IMMUNOBLOTTING

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Blocking

molti siti di legame della membrana (di nitrocellulosa o PVDF) rimangono liberi da proteine dopo il trasferimento

quindi

si devono bloccare questi siti con BSA o dry Milk (latte in polvere)

prima dell’incubazione con anticorpi

La BSA e’ generalmente piu’ purificata del latte in polvere ma contiene epitopi identici, quindi ha meno capacità “bloccante” rispetto al latteIl latte tuttavia non e’ raccomandato se si usano anticorpi che riconoscono carboidrati.

(stringenza dell’ ibridazione)

Il TWEEN nel buffer di incubazione con l’anticorpo serve per interferire con il legame aspecifico

dell’anticorpo alla membrana

Un effetto indesiderato e’ che il Tween interferisce anche con il legame tra antigene e anticorpo e puo’ causare la

dissociazione delle proteine dal filtro.

Il detergente non ionico Tween-20

Quindi la concentrazione di Tween deve essere attentamente calibrata e dipende dalla forza dell’ interazione tra ligando e anticorpo

Immuno-blotting :

1. separazione del campione tramite PAGE (Poliacrilammide gel elettroforesi)

2. Western blotting: trasferimento delle proteine separate elettroforeticamente su membrana

3. “BLOCKING”: bloccaggio dei siti aspecifici

4. Rivelazione con anticorpi: primari (che riconoscono e legano recognize la proteina specifica di interesse) e secondari

Proteina legata alla membrana

Anticorpo primario

Membrana

Anticorpo secondario

Fluoroforo oHRP o AF

Anticorpo secondarioConiugato a:

Perché nell’immunodetection si usa un anticorpo secondario?

L’anticorpo secondario

riconosce specificamente le IgG del primario

ed è coniugato con composti che ne permettono la evidenziazione

Proteina legata alla membrana

Anticorpo primario

Membrana

Anticorpo secondario

Fluoroforo oHRP o AF

Anticorpo secondarioConiugato a:

.-fluorofori, - colloidi d’oro -radioisotopi

o, piu’ comunemente, ad un enzima (es. Fosfatasi alcalina AF o perossidasi di rafano HRP)

L’ anticorpo secondario può essere coniugato a:

Anticorpo primario

Membrana

Anticorpo secondario

Fluoroforo oHRP o AF

Anticorpo secondarioConiugato a:

La perossidasi di rafano (HRP)in presenza di perossido di idrogeno

ossida il suo substrato, il luminolo, con concomitante emissione di luce

ECL(Enhanced Chemioluminescence System)

10 volte piu’ sensibile di un metodo colorimetrico

P

MEMBRANA

Ab primario

Ab secondario coniugato ad HRP

Substrato ECL

Luce emessa

X-Ray filmCCD camera

Rivelazione:

Colorazione delle proteine su carta

Ponceau S

Ponceau SC22H12N4O13S4

.Na4                                                      

e’ un metodo rapido e reversibile di colorazione delle proteine dopo trasferimento su carta.

meno sensibile del Comassie ma NON interferisce con le procedure di immuno-detection

Ponceau S Staining Solution :(0.1%(w/v) Ponceau S in 5%(v/v) acetic acid)

Colorazione delle proteine trasferite su carta con Ponceau S

ECL detection su membrana NCGel SDS-PAGEcolorato con CBB

Membrana colorata con PonceauS

Es. Colorazione su gel:Es. Colorazione su membrana:

MW 1 2

Sec4

Sec4GFP

One Dimensional (1D) Protein Electrophoresis Separation:

Isoelectric focusing (IEF) (par 10.3.4)

Altri tipi di elettroforesi:

2D PAGE pag 385 paragrafo 8.5.1

In un gradiente di pH e in presenza di un campo

elettrico

le proteina migreranno fino a raggiungere

il punto nel gradiente

dove la loro carica e’ nulla:Cioè al loro Punto isoelettrico

Isoelectric focusing (IEF)

IEF e un metodo per separare le proteine secondo il loro punto isoelettrico

IEF impiega gel orizzontali su piastre di vetro o fogli di plastica e percentuali di acrilammide e agarasio che

permettono la libera mobilità dela molecole

Per creare i gradienti nel gel si usano anfoliti

=miscele complesse di

di acidi poliammino-policarbossilici sintetici

Gli anfoliti coprono diversi di pH (es.pH 3-10 o pH7-8)

Il range di pH va scelto in dipendenza dei pI delle proteine di interesse

.

Isoelectric focusing of proteins (IEF)Utile per separare proteine con differenti modificazioni (es.

Fosforilazioni)o isoenzimi

http://www5.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/Elpho_IEF+Separation

Creazione di un gradiente di pH usando anfoliti

A. Nessun voltaggio applicatoB. Gli anfoliti e le proteine si muovono quando

la corrente e’ applicata secondo la loro caricaC. Al pH isolelettrico le proteine sono “focused”

cioè ferme

PROTEOMICA

L'elettroforesi bidimensionale (2D-Gels)

ID=IEF. Le proteine vengono assorbite su strisce di gel secchi che hanno gradienti di pH immobilizzati. Una volta idratate e applicato il campo elettrico le proteine acide che si trovano sul lato alcalino del gel dissoceranno e saranno caricate negativamente. A causa del campo elettrico queste proteine migreranno al polo positivo (il lato acido del gel).

2D: SDS-PAGE2D

ID

pH 2

pH 11

.

IEF

Gel figure from http://www.microbiology.science.ru.nl/tech/twod/

2D=SDS-PAGE

The MALDI-ToF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization

Time-of-Flight) MALDI ToF permette l’ analisi rapida di proteine digerite purificate da spots ottenuti da gel 2D or possibilmente 1D gel, by peptide mass fingerprinting. Parent masses of whole intact proteins can also be measured. Questo strumento è anche eccellente per determinare modificazioni che cambiano la massa o lo stato di carica di proteine note.

Es. di uno strumento di Maldi-Tof in commercio

Spettrometria di Massa MS-MALDI TOF

-Le molecole di campione sono convertite in ioni gassosi-gli ioni sono poi accellerati in un campo elettrico o magnatico o viene misurato il TOF di ioni di massa diversa in una data distanza - separati da un’analizzatore di massa-carica (m/z)-il rivelatore detrmina il rapporto massa/carica di ogni specie ionizzata

MALDI-TOF (Ionizzazione per desorbimento laser assistito da una matrice)

Time of flight) mass spectometer

Analisidati

Sistema ad alto vuoto

entratasorgete di ioni

Analizza-tore di massa

rivelatore

MALDI TOFTOF=Time of Flight

Tempo impiegato da ioni di massa diversa per percorrere un data distanza

MALDI, spettrometria di massa TOF e MALDI-TOFPag.408-419 paragrafo 9.3.7

2D PAGE pag 385 paragrafo 8.5.1

L’elettroforesi capillare e’ usata per la separazione analitica delle proteine, aminoacidi,

peptidi e frammenti di DNA

dati

catodo anodo

tempo

ASSOBANZA

Elettroforasi capillare Fonte di lucerivelatore

CZE: elettroforesi capillare in soluzione libera

HPCE: elettroforesi capillare zonale

CE: Elettroforesi capillare,

TIPI di ELETTROFORESI CAPILLARE

Le estremità del capillare sono immerse nel serbatoi riempiti con l’elettrolita.

Gli elettrodi sono fatti di platino e sono anche inseriti nei serbatoi con l’elettrolita. Il campione (nanomoli) viene inniettato a una estremità nel capillare.

Generalmente un rivelatore ad assorbanza UV si trova alla estremità opposta del capillare.Il rivelatore genera un grafico in funzione del tempo

Alto voltaggio (typicamente 10-30kV) capillare sottile (25-100mm).

Vantaggi: nanolitri di campione sono sufficienti e l’analisi è effettuata in tempo reale con alta sensibilità (fentomoli 10-15)

dati

catodo anodo

tempo

ASSOBANZA

Elettroforasi capillare Fonte di lucerivelatore

Tecniche cromatograficheNella cromatografia si definisce :

una fase mobile (liquida o gassosa che fluisce sopra o attraversa

una fase stazionaria (un solido, un gel, un liquido o una miscela solido liquido

immobilizzata).

I composti che devono essere separati si devono distribuire tra fase mobile e stazionaria in modo che abbiano diversi coefficienti di distribuzione

Cromatografia su colonna.

La fase stazionaria è attaccata ad una matrice

(un supporto inerte e insolubile) impaccata in una colonna

la fase mobile passa attraverso la colonna per gravità o usando un

sistema di pompaggio oppure un gas sotto pressione.

Schema di una semplice separazione in cromatografia a fase liquida

Colonna contenente

la fase stazionaria

Caricamento del campione

Aggiunta del solvente

Recupero del campione

La cromatografia a fase mobile liquida semplice consiste di una colonna che tiene una fase stazionaria

nell'equilibrio con un solvente.

Le fasi stazionarie tipiche (e le loro interazioni con i soluti) sono:

1) solidi (assorbimento Es. Silice QIAprep),

2) gruppi ionici su una resina (scambio ionico),

3) liquidi su un supporto solido inerte (di ripartizione ) e

4) particelle inerti porose (size-esclusion).

Cromatografia di gel filtrazioneLe molecole pi ù grandi del formato del poro non possono entrare nei pori

ed eluiscono insieme al primo picco nel cromatogramma.

Le molecole che possono entrare nei pori avranno un tempo di soggiorno medio nelle particelle che dipende dal formato e dimensione delle molecole.

Le molecole differenti quindi hanno tempi totali differenti di transito attraverso la colonna.

Le molecole che sono pi ù piccole di il formato del poro pu ò entrare in tutti i pori

ed hanno il tempo massimo del soggiorno sulla colonna e si eluiscono insieme come l'ultimo picco nel cromatogramma. Questo ultimo picco nel cromatogramma determina il limite totale di permeazione

Campioni piccoli

Campioni grandi

La cromatografia a fase liquida (LC)

è una tecnica cromatografica analitica che è utile per la separazione gli ioni o di molecole dissolte in un solvente.

I componenti della miscela si separeranno usando queste differenze ed esse determineranno il periodo di transito dei soluti attraverso una colonna

La soluzione del campione rimane a luogo in contatto con una seconda fase solida o liquida, i soluti differenti interagiranno con l'altra fase secondo le differenze

nell'adsorbimento, scambio ionico, dimensione o forma.

La scelta tra fase mobile e stazionaria viene fatta in modo che i composti da separare abbiano

diversi coefficienti di distribuzione Kd

Kd descrive il modo in cui un composto si distribuisce

tra due fasi immiscibili A e B a temperatura costante.

Kd =(concentrazione nella fase A/ concentrazione nella fase B)

Capacità di ritenzione (K’) è

la quantità totale di sostanza presente in una fase divisa la quantità totale presente nell’ altra fase

In pratica

Capacità di ritenzione K’= Kd . VA/VB

Kd=coefficiente di distribuzione (concentrazione relativa dell’analita tra ledue fasi)

VA=volume del composto A; VB=volume del composto B

Tre diversi metodi di eluizione: a. semplice o progressiva;b. a stadi;c. a gradiente di potere eluente.

A. Eluizione semplice la fase mobile rimane la medesima durante tutta

l'eluizione e le sostanze escono dalla colonna in dipendenza dai loro coefficienti di ripartizione

B. L'eluizione a stadi si utilizza quando si vogliono separare due sostanze che presentano un coefficiente di ripartizione molto diverso tra la fase fissa e la fase mobile utilizzate.

C. Eluizione a gradiente di potere eluente la variazione della composizione della fase mobile è progressiva, anziché brusca come nel metodo a stadi.

Questo metodo di eluizione viene utilizzato soprattutto quando le sostanze che costituiscono la miscela in studio presentano valori molto diversi di coefficiente di ripartizione tra fase fissa e fase mobile.

I componenti che si eluiscono dalla colonna possono

essere misurati da un rivelatore e/o essere raccolti per ulteriore analisi.

Cromatogramma e parametri che influenzano la risoluzione cromatografica

A280

Volume di eluizione

Vr1

Wb1

Pick1

Vr2

Wb2

Pick2

Wb1=ampiezza del picco1Wb2=ampiezza del picco2Vr1=il volume del picco 1Vr2=il volume del picco 2

Risoluzione: è la misura della separazione relativa raggiunta tra

due materiali cromatograficamente distinti

R= Vr2 - Vr1

½ (Wb2 + Wb1)

Wb1=ampiezza del picco1Wb2=ampiezza del picco2Vr1=il volume del picco 1Vr2=il volume del picco 2

La massima risoluzione è lo scopo primario di ogni purificazione

Capacità o fattore di risoluzione

E’ la misura della ritenzione di un componente del campione

da non confondere con la capacità di caricamento della colonna

k

k = Vr2-VmVm

Vm= volume dellafase mobile

Vr2= volume di eluizionedel picco 2

EFFICIENZA

(N)

E’ la misura dell’ampiezza del picco di eluizione della colonna

Vr1

Wb1

Pick1

Vr2

Wb2

Pick2