patients sur 3,6 ans en moyenne a montré que 47% de ceux ayant reçu le BCG ne

rechutaient pas, contre 26% dans les cas de traitement par chimiothérapie. Le BCG peut aussi

être efficace dans les cancers de la peau comme le mélanome 180. Bien que le BCG puisse

directement inhiber la prolifération de lignées tumorales in vitro 181, l’efficacité de ce

traitement repose surtout sur l’induction de réponses immunitaires. Le traitement par le BCG

induit une réaction inflammatoire locale impliquant le recrutement de neutrophiles, de

monocytes et de lymphocytes 182. Les cellules immunitaires infiltrant la tumeur expriment des

40

molécules d’activation telles que HLA-DR, CD25 et ICAM1 et restent dans le tissu tumoral

plusieurs mois après l’arrêt du traitement 183. Le BCG induit l’expression de cytokines

inflammatoires détectables dans les urines. Le taux de certaines cytokines comme l’IL-2, le

TNF-α, l’IL-6, l’IL-8 et l’IL-10 est corrélé à la réponse clinique. Parmi celles-ci le taux d’IL-

2 est un facteur indépendant de prédiction de réponse au traitement 184. Suite au traitement,

des LT spécifiques des antigènes du BCG peuvent être détectés dans le tissu tumoral des

patients 185. In vitro, des composants du BCG induisent la maturation des cellules

dendritiques humaines, ce qui pourrait expliquer l’effet observé sur les réponses spécifiques

in vivo 178. De plus, des études sur PBMC isolés ont montré que le BCG pouvait stimuler les

fonctions cytotoxiques anti-tumorales des cellules NK par un mécanisme impliquant la

production d’IFN-γ 186. Des études chez la souris ont en effet montré que l’efficacité

thérapeutique du BCG dépendait de la présence de LT CD4, CD8 et des cellules NK 182. Plus

récemment, il a été montré que le recrutement précoce de neutrophiles, phénomène crucial

pour l’efficacité thérapeutique du BCG, était dépendant de la production d’IL-17 par les

LTγδ 187.

L’imiquimode est un agoniste synthétique du TLR7. Il est actuellement utilisé en

clinique contre les cancers de la peau basocellulaire, ainsi que pour traiter les lésions pré-

cancéreuses de type kératose actinique 188 189 190. En plus de pouvoir présenter un effet

cytotoxique direct sur les cellules tumorales cutanées, l’imiquimode induit une réponse

immunitaire anti-tumorale 191. En effet, l’infiltrat immunitaire présent dans les tumeurs après

traitement est enrichi en LT CD4 et CD8, en cellules cytotoxiques exprimant le granzyme B,

et en pDC 192. Le traitement induit également une diminution du nombre de Treg 193. Le BCG

et l’imiquimode sont des traitements essentiellement locaux, peu adaptés à une injection

systémique. Récemment, un nouvel agoniste du TLR7, le « 852A », injectable en intra-

veineux a montré une efficacité dans la stabilisation de mélanomes métastatiques 194. De

l’IFN de type 1, de l’IP10 et des monocytes activés (CD86+) sont retrouvés dans le sang des

patients traités, ce qui reflète l’activation des pDC par cet agoniste 195. De nos jours, les

recherches se portent sur des traitements combinant des agonistes des TLR-7 et -8. Alors que

les ligands de TLR7 activent les pDC pour la production d’IFN de type 1, les ligands de

TLR8 stimulent la production de cytokines inflammatoires (TNF-α, IL-12, MIP-1) par les

cellules dendritiques myéloïdes et les monocytes 196. De plus, en agissant directement sur le

TLR8 exprimé par les Treg humains, ces agonistes sont capables d’inhiber la fonction

régulatrice de ces cellules 197.

41

Des agonistes du TLR9, administrés de manière systémique, sont également

développés. La molécule « PF-3512676 » a montré une efficacité dans les cancers

hématologiques (lymphomes T cutanés, lymphomes non Hodgkiniens) et les cancers de la

peau dont les mélanomes 198. Chez l’Homme, le TLR9 est notamment exprimé sur les pDC et

sur les LB. Après un traitement local par PF-3512676, les patients présentent des cytokines

inflammatoires dans leur sérum, telles que l’IL-6, l’IL-12p40, l’IP10 et le TNF-α, ainsi qu’un

infiltrat immunitaire variable au niveau des lésions cancéreuses 199. Administré après une

résection chirurgicale, PF-3512676 diminue le nombre de Treg dans le ganglion sentinel chez

les patients atteints de mélanomes 200. In vitro, la sécrétion d’IFN-α induite par le CpG active

les LT CD8 et les cellules NK 201. Ceci est en accord avec la corrélation de l’efficacité

thérapeutique de PF-3512676 avec le niveau d’activation des cellules NK dans le sang de

patients atteints de mélanome 202. Enfin, les agonistes du TLR3, le poly I:C et son analogue

plus stable le poly ICLC, ont été testés dans les gliomes de l’adulte et dans les cancers du rein

sans grande efficacité thérapeutique 203 204.

3.1.2 Les ligands de TLR comme adjuvants dans les protocoles de

vaccination anti-tumorale

En plus d’être utilisés en tant que monothérapie, les agonistes de TLR peuvent aussi

servir d’adjuvants dans les protocoles de vaccination. Les agonistes des TLR-2, -4, -7 et -9

sont particulièrement étudiés. Différents protocoles de vaccination combinant des ligands de

TLR et des antigènes tumoraux sous forme de cellules entières ou de molécules isolées (NY-

ESO-1, Melan-A, STn) ont permis d’induire des réponses anti-tumorales spécifiques, à la fois

humorales et cellulaires (Tableau 6). Parmi les adjuvants testés, figurent le BCG,

l’imiquimode, le CpG et un mélange de ligands du TLR4, le DETOX. Dans certains cas,

l’intensité des réponses immunitaires induites a été corrélée à la réponse clinique. Ceci a été

montré dans une étude de vaccination avec des cellules tumorales allogéniques de mélanome

utilisant le DETOX comme adjuvant. Tous les patients présentant une réponse clinique ont

développé des réponses anti-tumorales cytotoxiques, alors que ceci n’a été le cas pour aucun

des patients en progression clinique 205.

42

Adjuvant Cancer Vaccin Résultats cliniques et/ou immunitaires

BCG carcinome urothélial exprimant NY-ESO-1 NY-ESO-1 + GM-CSF

réponses humorales et cellulaires (CD4) spécifiques chez 80-100 % des patients

(TLR-2, -4, -9) colorectal (stade II) cellules tumorales autologues après

chirurgie ↑ survie sans rechute

DETOX sein STn-KLH réponses humorales spécifiques (IgM et IgG) chez tous les patients

(TLR4) ovaire, sein

STn-KLH après greffe de cellules souches

autologues

• ↑ survie et ↓ risque de rechute

• réponses cytotoxiques spécifiques corrélées aux réponses cliniques

mélanome lysat de cellules tumorales allogéniques

• réponses cytotoxiques spécifiques pour 50% des patients • association entre les réponses cytotoxiques et les réponses cliniques

Imiquimode mélanome NY-ESO-1

réponses humorales et cellulaires CD4 spécifiques pour 77 % des patients (TLR7)

CpG 7909 tumeurs exprimant

NY-ESO-1 NY-ESO-1 + montanide

• réponses humorales et cellulaires CD4 précoces pour 90-100 % des patients

(TLR9) • réponses cellulaires spécifiques tardives pour 50 % des patients

mélanome Melan-A

réponses cellulaires cytotoxiques spécifiques rapides chez 100 % des patients (10 x plus importantes que sans adjuvant)

Tableau 6 : Exemple d’utilisation de ligands de TLR comme adjuvants dans des protocoles de vaccinations anti-cancéreuses (d’après Adams S, Immunotherapy, 2009 206).

Les ligands de TLR, comme le LPS, sont aussi utilisés pour activer les cellules

dendritiques in vitro avant leur injection aux patients dans des protocoles de vaccination 207.

Enfin, ces agonistes sont aussi efficaces en combinaison avec des thérapies anti-cancéreuses

cytotoxiques conventionelles (chimiothérapie, radiothérapie) ou ciblées (ex : rituximab) ou

avec d’autres immunothérapies (ex : l’IL-2).

Ainsi, quelques ligands de TLR utilisés en monothérapies peuvent présenter une

efficacité thérapeutique supérieure à celle des traitements conventionnels. Ces

immunothérapies s’appliquent pour l’instant à un nombre limité de cancers. De même, des

réponses anti-tumorales peuvent être détectées suite à l’administration d’un vaccin utilisant

des ligands de TLR comme adjuvant. Cependant, les succès thérapeutiques sont globalement

43

rares 208. Alors que des études pré-cliniques chez la souris donnent des résultats satisfaisant,

leur application à l’Homme est parfois limitée par les différences entre les deux espèces,

notamment en ce qui concerne la nature des cellules exprimant les différents TLR 209.

3.2 Effets immunostimulants des thérapies anti-cancéreuses conventionnelles

En parallèle des immunothérapies spécifiques, des travaux des 10 dernières années

indiquent que des thérapeutiques anti-tumorales dites conventionnelles ont également la

capacité d’activer le système immunitaire et d’agir comme immunostimulants ou

immunomodulateurs. Dans cette partie, nous allons passer en revue certains de ces

mécanismes qui concernent différentes phases des réponses immunitaires en insistant sur leur

mode d’action, afin de guider leur combinaison rationnelle à d’autres stratégies.

3.2.1 Effets immunostimulant des thérapies anti-cancéreuses

conventionnelles sur la phase effectrice des réponses anti-tumorales

3.2.1.1 Présentation des thérapies conventionnelles anti-cancéreuses

Avec la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie sont les principales thérapies

anti-cancéreuses actuelles. Les chimiothérapies utilisées agissent sur des mécanismes

généraux de la fonction de réplication cellulaire, notamment en inhibant le métabolisme de

l’ADN ou en perturbant celui des microtubules (Tableau 7). De même, le principe d’action

général de la radiothérapie est l’introduction de cassures double brins dans l’ADN. Ces

thérapies visent donc à induire directement la mort ou la sénescence des cellules tumorales,

en endommageant leur ADN de manière irréversible. Bien que tuant préférentiellement les

cellules tumorales, ces agents induisent aussi la mort de cellules ayant un fort taux de

prolifération autre que les cellules tumorales. Au vu de la forte toxicité des chimiothérapies,

des thérapies ciblées se sont développées. Parmi celles-ci on compte par exemple les

inhibiteurs de tyrosine kinase (imatinib, sorafenib, sunitinib) ainsi que des molécules dirigées

contre d’autres cibles tumorales comme le facteur de transcription mTOR (Everolimus,

Temsorilimus).

44

Mécanismes d'action Exemples

modification de la structure de l'ADN

formation de liaisons covalentes avec l'ADN

agents alkylants : cyclophosphamide, melphalan, ifosfamide, busulfan,

carmustine

sels de platine : cisplatine, oxaliplatine, carboplatine

cassure de l'ADN bléomycine

radiation ionisante

agents intercalants anthracyclines (doxorubicine, daunorubicine)

inhibiteur de topoisomérases etoposide, irinotecan, topotecan

inhibition de la synthèse d'acides nucléiques anti-métabolites capecitabine, cytarabine, 5-FU,

floxuridine, gemcitabine, methotrexate

poison du fuseau mitotique

inhibition de la dépolymérisation des

microtubules taxanes : docetaxel, paclitaxel

destruction des microtubules "alcaloides de la pervenche" : vinblastine, vincristine, vinorelbine

Tableau 7 : Mécanismes d’action des principales thérapies anti-cancéreuses conventionnelles (chimiothérapies et radiothérapies).

Les cellules du système immunitaire se développent à partir de cellules souches de la

moëlle osseuse qui sont en perpétuelle division. De même, au cours d’une réponse

immunitaire, les lymphocytes prolifèrent. Ces cellules sont donc sensibles aux effets anti-

prolifératifs des traitements anti-cancéreux classiques. Les protocoles actuels sont souvent

très lourds, combinant plusieurs chimiothérapies au cours de plusieurs cycles de traitements.

Les patients ayant reçu de la chimiothérapie ou de la radiothérapie présentent très souvent une

neutropénie, une lymphopénie et une thrombocytopénie d’origine centrale 210. Certains agents

anti-cancéreux sont d’ailleurs utilisés comme traitements immunosupresseurs contre des

pathologies auto-immunes. Ceci est le cas du cyclophosphamide et du methotrexate utilisés

par exemple dans la sclérose en plaque et l’arthrite rhumatoide 211 212.

45

3.2.1.2 Effets immunostimulants de la lymphopénie induite par

certaines thérapies anti-cancéreuses conventionnelles

Le nombre de LT périphériques chez l’adulte est relativement constant au cours du

temps, phénomène que l’on appelle « homéostasie lymphocytaire ». A la fin de la réponse

immunitaire, les LT ayant proliféré suite à la stimulation antigénique meurent (phénomène de

« mort cellulaire induite par l’activation »), ce qui permet le retour du nombre de LT à la

normale. A l’inverse, lorsque le pool de lymphocytes diminue dans un contexte de

lymphopénie, les cellules restantes prolifèrent naturellement jusqu’à rétablir le nombre

adéquat de lymphocytes. Ce phénomène est appelé prolifération homéostatique. Il concerne à

la fois les lymphocytes mémoires et naïfs et dépend de la présence de certaines cytokines (IL-

7, IL-15) et de l’interaction avec des complexes peptides/CMH, surtout pour les LT naïfs 213.

Des études récentes ont cependant montré que dans un contexte de lymphopénie, des LT CD8

naïfs pouvaient proliférer indépendamment de signaux du TCR, dans un contexte cytokinique

inflammatoire 214. Les LT qui prolifèrent acquièrent des propriétés phénotypiques et

fonctionnelles de LT mémoires. Ils deviennent transitoirement plus sensibles à une

stimulation antigénique et y répondent en sécrétant de plus grandes quantités d’IFN-γ. De

plus, la prolifération homéostatique favorise les LT ayant une forte affinité pour les molécules

du soi, ce qui peut conduire au développement de maladies auto-immunes 215. La

lymphopénie transitoire induite par les traitements anti-cancéreux classiques offre une petite

fenêtre de temps durant laquelle une immunité anti-tumorale efficace peut naturellement se

développer. Ainsi, une étude chez la souris a montré qu’une irradiation lymphopéniante

diminuait la cinétique de croissance d’une tumeur implantée le jour suivant. Les auteurs ont

montré que cet effet était dû à l’activation de LT anti-tumoraux au cours de la prolifération

homéostatique et que cet effet dépendait de la présence d’antigène tumoraux dans le ganglion

drainant 216. Une autre étude a montré l’importance de la présence de l’antigène au moment

de la prolifération homéostatique pour l’activation transitoire de LT CD8 cytotoxiques 217.

Enfin, cet effet naturel peut servir à améliorer l’efficacité de protocoles d’immunothérapie

active (vaccins) ou passive (transfert adoptif de lymphocytes anti-tumoraux) 218 219.

46

3.2.1.3 Elimination sélective de populations immunosuppressives

par certaines thérapies conventionnelles

Le cyclophosphamide est un agent alkylant qui est très immunosuppresseur à fortes

doses. En revanche, à faibles doses, il inhibe les fonctions des Treg. Ces derniers sont en effet

plus sensibles que les autres LT CD4 à l’apoptose induite par le cyclophosphamide. De plus,

suite à l’administration de cyclophosphamide, les Treg présentent une diminution

d’expression de GITR et de Foxp3 et perdent une grande partie de leur fonction régulatrice.

Ces effets sont transitoires et réversibles 220. De même, le paclitaxel réduit le nombre et la

fonction régulatrice des Treg 221. La gemcitabine est un analogue de nucléoside pyrimidique

inhibitant la synthèse de l’ADN, à l’origine d’une neutropénie et d’une lymphopénie chez

l’Homme. La gemcitabine présente une toxicité sélective contre les MDSC de la rate de

souris porteuses de tumeurs 222. Ceci est également le cas du 5-fluorouracile 223. Le

cyclophosphamide et la gemcitabine sont tous les deux capables d’améliorer l’efficacité de

vaccins anti-tumoraux 224 225. Certaines thérapies agissent également sur les réponses Th1

anti-tumorales. La gemcitabine entraine la diminution du nombre de lymphocytes de la rate,

mais fait disparaitre sélectivement les LB, ce qui diminue les réponses humorales et favorise

les réponses cellulaires anti-tumorales 226.

3.2.1.4 Modulation de la reconnaissance des cellules tumorales par

les effecteurs immunitaires

Utilisés à des doses sous cytotoxiques, les agents anti-cancéreux conventionnels

peuvent induire différents stress cellulaires au niveau des cellules tumorales, favorisant leur

reconnaissance par le système immunitaire (Tableau 8). Ainsi, des cellules irradiées peuvent

sur-exprimer Fas et devenir plus sensibles à la lyse induite par FasL, exprimé sur les LT CD8.

Dans ce cas, la radiothérapie peut synergiser avec un vaccin anti-tumoral de manière

dépendante de l’interaction Fas / FasL 227. De plus, l’irradiation de cellules tumorales peut

augmenter leur répertoire antigénique selon trois mécanismes 228: 1) l’augmentation la

dégradation des protéines cyctoplasmiques, 2) la traduction de nouvelles protéines via le

facteur mTOR, et 3) l’apparition de nouvelles protéines. Les dommages de l’ADN induits par

des agents cytotoxiques (agents alkylants, irradiation) peuvent induire l’expression de ligands

de NKG2D, selon un mécanisme indépendant de p53, et favoriser la lyse des cellules

tumorales par les cellules NK, NKT, les LTγδ, et les LT CD8 229. De même, via l’activation

47

de p53, les dommages à l’ADN favorisent la sécrétion de cytokines et de chimiokines,

favorisant le recrutement de neutrophiles, de cellules NK et de macrophages anti-tumoraux

dans le lit tumoral 230. La migration des LT dans le lit tumoral est favorisée par l’induction de

CXCL16 par la tumeur irradiée et l’expression de VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule

1) sur les cellules endothéliales 231.

Effets sur les cellules tumorales Agent Mécanisme

↑ répertoire antigénique des cellules tumorales Irradiation (Reits EA)

↑dégradation protéique

↑ synthèse protéique (mTOR)

apparition de nouvelles protéines

↑ lyse par les LT paclitaxel, cisplatine,

doxorubicine ↑ récepteur au mannose-6-phosphate :↑

lyse par granzyme B 232 irradiation expression de Fas 227

↑ lyse par les cellules de l'immunité innée agents alkylants, irradiation ↑ ligands de NKG2D 229

attraction des effecteurs immunitaires

irradiation ↑ CXCL16 231 agents alkylants, irradiation ↑ IL-15 230

Tableau 8 : Effets positifs de certaines thérapies conventionnelles sur la reconnaissance des cellules tumorales par les effecteurs immunitaires.

3.2.2 Effets des thérapies conventionnelles sur la restauration du lien entre

immunité innée et immunité adaptative

Comme nous venons de le voir, certaines thérapies anti-cancéreuses conventionnelles

peuvent stimuler la phase effectrice des réponses anti-tumorales, en inhibant les cellules

immunosuppressives ou en favorisant la prolifération des LT spécifiques et la reconnaissance

des cellules tumorales par les effecteurs immunitaires. Nous allons maintenant décrire l’effet

des thérapies conventionnelles sur l’induction de réponses immunitaires anti-tumorales, par

des mécanismes impliquant une action directe sur les cellules dendritiques ou résultant de la

libération de signaux de danger.

48

3.2.2.1 Action directe des thérapies conventionnelles sur les cellules

présentatrices d’antigène

La progression tumorale peut s’accompagner d’une diminution du nombre de cellules

dendritiques et de l’induction de cellules dendritiques tolérogènes. Certaines chimiothérapies

peuvent induire la maturation des cellules dendritiques. Ainsi, l’effet de 54 chimiothérapies,

chacune à 5 concentrations différentes, a été étudié sur la maturation et la viabilité d’une

lignée de cellules dendritiques murines in vitro 233. Alors que certaines drogues n’exercent

que peu d’effet sur la maturation des cellules dendritiques, d’autres, et notamment la

vinblastine, s’avèrent très efficaces. In vivo, l’injection d’une faible dose de vinblastine dans

la tumeur favorise la maturation des cellules dendritiques locales et l’induction de réponses

CTL anti-tumorales efficaces 234. De même, de faibles doses de paclitaxel sur des cellules

dendritiques dérivées de la moëlle osseuse (BM-DC) induisent leur maturation in vitro

(CD40, CD86). In vivo, l’administration d’une seule petite dose de paclitaxel synergise avec

un vaccin anti-tumoral à base de cellules dendritiques dans un modèle de cancer du poumon

chez la souris 235 (Tableau 9).

Effets Exemples de drogue Mécanismes

↑ fonctions des cellules

dendritiques

vinblastine • ↑ maturation • ↑ réponses anti-tumorales CD8 234

paclitaxel • ↑ maturation • synergie avec un vaccin anti-tumoral à base de cellules dendritiques 235

stimulation des macrophages paclitaxel

• production de cytokines inflammatoires (TNF-α, NO et COX-2) 236 237

Tableau 9 : Effets immunostimulants de certaines thérapies anti-cancéreuses conventionnelles sur les fonctions des cellules présentatrices d’antigène (NO : oxyde nitrique ; COX-2 : cyclo-oxygénase 2).

Le Taxol (paclitaxel) peut induire la sécrétion de molécules pro-inflammatoires (TNF-

α, NO, COX-2) par les macrophages murins et les monocytes périphériques chez l’Homme 236 237 (Tableau 9). Chez la souris, le taxol peut directement se lier au TLR4 et induire une

signalisation via MyD88 238. De même, l’anti-angiogénique DMXAA active IRF-3 dans les

49

macrophages murins et induit fortement l’expression de l’ARNm de l’IFN-β, selon une voie

de signalisation différente de celles utilisées par la plupart des TLR 239.

3.2.2.2 Dommages tissulaires induits par les thérapies anti-

cancéreuses conventionnelles et stimulation du système immunitaire

Les thérapies anti-cancéreuses conventionnelles sont cytotoxiques et peuvent induire

des dommages tissulaires au niveau de la tumeur ou au niveau d’autres tissus ayant un taux de

prolifération important, comme l’épithélium intestinal. Suite à ces dommages, les cellules

peuvent libérer des réactifs toxiques de l’oxygène ou des cytokines à l’origine d’une

inflammation aigüe ou chronique, influençant la progression tumorale. La radiothérapie

locale à faible dose est utilisée pour le traitement de différentes pathologies malignes comme

les lymphomes folliculaires 240. En plus d’induire l’apoptose des cellules tumorales en

induisant des cassures dans leur ADN, l’irradiation peut avoir des effets sur les cellules non

directement irradiées. Les cellules au contact de la zone irradiée, comme les macrophages par

exemple, peuvent libérer des réactifs toxiques de l’oxygène, du NO, ou des cytokines

inflammatoires (TNF-α) 241. Cette inflammation peut représenter un stress génotoxique

potentiellement carcinogène pour les cellules à distance ou être à l’origine de complications

inflammatoires chroniques dans les tissus sains, comme la fibrose par exemple 242. En

revanche, une inflammation aigüe au niveau de la tumeur peut favoriser le développement de

réponses anti-tumorales. Ceci est illustré par l’observation rare d’une efficacité anti-tumorale

à distance de la zone irradiée (« effet abscopal »), concernant par exemple des métastases 243.

Des études chez la souris ont montré l’implication des systèmes immunitaires inné et

adaptatif dans cet effet. Ainsi, l’administration de Flt3L, facteur de croissance des cellules

dendritiques, ou de la chimiokines MIP-1α, potentialise fortement l’effet abscopal 244. De

même, des signaux inflammatoires libérés suite à une irradiation corps entier peuvent induire

une maturation des cellules dendritiques de la rate juste avant leur apoptose 245. Par ailleurs,

des équipes ont montré qu’une irradiation corporelle totale pouvait entrainer la destruction de

la barrière intestinale et la pénétration de bactéries commensales et de LPS dans l’organisme.

Ceci est à l’origine de la maturation des cellules dendritiques des organes lymphatiques et

augmente l’efficacité anti-tumorale de LT CD8 transférés, dans un contexte de lymphopénie 246. Enfin, la destruction tissulaire engendrée par certaines chimiothérapies anti-cancéreuses,

en libérant une grande quantité d’antigènes, peut favoriser la présentation croisée des

antigènes tumoraux et le développement de réponses CD8 spécifiques 225.

50

Ainsi, les modifications induites par les thérapies anti-cancéreuses conventionnelles

peuvent contribuer à remplacer l’inflammation chronique immunosuppressive en une

inflammation aigüe et immunogène.


L’activation de réponses immunitaires spécifiques est un enjeu important dans le

développement de solutions thérapeutiques anti-cancéreuses. En plus des immunothérapies

ciblées, visant spécifiquement des acteurs immunitaires comme les TLR, les thérapies anti-

tumorales conventionnelles, comme la chimiothérapie et la radiothérapie, permettent

également de moduler positivement les réponses immunitaires anti-cancéreuses. La

compréhension des mécanismes impliqués dans les effets immunostimulants de ces thérapies

est cruciale pour améliorer leur efficacité en les combinant par exemple à des agents

immunomodulateurs plus classiques.

51

4 Contexte d’étude et objectifs de la thèse

4.1 Les mécanismes moléculaires de l’immunogénicité de la mort cellulaire

induite par certaines thérapies anti-cancéreuses conventionnelles

La mort cellulaire induite par la plupart des thérapies anti-cancéreuses cytotoxiques

conventionnelles est une mort par apoptose. Contrairement à la nécrose, l’apoptose induit

l’expression de molécules qui permettent l’attraction des phagocytes (signaux « find me ») et

l’initiation de la phagocytose (signaux « eat me »). Ces signaux sont contre-balancés par des

molécules de répulsion des phagocytes inflammatoires, comme la lactoferrine et d’inhibition

de la phagocytose (signaux « don’t eat me »), comme CD47 par exemple. La phagocytose des

corps apoptotiques a longtemps été considérée comme un phénomène anti-inflammatoire. Par

exemple, la phosphaditylsérine, exprimée à la surface des cellules apoptotiques peut se lier à

son récepteur CD36 sur les phagocytes et induire la sécrétion d’IL-10 et de TGF-β par ce

dernier. Ceci est maintenant remis en question et certains signaux émis par les cellules

apoptotiques peuvent induire une inflammation et activer le phagocyte.

Plusieurs travaux du laboratoire ont mis en évidence la capacité de certaines

chimiothérapies anti-cancéreuses conventionnelles à induire une mort cellulaire immunogène,

c'est-à-dire capable d’induire une réponse immunitaire spécifique efficace. Parmi ces

chimiothérapies se trouvent les anthracyclines, comme la doxorubicine ou la mithoxanthrone,

et l’oxaliplatine. L’efficacité thérapeutique de ces chimiothérapies immunogènes est plus

faible chez les souris immunodéficientes que chez les animaux immunocompétents. Des

travaux successifs dans le laboratoire ont permis d’élucider quelques paramètres moléculaires

déterminant l’immunogénicité de la mort cellulaire induite par ces chimiothérapies. Ainsi, les

drogues immunogènes induisent l’expression de la calréticuline à la surface des cellules

tumorales mourantes 247. L’exposition précoce de la calréticuline est directement corrélée à la

capacité des cellules dendritiques à phagocyter les cellules tumorales mourantes (Figure 8).

L’induction de l’exposition de la calréticuline par des drogues immunogènes est un

phénomène rapide, dépendant ni de la transcription ni de la traduction. Ceci nécessite trois

modules de signalisation dans la cellule : un stress du réticulum endoplasmique, avec

phosphorylation du facteur eIF2a, un module apoptotique, impliquant la caspase 8, et un

module de transport antérograde du réticulum endoplasmique vers l’appareil de Golgi 248.

L’exposition précoce de la calréticuline par les cellules tumorales mourantes est un

52

évènement nécessaire à l’immunogénicité de la mort cellulaire induite par certaines

chimiothérapies. En effet, l’inhibition de l’exposition de la calréticuline par des siARN inhibe

l’immunogénicité des drogues immunogènes. A l’inverse, l’addition de calréticuline

recombinante permet de rendre immunogènes des chimiothérapies qui ne le sont pas, comme

la mitomycine C ou l’étoposide.

Bien que nécessaire pour l’immunogénicité de certaines chimiothérapies, l’exposition

précoce de la calréticuline sur les cellules mourantes n’est pas un facteur suffisant. En effet,

l’ajout de calréticuline recombinante sur des cellules vivantes ne les rend pas immunogènes.

Des travaux ultérieurs dans le laboratoire ont permis de mettre en évidence l’importance du

signal de danger HMGB1 dans l’apprêtement des antigènes tumoraux par les cellules

dendritiques 249 (Figure 8). HMGB1 est libéré par les cellules tumorales mourantes, se lie au

récepteur TLR4 et diminue la dégradation lysosomale du matériel phagocyté au niveau des

cellules dendritiques. L’efficacité thérapeutique des chimiothérapies immunogènes est

amoindrie dans des animaux déficients pour Tlr4 ou sa molécule adaptatrice MyD88. Chez

l’Homme, il existe un polymorphisme du gène TLR4, associé à une diminution d’affinité de

ce récepteur pour son ligand HMGB1. La présence de ce polymorphisme a été corrélée à une

progression métastatique plus rapide chez des patientes atteintes de cancer du sein non

métastatique avec invasion ganglionnaire et recevant des anthracyclines et de l’irradiation

locale en traitement adjuvant 249. De même, la présence de ce même polymorphisme a été

corrélée à une plus faible survie chez des patients atteints de cancer colorectal avancé

recevant de l’oxaliplatine 250. Pour qu’une drogue soit immunogène, il faut donc qu’elle

entraine l’exposition de la calréticuline sur la membrane plasmique et qu’elle induise la

libération d’HMGB1. Le cisplatine, très proche de l’oxaliplatine, induit la libération

d’HMGB1 mais ne permet pas l’exposition de la calréticuline, ce qui explique son caractère

non immunogène 250.

53

Figure 8 : Mécanismes moléculaires de l’immunogénicité de la mort cellulaire induite par les anthracyclines, l’oxaliplatine et l’irradiation. L’exposition précoce de la calréticuline sur la membrane plasmique et la libération d’HMGB1 dans le milieu favorise respectivement la phagocytose des corps apoptotiques et l’apprêtement des antigènes par les cellules dendritiques (d’après Zitvogel L, Nat Rev Immunol, 2008 251).

4.2 Problématiques de la thèse

L’exposition précoce de la calréticuline à la surface des cellules tumorales mourantes

et la libération d’HMGB1 constituent respectivement des signaux de phagocytose et de

danger, nécessaires pour l’immunogénicité de la mort induite par les anthracyclines,

l’oxaliplatine et l’irradiation. Cependant, ces deux signaux ne sont pas suffisants, puisque

l’ajout de calréticuline et d’HMGB1 recombinantes sur des cellules vivantes n’induit pas leur

immunogénicité. Ceci suggère l’existence d’autres signaux immunogènes, émis par les

cellules mourantes. Dans ce contexte, les questions adressées au cours de mon travail de thèse

ont été les suivantes :

- 1) En plus de la calréticuline et d’HMGB1, quels sont les signaux immunogènes émis

par les cellules tumorales mourantes exposées aux anthracyclines, à l’oxaliplatine et à

l’irradiation ?

- 2) Quelles sont les modifications induites par ces signaux au niveau des cellules

dendritiques ?

- 3) Quelles sont les conséquences immunitaires de l’activation des cellules

dendritiques en réponse à ces signaux au niveau de l’environnement tumoral ?

54

MATERIEL ET METHODES

Culture des lignées cellulaires tumorales

Les lignées cellulaires tumorales MCA205 (fibrosarcome, syngénique C57BL/6), EL4

(thymome, syngénique C57BL/6), CT26 (adénocarcinome du colon, syngénique BALB/c),

TS/A (adénocarcinome mammaire, syngénique BALB/c) ont été cultivées à 37°C avec 5% de

CO2, dans du RPMI complet contenant 10% de sérum de veau fœtal, 1mM de pyruvate de

sodium, 2mM de L-glutamine, 1% d’acides aminés non essentiels et 1% de

pénicilline/streptomycine. La lignée EG7 (thymome EL4 transfecté avec un ADNc codant

pour l’albumine de poulet) a été cultivée dans le même milieu supplémenté avec 0,5 mg/mL

de néomycine.

Induction de la mort des cellules tumorales par des agents cytotoxiques in vitro

Les cellules adhérentes (CT26, MCA205 et TS/A) ou les cellules flottantes (EL4) ont été

mises à une concentration de 0,01 x 106 par cm2 ou de 0,1 x 106 par mL deux jours avant

l’application des drogues. Les différentes chimiothérapies ont été ajoutées au milieu aux

concentrations et pendant la durée indiquées : mitoxantrone (1µM, 24h), doxorubicine (1µM,

24h), oxaliplatine (5µg/mL, 24h). Les cellules TS/A ont été irradiées à 10 grays. La

détermination de la mort cellulaire a été évaluée par marquage Annexine V/DAPI en

cytométrie de flux.

Vaccination préventive avec des cellules tumorales mourantes

Après l’induction de la mort des cellules tumorales par différents agents cytotoxiques (cf ci-

dessus), 3 x 106 , 5 x 106 ou 3 x 105 CT26, EL4 ou MCA205 respectivement ont été injectées

en sous-cutané dans le flanc des souris. 7 jours plus tard, 5 x 105 , 5 x 105 , 3 x 104 CT26, EL4

ou MCA205 respectivement ont été injectées vivantes dans le flanc opposé de l’animal. Les

souris ont ensuite été surveillées pendant environ 1 mois pour l’apparition de tumeurs.

Traitement d’animaux porteurs de tumeurs avec des chimiothérapies

Avant les injections en sous-cutané des cellules tumorales, celles-ci ont été amplifiées

pendant deux ou trois jours in vitro afin d’atteindre un niveau de confluence supérieur à 70%.

Après lavage du milieu de culture par du PBS, les cellules ont été injectées dans 100µL (5 x

105 CT26, 5 x 105 EL4, 8 x 105 MCA205 et EG7). Les traitements ont été administrés lorsque

55

les tumeurs avaient atteint une surface de 30-40 mm2 pour les CT26 et les MCA205 ou 50-60

mm2 pour les EL4 et les EG7. Les souris porteuses de CT26 ou de MCA205 ont reçu 50 µL

d’une solution à 4mM de doxorubicine en intra-tumoral. Les souris porteuses d’EL4 ou

d’EG7 ont reçu 5mg/kg d’oxaliplatine en intra-péritonéal.

Mise en évidence de l’activation de LT spécifiques par les corps apoptotiques de cellules

tumorales traitées par chimiothérapie

Après induction de la mort des cellules tumorales par les chimiothérapies in vitro, 1 x 106 de

cellules ont été injectées en sous-cutané dans le coussinet plantaire des animaux. 5 jours plus

tard, les ganglions poplités drainant le site d’injection des corps apoptotiques ont été prélevés.

Après obtention d’une suspension cellulaire par écrasage manuelle des ganglions, les cellules

ont été comptées et mises à 1 x 106 par mL dans du RPMI complet dans des plaques 96 puits.

La protéine OVA (ovalbumine) a été ajoutée a 1mg/mL, les peptides SIINFEKL et gp100 à 1

µg/mL. Après 48 h ou 72h de stimulation in vitro, les surnageants ont été prélevés pour un

dosage de l’IFN-γ par ELISA.

Production de cellules dendritiques à partir de moëlle osseuse de souris

Après prélèvement des fémurs et des tibias des souris en conditions stériles, les cellules de la

moëlle ont été « flushées » avec du milieu (IMDM). Les globules rouges ont ensuite été lysés

en utilisant un tampon hypotonique (0.15 M NH4Cl, 10 mM KHC03, 0.1 mM Na2EDTA dans

de l’eau distillée). Après deux lavages en milieu complet (IMDM contenant 10% de sérum de

veau fœtal, 2mM de L-glutamine, 1% de pénicilline/streptomycine, 50µM de beta-

mercaptoéthanol) les cellules ont été mises à 0,5 x 106 par mL dans du milieu complet

contenant du surnageant de cellules J558 (quantité suffisante pour avoir 20 ng de GMCSF,

préalablement dosé par ELISA) dans des grandes boites de Petri. Les cellules ont été

trypsinées et diluées dans de nouvelles boites tous les 3 jours et utilisées entre les jours 7 et

10, lorsque le pourcentage de cellules CD11c+ CMH II+ atteignait 70% minimum.

Chargement des cellules dendritiques avec des corps apoptotiques

Les BM-DC produites in vitro à partir de la moëlle de souris ont été récupérées sans

utilisation de trypsine, mais en faisant quelques lavages doux avec du milieu. Les cellules ont

ensuite été placées dans du RPMI complet ne contenant pas de beta mercaptoethanol à 1 x 106

par mL dans des plaques 24 puits. Les cellules tumorales dont la mort a été induite

56

préalablement sont lavées plusieurs fois afin d’enlever les drogues et mises en co-culture avec

les BM-DC pendant 18h.

Stimulation in vitro des cellules T CD8+

Les LT CD8+ spléniques ont été isolés par tri au MoFlo (CD3+ CD8+) et incubés dans des

plaques 96 puits à fond plat, préalablement recouvertes d’anti-CD3 activateur (1µg/mL) et en

présence d’anticorps anti-CD28 soluble (0,5 µg/mL). Différentes cytokines ont été ajoutées.

Au bout de 48h, les surnageant ont été récupérés et l’IFN-γ a été dosé par ELISA.

Immunofluorescence

Les cellules EG7 ont été incubées pendant 24 h avec de l’oxaliplatine. Ensuite de

l’antimycine (2µg/mL) ou du deoxyglucose (30mM) ont été ajoutés au milieu. Après avoir été

lavées de leurs drogues, les cellules tumorales ont été co-cultivées avec des BM-DC pendant

24h. De l’OxiATP (100µM) a parfois été ajouté à la co-culture. Les cellules dendritiques ont

ensuite été récupérées puis déposées pendant 30 min sur lame de polylysine. Les cellules ont

été fixées et perméabilisées avec le réactif Cytofix/Cytoperm de BD puis marquées avec les

anticorps anti-caspase 1 clivée (fragment p20) (Santa Cruz Biotechnology) et anti-CD11c

(Biolegend).

57

RESULTATS

1 Rôle de l’activation de l’inflammasome NLRP3 et de la production d’IL-1β par les

cellules dendritiques dans l’efficacité des chimiothérapies immunogènes

Nous présenterons ici les principaux résultats du papier de Ghiringhelli F et al :

« Activation of the NLRP3 inflammasome in dendritic cells induces IL-1β-dependent

adaptive immunity against tumors ».

L’efficacité thérapeutique de l’oxaliplatine et des anthracyclines dépend de l’intégrité

de certains acteurs de l’immunité adaptative. Dans des modèles de tumeurs établies chez la

souris (thymome EL4, fibrosarcome MCA), l’efficacité de ces traitements est diminuée chez

les souris présentant notamment un déficit dans la production d’IFN-γ (Ifng -/-) (Fig 1 et Fig

S2). De plus, l’injection de cellules tumorales préalablement exposées à ces chimiothérapies

dans le coussinet plantaire induit une réponse spécifique et protectrice dans le ganglion

drainant 249. Cette réponse se caractérise par la production d’IFN-γ suite à une restimulation

spécifique in vitro. Les souris sont alors protégées contre le développement de tumeurs induit

par une injection ultérieure de cellules tumorales vivantes. Ceci indique que des signaux

immunogènes provenant directement des cellules mourantes sont suffisants pour induire une

immunité spécifique. Parmi les signaux de danger stériles endogènes libérés par les cellules

tumorales mourantes, HMGB1 a été identifié comme un activateur du TLR4, facilitant

l’apprêtement des antigènes sur les CMH I et II des cellules dendritiques 249. L’objectif du

présent travail était d’étudier la présence d’autres signaux de danger endogènes pouvant

contribuer à l’immunogénicité de la mort cellulaire induite par l’oxaliplatine et les

anthracyclines.

L’ATP est un signal de danger endogène, libéré par les cellules mourantes et capable

d’activer l’inflammasome NLRP3 en se liant à son récepteur P2RX7. En association avec la

protéine ASC, NLRP3 induit l’activation de la caspase 1 et la production d’IL-1β. Exposées à

des chimiothérapies immunogènes, les cellules tumorales libèrent de l’ATP dans le milieu

(Fig 2a, 2b, 2c). Le traitement des cellules mourantes par des inhibiteurs de la production

d’ATP (Antimycine A, 2,4-dinitrophénol : DNP) ou par une enzyme dégradant l’ATP extra-

cellulaire (Apyrase) supprime leur immunogénicité (Fig 2d, 2g). De plus, des souris

déficientes pour P2rx7 ou des souris non mutées (WT) traitées par des antagonistes de ce

58

récepteur ne développent pas de réponses spécifiques contre les cellules tumorales mourantes

(Fig 3a, 2e, 2g). Ceci explique pourquoi les souris P2rx7 -/- ne sont pas protégées contre le

développement de tumeurs suite à une vaccination avec des corps apoptotiques et répondent

moins bien à l’administration de chimiothérapies immunogènes que les souris WT (Fig 5d,

1f).

Chez des souris P2rx7 -/-, l’injection de cellules dendritiques WT chargées avec des

corps apoptotiques induit le développement d’une réponse spécifique. Ceci n’est pas le cas si

les cellules dendritiques sont déficientes pour P2rx7 (Fig 3b). L’ajout de corps apototiques

sur des cellules dendritiques, in vitro, induit l’activation de la caspase 1 et la production d’IL-

1β par ces dernières, selon un mécanisme qui dépend de l’ATP extra-cellulaire et des

protéines NLRP3 et ASC (Fig 4). Les souris Nlrp3 -/- et Casp1 -/- ne sont pas capables de

développer des réponses spécifiques contre des cellules tumorales exposées à des agents

cytotoxiques immunogènes (Fig 5a, 5b, 5c). Ceci explique que l’efficacité d’une vaccination

avec des cellules tumorales mourantes chez ces souris soit limitée, de même que l’efficacité

de chimiothérapies immunogènes dans des modèles de tumeurs établies (Fig 5d, 1f). Ainsi,

l’ATP libéré par les cellules tumorales exposées à des chimiothérapies immunogènes active

l’inflammasome NLRP3 en se liant au récepteur P2RX7 sur les cellules dendritiques, ce qui

favorise le développement de réponses immunitaires spécifiques.

Chez les souris ayant reçu l’antagoniste naturel de l’IL-1R (IL-1RA) ou chez les

souris déficientes pour l’Il-1r1, l’immunogénicité des cellules tumorales mourantes est abolie

(Fig 6c, 5a). Ceci a notamment été montré dans le ganglion drainant des tumeurs établies

après administration de chimiothérapies immunogènes. Les souris ayant reçu l’IL-1RA

présentent moins de LT CD8 spécifiques (marquage tétramère) capables de produire de

l’IFN-γ (restimulation spécifique) (Fig 1h, 6e). Par ailleurs, l’IL-1β est capable de restaurer

l’immunogénicité des cellules mourantes dans les souris P2rx7 -/-, Nlrp3 -/- et Casp1 -/- (Fig

6f). L’ajout d’IL-1β recombinante sur des LT activés in vitro augmente la production d’IFN-γ

par ces derniers, ce qui n’est pas le cas de l’IL-6 ou du TNF-α (Fig 6b). L’inhibition d’IL-1β

par un anticorps neutralisant élimine la capacité des cellules dendritiques chargées avec des

corps apototiques exprimant l’OVA à stimuler la production d’IFN-γ par des OT-1 naïfs (Fig

6a). Enfin, la neutralisation de l’IL-1β diminue l’efficacité thérapeutique des anthracyclines

dans des modèles de fibrosarcomes transplantés ou induits par le méthylcholantrène (Fig 5e,

5f). Tout ceci indique que l’IL-1β produit suite à l’activation de l’inflammasome NLRP3 par

59

l’ATP dans les cellules dendritiques, contribue à l’activation de LT CD8 producteur d’IFN-γ,

impliqués dans l’efficacité anti-tumorale des thérapies cytotoxiques immunogènes.

Chez l’Homme, il existe un polymorphisme dans le gène P2RX7 (Glu496Ala) qui

diminue la capacité de ce récepteur à se lier à l’ATP. Les monocytes présentant ce

polymorphisme produisent moins d’IL-1β en réponse à une stimulation par l’ATP. Dans une

cohorte de patients atteint de cancer du sein et traités par des anthracyclines, la présence de ce

polymorphisme est associée à une plus faible survie (Fig 6g).

1170 volume 15 | number 10 | october 2009 nature medicine

a r t i c l e s

It has been an ongoing conundrum to find which particular biochemical or metabolic alterations could be used to distinguish between immunogenic and nonimmunogenic cell death1,2. Physiological cell death, which occurs as a continuous byproduct of cellular turnover, is nonimmunogenic (or even tolerogenic). Avoidance of autoimmu-nity likewise results from the fact that physiological cell death fails to activate pattern recognition receptors, including Toll-like recep-tors (TLRs) and NOD-like receptors (NLRs) that recognize patho-gen and/or damage molecular patterns and activate innate immune effectors3–9. In contrast, cell death elicited by radiotherapy and some chemotherapeutic agents such as anthracyclines and oxaliplatin elicits an immune response required for the therapeutic success10,11.

To mount a T cell immune response, DCs must incorporate anti-gens from stressed or dying cells, acquire the competence of antigen processing in a maturation step and present antigenic peptides bound to major histocompatibility complex (MHC) molecules in the context

of co-stimulatory signals and cytokines that allow for the differentiation of specific T cells12. One of the peculiarities of immunogenic cell death is early, preapoptotic exposure of calreticulin on the plasma membrane, which facilitates the uptake of dying cells by DCs13. A second characteristic of immunogenic cell death is the release of high mobility group box-1 (HMGB1) protein from the nucleus into the surroundings of dying cells14. HMGB1 acts on TLR4 on DCs, and this interaction stimulates the processing of tumor antigens from dying cells15. However, addition of recombinant calreticulin or HMGB1 to live cancer cells is not sufficient to elicit the presentation of tumor antigens by DCs16, implying that additional, yet-to-be-identified signals must be exchanged between dying cells and DCs.

In macrophages, the so-called inflammasome serves as a central sen-sor for pathogen and/or damage molecular patterns17–19. In response to danger signals, NLRP3 (also called NALP3 or cryopyrin) interacts with the adaptor molecule apoptosis-associated speck-like protein

Activation of the NLRP3 inflammasome in dendritic cells induces IL-1β–dependent adaptive immunity against tumorsFrançois Ghiringhelli1–4,18, Lionel Apetoh1,2,5,6,18, Antoine Tesniere2,5,7,18, Laetitia Aymeric1,2,5,18, Yuting Ma1,2,5, Carla Ortiz1,2,5,8, Karim Vermaelen1,2,5,9, Theocharis Panaretakis2,5,7, Grégoire Mignot1–4, Evelyn Ullrich1,2,5, Jean-Luc Perfettini2,5,7, Frédéric Schlemmer2,5,7, Ezgi Tasdemir2,5,7, Martin Uhl10, Pierre Génin11, Ahmet Civas11, Bernhard Ryffel12, Jean Kanellopoulos13, Jürg Tschopp14, Fabrice André1,2,5, Rosette Lidereau15, Nicole M McLaughlin16, Nicole M Haynes16, Mark J Smyth16,18, Guido Kroemer2,5,7,18 & Laurence Zitvogel1,2,5,17,18

The therapeutic efficacy of anticancer chemotherapies may depend on dendritic cells (DCs), which present antigens from dying cancer cells to prime tumor-specific interferon- (IFN-)–producing T lymphocytes. Here we show that dying tumor cells release ATP, which then acts on P2X7 purinergic receptors from DCs and triggers the NOD-like receptor family, pyrin domain containing-3 protein (NLRP3)-dependent caspase-1 activation complex (‘inflammasome’), allowing for the secretion of interleukin-1 (IL-1). The priming of IFN-–producing CD8+ T cells by dying tumor cells fails in the absence of a functional IL-1 receptor 1 and in Nlpr3-deficient (Nlrp3–/–) or caspase-1–deficient (Casp-1–/–) mice unless exogenous IL-1 is provided. Accordingly, anticancer chemotherapy turned out to be inefficient against tumors established in purinergic receptor P2rx7–/–or Nlrp3–/–or Casp1–/–hosts. Anthracycline-treated individuals with breast cancer carrying a loss-of-function allele of P2RX7 developed metastatic disease more rapidly than individuals bearing the normal allele. These results indicate that the NLRP3 inflammasome links the innate and adaptive immune responses against dying tumor cells.

1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), U805, Villejuif, France. 2Institut Gustave Roussy, Villejuif, France. 3AVENIR team INSERM CRI-866, Dijon, France. 4Centre Georges Francois Leclerc, Dijon, France. 5Université Paris-Sud, Villejuif, France. 6Center for Neurological Diseases, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA. 7INSERM, U848, Villejuif, France. 8Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Químicas Farmacéuticas, Centro FONDAP Estudios Moleculares de la Célula, Santiago, Chile. 9Laboratory of Immunoregulation, Department of Respiratory Medicine, Ghent University Hospital, Belgium. 10INSERM, U818, Institut Pasteur, Paris, France. 11UPR 2228-CNRS, Laboratoire de Régulation Transcriptionnelle et Maladies Génétiques, Biomédicale des Saints-Pères, Université Paris Descartes, Paris Cedex 06, France. 12UMR6218, IEM, CNRS Transgenose Institute, Orleans, France. 13UMR8619, CNRS, Université Paris, Orsay, France. 14Department of Biochemistry, University of Lausanne, Epalinges, Switzerland. 15Centre René Huguenin, INSERM U735, St. Cloud, France. 16Cancer Immunology Program, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Victoria, Australia. 17CICBT507, Villejuif, France. 18These authors contributed equally to this work. Correspondence should be addressed to L.Z. ([email protected]) or G.K. ([email protected]).

Received 16 July; accepted 18 August; published online 20 september 2009; doi:10.1038/nm.2028

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nature medicine volume 15 | number 10 | october 2009 1171

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(ASC, encoded by the Pycard gene) to form the inflammasome, the principal Casp-1 activation complex20–22. Casp-1 activated by the NLRP3 inflammasome is required for the proteolytic maturation of pro–IL-1β and hence IL-1β secre-tion in response to purinergic P2RX7 receptor agonists and TLR4 ligands23–26. Multiple distinct bacterial products or endogenous damage signals stimulate the NLRP3 inflamma-some, resulting in the proteolytic activation of caspase-125,27–30. Gain-of-function mutations in NLRP3 that increase IL-1β secretion account for hereditary inflammatory diseases31,32.

Here we report the unexpected finding that the activation of the NLRP3 inflammasome within DCs is decisive for the immune response against dying tumor cells, providing a previously unknown link between the innate and acquired immune systems.

RESULTSChemotherapy efficacy relies on the NLRP3 inflammasomeOxaliplatin is efficient in controlling tumor growth in immuno-competent wild-type (WT) mice but loses its therapeutic efficacy on syngeneic EL4 thymomas in Rag2–/– mice, which lack T and B cells, in nu/nu mice, which lack T cells, in mice that have been depleted of CD8+ T cells by injection of a specific antibody (Fig. 1a; for treated controls, see Supplementary Fig. 1 and Supplementary Methods), and in mice deficient in IFN-γ receptor-1 (Ifngr1–/– mice), yet remains efficient in mice deficient in IL-12 receptor-β2 (Il12rb2–/– mice) (Fig. 1b). The gene-targeting of Ifngr1 or Ifng also abolished the therapeutic response against EG7 thymomas (EL4 expressing the model antigen ovalbumin, OVA) (Fig. 1c). In contrast, EL4 or EG7 thymomas fully responded to chemotherapy in mice lacking perforin or tumor necrosis factor–related apoptosis-inducing ligand (TRAIL, encoded by Tnfsf10; Fig. 1d,e). We obtained similar data indicating the requirement for IFN-γ (but not perforin or TRAIL) for the

efficacy of chemotherapy for mouse CT26 colon cancers and mouse MCA2 sarcomas treated with doxorubicin (Supplementary Fig. 2 and Supplementary Methods).

In addition, tumors implanted in mice that lack either of two components of the inflammasome28, NLRP3 or Casp-1, failed to respond to oxaliplatin (Fig. 1f). Systemic oxaliplatin treatment primed T cells from the tumor-draining lymph node for IFN-γ production, and this chemotherapy-induced T cell priming was deficient in Casp1–/– mice (Fig. 1g). Intracellular staining revealed that dying tumor cells primed CD8+ T cells for IFN-γ production and that an IL-1 recep-tor antagonist (IL-1RA33) applied with the chemotherapy abolished this T cell priming (Fig. 1h). Therefore, CD8+ T cell–mediated, IFN-γ−dependent antitumor immune responses elicited by chemotherapy are controlled at some level by the NLRP3 inflammasome.

ATP released from dying cells engages DC P2RX7 receptorsOne of the most pleiotropic activators of the NLRP3 inflamma-some is extracellular ATP, which is released from stressed cells34. Oxaliplatin (and a variety of cytotoxic agents) induced the release

WT Pfr1–/–

WT

Time (d) after treatment

a b

Tum

or s

ize

(mm

2 )Tu

mor

siz

e (m

m2 )

Tum

or s

ize

(mm

2 )

0

100

200

300

400

0 5 10 15 200

100

200

300

400

0 5 10 15 20

*

*

**

*

g

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Co PBS Ox Co PBS Ox

WT Casp1–/–

IFN

-γ (

ng m

l–1)

PBS versus

oxaliplatin Day 5

PBSIn vitrore-stimulation OVA

WT versus Casp1–/–

*

WT

nu/nuRag2 –/–

Anti-CD8 Ab

WT

Casp1 –/–Nlrp3 –/–P2rx7 –/–

0

100

200

300

400

0 5 10 15 20

**

* *

EL4 Ox

EG7Ox

EG7

EG7Ox

+ IL-1RA

Anti-CD3 AbAnti-CD3 Ab+ SIINFEKL

Intr

acel

lula

r IF

N-γ

CD8

200

100

00 5 10 15 20

200

100

00 5 10 15 20

WT Ifng–/–

Ifngr –/–

c d

e f

h

WT Tnfsf10–/–

Tnfsf10–/–

Pfr1–/– × Ifng–/–

0.7%±0.3%

3.1%±0.9%

0.6%±0.3%

0.5%±0.2%

0.8%±0.3%

2.6%±1.1%

13.0%±2.5%

2.0%±0.2%

0 5 10 15 200

100

200

300

400

500

Ifngr1–/–

Il12r b2–/–

WTWT

Ox Ox

OxOx

OxOx

EL4

EL4

EL4EL4

EG7

EG7

WT

WT PBSPBS

PBS

PBS

*

**

**

**

*

**

*

*

*

WT PBS

WT PBS

Figure 1 The tumoricidal activity of oxaliplatin depends on the NLRP3 inflammasome. (a–f) EL4 or EG7 thymoma tumor size in syngeneic mice bearing the indicated genotypes (a–f) or injected with CD8-specific antibody (Anti-CD8 Ab) and treated with oxaliplatin (Ox) (a). Each treatment group included five or six mice (data are means ± s.e.m.), and each experiment was repeated at least twice with similar results. *P < 0.05. PBS-treated controls are only shown for tumors growing on WT mice. For PBS-treated controls in all genotypes, see Supplementary Figure 1. Pfr1, gene encoding perforin. (g,h) IFN-γ secretion by inguinal lymph node cells draining established EG7 tumors treated or not with oxaliplatin (Ox) and re-stimulated with OVA, as measured by ELISA (g). Monitoring by immunofluorescence detection of intracellular IFN-γ of the proportion of IFN-γ–positive CD8+ T cells in inguinal lymph nodes draining established EL4 or EG7 treated or not with Ox after ex vivo re-stimulation with antibody to CD3ε ± SIINFEKL peptides (h). Results (means of triplicates ± s.e.m., n = 3 per group) are representative of one typical experiment out of three. *P < 0.01.

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of ATP from EL4 cells (data not shown), as well as from EG7 cells (Fig. 2a–c). Simultaneous inhibition of glycolytic ATP generation (with deoxyglucose) and oxidative phosphorylation (with antimycin A) or uncoupling of mitochondria with 2,4-dinitrophenol (DNP) resulted in the depletion of ATP from EG7 cells (Fig. 2b) without the induction of necrosis (data not shown). ATP depletion or addi-tion of the ATP-degrading enzyme apyrase abolished the capacity of dying EG7 cells to trigger a local immune response after oxaliplatin treatment. After injection into the footpad, ATP-containing (but not ATP-depleted), oxaliplatin-treated EG7 cells primed T cells from the popliteal lymph node to secrete IFN-γ in response to restimulation with OVA (Fig. 2d). Blockade of purinergic receptors

with the 2′,3′-dialdehyde derivative of ATP (‘oxidized ATP’) or with PPADS (iso-pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2’,5′-disulphonate, which inhibits the P2X subclass of purinergic receptors) abolished T cell priming by DCs exposed to oxaliplatin-treated EG7 cells but not to OVA protein (Fig. 2e).

We obtained similar results for CT26 mouse colon cancer cells, which released ATP in response to doxorubicin (Fig. 2f). Blockade of purinergic receptors or depletion of ATP (Fig. 2f) from doxo-rubicin- or mitoxanthrone-treated CT26 cells abolished their capacity to protect the host against a lethal rechallenge with CT26 (Fig. 2g). Moreover, oxaliplatin-treated EG7 cells failed to prime T cells for IFN-γ production when they were inoculated into the

Figure 2 ATP release by dying tumor cells dictates the immunogenicity of cell death. (a,b) ATP release into the supernatant (a) or residual intracellular ATP (b) in EG7 cells treated with oxaliplatin and with antimycin A plus deoxyglucose (A/D), DNP or apyrase (APY). Means ± s.e.m. of triplicates of one representative experiment out of three are depicted. The graph at right in a depicts the dose-response of ATP release monitored at 24 h. (c) Quantification of ATP released by EG7 cells treated with various cytotoxic agents using a selected dosage of each drug mediating cell death. *P < 0.01. (d,e) Quantification of IFN-γ released by OVA-stimulated lymph node cells after immunization with ATP-depleted, oxaliplatin-treated EG7 cells (d) or Ox-treated EG7 admixed with oxidized ATP (oxiATP) or PPADS (e) using IFN-γ enzyme immunoassay. Means ± s.e.m. of three independent experiments are shown. (f) ATP release by CT26 cells exposed to doxorubicin. (g) Percentages of tumor-free mice rechallenged with live syngeneic CT26 cells after immunization with CT26 cells treated with mitoxanthrone or doxorubicin and ATP scavengers or inhibitors of P2RX receptors (n = 15 per group). One representative experiment out of three is shown.*P < 0.05.

0 4 8 12 16 20 24

IFN

-γ (

ng m

l–1)

IFN

-γ (

ng m

l–1)

a b

PBS

OVA

d e

f g

Time (h) Time (h)

Time (h)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 4 8 12 16 20 24 24+A/D

*

AT

P (

10–7

M)

AT

P (

10–8

M)

AT

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10–7

M)

AT

P (

10–7

M)

AT

P (

10–3

M)

c

24+DNP

**0

10

20

30

40

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0 4 8 12 16 20 24

*

*

*

24+A/D

24+DNP

24+APY

CO

*

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0.5

1.0

1.5

2.0

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EG7 Ox

CO OxiATP

**

*

Live EG7

PBS

OVA

– – OxiATP

OVA C/P

0

1

2

3

4

5

EG7 Ox

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Tum

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)

0

50

100

150

200

0 1 5 10 20 50

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0

20

40

60

80

100

0

5

10

15

20

25

Co Cadmium Etoposide Mitomycin C Oxaliplatin Cisplatin Staurosporin Thapsigargin Mitoxantrone Doxorubicin

Percentage of

annV D

AP

I cells

Extracellular ATP

Annexin V DAPI– cells

Annexin V DAPI cells+

+

+

* * * *

*

*

**

*

0

10

20

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40

50

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**

A/DVehicle Apyrase OxiATPDNP PPADSCo –

* *

0

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MTXDXPBS

Immunized

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footpad of P2rx7–/– mice (ref. 35), in conditions in which they medi-ated T cell priming in WT P2rx7+/+ or heterozygous P2rx7+/– con-trols (Fig. 3a). Bone marrow-derived DCs from WT mice (but not from P2rx7–/– mice) could prime T cells when they were preincu-bated with dying EG7 cells and then inoculated into P2rx7–/– mice (Fig. 3b), indicating that it is indeed the P2RX7 receptor on DCs that senses ATP from dying tumor cells as an obligate co-signal of immunogenicity. EL4 tumors implanted in P2rx7–/– mice responded less efficiently to oxaliplatin than tumors growing in WT mice (Fig. 1f), underscoring the importance of P2RX7 for chemo-therapeutic responses.

Dying tumor cells activate the NLRP3 inflammasome in DCsDCs incubated with dying EG7 cells activated caspase-1, as determined by immunofluorescence staining with an antibody that recog-nizes a neoepitope formed by proteolytic maturation of caspase-1 (Fig. 4a,b). Caspase-1 activation, as observed in WT DCs, was inhibited by oxidized ATP (Fig. 4a,b). DCs from P2rx7–/–, Pycard–/– (ref. 36) or Nlrp3–/– mice were unable to activate caspase-1 (Fig. 4a,b). The proteolytic maturation of caspase-1 strictly correlated with the caspase-1–dependent secretion of IL-1β (but not IL-18, data not shown). Thus, in contrast to WT DCs, P2rx7–/–, Pycard–/– or Nlrp3–/– DCs failed to secrete IL-1β in response to dying tumor cells, and oxidized ATP efficiently suppressed IL-1 β secretion by WT DCs in these conditions (Fig. 4c). The acquisition of MHC class II antigen, CD40, CD80 or CD86 molecules by DCs stimu-lated with dying tumor cells was independent of NLRP3 or Casp1 (data not shown), and the production of the IL-12 p40 subunit by DCs exposed to dying tumor cells was not affected by the knock-out of P2rx7, Nlrp3 or Pycard (Fig. 4d). Accordingly, Nlrp3–/– or Casp1–/– DCs presented the OVA-derived SIINFEKL peptide to T cell hybridoma cells as efficiently as WT DCs (Supplementary Fig. 3 and Supplementary Methods).

Priming of CD8+ cells requires a functional NLRP3 inflammasomeThe OVA-specific IFN-γ production elicited by dying EG7 cells was abolished in Nlrp3–/–, Casp1–/– and mice deficient in the IL-1 receptor-1 (but normal in Il12rb2–/– and Il18r1–/– mice) (Fig. 5a). Moreover, dying CT26 cells primed T cells for IFN-γ production in response to autologous CT26 lysate (but not control lysates from a distinct tumor) (Supplementary Fig. 4a). This tumor- specific response was abolished by injecting IL-1RA (Supplementary Fig. 4a). Cross-priming of MHC class I–restricted CD8+ T cells in an MHC-incompatible system also depended on caspase-1 because dying mouse embryonic fibroblasts expressing cell-associated OVA (fused to the transmembrane domain of MHC Kb protein) primed T cells only when injected into WT (but not Casp1–/–) mice (Fig. 5b and Supplementary Fig. 4b,c). DCs from Nlrp3–/– or Casp1–/– mice were unable to prime T cells to respond to OVA when they were first

incubated with oxaliplatin-treated EG7 cells and then injected into the footpad of normal mice (Supplementary Fig. 5).

Similarly, oxaliplatin-treated B16F10 melanoma cells (which express the endogenous tumor antigen gp100) induced gp100- specific, IFN-γ–producing CD8+ T cells in WT, but not in Casp1–/–, mice (Fig. 5c). In yet another tumor model, mitoxantrone-treated mouse MCA205 fibrosarcoma cells elicited a protective immune response that prevented the growth of live tumor cells in WT mice but not in mice deficient in P2rx7, Nlrp3 or Casp1 (Fig. 5d). Neutralizing antibodies to IL-1R1 or IL-1β (but not IL-1α) also blunted the therapeutic response of two independent transplant-able methylcholanthrene (MCA)-induced sarcomas to doxorubicin (Fig. 5e) and that of CT26 cells to anthracyclines or oxaliplatin in vivo (data not shown). Notably, the IL-1β–dependent efficacy of doxorubicin could also be shown in a proportion (8 of 15) of primary fibrosarcomas elicited by MCA treatment in vivo37 in C57BL/6 mice (Fig. 5f) and BALB/c mice (data not shown). Together, these results suggest that the NLRP3 inflammasome–mediated caspase-1 activation in DCs is stringently required for an IL-1β–dependent antitumor T cell response.

IL-1 secretion by DCs is mandatory for T cell primingTo directly assess the contribution of IL-1β to the priming of T cells, we performed in vitro priming assays using bone marrow–derived DCs (derived from WT or Casp1–/– mice) that were pulsed with dying tumor cells and then cultured with naive T cells in the presence of IL-1RA or antibodies that neutralize IL-1β. MHC H-2b–expressing Casp1–/– DCs incubated with oxaliplatin-treated EG7 cells failed to prime naive T cells from OT-1 mice, which express a transgenic T cell receptor that recognizes the OVA-derived SIINFEKL peptide presented by H-2b class I molecules (Fig. 6a). In similar conditions, WT DCs did stimulate OVA-specific OT-1 cells to produce IFN-γ, and this effect was inhibited by addition of IL-1β–specific antibodies (Fig. 6a). Conversely, exogenous recombinant IL-1β (rIL-1β) or rIL-12 restored the priming capacity of Casp1–/– DCs in vitro

b

a

0

1

2

3

4

5

6

7

IFN

-γ (

ng m

l–1)

*

NS

IFN

-γ (

ng m

l–1)

LiveEG7EG7 Ox versus

In vitrore-stimulationDay 5

In vitrore-stimulationDay 5

OVA + C/P

Live EG7EG7 Ox versus

OVA + C/P

PBSOVA

PBSOVA

P2rX7 –/–WT versus P2rX7 +/–

0

1

2

3

4

5

6

WT

P2rx7

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WT

WT

WT

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DCWT versusP2rx7 –/–

Live EG7 OVA + C/PEG7 Ox

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P2rx7

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P2rx7

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P2rx7

+/–

*

P2rx7

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P2rx7

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P2rx7

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WT P2rx7 –/– WT WT WTP2rx7 –/– P2rx7 –/– P2rx7 –/–

NS

NS

Figure 3 Purinergic P2RX7 receptors are mandatory for the DC-mediated immunogenicity of cell death. (a) Quantification of IFN-γ secretion using ELISA in popliteal lymph node cells restimulated with OVA after footpad inoculation of live versus oxaliplatin-treated EG7 cells in C57BL/6 mice (WT or P2rx7+/– or P2rx7–/–). In parallel, mice were injected with 1 mg of OVA protein plus 10 µg CpG 28 and 5 µg polyI:C (C/P) as adjuvant. NS, not significant. (b). Same experiment as in a, but recipient mice were P2rx7–/– mice treated with an adoptive transfer of WT or P2rx7–/– DCs loaded with antigen (OVA holoprotein with C/P adjuvant, live or oxaliplatin-treated EG7 cells). The experiments included three or four mice per group and were repeated three times with similar results. *P < 0.05.

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(Fig. 6a). It is noteworthy that OT-1 activa-tion was promoted by WT and Casp1–/– DCs with similar efficacies if the DCs were stim-ulated by soluble OVA protein and TLR3 and TLR9 agonists instead of dying OVA-expressing cells (Fig. 6a). Upon culturing with WT DCs (but less so with Casp1–/– DCs) pulsed with dying cells, OT1 cells upregu-lated messenger RNA specific for IFN-γ (but not for perforin) (data not shown). To show a direct role of IL-1β in stimulating CD8+ T cells, we stimulated CD3+CD8+ splenic T cells by simultaneously cross-linking CD3 and CD28 in the absence or presence of IL-1β. Naive CD8+ T cells (which express basal amounts of CD121a, the IL-1β receptor, Fig. 6b) failed to produce IFN-γ, unless we added rIL-1β (or rIL-12 as a positive control, but not tumor necrosis factor-α or IL-6 as negative controls) (Fig. 6b). Oxaliplatin-treated EG7 cells failed to prime OVA- specific T cells in vivo after inoculation into the footpad if they were injected along with IL-1RA (Fig. 6c). Moreover, in vitro–re-stimulated CD3+CD8+ T lymphocytes failed to stain positively for cytoplasmic IFN-γ in WT mice injected with IL-1RA together with oxaliplatin-treated EG7 cells, or in Casp1–/– mice (Fig. 6d). Accordingly, IL-1RA blocked the expansion of antigen-specific CD8+ T cells that were induced by dying EG7 (but not EL4) cells in vivo and then were detected with a SIINFEKL-Kb tetramer ex vivo (Fig. 6e). The P2RX7–NLRP3–Casp-1–dependent antitumor effect also required CD4+ T cell help (Supplementary Fig. 6a,b).

Immunization with oxaliplatin-treated EG7 cells promoted T helper type 1 polarization. Expression of CD69 and production of IFN-γ and IL-2 by CD4+ T cells located in the draining lymph node occurred in a Casp-1–dependent manner (Supplementary Fig. 6c,d). In mice bearing a deficient P2RX7–NLRP3–Casp-1 axis, the oxaliplatin-elicited OVA-specific response was shifted to a T helper type 2 pattern (with production of IL-10 and IL-13) (Supplementary Fig. 7). These results underscore the cardinal

contribution of IL-1β to the immune response elicited by dying tumor cells. In agreement with this interpretation, local injection of recombinant IL-1β protein (or IL-12, but not IL-6), together with oxaliplatin-treated EG7 cells, fully restored deficient T cell priming in Nlrp3–/– or Casp1–/– mice (Fig. 6f). Thus, IL-1β is the factor that determines the NLRP3-dependent immunogenicity of cancer cell death.

P2RX7 mutations in human breast cancerLoss-of-function alleles of the gene encoding TLR4, a receptor involved in the perception of immunogenic cell death, negatively affect the prog-nosis of individuals with breast cancer treated with anthracyclines15. We sought to determine whether a loss-function polymorphism that affects P2RX7 (Glu496Ala, rs3751143), lowering its affinity for ATP38 and thus IL-1β release in human monocytes39, would decrease the

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0

100

200

300

400

500

b

c

IL-1

β (p

g m

l–1)

a

WT

LPS + ATP Live EG7

Nlrp3 –/–

EG7 Ox + OxiATP

* * *

*

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*

*

*

10 µm

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LPS + ATP Live EG7 OxiATPCo

EG7 Ox

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2 p4

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l–1)

*

–

LPS + ATP Live EG7 OxiATPCo

EG7 Ox

Live EG7Co EG7 Ox

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0

10

20

30

40

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Nlrp3 –/–

P2rx7 –/–

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Per

cent

age

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Cas

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CD

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cel

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WT

Nlrp3 –/–

P2rx7 –/–

Pycard –/–

WT

Nlrp3 –/–

P2rx7 –/–

Pycard –/–

Figure 4 Activation of caspase-1 and IL-1β secretion in DCs exposed to dying tumor cells. (a,b) Immunofluorescence staining of active caspase-1 in bone marrow–derived DCs (a) and quantification of DCs containing active caspase-1 (b). DCs (WT or derived from P2rx7–/–, Nrlp3–/– or Pycard–/– mice) were exposed to PBS or oxaliplatin or to live or oxaliplatin-treated EG7 tumor cells in the presence or absence of oxidized ATP and labeled with antibody to CD11c, antibody to caspase-1 p20 and DAPI (a,b). Positive controls included DCs exposed to LPS (50 ng ml–1) for 16 h and then to ATP (2 mM) for 20 min. (c,d) IL-1β (c) or IL-12 p40 (d) concentrations measured by commercial ELISA in the supernatants of DCs. ND, not determined. The experiments were performed three times with similar results. Representative microphotographs or histograms are depicted. Means ± s.e.m. are shown for triplicate wells. *P < 0.05.

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beneficial effect of anthracyclines in breast cancer. We analyzed a cohort of individuals with sporadic breast cancer that was stratified according to the P2RX7 genotype (normal versus variant P2RX7). The frequencies of heterozygous (‘variant’) and homozygous (‘normal’) germline polymorphisms were 36% and 64%, respectively. We found no significant differences in classical prognostic factors between normal and variant group of patients (Supplementary Table 1). However, the P2RX7 loss-of-function allele had a significant negative prognostic impact on metastatic disease-free survival (log-rank test; P = 0.02).

The univariate Cox regression analysis confirmed statistically significant results for the P2RX7 genotype (P = 0.021), with a haz-ard ratio of 1.6 (95% confidence interval [1.074; 2.398]) for P2RX7 Glu496Ala versus P2RX7 Glu496Glu (Fig. 6g and Supplementary Table 1). A multivariate Cox regression model revealed a signifi-cant effect for tumor grade (tumor grade 1 versus tumor grade 2–3, hazard ratio 3.243[1.024;4.383], P < 0.05) and for P2RX7 genotype (Glu496Glu versus Glu496Ala, hazard ratio 1.556[1.017;2.383], P < 0.05). These results lend support to the clinical relevance of the P2RX7 and inflammasome pathway.

Figure 5 The NLRP3 inflammasome is required for the elicitation of an adaptive antitumor immune response. (a–c) Quantification of IFN-γ secretion, using ELISA, by lymph node cells re-stimulated with SIINFEKL peptides (b) with or without OVA holoprotein (a,b) or with gp100-derived peptide (QVPRNQDWL) (c) after immunization of MHC H-2b+ WT (a–c), Nlrp3–/– (a), Casp1–/– (a–c) or IL1r1–/– (a) mice (five mice per group) with oxaliplatin-treated EG7cells (a),irradiated H-2d+ mouse mammary cancer TS/A cells (b) or oxaliplatin-treated B16F10 cells (c). (d) Percentages of tumor-free mice after rechallenge with syngeneic MCA205 sarcoma after immunization with mitoxantrone (MTX)-treated MCA205 cells in the indicated genetic backgrounds of C57BL/6 mice (n = 15 per group). (e) Tumor growth kinetics of day 7–established MCA-2 or MCA-4 sarcomas treated with doxorubicin (Dx) in the presence of control immunoglobulin (Co Ig), neutralizing antibody to IL-1α (Anti–IL-1α), IL-1β (Anti–IL-1β) or IL-R1 (Anti–IL-1R1) (n = 5 per group). (f) Tumor growth kinetics of spontaneous MCA-induced sarcomas in C57BL/6 mice treated with intravenous doxyrubicin with or without neutralizing antibodies to IL-1β (n = 15 per group). Tumor growth kinetics of one typical experiment (e) from six different MCA lines assessed or one experiment (f) separating responders from nonresponders are depicted.

0

0.5

1.0

1.5

2.0

5.0

a

WT Il1r1–/– Il12rb2–/–Nlrp3–/–

IFN

-γ (

ng m

l–1)

IFN

-γ (

ng m

l–1)

IFN

-γ (

ng m

l–1)

In vitrore-stimulation

In vitrore-stimulation In vitro

re-stimulation

PBSOVA

WT versusLive EG7 EG7 Ox

OVA + C/P

Il18r –/–

Il12r b2 –/–

Nlrp3 –/–

Il1r1–/–Casp1–/–

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Live EG7 Ox

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Live EG7 Ox

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Live EG7 Ox

OVA + C/P

Live EG7 Ox

OVA + C/P

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OVA + C/P

Live EG7 Ox

OVA + C/P

Il18r –/–

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0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

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WT

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X-raysLive OVA

C/P TS/AOVA

X-raysLive OVA

C/P TS/AOVA

X-raysLive


WT versus Casp1–/–Live TS/AOVA

TS/AOVA X-rays versusOVA C/P PBS

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* *Casp1–/–

WT Casp1–/–

*

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0

100

200

300

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500

1,500

PBS Live B16 Ox

PBS

PBS Live B16 Ox

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gp100 C/P

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0 10 20 30 40

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Time (d)

Time (d)

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0

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0 10 20 30

Nlrp3–/–

CO

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n = 15 for each group

40

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0

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Anti–IL-1αAnti–IL-1βCo Ig

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0.1

0.2

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0 10 20 30

MCA 2

Anti–IL-1R

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Anti–IL-1βAnti–IL-1R

Time (d)

0

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Co Ig Co Ig

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Tum

or s

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(cm

2 )

Tum

or s

ize

(cm

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0

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50 100 150 200

Dx nonresponders (n = 7)

Dx responders (n = 8)

PBS (n = 15)

PBS + anti–IL-1β (n = 15)

Dx nonresponders + anti–IL-1β (n = 15)

MCA challenge± anti IL-1β

PBS versus Dx

Monitor tumor growthDay 0 Days 63–84

Dx

PBS

Dx

PBS

Dx

PBS

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DISCUSSIONOur results identify a new signal that is required for cancer cell death to be immunogenic, namely the release of ATP. This signal has been previously shown to increase as a danger signal in severe tissue damage including myocardial infarction and hepatotoxic insult18, with potent proinflammatory effects. Because most cells express ATP-degrading ectoenzymes40, ATP released from stressed or dying cells likewise fol-lows a steep gradient and only activates purinergic receptors in the immediate vicinity of the lethal event. Our data are compatible with

a scenario in which ATP activates P2RX7 receptors on DCs, thereby stimulating the aggregation of the NLRP3-ASC–Casp-1 inflamma-some, the proteolytic maturation of caspase-1, pro–IL-1β cleavage and consequent IL-1β release. IL-1β then is required for the priming of IFN-γ–producing, tumor antigen–specific CD8+ T cells. In accord with previous studies addressing the capacity of adoptively transferred or vaccine-induced CD8+ T cells to eradicate established tumors41,42, IFN-γ, rather than cytolytic activities (that are dependent on perforin or TRAIL), mediates the anticancer activity of T lymphocytes

Figure 6 NLRP3 inflammasome-dependent differentiation of tumor specific CD8+ T cells toward IFNγ polarization. (a,b) Monitoring of IFN-γ concentrations in supernatants of a 4-d coculture of naive OT-1 cells (a) with syngeneic WT or Casp1–/– bone marrow–derived DCs loaded with oxaliplatin-treated EG7 or OVA in C/P (inset) in the presence of neutralizing monoclonal antibody to IL-1β or exogenous rIL-1 (100 ng ml–1) or IL-12 (10 ng ml–1). Purified CD3+CD8+ T cells (b) were stimulated for 72 h with plastic-immobilized monoclonal antibodies to CD3 and CD28 with cytokines (10 ng ml–1 for IL-12 p70, 100 ng ml–1 for others). Inset shows CD121a (IL-1R1) expression on naive CD8+ T cells (isotype control in gray). (c) Quantification of IFN-γ produced by lymph node cells re-stimulated with OVA after immunization with oxaliplatin (Ox)-treated EG7 cells in the presence of IL-1RA molecules. (d) The frequency of IFN-γ–producing CD8+ T cells after re-stimulation of the lymph node is shown (representative dot plots at the top, means ± s.e.m. (n = 3) at the bottom). (e) The frequency of CD8+ T cells staining positively with SIINFEKL-Kb tetramers in the draining lymph node of oxaliplatin-treated EG7 or EL4 cells determined at day 5. (f) Quantification of IFN-γ produced by lymph node cells re-stimulated with OVA after immunization with oxaliplatin-treated EG7 cells in the presence of the indicated cytokines in the indicated mouse backgrounds. *P < 0.05. (g) Kaplan-Meier estimates of time to metastasis in two groups of subjects with breast cancer treated with adjuvant anthracyclines (n = 225) bearing the normal (Glu496Glu) or loss-of-function (Glu496Ala) P2RX7 alleles.

a

b c

de

Liv EG7versus

CO lg or anti–IL-1β Ab± exogenous IL-1β or IL-12

DC

WT

NS

NS

2.0

0Co OVA OVA

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1234567

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1.0

0.5IFN

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ng m

l–1)

IFN

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l–1)

IFN

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ng m

l–1)

0PBS Co Ig

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Anti–IL-1β Ab IL-1β IL-12

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CD121a1.0

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CD

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(%

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0

0

WT

0Co Live EG7 – –IL-1RA IL-1RA

EG7 Ox OVA C/P

2

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6

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103

103

104

104

105

105 0 103 104

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2.1% 8.4% 3.3%

EG7 Ox EG7 Ox+IL-1RA

CoIL

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IL-6

TNF-α

IL-1

2 p7

0–Live EG7

Live EG7EG7 Ox

OVA + C/P± IL-1RA

NS

0

CoIL-1RA

(100 µg)IL-1RA(20 µg)

IL-1RA(100 µg)

LiveEG7

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0% 0.1%± 0.1%

0.8%± 0.1%

0.2%± 0.1%

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s

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0.5

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*


WT

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* **


OT1activation

Casp1–/–

Casp1–/–

EG70xOVA + C/P

ND

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PBSOVA

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Tlr4–/–

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P2rx7 ––/–

P2rx7 –/–

Casp1–/–

Casp1–/–

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g

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1.81.61.41.21.00.80.60.40.2

0EG7

EG7 Ox EG7 Ox EG7 Ox EG7 Ox EG7 Ox

NS

*

* * *

EG7EG7

WT

00 20 40 60

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20

Met

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free

sub

ject

s (%

)

40

60

80

100 Glu496Glu (n = 144)Glu496Ala (n = 81)

Log-rank P = 0.02EG7 EG7– – – – –IL-1β IL-1β IL-1β IL-1β IL-1βIL-6 IL-12 IL-6 IL-12

IFN

-γ (

ng m

l–1)

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that have been primed in a P2RX7–NLRP3–ASC–Casp-1–IL-1β– dependent fashion.

Each of the individual steps in this linear cascade (ATP to P2RX7 to NLRP3–ASC–Casp-1 to IL-1β to CD8+ T cell polarization for IFN-γ production) have been described previously18,25,29,43,44. However, there are key notions that emerge from our study. First, it was unexpected that, when activated in DCs, inflammasome activation can establish a link between the innate (inflammatory) and the acquired (cognate) immune responses because IL-1β produced by DCs is required for the priming of T cells. Second, none of the functional entities of this cascade (the ATP-P2X7 system, the inflammasome and the IL-1β–IL-1βR axis) has previously been described as involved in anticancer immune responses that determine the efficacy of chemotherapy.

The NLRP3 inflammasome responds to multiple danger signals, including a decrease in cytosolic potassium concentrations and an increase in cytosolic DNA levels, urate and bacterial products24,45–47. The NLRP3 inflammasome is also controlled by the serial liga-tion of purinergic receptors and TLRs18,23. In addition to tumor cell–derived ATP acting on P2RX7 receptors, HMGB1, a TLR4 agonist released by dying tumor cells treated with doxorubicin or oxaliplatin15, may contribute to the stimulation of the NLRP3 inflammasome. Indeed, our data indicate that HMGB1 could synergize with ATP to induce IL-1β release by DCs (Supplementary Fig. 8a) and that antibody specific for HMGB1 abrogated the ability of DCs to produce IL-1β in contact with dying tumor cells (Supplementary Fig. 8b). Hence, both ATP and HMGB1 released from dying cells contribute to the activation of the NLRP3 inflam-masome in DCs.

Notably, not only injured tumor cells but also stressed healthy tissues may elicit a Casp-1–dependent T cell response. Thus, we observed that immortalized, nontransformed mouse embryonic fibroblasts expressing cell-associated OVA and oxaliplatin-treated peritoneal macrophages pulsed with OVA protein both triggered OVA-specific immune responses in a Casp-1–dependent manner. However, anticancer chemotherapy does not elicit a generalized autoimmune response, presumably because tumor cells die more efficiently than healthy cells, because they express a set of tumor-specific antigens against which no self-tolerance has been established, or both.

Although IL-1β could be instrumental at the level of DCs (by con-tributing to DC activation and migration), our data indicate that maturation of DCs triggered by dying cells is caspase-1 independ-ent (data not shown), that IL-1β does not affect the capacity of DC to process cell-associated antigens and that IL-1β can directly act at the transcriptional level on T cells to polarize CD8+ T cell immune responses in vitro.

Chronic inflammation including overactivation of the IL-1β– IL-1βR system48 has been considered a tumor-promoting condition, arguing in favor of IL-1β inhibition for tumor prevention or ther-apy49–52. However, as shown here, the production of IL-1β by DCs and the action of IL-1β on specific CD8+ T cells may contribute to therapeutically relevant anticancer immune responses.

The clinical study reported here underscores the medical relevance of the ATP-P2RX7 pathway for anthracycline treated breast cancer individuals. These results may therefore have major implications by defining new constitutional markers of chemotherapy efficacy in can-cer patients. It will be crucial to determine which chemotherapies have the capacity to induce immunogenic cell death and which type of tumors can actually generate immunogenic signals after radiotherapy or chemotherapy in humans.

METHODSMethods and any associated references are available in the online version of the paper at http://www.nature.com/naturemedicine/.

Note: Supplementary information is available on the Nature Medicine website.

ACKNOwLEdGMENTSWe thank I. Couillin (CNRS) and A. Mignon (Cochin Hospital) for helpful discussion and for providing IL-1RA, R. Schreiber (Washington University School of Medicine) for monoclonal antibodies to IL-1α, IL-1β and IL-1R, H. Yang (Feinstein Institute for Medical Research) for antibody to HMGB1, H. Yagita (School of Medicine, Juntendo University) for the N2B2 antibody to mouse TRAIL, J.-C. Guéry (INSERM) for IL12rb2−/− mice, V. Dixit (Pennington Biomedical Research Center) for Pycard−/− mice, M. Albert (Pasteur Institute) for membrane-bound OVA–transfected mouse embryonic fibroblast cells, S. Forget and J. Bombled for access to the genomics platform, V. Vasseur and the Institut Gustave Roussy animal facility for breeding of transgenic mice, I. Martins for help in ATP release screening and A. Boissonnas (INSERM, Curie Institute) for providing OT1-GFP mice. We are deeply indebted to P. Arveux and S. Dabakuyo for useful help with the statistical analyses. The authors are supported by grants from the Ligue Nationale contre le Cancer (to L. Aymeric., G.K. and L.Z.), the Fondation pour la Recherche Médicale (to L. Apetoh., G.K., E.U., F.S. and L.Z.), the European Union (INFLACARE grant), the association for International cancer research (to G.K.) Cancéropôle Ile-de-France, Institut National du Cancer (L.Z., G.K.), Agence Nationale pour la Recherche (to G.K.), the European Molecular Biology Organization (L. Apetoh.), INSERM (A.T.), the National Health, Association pour la recherche sur le cancer RC (to G.M.), National Health and Medical Research Council of Australia, Cancer Council of Victoria, the China Scholarship Council (Y.M.) and the Leukemia Foundation (M.J.S., N.M.M. and N.M.H.). K.V. is the recipient of a European Respiratory Society Fellowship (number 605).

AUTHOR CONTRIBUTIONSF.G., L. Aymeric., A.T., L. Apetoh., T.P., F.S., G.M., E.U., Y.M., N.M.M., N.M.H. and M.J.S. performed in vitro and in vivo experiments. C.O., E.T., P.G. and A.C. performed in vitro experiments. A.T. and T.P. performed immunofluorescence experiments. M.U., J.-L.P., B.R., J.K. and J.T. provided transgenic cells or mice and gave scientific advice. K.V., F.A., R.L., F.G. and A.T. performed the single nucleotide polymorphism analysis on cohorts of subjects with cancer. F.G., L. Apetoh., M.J.S. and A.T. prepared the figures and drafted the manuscript. G.K. and L.Z. designed the study and wrote the manuscript. M.J.S., G.K. and L.Z. all contributed equally to the design of the experiments and to the writing of the manuscript.

Published online at http://www.nature.com/naturemedicine/. Reprints and permissions information is available online at http://npg.nature.com/reprintsandpermissions/.

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ONLINE METHODSATP assays. We treated 1 × 105 EG7 or CT26 cells (American Type Culture Collection) with oxaliplatin (5 µg.ml−1), doxorubicin (20 µM) or other cell death inducers (all from Sigma-Aldrich), and measured intracellular or extra-cellular ATP at the time points indicated in Figure 2. Briefly, we collected super-natants and assessed the amount of extracellular ATP with the luciferin-based ENLITEN ATP Assay (Promega). We added 100 µl of luciferin-luciferase solu-tion to the supernatants and recorded light emission with a Fluostar lumino-meter (BMG Labtech). We calibrated light emission by using standard samples furnished by the manufacturer. We measured intracellular ATP with a commer-cial ATP Assay kit (Calbiochem). We treated cells with a lysis solution contain-ing 1% trichloroacetic acid for 1 min. We then added the luciferin-luciferase solution and measured ATP. For ATP depletion, we first treated cells with either oxaliplatin or doxorubicin for 24 h and then incubated them with antimycin A (2 µg ml−1) and 2-deoxyglucose (30 mM) (Sigma Aldrich) for 20 min, and we subsequently measured ATP as described above. Alternatively, we treated the cells with DNP (200 µM) or apyrase (40 international units per ml) (Sigma Aldrich), for 20 min.

Chemotherapy and radiotherapy of tumors established in mice. We injected WT C57BL/6 mice or knockout mice subcutaneously with 1 × 106 EL4 (or EG7) cells into the right flank. Alternatively, we injected WT BALB/c mice with 5 × 105 CT26 cells or 1 × 105 MCA2 or MCA4 cells subcutaneously into the right flank. We then randomly assigned mice to treatment groups of four to six mice each. When tumor size reached 70–90 mm2 for EL4 (9–12 d after injection), 15–25 mm2 for EG7 (7 d after injection), 60–80 mm2 for CT26 (8–10 d after injection) or 15–20 mm2 for MCA2 and MCA4 (7 d after injection), we gave the mice chemotherapy. We injected mice bearing EL4 tumors with oxaliplatin (5 mg per kg body weight intraperitoneally), mice bearing CT26 tumors with oxiplatin (5 mg per kg body weight intraperitoneally) or doxorubicin (50 µl, 4 mM intratumorally) and mice bearing MCA2 or MCA4 tumors with doxo-rubicin (2 mg per kg body weight intravenously). In some experiments, CT26 tumor-bearing mice received two injections (on day 0 and day 2 after the first injection of chemotherapeutic treatment) of IL-1RA (100 µg), IL-1–specific antibody (100 µg) (R&D Systems, clone 30311) or hamster serum as a con-trol. Some CT26 and MCA2 or MCA4 tumor–bearing mice received biweekly administration of control immunoglobulin, antibody to IL-1α, antibody to IL-1β or antibody to IL-1R (provided by R. Schreiber) from day 4 to day 21 after tumor inoculation. In individual mice where fibrosarcomas were generated de novo by MCA, treatment with PBS or doxorubicin in the presence of con-trol or IL-1β–specific antibody began on first palpation of tumors >0.1 cm2 in size. We administered doxorubicin twice, with injections 1 week apart (2 mg

per kg body weight intravenously), and administered antibody twice weekly (250 µg intraperitoneally). Mice were bred and maintained according to both the Federation of European Laboratory Animal Science Associations and the Val de Marne Animal Experimental Ethics Committee guidelines.

In vitro stimulation of CD8+ T cells or OT-1 cells by dendritic cells. We purified CD8+ T cells from OT-1 spleens with a CD8+ T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec). We cultured these responder cells (2 × 104) with bone marrow–derived DCs from WT or Casp-1–deficient mice (1 × 104) loaded with live or oxaliplatin-treated EG7 cells (1 × 104) in the presence of a control or IL-1β–specific antibody (10 µg ml–1) in round-bottom 96-well plates. Alternatively, we incubated OT-1 cells and bone marrow–derived DCs with OVA protein alone or with CpG (10 µg ml–1) and polyI:C (5 µg ml–1) (Sigma Aldrich). We collected the supernatants after 48 h and assayed them for IFN-γ by ELISA (BD Biosciences). Alternatively, we isolated double-positive CD3+ and CD8+ cells from mouse spleen by cell-sorting on a MoFlo cytofluorometer (Dako) and incubated them in flat-bottom 96-well culture plates precoated with monoclonal antibodies to CD3ε (1 µg ml–1) (eBioscience, clone 145-2C11) and CD28 (0.5 µg ml–1) (BD Biosciences, clone 37.51) supple-mented with various amounts of cytokines. We collected the supernatants after 48 h and assayed them for IFN-γ by ELISA.

Genotyping of P2RX7 single nucleotide polymorphism. We obtained written informed consent from subjects entering the study approved by the local Ethical Committee of Kremlin Bicêtre and the Institut Gustave Roussy Biopathology Review Board. We isolated DNA from frozen blood leukocytes of each individual. We used Taqman primers and probe (Applied Biosystems) to amplify a fragment containing the P2RX7 Glu496Ala single nucleotide polymorphism (rs3751143). After PCR amplification, we assigned genotypes to each subject by comparing the signals from the two fluorescent probes, FAM and VIC, and calculating the –log(FAM/VIC) ratio for each data point.

Additional methodology. Specific reagents, tumor cell lines, mouse strains, primary DC cultures, anticancer prophylactic vaccines, immunofluorescence assays for Casp-1 activation, monitoring tumor-specific T cell responses and the design of the clinical study are all detailed in the Supplementary Methods.

Statistical analyses. We compared continuous data by the Mann-Whitney U test and compared categorical data by Chi-square or Fisher’s exact test, as appropri-ate. We used the log-rank test for the analysis of Kaplan-Meier survival curves. We performed statistical calculations with JMP 5.1 software (SAS Institute). All P values were two-tailed. A P value < 0.05 was considered statistically significant for all experiments.

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Figure 8Sa

b

IL1-β

(pg.

ml

)

0

50

100

150

200

250

CO LPS 1 µg 0.1 µg

PBS

ATP

IL-1

2p40

(ng

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)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

CO

IL-12p40IL-1β

0

100

200

300

400

500

CO

EG7 Ox

Oxi ATP

IL-1β

(pg.

ml

)

HMGB1

Anti-HMGB1 Ab-EG7 Ox

Oxi ATPAnti-HMGB1 Ab-

NS

* *

**

*

1.2

-1

-1

-1

Supplemental Fig. 8. Serial stimulation with HMGB1, a TLR4 agonist, and ATP is required by DC for optimal IL-1β production. a. Synergistic effects of TLR4 agonists with ATP for IL-1β release from DC. BM-DC were pre-incubated for 16 hrs with either LPS or increasing dosages of HMGB1 and then exposed to a second stimulation with 2mM ATP. b. Blocking HMGB1 during exposure of DC to dying tumor cells compromises IL-1β secretion. WT BM-DC were incubated with oxaliplatin-treated EG7 tumor cells in the presence of oxidized ATP or anti-HMGB1 (or irrelevant) neutralizing Ab. The levels of IL-1β and IL-12p40 were monitored in the culture supernatants at 24 hrs using commercial ELISA. These experiments have been performed twice, yielding similar results. A representative graph is depicted, showing the mean+SEM value of IL-12p40 or IL-1β production in triplicate wells. *p<0.05.

Nature Medicine: doi:10.1038/ng.2028

60

2 Rôle des LTγδ producteurs d’IL-17 dans l’efficacité thérapeutique de thérapies anti-

cancéreuses conventionelles

Nous présenterons ici les principaux résultats du papier de Ma Y et al : « Contribution

of IL-17-producing γδ T cells to the efficacy of anticancer chemotherapy ».

L’administration de chimiothérapies immunogènes induit la libération de signaux de

danger par les cellules tumorales mourantes. Ces signaux alertent le système immunitaire et

contribuent à l’activation de LT CD8 anti-tumoraux producteurs d’IFN-γ. Une analyse par

micro-array révèle que les chimiothérapies immunogènes modifient le profil d’expression de

nombreux gènes de l’immunité au niveau de l’environnement tumoral (Fig 1A, 1B). Ainsi, le

traitement de tumeurs MCA205 par la doxorubicine induit l’expression de gènes de

l’immunité Th1, comme Eomes et Tbx21, 8 jours après le traitement (Fig 1C). Au niveau

protéique, la doxorubicine induit une augmentation d’IFN-γ et d’IL-17A dans le lit tumoral

(Fig 1D). L’analyse des leucocytes infiltrant les tumeurs indique que les LT produisent 3 fois

plus d’IFN-γ et d’IL-17A chez les souris traitées par la chimiothérapie que chez les souris

ayant reçu du PBS (Fig 1E). Alors que l’IFN-γ est majoritairement produit par les LT CD8+,

les LTγδ des types γ4 et γ6 sont les principaux producteurs d’IL-17A (Fig 1F, 1G, S2). Les

LTγδ commencent à s’accumuler dans le lit tumoral 3 jours après le traitement, et sont suivis

par les LT CD8 IFN-γ + qui apparaissent à jour 8 (Fig 2A, 2C). Les deux types cellulaires

s’accumulent et prolifèrent de manière transitoire (Fig 2A, 2B). Leurs proportions

commencent à diminuer 10 jours après le traitement et reviennent aux valeurs de base à jour

15 (Fig 2A). Ces observations ont été faites dans trois modèles différents : le fibrosarcome

MCA205 et le carcinome du colon CT26 traités par la doxorubicine et l’adénocarcinome

mammaire TSA irradié (Fig 3). Dans ce dernier modèle, seules les souris répondant au

traitement présentent une accumulation de LT producteurs d’IFN-γ et d’IL-17A (Fig 3D, 3E,

3F). Dans les trois types de modèles, la proportion de LT CD8 IFN-γ + présents dans le lit

tumoral est corrélée à celle des LTγδ IL-17A+ (Fig 3G).

Les souris ayant reçu un anticorps neutralisant l’IL-17A ou incapables de répondre à

cette cytokine (Il-17ra -/-) ne développent pas de réponses IFN-γ spécifiques contre des

cellules tumorales exposées à des chimiothérapies immunogènes (Fig 5A). Ceci explique que

les protocoles de vaccination avec des cellules tumorales mourantes ne soient pas efficaces

chez les souris Il-17ra -/- (Fig 5B). De même, l’efficacité thérapeutique de chimiothérapies

61

immunogènes est diminuée chez des souris déficientes pour la production d’IL-17A (Il-17a -/-

) ou ayant reçu des anticorps neutralisant l’IL-17A ou son récepteur IL-17RA (Fig 4). L’IL-

17A joue donc un rôle important dans l’efficacité thérapeutique des chimiothérapies

immunogènes.

En réponse à l’administration de traitements immunogènes, les LTγδ sont les

principaux producteurs d’IL-17A dans le lit tumoral. La production d’IL-17A par ces cellules

est stimulée in vitro par l’IL-1β produite par les cellules dendritiques exposées à des corps

apoptotiques immunogènes (Fig 5C, 5D). Chez les souris déficientes pour les LTγδ des types

γ4 et γ6 (Vγ4/6 -/-), les protocoles de vaccination avec des cellules mourantes ainsi que les

traitements de tumeurs établies par des chimiothérapies immunogènes sont moins efficaces

(Fig 5B, 6A). Ceci est en accord avec l’absence d’accumulation de LT CD8 IFN-γ + dans le

lit tumoral de ces souris (Fig 6B). Le transfert adoptif de LTγδ WT, mais pas celui de LTγδ

ne pouvant pas produire d’IL-17A ou répondre à l’IL-1β (Il-1r -/-), améliore l’efficacité

thérapeutique de traitements immunogènes (Fig 7A, 7B, 7C). Enfin, les LTγδ sont capables

de restaurer l’efficacité thérapeutique de la doxorubicine chez des souris IL-17A -/- (Fig 7D).

Tout ceci indique que les LTγδ producteurs d’IL-17A sont activés par l’IL-1β produite par les

cellules dendritiques exposées à des corps apoptotiques immunogènes et jouent un rôle

important dans l’efficacité thérapeutique de chimiothérapies immunogènes.

Article

The Rockefeller University Press $30.00J. Exp. Med.www.jem.org/cgi/doi/10.1084/jem.20100269

Cite by DOI: 10.1084/jem.20100269 � of �3

CORRESPONDENCE Laurence Zitvogel: [email protected] OR Guido Kroemer: [email protected]

Abbreviations used: AhR, aryl hydrocarbon receptor; BMDC, BM-derived DC; CIg, isotype control Ig; DX, doxorubicin; T17, IL-17A–producing T cell; MTX, mitoxantrone; OX, oxaliplatin; Tc1, IFN-–producing CD8+ T cell; TIL, tumor-infiltrating lymphocyte; TR, tumor regression.

Contribution of IL-17–producing T cells to the efficacy of anticancer chemotherapy

Yuting Ma,1,6 Laetitia Aymeric,1,6 Clara Locher,1,6 Stephen R. Mattarollo,8 Nicolas F. Delahaye,1 Pablo Pereira,9 Laurent Boucontet,9 Lionel Apetoh,10,11,12 François Ghiringhelli,10,11,12 Noëlia Casares,13 Juan José Lasarte,13 Goro Matsuzaki,14 Koichi Ikuta,15 Bernard Ryffel,16 Kamel Benlagha,17 Antoine Tesnière,2 Nicolas Ibrahim,5 Julie Déchanet-Merville,18 Nathalie Chaput,1,3 Mark J. Smyth,8 Guido Kroemer,2,4,19,20,21 and Laurence Zitvogel1,3,7

1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) U1015, 2INSERM U848, 3Center of Clinical Investigations in Biotherapies of Cancer (CICBT) 507, 4Metabolomics Platform, 5Department of BioPathology, Institut Gustave Roussy, 94800 Villejuif, France

6École Doctorale de Cancérologie de l’Universite Paris-Sud XI, 94800 Villejuif, France7Faculté de Médecine de l’Université Paris-Sud XI, 94270 Le Kremlin-Bicêtre, France8Cancer Immunology Program, Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, 3002, Victoria, Australia9Développement des Lymphocytes, INSERM U668, Institut Pasteur, 75015 Paris, France10INSERM U866, 21000 Dijon, France11Department of Medical Oncology, Georges François Leclerc Center, 21000, Dijon, France12Faculty of Medicine and Pharmacy, University of Burgundy, 21000 Dijon, France13Division of Hepatology and Gene Therapy, Centre for Applied Medical Research (CIMA), University of Navarra, 31008 Pamplona, Spain

14Molecular Microbiology Group, COMB, Tropical Biosphere Research Center, University of the Ryukyus, Okinawa 903-0213, Japan15Laboratory of Biological Protection, Department of Biological Responses, Institute for Virus Research, Kyoto University, Kyoto 606-8507, Japan

16Molecular Immunology and Embryology, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), IEM 2815, 45071 Orléans, France17INSERM Unité 561/Groupe AVENIR, Hôpital Cochin St. Vincent de Paul, Université Descartes, 75014 Paris, France18CNRS, UMR 5164, Université Bordeaux 2, 33076 Bordeaux, France19Centre de Recherche des Cordeliers, 75006 Paris, France20Pôle de Biologie, Hôpital Européen Georges Pompidou, AP-HP, 75015 Paris, France21Faculté de Médecine, Université Paris René Descartes, Paris, France

By triggering immunogenic cell death, some anticancer compounds, including anthracyclines and oxaliplatin, elicit tumor-specific, interferon-–producing CD8+ T lymphocytes (Tc� CTLs) that are pivotal for an optimal therapeutic outcome. Here, we demonstrate that chemo-therapy induces a rapid and prominent invasion of interleukin (IL)-�7–producing (V4+ and V6+) T lymphocytes ( T�7 cells) that precedes the accumulation of Tc� CTLs within the tumor bed. In T cell receptor / or V4/6/ mice, the therapeutic efficacy of chemo-therapy was compromised, no IL-�7 was produced by tumor-infiltrating T cells, and Tc� CTLs failed to invade the tumor after treatment. Although T�7 cells could produce both IL-�7A and IL-22, the absence of a functional IL-�7A–IL-�7R pathway significantly reduced tumor-specific T cell responses elicited by tumor cell death, and the efficacy of chemotherapy in four independent transplantable tumor models. Adoptive transfer of T cells restored the efficacy of chemotherapy in IL-�7A/ hosts. The anticancer effect of infused T cells was lost when they lacked either IL-�R� or IL-�7A. Conventional helper CD4+ T cells failed to produce IL-�7 after chemotherapy. We conclude that T�7 cells play a decisive role in chemotherapy-induced anticancer immune responses.

© 2011 Ma et al. This article is distributed under the terms of an Attribution–Noncommercial–Share Alike–No Mirror Sites license for the first six months after the publication date (see http://www.rupress.org/terms). After six months it is available under a Creative Commons License (Attribution–Noncommercial–Share Alike 3.0 Unported license, as described at http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/).

The current management of cancer patients re-lies upon the therapeutic use of cytotoxic agents that are supposed to directly destroy cancer cells through a diverse array of cell death pathways.

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(and perhaps the targets) of IL-17 in the tumor microenvi-ronment may determine whether this cytokine negatively or positively affects tumor growth. Whether conventional anti-cancer therapies such as chemotherapy and radiotherapy modulate IL-17 secretion and/or Th17 polarization remains to be explored (Maniati et al., 2010).

Similarly, the contribution of T cells in tumor immuno-surveillance is still elusive (Hayday, 2009). In humans, V1+ T cells have been shown to mediate immunosuppressive ac-tivities (Peng et al., 2007) or, on the contrary, to be associated with a reduced occurrence of cancers in transplanted patients bearing a CMV infection (Déchanet et al., 1999; Couzi et al., 2010) and with long-term relapse-free survival after BM transplantation (van Burik et al., 2007). V2+ T cells can be activated by various synthetic ligands to produce Th1-like cyto-kines, exhibit cytotoxic functions against tumors (Kabelitz et al., 2007), and mediate antitumor effects in patients (Wilhelm et al., 2003; Dieli et al., 2007). Although various T cell subsets are capable of producing IL-17 during microbial in-fection or autoimmune disorders of mice (Shibata et al., 2007; O’Brien et al., 2009), very little is known about the incidence and functional relevance of IL-17–producing T cells (that we termed T17) in cancer (Gonçalves-Sousa et al., 2010). T17 cells have been reported to share most phenotypic markers with Th17 cells (expressing CCR6, RORt, aryl hy-drocarbon receptor [AhR], IL-23R, IL-17A, and IL-22; Martin et al., 2009). T17 cells depend upon TGF- but not IL-23 or IL-6 for their development and maintenance (Do et al., 2010) and can be activated by IL-1 plus IL-23 (Sutton et al., 2009). They are unrestricted by V usage (although they are mostly V4 in the context of mycobacteria [Martin et al., 2009] and experimental autoimmune encephalitis [Sutton et al., 2009]). Recent work suggests that thymic selection does little to constrain T cell antigen specificities, but instead de-termines their effector fate. When triggered through the TCR, ligand-experienced cells secrete IFN-, whereas ligand-naive T cells produce IL-17 (Jensen et al., 2008). CD27+ thy-mocytes expressed LTR and genes associated with a Th1 phenotype, in contrast to CD27 thymocytes which give rise to IL-17–producing cells (Ribot et al., 2009).

Therapy-induced immunogenic tumor cell death that stimulates a therapeutic anticancer immune response can be expected to influence the composition and/or the architec-ture of tumor immune infiltrates, which in turn contribute to the control of residual tumor cells. Here, we demonstrate that both IL-17A/IL-17RA signaling and T cells are required for optimal anticancer responses and that the source of IL-17A is the T population during immunogenic chemotherapy and radiotherapy. We show that an early tumor infiltration by T17 cells is a prerequisite for optimal tumor colonization of IFN-–producing CD8+ T cells. T cell activation de-pends on IL-1R1 and IL-1 (but not IL-23) produced by DCs in response to immunogenic dying tumor cells. Finally, the adoptive transfer of WT T17 cells can restore the ther-apeutic efficacy of anticancer chemotherapy that is compro-mised in IL-17A/ hosts.

Nonetheless, several lines of evidence point to a critical con-tribution of the host immune system to the therapeutic activ-ity mediated by tumoricidal agents (Nowak et al., 2002, 2003). Indeed, in some instances, the cell death triggered by chemo-therapy or radiotherapy allows recognition of dying (anthra-cycline-treated or irradiated) tumor cells by antigen-presenting cells, thus eliciting a tumor-specific cognate immune response for tumor resolution. Whether cell death is immunogenic or not depends on the presence of tumor-specific antigens, as well as on the lethal hit. Thus, oxaliplatin (OX) and anthracy-clines induce immunogenic cell death, whereas other chemo-therapeutic agents such as cisplatin and alkylating agents tend to induce nonimmunogenic cell death (Casares et al., 2005; Obeid et al., 2007). Stressed and dying tumor cells may emit a particular pattern of “danger signals,” and these cell death–associated molecules are either exposed on the surface of dying cells or secreted into the microenvironment. The com-bined action of “find-me” and “eat-me” signals, together with the release of hidden molecules that are usually secluded within live cells may influence the switch between silent corpse removal and inflammatory reactions that stimulate the cellular immune response (Zitvogel et al., 2010). We initially described the crucial importance of an eat-me signal represented by the early translocation of the endoplasmic reticulum resi-dent calreticulin–ERp57 complex to the plasma membrane for the immunogenicity of tumor cell death (Obeid et al., 2007; Panaretakis et al., 2008, 2009). Next, we showed that the nuclear alarmin HMGB1 must be released into the tumor microenvironment to engage TLR4 on host DCs to facilitate antigen processing and presentation (Apetoh et al., 2007). We also reported that ATP released from dying tumor cells could trigger the purinergic P2RX7 receptor on host DC, stimulat-ing the release of IL-1, which in turn facilitates the priming of CD8+ tumor-specific T cells for IFN- production that is indispensable for the success of chemotherapy (Ghiringhelli et al., 2009).

Although the contribution of IFN- to tumor surveil-lance and anticancer immune responses is clearly established, that of the IL-17A–IL-17R pathway remains controversial (Martin-Orozco and Dong, 2009; Muranski and Restifo, 2009; Ngiow et al., 2010). In tumor models where CD4+ T cells are the source of IL-17, this cytokine could induce Th1-type chemokines, recruiting effector cells to the tumor microenvironment (Kryczek et al., 2009) or promote IL-6–mediated Stat3 activation, acting as a protumorigenic trigger (Kortylewski et al., 2009; Wang et al., 2009). Tumor-specific Th17 exhibited stronger therapeutic efficacy than Th1 cells upon adoptive transfer, and converted into effective IFN- producers (Muranski et al., 2008) and/or triggered the ex-pansion, differentiation, and tumor homing of tumor-specific CD8+ T cells (Martin-Orozco et al., 2009). IL-17–producing CD8+ T cells also reduced the volume of large established tumors and could differentiate into long-lasting IFN- pro-ducers (Hinrichs et al., 2009). In contrast, Kwong et al. (2010) described a tumor-promoting, IL-17–producing TCR +CD8+ cell subset. Therefore, the heterogeneous source

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CD8+ T and T cells were polarized to become potent pro-ducers of IFN- and IL-17, respectively. DX-based chemo-therapy substantially enhanced IFN- production by CD8+ and CD4+ TILs, as well as IL-17 production by TILs (Fig. 1 G).

T�7 cells preceded and predicted the accumulation of Tc� CTLs in tumor beds after chemotherapyKinetic experiments revealed that TILs invaded MCA205 tumor beds and produced IL-17 shortly after chemotherapy, with significant increases (9-fold) over the background 4 d after DX injection (Fig. 2 A, left). TILs still rapidly divided (as indicated by the expression of Ki67) 8 d after DX treat-ment (Fig. 2 B). This early induction of IL-17–producing T cells (Fig. 2 C, left) contrasted with the comparatively late induction of IFN-–producing CD8+ T cells, which emerged sharply 8 d after chemotherapy (Fig. 2 C, right) and rapidly proliferated (Fig. 2 B). Altogether, anthracyclines induced an early Th17-biased inflammation together with a marked Th1 polarization in MCA205 tumor beds, associated with a brisk infiltration of T17 cells followed by Tc1 effectors.

To generalize these findings, we systematically immuno-phenotyped TILs in CT26 colon cancer treated by a single intratumoral injection of DX, which significantly retarded tumor growth (Fig. 3 A). Indeed, the majority of IL-17A+ TILs were CD45+CD3bright. They failed to express CD4, but were positively stained with anti-TCR –specific antibodies (Fig. S2 A). Consistently, chemotherapy dramatically increased the frequency of IFN-–producing CD8+ T lymphocytes (Tc1; Fig. 3 B) and IL-17A–producing T cells ( T17; Fig. 3 C) in the tumor microenvironment. Next, we moni-tored transplantable TS/A mammary carcinomas treated with local radiotherapy, which operates in a T cell–dependent manner (Apetoh et al., 2007). Irradiation of TS/A tumors led either to tumor regression or to no response, and hence tumor progression (Fig. 3 D). An accumulation of both Tc1 (Fig. 3 E) and T17 (Fig. 3 F) lymphocytes was found in those tumors that responded to radiotherapy, but not in those that continued to progress or in untreated controls. Importantly, in each of the three tumor models that we tested, a clear correla-tion was observed between tumor invading T17 and Tc1 cells (Fig. 3 G).

T17 TILs were preponderantly CD44+ CD62L CD69+ and Granzyme B+. They did not express CD24, c-kit, NKG2D, CD27 (a thymic determinant for IFN-–producing T cells; Ribot et al., 2009), SCART2 (a specific marker for peripheral IL-17–producing cells which can be down-regulated upon activation; Kisielow et al., 2008), or CD122 (a marker for self antigen-experienced T cells with potential to pro-duce IFN- (Jensen et al., 2008; unpublished data). FACS in-dicated that 60% of T17 used V4 chain (nomenclature of V genes according to Heilig and Tonegawa [1986]), but expression of V1 and V7 chain was rarely found (Fig. S2 B). We then sorted V1V4V7 T17 TILs (Fig. S2 C) and performed single-cell PCRs and sequencing (Pereira and Boucontet, 2004) to examine their V chain usage. The ma-jority of these cells (21 of 23 clones) contained functional

RESULTSA marked Th� pattern 8 d after chemotherapyAnthracyclines induce immune responses that culminate in CD8+ T cell– and IFN-/IFN-R–dependent antitumor effects (Ghiringhelli et al., 2009). To further study chemo-therapy-induced immune effectors at the site of tumor retar-dation, we performed quantitative RT-PCR to compare the transcription profile of 40 immune gene products expressed in MCA205 tumors, which were controlled by the anthracy-cline doxorubicin (DX) 8 d after treatment (Fig. 1 A, top), with that of progressing, sham-treated (PBS) tumors (Fig. 1 A, bottom). Several Th1-related gene products were specifically induced in regressing tumors (Fig. 1 B). In particular, the Th1 transcription factors Eomes and Tbx21 (also called T-bet) and their target, IFN-, were increased by 4–5 fold in DX versus PBS-treated tumors (Fig. 1 C, left). Unsupervised hierarchical clustering indicated that IFN- production correlated with that of the quintessential Th1 transcription factor, Tbx21. By day 8, the protein levels of IFN- also increased in DX-treated MCA205 sarcomas (Fig. 1 D, left). Other sur-rogate markers of Th1 responses (lymphotoxin-, Ccl5, Cxcl10, Cxcl9, and TNF) were also significantly induced at the mRNA level after DX treatment (Fig. 1, B and C, left). Another set of gene products was also overexpressed in the context of DX-induced tumor regression. These genes en-coded IL-7R, IL-21, AhR, Cxcl2, and Foxp3, suggesting that inflammation and/or tissue repair occurred in the tumor bed (Fig. 1, B and C, right). Indeed, by day 3 after chemotherapy, the protein levels of the inflammatory cytokine IL-17 were significantly increased within tumor homogenates (Fig. 1 D, right).

Reinforcing this finding, we found that AhR, a sensor of small chemical compounds, is involved in the success of anthracycline-based therapy in this model. AhR is recognized as a transcriptional regulator for the optimal IL-17–associated immune response, promoting the differentiation and/or mainte-nance of IL-17–producing cells (Esser et al., 2009). CH-223191 is a pure antagonist of AhR because it does not have any ago-nist actions up to 100 µM (Kim et al., 2006). Blocking AhR with CH-223191 markedly reduced the efficacy of DX on established cancers in vivo (Fig. S1 A). This contrasts with the observation that CH-223191 had no cell autonomous effects on the tumor cells, alone or in combination with anthracy-clines (Fig. S1 B).

DX (compared with PBS) induced a threefold increase in the proportions of both IFN-– and IL-17–producing tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as tested by flow cytom-etry (FACS; Fig. 1 E). To identify the cellular source of IFN- and IL-17, TILs were immunophenotyped by cell surface staining and intracellular detection of the cytokines with FACS. Careful analyses revealed that the major source of IFN- was CD8+ T cells, whereas that of IL-17 was mostly TCR + T cells rather than CD4+ Th17 cells 8 d after che-motherapy in MCA205 sarcomas (Fig. 1 F). We further ana-lyzed the IFN- and IL-17 production by each subset of TILs. CD4+ T cells could secrete IFN-, but rarely IL-17.

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Figure �. Th� and Th�7 immune response in tumors after chemotherapy. (A) Mice bearing MCA205 tumors were treated with PBS (solid symbols) or DX (open symbols) intratumorally at day 7 after tumor inoculation. Tumor growth was monitored at the indicated time points. (B and C) 8 d after chemo-therapy (day 15 after tumor inoculation), tumor homogenates in PBS and DX groups were tested by quantitative RT-PCR (qRT-PCR). (B) Fold changes of gene expression are shown as a heat map. (C) Th1- and Th17-related gene expression in DX versus PBS groups (with a fold change >2) are listed. (D) Measurements of IFN- and IL-17A protein in tumor homogenates by ELISA at the indicated time points. (E and F) Single-cell suspension of MCA205 tumors (day 8 after DX) were analyzed by FACS. (E) Expression of IFN- and IL-17A in TILs was tested by intracellular staining gated on live, CD45+ and CD3+ cells. (F) IFN-+ and IL-17A+ cells were gated, and the proportions of CD3+ CD8+ cells and CD3+ TCR + cells were examined in DX-treated tumors. A typical dot plot analysis (left) and the absolute numbers of Th17 and T17 cells in the whole tumors (right) are shown. (G) IFN- and IL-17A production by total CD4+, CD8+, and TCR + TILs. Representative FACS plots in DX-treated tumors (left) and the percentages in PBS- or DX-treated tumors (right) are shown. Each group contained at least five mice, and each experiment was performed at least twice, yielding similar results. Graphs depict mean ± SEM of fold change of gene expression (C), pro-tein content (D), percentages, or absolute numbers of positive cells (E and G). *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001.

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abolished antigen-specific T cell priming in re-sponse to dying cells, yet had no negative effect on T cell priming by OVA holoprotein admixed with CpG oligodeoxynucleotides (Fig. 5 A, left). Consistently, a neutralizing anti–IL-17A anti-body, but not the isotype control Ig (CIg), markedly impaired the OVA-specific T cell in-duced by OX-treated EG7 (Fig. 5 A, right). Be-cause Th1/Tc1 immune responses against dying

tumor cells mediate a prophylactic protection against rechal-lenge with live tumor cells (Apetoh et al., 2007; Ghiringhelli et al., 2009), we addressed the functional relevance of the IL-17A–IL-17RA pathway in this setting. Subcutaneous in-jection of mitoxantrone (MTX)-treated MCA205 sarcoma cells could protect WT mice, but not athymic nude mice, against rechallenge with live MCA205 tumor cells (Fig. 5 B). The efficacy of this vaccination was attenuated in IL-17RA/ mice. Because IL-17 was not significantly produced by CD4+ or CD8+ T cells, neither in tumor beds during chemotherapy (Fig. 1 G) nor in the tumor draining LNs (unpublished data), we refrained from investigating Th17 cells and rather focused on T and NKT cells as potential IL-17 producers (Mills, 2008; Pichavant et al., 2008) that might contribute to the anti-cancer vaccination by dying tumor cells. Although CD1d/ mice, which lack all NKT population (Godfrey et al., 2010), were undistinguishable from WT controls in their ability to resist live tumor cells rechallenge after a dying tumor cell vac-cine, V4/6/ mice (Sunaga et al., 1997) exhibited a reduced capacity to mount this anticancer immune response (Fig. 5 B). These results suggest that IL-17A, IL-17R, and T17 cells all play a partial role in the afferent phase of the immune re-sponse against dying tumor cells, which includes T cell prim-ing for IFN- production.

IL-�–dependent, but not IL-23-dependent, activation of T lymphocytesThe IL-1–IL-1R1 pathway is mandatory for eliciting Tc1 immune responses and for the efficacy of chemotherapy (Ghiringhelli et al., 2009). Moreover, we found an IL-1– related gene expression signature after chemotherapy in tumor beds (Fig. 1 B), prompting us to address its role in the activa-tion of T17 cells.

To explore the molecular requirements for T17 activa-tion in situ, we sorted T cells from the skin-draining LNs

V6 rearrangements identical to those found in fetal T cells (Lafaille et al., 1989). These experiments show that most T17 TILs express V4 or V6 chains (Fig. S2, D and E).

Thus, chemotherapy and radiotherapy could trigger the accumulation of cytokine producing TILs in the tumor bed. This applies to distinct subsets of T cells that rapidly invaded tumor and become IL-17 producers, correlating with the accu-mulation of Tc1 cells, which contribute to the chemotherapy-induced anticancer immune response.

The IL-�7A–IL-�7R pathway is involved in the immunogenicity of cell deathBecause both Tc1 and T17 cells accumulated within tumors after chemotherapy or radiotherapy in a coordinated fashion, we determined whether neutralizing their signature cytokines IFN- and IL-17A could mitigate the efficacy of anticancer therapies. Antibody-mediated neutralization of either IFN- or IL-17A negatively affected the growth-retarding effect of DX against MCA205 tumors (Fig. 4 A). The mandatory role of the IL-17A–IL-17RA pathway was confirmed using neu-tralizing anti–IL-17RA antibodies and IL-17A/ mice in the same tumor model (Fig. 4 B), in DX-treated MCA2 sar-comas (Fig. 4 C), as well as in OX-treated, OVA-expressing EG7 thymomas or CT26 colon cancers (Fig. 4, D and E).

To rationalize the sequential recruitment of T17 and Tc1 cells into the tumor bed after chemotherapy, we hypoth-esized that T17 might act as helper cells for Tc1 priming. We previously reported that specific antitumor immune re-sponses rely on Tc1 cells primed by tumor cells undergoing immunogenic cell death by using a system in which IFN- production by OVA-specific T cells could be triggered by OX-treated EG7 cells (Ghiringhelli et al., 2009). We used this system to check whether IL-17 is involved in initiating the specific antitumor response, comparing normal WT with IL-17RA/ mice. In this assay, the absence of IL-17RA fully

Figure 2. T�7 cells preceded Tc� CTL into tumors after chemotherapy. (A) The percentages of IL-17– and IFN-–producing cells among all tumor infiltrating T cells and CD8+ T cells, respectively, are plotted before and at the indicated time points after tumor inoculation. Mice were treated with PBS (filled symbols) or DX (open sym-bols) at day 7. (B) Ki67 expression on T and CD8+ TILs 8 d after treatment. (C) The percentages of T17 and Tc1 among all CD3+ TILs at the indicated time points after tumor inoculation. DX was given at day 7. These experi-ments were performed twice on 5–10 tumors at each time point. *, P < 0.05; **, P < 0.01.

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Thus, BM-derived DCs (BMDCs) that had been loaded with DX-treated MCA205 (Fig. 5 C; or CT26, not depicted), but not with live tumor cells, produced IL-1 and markedly stim-ulated the release of IL-17 and IL-22 by T cells (Fig. 5 C). As a quality control for in vitro–generated DCs, the expres-sion of CD11c, MHC class II, CD11b, and F4/80 was as-sessed. Only qualified DC preparations that contain functional DCs (>80% CD11c+MHCII+) rather than macrophages (>70% CD11b+F4/80+CD11c) could activate T cells for IL-17A production when they encountered DX-treated tumor cells. CD11b+Gr1+ neutrophils reportedly produce IL-17 and promote downstream IL-12/IFN- contributing to reperfu-sion injury (Li et al., 2010). Interestingly, CD11b+Gr1+ cells sorted from DX-treated tumor beds bearing the IL-1 mes-senger RNA failed to secrete IL-1 or IL-17A protein and failed to activate T cells for IL-17A production in vitro (unpublished data). IL-17 production by T cells was de-pendent on IL-1 because the IL-1R1 antagonist IL-1RA entirely abrogated the DC/ T cell cross talk in the presence

of naive mice (around 1–2% of the LN T cell pool). Among these T cells, 70% harbored the V4 TCR. Moreover, these cells vigorously produced IL-17A (but not IFN-) upon stimulation with PMA/ionomycin (Fig. S2 F; Do et al., 2010). In contrast to Th17 cells (Ivanov et al., 2006), LN-resident T cells failed to produce IL-17 in response to TGF- or IL-6 alone, or in combination with IL-1. However, they potently secreted IL-17 and IL-22 in response to the combined stimu-lation of IL-1 plus IL-23 (unpublished data; Sutton et al., 2009). TCR engagement also synergized with IL-1 (and to a lesser extent with IL-23) to trigger IL-17 and IL-22 secre-tion by LN-resident T cells (unpublished data). It is note-worthy that these stimuli specifically activated IL-17A, but not IFN- production by T cells. Because T17 cells were activated (as indicated by their Ki67+, GzB+, CD69+, and IL-17+ phenotype) after chemotherapy, we addressed whether dying tumor cells could directly promote the activation of T17. Although DX-treated MCA205 cells failed to directly in-duce IL-17 secretion by T cells, they did so indirectly.

Figure 3. Recruitment of both Tc� and T�7 cells in CT26 and TS/A tumors that correlate with better tumor control. (A–C) CT26 colon cancer treated with anthracyclines. (A) Tumor size before and 8 d after treatment with PBS (filled symbols) or DX (open symbols). (B) The percentage of CD8+ T cells among CD3+ cells and of IFN-–producing cells among CD8+ T cells. (C) The percentage of T cells among CD3+ cells and of IL-17A–producing cells among CD3+ T cells. Data are presented as mean ± SEM with five tumors/group. (D–F) TS/A mammary cancer treated with x rays. (D) Established TS/A tumors were treated with local irradiation (open symbols) on day 10. Mice were segregated into nonresponders (tumor progression [TP], triangles) and responders (tumor regression [TR], circles) 22 d after radiotherapy (n = 5). (E) The percentage of CD8+ T cells among CD3+ cells and of IFN--producing cells among CD8+ T cells; (F) The percentage of T cells among CD3+ cells and of IL-17A–producing cells among CD3+ T cells are indicated as mean ± SEM. (G) The correlation between the percentages of T17 and Tc1 TILs in all tumors (treated or not) was plotted for MCA205, CT26, and TS/A tumors (each dot representing one mouse). Data are representative of two to three independent experiments. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001.

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T lymphocytes are indispensable for the immune-dependent effects of chemotherapyTo further evaluate the contribution of T cells to the therapeutic action of DX on es-tablished MCA205 sarcomas, such tumors were implanted into age- and sex-matched WT, TCR /, V4/6/ mice, and then subjected to chemotherapy. As compared with WT controls, the absence of the TCR chain, as well as that of V4 and V6 T cells, greatly reduced the efficacy of chemotherapy (Fig. 6 A). At day 8 after chemotherapy, when T17 and Tc1 massively infiltrated tumor beds in WT mice, these cytokine-producing TILs were either absent or greatly reduced in V4/6/ mice (Fig. 6 B), suggesting that the presence of V4 and V6 T cells are critical for the optimal Tc1 response in tumor beds.

Expression of CCR6 is a phenotypic and functional hall-mark of Th17 cells (Reboldi et al., 2009) during some inflam-matory processes. We therefore analyzed the role of CCR6 in the efficacy of chemotherapy. Because CCL20 was detectable in tumor tissues before and after chemotherapy (unpublished data), we assessed whether T17 cells could be recruited in a CCL20/CCR6-dependent manner. The tumoricidal activ-ity of DX against CT26 was not affected by repetitive sys-temic injections of neutralizing anti-CCL20 antibody before and during anthracycline treatment (Fig. S3 B). Consistently, anthracycline treatment against established MCA205 sarcoma remained efficient in CCR6 loss-of-function mice. Moreover, CCR6 deficiency did not influence tumor infiltration by T17 (unpublished data). Therefore, V4 and V6 T cells contribute to the immune-mediated action of anticancer agents in a CCR6-independent fashion.

Next, we determined the contribution of adoptively trans-ferred T cells to the efficacy of chemotherapy. The infusion of T cells derived from skin-draining LNs (from naive

of dying cells. The neutralization of IL-18R, IL-23, or IL-23R failed to abolish IL-17 production by T cells co-cultured with DCs (Fig. 5 D). IL-22 production was completely abol-ished by blocking the IL-1–IL-1R or IL-23–IL-23R path-ways but not affected by IL-18R blockade. Interestingly, chemotherapy lost part of its anticancer activity in IL-1R1–deficient mice, yet maintained its efficacy in mice treated with IL-23p19–neutralizing antibodies or in IL-23p19/ mice (Fig. 5, E–G). IL-1–activated T cells produced IL-17 and IL-22 (Fig. 5, C and D). However, IL-22 did not play an es-sential role in the antitumor effects promoted by chemother-apy (Fig. S3 A). It is of note that the antibody we used in this experiment could block the bioactivity of IL-22 in a lung bacterial infection model (Aujla et al., 2008), and IL-22 mRNA in the bulk TILs was below the detection limit of quantitative RT-PCR. Collectively, these results underscore the importance of IL-1 and IL-17 for the immune-dependent anticancer effects of chemotherapy, yet suggest that both IL-23 and IL-22 are dispensable for such effects.

Figure 4. A mandatory role for the IL-�7A–IL-�7RA pathway in the efficacy of chemotherapy. (A) Mice bearing established MCA205 sarcomas were treated with local PBS (filled symbols) or DX (open symbols) 7 d after tumor inoculation and with sys-temic neutralizing antibodies against mouse IFN- (left), IL-17A (right), or control Ig (CIg) i.p. every 2 d (3 injections, 200 µg/mouse) starting on the day of DX. (B–E) WT (circles or squares) or IL-17A/ (triangles) mice bearing established MCA205 sarcomas (B), MCA2 (C), EG7 (D), or CT26 (E) tumors were treated with PBS (B-E, solid symbols), DX (B and C, open symbols), or OX (D and E, open symbols) together with systemic administration of neutralizing antibodies against IL-17RA (squares) or CIg. Tumor sizes are plotted as mean ± SEM for 5–15 mice/group, and each experi-ment was repeated at least 2 times, yielding similar results. *, P < 0.05; **, P < 0.01.

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Figure �. Role of T�7 in the priming of T cell responses during an immunogenic cell death and regulation by IL-�. (A) OX-treated EG-7 cells were inoculated in the footpad of WT versus IL-17RA/ mice (n = 5; left) along with anti–IL-17A neutralizing antibody (or CIg; right panel). OVA-specific IFN- secretion by draining LN cells was measured in vitro by ELISA after stimulation with OVA protein (1 mg/ml). OVA/CpG immunization was used as positive control. (B) Immunization with MTX-treated MCA205 and rechallenge with a tumorigenic dose of live MCA205 were performed at day 0 and day 7, respectively in WT C57Bl6 (n = 10), nude (n = 10), V4/6/ (n = 15), IL-17RA/ (n = 8), and CD1d/ (n = 6) mice. The percentages of tumor-free mice were scored at the indicated time points. Experiments in A and B were performed twice with similar results. (C) Production of IL-1, IL-17A, and IL-22 from mixed co-cultures of LN-derived T cells and/or BMDCs loaded or not loaded with live or DX-treated MCA205 was monitored by ELISA. Data are shown as mean ± SEM (D) Co-cultures of DX-treated MCA205/BMDC/ T were performed in the presence of 20 µg/ml IL-1RA (Amgen), anti–IL-23, or

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When exploring the source of IL-17A elicited by dying tumor cells, we found that T cells were the quantitatively and func-tionally most important IL-17A producers, based on several observations. First, in the context of chemotherapy, IL-17–producing cells accumulated in tumors, and most of them were positive for T markers. Sec-ond, antigen-specific CD4+ T cells in LNs

draining the dying tumor cells showed a Th1 (IL-2 and IFN-) instead of a Th17 cytokine pattern (Ghiringhelli et al., 2009). CD4+ and CD8+ TILs were polarized to produce IFN- instead of IL-17. Also, IL-6 and TGF-, two key regu-latory cytokines essential for the differentiation of Th17 cells (Ivanov et al., 2006; Veldhoen et al., 2006), were dispensable for the efficacy of chemotherapy or vaccination with dying tumor cells (Fig. S3, C and D), suggesting that Th17 cells may not be required for the anticancer immune response after chemotherapy. Third, when popliteal LNs were recovered from mice that had been injected with dying (but not live) tumor cells through footpad, the restimulation of LN-resident cells using anti-CD3 plus IL-23 readily enhanced IL-17 production (unpublished data), a feature common to memory T cells (van Beelen et al., 2007), innate NKT (Rachitskaya et al., 2008), and T cells (Sutton et al., 2009). Fourthly, the subset of NKT cells capable of producing IL-17 in LNs (CD103+CD4NK1.1CCR6+CD1d tetramer+; Doisne et al., 2009) did not appear to be specifically triggered by dying cells in vivo (unpublished data). Moreover, CD1d/ mice, which lack NKT cells, were indistinguishable from WT mice when the efficacy of chemotherapy was assessed in prophy-lactic vaccination settings. Fifthly, knockout of V4/6 or TCR attenuated the protective antitumor vaccination with dying tumor cells and reduced the efficacy of the anthra-cycline-based chemotherapy on established tumors. Finally, the adoptive transfer of WT T cells into IL-17A/ hosts could restore the clinical response to chemotherapy and improve

WT mice) into tumor beds 2 d after DX potentiated the growth-retarding effect of chemotherapy, yet had no effect on PBS-treated tumors (Fig. 7 A). Importantly, synergistic antitumor effects of DX and adoptively transferred T cells were lost when the T cells were obtained from IL-17A/ or IL-1R1/ donors (Fig. 7, B and C), emphasiz-ing the role of IL-1 responses and IL-17 production in the function of T cells. Moreover, the adoptive transfer of WT T cells could restore the antitumor efficacy of chemotherapy in IL-17A–deficient mice (Fig. 7 D). Collectively, these results emphasize the important contribution of T17 cells to the immune-dependent effects of anticancer chemotherapy.

DISCUSSIONOur results highlight a role of T cells, particularly the V4- and V6-expressing subsets that produce the effector cytokine IL-17A, in the anticancer immune response induced by cytotoxic chemotherapeutics. We demonstrated that the IL-17A–IL-17RA signaling pathway is required for the priming of IFN-–secreting, antigen-specific T cells by tumor cells ex-posed to chemotherapy. This tumor-specific, Tc1-mediated im-mune response is essential for anticancer immunity because the protective effect of dying tumor cell vaccination is lost in athymic nude mice or when CD8+ T cells are depleted (Casares et al., 2005), and chemotherapy fails to work when the IFN-–IFN-R system is blocked (Ghiringhelli et al., 2009). Accordingly, we found that the absence of the IL-17A–IL-17RA pathway reduced the capacity of mice to mount a protective antitumor response.

IL-23R neutralizing antibodies, or 10 µg/ml IL-18BP. Experiments in C and D were repeated three to six times. (E and G) Tumor size was monitored in WT (circles), IL-1R1/ (diamonds), and IL-23p19/ (squares) mice treated with PBS (filled symbols) or DX (open symbols; E and F), or in WT mice treated with systemic anti–IL-23 neutralizing antibodies (squares) or CIg (circles; G). Data are representative of 2 experiments with 6–10 mice/group. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001.

Figure 6. The therapeutic activity of anthra-cyclines and tumor colonization of Tc� depend upon V4 V6 T cells. (A) WT, TCR /, or V4/6/ mice with established MCA205 tumors were injected intratumorally with PBS or DX. Tumor size was measured at the indicated time and plotted as mean ± SEM (n = 8/group). (B) Percentage of IL-17A– or IFN-–expressing cells within CD3+ TCR+ and CD3+ CD8+ TILs, respectively, in WT or V4/6/ mice. A typical dot plot is shown (left) and statisti-cal analysis was performed with combined data from two independent experiments (right). *, P < 0.05; ***, P < 0.001.

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results imply a causal relationship between the presence of T17 cells and the recruitment of antitumor effector Tc1 cells into tumor beds.

T cells represent a major source of IL-17 during lung infection by Mycobacterium tuberculosis (Lockhart et al., 2006; Umemura et al., 2007) and liver infection by Lysteria (Hamada et al., 2008). T cell-derived IL-17 is critical for the recruit-ment of neutrophil recruitment into the peritoneal cavity after Escherichia coli inoculation (Shibata et al., 2007). T cells can be directly stimulated through TLR2, TLR1, and/or dectin-1 in response to Mycobacterium tuberculosis and Candida albicans to produce IL-17 in synergy with IL-23 (Martin et al., 2009). As to the mechanisms that link chemotherapy-elicited tumor cell death to the accumulation of T17 cells, our data suggest that IL-1 acts as a major trigger. One previ-ous report demonstrated the pivotal function of IL-1 in regulating T17 cells in experimental autoimmune enceph-alomyelitis (EAE; Sutton et al., 2009). In that model, IL-1 synergized with IL-23 to promote IL-17 production by T, which in turn, stimulated the differentiation of pathogenic Th17 cells.

Our data can be interpreted to support the contention that the context and immune orchestration at the site of cell death may be critical for an optimal contribution of the im-mune system to the efficacy of anticancer therapies. The pres-ent data introduces the idea that T17 cells are part of the innate immune response that facilitates the subsequent cognate anticancer T cell responses. It remains a formidable challenge for investigating further how the innate and cognate immune effec-tors develop a dialog within the three-dimensional architec-ture of the tumor composed of dying and live tumor cells, as well as multiple stromal elements. Should T17 cells also be recruited into human tumor beds after chemotherapy, it would be of the utmost importance to determine their TCR V usage to propose combination therapy of phosphoantigens (for V2+) or other ligands or innate cytokines (for V2) and anthracyclines to increase therapeutic benefit in neoadjuvant settings or prevent metastases.

MATERIALS AND METHODSMice. WT C57BLl/6 (H-2b) and BALB/c (H-2d) mice aged between 7 and 12 wk were purchased from Harlan. Nude mice were bred in the animal facil-ity of Institut Gustave Roussy. TCR /, IL-1R1/, and IL-17RA/(H-2b) mice were bred at Cryopréservation, Distribution, Typage, et Archivage Ani-mal (Orléans, France) by B. Ryffel (CNRS, Orleans, France) and P. Pereira (Institut Pasteur, Paris, France; TCR / was bred in the same manner). IL-23p19/ and IL-17A/ (H-2b) were provided by M.J. Smyth (Peter Mac-Callum Cancer Centre, Victoria, Australia). V46/ mice (H-2b) were provided by G. Matsuzaki (University of the Ryukyus, Okinawa, Japan) and K. Ikuta (Kyoto University, Kyoto, Japan). CD1d/ and CCR6/ (H-2b) mice were bred at St. Vincent de Paul Hospital AP-HP (Paris, France) and provided by K. Benlagha. The experimental protocols were approved by the Animal Care and Use Committee in the animal facility of Institut Gustave Roussy.

Cell lines and reagents. CT26 (H-2d) colon cancer, MCA205 (H-2b) and MCA2 (H-2d) sarcoma, TS/A mammalian cancer (H-2d), and EG7 thymoma (H-2b) were cultured in RPMI 1640 containing 10% FBS, 2 mM l-glutamine, 100 IU/ml penicillin/streptomycin, 1 mM sodium pyruvate, and 10 mM

the response in WT hosts, and this latter effect was lost when T cells from IL-17A/ (rather than WT) donors were used.

In the context of immunogenic chemotherapy, it appears clear that IL-1 plays a major role in stimulating IL-17 pro-duction and the anticancer function of T cells. The key role of IL-1 in regulating T cells function was shown by using IL-1RA in co-cultures of DCs/ T cells in the pres-ence of dying tumor cells. Also, T cells that lack IL-1R1 lose the capacity to amplify the tumoricidal action of anthra-cyclines. Interestingly, inflammasome-dependent IL-1 secre-tion from DCs was also found to be mandatory for the polarization of CD8+ T cells toward a Tc1 pattern (Ghiringhelli et al., 2009), suggesting that a connection between DCs, T17 cells, and Tc1 cells might be important for optimal anti-cancer immune responses. We noticed a strong correlation between T17 and Tc1 cells after chemotherapy in three different tumor models. We also noticed that the production of IL-17 production preceded that of IFN- by TILs. It is well possible that besides helping the development of Tc1 response, T17 cells might enhance the chemoattraction of effector Tc1 into the tumor beds. These results are compatible with observations obtained in a cancer-unrelated context, micro-bial infection, in which T17 associated with Th1 responses exert protective immune response (Umemura et al., 2007). As IL-17 could not directly induce IFN- production or enhance proliferation of CD8+ T cells (unpublished data), our

Figure 7. Role of T cell–derived IL-�7A during chemotherapy. CD3+ TCR + or CD3+ TCR T cells from WT mice (A), CD3+ TCR + T cells from IL-17A/ (B), or IL-1R1/ (C) mice were injected intratumorally into MCA205-bearing WT mice (A–C) or IL-17A/ mice (D) 2 d after PBS or DX treatment. Tumor sizes are plotted as mean ± SEM for five mice/group. Experiments were repeated two to three times with similar results. *, P < 0.05; **, P < 0.01.

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IL-17A or CIg was injected i.p. 5 d later, the popliteal LN cells were har-vested, seeded in a 96-well plate at 3 × 105/well and restimulated with 1 mg/ml OVA protein. IFN- secretion was measured by OptEIA Mouse IFN- ELISA kit (BD). MCA205 cells were treated with 2 µM MTX overnight, washed thoroughly, and injected into left flank s.c. at 3 × 105/mouse. PBS was used as control. Mice were rechallenged with 5 × 104 live MCA205 cells in the right flank 7 d later. Tumor growth was monitored every 2–3 d.

DC-tumor mixed lymphocyte cultures. DCs were propagated in Iscoves’s medium (Sigma-Aldrich) with J558 supernatant (40 ng/ml GM-CSF), 10% FCS, 100 IU/ml penicillin/streptomycin, 2 mM l-glutamine, 50 µM 2-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) and used between day 8 and 12 when the proportion of CD11c/MHC class II+ cells was >80%. In mixed co-cultures, DCs were seeded at 105/100 µl/well in U-bottom 96-well plates. Tumor cells were treated overnight with 25 µM DX or left untreated, washed, and used at 7.5 × 104/100 µl/well. 2 × 104/50 µl T cells were added 12 h later. Supernatant was collected 36 h later.

Statistical analyses of experimental data. All results are expressed as mean ± SEM, or as ranges when appropriate. For two groups, normal distri-butions were compared by unpaired Student’s t test. Non-normal samplings were compared using the Mann-Whitney test or Wilcoxon matched paired test when appropriate. The log-rank test was used for analysis of Kaplan-Meier survival curve. Statistical analyses were performed using Prism 5 soft-ware (GraphPad). P values of <0.05 were considered significant.

Online supplemental material. Fig. S1 shows the effect of AhR antago-nist on the efficacy of chemotherapy (DX). Fig. S2 depicts the V chain usage of tumor-infiltrating T17 and T cells in the LNs of naive mice. Fig. S3 shows the effect of neutralizing IL-22, CCL20, IL-6, or blocking TGF- on the efficacy of chemotherapy or vaccine. Online supplemental material is avail-able at http://www.jem.org/cgi/content/full/jem.20100269/DC1.

This work was supported by LIGUE labellisée (L. Zitvogel and G. Kroemer), INFLA-CARE FP7 EU grant, INCa, Fondation pour la Recherche Médicale ,and Fondation de France. Y. Ma was supported by the China Scholarship Council. N.F. Delahaye was supported by INCa and INFLACARE FP7. L. Apetoh was supported by the Agence Nationale pour la Recherche [ANR-10-PDOC-014-01].

The authors have no conflicting financial interests.

Submitted: 8 February 2010Accepted: 4 February 2011

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Hepes at 37°C, 5% CO2. All media were purchased from Invitrogen. Recom-binant mouse IL-1, IL-23, IL-6, TGF-, and IL-18 BPd/Fc were purchased from R&D Systems. AhR antagonist CH223191 was obtained from EMD. DX hydrochloride (D1515), MTX dihydrochloride (M6545), and DiOC6(3) were obtained from Sigma-Aldrich. Mouse IL-17A, IL-1, and IL-23p19 ELISA kits were purchased from eBioscience. Mouse ELISA kits and neutral-izing antibody for IL-22 (AF582; AB108C as isotype control) were purchased from R&D system. Antibodies for CD45.2 (104), CD3 (145-2C11), CD4 (GK1.5), CD8 (53–6.7), TCR (GL-3), CD69 (H1.2F3), IL-17A (TC11-18H10), or IFN- (XMG1.2) were purchased from BD or eBioscience. Anti-SCART2 polyclonal serum was provided by J. Kisielow (Swiss Federal Institute of Technology, Zurich, Switzerland). Neutralizing antibodies for IL-17A (MAB421), IFN- (XMG1.2), CCL20 (MAB760), IL-23 (AF1619), IL-23R (MAB1686), IL-6 (MAB406), and IL-22 (AF582) were purchased from R&D Systems. CpG oligodeoxynucleotide 1668 was obtained from MWG Biotech AG. Anti–TGF- peptide P17 and control peptide were obtained from J.J. Lasarte (University of Navarra, Pamplona, Spain; Dotor et al., 2007),

Tumor models and chemo/radiotherapy. 8 × 105 MCA205, EG7, CT26, TS/A, or MCA2 tumor cells were inoculated s.c. near the thigh into syngeneic mice. Chemotherapy was performed in MCA205 and CT26 mod-els by intratumoral injection of DX (2 mM, 50 µl) or OX (5 mg/kg body weight, i.p) when tumors reached 25-45 mm2. Radiotherapy was performed by local x-ray irradiation (10 Gy; RT250; Phillips) at the unshielded tumor area when TS/A tumor reached 40–60 mm2.

Gene expression assays. Whole RNA was extracted using RNEasy Mini kit (QIAGEN) from tumor homogenates. 5 µg of RNA from each sample were reverse-transcribed using QuantiTect Reverse Transcription kit (QIAGEN). Gene expression assays were performed with custom TaqMan Low Density Arrays using StepOnePlus Real-Time PCR System. PPIA was chosen as the endogenous control to perform normalization between different samples.

Tumor dissection and FACS analysis. Tumor burdens were carefully re-moved, cut into small pieces, and digested in 400 U/ml Collagenase IV and 150 U/ml DNase I for 30 min at 37°C. Single-cell suspension was obtained by grinding the digested tissue and filtering through a 70-µM cell strainer. Cells were blocked with 10 µg/ml anti-CD16/CD32 (eBioscience) before surface staining (2.5 µg/ml of each antibody). LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain kit (Invitrogen) was used to distinguish live and dead cells. For intracellular staining, freshly isolated cells were treated with 50 ng/ml PMA, 1 µg/ml ionomycin, and GolgiStop (BD) for 4 h at 37°C in RPMI contain-ing 2% mouse serum (Janvier). Cells were then stained with anti–IFN- and anti–IL-17 using a Cytofix/Cytoperm kit (BD).

Protein extraction. Tumors were mechanically dissociated with lysis buffer (T-PER Tissue Protein Extraction Reagent; Thermo Fisher Scientific) con-taining protease inhibitor (complete Mini EDTA-free; Roche). Tumor lysate was then centrifuged at 10000 g for 5 min at 4°C to obtain supernatant.

Purification and adoptive transfer of T cells. The skin-draining LNs (inguinal, popliteal, superficial cervical, axillary, and brachial LNs) were har-vested from naive mice (8–12 wk). Dead cells were removed from single-cell suspension (Dead Cell Removal kit) before T cell purification (TCR/+ T Cell Isolation kit) using AutoMACS Separator (Miltenyi Biotec) with rec-ommended programs. Purity of this isolation normally reached >95%. The TCR CD3+ cell fraction was also collected and used as control for some experiments. Day 2 after chemotherapy, 2.5 × 105 cells were injected directly into the tumor with insulin syringes for the adoptive transfer setting.

T cell priming and tumor vaccination. EG7 cells pretreated with 5 µg/ml OX overnight or left untreated were washed thoroughly and injected at 1 million/50 µl into the foodpad of naive syngeneic mice. CpG/OVA (5 µg CpG+1 mg OVA/mouse) and PBS injection were used as positive and nega-tive controls. In some setting, neutralizing antibody (200 µg/mouse) for

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62

DISCUSSION

1 Importance des modèles de tumeurs établies

Au cours de notre étude, nous avons utilisé deux types de modèles différents : des

modèles de vaccination prophylactique de souris naïves avec des corps apoptotiques et des

modèles de traitement de souris porteuses de tumeurs établies. Dans le premier cas, l’injection

de cellules tumorales mourantes ou de cellules dendritiques chargées avec des corps

apoptotiques en sous-cutané chez des souris naïves nous permet de mettre en évidence des

réponses spécifiques et protectrices. Ces protocoles sont bien appropriés pour élucider les

déterminants moléculaires directement impliqués dans l’immunogénicité de la mort cellulaire

induite par certains agents cytotoxiques. Il est notamment possible de modifier l’expression

de molécules au niveau des cellules tumorales ou des cellules dendritiques servant à la

vaccination. Ceci nous a permis de montrer que l’expression de P2RX7 sur les cellules

dendritiques était suffisante pour induire l’immunogénicité des corps apoptotiques in vivo.

Bien que très utiles, ces protocoles de vaccination ne sont pas aussi proches de la réalité

clinique que les protocoles de tumeurs établies. En effet, un des principaux objectifs de notre

travail est de proposer des solutions thérapeutiques pour des patients déjà atteints de cancer,

et traités par des chimiothérapies. Or, comme nous l’avons vu en introduction, le système

immunitaire réagit à la présence d’une tumeur et son état est différent chez un animal porteur

de tumeur que chez les souris naïves. Des études ont montré que les protocoles de

vaccinations prophylactiques présentaient une efficacité nettement supérieure aux protocoles

de vaccinations thérapeutiques 252. De plus, contrairement aux protocoles de vaccination

utilisant des cellules tumorales mourantes ayant été lavées des agents cytotoxiques, le

traitement de tumeurs établies peut induire la mort de cellules non tumorales. Ceci est

important car nous avons montré que des fibroblastes ou des macrophages traités avec de

l’oxaliplatine pouvaient induire une réponse immunitaire spécifique, dépendant de l’IL-1β

(Fig 4S, Nat Med). De plus, en agissant sur les tumeurs établies, les chimiothérapies peuvent

induire la libération de signaux de danger liés par exemple à la destruction de la matrice

extra-cellulaire, pouvant jouer un rôle important dans l’inflammation anti-tumorale observée 253. En utilisant des protocoles de tumeurs établies, nous avons montré que les

chimiothérapies immunogènes permettaient l’induction de réponses Th1 et Tc1 spécifiques

dans le ganglion drainant (Fig 1h, 6e, 6Sd Nat Med). L’étude des LTγδ infiltrant les tumeurs

nous a montré l’importance de l’environnement tumoral dans l’efficacité de certaines

63

thérapies anti-cancéreuses. Enfin, bien que présentant une signification clinique plus

importante que les modèles de vaccination, nos modèles de tumeurs établies présentent aussi

des limites. En effet, la grande majorité sont des modèles de tumeurs implantées en sous-

cutané, pour la plupart de manière non orthotopique (thymome EL-4, carcinome du colon

CT26). Or, la nature du tissu dans lequel se développe une réponse immunitaire peut avoir un

impact important sur la nature et la polarisation de cette réponse 254. En plus des nombreuses

molécules informatives qui peuvent être produites par des cellules spécifiques d’un tissu au

cours d’une inflammation, il existe des cellules immunitaires résidentes, spécifiques de

certains tissus. Une étude a notamment montré l’importance de LTγδ producteurs d’IL-17

présent dans le derme, pour l’activation de réponses immunitaires contre des antigènes

spécifiquement injectés dans la peau 255. Des différences dans le développement de réponses

immunitaires spécifiques ont également été mises en évidence dans une étude comparant

l’injection orthotopique ou sous-cutanée d’une lignée tumorale pancréatique 256. Enfin,

l’administration de certaines chimiothérapies en intra-tumoral, bien que permettant d’induire

un taux important de mort cellulaire localement, n’est pas directement comparable à ce qui se

fait en clinique.

2 Rôle de l’ATP extra-cellulaire dans le développement de réponses immunitaires

spécifiques

Nos travaux montrent que l’ATP extra-cellulaire libéré par les cellules tumorales

mourantes induit la production d’IL-1β par les cellules dendritiques suite à l’activation de

l’inflammasome NLRP3. De plus, nous montrons que ceci stimule des réponses Th1 et Tc1

anti-tumorales. D’autres études ont montré une libération d’ATP extra-cellulaire suite à des

lésions tissulaires. Ceci est notamment le cas des irritants chimiques cutanés, comme le

TNCB, utilisé comme sensibilisant dans des modèles murins de dermatite de contact (CHS) 257. Dans ces modèles, les cellules dendritiques (cellules de Langerhans) capturent l’allergène

et migrent dans le ganglion drainant où elles activent des LT spécifiques producteurs d’IFN-γ.

Les auteurs montrent que les souris P2rx7 -/- ne développent pas de CHS et que l’expression

de P2RX7 sur des cellules dendritiques sensibilisées au TNCB est suffisante pour restaurer la

maladie chez ces animaux. Comme dans notre étude, l’ATP se lie à P2RX7 et stimule

l’inflammasome NLRP3 et la production d’IL-1β, cytokine essentielle pour le développement

de la pathologie. Seul, l’ATP n’est pas suffisant pour induire la production d’IL-1β, qui

nécessite en plus, la présence d’un ligand de TLR. A l’instar d’HMGB1, impliqué dans la

64

production d’IL-1β dans notre modèle (Fig 8S du Nat Med), le hyaluronane, ligand endogène

des TLR-4 et -2, joue un rôle important dans la phase de sensibilisation de la CHS et pourrait

être impliqué dans la production d’IL-1β 258.

Une augmentation de l’ATP extra-cellulaire est également observée dans les poumons

de patients asthmatiques 24h après l’administration de l’allergène 259. Des études chez la

souris ont montré que cet ATP extra-cellulaire était impliqué dans l’inflammation Th2

caractéristique de l’asthme. Les cellules dendritiques exposées à l’ATP favorisent l’activation

de LT CD4 Th2, caractérisés par une production d’IL-4, d’IL-5 et d’IL-13 et une faible

production d’IFN-γ. L’ATP augmente l’expression de molécules de co-stimulation sur les

cellules dendritiques (CD40, CD80, CD83, CD86) mais diminue leur production d’IL-12 et

de TNF-α, tout en augmentant leur sécrétion d’IL-10. L’injection de cellules dendritiques

P2rx7 -/- chargées avec de l’OVA induit une pathologie asthmatique moins sévère qu’avec les

cellules dendritiques non mutées. Ceci est associé à une plus faible réponse Th2 dans les

ganglions drainants, notamment caractérisée par une plus faible production d’IL-13 260. Dans

notre modèle en revanche, aucune différence dans la production d’IL-12p40 n’a été observée

pour les cellules dendritiques P2rx7 -/- exposées aux corps apoptotiques (Fig 4d du Nat Med).

De même, l’activation de P2RX7 sur les cellules dendritiques favorise les réponses Th1 anti-

tumorales, mais ne modifie pas la production d’IL-13 et d’IL-10 par les LT spécifiques

(Fig7S du Nat Med). Une des explications de ces différences de polarisation des réponses T

par les cellules dendritiques exposées à l’ATP pourrait être la différence de concentration

extra-cellulaire d’ATP dans les différents modèles. Ceci est appuyé par des études chez

l’Homme qui ont montré que de faibles doses d’ATP induisait une maturation « pro-Th2 »

des cellules dendritiques, alors que de fortes concentrations favorisaient la production d’IL-1β 261 262.

Enfin, il est important de considérer les effets de l’ATP extra-cellulaire sur d’autres

cellules que les cellules dendritiques. L’ATP peut en effet directement agir sur les cellules

tumorales via le récepteur P2RX7 et favoriser leur prolifération ou induire leur apoptose, en

fonction de sa concentration 263. Dans le cancer du sein, les cellules tumorales expriment

moins de P2RX7 fonctionnels que les tissus épithéliaux sains, ce qui pourrait leur conférer un

avantage, en les protégeant des effets cytotoxiques de l’ATP extra-cellulaire 264. Ces données

nous invitent à rester prudents quant à l’interprétation de nos résultats concernant la cohorte

65

de patients atteints de cancer du sein. Nous ne pouvons en effet pas exclure que le mauvais

pronostic observé chez les patients présentant un polymorphisme de P2RX7 diminuant la

fonction du récepteur, soit en partie dû à l’expression de cette protéine au niveau des cellules

tumorales.

3 Rôle de l’IL-1β dans le développement de réponses Th1 et Tc1 spécifiques

Nos données montrent que l’IL-1β produit par les cellules dendritiques est nécessaire

pour l’induction de réponses Th1 et Tc1 spécifiques en réponse à des corps apoptotiques

immunogènes. Nous montrons également que l’IL-1β peut directement agir sur les LT CD8

pour induire leur polarisation vers un phénotype Tc1, producteur d’IFN-γ. Quelques études

ont montré le rôle positif de l’IL-1β dans le développement de réponses spécifiques. En plus

de sa capacité à synergiser avec différents agents mitogènes pour la prolifération de

thymocytes in vitro 265, l’IL-1β favorise la prolifération de LT CD4 Th1, Th2 et Th17 in vivo 266. Concernant la polarisation des réponses T, l’IL-1β est surtout associé au développement

de LT Th17. Cependant, son implication dans la polarisation de réponses Th2 ou Th1 a été

décrite 267 268 269. Une étude a notamment montré que des cellules de mélanome (B16)

irradiées exprimant l’IL-1β permettaient de protéger des souris contre une injection ultérieure

de cellules tumorales vivantes 270. La protection pouvait être effective plusieurs mois après la

vaccination, ce qui indique l’implication du système immunitaire spécifique. Les auteurs ont

en effet montré que l’expression d’IL-1β par les cellules tumorales servant à la vaccination

permettait l’induction de réponses Tc1 et Th1 plus importantes au niveau de la rate. Les

cellules tumorales exprimant l’IL-1β étaient également capables de ralentir la croissance de

tumeurs établies dans un contexte de vaccination thérapeutique. Bien que quelques études

montrent que l’IL-1β peut favoriser le développement de réponses Tc1, le rôle de cette

cytokine en tant que cytokine polarisante Tc1 agissant directement sur les LT CD8 n’est pas

clairement établi.

66

4 Rôle de l’IL-17 dans le développement et l’efficacité de réponses Th1 et Tc1

spécifiques

Nous avons montré que l’IL-17 produite par les LTγδ qui s’accumulent dans le lit

tumoral quelques jours après le traitement, joue un rôle important dans l’efficacité des

réponses T anti-tumorales, caractérisées par la production d’IFN-γ. Dans notre étude, la

production d’IFN-γ dans le lit tumoral est positivement corrélée à celle d’IL-17. Ceci n’est

pas en accord avec certaines études qui montrent une inhibition réciproque des réponses Th1

et Th17 et donc une corrélation inverse des taux d’IL-17 et d’IFN-γ 271. Par exemple, dans un

modèle murin d’auto-immunité, les souris déficientes pour l’IL-17 développent des réponses

Th1 plus importantes, alors que les réponses Th17 sont augmentées chez les animaux ne

pouvant pas produire d’IFN-γ 272. De même, l’IL-17 peut inhiber les réponses Th1 en agissant

directement sur les LT 273.

En revanche, l’IL-17 peut favoriser la production de chimiokines capables d’attirer les

LT Th1 préalablement activés 274. Ceci a été montré dans un modèle murin de vaccination

contre Mycobacterium tuberculosis. Les auteurs montrent que la vaccination induit la

différenciation de LT CD4 producteurs d’IL-17 présentant un tropisme privilégié pour les

poumons. Au cours d’une exposition ultérieure à la bactérie, ces LT CD4 sécrètent de l’IL-17

qui favorise la sécrétion des chimiokines CXCL9, CXCL10 et CXCL11, impliquées dans le

recrutement de LT Th1 activés exprimant CXCR3. Les gènes de ces chimiokines présentent

des séquences de liaison à des facteurs de transcription ressemblant à celles présentes en

amont des gènes cibles de l’IL-17. Ceci suggère que dans ce modèle, l’IL-17 pourrait avoir

une action directe sur la production des chimiokines. Cependant, ceci n’est pas clairement

démontré dans le papier et il est aussi possible que l’IL-17 attire d’autres cellules comme les

neutrophiles, à l’origine de la production des chimiokines attirant les LT. Dans notre étude, il

est intéressant de noter que la cinétique d’accumulation de LT CD8 producteurs d’IFN-γ dans

la tumeur après chimiothérapie est très rapide. Nous pouvons donc envisager que l’IL-17

produit par les LTγδ tumoraux favorise le recrutement de LT effecteurs dans la tumeur. Dans

notre modèle, il serait intéressant d’étudier l’implication de différents récepteurs de

chimiokines, comme CXCR3 ou CCR5, par l’utilisation de souris génétiquement modifiées

ou d’anticorps neutralisants.

67

Nos données indiquent cependant que l’IL-17 est directement impliquée dans

l’activation de LT spécifiques producteurs d’IFN-γ. Ceci est en accord avec des études

montrant l’importance de l’IL-17 dans le développement de réponses Th1 ou Tc1. Par

exemple, le transfert adoptif de LT Th17 chez des souris porteuses de tumeurs diminue la

croissance tumorale en favorisant l’activation de LT CD8 spécifiques des antigènes tumoraux 275. Les auteurs montrent que les LT Th17 infiltrent les tumeurs et favorisent la production de

CCL20, une chimiokine qui attire les cellules dendritiques CD8α+ dans le lit tumoral et qui

stimule ainsi l’induction de réponses T spécifiques. L’observation que l’IL-17 peut

directement induire l’expression de CCL20 par les fibroblastes embryonnaires murins

suggère un rôle direct de l’IL-17 dans ce modèle 276. Dans notre modèle en revanche, il est

important de noter que les LT Th17 ne sont pas les principaux producteurs d’IL-17 dans le lit

tumoral après le traitement. De plus, aucune production d’IL-17 n’est détectée après une

restimulation antigénique des ganglions drainant le site d’injection des cellules tumorales

mourantes (Fig 7S, Nat Med). Enfin, l’IL-6 et le TGF-β, deux cytokines importantes pour le

développement des Th17 murins, ne sont pas indispensables pour l’effet anti-tumoral observé.

Enfin, contrairement à l’étude sur le transfert adoptif des Th17, CCL20 n’est pas nécessaire à

l’efficacité des chimiothérapies dans nos modèles.

D’autres études ont montré que l’IL-17 pouvait agir directement sur les cellules

dendritiques. Dans un modèle d’infection par Listeria monocytogenes, l’IL-17 est produit

majoritairement par les LTγδ de la rate et favorise l’activation de LT CD8 naïfs 277. Les

auteurs ont montré que l’IL-17 agissait directement en augmentant l’expression de CMH I et

la production d’IL-1β, d’IL-12 et d’IL-6 par les BM-DC in vitro, favorisant ainsi la

présentation croisée des antigènes microbiens. Les auteurs ont également pu montrer que les

cellules dendritiques CD8+ de la rate de souris il-17a-/- infectées par la bactérie produisaient

moins d’IL-12 que les souris WT. Il est intéressant de noter qu’une action directe de l’IL-17

sur les cellules dendritiques a également été mise en évidence dans un modèle d’activation de

LT Th1 278. Dans cette étude, les auteurs montrent que l’IL-17A seule, contrairement à l’IL-

22 ou à l’IL-17F, peut induire la production d’IL-12 par des BM-DC in vitro, selon un

mécanisme impliquant une régulation à l’échelle transcriptionnelle. Outre son rôle sur la

production d’IL-12, l’IL-17A peut également induire la sécrétion d’IL-6 et d’IFN-γ par les

cellules dendritiques, selon un mécanisme impliquant l’activation de NF-κB. De manière

intéressante, les auteurs ont montré que les cellules dendritiques du poumon étaient également

68

capables de répondre directement à l’IL-17A par la production d’IL-12 et d’IFN-γ. Dans

notre modèle, il est possible que l’IL-17 agisse sur les cellules dendritiques mais d’autres

expériences sont nécessaires pour répondre à cette question.

L’IL-17 est également impliqué dans le recrutement de neutrophiles et de monocytes

sur les sites inflammatoires. Dans des modèles in vitro, il a été montré que l’IL-17 pouvait

directement agir sur les cellules épithéliales, les fibroblastes ou les cellules endothéliales,

pour induire la sécrétion de chimiokines telles que CXCL1, CXCL8 (chez l’Homme) 279,

CCL2 ou CCL7 280. In vivo, l’injection d’IL-17 dans le péritoine est associée à une production

de CXCL1 et à un recrutement massif de neutrophiles 281. Dans un modèle

d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, la neutralisation de l’IL-17 induit une

diminution du taux cérébral de CCL2, CCL7 et CXCL1, et un plus faible recrutement de

leucocytes 276. De même, dans un modèle d’infection par Escherichia coli, l’IL-17 permet le

recrutement de neutrophiles protecteurs contre l’infection 282. Enfin, l’IL-17 peut induire la

sécrétion de G-CSF et favoriser ainsi la granulopoièse 283 284.

Dans certains modèles, les LTγδ sont les principaux producteurs d’IL-17. Ainsi, des

souris déficientes en LTγδ présentent une plus grande sensibilité à une infection par

Staphylococcus aureus, associée à un défaut de recrutement de neutrophiles 285. Une étude

récente montre que les LTγδ présents dans le derme sont les principaux producteurs cutanés

d’IL-17 après une injection intra-dermique de BCG 255. Les auteurs montrent que ces LTγδ

favorisent le recrutement de neutrophiles sur le site de l’infection, le transport d’antigènes

dans le ganglion drainant et l’activation de LT Th1 spécifiques. Cette étude suggère que les

neutrophiles sont impliqués dans la phagocytose des antigènes et dans leur acheminement

vers les ganglions drainants. Il est intéressant de noter que contrairement aux LTγδ

épidermiques, ces LTγδ dermiques ressemblent aux LTγδ que l’on trouve dans nos tumeurs

sous-cutanées, notamment en terme de type de chaine γ exprimée et de niveau d’expression

de CD44 et de CD69. Par ailleurs, des données récentes dans le laboratoire suggèrent que des

neutrophiles sont recrutés dans la tumeur peu de temps après l’administration de

chimiothérapies.

69

5 Rôle de l’IL-17 et de l’IL-1β dans la progression tumorale

Le rôle de l’IL-17 dans le développement et la progression tumorale est controversé.

Certaines études murines ont montré que l’IL-17 pouvait avoir un effet anti-tumoral,

impliquant notamment l’activation de LT spécifiques dans le ganglion drainant 286 275. En

revanche, la présence de LT Th17 dans les tumeurs gastriques humaines a été associée à un

mauvais pronostic 287. L’IL-1β et d’autres cytokines comme l’IL-23 et l’IL-6 ont notamment

été impliquées dans l’accumulation de LT Th17 dans les tumeurs humaines 288. Une étude

chez la souris a mis en évidence le rôle de l’IL-17 dans la production d’IL-6 et l’activation de

STAT3, ce qui favorise la survie des cellules tumorales et l’angiogenèse 289. L’activation de

STAT3 au niveau des cellules transformées a également été impliquée dans l’effet pro-

tumoral de l’IL-17 dans un modèle de carcinogenèse cutanée induite par les agents

DMBA/TPA 290. Dans notre modèle, l’IL-17 induit une inflammation anti-tumorale

différente, qui n’implique pas les LT Th17 et qui ne dépend ni de l’IL-6 ni de l’IL-23. Une

étude récente a montré que les LTγδ producteurs d’IL-17 pouvaient favoriser la croissance

tumorale en stimulant l’angiogenèse. Les LTγδ infiltrant les tumeurs après chimiothérapie ne

sont cependant pas les mêmes que dans cette étude, puisqu’ils n’expriment pas les chaines γ1

et γ2, ni le récepteur activateur NKG2D.

Le rôle de l’IL-1β dans la progression tumorale est également controversé. Alors que

nous montrons que cette cytokine est impliquée dans l’effet anti-tumoral des chimiothérapies

immunogènes, d’autres études ont montré qu’elle favorisait la carcinogenèse induite par des

agents chimiques inflammatoires 291. L’Il-1β peut aussi avoir un effet pro-tumoral en

favorisant l’angiogenèse 292. Le manque de consensus quant au rôle de l’IL-17 et de l’IL-1β

dans la progression tumorale pourrait en partie venir des différences de modèles utilisés. De

plus, des paramètres comme la nature des cellules productrices et la cinétique de production

de ces cytokines inflammatoires pourraient être importants. Enfin, le contexte dans lequel ces

cytokines sont produites est déterminant pour leur effet biologique et il est difficile de réduire

la complexité d’une situation inflammatoire à la présence ou non d’une ou de quelques

cytokines.

70

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Nos travaux ont permis de montrer que l’ATP libéré par les cellules tumorales

mourantes suite à leur exposition à certaines chimiothérapies anti-cancéreuses favorisait la

production d’IL-1β par les cellules dendritiques, une cytokine importante pour la polarisation

des réponses Tc1 anti-tumorales. L’augmentation du taux d’IL-1β dans le lit tumoral stimule

la production d’IL-17 par les LTγδ, et favorise ainsi l’accumulation de LT CD8 producteurs

d’IFN-γ dans la tumeur. Sur le plan fondamental, certaines questions subsistent. En effet,

notre étude montre que les cellules dendritiques dérivées de la moëlle sont capables de

produire de l’IL-1β en présence de corps apoptotiques immunogènes in vitro. Il serait

intéressant d’étudier la nature des cellules présentatrices d’antigène qui produisent l’IL-1β in

vivo. De même, le site d’activation des LT CD8 ainsi que la nature des LT activés (naïfs ou

mémoires) en réponse à la chimiothérapie sont des questions importantes, que des études à

venir dans le laboratoire visent à élucider.

Certaines thérapies cytotoxiques sont donc capables d’induire la production de

signaux de danger, à l’origine du développement de réponses anti-tumorales efficaces. Notre

étude indique qu’en plus de la quantité de signaux de danger, la nature de ces signaux est un

critère important. Par exemple, HMGB1 et l’ATP sont tous les deux nécessaires pour

l’activation de l’inflammasome NLRP3 (Fig 8S de Ghiringhelli F et al, Nat Med, 2007). Ceci

est en accord avec les études montrant la nécessité d’avoir un signal TLR induisant la

transcription des ARN messagers de la pro-IL-1β et de NLRP3, préalablement à l’induction

de la production d’IL-1β par l’ATP 12.

Sur le plan médical, ces travaux pré-cliniques apportent une nouvelle façon de

concevoir et d’utiliser les thérapies anti-cancéreuses cytotoxiques conventionnelles. En effet,

selon la vision traditionnelle, l’efficacité thérapeutique des chimiothérapies anti-cancéreuses

se mesurait en considérant leur cytotoxicité directe sur les cellules tumorales en rapport avec

les effets secondaires endommageant les tissus sains. De nombreuses drogues anti-

cancéreuses sont d’ailleurs testées in vivo en implantant des cellules tumorales humaines chez

des animaux immunodéficients 251. Cependant, beaucoup d’études ont montré que des

paramètres immunitaires pouvaient avoir une valeur prédictive des réponses cliniques 293. La

compréhension des mécanismes moléculaires déterminant l’immunogénicité de certains

traitements anti-cancéreux permettra à terme de mieux prédire les réponses cliniques et

71

d’utiliser ainsi des traitements plus adaptés à chaque patient. Les facteurs prédictifs devront

intégrer des caractéristiques de la drogue, de la tumeur et de l’hôte (Figure 9). Par exemple,

dans des cas de cancers du colon avancés traités par chirurgie et chimiothérapie adjuvante,

l’expression de la calréticuline sur les cellules tumorales a été corrélée au degré d’infiltration

de la tumeur par des LT naïfs et à une meilleure survie globale sur 5 ans 294. Concernant les

facteurs non directement liés à la tumeur, des polymorphismes « perte de fonction » de TLR4

et de P2RX7 ont été associés à une moins bonne survie chez des patients atteints de cancer de

sein, traités par de la radiothérapie et des anthracyclines 293.

Le traitement de tumeurs établies avec des chimiothérapies immunogènes induit des

réponses anti-tumorales contribuant à l’efficacité thérapeutique observée. Cependant, il est

intéressant de noter que dans nos modèles, les cas de régressions tumorales complètes sont

extrêmement rares. Ceci suggère que l’induction de réponses anti-tumorales spécifiques n’est

pas suffisante et que l’inhibition des mécanismes immunosuppresseurs induits par la tumeur

pourrait augmenter l’efficacité thérapeutique des chimiothérapies immunogènes. Certaines

études montrent une augmentation de l’efficacité thérapeutique de thérapies conventionnelles

par la combinaison avec des anticorps neutralisant CTLA-4 ou PD-1 295 296. De plus, sur le

plan thérapeutique, l’identification des paramètres impliqués dans l’immunogénicité de

certaines chimiothérapies peut permettre de compenser les défauts éventuels chez les patients.

Par exemple, un défaut dans le TLR4 peut être compensé par l’administration des ligands

d’autres TLR, comme les TLR-3 et -9 297. En revanche, certains adjuvants, pouvant avoir un

effet anti-tumoral seul, ne sont pas capables d’améliorer l’efficacité des chimiothérapies. Ceci

est le cas de l’α-GalCer qui stimule les iNKT 297. Il est donc nécessaire d’étudier de manière

rationnelle les relations entre les chimiothérapies anti-cancéreuses conventionelles et le

système immunitaire de chaque patient, afin d’améliorer l’efficacité globale de ces

traitements, notamment en les combinant avec des immunothérapies appropriées.

72

Figure 9 : Schéma théorique des différents paramètres prédictifs de l’efficacité des chimiothérapies anti-cancéreuses immunogènes (d’après Zitvogel L, Nat Rev Clin Oncol, 2011 293).

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ANNEXES

Cette partie contient d’autres papiers publiés au cours de ma thèse, dont un article collaboratif

et une revue.

ORIGINAL ARTICLE

Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin

A Tesniere1,2,3,14, F Schlemmer1,2,3,14, V Boige2,4, O Kepp1,2,3, I Martins1,2,3, F Ghiringhelli5,6,L Aymeric2,3,7, M Michaud1,2,3, L Apetoh2,3,7, L Barault8,9, J Mendiboure2,10, J-P Pignon2,10,V Jooste9,11, P van Endert12, M Ducreux2,3,4, L Zitvogel2,3,7,13, F Piard8,9,14 and G Kroemer1,2,3,14

1INSERM, U848, Villejuif, France; 2Institut Gustave Roussy, Villejuif, France; 3Universite Paris-Sud/Paris XI, Orsay, France;4Departement de medecine, Institut Gustave Roussy, Villejuif, France; 5AVENIR team INSERM CRI-866, Dijon, France; 6CentreGeorges Francois Leclerc, Dijon, France; 7INSERM, U805, Villejuif, France; 8Service d’Anatomie Pathologique, CHU, Dijon,France; 9INSERM U866, Dijon, France; 10Service de biostatistiques et d’epidemiologie, Institut Gustave Roussy, Villejuif, France;11Registre des cancers digestifs, Dijon, France; 12INSERM, U580, Universite Paris Descartes, Paris, France and 13CIC BT507,Institut Gustave Roussy, Villejuif, France

Both the pre-apoptotic exposure of calreticulin (CRT) andthe post-apoptotic release of high-mobility group box 1protein (HMGB1) are required for immunogenic celldeath elicited by anthracyclins. Here, we show that bothoxaliplatin (OXP) and cisplatin (CDDP) were equallyefficient in triggering HMGB1 release. However, OXP,but not CDDP, stimulates pre-apoptotic CRT exposure ina series of murine and human colon cancer cell lines.Subcutaneous injection of OXP-treated colorectalcancer (CRC), CT26, cells induced an anticancer immuneresponse that was reduced by short interfering RNA-mediated depletion of CRT or HMGB1. In contrast,CDDP-treated CT26 cells failed to induce anticancerimmunity, unless recombinant CRT protein was absorbedinto the cells. CT26 tumors implanted in immunocompe-tent mice responded to OXP treatment in vivo, and thistherapeutic response was lost when CRT exposure byCT26 cells was inhibited or when CT26 cells wereimplanted in immunodeficient mice. The knockout oftoll-like receptor 4 (TLR4), the receptor for HMGB1,also resulted in a deficient immune response againstOXP-treated CT26 cells. In patients with advanced (stageIV, Duke D) CRC, who received an OXP-basedchemotherapeutic regimen, the loss-of-function allele ofTLR4 (Asp299Gly in linkage disequilibrium withThr399Ile, reducing its affinity for HMGB1) was asprevalent as in the general population. However, patientscarrying the TLR4 loss-of-function allele exhibitedreduced progression-free and overall survival, as comparedwith patients carrying the normal TLR4 allele. Inconclusion, OXP induces immunogenic death of CRCcells, and this effect determines its therapeutic efficacy inCRC patients.Oncogene (2010) 29, 482–491; doi:10.1038/onc.2009.356;published online 2 November 2009

Keywords: apoptosis; dendritic cells; OXP; calreticulin;HMGB1; TLR4

Introduction

Conventional anticancer chemotherapy or radiotherapyis generally thought to reduce tumor progression bydirect cytostatic and cytotoxic effects on tumor cells.Although this paradigm undoubtedly holds for humancancers that are xenografted into immunodeficient mice,it must be revised for tumors that grow on immuno-competent hosts (Apetoh et al., 2007a, b). Thus, multipledifferent murine cancer models, including CT26 coloncancers, EL4 thymomas, TS/A mammary carcinomas,MCA205 fibrosarcomas and GOS osteosarcomasrespond more efficiently to conventional anticancertherapy when they are implanted in syngeneic immuno-competent as opposed to immunodeficient hosts (Ape-toh et al., 2007a, b). On the basis of these observations,we and other researchers have become interested in thecontribution of the immune system to the efficacy ofanticancer chemotherapies.

Many chemotherapeutic agents mediate their cyto-toxic effects by the induction of apoptosis, and apoptosisis generally thought to be non-inflammatory and non-immunogenic (Savill and Fadok, 2000; Matzinger, 2002).Recent data, however, suggest that, in spite of itsmorphological uniformity, apoptosis can follow bio-chemically distinct subroutines, some of which mayresult in immunogenic cell death (Blachere et al., 2005;Casares et al., 2005; Sancho et al., 2008; Laane et al.,2009). When murine tumor cells are treated with distinctapoptosis inducers and then injected subcutaneously, inthe absence of an adjuvant, they mostly fail to elicit animmune response that would protect the animals againstsubsequent challenge with live tumor cells (Casares et al.,2005; Obeid et al., 2007b). In contrast to many otherapoptosis-inducing regimens, anthracyclines can induceimmunogenic cell death, meaning that tumor cellsthat die in response to anthracyclines constituteefficient anticancer vaccines and elicit the generation of

Received 17 July 2009; revised 12 August 2009; accepted 7 September2009; published online 2 November 2009

Correspondence: Dr G Kroemer, INSERM, U848, Institut GustaveRoussy, PR1 39, rue Camille Desmoulins, F-94805 Villejuif, France.E-mail: [email protected] authors contributed equally to this work.

Oncogene (2010) 29, 482–491& 2010 Macmillan Publishers Limited All rights reserved 0950-9232/10 $32.00

www.nature.com/onc

http://dx.doi.org/10.1038/onc.2009.356

mailto:[email protected]

http://www.nature.com/onc

tumor-specific cytotoxic T lymphocytes, in a dendriticcell (DC)-dependent manner (Apetoh et al., 2007b;Tesniere et al., 2008; Sancho et al., 2009).

In contrast to cell death elicited by standard protocolsof apoptosis induction (such as treatment with thegeneral tyrosine kinase inhibitor, staurosporin, or thetopoisomerase inhibitors etoposide and campothecin),anthracyclin-induced cell death is preceded by the pre-apoptotic exposure of calreticulin (CRT) on the plasmamembrane surface (Obeid et al., 2007b). Although CRTis usually located in the lumen of the endoplasmicreticulum (ER), yet it translocates to the cell surface inresponse to anthracyclines. This involves a complexsignal transduction pathway, including an ER stressresponse, the subapoptotic activation of caspase-8 andthe exocytosis-dependent co-translocation of CRT,together with another ER protein, ERp57, to the outersurface of the plasma membrane (Laane et al., 2009).Surface CRT serves as an engulfment signal (Obeidet al., 2007a, b) and similarly targets apoptotic cells forinteraction with DCs and subsequent cross-presentationof tumor antigens (Zeng et al., 2006). Inhibition of CRTexposure by knockdown of CRT or ERp57 abolishesthe immunogenicity of cell death (Obeid et al., 2007b;Panaretakis et al., 2008), and ERp57-deficient cellsimplanted into mice form anthracyclin-resistant tumors(Panaretakis et al., 2008). Importantly, non-immuno-genic cell death (without CRT exposure) can berendered immunogenic by absorbing recombinantCRT protein to the cell surface (Obeid et al.,2007a, b), and chemotherapeutic agents that fail toinduce CRT exposure can be rendered efficient byinjecting CRT into tumors (Obeid et al., 2007b). LocalCRT injection also reverses the chemotherapy resistanceof ERp57-deficient tumors (Panaretakis et al., 2008).These results establish CRT exposure as a majorcheckpoint of immunogenic cell death.

To be detected as immunogenic, dying cells must emitsignals in addition to CRT. Indeed, dying cells releaseHMGB1 into the extracellular milieu in response tomost chemotherapeutic agents (Apetoh et al., 2007a, b),and neutralization or depletion of HMGB1 abolishesthe immunogenicity of cell death (Apetoh et al., 2007b).HMGB1 can interact with several receptors expressedon the surface of DCs (Park et al., 2006) including toll-like receptor 4 (TLR4). Mice that lack TLR4 or thatbear a mutant TLR4 fail to mount an immune responseagainst anthracyclin-treated cancer cells (Apetoh et al.,2007b). Moreover, tumors growing on TLR4-deficientmice are largely refractory to anticancer chemotherapy(Apetoh et al., 2007b). This result can be recapitulatedin humans. Approximately 12–14% of Caucasians bearan allele of TLR4 in which two residues (amino acids299 and 399) of the extracellular loop are mutated(Ferwerda et al., 2007). This results in a mutated TLR4protein (Asp299Gly, Thr399Ile) that exhibits a reducedaffinity for HMGB1 (Apetoh et al., 2007b). Impor-tantly, breast cancer patients bearing this loss-of-function allele of TLR4 exhibit an accelerated relapseafter anthracyclin-based adjuvant chemotherapy com-pared with patients bearing the normal TRL4 allele

(Apetoh et al., 2007b), underscoring the importanceof anti-cancer immunity for an optimal response toanthracyclines (Zitvogel et al., 2008).

Circumstantial evidence suggests that, similar toanthracyclines, oxaliplatin (OXP) can induce immuno-genic cell death. Thus, ovalbumin-expressing thymomacells (EG7 cells) were found to efficiently prime poplitealT cells in vivo when they were treated with OXP andinjected into the footpad of immunocompetent mice(Apetoh et al., 2007b). This T-cell priming was suppressedby the neutralization of HMGB1 and required theexpression of TLR4 by DCs (Apetoh et al., 2007b).Oxaliplatin is mostly used for the treatment of CRC(Muggia and Fojo, 2004; Kelland, 2007), a tumor typeprognosis of which is profoundly influenced by the type,density and location of lymphoid infiltrates in tumor beds(Pages et al., 2005; Galon et al., 2006). Thus, even inadvanced CRC, the presence of markers of cytotoxic Tcells and T helper 1-adaptative responses has a positiveprognostic impact (Galon et al., 2006; Camus et al., 2009).

Driven by these considerations, we decided toevaluate the possible role of OXP as an immunogeniccell death inducer in the treatment of CRC. In thisstudy, we show that OXP (but not cisplatin, CDDP)induces immunogenic apoptosis accompanied by CRTexposure, that OXP-mediated chemotherapy of coloncancers implanted into mice relies on an intact immunesystem including the presence of TLR4, and thatadvanced CRC patients bearing the loss-of-functionallele of TLR4 had a lower progression-free survival(PFS) after OXP-based chemotherapy compared withcontrol patients with a wild-type allele.

Results

Oxaliplatin induces immunogenic colon cancer cell deathIn response to CDDP or OXP, CT26 cells underwentcell death, as indicated by staining with annexin-Vfluorescein isothiocyanate (which detects phosphatidyl-serine residues on the surface of apoptotic cells) and thevital dye, propidium iodine (that only penetrates intodead cells; Figures 1a and b). Kinetic and morphologicalanalyses indicated that morphologically discernible apop-tosis was followed by secondary necrosis (data notshown). As a positive control (Obeid et al., 2007b),mitoxantrone was used to induce immunogenic cell death.Thus, Balb/c mice inoculated with mitoxantrone-treatedCT26 cells as a tumor vaccine, were protected against asubsequent challenge with live CT26 cells. AlthoughCDDP-treated tumor cells largely failed to induce animmune response, OXP-treated CT26 cells vaccinated asefficiently against cancer as mitoxantrone-treated cells(Figures 1c and d), pointing to a major difference betweenOXP and CDDP, which induced immunogenic versusnon-immunogenic cell death, respectively.

Next, we treated established CT26 colon cancers assoon as they became palpable with CDDP (50 mg/kg) orOXP (250 mg/kg). This treatment caused a delay in thegrowth of CT26 tumors implanted in immunocompetent

Oxaliplatin and anticancer immunityA Tesniere et al

483

Oncogene

Balb/c mice, with OXP yielding a more pronouncedtherapeutic response than CDDP (Figure 2a). A doseescalation using OXP or CDDP by a factor of 10 did notimprove the therapeutic outcome (Supplementary Fig-ure 1). Importantly, no therapeutic effect was observedwhen instead of CT26 wild-type cells, CT26 cells,subjected to a stable knockdown of ERp57 using ashort hairpin RNA, were injected into immunocompe-tent Balb/c mice and then treated with CDDP or OXP(Figure 2b). Such ERp57 knockdown cells failed to emitimmunogenic signals (such as CRT exposure) (Panar-etakis et al., 2008) and hence become refractory tochemotherapies whose efficiency relies on the immunesystem (Tesniere et al., 2008). To further investigate the

contribution of the immune system to the control oftumor growth, we treated CT26 tumors that wereexpanding in immunodeficient nu/nu mice with CDDPor OXP. Neither of the two treatments retarded thegrowth of tumors implanted in nu/nu mice (Figure 2c),underscoring the contribution of the immune system tothe therapeutic response elicited by OXP (and to lessextent by CDDP).

Calreticulin exposure determines the immunogenicity ofOXP-induced cell deathAfter short-term stimulation (4 h) with mitoxantroneor OXP, CT26 cells exposed CRT on the cell surface,

AnnexinV-FITC

Pro

pidi

um Io

dide

CT26a

b

c d

OXP CDDP

n=20

Control 150µM15µM 15µM300µM

0

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40

60

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100

0 20 40 60

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(%)

Days after challenge

Control

CDDP 15µM

OXP 15µM

MTX 1µM

n=11

n=10

n=15

Control

OXP 300µM

CDDP 150µM

% g

ated

cel

ls

Annexin V + PI -

Annexin V + PI +

Oxaliplatin Cisplatin

n=15 mice per group

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60


0

20

40

60

80

100

MTX

*

3 15 75 150 300300 3 15 75 150 300 450 1

*

Tum

or fr

ee m

ice

(%)

104

103

102

101

100

100 102 103101

104

103

102

101

100

100 102 103101

104

103

102

101

100

100 102 103101

104

103

102

101

100

100 102 103101

104

103

102

101

100

100 102 103101

Figure 1 Oxaliplatin (OXP) induces immunogenic colon cancer cell death. (a, b) Frequency of apoptotic (Annexin Vþ PI�) andsecondary necrotic (Annexin Vþ PIþ ) CT26 cells after 24 h of treatment with OXP, cisplatin (CDDP) and mitoxantrone (MTX). CT26cells were cultured in complete medium along with chemotherapeutic agents, at the indicated dose, for 24 h, and then stained withannexin-V fluorescein isothiocyanate (FITC) and with vital dye, propidium iodine, before subsequent analysis by flow cytometry. Dataare represented as dot plot (a) or mean value±s.e.m. of triplicates of one representative experiment (b). (c, d) OXP-treated CT26 cellsvaccinated efficiently against live tumor cells. CT26 cells treated in vitro with OXP, CDDP or MTX were inoculated subcutaneously inBalb/c mice. After 7–10 days, mice were re-challenged with live 5� 106 CT26 cells. The percentages of tumor-free mice are pooled fromthree independent experiments. *Po0.05.


484

Oncogene

as determined by immunofluorescence staining andmicroscopic examination (Figure 3a) or cytofluoro-metric analysis (Figure 3b). In identical conditions,however, CDDP failed to elicit pre-apoptotic CRTexposure, over a wide range of different concentrations(Figures 3a-c). Depletion of CRT using an siRNAabolished the immunogenicity of OXP-treated CT26cells in vivo (Figure 3d). Absorbance of recombinantCRT protein to the plasma membrane restored the lostimmunogenicity of CRT-depleted OXP-treated cells(Figure 3d), as well as the absent immunogenicity ofCDDP-treated CT26 cells (Figure 3e). Similarly,CDDP-treated EG7 cells (which express the modelantigen OVA) were unable to prime popliteal T cells forinterferon-g production in vivo, and this defective T-cellpriming was restored by absorbing recombinant CRTprotein onto the surface of cells before they wereinjected into the footpad (Figure 3f). These results pointto a fundamental difference in the ability of the twoplatinum compounds in eliciting CRT exposure, whichis necessary for signaling immunogenicity. The differ-ence between CDDP and OXP with regard to theirCRT-exposing activity was observed over a range ofdifferent colon cancer cell lines. Thus, the two humancolon cancer cell lines, RKO and HCT116, both ofwhich were killed by CDDP and OXP (SupplementaryFigure 2), exhibited CRT exposure in response to OXP,but not in response to CDDP (Supplementary Figure 3).Altogether, these results support the idea that OXP is amore efficient inducer of CRT exposure than CDDP,and that this difference in CRT exposure determinesthe divergence in the in vivo anti-tumor efficacy ofboth drugs.

The HMGB1–TLR4 axis contributes to theimmunogenicity of OXP-induced cell deathBoth OXP and CDDP induced the release of HMGB1from the nuclei of mouse colon cancer cells (Figure 4a).HMGB1 appeared in the supernatant of the cells, asdetectable by enzyme-linked immunosorbent assay(Figure 4b). Similarly, both OXP and CDDP released

HMGB1 from several human colon cancer cell lines(Supplementary Figure 4). Neutralization of HMGB1with a specific antibody abolished the capacity of OXP-treated EG7 cells to prime T cells for interferon-gproduction (Figure 4c). Similarly, the co-injection of theneutralizing anti-HMGB1 antibody abolished the capa-city of OXP-treated tumor cells to vaccinate againstCT26 cancers. The partial depletion of HMGB1 with aspecific siRNA also reduced the immunogenicity ofOXP-treated tumor cells (Figure 4d). Moreover, OXP-treated dying cells failed to elicit an anti-tumor immuneresponse in tlr4�/� mice, in conditions in which tlr4þ /þ

controls were protected against challenge with livecancer cells (Figure 4e). These results corroborate theimportance of the HMGB1–TLR4 axis for the immuneresponse against tumor cells dying in response to OXP.

The Asp299Gly polymorphism influences PFS in advancedpatients treated with chemotherapyNext, we investigated whether a loss-of-function alleleof TLR4 (Asp299Gly, in linkage disequilibrium withThr399Ile) (Ferwerda et al., 2007) could affect PFS ofmetastatic CRC patients (Bouche et al., 2007) (n¼ 338)that had been included in the FFCD 2000–05randomized trial and for whom blood samples wereavailable. This trial compared the single agent5-fluorouracil (administered together with folinic acid)until failure, then combination chemotherapy withOXP plus 5-fluorouracil versus the latter combinationchemotherapy from the outset. The loss-of-functionallele was approximately as frequent among thepatient population (16.5%) as in the general Caucasianpopulation (12–14%) (Arbour et al., 2000; Agnese et al.,2002). Patients that were heterozygous or homozygousfor the TLR4 Asp299Gly/Thr399Ile allele (n¼ 48) weresimilar to patients bearing the normal TLR4 allele(n¼ 290) with respect to age, sex, number of diseasesites, the WHO classification, alkaline phosphataseserum levels and other laboratory parameters (Table 1).Interestingly, patients bearing the normal TLR4 allelemanifested an increased progression-free survival

CT26 shERp57 Nude mice CT26 WTCT26 WT

0 5 10 15 20

Days after treatment

0 2 4 6 8 10


Tum

or s

ize

(cm

3 )

Tum

or s

ize

(cm

3 )

0

1

2

3

0 5 10 15 20


Tum

or s

ize

(cm

3 )

0

1

2

1

2

3

4

0

Co

CDDP

OXP

Co

CDDP

OXP

Co

CDDP

OXP

*

*

Figure 2 Calreticulin (CRT) exposure and the immune system are critical for the therapeutic effect of oxaliplatin (OXP) onestablished tumors in vivo. CT26 colon cancer tumors were subcutaneously established in immunocompetent (wild—type mice) (a, b) orimmunodeficient (nu/nu)mice (c). (b) CT26 cells were previously stably transfected with short hairpin RNA for ERp57, which diminishthe ability of CRT exposure on the cell surface and then the efficacy of immunogenic chemotherapy. When the tumors reached 40–80mm2 in size, mice were either left untreated or treated with intratumoral chemotherapy (OXP: 1.25mg/kg; CDDP: 0.25mg/kg).Tumor sizes were monitored every 2 or 3 days using a caliper and tumor volumes were calculated as previously described (35). Eachgroup included five mice. One representative experiment out of three is depicted. *Po0.05.


485

Oncogene

(hazard ratio: 0.73; confidence interval¼ 0.53–1.00;Pp0.05) and overall survival (hazard ratio¼ 0.72;confidence interval¼ 0.52–1.01); P¼ 0.05), comparedwith patients bearing the loss-of-function allele ofTLR4 (Figure 5). We also investigated the role of thetlr4Asp299Gly polymorphism in a cohort of stage II

CRC patients (n¼ 258) that were treated by surgicalremoval of the primary tumor in a curative intent,without any adjuvant chemotherapy. Furthermore, nodifferences were found in main patient and tumorcharacteristics according to TLR4 genotype (data notshown). Interestingly, we found no statistical differences

Control

Isotype

Control

CDDP

OXP

MTX

Control

CDDP + rCRT

Cou

nts

CRT-Alexa488

CDDP

CRT + (%)CRTWGA 633

Hoechst 33342 CRT + (%)WGA 633

Hoechst 33342 MergeCRT

100

20

40

60

80

0

100

20

40

60

80

0

% s

urfa

ce C

RT

+ /

PI n

egat

ive

cells

100

20

40

60

80

0

100

20

40

60

80

0

0

20

40

60

80

100 OXP siRNA CRT (n=15)

OXP siRNA CRT + rCRT (n=15)

OXP siRNA Co (n=10) Control (n=10)

Tum

or-f

ree

mic

e (%

)


0

5

10

15

20

25

30

35

Tum

or-f

ree

mic

e (%

)


OXPMTX

Contro

l

60

80

40

20

0

Control

OXP

0 101

103

102

60

80

40

20

0

Control

MTX

0 101

103

102

Control

CDDP

n=10 for each group

0

20

40

60

80

100

60

80

40

20

0

0 101

103

102

60

80

40

20

0

0 101

103

102

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

IFN

-γ (

ng/m

l)

Live

EG7

CDDP

CDDP

+ rC

RTOXP

10 µm

PBS + rCRT

Merge

15015 300 3 30

0 20 40 60 0 20 40 60

CDDP

Figure 3 Calreticulin (CRT) exposure determines the immunogenicity of OXP-induced cell death. CRT exposure on the cell surface ofCT26 cells was assessed after short-term stimulation (4 h) with mitoxantrone (MTX), oxaliplatin (OXP) or cisplatin (CDDP)treatment, or without treatment (control) by immunofluorescence staining followed by confocal microscopic examination (a) or byflow cytometric analysis (b, c). Data are presented as means±s.e.m. of three independent experiments (A, B, C). (d, e) CRT exposuredetermines the efficacy of in vivo anti-cancer vaccination. (d) CT26 colon cancer cells were transfected with short interferingRNA(siRNA) for CRT (siRNA CRT) or an irrelevant siRNA (siRNA Co), and then treated with OXP for 24 h in vitro. In one group,recombinant CRT (rCRT) was coated on cells before the subcutaneous injection of the dying cells in one flank. At day 7, mice (n pergroup, as indicated) were inoculated with live syngeneic tumor cells in the opposite flank and tumor growth was monitored. Thepercentage of tumor-free mice is indicated. (f) CRT exposure determines the priming of T cells in the draining lymph node. OVA-expressing EG7 tumor cells were treated with medium alone, OXP (5mM) or CDDP (5mM) for 16 h and injected into the footpad ofC57BL/6 mice. In some experiments, tumor cells treated with phosphate buffered saline (PBS) or CDDP were incubated with rCRTbefore in vivo injection. After 5 days, lymphocytes from the draining popliteal lymph nodes were challenged with PBS or PBSþOVAprotein, and IFN-g secretion was assessed at 72 h by ELISA. Data are presented as mean±s.e.m. of IFN-g secretion afterre-stimulation with PBS–OVA or PBS alone. A representative out of three independent experiments is depicted. *Po0.05.


486

Oncogene

0

20

40

60

80

100

HM

GB

1 (n

g/m

l)

OXP (µM) CDDP (µM)

CT26 supernatants

OXP

OXP siRNA HMGB1 + rHMGB1OXP siRNA HMGB1


Tum

or-f

ree

mic

e (%

)

OXP

*

100

20

40

60

80

0

MTX

100

20

40

60

80

0

CDDP

MergeHoechst 33342

HMGB1 HMGB1 (%)

100

20

40

60

80

0

Nuclear HMGB1

Cytosolic and nuclear HMGB1

Cytosolic HMGB1

HMGB1 negative cells

Live CT26

100

20

40

60

80

010 µm

0 5 10 25 50 100 200 400 800 5 10 20 38 75 150 300 600

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60

Control

ControlOXP

Balb/c miceControlOXP tlr4 –/– mice


Tum

or-f

ree

mic

e (%

)

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60


0

20

40

60

80

100

0 20 40 60

MergeHoechst 33342

HMGB1 HMGB1 (%)

Tum

or-f

ree

mic

e (%

)

n=10 mice/group n=15 mice/group

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Co OXP OXP+

anti-HMGB1

IFN

-γ (

pg/m

l)

OXP + anti HMGB1 Ab

10 µm

Figure 4 The HMGB1–TLR4 (high-mobility group box 1–toll-like receptor 4) axis contributes to the immunogenicity of oxaliplatin(OXP)-induced cell death. (a) Immunofluorescence microscopy of HMGB1 release from the nuclei to the cytosol in CT26 cells,untreated (live) or treated for 24 h with OXP (300mM), cisplatin (CDDP, 150mM) or mitoxantrone (MTX, 1mM). After the indicatedtreatments, cells were permeabilized and stained with a rabbit anti-HMGB1 antibody (or an isotype-matched control antibody, datanot shown) and were counterstained with a goat anti-rabbit Alexa 488. Nuclei were stained with Hoechst 33342. Data are presented asmeans±s.e.m. of three independent experiments. (b) ELISA detection of HMGB1 release in the supernatants of CT26 cells treatedwith different concentrations of OXP and CDDP for 24 h. Data are presented as means±s.e.m. of duplicates of a representativeexperiment. (c–e) HMGB1 determines the immunogenicity of dying tumor cells. The depletion of HMGB1 with a specific blockingantibody abolishes the priming of T cell responses to OXP-treated EG7 cells (see Figure 3f for details) (c) and the capacity of OXP-treated tumor cells to vaccinate against CT26 tumor cells (d). *Po0.05. The knockdown of HMGB1 in CT26 cells transfected with aspecific small interfering RNA reduces the efficacy of antitumor vaccination, which can be restored by addition of recombinantHMGB1. Loss of the efficacy of antitumor vaccination with OXP-treated CT26 in tlr4�/� mice, in condition in which tlr4þ /þ controlswere protected against challenge with live tumor cells.


487

Oncogene

in terms of disease-free survival among patients bearingthe normal or variant allele of TLR4. This resultshows that TLR4Asp299Gly is not a prognostic factorper se, unless patients receive immunogenic chemotherapy,thereby underlining the major role of immunogenic celldeath induced by chemotherapy in the participationof the immune system for the therapeutic outcome.Altogether, these results indicate that the TLR4 poly-morphism Asp299Gly influences the therapeuticresponse of metastatic colon cancer patients toward OXP.

Discussion

Oxaliplatin and CDDP are chemically related agentsthat induce apoptosis through DNA damage as well ascytoplasmic effects (Wang and Lippard, 2005), and

against which tumors often (but not always) exhibitcross-resistance (Castedo et al., 2006). In spite of theirsimilarity, however, CDDP and OXP differ fundamen-tally in their capacity to elicit immunogenic cell death, asshown here. This difference was manifested at severallevels, in different cell lines and species. AlthoughOXP-treated cancer cells were able to prime T cellsfor interferon-g production and to mediate anti-cancervaccination, CDDP-treated cells failed to do so. At thebiochemical level, the major difference between OXP-and CDDP-triggered cell deaths was found at the levelof CRT exposure. OXP stimulated the translocation ofCRT from the endoplasmic reticulum to the cell surface,whereas CDDP failed to do. Similarly, absent versuspresent CRT exposure explains the difference betweenCDDP versus OXP-induced cell death, respectively,because depletion of CRT rendered OXP-induced celldeath non-immunogenic whereas absorption of CRT toCDDP-treated cells restored immunogenicity.

In contrast, OXP and CDDP were equipotent ininducing the release of HMGB1, which is anotherdeterminant of immunogenicity. It is important to notethat failure to emit one single among several immuno-genic signals (CRT exposure or HMGB1 release) issufficient to abrogate the immunogenicity of cell death(Tesniere et al., 2008). Hence, the difference in CRTexposure is sufficient to explain the distinction betweenimmunogenic versus non-immunogenic cell deathcaused by OXP and CDDP, respectively. This differencein the ability to trigger immunogenic cell death may beone plausible explanation to understand the lack ofefficacy of CDDP in CRC patients.

It may be argued that only a minor fraction of OXP-treated tumor cells expose CRT at the pre-apoptoticstage (when the cells lack phosphatidylserine exposureand are viable), and that the amount of antigen thatwould be targeted to the DCs would be rather low.However, in vivo, when tumors are treated with

Table 1 Baseline characteristics of patients and prognostic factors

TLR4Asp299Gly

TLR4Asp299Asp

P-value

n % n %

SexMale 34 71 175 60 0.17Female 14 29 115 40

Agep60 years 11 23 104 36 0.21Between 60 and 70 years 16 33 84 29>70 years 21 44 102 35

WHO Score0 or 1 39 81 248 86 0.442 9 19 42 14

Alcaline phosphataseMissing 1 2 19 7 0.4p300UI/l 33 69 206 71>300UI/l 14 29 65 22

White blood countsMissing 1 2 11 4 0.85p10 000 /mm3 34 71 198 68>10 000 /mm3 13 27 81 28

Number of disease sites1 25 52 154 53 0.9>1 23 48 136 47

Prior adjuvant chemotherapyNo 43 90 255 88 0.74Yes 5 10 35 12

Prognostic scoreMissing 8 3 1 2 0.941 45 16 9 192 103 36 16 333 134 46 22 46

TreatmentLV5FU2 first 144 46 22 50 0.62FOLFOX6 first 146 54 26 50

Abbreviations: TLR4, toll-like receptor 4; WHO, World HealthOrganization.

Pro

gres

sion

-fre

e su

rviv

al r

ate

100%

80%

60%

40%

20%

0%

Months

TLR4 Asp299Gly

TLR4 Asp299Asp

Multivariate Cox model : p = 0.05

0 6 12 18 24 30

Figure 5 The Asp299Gly polymorphism influences progression-free survival in colorectal cancer patients treated withchemotherapy. Kaplan–Meier analysis of progression-free survivalin metastatic colorectal cancer patients treated with oxaliplatin(OXP)-based chemotherapy regimen among patients bearing thetlr4 Asp299Asp and Asp299Gly or Gly299Gly alleles.


488

Oncogene

chemotherapy, dying cells were similarly phagocytosedbefore they lost the integrity of the plasma membraneand hence had a high chance of being engulfed by DCs.Indeed, as we inject oxaliplatin-treated tumor cellsin vivo, a significant fraction of cells are still viable.As such oxaliplatin-treated CT26 cells do not formtumors in vivo, they must die after injection and similarlyexpose CRT before they lose viability. At this point,they might be engulfed by DCs that subsequentlypresent tumor antigens to T lymphocytes.

The aforementioned results underscore the likelyimpact of the immune response on OXP-based che-motherapy. If an intact immune system is required foran optimal therapeutic response to OXP, two majorpredictions can be made. First, the chemotherapeuticresponse will not only be dictated by the capacity oftumor cells to undergo apoptosis in response to OXPbut will also be influenced by their intrinsic potential toemit immunogenic signals (such as CRT exposure andHMGB1 secretion). In this context, it seems intriguingthat reduced calreticulin expression constitutes a nega-tive prognostic/predictive feature of colon cancers(Toquet et al., 2007). Reduced calreticulin expressionalso has a negative impact on neuroblastoma (Hsu et al.,2005), cervical carcinoma (Mehta et al., 2008), as well ason follicular thyroid carcinoma (Netea-Maier et al.,2008). Hence, it will be important to investigate whetherCRT affects the immunogenicity of such tumors beyondits role in contributing to optimal peptide loadinginto major histocompatibility complex class I antigen(Wright et al., 2004; Zhang and Williams, 2006).Second, failure of the immune system to perceiveimmunogenic signals would have a negative influenceon the efficacy of chemotherapy. In apparent accor-dance with this prediction, we found that the knockoutof TLR4 compromised T-cell priming by OXP-treatedEG7 thymoma cells (Apetoh et al., 2007b) and thatTLR4 deficiency abolished the capacity of OXP-treatedCT26 cells to induce a protective anti-cancer immuneresponse (this study). TLR4 was also required for theoptimal therapeutic response toward OXP in mousemodels for thymoma and osteosarcoma (Apetoh et al.,2007a). Moreover, as shown here, a loss-of-functionallele of TLR4 was associated with reduced progression-free survival and overall survival in CRC patientsreceiving OXP-based chemotherapy for advanceddisease.

In conclusion, OXP elicits immunogenic cell death inseveral rodent models of colon cancer. The immuno-genicity of an OXP-induced cell death is governed by thesame rules as applicable to those elicited by anthracy-clines thus far that it involves CRT exposure andHMGB1 release. Moreover, it critically depends on thepresence of functional TLR4 in the immune system.Correlative evidence suggests that these findings alsoapply to CRC patients in which a loss-of-function alleleof TLR4 negatively affects outcomes after OXP-basedchemotherapy. On the basis of our results, we predictthat TLR4 alleles should not affect the therapeuticresponse to CDDP treatment, a problem that requiresfurther investigation.

Materials and methods

Cell linesCT26 and EG7 cells were cultured in RPMI 1640 medium,RKO and HCT116 cells in McCoys 5A (Gibco, Carlsbad, CAUSA). All media were supplemented with 10% heat-inacti-vated fetal bovine serum, 10mM Hepes, 10U/ml penicillin and10 mg/ml streptomycin.

Mouse strainsBALB/c (H-2d), C57BL/6 (H-2b) and nu/nu BALB/c micewere obtained from the Centre d’elevage Janvier (Le GenestSt Isle, France) and from Charles River Laboratories (Saint-Germain sur l’Arbresle, France). BALB/c Tlr4�/� mice werekindly provided by Gregoire Lauvau (INSERM, University ofSofia Antipolis, Valbonne, France), and bred in our animalfacility.

Antibodies and reagentsA rabbit polyclonal antibody against calreticulin (ab2907) anda rabbit polyclonal antibody against HMGB1 (ab18256)were purchased from Abcam (Paris, France). An Alexa 633-conjugated wheat germ agglutinin (WGA 633) was purchasedfrom Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). In some experiments,mice were injected with a neutralizing anti-HMGB1 antibody(50 mg per mice) kindly provided by Huan Yang (Lexington,MA, USA). HMGB1 enzyme-linked immunosorbent assay IIkits were obtained from SHINO-TEST CORPORATION(Tokyo, Japan). In some experiments, cells were exposed torecombinant CRT, at 3 mg per 106 cells in phosphate bufferedsaline (PBS) on ice for 30min, as described earlier (Obeid et al.,2007b; Panaretakis et al., 2009), followed by three washes.Recombinant HMGB1 was purchased from R&D systems(Minneapolis, MN, USA), and 200ng per mouse was injectedalong with dying tumor cells. Mitoxantrone (Sigma-Aldrich,St Louis, MO, USA), OXP (Sanofi Synthelabo, Paris, France)and CDDP (Sigma-Aldrich) were used to induce cell death.

Quantification of cell deathCell death was assessed by annexin V fluorescein isothiocya-nate (MACS, Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)staining. Briefly, 2� 105 cells per sample were collected,washed in PBS, pelleted, and resuspended in an incubationbuffer (10mM HEPES/NaOH (pH 7.4), 140mm NaCl and5mM CaCl2) containing annexin V fluorescein isothiocyanateantibody. Samples were kept in the dark and incubated for15min before the addition of another 400 ml of 0.1% propi-dium iodide incubation buffer and subsequent analysis on afluorescence-activated cell sorter Calibur flow cytometer (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) using Cell Quest software.

Flow cytometric analysis of CRT on the cell surfaceA total of 105 cells were plated in 12-well plates and treated theday after with the indicated agents for 4 h. Cells were collected,washed twice with PBS and fixed in 0.25% paraformaldehydein PBS for 5min. After washing again twice in cold PBS, cellswere incubated for 30min with primary antibody, diluted incold blocking buffer (2% fetal bovine serum in PBS), followedby washing and incubation with the Alexa488-conjugatedmonoclonal secondary antibody in a blocking buffer (for30min). Each sample was then analysed by FACScan (Becton-Dickinson) to identify cell surface CRT. Isotype-matched IgGantibodies were used as a control, and the fluorescent intensityof stained cells was gated on propidium iodide-negative cells.


489

Oncogene

ImmunofluorescenceFor surface detection of CRT, cells were placed on ice, washedtwice with PBS and fixed in 0.25% paraformaldehyde in PBS for5min. Cells were then washed twice in PBS, and a primaryantibody, diluted in cold blocking buffer, was added for 30min.After three washes in cold PBS, cells were incubated for 30minwith the appropriate Alexa 488-conjugated secondary antibodyand the Alexa 633-conjugated wheat germ agglutinin (WGA633) diluted in a cold blocking buffer. Cells were fixed with 4%paraformaldehyde for 20min before nuclear staining withHoechst 33342 (1/10000) in PBS for 20min and then mountedon slides. For intracellular HMGB1 staining, cells were washedwith PBS, fixed with 4% paraformaldehyde for 20min,permeabilized with 0.1% Triton X-100 (Sigma) for 10min,rinsed three times with PBS, and nonspecific binding sites wereblocked with 10% fetal bovine serum in PBS for 30min. Aprimary antibody was added for 1h. Subsequently, cells werewashed three times with PBS and incubated for 30min withan Alexa Fluor 488-conjugated secondary antibody (1:500,Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA).

Detection of HMGB1 releaseCT26, HCT116 and RKO cells were plated in 6-well plates with2ml full medium appropriate for the cell types. The medium waschanged 24h later and treatment was added onto the cells.Supernatants were collected at different time points, dying tumorcells were removed by centrifugation and supernatants wereisolated and frozen immediately. Quantification of HMGB1 inthe supernatants was assessed by enzyme-linked immunosorbentassay according to the manufacturer’s instructions.

Small interfering RNA transfectionsCT26 cells were transfected with small interfering RNA(siRNA) heteroduplexes specific for calreticulin (50-rCrCrGrCUrGrGrGUrCrGrArAUrCrRrArATT-30), HMGB1 (50-rGrCrArGrCrCrCUrAUrGrArGrArArGrArArATT-30 and rGrCUrGrArArArArGrArGrCrArArGrArArArATT) or an unre-lated control (50-rGrCrCrGrGUrAUrGrCrCrGrGUUrArArGUTT-30) designed in our laboratory and synthesized bySigma-Proligo (St Louis, MO, USA), at a final concentrationof 100 nM using HiPerFect (Qiagen, Dusseldorf, Germany)according to the manufacturer’s instructions. At 48 h aftertransfection, CT26 cells were assessed for total content of therespective proteins by immunobloting.

Anti-tumor vaccinationA total of 3� 106 CT26 cells, untreated or treated with eitherOXP, CDDP or mitoxantrone for 4 h, were inoculatedsubcutaneously in 200ml PBS into 6-week-old female BALB/c mice (Janvier, Charles River) into the lower flank, whereas5� 105 untreated control cells were inoculated into thecontralateral flank 7 days later (Casares et al., 2005). Torestore ecto-CRT, CT26 cells were incubated with recombi-nant CRT at 3 mg per 106 cells in PBS on ice for 30min,followed by three washes. Animals that bore tumors in excessof 20–25% of the body mass or were necrotic, were killed. Allanimals were maintained in specific pathogen-free conditions,and all experiments were carried out according to theFederation of European Laboratory Animal Science Associa-tion guidelines. The Ethics Committee of Institut GustaveRoussy approved all the animal experiments.

Chemotherapy of established tumors in miceMice were injected in the flank with 5� 105 CT26 cells. Thetumor surface was monitored using calipers. When the tumor

size reached 40–80mm2, mice were assigned into homo-genous groups of 4–6 mice each treated with OXP orCDDP injected intratumorally in 50ml PBS. Tumor volumewas then calculated for comparison of tumor growth (Streitet al., 1999).

Priming assayA total of 106 EG7 cells either untreated or treated with 300mmOXP or 150 mM CDDP for 12 h (note that EG7 and CT26 cellsdiffer in the kinetics of their response to OXP and CDDP)were injected into the footpad of the mice. After 5 days,gangliocytes of popliteal lymph nodes were collected and re-stimulated with OVA protein. After 72 h, interferon-g secre-tion was assessed by enzyme-linked immunosorbent assay.

Clinical studiesThe first clinical study analysed was the multicenter, prospective,controlled randomized trial designed to compare the efficacy ofsimplified LV5FU2 followed by FOLFOX6 to FOLFOX6 andby FOLFIRI on PFS after two lines of chemotherapy inmetastatic colon cancer. A total of 410 patients were enrolled inthis study with the following inclusion criteria:Non-resectable metastases of histologically proven color-

ectal adenocarcinoma; Evaluable disease (World HealthOrganization (WHO) criteria: lesions 42 cm and outside ofthe irradiation field); Absence of previous chemotherapy otherthan adjuvant with 5-fluorouracil and folinic acid or con-comitant to radiotherapy (rectum); WHO performance statuslower or equal to 2.The main end point of this study was PFS after two lines of

chemotherapy. A total of 388 germline DNAs was prospec-tively obtained from whole blood samples of the 410 patientsenrolled in this study.The second clinical study analysed was the retrospective

population-based registry study of non-metastatic coloncancer (Dukes stage II colon cancer) patients that were treatedby surgical removal of the tumor, without any adjuvanttreatment. A total of 258 stage-II colon cancer patients linkedwith a frozen tumor sample were included in the Cote d’Ordigestive registry between 1997 and 2005, and were followedfor progression 5 years after diagnosis. DNA was isolatedfrom frozen blood leukocytes obtained from all subjects. PCRprimers (Applied Biosystems, Villebon, France) were used toamplify a 101-bp fragment containing the TLR4 Asp299Glymutation (rs4986790) site. After PCR amplification, geno-types were assigned to each subject, by comparing the FAMsignal to its corresponding VIC signal and calculating thelog(FAM/VIC) ratio for each data point.

Statistical analysesFor the analysis of experimental data, comparison ofcontinuous data was achieved by the Mann–Whitney U testand comparison of categorical data by w2 or Fisher’s exact test,as appropriate. For clinical data, the log-rank test was used forthe analysis of the Kaplan–Meier survival curves. A Coxmodel was then established to assess the role of tlr4 variationamong the different groups. Statistical analyses were per-formed with SAS software (SAS Institute Inc, Cary, NC,USA). All P-values were two tailed. A P-value of 0.05 wasconsidered statistically significant for all experiments.

Conflict of interest

The authors declare no conflict of interest.


490

Oncogene

Acknowledgements

We thank all the investigators who participated in the FFCD2000–05 clinical trial; Pierre Laurent Puig for help with DNAextraction and storage; and Patrick Gonin and IGR animalfacility for helping with mouse breeding. This study wassupported by INSERM (AT); FRM (FS); Canceropole Ile-de-

France, Institut National du Cancer, Fondation de France,Association Laurette Fugain, Cent pour Sang la Vie, AgenceNational de la Recherche, Association for InternationalCancer Research (AICR), and the European Commission(ApoSys, ChemoRes, Death-Train, RIGHT) (GK); la Ligueand FRM (LA); a fellowship from La Ligue (IM); a fellowshipfrom ARC (MM).

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Supplementary Information accompanies the paper on the Oncogene website (http://www.nature.com/onc)


491

Oncogene

Review
Cancer
Research
Tumor Cell Death and ATP Release Prime Dendritic Cellsand Efficient Anticancer Immunity
Laetitia Aymeric1,2,3, Lionel Apetoh1,2,3, François Ghiringhelli1,2,3,4,5, Antoine Tesniere2,3,6, Isabelle Martins2,3,6,Guido Kroemer2,3,6, Mark J. Smyth7, and Laurence Zitvogel1,2,3

Abstract

Authors'3Université866; 5CentVillejuif, FrCancer Ce

Note: G. Kr

CorresponSERM, InsVillejuif, FrE-mail: zitv

doi: 10.115

©2010 Am

www.aacr

By destroying tumor cells, conventional anticancer therapies may stimulate the host immune system to elim-inate residual disease. Anthracyclines, oxaliplatin, and ionizing irradiation activate a type of tumor cell deaththat elicits efficient anticancer immune responses depending on interferon γ (IFNγ) and the IFNγ receptor.Thus, dying tumor cells emit danger signals that are perceived by dendritic cells (DC), which link innate andcognate immune responses. Recently, we observed that ATP was released by tumor cells succumbing to chemo-therapy. ATP activates purinergic P2RX7 receptors on DC, thus activating the NLRP3/ASC/caspase-1 inflamma-some and driving the secretion of interleukin-1β (IL-1β). IL-1β then is required for the adequate polarization ofIFNγ-producing CD8+ T cells. These results imply a novel danger signal, ATP, and a novel receptor, P2RX7, in thechemotherapy-elicited anticancer immune response. Cancer Res; 70(3); 855–8. ©2010 AACR.

Setting the Stage

Some regimens of chemotherapy mediate direct cytotoxiceffects on the tumor and, in addition, elicit indirect antitumoreffects resulting from the immunogenicity of cell death (1, 2).Anthracyclines, oxaliplatin, and ionizing irradiation can trig-ger immunogenic cell death, whereas many other anticanceragents fail to do so. We delineated the molecular mechanismsunderlying the recognition of dying tumor cells by dendriticcells (DC) and found two major checkpoints that dictatethe immunogenicity of cell death. First, optimal phagocytosisof chemotherapy or radiotherapy-treated tumor cells byDC requires the translocation of endoplasmic reticulum(ER)-resident calreticulin and disulfide isomerase ERp57 tothe plasma membrane of dying tumor cells (3–5). Second,the chromatin-binding high mobility group box 1 protein(HMGB1) must be released by dying tumor cells and mustbind to its receptor toll-like receptor 4 (TLR4) on DC to facil-itate antigen processing of the phagocytic cargo (6). However,additional signals emanating from dying tumor cells arerequired for the full-blown maturation and differentiationof DC and T cells, respectively. Therefore, we addressed the con-tribution of damage-associated molecular patterns (DAMP) tothe efficacy of chemotherapy in mouse tumor models (7).

Affiliations: 1INSERM, U805; 2Institut Gustave Roussy;Paris-Sud, Villejuif, France; 4AVENIR team INSERM CRI-

re Georges Francois Leclerc, Dijon, France; 6INSERM, U848,ance; and 7Cancer Immunology Program, Peter MacCallumntre, East Melbourne, Victoria, Australia

oemer, M.J. Smyth, and L. Zitvogel share senior co-authorship.

ding Author: Laurence Zitvogel, U805 and CIC BT507 IN-titut Gustave Roussy, 39 rue Camille Desmoulins, F-94805ance. Phone: 33-1-42-11-50-41; Fax: 33-1-42-11-60-94;[email protected].

8/0008-5472.CAN-09-3566

erican Association for Cancer Research.

journals.org

Results

Components of the immune system required for thera-peutic effects. Immunosurveillance of tumors involves lym-phocytes and requires an intact interferon γ (IFNγ)/IFNγRpathway (8–10). To investigate the contribution of theseimmune effectors in the efficacy of chemotherapy, we com-pared chemotherapy-induced tumor growth retardation inimmunocompetent mice and in mice bearing various immu-nodefects affecting B and/or T cells [Rag−/−, nu/nu, or wild-type (WT) mice treated with a depleting anti-CD8 mAb] orthe IFNγ/IFNγR system (Ifng−/−, IfngR−/−, or WT treated withneutralizing anti-IFNγ antibodies). The depletion of CD8+

T cells or the removal of the IFNγ/IFNγR pathway reducedthe therapeutic effects of oxaliplatin against CT26 colon can-cer, EL4 thymoma, and abolished the antitumor effects ofanthracyclines (doxorubicin or mitoxanthrone) againstCT26 cells or MCA-induced sarcomas. In contrast, other mo-lecules such as IL-12Rβ2, perforin, and TRAIL were dispens-able for the efficacy of these cancer chemotherapies in the sametumormodels. Chemotherapy promoted a tumor-specific T-cellresponse that was detectable in the tumor-draining lymphnodes (LN), 7 to 10 days after the systemic administrationof oxaliplatin. After ex vivo restimulation with tumor anti-gens, oxaliplatin-induced CD4+ T cells mainly producedinterleukin-2 (IL-2), whereas chemotherapy-induced CD8+

T cells produced high levels of IFNγ. These chemotherapy-induced T-cell responses apparently resulted from local can-cer cell death because they were detectable in draining LN(but not distant LN) and because dying (but not living) tumorcells inoculated in the footpad could mimic these immuneeffects (7).In conclusion, tumor regression promoted by oxaliplatin or

anthracyclines elicits a tumor-specific IFNγ-polarized CD8+

T-cell immune response, which is critical for the efficacy ofchemotherapy.

855

Aymeric et al.

856

The inflammasome NLRP3 is mandatory for the efficacyof chemotherapy. Inoculation of anthracycline or oxalipla-tin-treated tumor cells in the footpad induced a potentIFNγ-polarized CD8+ T-cell response relying on TLR4 signal-ing in DC (6). We investigated the possible contribution ofother receptors for DAMPs that could account for the prim-ing of IFNγ-producing T cells during anticancer chemother-apy. In addition to TLR, NOD-like receptors (NLR) recognizeDAMPs and link inflammation to innate immunity (11, 12).In macrophages, the so-called “inflammasome” serves as acentral sensor for DAMPs (13). The NLRP3 (CIAS1/CRYO-PYRIN)-inflammasome is a multimeric protein complex thatactivates the protease caspase-1, which mediates the proces-sing and secretion of pro-inflammatory cytokines (IL-1β,IL-18, IL-33). The NLRP3 inflammasome can be activated byendogenous danger signals (DAMPs) or pathogen-associatedmolecular patterns (PAMP), which all act in concert to induceK+ efflux (14–17). Gain-of-function mutations in the humanNLRP3 gene cause autoinflammatory disease that can besuppressed by the systemic administration of IL-1R antago-nists (18, 19). To investigate the putative role of the NLRP3inflammasome in anticancer chemotherapy, we comparedtumor growth kinetics of EL4 sarcomas treated with oxalipla-tin in WT mice versus mice deficient in each component ofthe inflammasome [NLRP3, its adaptor molecule apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruit-ment domain (ASC) or caspase-1] or its final product IL-1β.Each individual player of this complex was required for thesuccess of chemotherapy. The key contribution of IL-1β inthe antitumor effects mediated by anthracyclines and/or ox-aliplatin was also shown in CT26 colon cancer and moreimportantly in spontaneous tumors induced by MCA (7).To analyze the role of the NLRP3 inflammasome in the

antitumor immune response elicited by chemotherapy, weinoculated live versus dying tumor cells exposed to chemo-therapy ex vivo and determined the capacity of draining LN Tcells to produce IFNγ in response to tumor antigens. In thesecircumstances, T cells from mice deficient in individual com-ponents of the inflammasome/IL-1β axis (NLRP3, Casp-1,IL-1R1) failed to mount optimal IFNγ polarized CD8+ T-cellresponses. Moreover, caspase-1-deficiency resulted in defi-cient IFNγ production by tumor antigen-specific CD8+ Tcells, whereas normal mice mounted such T-cell responsesin the draining LN of established tumors treated by systemicoxaliplatin injections (7). Hence, we showed that the NLRP3inflammasome is critical for the immunogenicity of celldeath triggered by anthracyclines, oxaliplatin, or x-rays.Key contribution of ATP and purinergic receptors.

Multiple distinct bacterial products or endogenous damagesignals (such as toxins, ATP, uric acid crystals, alum, silica)stimulate the NLRP3 inflammasome resulting in the proteolyt-ic auto-activation of caspase-1 (15, 20, 21). One of the mostpleiotropic activators of the NLRP3 inflammasome is extracel-lular ATP, which is released from stressed cells and acts onpurinergic receptors, mostly of the P2 × class (22). To our sur-prise, multiple distinct cell death inducers (cadmium, etopo-side, mitomycin C, oxaliplatin, cis-platin, staurosporine,thapsigargin, mitoxanthrone, doxorubicin) induced the re-

Cancer Res; 70(3) February 1, 2010

lease of ATP in vitro from dying tumor cells, by 8 to 20 hourspostexposure (7, 23). This ATP release became undetectablewhen cells were incubated with the ATP-degrading enzymeapyrase or with inhibitors of ATP synthesis such as antimycinA plus deoxyglucose (A/D) or the oxidative phosphorylationuncoupler 2,4-dinitrophenol (DNP). When oxaliplatin-treatedEG7 or anthracycline-treated CT26 cells were admixed withATP scavengers (A/D, apyrase, DNP) or nonselective P2× re-ceptor antagonists (iso-pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2′,5′-disulphonate or oxidized ATP), they lost their capacityto elicit protective antitumor immune responses upon subcu-taneous inoculation into normal mice. ATP depletion or P2×receptor blockade also abolished the capacity of oxaliplatin-treated EG7 cells [which express the model antigen ovalbu-min (OVA)] to prime OVA-specific cells for IFNγ production(7). Altogether, we generalized the finding that dying tumorcells release ATP, which is indispensable for their immunoge-nicity. In contrast, the immunizing capacity of candidateantigen proteins admixed in TLR adjuvants is not blockedby P2× receptor antagonists and hence is likewise indepen-dent of endogenous ATP.Because the high affinity receptor for ATP is the purinergic

receptor P2RX7, we assessed the ability of p2rx7−/− mice tomount a chemotherapy-induced IFNγ polarized CD8+ T-cellresponse and to control the growth of established tumorsafter chemotherapy. Importantly, oxaliplatin failed to controltumor progression in p2rx7−/− mice, and, similarly, oxalipla-tin-treated OVA expressing EG7 could not elicit OVA-specificT-cell responses in LN harvested from p2rx7−/− mice. Next,we showed that host DC were the cells harboring functionalP2RX7 receptors during chemotherapy. In transgenic miceexpressing the diphtheria toxin receptor on their DC (underthe control of the CD11c promoter), diphtheria toxin depletesLN DC, and this maneuver readily abolishes the CD8+ T-cellresponse elicited by dying EG7 cells. The adoptive transfer ofbone marrow-derived WT (but not in p2rx7−/−) DC loadedwith dying EG7 restored the OVA-specific CD8+ T-cellresponse in p2rx7−/− mice. Accordingly, WT DC loaded withoxaliplatin-treated EG7 cells in vitro produced IL-1β in aNLRP3-, ASC-, and casp-1-dependent fashion, in conditionsin which IL-12p40 secretion was independent of the NLRP3inflammasome. The PAMP lipopolysaccharide (a TLR4ligand) and the DAMP ATP reportedly act in concert to ignitethe NLRP3 inflammasome in macrophages (17). Accordingly,we found that the TLR4 ligand HMGB1 and ATP, which areboth released by tumor cells exposed to cytotoxic agents,act in concert to promote IL-1β secretion by DC ex vivo.The treatment of DC with oxidized ATP or anti-HMGB1-neutralizing antibodies prior to loading with dying tumorcells completely abolished IL-1β secretion (7).The link between inflammation and cognate immunity.

As discussed above, ATP released by dying tumor cells en-gages P2RX7 receptors on DC, thereby triggering the NLRP3inflammasome that culminates in IL-1β production and DC-mediated IFNγ polarized CD8+ T-cell response. How thencould IL-1β contribute to the immunogenicity of cell death?We hypothesized that IL-1β may control and/or switchthe quality of the priming of naive CD8+ T cells during the

Cancer Research

Immune Response against Dying Tumor Cells

treatment of a tumor by chemotherapy (7). We producedthree lines of evidence supporting this contention.First, DC loaded with dying EG7 cells induced the polari-

zation of naive OT-1 cells (which express a transgenic T-cellreceptor that recognizes an OVA-derived peptide, SIINFEKL)into IFNγ producing lymphocytes in a caspase-1- and IL-1β-dependent manner in vitro and in vivo. IL-1β receptor antag-onist or neutralizing anti-IL-1β antibodies suppressed IFNγpolarization in this in vitro priming system. Similarly, OT-1cells were activated (CD69 expression) upon their adoptivetransfer into WT mice, but not into casp-1 −/− mice, followingimmunization with dying EG7 cells. IL-1RA also preventedthe expansion of SIINFEKL/Kb tetramer-specific T cellsin LN draining the immunization with dying EG7. Second,activation of naive CD3+ T lymphocytes by a cocktail ofanti-CD3/anti-CD28 mAb in the presence of IL-1β (but notIL-6 or TNFα) resulted in a IFNγ polarizing effect that wassimilar to the one described for IL-12 (7). Third, the failure ofp2rx7−/− and casp-1−/− mice to mount OVA-specific IFNγ-polarized CD8+ T-cell response after immunization withoxaliplatin-treated EG7 could be overcome by recombinantIL-1β coinjected with the vaccine (7).

www.aacrjournals.org

In conclusion, IL-1β contributes to the full differentiationof IFNγ polarized CD8+ T cells during the priming of anti-tumor immune responses that are elicited as a byproductof anticancer chemotherapy.

Discussion

Our results identify tumor-derived ATP as a new DAMP,which is required for cancer cell death to be immunogenic.Our data are compatible with a scenario (Fig. 1) in whichATP activates P2RX7 receptors on DC, thereby stimulatingthe aggregation and/or activation of the NLRP3/ASC/Casp-1inflammasome, the proteolytic maturation of caspase-1, pro-IL-1β cleavage, and consequent IL-1β release. IL-1β then isrequired for the priming of IFNγ-producing tumor antigen-specific CD8+ T cells (7). In accord with previous studies(24), IFNγ, rather than perforin or TRAIL-dependent cyto-toxic activities, mediates the anticancer activity of T lympho-cytes that have been primed in a P2RX7/NLRP3/ASC/Casp-1/IL-1β-dependent fashion.New links between inflammasomes and cognate immunity

are being progressively unraveled. Eisenbarth and colleagues

Figure 1. The integrity of the NLRP3 inflammasome is required for IFNγ polarized CD8+ T-cell response with dying tumor cells. During a hit withchemotherapy, dying tumor cells are captured and processed by host DC triggering a tumor-DC crosstalk dictated by ATP/P2RX7 and HMGB1/TLR4molecular interactions. ATP and HMGB1 act in concert to ignite the NLRP3 inflammasome in DC, culminating in IL-1β processing and secretion in theextracellular milieu. IL-1β then contributes to the TCR-driven IFNγ polarized CD8+ T-cell response, a mandatory step for the efficacy of chemotherapy.

Cancer Res; 70(3) February 1, 2010 857

Aymeric et al.

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(25) showed that the NLRP3 inflammasome pathway stimu-lated by aluminum-based adjuvant (alum) directs a humoraladaptive immune response. Mice deficient in Nlrp3, ASC, orcaspase-1 failed to mount an antibody response to antigenadministered with alum, yet generated normal responsesagainst antigens emulsified with complete Freund's adjuvant.The Nlrp3 inflammasome was required for the production ofIL-1β and IL-18 by macrophages in response to alum (25). Itis noteworthy that in response to dying tumor cells, IL-18was not produced by P2RX7/NLRP3-activated DC andIL-18R was not required for the immunogenicity of cell deathin vivo (7). During lung infection with influenza A virus, ASCand caspase-1 (but not NLRP3) were required for CD4+ andCD8+ protective T-cell immunity, mucosal IgA production,and systemic IgG antibody responses (26), suggesting thateach immune response relies on a specific mode of inflam-masome activation and perhaps a specific pattern of inflam-masome-dependent cytokines.Importantly, we showed that a loss-of-function allele of

P2RX7 that reduces the affinity of P2RX7 receptor for ATP

Cancer Res; 70(3) February 1, 2010

compromises the efficacy of anthracycline-based chemother-apy in breast cancer patients, implying that the pathwaywe elucidated has clinical relevance and will presumably beclinically implemented for a better management of “person-alized chemotherapy.”

Disclosure of Potential Conflicts of Interest

No potential conflicts of interest were disclosed.

Grant Support

G. Kroemer and L. Zitvogel are supported by grants from the LigueNationale contre le Cancer (équipes labellisées), Fondation pour la RechercheMédicale, European Union, Cancéropôle Ile-de-France, Institut National duCancer, Association for International Cancer Research, and Agence Nationalepour la Recherche. M.J. Smyth is supported by the National Health and MedicalResearch Council of Australia and the Victorian Cancer Agency. A. Tesniere issupported by INSERM (poste d'accueil).

Received 10/16/09; accepted 10/18/09; published OnlineFirst 1/19/10.

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immunogenicite de la mort cellulaire induite par les chimiotherapies