Immunglobulin A in humaner Gallenblasengalle und sein ... · PDF fileImmunglobulin A in humaner Gallenblasengalle und sein Einfluß auf die Cholesterinkristallisation Von der Medizinischen

Immunglobulin A in humaner Gallenblasengalle und

sein Einfluß auf die Cholesterinkristallisation

Von der Medizinischen Fakultät der

Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen

zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Medizin genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Stefan Südfeld

aus

Werne an der Lippe

Berichter: Universitätsprofessor Dr. med. Dipl.-Biochem. S. Matern

Universitätsprofessor Dr. med. F. Lammert

Tag der mündlichen Prüfung: 11. Mai 2005

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.

Inhalt

1 Einleitung.................................................................................................................. 1

2 Material und Methoden............................................................................................. 7

2.1 Gallenblasengalle.............................................................................................. 7

2.2 Immunglobulin A-Gewinnung.......................................................................... 8

2.2.1 Zentrifugation der Gallenblasengalle............................................... 8

2.2.2 ConA-Sepharose-Affinitätschromatographie ................................... 8

2.2.3 IgA-Immunaffinitätschromatographie ............................................. 9

2.3 Methoden zur Messung der Konzentration von Proteinen............................. 11

2.3.1 Radiale Immunodiffusion (RID) .................................................... 11

2.3.2 ELISA............................................................................................. 12

2.3.2.1 Spezifität.................................................................................... 14

2.3.2.2 Reproduzierbarkeit .................................................................... 15

2.3.2.3 ELISA für Immunglobulin G .................................................... 15

2.4 Vergleich von kolostralem und biliärem Immunglobulin A........................... 15

2.4.1 Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation................................... 15

2.4.2 Kristall-ELISA............................................................................... 16

2.4.2.1 Reproduzierbarkeit .................................................................... 18

2.4.2.2 Vergleich der Kristallbindung verschiedener Arten von IgA.... 18

2.4.2.3 Vergleich der Kristallbindung von IgA und IgG...................... 18

2.4.3 Cholesterinkristallisationstest......................................................... 18

2.5 Optische Darstellung der IgA-Kristallbindung............................................... 21

2.5.1 Herstellung der Cholsterinkristalle................................................. 21

2.5.2 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)................................ 22

2.5.3 Fluoreszenzmikroskopie................................................................. 22

2.6 Ergänzende Methoden.................................................................................... 23

2.6.1 Proteinbestimmung......................................................................... 23

2.6.2 Qualitatives Gel.............................................................................. 23

3 Ergebnisse ............................................................................................................... 25

3.1 Gallenblasengallen.......................................................................................... 25

3.1.1 Testung der Gallenblasengallen auf Verunreinigung mit Blut....... 25

3.2 Immunglobulin A-Gewinnung........................................................................ 26

3.2.1 IgA-Immunaffinitätschromatographie ........................................... 26

Inhalt

3.3 Bestimmung der IgA-Konzentration in humaner Gallenblasengalle..............28

3.3.1 RID.................................................................................................29

3.3.2 ELISA.............................................................................................29

3.4 Vergleich von kolostralem und biliärem IgA.................................................30

3.4.1 Saccharose Dichtegradientenzentrifugation...................................31

3.4.2 Kristall-ELISA...............................................................................31

3.4.3 Cholesterinkristallisationstest.........................................................33

3.5 Optische Darstellung der IgA-Kristallbindung...............................................35

3.5.1 TEM................................................................................................35

3.5.2 Fluoreszenzmikroskopie .................................................................36

4 Diskussion...............................................................................................................39

5 Zusammenfassung...................................................................................................43

6 Abkürzungsverzeichnis ...........................................................................................45

7 Literaturverzeichnis.................................................................................................47

1 Einleitung 1

1 Einleitung

Die symptomatische Cholecystolithiasis ist eine häufige Erkrankung. Sie stellt für den

Einzelnen und aufgrund ihrer hohen Inzidenz auch gesundheitsökonomisch ein

bedeutendes Ereignis dar. Derzeit ist jeder 13. Einwohner in Deutschland

asymptomatischer Gallenblasensteinträger1. Es zeigt sich ein deutlicher Anstieg der

Steinprävalenz mit dem Lebensalter1. Da die Lebenserwartung steigt, erhöht sich das

individuelle Risiko, Gallenblasensteinträger zu sein und Komplikationen zu erleiden.

Hierzu zählen eine mechanische Verlegung und eine Entzündung der Gallenwege.

20 - 40% der Patienten entwickeln im Verlauf Komplikationen und müssen medizinisch

behandelt werden. Patienten die im Rahmen einer symptomatischen aber

unkomplizierten Cholecystolithiasis ärztlich vorstellig werden, können sowohl operativ

als auch nicht-chirurgisch behandelt werden. Dabei ist neben dem Versuch der

medikamentösen Steinauflösung auch eine extrakorporale Stosswellenlithotripsie

(ESWL) möglich. Bei beiden nichtoperativen Optionen treten jedoch mit hoher

Wahrscheinlichkeit Rezidivsteine auf. Bei der ESWL beträgt dieses Risiko bis zu 50%

innerhalb von 5 Jahren. Daher werden in Deutschland pro Jahr über 130.000

Cholezystektomien durchgeführt2. Bei der operativen Entfernung der Gallenblase liegt

die Gesamtmortalität bei 0,7%, so dass im Rahmen der Cholezystektomie in

Deutschland etwa 900 Menschen pro Jahr versterben3. Insgesamt verursacht das

Gallensteinleiden über 200.000 stationäre Behandlungen pro Jahr in Deutschland. Dabei

entstehen bei 1,9 Millionen Behandlungstagen Kosten in Höhe von über einer halben

Milliarde Euro4,5.

Ein besseres Verständnis der Gallensteinentstehung ist ein wichtiger Schritt zur

Primärprävention von Gallensteinen und zur Entwicklung neuer Therapieansätze. Bei

der Untersuchung der Gallensteinentstehung müssen die verschiedenen Gallenstein-

typen und ihre Pathogenese unterschieden werden. Die Cholesteringallensteine stellen

mit 80% aller Gallensteine den größten Anteil6 und stehen im Mittelpunkt dieser Arbeit.

Risiokofaktoren für die Cholesteringallensteinbildung wie Adipositas1 sowie starke

Gewichtsabnahme 7 können primär durch Aufklärung oder Prophylaxe

1 Einleitung2

(Gewichtsreduktion, keine forcierte Gewichtsabnahme) behandelt werden. Andere

Veränderungen der Zusammensetzung der Gallenblasengalle sind derzeit einer

Prävention noch nicht zugänglich, da sie auf noch zu erforschenden

pathophysiologischen Mechanismen, insbesondere einer genetische Prädisposition8

beruhen.

Nach dem derzeit gültigen Modell basiert die Pathophysiologie der Gallensteinent-

stehung auf drei Schlüsselfaktoren:

1. Cholesterinübersättigung der Gallenblasengalle

2. Störung der Motilität der Gallenblase

3. Einfluss anderer gelöster Stoffe (insbesondere biliärer Proteine)

Die Gallensteinbildung wird in zwei Phasen unterteilt, die Nukleation und das

Steinwachstum. Für das Steinwachstum ist vor allem eine veränderte Motilität der

Gallenblase mit verlängerter Verweildauer der Galle in der Gallenblase verantwortlich

zu machen. Für die Nukleation ist hingegen die Zusammensetzung der Galle

entscheidend.

Zur Untersuchung der physikalisch-chemischen Eigenschaften und der Cholesterin-

kristallisation werden Modellgallen benutzt. Dies sind wässrige Lösungen, in denen

Cholesterin, Gallensäuren und Phospholipide in unterschiedlichen Konzentrationen

gelöst sind. Die Galle muß als notwendige Voraussetzung für die Entstehung von

Cholesterinkristallen mit Cholesterin übersättigt sein9. Cholesterin selbst ist in wässriger

Lösung nur schlecht löslich. Bei Zugabe von Gallensäuren und Phospholipiden steigt

die Löslichkeit. Für Modellgalle, mit der die Cholesterinnukleation und das

Kristallwachstum simuliert werden können, ermittelten Carey et al.10,11 für verschiedene

Konzentrationen von Cholesterin, Gallensäuren und Phospholipiden experimentell

einen Cholesterinsättigungsindex9,12 (CSI). Nukleation tritt nur bei einem

Sättigungsindex > 1 auf. Humane Gallenblasengalle ist mit Cholesterin übersättigt13.

Die eigentlich zu erwartende Nukleation wird jedoch nur bei maximal 50% der

Patienten beobachtet14. Es müssen daher in humaner Gallenblasengalle aber nicht in

Modellgalle vorkommende Stoffe einen zusätzlichen Einfluss auf die Nukleation haben.

1 Einleitung 3

Busch et al. 15 beschrieben erstmals, dass ein aus Gallenblasengalle mittels

Concanavalin A- und Helix pomatia-Lectin-Affinitätschromatographie gewonnenes

Proteingemisch in einem in vitro Wachstumsversuch nukleationshemmend wirkt. Auf

der Suche nach weiteren an der Nukleation und dem Gallensteinwachstum beteiligten

Proteinen wurden vier an Cholesterinkristalle absorbierte Glykoproteine isoliert, welche

inhibitorische Effekte auf die Nukleation haben16. Sie konnten als die leichten und

schweren Unterketten, die sekretorische Komponente und die Joining-chain des

Immunglobulins A identifiziert werden17.

Immunglobulin A ist das wichtigste Immunglobulin zum Schutz von Schleimhäuten. Es

kann in monomerer und dimerer Form vorliegen. Größere Konglomerate sind im Serum

nachgewiesen worden18. Die monomere Form besteht aus zwei schweren und zwei

leichten Ketten. Die aus einer variablen und aus drei konstanten Domänen bestehende

schwere Kette (α-chain) ist über eine Disulfidbrücke mit der leichten Kette verbunden.

Diese besteht wie bei allen Immunglobulinen aus jeweils einer variablen und einer

konstanten Domäne19.

Monomeres Immunglobulin A kommt in zwei Subklassen vor20,21. Von IgA1

unterscheidet sich IgA2 durch eine Deletion von 13 Aminosäuren in der Hinge-Region

(Gelenkregion, in der die schweren Ketten über Disulfidbrücken verbunden sind) der

schweren Kette. Aufgrund dessen wird es nicht durch die an dieser Stelle ansetzenden

Proteasen22 der auf den Schleimhäuten angesiedelten Keime gespalten. Der Anteil von

IgA2 am gesamten kolostralen Immunglobulin A ist mit 30 %23 bis 61 %24 höher als bei

humoralem Immunglobulin A (20 %)23,24.

Dimeres Immunglobulin A besteht aus zwei Immunglobulin A-Molekülen. Diese sind

miteinander kovalent über eine J-Chain (Joining Chain) verbunden. Diese Verbindung

von zwei Monomeren zu einem Dimer wird durch die um 19 Aminosäuren gegenüber

der schweren Kette des Immunglobulin G (γ-chain) verlängerte schwere Kette des

Immunglobulins A ermöglicht25. Für den transepithelialen Transport wird das Dimer an

eine sekretorische Komponente gebunden26. Im Serum liegt ungefähr 8 % des

1 Einleitung4

Immunglobulins A in dimerer Form vor, wovon 5 % an die sekretorische Komponente

gekoppelt sind27.

Das Verhältnis von Immunglobulin G zu monomerem Immunglobulin A ist im Serum

und in Galle annähernd identisch27. Polymeres Immunglobulin A mit und ohne

sekretorische Komponente ist jedoch in Galle im Vergleich zum Blut vermehrt

vorhanden. Der relative Anteil des polymeren Immunglobulins A in Lebergalle liegt

nach unterschiedlichen Quellen zwischen 44 - 70 %27 und 72 - 95 % 28. Dabei liegt das

polymere Immunglobulin A zu etwa gleichen Anteilen mit und ohne sekretorische

Komponente vor.

Während die meisten humoralen Proteine durch passiven, vom Molekulargewicht

abhängigen Transport in die Galle gelangen, ist dies bei Immunglobulin A nicht der

alleinige Weg29. In der Mukosa der Gallenwege konnten Immunglobulin A und J-Chain

synthetisierende Plasmazellen nachgewiesen werden30. Die dort gebildeten Dimere

werden mit Hilfe der sekretorischen Komponente von den Epithelzellen der Gallenwege

durch einen endozytischen vesikulären Transport in das Lumen sezerniert31. Ähnliches

gilt auch für das kolostrale Immunglobulin A. Hier konnte nachgewiesen werden, dass

ein Großteil des sezernierten Immunglobulin A aus lokaler Produktion (98 % des

dimeren, 68 % des monomeren IgA) und nur ein kleiner Anteil aus dem IgA-Blutpool

stammt32.

Busch et al.15 wiesen nach, dass IgA in vitro die Gallensteinbildung hemmt und den

Aufbau der Gallensteine modifiziert. Da IgA in vivo zu einem großen Teil in der

Submukosa des biliären Epithels gebildet wird, scheint eine Bildung spezifischer IgA-

Antikörper gegen Cholesterin möglich. Diese könnten dann den beschriebenen Effekt

auf die Gallensteinbildung haben. Bei dem kolostralen IgA wäre dann eine spezifische

Bindung aufgrund der Bildung in der Darmukosa nicht zu erwarten. Entsprechend

würde der Effekt auf die Gallensteinbildung fehlen.

1 Einleitung 5

Es wurde daher in dieser Arbeit

1. ein ELISA zur IgA-Bestimmung entwickelt und validiert um hiermit die

Konzentration von Immunglobulin A in humaner Gallenblasengalle und

anderen Proben zu bestimmen.

2. untersucht, ob biliäres Immunglobulin A einen reproduzierbaren Effekt auf

die Bildung von Cholesterinkristallen hat.

3. untersucht ob der Effekt von biliärem Immunglobulin A auf die Cholesterin-

kristallisation im Vergleich zu nicht biliärem Immunglobulin A unterschied-

lich ist.

4. untersucht ob sich eine Bindung von Immunglobulin A an

Cholesterinkristalle darstellen und vor allem im Vergleich zu nicht biliärem

Immunglobulin A quantifizieren lässt. Hierfür wurde ein Kristall-ELISA

entwickelt und validiert. In diesem wurden dann verschiedene gereinigte

IgA-Proben untersucht.

Präventive Maßnahmen zielen schlussendlich darauf ab, die Gallensteinbildung

überhaupt zu verhindern. Durch die weitere Untersuchung der die Bildung

beeinflussenden Faktoren trägt diese Arbeit zum besseren Verständnis der

zugrundeliegenden pathophysiologischen Mechanismen bei.

2 Material und Methoden6

2 Material und Methoden 7

2 Material und Methoden

2.1 Gallenblasengalle

Humane Gallenblasengalle wurde im Rahmen der konventionellen und

laparoskopischen Chirurgie von symptomatischen Gallensteinträgern gewonnen. Die

Sammlung erfolgte in Zusammenarbeit mit der Chirurgischen Klinik der RWTH

Aachen, der Chirurgischen Abteilung des St. Franziskus Krankenhauses Aachen und

der Chirurgischen Abteilung des Luisenhospitals Aachen.

Um die in der Gallenblasengalle vorkommenden Proteasen33 zu neutralisieren, wurde

ein Proteaseninhibitorencocktail zu den gewonnenen Gallenblasenproben hinzugegeben.

Die Endkonzentration der Proteaseninhibitoren betrug 1 mM PMSF, 1 mM

Iodacetamid, 1 mM Benzamidin, 2 mM EDTA und 5 µM Bacitracin.

Proben, die eine Verunreinigung des biliären Immunglobulins A mit mehr als einem

Prozent humoralem Immunglobulin A enthielten, sollten verworfen werden. Dies ergibt

für die maximal zulässige Hb-Konzentration in Gallenblasengalle folgenden Grenzwert:

HbIgAc

HbcIgAcHbc l

g

Blut

BlutGalle ][089,001,02,213015,0

01,0)(

)()(max)( =•

•=•

•=

Die gewählten Werte von

c(IgABlut) = 2,2 g/l34 (Maximalwert)

c(HbBlut) = 130 g/l35 (Minimalwert)

c(IgAGalle) = 150 mg/l (Minimalwert, nach eigenen Messungen)

minimieren die Wahrscheinlichkeit, eine Gallenblasengallenprobe mit einem

IgABlut/IgAGalle von größer einem Prozent fälschlicherweise nicht zu verwerfen.

Zum Hämoglobinnachweis wurde der Hemocare®-Test (Care Diagnostica, Voerde)

verwendet. Er entspricht dem modifizierten Guajak-Test nach Gregor36. Dabei wurde

die peroxidaseähnliche Wirkung des intakten Hämoglobins auf Guajak unter Zusatz von

alkoholischer Peroxid-Lösung genutzt. Dies führte zu einer Blaufärbung des

Testmediums.


Das Testblut (c(Hb) = 145 g/l) wurden auf die oben berechnete tolerierbare

Konzentration verdünnt. Hierzu wurden in zwei Ansätzen 60 µl des Blutes in 100 ml

isotoner Kochsalzlösung verdünnt. Mit dieser Testlösung (c(Hb) ≈ 0,089 g/l) wurde

dann im nächsten Schritt in verschiedenen Konzentrationen der Hemocare®-Test in

Dreifachbestimmung durchgeführt.

2.2 Immunglobulin A-Gewinnung

Humanes sekretorisches Immunglobulin A wurde aus Gallenblasengalle mittels

Affinitätschromatographie gewonnen. Als erstes wurden Mucin und Feststoffe durch

Zentrifugation aus der Gallenblasengalle entfernt. Anschließend erfolgte die Gewinnung

der Proteinfraktion mit Hilfe der Concanavalin A (Con A)-Sepharose Affinitäts-

chromatographie. Aus dieser Proteinfraktion wurde schließlich mittels IgA-

Affinitätschromatographie das humane Immunglobulin A isoliert.

2.2.1 Zentrifugation der Gallenblasengalle

Gallenblasengalleproben wurden mit 100.000 gn bei 4 °C für eine Stunde

ultrazentrifugiert (Ultrazentrifuge Centrikon T-1000, Kontron Instruments GmbH,

Eching). Sedimentierte Feststoffe und die aufschwimmende Lipidfraktion wurden

verworfen.

2.2.2 ConA-Sepharose-Affinitätschromatographie

Eine 2,5 x 20 cm Säule (Econo-Columns®, Bio Rad Laboratories, Richmond, USA)

wurde mit 50 ml Con A-Sepharose (Pharmacia Biosystems GmbH, Freiburg) gepackt.

Con A-Sepharose besteht aus Concanavalin A isoliert aus Canavalia enisformis

(Schwertbohne), das mittels der Cyanobromid-Methode an Sepharose 4B gekoppelt ist.

Concanavalin A bindet Moleküle, die α-D-Mannose, α-D-Glukose oder sterisch

Verwandte mit C3-, C4- oder C5- Hydroxylgruppen enthalten. Alle folgenden Schritte

wurden bei 4 °C durchgeführt.


Die Con A-Säule wurde vor dem ersten Lauf mit 500 ml Startpuffer (20 mM TRIS/

HCl, pH 7,40, 0,2 mM NaCl, 3 mM NaN3) bei einer Flussgeschwindigkeit von

v = 10 cm/h äquilibriert. Nach der Äquilibrierung wurde die zentrifugierte

Gallenblasengalle mit einem Volumen entsprechend dem Con A-Säulenvolumen

aufgetragen und über Nacht mit gleicher Flussgeschwindigkeit zehnmal rezykliert.

Die Säule wurde mit mindestens 500 ml Waschpuffer (20 mM TRIS/ HCl, pH 7,40 ,

0,2 mM NaCl, 3 mM NaN3 + 3 mM STDC37) unter häufigem Aufrühren gewaschen, bis

die Extinktion bei 280 nm auf einen konstanten Wert abgefallen war. Die gebundene

Proteinfraktion wurden über Nacht bei 4 °C mit 250 ml Eluationspuffer (20mM TRIS/

HCl, pH 7,40, 0,2 mM NaCl, 3 mM NaN3 + 0,25 M Methyl-α-D-mannopyranosid) bei

v = 5 cm/h eluiert. Die gewonnene Probe wurde bis zur weiteren Verwendung bei –

20 °C gelagert.

Regeneriert wurde die Säule zuerst mit 500 ml (zehn Säulenvolumina) 100 mM

TRIS/HCl, pH 8,5, 0,5 M NaCl, 1 mM STDC und dann mit der gleichen Menge

100 mM Natriumacetat, pH 4,5, 0,5 M NaCl mit v = 30 cm/h. Anschließend wurde mit

500 ml Äquilibrierungspuffer (20 mM TRIS/ HCl, 0,2 mM NaCl, pH 7,40, 3 mM

NaN3, 1 mM CaCl, 1 MnCl2) bei v = 10 cm/h reäquilibriert.

2.2.3 IgA-Immunaffinitätschromatographie

Verwendet wurde das Immunopure® Immobilization Kit von Pierce (Rockford, USA).

Das darin enthaltene zu 4 % querverknüpfte Agarosegel enthält Aldehydgruppen, die

mit den primären Amingruppen der Antikörperproteine Schiff’sche Basen bilden.

Dadurch ist die mit Antikörpern gekoppelte Säule über einen weiten pH-Bereich stabil

und wiederverwendbar. Alle Schritte der Antikörperkopplung wurden bei

Raumtemperatur, die der späteren Immunglobulin A-Extraktion bei 4 °C vorgenommen.

Eine 2 ml Aminolink Säule wurde mit spezifisch gegen Immunglobulin A-gerichteten

Antikörpern (a-IgA-Ak, α-Ketten spezifisch, Sigma, St. Louis, USA) gekoppelt.

Hierzu wurde die bei 4 °C in Aminolink Storage Solution (Lagerungslösung, 0,05 %

NaN3, entgast) gelagerte Säule mit dreimal 2 ml Aminolink Coupling Buffer (0,1 M

H2PO4, pH 7,0, 0,05 % NaN3, über 0,2 µm filtriert) bei Raumtemperatur äquilibriert.


Die a-IgA-Ak (Sigma) wurden gegen den Aminolink Coupling Buffer diafiltriert und

die Aminolink Säule mit 2 ml dieser Antikörperlösung (24 mg Protein, davon 5,4 mg

spez. Antikörper) und 0,2 ml der Aminolink Reductant Solution (32 mg NaCNBH3 in

500 µl H2Obidest.) für 2 Stunden langsam auf einem Schüttler und dann für weitere 4

Stunden inkubiert. Danach wurde die Säule zuerst mit 4 ml Coupling Buffer gewaschen

und mit 4 ml Aminolink Quenching Buffer (1 M TRIS/HCl, pH 7,4, über 0,2 µm

filtriert) äquilibriert. Die verbleibenden unbesetzten Bindungsstellen der Säule wurden

mit 2 ml Aminolink Quenching Buffer und 0,2 ml Aminolink Reductant Solution

blockiert.

Zur Entfernung ungebundener Anteile wurde die Säule mit viermal 5 ml Aminolink

Wash Solution (1 M NaClaq, über 0,2 µm filtriert) und dreimal 5 ml Lagerungslösung

gewaschen. Danach wurde eine Polyethylenfritte aufgetragen und diese mit 2 ml

Lagerungslösung überschichtet. Das luftblasenfreie Gel wurde dann bei 4 °C bis zur

weiteren Verwendung gelagert.

Es wurden gebundene Con A-Fraktionen zur Gewinnung von humanem

Immunglobulin A mittels Immunaffinitätschromatographie verwendet.

Die Proben mit einem Immunglobulin A-Gehalt von 2 – 3 mg wurden mit dreimal

10 ml Startpuffer (20 mM TRIS/ HCl, pH 7,40, 0,2 mM NaCl, 3 mM NaN3) diafiltriert

(Amiconzelle mit Filter YM10, Molekulargewichtsgrenze 10 kD, Millipore, Bedford,

USA) und auf 1 ml eingeengt. Sie wurden dann auf die mit 30 ml Startpuffer

äquilibrierte Immunaffinitätschromatographiesäule aufgetragen und über Nacht

zehnmal rezykliert. Die Säule wurde mit 15 ml Startpuffer (siehe 2.2.2) gewaschen,

wobei die ersten 10 ml als ungebundene Fraktion aufgefangen und bei -70 °C

aufbewahrt wurden.

Danach wurde die Säule erneut mit fünfmal 5 ml Startpuffer gewaschen und dann

eluiert. Hierzu wurden in eine Amiconzelle 0,5 ml Neutralisationspuffer (1 M TRIS,

pH 9,5) vorgelegt und die gebundene Proteinfraktion mit 10 ml Elutionspuffer (0,1 M

Glycin, pH 2,5) direkt in die Amiconzelle eluiert. Die Säule wurde mit fünfmal 5 ml

Startpuffer und mit zweimal 5 ml Lagerungslösung gewaschen, mit 2 Lagerungslösung

versetzt und bei 4 °C bis zur Wiederverwendung gelagert.


Zur qualitativen Beurteilung der Fraktionen des Proteineluats der Affinitätssäule

wurden 3 ml (Gesamtproteingehalt 1,96 mg, siehe 2.6.1) einer gebundenen Con A-

Fraktion eines humanen Gallenblasengallenpools gegen Probenpuffer

(25 mM NH4HCO3) diafiltriert. Die resultierende Lösung (1 ml) wurde auf die mit

30 ml Probenpuffer äquilibrierte Säule aufgetragen. Daraufhin wurde die Säule nach

obigem Schema inkubiert und gewaschen. Die Elution erfolgte in 2 ml-Schritten mit

Elutionspuffer, wobei die einzelnen Fraktionen in Küvetten aufgefangen und direkt mit

50 µl TRIS-HCl (pH 9,5) neutralisiert wurden. Anschließend wurde die Säule mit 5 ml

Elutionspuffer versetzt, nach obigem Schema gewaschen und gelagert.

Die Extinktionen der einzelnen Fraktionen wurden photometrisch (280nm, Ultrameter,

LKB, Bromma, Schweden) gegen Probenpuffer gemessen.

Zur Bestimmung der Bindungskapazität der Immunaffinitätschromatographiesäule

wurden verschiedene Läufe mit vorher festgesetzten, unterschiedlichem Immunglobulin

A-Gehalt der Proben durchgeführt. Hierbei wurde kolostrales Immunglobulin A

verwendet. Danach wurde in der ungebundenen Fraktion und in der gebundenen

Fraktion jeweils die Konzentration des Immunglobulins A mittels ELISA (siehe 2.3.2)

bestimmt.

2.3 Methoden zur Messung der Konzentration von Proteinen

2.3.1 Radiale Immunodiffusion (RID)

Um die IgA Konzentration in Gallenblasengalle zu beurteilen, wurden erworbene, mit

Anti-Immunglobulin A-Antikörpern beschichtete Gelplatten (Human-IgA-NanoridTM-

Plate, The Binding Site, Birmingham, GB) benutzt. Die vorhandenen Wells wurden zur

Doppelbestimmung wie folgt bestückt:

• Calibrator (Konzentration: 5,8 mg IgA /l)

• unverdünnt

• 50% in PBS (Na2HPO4, 0,24 g/l KH2PO4, pH 7,4, 8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl,

1,44 g/l + 0,001 % Thiomersal)


• 10% in PBS

• Kontrolle (Sigma)

• Probe (Galle)

• 2%

• 1%

• 0,5%

Daraufhin wurden die Platten 96 Stunden lang waagrecht bei Zimmertemperatur

gelagert und der Durchmesser der Präzipitationskreise ausgemessen.

2.3.2 ELISA

Der „enzyme-linked immunosorbent assay“ (ELISA) wurde erstmals von Engvall et al38

als Methode zur rationalen und einfach zu handhabenden Proteinkonzentrations-

bestimmung39 beschrieben. Hierbei wird ein spezifischer Antikörper an einer Mikro-

titerplatte immobilisiert. Die zu messende Substanz bindet an diesen und kann mittels

eines zweiten spezifischen Antikörpers nachgewiesen werden. Diese Technik wird

wegen des Einsatzes zweier Antikörper als „double-site immunoassay“ bezeichnet.

HRP-Antikörper

biliäres IgA

a-IgA

Abb. 1: Anordnung der verschiedenen Antikörper im ELISA

In dieser Arbeit wurden Mikrotiterplatten mit Antikörpern gegen humanes

Immunglobulin A (a-IgA) bestückt (Abb.1). Die Menge des nach Zugabe der

Testproben gebundenen Immunglobulins A wurde nach Bindung eines dritten


Antikörpers, der mit HRP (HRP-Antikörper, Peroxidase aus Meerrettich) konjugiert

war, durch Bestimmung der enzymatischen Aktivität gemessen.

Es wurden Flachboden-Mikrotiterplatten MaxiSorp® (Nunc Immuno Plate, Nunc,

Rochester, USA) über Nacht mit 100 µl a-IgA (α-Ketten spezifisch, Kaninchen-IgG,

Sigma) 1:4000 (0,5 ng/ml) in PBS-Puffer (Na2HPO4, 0,24 g/l KH2PO4, pH 7,4, 8 g/l

NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,44 g/l + 0,001 % Thiomersal) bei 4oC beschichtet. Am nächsten

Tag wurden die Platten dreimal mit PBS-Tween-Puffer (PBS-Puffer mit

0,05 % Tween-20, Serva, Merck, Freiburg) gewaschen. Die freien Bindungsstellen der

Mikrotiterplatten wurden mit 200 µl 1 % bovinem Serumalbumin (BSA, reinst,

Behring, Marburg) in PBS-Tween-Puffer für eine Stunde bei 37 °C blockiert.

Nach erneutem dreimaligen Waschen der Platten mit PBS-Tween-Puffer wurden die

Proben aufgetragen. Hierfür wurden 100 µl 0,1 % BSA in PBS-Tween-Puffer vorgelegt

und die auf etwa 500 µg/l in 0,1 % BSA in PBS-Tween-Puffer vorverdünnten Proben

(Volumen 100 µl) in die erste Zeile der Mikrotiterplatten gefüllt. Als Standard wurde

humanes Immunglobulin A von Sigma mit einer nephelometrisch bestimmten

Konzentration von 2,1 g/l benutzt. Hierauf erfolgte eine Verdünnung mit einer Zwölf-

Kanal-Pipette (Independent 36012, Integra Biosciences, Fernwald). Daraus ergaben sich

für den Standard (IgA, Sigma) Konzentrationen von 210,0/ 105,0/ 52,5/ 26,3/ 13,1/ 6,6/

3,3 µg/l. Die letzte Zeile der Mikrotiterplatten wurde zur Bestimmung des Leerwertes

benutzt. Dieser wurde durch den Austausch der Probe gegen PBS-Tween-Puffer

bestimmt. Alle Proben wurden in Doppelbestimmung gemessen und ebenso wie der

Standard behandelt. Daraufhin wurden die Platten für zwei Stunden im

Trockeninkubator bei 37 °C mit 80 UpM inkubiert und dann erneut dreimal mit PBS-

Tween-Puffer gewaschen um nicht gebundenes IgA zu entfernen.

Zum Nachweis der Immunglobulin-A-Bindung wurden jetzt 100 µl Kaninchen a-IgA-

Antikörper (HRP konjugiert, α-Ketten spezifisch, Dako, Glostrup, DK) in 0,1 %

BSA/PBS-Tween-Puffer hinzugefügt. Diese wurden nach der zweistufigen

Glutaraldehyd-Methode40 hergestellt. Nach dreimaligen Waschen mit PBS-Tween-

Puffer und zweimaligen Waschen mit PBS-Puffer wurden 100 µl der Färbelösung

(0,1 g/l 3,3,5,5-Tetramethylbenzidin, 0,0036 % H2O2, 0,1 M Natrium-Acetat, pH 5,5) je


Probe hinzugefügt. Dabei wird Tetramethylbenzidin (C16H20N2) als Protonendonator

(D-H2), unter Anwesenheit der Peroxidase und Wasserstoffperoxid als Reaktionspartner

dehydriert. Die nach dem Schema:

DO2HH-DOH 2222 +→+

von farblos nach gelb ablaufende Reaktion wurde unter visueller Überprüfung nach

5 Minuten mit 2 molarer Schwefelsäure gestoppt. Die Lösung hatte durch den dadurch

erfolgten Farbumschlag von gelb nach blau ein Extinktionsmaximum bei 450 nm41,42.

Anschließend erfolgte die Ablesung mit einem Mikrotiterplattenlesegerät (TR 400, SLT

Labinstruments) bei 450 nm Messwellenlänge und 550 nm Referenzwellenlänge. Die

Errechnung der Standardkurve und die Ermittlung der Probenkonzentrationen erfolgten

mittels der gewichteten linearen Regression nach logit-log-Transformation (auf einem

Personalcomputer mit dem Programm EasyFit® von SLT Labinstruments) nach der

folgenden Formel43:

BC

ionKonzentrat )(1DA

DExtinktion+

−+=

Die Parameter A und D geben die Extinktionswerte der Asymptote an, gegen welche

die Kurve rechts und links läuft. Sie wurden mittels Vier-Parameter-Interpolation

errechnet. Die Parameter B und C wurden nach einer Achsentransformation durch

lineare Regression ermittelt. Dabei wurden zur Berechnung der Probenkonzentrationen

nur die Probenwerte berücksichtigt, die auf dem linearen Anteil der optisch

kontrollierten Standardkurve43 lagen.

2.3.2.1 Spezifität

Die Spezifität des Tests gegenüber dem häufigsten anderen Immunglobulin in der

Gallenblasengalle, Immunglobulin G, wurde durch Messung einer humanen

Immunglobulin G-Probe (Sigma) mit einer mittleren Konzentration der obigen

Verdünnungsreihe (25 µg/l) auf fünf verschiedenen Assayplatten bestimmt.


2.3.2.2 Reproduzierbarkeit

Als Maß für die Reproduzierbarkeit des durchgeführten Assays wurden der intraassay-

und der interassay-Variationskoeffizient bestimmt. Der intraassay-Variationskoeffizient

wurde aus 12 Einzelwerten von drei Verdünnungsreihen auf einer Mikrotiterplatten, der

interassay-Variationskoeffizient aus den 20 Einzelwerten von fünf Verdünnungsreihen

zweier an verschiedenen Tagen verarbeiteten Mikrotiterplatten bestimmt.

2.3.2.3 ELISA für Immunglobulin G

Zum relativen Vergleich mit dem Kristall-ELISA, der auch mit Immunglobulin G

durchgeführt wurde, wurde der oben angeführte ELISA auch mit a-IgG (Sigma) als

primärem Antikörper beschichtet und mit a-IgG (konjugiert mit HRP, Dako) als

tertiärem Antikörper durchgeführt. Als sekundärer (zu bestimmender) Antikörper wurde

hier immer eingewogenes Immunglobulin G (Sigma) verwendet.

2.4 Vergleich von kolostralem und biliärem Immunglobulin A

Um Unterschiede in den Eigenschaften des Immunglobulin A aus Kolostrum und

Gallenblasengalle darzustellen, wurden sie in verschiedenen Assays eingesetzt. Mit der

Saccharose-Gradientenzentrifugation wurden Unterschiede in der Immunglobulin A-

Zusammensetzung dargestellt. Der Einsatz der Proben in einem mit Cholesterin-

kristallen beschichteten ELISA zeigte quantitativ das Bindungsverhalten gegenüber

diesen Kristallen. Die Durchführung eines Cholesterinkristallisationstests zeigte den

unterschiedlichen Einfluss auf die Geschwindigkeit der Cholesterinkristallisation.

2.4.1 Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation

Zur Bestimmung des relativen Verhältnisses von mono- und dimerem Immunglobulin A

in Gallenblasengalle wurde mittels der Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation die

Verteilung der Konzentration von kolostralem und biliärem Immunglobulin A in einem


Dichtegradienten ermittelt 44. Als Proben wurden ein Gallenblasengallenpool und

Immunglobulin A-Standard eingesetzt.

Es wurden 40 ml 10 % (m/v) Saccharose Lösung in PBS (10,1 mM Na2HPO4,

1,76 mM KH2PO4, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl + 0,001 % Thiomersal) in

einem Ultrazentrifugationsröhrchen bei –20 °C eingefroren und langsam aufgetaut. Die

Proben mit einem Immunglobulin A-Gehalt von 222,5 µg wurden vorsichtig

aufgetragen. Die darauffolgende Zentrifugation erfolgte bei 30.000 UpM für 15 Stunden

(Ultrazentrifuge Centrikon T1000 mit Vertikalrotor VC 53) bei 4 °C. Aus den Röhrchen

wurden mit einem FPLC-Fraktionssammler (Pharmacia, Uppsala, Schweden) jeweils 43

Fraktionen mit einem Volumen von je 940 µl mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min

gewonnen44. Die Immunglobulin A Konzentration in den Fraktionen wurde mittels

ELISA (siehe 2.3.2) bestimmt.

2.4.2 Kristall-ELISA

Der Aufbau des Kristall-ELISA entsprach grundsätzlich dem oben beschriebenen

allgemeinen ELISA-Aufbau (siehe 2.3.2), nur wurden anstelle des ersten Antikörpers

Cholesterinkristalle an der Assayplatte immobilisiert (Abb.2). Diese Technik wird auch

als „single-side immunoassay“ bezeichnet.

HRP-Antikörper

biliäres IgA

ChMHK

Abb. 2: Aufbau des Kristall-ELISA

Zur Bestimmung der spezifischen Cholesterinbindungsfähigkeit des Immunglobulins A

wurden die verwendeten Mikrotiterplatten mit feinen Cholesterinmonohydratkristallen


(ChMHK) beschichtet. Diese wurden dann, um die unspezifische Bindung des Immun-

globulin A zu minimieren, blockiert. Die Kristalle wurden durch die Auskristallisation

einer cholesterinhaltigen Lösung hergestellt. Um Monohydratkristalle zu erhalten,

wurde als Lösungsmittel wässriges Ethanol mit einem Wasseranteil von 5 % gewählt45.

Ebenso wie bei dem normalen ELISA wurde die Menge des nach Zugabe der

Testproben gebundenen Immunglobulins A mittels eines dritten Antikörpers, der mit

HRP (HRP-Antikörper) konjugiert war, durch enzymatische Färbung gemessen.

Um Monohydratkristalle zu erhalten, wurden Mikrotiterplatten (Dynatech Immulon 1B,

Dynex Technologies, Chantilly, USA) über Nacht mit 50 µl Cholesterin (Kodak,

Rochester, USA) in 95% Ethanol (v/v) in unterschiedlicher Konzentration bei

Raumtemperatur und 100 UpM im Trockeninkubator unter Verdunstung des

Lösungsmittels beschichtet. Am nächsten Tag wurden die Platten dreimal mit PBS

(siehe 2.4.1) gewaschen. Die freien Bindungsstellen der Mikrotiterplatten wurden mit

200 µl 1 % bovinem Serumalbumin (reinst, BSA, Behring) in PBS-Puffer für eine

Stunde im Trockeninkubator bei 37oC mit 80 UpM geblockt. Nach erneutem

dreimaligen Waschen der Platten mit PBS-Puffer wurden die Proben aufgetragen.

Hierfür wurden 100 µl 0,1% BSA in PBS-Puffer vorgelegt und die auf 400 mg/l in

0,1 % BSA in PBS-Puffer vorverdünnten Proben in die erste Zeile der Mikrotiterplatten

gefüllt. Als Standard wurde humanes Immunglobulin A von Sigma mit einer

nephelometrisch bestimmten Konzentration von 2,1 g/l verwendet. Hierauf erfolgte eine

Verdünnung mit einer Zwölf-Kanal-Pipette. Daraus ergaben sich für den Standard (IgA,

Sigma) Konzentrationen von 210,0/ 105,0/ 52,5/ 26,3/ 13,1/ 6,6/ 3,3 [mg/l]. Die letzte

Zeile der Mikrotiterplatten wurde zur Bestimmung des Leerwertes benutzt. Hierfür

wurde die Probe gegen BSA/PBS-Puffer ausgetauscht. Alle Proben wurden in

Doppelbestimmung gemessen und ebenso wie der Standard behandelt. Daraufhin

wurden die Platten für zwei Stunden im Trockeninkubator bei 37oC mit 80 UpM

inkubiert und dreimal mit PBS-Puffer gewaschen. Zum Nachweis der Immunglobulin-

A-Bindung wurden jetzt 100 µl Kaninchen a-IgA-Antikörper, HRP konjugiert (Dako) in

0,1 % BSA/PBS-Puffer je Probe hinzugefügt. Nach dreimaligen Waschen mit PBS-

Puffer und zweimaligen Waschen mit PBS-Puffer wurden 100 µl der Färbelösung

gemäß Standard-ELISA hinzugefügt und die Färbung nach visueller Überprüfung


gestoppt und abgelesen. Die Farbreaktion, die Ablesung der Platten und die Berechnung

der Probenkonzentrationen erfolgten wie bei dem Standard-ELISA (2.3.2).

2.4.2.1 Reproduzierbarkeit

Als Maß für die Reproduzierbarkeit und damit Güte des durchgeführten Assays wurde

der intraday-, der interday-Variationskoeffizient und das Quantil25/75 bestimmt. Der

intraday-Variationskoeffizient und das Quantil25/75 wurden aus 48 Einzelwerten zweier

Verdünnungsreihen, die parallel bestückt wurden, bestimmt. Dabei wurde die

Konzentrationen der Cholesterin/Ethanol-Lösung variiert. Der interday-

Variationskoeffizient wurde aus den 36 Einzelwerten zweier an verschiedenen Tagen

verarbeiteter Mikrotiterplatten bestimmt.

2.4.2.2 Vergleich der Kristallbindung verschiedener Arten von Immunglobulin A

Mittels Con A- und Immun-Affinitätssäule aus Gallenblasengalle verschiedener

symptomatischer Gallensteinträger gewonnenes sekretorisches Immunglobulin A

(vorverdünnt auf 410 mg/l) wurde vergleichend mit dem gekauften Standard

(kolostrales IgA, Sigma) im Kristall-ELISA und normalen ELISA gemessen.

2.4.2.3 Vergleich der Kristallbindung von Immunglobulin A und Immunglobulin G

Ebenso wurde die Kristallbindung von Immunglobulin G und Immunglobulin A im

Kristall-ELISA verglichen. Hierfür wurde Immunglobulin G (Sigma) auf 2 mg/l (10 mg

in 5 ml PBS) vorverdünnt und gegen den Immunglobulin A-Standard gemessen.

2.4.3 Cholesterinkristallisationstest

Im Cholesterinkristallisationstest kann der Einfluss, den Substanzen auf die

Kristallisation in einer mit Cholesterin übersättigten Modellgalle haben, bestimmt

werden. Diese Modellgalle ist in ihrer Zusammensetzung der Gallenblasengalle

nachempfunden. Sie besteht aus einer wässrigen Lösung der wichtigsten Bestandteile

der Gallenblasengalle: Gallensäure, Cholesterin und Phospholipid. Die Herstellung

erfolgt aus Stammlösungen dieser Substanzen.

Einer übersättigten Cholesterin/Methanol-Lösung wurde Chloroform bis zur

vollständigen Lösung des Cholesterins zugesetzt. Danach wurde die Stammlösung zur


Entfernung von festen Bestandteilen zentrifugiert (15 min, 22 °C, 1000 gn, Minifuge

GL, Heraeus, Hanau) und mit N2 überschichtet bei -70°C gelagert. Die

Cholesterinkonzentration der Stammlösung wurde enzymatisch mit dem Monotest®

Cholesterin HP (Boehringer, Mannheim) nach Allain et al.46 bestimmt. Dieser beruht

auf dem Nachweis des bei der Oxidation des Cholesterins durch die Cholesterinoxidase

entstehenden Wasserstoffperoxids mittels Peroxidase unter Anwesenheit einer

geeigneten Färbesubstanz. Die Extinktion der Lösung mit dem unter Anwesenheit von

Phenol und 4-Aminophenazon gebildeten roten Chinonimin47 wurde bei 500 nm

photometrisch bestimmt und die Konzentration berechnet.

Taurocholsäure (Sigma) wurde in Methanol gelöst und nach der Zentrifugation (15 min,

15 °C, 1000 gn) mit N2 überschichtet bei –70 °C gelagert. Die Konzentration der

Taurocholsäure wurde mit dem Sterognost-3α® Pho-Kit (Nycomed AS, Oslo,

Norwegen) nach Fausa und Skalhegg48 bestimmt. Dabei katalysiert die 3α-

Hydroxysteroiddehydrogenase die Umsetzung von 3α-Hydroxygallensäuren unter

NAD-Bildung. Die Menge des gebildeten NAD kann dann mittels des optischen Tests

nach Warburg49 nachgewiesen und die Konzentration der Taurocholsäure berechnet

werden.

Gelöstes Lecithin in Chloroform-Methanol 2:1 (v/v) (Lipid Products, South Nutfield,

GB) wurde als Phospholipid-Stammlösung verwendet. Die Lecithinkonzentration wurde

nach der von Gurantz et al. 50 modifizierten Methode nach Takayama 51 gemessen.

Verwendet wurde hierfür der Phospholipid-Test von Texas International Laboratories,

Houston, USA). Dabei wird durch die Phospholipase D aus Phospholipiden Cholin

freigesetzt, welches dann mit der Cholinoxidase oxidiert wird. Die Konzentration des

entstehenden Wasserstoffperoxid wird dann wie oben angegeben gemessen und die

Ausgangskonzentration des Lecithins berechnet.

Die für die Modellgalle benutzten Mengen der Stammlösungen waren abhängig von der

vorgegebenen

• Gesamtlipidkonzentration (hier 10 g/dl),

• dem molaren Gallesäuren-/ Phospholipid-Verhältnis und dem

• Cholesterinsättigungsindex (hier 1,3).


Die maximal lösliche Cholesterinkonzentration in Molprozent wurde von Carey für

gegebene Werte für die Gesamtlipidkonzentration und dem molaren

Gallesäuren/Phospholipid-Verhältnis tabellarisch zusammengestellt10.

Die endgültige Cholesterinkonzentration errechnet sich aus dem Produkt der maximal

löslichen Cholesterinkonzentration und dem vorgegebenen Cholesterinsättigungsindex.

Die Herstellung der Modellgalle erfolgte nach der von Busch et al. beschriebenen

Methode52.

Dabei wurden die errechneten Mengen der Lecithin- und Cholesterin-Stammlösung in

einem Reagenzglas vor der Zugabe der Phospholipid-Stammlösung bei 50 °C eingeengt.

Das fehlende Volumen wurde durch Methanol ergänzt und die Lösung gut

homogenisiert. Die organischen Lösungsmittel wurden dann verdampft und die Proben

zur vollständigen Entfernung des Lösungsmittels lyophilisiert. Die Proben wurden dann

unter N2 bei –70 °C bis zur Verwendung gelagert.

Zum Schutz vor Oxidation der Substanzen wurden alle obigen Schritte bei maximal

50 °C und unter N2 durchgeführt53.

Zur Herstellung der endgültigen Modellgalle wurden die Proben mit TBS-Puffer

(25 mM TRIS/ HCl, pH 7,45, 150 mM NaCl, 3 mM NaN3) resuspendiert. Dabei wurde

das Volumen der Lipide (0,75 µl/ml bei einer Gesamtlipidkonzentration von 1 g/l) von

der zu verwendenden Pufferlösung abgezogen. Die Suspension wurde bei 50 °C gut

resolublisiert und bei 37 °C durch einen vorgewärmten Filter (0,22 µm, Millipore

Corp.) filtriert. Die zu testende Proteinprobe wurde in Reagenzgläser, gelöst in 40 µl

TBS-Puffer, gefüllt. Als Leerwert wurde nur 40 µl TBS-Puffer verwendet. Alle Proben

wurden auf 37 °C erwärmt.

Alle folgenden Schritte wurden unter N2-Überschichtung und bei 37 °C durchgeführt.

Zu den Proben wurde jeweils 460 µl der Modellgalle gegeben und durchmengt. Dieser

Zeitpunkt markierte den Beginn des Cholesterinkristallisationstests.

Daraufhin wurde über einen Zeitraum von einer Woche zehnmal 20 µl aus den

einzelnen Proben entnommen und unter Zugabe von 80 µl 10 mM Taurodeoxycholsäure

in TBS-Puffer photometrisch vermessen. Die Zugabe des Taurodeoxycholsäure-Puffer

eliminierte die vesikelbedingte Trübung der Modellgalle durch Auflösung der Vesikel.


Auf diese Weise konnte die kristallbedingte Trübung spezifisch erfasst werden52. Die

Extinktion wurde bei 840 nm mit einem Winkel von 13-24° gegen 10 µM

Taurodeoxycholsäure in TBS-Puffer nephelometrisch gemessen (BN 100

Nephelometer, Behring, Marburg) und graphisch sowie statistisch ausgewertet.

Als Proben wurde kolostrales Immunglobulin A (Sigma) und gewonnenes biliäres

Immunglobulin A (2.2) in fünf verschiedenen Konzentrationen jeweils in Doppel-

bestimmung getestet. Der Leerwert wurde in Dreifachbestimmung gemessen. Die

statistische Auswertung erfolgte mittels Varianzanalyse.

Da der benutzte Test thermodynamisch instabil war und es zu einer überschießenden

heterogenen Auskristallisation bei der Zugabe der Proteinproben kommen konnte17,

wurden Proben, die nach 26 h eine höhere Extinktion als 0,03 (normal bis 0,015) hatten,

bei der Auswertung nicht berücksichtigt.

2.5 Optische Darstellung der IgA-Kristallbindung

Um die Bindung des Immunglobulin A an die Cholesterinkristalle optisch darzustellen,

wurden in vitro hergestellte Cholesterinkristalle und Fragmente humaner Gallensteine

verwendet. Die Cholesterinkristalle wurden mit IgA inkubiert und es wurde versucht die

Immunglobulin A Bindung mittels verschiedener a-IgA Antikörper und Techniken

nachzuweisen.

2.5.1 Herstellung der Cholsterinkristalle

Cholesterinmonohydratkristalle wurden durch Erhitzen von 12,5 g/l Cholesterin in 95 %

Ethanol auf 60 °C und anschließendes Abkühlen auf Raumtemperatur hergestellt. Um

möglichst kleine, nicht zerbrochene Kristalle zu erhalten, wurde die Lösung während

des Abkühlens mit 30 UpM gerührt. Im nächsten Schritt wurden die Kristalle durch


Abzentrifugieren mit 2400gn über fünf Minuten und anschließendes Dekantieren

gewonnen.

2.5.2 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

Zur Darstellung von einzelnen Antikörperbindungen wurde versucht, die Bindung

goldkonjugierter a-IgA-Antikörper an Immunglobulin A auf vorbehandelten

Cholesterinkristallen mittels Transmissionselektronenmikroskop darzustellen.

Hierfür wurden 10 µl der in destilliertem Wasser resuspensierten Cholesterinkristalle

(siehe 2.5.1) auf die Oberfläche der TEM-Grids (SPI, West Chester, USA) gegeben und

die überstehende Lösung nach 30 Minuten mit Filterpapier entfernt. Die Grids wurden

im Exsikkator mit Phosphorpentoxid gelagert. Vor der Transmissionselektronen-

mikroskopie (TEM400T, Philips, NL-Eindhoven) wurden sie mittels Durchlicht-

mikroskopie auf Kristalle untersucht.

2.5.3 Fluoreszenzmikroskopie

Die Resuspension der gewonnen Kristalle (siehe 2.5.1) erfolgte mit 1 % BSA/PBS und

anschließender Inkubation bei 37 °C für eine Stunde im Trockeninkubator bei

100 UpM, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Nach dreifachem

Zentrifugieren, Dekantieren und Resolubilisieren mit 0,1 % BSA/PBS wurde 1 ml

kolostrales IgA (Sigma) in einer Konzentration von 200 µg/l in 0,1 % BSA/PBS

hinzugefügt. Die Suspension wurde für zwei Stunden bei 37 °C und 100 UpM inkubiert.

Nach der darauffolgenden viermaligen Reinigung wurde 1 ml der

Fluoreszenzantikörperlösung, bestehend aus 100 µl anti-human-IgA FITC konjugiert

(Sigma) in 0,1 % BSA/PBS, hinzugegeben und für eine Stunde bei 37 °C und 100 UpM

inkubiert. Daraufhin wurde die Suspension erneut gereinigt und in 1 ml 0,1 % BSA/PBS

resolubilisiert.

25 µl dieser Suspension wurden auf ein Objektträger gegeben und in der

Durchlichtmikroskopie (Leica DM RB) und in der Fluoreszenzauflichtmikroskopie

(Leica DM RB mit I3 Filter) fotografiert (Minolta 9000).

Die Bilder wurden zur weiteren Bearbeitung mittels Dia- (Polaroid, Cambridge, USA)

und Flachbettscanner (Paragon 12000 SP, Mustek, Taiwan) eingelesen und an einem


Personal Computer mit Corel PhotopaintTM (Version 7.0, Corel Corporation, Dublin,

Irland) bearbeitet und optisch ausgewertet.

2.6 Ergänzende Methoden

2.6.1 Proteinbestimmung

Die Proteinbestimmung wurde mit dem Protein Assay DC (Bio-Rad Laboratories,

Richmond, USA) nach Bradford54 durchgeführt. Nach dieser Methode wird die

Änderung der Extinktion von Coomassie Brilliant Blue nach der Bindung an Protein bei

595 nm gemessen. Dabei steigt die gemessene Extinktion über eine großen Bereich

linear zur gemessenen Proteinkonzentration55. Die Konzentrationen wurden gegen

Rinderserumalbumin (Sigma) als Standard errechnet.

2.6.2 Qualitatives Gel

Zur Auftrennung der gewonnenen Proteinfraktionen wurde eine Elektrophorese im

diskontinuierlichen TRIS-Glycin-HCl-Puffersystem nach Lämmli56 im homogenen Gel

in Vertikaltechnik durchgeführt.

Die Laufstrecke des Trenngels betrug 6 cm, die des Sammelgels 1 cm, die Dicke des

Gesamtgels betrug 1 mm. Die Totalacrylamidkonzentration betrug im Trenngel 15 %

und im Sammelgel 5 % (m/v), jeweils mit einem Vernetzungsgrad von 2,67 %. Beide

Gele enthielten 0,375 M TRIS/HCl-Puffer (pH 8,80), 0,1 % (m/v) SDS und 2 mM

EDTA. Als Elektrophoresepuffer wurde 25 mM TRIS, 192 mM Glycin, 0,1 % (m/v)

SDS, 3 mM NaN3, pH 8,40 verwendet.

Das Trenngel polymerisierte, überschichtet mit 0,5 % (m/v) SDS, bei Raumtemperatur

über Nacht aus. Danach wurde das Sammelgel aufgetragen, das nach dem Einsetzen des

Kammes für die Probentaschen innerhalb von 30 Minuten auspolymerisierte.

Die Proben mit einer Proteinfraktion von maximal 5 µg wurden in 20 µl SDS-

Probenpuffer (50 mM TRIS/HCl, 2 % (m/v) SDS, 10 % (v/v) Glycin, 10 % (v/v)

2-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA, 3mM NaN3, 0,004 % (m/v) Bromphenolblau,

pH 6,80) verdünnt und für 5 min auf 95 °C erhitzt. Dabei diente das Mercaptoethanol

als Reduktionsmittel und das Bromphenolblau als Marker für die Lauffront während der

Elektrophorese.


Die Proben wurden in die Geltaschen pipettiert und die Elektrophorese durchgeführt.

Hierfür wurden Strom und Spannung jeweils begrenzt, und zwar während der ersten

10 min (Sammelgel) auf Imax = 10 mA und Umax = 80 V und dann auf Imax = 25 mA und

Umax = 200 V für die verbleibende Zeit.

Die Proteine wurden 30 min mit 10 % (v/v) Essigsäure, 40 % (v/v) Ethanol fixiert und

dann nach der Methode nach Heukeshoven57,58 mit Silber gefärbt. Hierzu wurde das

Gel für zwei Stunden mit 30 % (v/v) Ethanol, 0,5 M Natriumacetat, 8 mM

Natriumthiosulfat, 0,13 % (v/v) Glutaraldehyd für die nachfolgende Silberanlagerung

vorbereitet.

Für die Molekulargewichtsbestimmung wurde das Gel mit sechs Standardproteinen

(LMW-Standard) geeicht (Tab.1).

Standardprotein Herkunft Molekulargewicht [kD]

Phosphorylase bAlbumin

OvalbuminCarboanhydraseTrypsininhibitora-Lactalbumin

KaninchenmuskelRinderserum

HühnereiweißRindererythozyten

SojabohneKuhmilch

94,067,043,030,020,114,4

Tab. 1: LMW-Standard für die Eichung der qualitativen Gele

3 Ergebnisse 25

3 Ergebnisse

3.1 Gallenblasengallen

3.1.1 Test der Gallenblasengallen auf Verunreinigung mit Blut

Für die Untersuchung der Eigenschaften von biliärem Immunglobulin A war dessen

Reinheit wichtig. Eine Verunreinigung des biliären Immunglobulin A mit humoralem

Immunglobulin A wurde bis zu 1 % toleriert, da zum einen eine geringere

Verunreinigung der Gallenblasengalle mit Blut bei der Punktion der Gallenblase meist

nicht zu vermeiden war und sie zum anderen auch keinen nennenswerten Einfluss auf

die Interpretation der Ergebnisse hatte. Dies entsprach bei dem angenommenen

Normalwert von 130 g Hb/l Blut einer Verunreinigung der Gallenblasengalle mit

maximal 0,090 g Hb/l. Mit einer Testlösung dieser Hämoglobin-Konzentration wurde

der verwendete Peroxidasetest auf seine Empfindlichkeit getestet:

Verdünnungsfaktor c(Hb) [mg/l]Reaktion

(Probe mit 0,9 %NaCl-Lösung)

Konzentriert 89,0 ++

0,5 44,5 ++

0,2 17,8 ++

0,1 8,9 +

0,05 4,5 (+)

0,025 2,2 -

Tab. 2: Peroxidasetest mit verdünntem Blut (++ deutlich positiv/ + positiv/ (+) schwach positiv/ - negativ)

Der Test fiel bis zu einer Verdünnung der Testlösung auf 10 % positiv aus (Tab.2).

Daher haben wir die von uns benutzten Gallenblasengallenproben in drei Verdünnungs-

stufen (Gallenblasengalle konzentriert; 20 %; 10 %) auf ihre Blutkontamination

getestet, um lediglich Proben mit Verunreinigungen des biliären Immunglobulins A

durch weniger als 1 % humorales Immunglobulin A einzuschließen.

3 Ergebnisse26

Die von uns getesteten 50 Gallenblasengallen (Proben) symptomatischer

Gallensteinträger wurden direkt vor der Durchführung des Tests entsprechend verdünnt.

Die 29 bei der stärksten Verdünnung (10 %) negativ getesteten Proben wurden im

Weiteren zur Gewinnung von Immunglobulin A genutzt.

Das Probenvolumen lag im Mittel bei 17,9 ±9,5 ml. Von den 29 Proben wurden jeweils

2 ml zur Bestimmung der Konzentration von Immunglobulin A zurückgehalten und bis

zur weiteren Verwendung bei -70 °C gelagert. Die Proben wurden dann

ultrazentrifugiert, um das unlösliche Mucin und andere unlösliche Bestandteile

weitgehend zu entfernen. Bei fünf Proben wurde in den verschiedenen Fraktionen

(aufschwimmende Lipidfraktion/ Gallenlösung/ Sediment) mittels ELISA die

Konzentration von Immunglobulin A bestimmt.

Die Verteilung ergab, dass das Immunglobulin A mit einer mittleren Konzentration von

158,8 mg/l in der Mucinfraktion signifikant (p<0,05) erniedrigt gegenüber der

Konzentration in der Gallenblasengalle mit 423,2 mg/l war. Nicht signifikant

unterschieden sich die Konzentrationen des Immunglobulin A in der Gallenlösung

(c = 418,2 mg/l) und im Sediment (c = 659,2 m/l).

3.2 Immunglobulin A-Gewinnung

Um den Reinheitsgrad des Immunglobulin A zu maximieren, wurden zwei

Affinitätschromatographie-Methoden verwendet. Die besonders gut geeignete

Isolierung der Proteinfraktion mit Hilfe von Concanavalin A Lectin59,60,61 wurde

verwendet, um das lösliche Mucin, das nicht an Concanavalin A bindet, und Lipide aus

der Gallenlösung zu entfernen. Um Immunglobulin A aus der gewonnenen

Proteinfraktion zu extrahieren, wurde dann eine Immunaffinitätssäule eingesetzt.

3.2.1 IgA-Immunaffinitätschromatographie

Aus der mittels Con A Affinitätschromatographie gewonnenen Proteinfraktion wurde

anschließend das Immunglobulin A isoliert.

3 Ergebnisse 27

0

0,01

0,02

0,03

0,04

1 3 5 7 9 11 13

Fraktion

Ext

inkt

ion

Abb. 3: Qualitative Abschätzungder Fraktionen des Eluats der a-IgA Immunaffinitätssäule.

Die qualitative Abschätzung der Fraktionen des Eluats der a-IgA Immunaffinitätssäule

erfolgte photometrisch (Abb.3) und mittels Auftrennung durch eindimensionale

Elektrophorese (Abb.4) entsprechend des Molekulargewichtes (MG).

MG[kD]

Abb. 4: Mit den Fraktionen (Fr) 1 bis 11, 12 und 15 und der ungebundenen Fraktion (IA-Unbound) derImmunaffinitätssäule (IA) wurde ein qualitatives Gel erstellt.

Als Standard dienten ein Proteinstandard (Kontrolle) und Immunglobulin A(IgA-Std).

3 Ergebnisse28

In der Auftrennung (Abb.4) zeigte sich, dass die gebundene Fraktion in den ersten

10 ml (Fr 1-11) gut eluiert war. In der Abbildung 4 sind die Anteile des

Immunglobulin A (Fr 1-11) sichtbar: Die schweren Ketten (63 kD), die leichten Ketten

(28 kD), die sekretorische Komponente (74 kD) und die Joining-Chain (16 kD) sowie

eine zusätzliche Bande bei ungefähr 55 kD, die sich im IgA-Standard (IgA-Std) nicht

darstellt. In der ungebundenen Fraktion fehlen diese Banden nahezu vollständig.

Die Bindungskapazität der a-IgA Immunaffinitätssäule wurde durch Läufe mit

unterschiedlichem Immunglobulin A-Gehalt der Proben ermittelt (Tab.3).

Immunglobulin A-Gehalt [mg]EingewogeneIgA-Probe

[mg]gebundene Fraktion ungebundene

Fraktion

Anteil des in derungebundenen Fraktion

vorhandenen IgA5 2436,2 510,0 17,3 %

4 1527,1 429,6 22,0 %

2 1343,9 78,3 5,5 %

1 267,0 20,4 7,1 %

Tab. 3: Vergleich des Gehaltes an Immunglobulin A in der gebundenen und ungebundenen Fraktion derImmunaffinitätssäule bei unterschiedlicher Menge an eingesetztem Protein.Die Konzentrationen wurde mittels ELISA gegen einen Standard ermittelt.

Um die Ausbeute zu maximieren, wurden daher Proben mit einem Gehalt von 2 mg

Immunglobulin A auf die Immunaffinitätssäule aufgetragen.

3.3 Bestimmung der IgA-Konzentration in humaner Gallenblasengalle

Die Lebergalle wird bei nüchternen Patienten in der Gallenblase gesammelt und

konzentriert. Der Gewinnung der Gallenblasengalle, die während der Cholezystektomie

erfolgt, geht immer eine Nahrungskarenz des Patienten voraus. Daher ist die

Konzentration des Immunglobulin A stark abhängig vom Operationszeitpunkt bzw. der

präoperativen Nahrungskarenzzeit.

3 Ergebnisse 29

Die in der Literatur vorhandenen Angaben für die Immunglobulin A-Konzentration in

Galle variieren stark62,24. Der genaue Vorgang der Probengewinnung ist dabei teilweise

nicht zu eruieren. Für die weiteren Untersuchungen war es nötig, die Konzentration von

Immunglobulin A genau und kostengünstig zu messen. In den verwendeten

Gallenblasengallen wurden mittels ELISA (bzw. RID) die IgA-Konzentrationen

bestimmt.

3.3.1 RID

Die zur Bestimmung zuerst eingesetzte radiale Immunodiffusion ließ nur eine

semiquantitative Bestimmung der Immunglobulin A-Konzentrationen zu, da die Größen

der Präzipitationskreise nur näherungsweise bestimmt werden konnten.

Der in Doppelbestimmung gemessene Standard (5 mg IgA/l) wurde mit einer

Immunglobulin A-Konzentration von 5,9 mg/l relativ genau, die zufällig ausgewählte

Gallenblasengalle mit 178 mg/l gegenüber der im ELISA bestimmten Konzentration

von 305 mg/l zu niedrig gemessen.

3.3.2 ELISA

Für den normalen ELISA wurde mit Immunglobulin A-Standard in mehreren

Verdünnungsreihen ein intraassay-Variationskoeffizient von 4,4 errechnet. Der

interassay-Variationskoeffizient betrug 5,1.

Die Spezifität des Immunglobulin A-Assays für die Messung von IgA wurde im

Vergleich mit einem anderen humanen Immunglobulin bestimmt. Im Vergleich mit

Immunglobulin G, dem anderen in Gallenblasengalle in großer Konzentration

vorkommenden Immungloblin, konnte eine mittlere Spezifität von 1:283 (1:106 bis

1:714) für Immunglobulin A ermittelt werden.

Mit diesem Assay wurde in 28 Gallenblasengallen die Immunglobulin A-

Konzentrationen gemessen. Diese lagen zwischen 12,9 mg/l und 1004,2 mg/l mit einem

Mittel von 353,4 ±272,5 mg/l.

3 Ergebnisse30

Abb. 5: Immunglobulin A-Konzentrationen in Gallenblasengalle

Bei der graphischen Auftragung der Werte (Abb.5) gruppieren sich die gemessenen

Konzentrationen um zwei Werte. Die unteren zwei Drittel der ermittelten

Konzentrationen liegen zwischen 130 mg/l und 350 mg/l bei einem Mittel von

218 mg/l. Die hohen Konzentrationen liegen mit einem Mittel von 777 mg/l auf dem

oberen Plateau.

3.4 Vergleich von kolostralem und biliärem IgA

Es wurden verschiedene Untersuchungen durchgeführt, in denen biliäres Immun-

globulin A mit Immunglobulin A aus anderen Quellen (Kolostrum) verglichen wurde.

Mit der Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation wurde der Anteil von mono- und

dimerem Immunglobulin A in biliärem und kolostralem Immunglobulin quantifiziert.

Im Kristall-ELISA wurden die Unterschiede in der Cholesterinbindungsfähigkeit der

unterschiedlichen Immunglobuline ermittelt. Der Kristallisationsversuch diente dem

Vergleich des unterschiedlichen Einflusses auf die Cholesterinkristallisation.

IgA in Gallenblasengalle

0

200

400

600

800

1000

1200 I

gA [

mg/

l]

3 Ergebnisse 31

3.4.1 Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation

In den gewonnenen 43 Fraktionen wurde die Immunglobulin A-Konzentration

gemessen und die relativen Werte aufsummiert dargestellt (Abb.6).

Der Anteil des dimeren am kolostralen Immunglobulin A wird recht konstant mit

95 %62,63 angegeben und war in den ersten 17 Fraktionen enthalten. In diesen

Fraktionen sind 57 % des biliären Immunglobulins A enthalten.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 11 21 31 41

Fraktion

aufs

um

mie

rt c

(Ig

A)

[%]

biliäres IgA kolostrales IgA

Abb. 6: Aufsummierte relative IgA-Konzentration in den einzelnen Fraktionen einerDichtegradzentrifugation

Somit liegen in unserem Gallenblasengallenpool 57 % des Immunglobulin A in dimerer

Form vor.

3.4.2 Kristall-ELISA

Die Kristallbindungsfähigkeit des Immunglobulins A aus verschiedenen Quellen an

Cholesterikristalle wurde mittels ELISA ermittelt. Dabei wurden an Assayplatten

Cholesterinkristalle immobilisiert. Die ermittelten relativen Konzentrationen ergaben im

3 Ergebnisse32

Verhältnis zu der im normalen ELISA ermittelten Konzentration einen Wert für die

Kristallbindungsaktivität des verwendeten Immunglobulins A.

Zur Ermittlung der optimalen Cholesterinkonzentration in der Lösung zur Beschichtung

der Platten wurden zunächst verschiedene Platten mit jeweils unterschiedlichen

Konzentrationen eingesetzt. Auf diesen Platten wurde dann der intrassay-

Variationskoeffizient und das Q25/ Q75- Quantil bestimmt (Abb.7).

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0 2 4 6 8 10 12

Cholesterin [g/l Ethanol]

Interquantilabstand Q75/ Q25 Variationskoeffizient

Abb. 7: Interquantilabstand und Variationskoeffizient bei unterschiedlichenCholesterinkonzentrationen in der Lösung zur Beschichtung der Platten im Kristall-ELISA

Da der kleinste Variationskoeffizient bei einer Konzentration von 2,5 g Cholesterin/l

Ethanol (95 %) ermittelt wurde, wurden im Folgenden zur Beschichtung Lösungen mit

dieser Cholesterinkonzentration verwendet.

Die gemessenen IgA-Konzentrationen in Gallenblasengallen schwankten bei gleicher

Probe sehr stark (>10x). Dies wurde auf die variablen Wechselwirkungen von in

Gallenblasengalle gelösten Stoffen mit den Cholesterinkristallen zurückgeführt. Daher

wurde gereinigtes biliäres Immunglobulin A, das mittels der Concanavalin A- und

Immunaffinitätschromatographie aus Gallenblasengallen gewonnen worden war (siehe

4.2 und 4.2.1), verwendet.

3 Ergebnisse 33

In fünf aus Gallenblasengallen gewonnenen biliären Immunglobulin A-Proben wurde

im normalen und im Kristall-ELISA die Immunglobulin A-Konzentrationen bestimmt.

Kolostrales Immunglobulin A wurde als Standard und zum Vergleich eingesetzt.

Probe Relative IgA-

Konzentration

Normaler ELISA

Relative IgA-

Konzentration

Kristall-ELISA

Quotient

c(Kristall-ELISA)/

c(normaler ELISA)

Kolostrale Probe 1,00 1,00 1,0

biliäre Probe 1 0,13 1,16 8,7





Tab. 4: Biliäres IgA im normalen und Kristall-ELISA im Vergleich zu kolostralem IgA

Dabei hatten die biliären Proben im Kristall-ELISA gegenüber dem normalen ELISA

eine signifikant (p<0,05) höhere Konzentration (1,7 - 18,6x).

3.4.3 Cholesterinkristallisationstest

Im Kristallisationstest wurde der Einfluss von kolostralem und biliärem

Immunglobulin A auf die Cholesterinkristallisation getestet.

Die Tabelle 5 zeigt die ermittelten Extinktionen der unterschiedlichen Proben zu den

jeweiligen Zeitpunkten. In Abbildung 8 sind die gemessenen Extinktionen für die

verschiedenen Proben gemittelt über die Zeit aufgetragen.

3 Ergebnisse34

Zeit (h) 0 20,5 26 43,5 49 66,5 96 117 141

c(IAb) 0,5 52 0 12 409 520 910 1038 1071 1013

0,5 11 4 0 96 159 921 1389 1445 936

2,5 0 3 42 134 99 571 746 770 1064

2,5 19 17 12 126 199 625 831 941 922

5 19 23 58 112 101 309 592 362 995

5 33 29 87 629 507 874 883 894 929

10 12 20 71 407 482 772 1143 957 988

10 24 25 63 462 517 755 735 1127 849

20 17 0 27 197 364 523 829 770 832

c(IAcol) 0,5 39 20 32 343 785 1639 1571 1167 1507

0,5 32 7 73 151 269 1590 1813 2034

2,5 41 11 34 608 920 1454 1734 1596 1395

2,5 58 12 28 503 750 1060 1494 819 1336

5 47 33 25 564 614 1035 1600 1550 1092

5 65 16 57 608 736 935 703 912 832

10 38 11 35 306 456 1490 1145 1553 1372

10 52 28 38 301 311 1157 873 1398 1142

20 45 32 108 1121 1605 1824 1533 1869 2111

20 30 22 41 912 1472 1857 2181 2019 1750

Kontrolle K1 87 31 60 352 582 1091 1286 1316 1222

K2 63 20 34 725 1074 1505 1445 1563 1327

Tab. 5: Extinktionen (x10-4) der Proben im Wachstumsversuch mitkolostralem und biliärem Immunglobulin A im Vergleich.

(IAb: gebundener Anteil der mit der ConA-Fraktion der Gallenblasengallen beschicktenImmunaffinätätssäule; IAcol: kolostrales Immunglobulin A gereinigt über Immunaffinitätssäule)

3 Ergebnisse 35

0200400600800

1000120014001600

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132

Zeit [h]

Ext

inkt

ion

[x10

E-4

]

Kontrolle biliäres IgA kolostrales IgA

Abb. 8: Extinktionszunahme der Proben im Wachstumsversuch durch fortschreitendeCholesterinkristallisation

Während das kolostrale Immunglobulin A in den getesteten Konzentrationen keinen

Einfluss auf die Kristallisation ausübte, zeigte das biliäre eine signifikante Inhibition der

Kristallbildung. In der Varianzanalyse unterschieden sich die Extinktionen im

Einzelvergleich der Zeitpunkte ab dem fünften Messzeitpunkt (48 h) signifikant

(p<0,01). Der relative Vergleich der biliären und kolostralen Probe ergab in der

Varianzanalyse unter Einbeziehung des ersten bis dritten Wertes als Grundwert eine

ebenso signifikante Abweichung der beiden Kurven ab dem fünften Messwert.

3.5 Optische Darstellung der IgA-Kristallbindung

3.5.1 TEM

Die Cholesterinkristalle konnten mittels Transmissionelektronenmikroskopie nicht

dargestellt werden. Es kam im Rahmen der Fokussierung des Elektronenstrahls zur

Verflüssigung der Kristalle, welche auch durch Variation der Kristallpräparation nicht

zu beeinflussen war.

3 Ergebnisse36

3.5.2 Fluoreszenzmikroskopie

Die Antikörperbindung an die synthetisierten Cholesterinkristalle wurde mit an

Fluorescein-Isothiocyanat gekoppelten Antikörpern gegen humanes Immunglobulin A

nachgewiesen.

Die Bindungsstellen der Kristalle, die mit Albumin gegen unspezifische Bindung

geblockt wurden, zeigten eine erhöhte Affinität für Immunglobuline.

Im unbearbeiteten Bild zeigten die Kristalle eine gegenüber der Umgebung

(Grundfluoreszenz) deutlich gesteigerte Fluoreszenz (Abb.9).

Abb. 9: Kristall im Phasenkontrastbild/ in der Auflicht-Fluoreszenz/ in der Durchlichtmikroskopie

Die aufgenommenen Fluoreszenzbilder wurden dann über die in der

Durchlichtmikroskopie aufgenommenen Bilder projiziert (Abb.10).

3 Ergebnisse 37

Abb. 10: Extrahierte Fluoreszenzinformationen, auf Kristallbild projiziert

In der Auflicht-Fluoreszenz zeigten die Seiten und Bruchkanten der Kristalle die größte

Aktivität.

3 Ergebnisse38

Bei dem Einsatz des fluoreszierenden Antikörpers ohne vorhergehende Inkubation mit

Immunglobulin A fehlte die Kristallfluoreszenz und der Kristall hob sich als deutliche

Aussparung in der Grundaktivität vom Hintergrund ab.

Die Spezifität des an Fluorescein-Isothiocyanat gekoppelten Antikörpers wurde

gegenüber einem mit Immunglobulin G beschichteten Cholesterinkristall ermittelt. Der

Kristall zeigte sich dabei wenig fluoreszierend und hob sich deutlich als Aussparung

vom fluoreszierenden Hintergrund ab (Abb.11).

Abb. 11: Mit Immunglobulin G inkubierter Kristall, der dann mit einem gegen IgA gerichteten und mitFluorescein-Isothiocyanat gekoppelten Antikörper behandelt wurde

4 Diskussion 39

4 Diskussion

In der Gallenblasengalle liegt Cholesterin in einfachen und gemischten Mizellen gelöst

vor. Bei einer Änderung dieses Gleichgewichtes kommt es zur Bildung cholesterin-

reicher Vesikel, die nach Fusion zur Ausbildung multilamellärer Strukturen und zur

Kristallpräzipitation neigen64. Als Voraussetzung für die Gallensteinbildung muss eine

Übersättigung der Gallenblasengalle mit Cholesterin vorliegen9. Allerdings bilden sich

nur bei etwa der Hälfte der Patienten mit einer Cholesterinübersättigung Gallensteine14.

Auch bei gesunden (gallensteinfreien) Patienten liegt in 50 - 70% eine Übersättigung

der Gallenblasengalle mit Cholesterin vor65. Daher kommen den anderen beiden

pathogenetischen Schlüsselfaktoren der Cholesterincholelithiasis, den die Kinetik der

Kristallisation beeinflussenden Substanzen und der Gallenblasenmotilitätstörung,

besondere Aufmerksamkeit zu. Voraussetzung für eine Cholesterinsteinbildung ist die

oben beschriebene Bildung von Mikrokristallen (Kristallisation). Durch eine Störung

der Gallenblasenmotilität und einer Verlängerung der Verweilzeit wird dann das

Gallensteinwachstum gefördert und die Elimination der gebildeten Kristalle aus der

Gallenblase verringert.

Generell zeigen Patienten mit Gallenblasensteinen einen höheren Proteingehalt der

Gallenblasengalle66. Denaturierung dieser Proteine führt zu einer verzögerten

Kristallisation; dieser Effekt kann durch Zugabe geringer Mengen nicht denaturierter

Gallenblasengalle aufgehoben werden62,67. Die Zugabe eines Proteinextrakts aus

Gallenblasengalle Gesunder bewirkt dagegen eine verzögerte Nukleation68. Es

existieren also in der Proteinfraktion der Galle sowohl nukleationsfördernde als auch

nukleationshemmende Proteine.

Die Proteine, die Einfluss auf die Kinetik der Nukleation und das weitere Wachstum der

Cholesterinkristalle haben, sind in Tab. 6 zusammengefasst. Die mit der

Concanavalin A-Affinitätschromatographie gewonnene Proteinfraktion hat einen

fördernden Einfluss auf die Nukleation. Als möglicher Promotor in dieser Fraktion

wurde Phospholipase C identifiziert69. Als weitere Promotoren wurde ein 42kD

Glykoprotein (α1-saures-Glykoprotein) 70,71,72, sowie ein 130kD Glykoprotein

4 Diskussion40

(Aminopeptidase N)61,73 und Gallenblasenmucin74 identifiziert. Als

nukleationsverzögernd wurden Apolipoprotein A-I75,76 und A-II76 beschrieben. Bei den

untersuchten Immunglobulinen zeigen Immunglobulin G und ebenfalls

Immunglobulin M77 einen nukleationsfördernden Effekt, während für Immunglobulin A

von Busch et al. einen negativer Einfluss auf die Nukleation nachgewiesen wurde17.

Promotoren Inhibitoren

Phospholipase C

α1-saures Glykoprotein

Aminopeptidase N

Immunglobulin G

Immunglobulin M

Gallenblasenmucin

Apolipoprotein A-I und A-II

Immunglobulin A

Tab. 6: Promotoren und Inhibitoren der Cholesterinkristallisation und des Gallensteinwachstums

4.1 Cholesterinkristallisationstest

In dieser Arbeit wurde die Gallenblasengalle symptomatischer Gallenblasensteinträger

für weitere Untersuchungen benutzt. Aus der Gallenblasengalle wurde biliäres

Immunglobulin A gewonnen und mittels verschiedener affinitätschromatographischer

Verfahren gereinigt.

In unserem Cholesterinkristallisationstest wirkte biliäres Immunglobulin A als Inhibitor

der Kristallisation. Dabei änderte sich die Morphologie der Kristalle, die unter

Anwesenheit von Immunglobulin A gewachsen waren16. Kolostrales Immunglobulin A

zeigte hingegen keinen Einfluss auf die Wachstumsgeschwindigkeit. Der Unterschied

zwischen biliärem und kolostralem Immunglobulin A war signifikant. Der kompaktere

Aufbau der Kristalle und die Verlangsamung der Kristallisation bei Steinwachstum

unter Anwesenheit von biliärem Immunglobulin A ließen eine Bindung des biliären

Immunglobulin A an Cholesterin vermuten. Eine solche Bindung könnte sowohl den

4 Diskussion 41

modifizierten Kristallaufbau als auch die Änderung der Wachstumsgeschwindigkeit

erklären. Die durchgeführten Untersuchungen zur visuellen Darstellung der IgA-

Cholesterinkristallbindung bestätigen diese Hypothese. Auf Cholesterinkristallen, die

mit biliärem Immunglobulin A inkubiert worden waren ließ sich mittels Fluoreszenz-

untersuchung IgA nachweisen.

Die Bildung spezifischer Antikörper gegen Cholesterin wurden bereits im Tierversuch

bei einer Reihe von Substanzen nachgewiesen. So bilden Kaninchen in

Modelluntersuchungen zum Anti-Phospholipid-Syndrom Antikörper gegen saure

Phospholipide (Cardiolipin, Phosphatidylinositol), die dann in verschiedenen Assays

nachgewiesen wurden78-82. Darauf aufbauend konnte mit Hilfe einer Impfung mit

cholesterinreichen Liposomen die Produktion von Antikörpern gegen Cholesterin, VDL

und LDL in Mäusen und Kaninchen nachgewiesen werden83-85. Die antigenen

Strukturen des Cholesterin war dabei die polare C3-Hydroxylgruppe84,85. Dabei zeigten

immunisierte Kaninchen bei der Verabreichung einer cholesterinreichen Diät einen

signifikant geringeren Anstieg des Serumcholesterinspiegel als nicht immunisierte

Kaninchen85.

Das biliäre IgA wird im Gegensatz zum biliären IgG, dass durch passiven vom

Molekulargewicht abhängigem Transport in die Galle gelangt, zum großen Teil lokal in

der Submukosa produziert. Das IgA wird dann mit Hilfe der sekretorischen

Komponente durch einen endocytischen vesikulären Transport in das Lumen der

Gallenwege sezerniert. Möglicherweise bildet auch der Mensch spezifische biliäre

Antikörper gegen Cholesterin. Biliäres Cholesterin in gelöster und kristalliner Form

könnte nach Inkorporation oder Aufnahme in die Mukosa zu einer Aktivierung

immunkompetenter und Antikörper-synthetisierender Zellen führen. Durch diese

spezifische Interaktion des biliären Immunglobulins A mit Cholesterinkristallen könnte

die von Busch et al.17 beschriebene Modifikation des Kristallaufbaus und der

inhibitorische Effekt auf die Gallensteinbildung erklärt werden.

4 Diskussion42

4.2 Kristall-ELISA

Zur Bestimmung der IgA-Konzentration in verschiedenen Galleproben wurde zunächst

ein ELISA validiert. Unter der Annahme, dass bei einer spezifischen Bindung das

biliäre IgA an Cholesterinkristalle binden und diese Bindung die Reinigungsschritte

überdauern würde, wurde zur Quantifizierung der Cholesterinbindungsfähigkeit

zusätzlich ein Kristall-ELISA entwickelt. Hierzu wurden Cholesterinmono-

hydratkristalle als primäres Antigen an einer apolaren Oberfläche immobilisiert. Als

sekundärer Antikörper wurde IgA aus verschiedenen Quellen und als tertiärer ein

enzymgekoppelter Antikörper verwendet. Aufgrund zahlreicher verschiedener in

Gallenblasengalle vorkommender (Glyko-) Proteine, die zu einer Instabilität des

Kristall-ELISAs führten, wurde Immunglobulin A zunächst aus den verschiedenen

Galleproben mittels Zentrifugation und zweier Chromatographieverfahren gereinigt.

Die gleiche Untersuchung wurde mit gereinigtem kolostralen Immunglobulin A

durchgeführt. Gegenüber dem IgA-Pool aus Kolostrum zeigte biliäres IgA im Kristall-

ELISA eine im Mittel 10fach erhöhte Affinität zu Cholesterin. Diese hohe Affinität

spricht für eine spezifische Bindung des biliären Immunglobulins A an Cholesterin-

kristalle. Die optische Darstellung der Antikörper-Kristallbindung mittels

fluoreszierenden Antikörpern zeigte dabei eine homogene Verteilung der Fluoreszenz-

aktivität auf dem Kristall.

Bei einer spezifischen Bindung wäre eine interindividuell unterschiedliche

Beeinflussung des Kristallwachstums durch das Immunglobulin A je nach Prägung des

variablen Anteiles möglich. Weitere Untersuchungen unter dem Einsatz von

Immunglobulin A-Proben mit unterschiedlicher Cholesterinbindungsfähigkeit im

Wachstumsassay könnten im Vergleich zeigen, ob hier ein direkter Zusammenhang

zwischen Cholesterinbindungsfähigkeit und hemmendem Einfluss auf die

Cholesterinkristallisation besteht.

5 Zusammenfassung 43

5 Zusammenfassung

Biliäres Immunglobulin A moduliert die Cholesterinkristallisation. In dieser Arbeit

wurde Immunglobulin A aus humaner Gallenblasengalle gewonnen und sein Einfluss

auf die Cholesterinkristallisation und die Kristallbindung in vitro quantifiziert. Hierfür

wurde ein neuer Assay zur Kristallbindung entwickelt und evaluiert.

1. Es wurde humanes biliäres Immunglobulin A gewonnen und mittels verschiedener

affinitätschromatographischer Verfahren gereinigt.

2. Es wurde eine vergleichender Cholesterinkristallisationstest mit kolostralem und

biliärem Immunglobulin A durchgeführt. Hierbei zeigte biliäres Immunglobulin A

eine signifikante Hemmung der Kristallisation, während kolostrales

Immunglobulin A keinen Einfluss auf die Kristallisation hatte.

3. Ausgehend von einer Methode zur Bestimmung der Immunglobulin A-

Konzentration in Gallenblasengalle wurde ein Cholesterinkristall-ELISA entwickelt

und evaluiert. Damit steht ein Instrument zur quantitativen Bestimmung der

relativen Kristallbindungsfähigkeit biliärer Inhibitorproteine zur Verfügung. Biliäres

Immunglobulin A zeigte im Vergleich zu kolostralem Immunglobulin A eine

deutlich höhere Bindung an Cholesterinkristalle bei hoher interindividueller

Variabilität.

4. Die Bindung von Immunglobulin A an Cholesterinmonohydratkristalle wurde

mittels Fluoreszenzmikroskopie dargestellt. Sie erwies sich als gleichmäßig.

Desweiteren konnte eine spezifische Bindung des Immunglobulin A an

Cholesterinkristalle nachgewiesen werden, so dass eine Beeinflussung der

Cholesterinkristallisation durch diese spezifische Bindung anzunehmen ist.

Weitergehende Untersuchungen individueller IgA-Pools in Bezug auf Ihre

Kristallbindung und ihren Einfluß auf die Cholesterinkristallisation könnten den Einfluß

von IgA auf die Kristallisation weiter spezifizieren und damit das Verständnis über die

Pathogenese der Gallensteinbildung erweitern.

5 Zusammenfassung44

5 Zusammenfassung 45

Abkürzungsverzeichnis

a-IgA Antikörper gegen humanes Immunglobulin A

a-IgG Antikörper gegen humanes Immunglobulin G

Ak Antikörper

BSA bovines Serumalbumin

c(...) Konzentration

Con A Concanavalin A Lectin

CSI Cholesterinsättigungsindex

E Extinktion

EDTA Ethylendiamin-tetraessigsäure

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay

FPLC Fast Protein Liquid Chromatography

Hb Hämoglobin

HRP Horseradish Peroxidase

IgA Immunglobulin A

IgG Immunglobulin G

J-Chain Joining Chain

kD Kilodalton

LDL Low-density Lipoproteine

m/v Masse/Volumen

NAD Nicotinamidadenindinucleotid

PBS Phosphat Buffered Saline

PMSF Phenylmethansulfonylfluorid

RID Radiale Immunodiffusion

RWTH Rheinisch-Westfälische Hochschule Aachen

SDS Natriumdodecylsulfat

STDC Taurodeoxycholsäure

TBS TRIS Buffered Saline

TEM Transmissionselektronenmikroskopie

TM Trademark

TRIS Tris-(hydroxylmethyl)-aminomethan

5 Zusammenfassung46

UpM Umdrehungen pro Minute

VLDL Very Low-density Lipoproteine

v/v Volumen/Volumen

6 Literaturverzeichnis 47

6 Literaturverzeichnis

1 Kratzer W, Kron M, Hay B, Pfeiffer MM, Kächele V. Prävalenz der

Cholezystolithiasis in Süddeutschland. Z Gastroenterol 1999; 37: 1157-11622 Gerste B. Operationshäufigkeit in Krankenhäusern 1996 bis 1999. In Arnold M, Litsch

M, Schellschmidt H (Hrsg.). Krankenhaus-Report 2000. Schattauer, Stuttgart 2001,

415-4243 Neubrand M, Sackmann M, Caspary WF, Feussner H, Schild H, Lauchart W,

Schildberg FW, Reiser M, Classen M, Paumgartner G et al. Leitlinien der Deutschen

Gesellschaft für Verdauungs- un Stoffwechselkrankheiten zur Behandlung von

Gallensteinen. Z Gastroenterol 2000; 38: 449-4684 Berndt H, Anker S. Gallensteine und kein Ende? Z Ärztl Fortbild 1990; 84: 183-1855 Statistisches Bundesamt. Die Gesundheitsberichterstattung des Bundes. Wiesbaden

2001 (http://www.gbe-bund.de/)6 Busch N, Matern S. Current concepts in cholesterol gallstone pathogenesis. Europ J

Clin Invest 1991; 21: 453-4607 Shiffman ML, Sugarman HJ, Kellum JM, Brewer WH, Moore EW. Gallstone

formation after rapid weight loss: A prospective study in patients undergoing gastric

bypass surgery for treatment of obesity. Am J Gastroenterol 1991; 86: 1000-10058 Lammert F, Carey MC, Paigen B. Chromosomal organization of candidate genes

involved in cholesterol gallstone formation: a murine gallstone map. Gastroenterology.

2001; 120: 221-238.9 Carey MC, Small DM. The characteristics of mixed micellar solutions with particular

Reference to bile. Am J Med 1970; 49: 590-60810 Carey MC. Critical tables for calculating the cholesterol satuation of native bile. J

Lipid Res 1978; 19: 945-95511 Mazer NA, Carey MC. Quasi-elastic light-scattering studies of aqueous biliary lipid

systems. Cholesterol sobulization and precipitation in model bile solutions.

Biochemistry 1983; 22: 426-44212 Metzger AL, Heymsfield S, Grundy SM. The lithogenic index – a numerical

expression for the relative lithogenicity of bile. Gastroenterology 1972; 62: 499-501

6 Literaturverzeichnis48

13 Holan KR, Holzbach RT, Hermann RE, Cooperman AM, Claffey WJ. Nucleation

time: a key factor in the pathogenesis of cholesterol gallstone disease. Gastroenterology

1979; 77: 611-61714 Holzbach RT, Marsh M, Olszewski M, Holan KR. Cholesterol solubility in bile.

Evidence that supersaturated bile is frequent in healthy man. J Clin Invest 1973; 52:

1467-147915 Busch N, Matiuck N, Sahlin S, Pillay SP, Holzbach RT. Inhibition and promotion of

cholesterol crystallization by protein fractions from normal human gallbladder bile. J

Lipid Res 1991; 32: 695-70216 Busch N, Lammert F, Marschall HU, Matern S. A new subgroup of lectin-bound

biliary proteins binds to cholesterol crystals, modifies crystal morphology, and inhibits

cholesterol crystallization. J Clin Invest 1995; 95: 3009-1517 Busch N, Lammert F, Matern S. Biliary secretory immunoglobulin A is a major

constituent of the new group of cholesterol crystal-binding proteins. Gastroenterology

1998; 115: 129-3818 Delacroix DL, Vaerman JP. Secretoy Component (SC): preferential binding to heavy

(>11S) IgA polymers and IgM in serum, in contrast to predominance of 11S and free

SC in secretions. Clin exp Immunol 1982; 49: 717-72419 Mestecky J, Kilian M. Immunglobulin A. In: Colowick SP, Kaplan NO (Hrsg.).

Methods in Enzymology Vol.116 Part H. Academic Press 1985: 37-7520 Vaerman JP, Heremans JF. Subclasses of human immunglobulin A based on

differences in the alpha polypeptide chains. Sciences 1966; 153: 647-64921 Grey HM, Abel CA, Yount WJ, Kunkel HG. A subclass of human ?A-Globulins

(?A2) which lacks the disulfide bonds linking heavy and light chains. J Exp Med 1968;

128: 1223-123622 Plaut AG, Wistar Jr. R, Capra JD. Differential Susceptibility of Human IgA

Immunoglobulins to Streptococcal IgA Protease. J Clin Invest 1974; 54: 1295-130023 Crago SS, Kutteh WH, Moro I, Allansmith MR, Radl J, Haaijman JJ, Mestecky J.

Distribution of IgA1-, IgA2-, and J Chain-Containing Cells in Human Tissues. J

Immunol 1984; 132: 16-18


24 Delacroix DL, Dive C, Rambaud JC, Vaerman JP. IgA subclasses in various

secretions and in serum. Immunology 1982; 47: 383-38525 Mestecky J, Schrohenloher RE, Kulhavy R, Wright GP, Tomana M. Site of J Chain

Attachment to Human Polymeric IgA. Proc Nat Acad Sci USA 1974; 71: 544-54826 Pardo AG, Lamm ME, Plaut AG, Frangione B. Secretory Component is covalently

bound to a single sub-unit in human secretory IgA. Mol Immunol 1979; 16: 477-48227 Kutteh WH, Prince SJ, Phillips JO, Spenney JG, Mestecky J. Properties of

immunoglobulin A in serum of individuals with liver dieseases and in hepatic bile.

Gastroenterology 1982; 82: 184-19328 Nagura H, Smith PD, Nakane PK, Brown WR. IgA in human bile and liver. J

Immunol 1981; 126: 587-59529 Dive C, Heremans JF. Nature and origin of proteins of bile. Europ J Clin Invest 1974;

4: 235-23930 Nagura H, Tsutsumi Y, Hasegawa H, Watanabe K, Nakane PK, Brown WR. IgA

plasma cells in biliary mucosa: a likely source of locally synthesizes IgA in human

hepatic bile. Clin exp Immunol 1983; 54: 671-68031 Kühn LC, Kraehenbuhl JP. The membrane receptor for polymeric immunglobulin is

structurally related to secretory component. J Biol Chem 1981; 256: 12490-1249532 Jonard PP, Rambaud JC, Dive C, Vaerman JP, Galian A, Delacroix DL. Secretion of

immunoglobulins and plasma proteins from the jejunal mucosa. Transport rate and

origin of the polymeric immunoglobulin A. J Clin Invest 1984; 74: 525-53533 Harvey PR, Upadhya GA, Toth JL, Strasberg SM. Fluorometric assay of protein in

native bile. Clin Chim Acta 1989; 183: 147-15434 Spiegelberg HL. Biological activities of immunoglobulins of different classes and

subclasses. Advanc Immunol 1974; 19: 259-29435 Dittrich H. Die mittlere Hämoglobulin-Konzentration der Erythrozyten. Med Klin

1963; 46: 1882-188436 Hammes PH, Gnauck R, Hawle H. Screening nach kolorektalen Neoplasien:

Vergleich von Hemdetect und Haemoccult. Z Gastroenterol 1989; 27: 611-613


37 Harvey PR, Upadhya GA, Strasberg SM. Cholesterol microcrystals associated with

concanavalin A-binding glycoproteins contribute artifactually to nucleating activity

assays. J Lipid Res 1995; 36: 2661-266938 Engvall E, Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative

assay of immunoglobulin G. Immunochemistry 1971; 8: 871-87439 Sack DA, Neogi PKB, Alam K. Immunobead enzyme-linked immunosorbent assay

for the quantitating immunoglobulin A in human secretions and serum. Infect Immun

1980; 29: 281-28340 Tijssen P. Homobifunctional reagents: Glutaraldehyd. In: Practice and theory of

enzyme immunoassays. Elsevier, Amsterdam 1985: 242-24541 Madersbacher S, Berger P. Double wavelength measurement of 3,3‘,5,5‘-

tetramethylbenzidine (TMB) provides a three-fold enhancement of the ELISA

measuring range. J Immunol Methods 1991; 138: 121-12442 Bos ES, van der Doelen AA, van Rooy N, Schuurs AH. 3,3‘,5,5‘-

Tetramethylbenzidine as an Ames test negative chromogen for horse-radish peroxidase

in enzyme-immunoassay. J Immunoassay 1981; 2: 187-20443 Sandel P, Vogt W. Rechnerunterstützte Ergebnisauswertung bei

Enzymimmunoassays. In: Vogt W (Hrsg.). Enzymimmunoassay. Georg Thieme Verlag,

Stuttgart 197844 Johns P, Stanworth DR. A simple numerical method for the construction of isokinetic

sucrose density gradients, and their application to the characterisation of

immunoglobulin complexes. J Immunol Methods 1976; 10: 231-25245 Garti N, Karpuj L, Sarig S. Correlation between crystal habit and the composition of

solvated and nonsolvated cholesterol crystals. J Lipid Res 1981; 22: 785-79146 Allain CC, Poon LS, Chan CS, Richmond W, Fu PC. Enzymatic determination of

total serum cholesterol. Clin Chem 1974; 20: 470-47547 Trinder P. Determination of glucose in blood using glucose oxidase with alternative

oxygen acceptor. Ann Clin Biochem 1969; 6: 2448 Fausa O, Skalhegg BA. Quantitative determination of bile acids and their conjugates

using thinlayer chromatography and a purified 3α-hydroxysteroid dehydrogenase.

Scand J Gastroent 1974; 9: 249-254


49 Rick W. Klinische Chemie und Mikroskopie, Eine Einführung. Springer Verlag,

Berlin, Heidelberg 197750 Gurantz D, Laker MF, Hofmann AF. Enzymatic measurement of choline-containing

phospholipids in bile. J Lipid Res 1981; 22: 373-37651 Takayama M, Itoh S, Nagasaki T, Tanimizu I. A new enzymatic method for

determination of serum choline-containing phospholipids. Clin Chim Acta 1977; 79: 93-

9852 Busch N, Tokumo H, Holzbach RT. A sensitive method for determination of

cholesterol growth using model solutions of supersaturated bile. J Lipid Res 1990; 31:

1903-190953 Renshaw PF, Janoff AS, Miller KW. On the nature of dilute aqueous cholesterol

suspensions. J Lipid Res 1983; 24: 47-5154 Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976;

71: 248-25455 Spector T. Refinement of the Coomassie blue method of protein quantitation. A

simple and linear spectrophometric assay for less than or equal to 0.5 to 50 micrograms

of protein. Anal Biochem 1978; 86: 142-14656 Lämmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4. Nature 1970; 227: 680-68557 Heukeshoven J, Dernick R. Simplified method for silver staining of proteins in

polyacrylamide gels and the mechanism of silver staining. Electrophoresis 1985; 6: 103-

11258 Heukeshoven J, Dernick R. Neue Ergebnisse zum Mechanismus der Silberfärbung.

In: Radola BJ (Hrsg.). Elektrophorese Forum `86. Eigenverlag. München 1986: 22-2759 Groen AK, Stout JPJ, Drapers JAG, Hoek FJ, Grijm R, Tytgat GNJ. Cholesterol

nucleation-influencing activity in T-tube bile. Hepatology 1988; 8: 347-35260 Groen AK, Ottenhof R, Jansen PL, van Marle J, Tytgat GN. Effects of cholesterol

nucleation-promoting activity on cholesterol sobulization in model bile. J Lipid Res

1989; 30: 51-58


61 Groen AK, Noordam C, Drapers JAG, Egbers P, Jansen PLM, Tytgat GNJ. Isolation

of a potent cholesterol nucleation-promoting activity from human gallblader bile: Role

in the pathogenesis of gallstone disease. Hepatology 1990; 11: 525-53362 Delacroix DL, Hodgson HJ, McPherson A, Dive C, Vaerman JP. Selective transport

of polymeric immunglobulin A in bile. Quantitative relationship of monomeric and

polymeric immunglobulin A, immunglobulin M, and other proteins in serum, bile and

saliva. J Clin Invest 1982; 70: 230-24163 Delacroix DL, Dive C, Rambaud JC, Vaerman JP. IgA subclasses in various

secretions and in serum. Immunology 1982; 47: 383-38564 Bourgès M, Small DM, Dervichian DG. Biophysics of lipid associations. III. The

quaternary systems lecithin-bile salt-cholesterol-water. Biochim Biophys Acta 1967;

144: 189-20165 Carey MC, Small DM. The physical chemistry of cholesterol solubility in bile.

Relationship to gallstone formation and dissolution in man. J Clin Invest 1978; 21:998-

102666 Gallinger S, Harvey PRC, Petrunka CN, Ilson RG, Strasberg SM. Biliary proteins and

the nucleation defect in cholesterol cholelithiasis. Gastroenterology 1987; 92: 867-87567 Gallinger S, Taylor RD, Harvey PRC, Petrunka CN, Strasberg SM. Effect of mucous

glycoprotein on nucleation time of human bile. Gastroenterology 1985; 89: 648-65868 Holzbach RT, Kibe A, Thiel E, Howell JH Marsh M, Hermann RE. Biliary proteins. J

Clin Invest 1984; 73: 35-4569 Pattinson NR, Willis KE. Effect of phospholipase C on cholesterol solubilization in

model bile. A conconavalin A-binding nucleation-promoting factor from human

gallblader bile. Gastroenterology 1991; 101: 1339-134470 Abei M, Kawczak P, Nuutinen H, Langnas A, Svanvik J, Holzbach RT. Isolation of a

cholesterol crystallization promotor from human bile. Gastroenterology 1993; 104: 539-

54871 Abei M, Nuutinen H, Kawczyk, Schwarzendrube J, Pillay SP, Holzbach RT.

Identifcation of human biliary α1-acid glycoprotein as a cholesterol crystallization

promotor. Gastroenterology 1994; 106: 231-238


72 Arnaud P, Miribel L, Roux AF. α1-acid glycoprotein. Meth Enzymol 1988; 163: 418-

43073 Offner GD, Gong D, Afdahl NH. Identification of a 130-kilodalton human biliary

concanavalin A binding protein as aminopeptiodase N. Gastroenterology 1994: 106;

755-76274 Levy PF, Smith BF, LaMont JT. Human gallblader mucin accelerates nucleation of

cholesterol in artificial bile. Gastroenterology 1984; 87: 270-27575 Tao S, Tazuma S, Kajiyama G. Apolipoprotein A-I stabilizes phospholipid lamellae

and thus prolongs nucleation time in model bile systems: an ultrastructural study.

Biochim Biophys Acta 1993; 1166: 25-3076 Kibe A, Holzbach RT, La Russo NF, Mao SJ. Inhibition of cholesterol crystal

formation by apolipoproteins in supersaturated model bile. Science 1984; 225: 514-51677 Harvey PR, Upadhya GA, Strasberg SM. Immunglobulins as nucleating proteins in

the gallbladder bile of patients with cholesterol gallstones.78 Hara I, Muramatsu T, Fukuda T, Sato J. Immunochemical properties of phosphatidyl

cholesterol and ist homologue. Chem and Phys Lipids 1979; 23: 2-1279 Inoue K, Nojima S. ImmunochemicaL studies of phospholipids. III. Production of

antibody to cardiolipin. Biochim Biophys Acta 1967; 144: 409-41480 Kataoka T, Nojima S. Immunochemical studies of phospholipids. IV. Haptenic

activity of phosphatidylinositol and the role of lecithin as an auxiliary lipid. J Immunol

1970; 105: 502-51181 Schiefer HG, Schummer U, Hegner D, Gerhardt U, Schnepel GH. Electron spin

resonance studies on the lipid-protein interaction between cardiolipin and anti-

cardiolipin antibodies. Z Physiol Chem 1975; 356: 293-29982 Schiefer HG. The orientation of serologically active phospholipids in mitochondrial

membranes, II. Z Physiol Chem 1973; 354: 725-72883 Dijkstra J, Swartz GM, Raney JJ, Aniagolu J, Toro L, Nacy CA, Green SJ. Interaction

of anti-cholesterol antibodies with human lipoproteins. J Immunol 1996; 157: 2006-

201384 Swartz GM, Gentry MK, Amende LM, Blanchette-Meckie EJ, Alving CR.

Antibodies to cholesterol. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85: 1902-1906


85 Alving CR, Swartz GM, Wassef NM, Ribas JL, Herderick EE, Virmani R, Kolodgie

FD, Matyas GR, Cornhill JF. Immunization with cholesterol-rich liposomes induces

anti-cholesterol antibodies and reduces diet-induced hypercholesterinemia and plaque

fomation. J Lab Clin Med 1996; 127: 40-49

Die vorliegende Arbeit wurde von 1995 bis 2000 im biochemischen Labor der

Medizinischen Klinik III der RWTH Aachen angefertigt. Ich danke

Herrn Univ.-Prof. Dr. med. Dipl.-Biochem. S. Matern, Direktor der Medizinischen

Klinik III der RWTH Aachen, sehr herzlich, daß er mir die Durchführung der Arbeit in

seiner Forschungsgruppe ermöglichte und durch optimale Rahmenbedingungen

unterstützte.

Herrn Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Norbert Busch für die kompetente und motivierende

Betreuung.

Herrn PD Dr. med. Frank Lammert für die ausführlichen und fruchtbaren Diskussionen,

für die er jederzeit zur Verfügung stand.

Herrn Univ.-Prof. Dr. med. Schumpelick, Direktor der Chirurgischen Klinik der RWTH

Aachen und Herrn Prof. Dr. med. G. Müller Chefarzt der Chirurgischen Abteilung des

Luisenhospitals Aachen für die Sammlung der Gallenproben im Rahmen der

Cholecystektomien.

Darüber hinaus danke ich Frau Ingrid Franz für die sehr gute technische Assistenz,

Herrn Dr. rer. nat. H. G. Hollweg, Pathologie der RWTH Aachen und Herrn Dr. H.

Klahr, Gemeinschaftslabor für Elektronenmikroskopie der RWTH Aachen für Beratung

bei und Durchführung der transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen

und Herrn Dipl.-Math. Thorsten Reineke, Institut für Medizinische Informatik für die

Beratung bei der statistischen Auswertung.

Curriculum vitae

Name: Stefan Südfeld

Geburtsdatum: 14.12.1970 in Werne an der Lippe

Familienstand: verheiratet seit 13.8.1999, eine Tochter

Schulbildung:

1977-1981: Grundschule Nordenstadt, Friedrich-Schiller-Grundschule Wiesbaden

1981-1990: Helene-Lange-Gymnasium und Tagesheimgymnasium Kerpen

Zivildienst: 08/90 - 10/91 Rettungsdienst der Berufsfeuerwehr Detmold

Studium:

1992-1999 Studium der Humanmedizin an der RWTH Aachen

08 / 1994 Ärztliche Vorprüfung

04 / 1996 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

04 / 1998 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

1998-1999 Praktisches Jahres in der Chirurgischen, Medizinischen und

Neurologischen Klinik des Knappschaftskrankenhauses Bardenberg

10 / 1999 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

Beruf:

seit 12 / 1999 Tätigkeit als Arzt im Praktikum/ Arzt in der Medizinischen

Klinik III des Universitätsklinikums der RWTH Aachen

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Immunglobulin A in humaner Gallenblasengalle und sein ... · PDF fileImmunglobulin A in humaner Gallenblasengalle und sein Einfluß auf die Cholesterinkristallisation Von der Medizinischen