Il b li i d ll i Il metabolismo epatico delle proteine in ...unigastro.it/.../2_intervento-cantafora-metabolismo_epatico.pdf · Il metabolismo epatico delle proteine in fisiologia

Il metabolismo epatico delle proteine in fisiologia e patologia

Il b li i d ll i Il b li i d ll i Il metabolismo epatico delle proteine Il metabolismo epatico delle proteine in fisiologia e patologiain fisiologia e patologia

Alfredo CantàforaAlfredo CantàforaDipartimento di Medicina ClinicaDipartimento di Medicina ClinicappUniversità “La Sapienza” Università “La Sapienza” -- RomaRoma


Argomenti trattatiArgomenti trattatirgom nt trattatrgom nt trattat

•• Comparti epatocellulari Comparti epatocellulari

•• Biosintesi delle proteineBiosintesi delle proteine

•• Struttura e funzioneStruttura e funzione

•• Traffico intracellulareTraffico intracellulare

•• Catabolismo delle proteineCatabolismo delle proteine

•• Molecole ChaperoneMolecole Chaperone

•• Meccanismi di danno cellulareMeccanismi di danno cellulare

•• Risposta al danno cellulareRisposta al danno cellulare


Distribuzione delle superfici di membrana nella Distribuzione delle superfici di membrana nella cellula epatica (volume circa 5000 cellula epatica (volume circa 5000 μμmm33))cellula epatica (volume circa 5000 cellula epatica (volume circa 5000 μμmm ))

••Membrana plasmatica Membrana plasmatica 2%2%

••ER rugosoER rugoso 35% 35% Totale del ReticoloTotale del Reticolo

••ER liscioER liscio 16% 16% endoplasmatico 51%endoplasmatico 51%

••Apparato di GolgiApparato di Golgi 7%7%

••MitocondriMitocondri 39%39%

••Membrana nucleareMembrana nucleare 0.2%0.2%

••LisosomiLisosomi 0.4%0.4%

••PerossisomiPerossisomi 0.4%0.4%

••Endosomi Endosomi 0.4%0.4%

Molecular biology of the cell – 2 nd ed. – Bruce Alberts et al. – Garland Publisher, Inc. – NY, 1990


Il Reticolo Endoplasmatico Il Reticolo Endoplasmatico

Nell’epatocita può occupare fino al 50% dello spazio intracellulare


Sintesi proteica catalizzata dai RibosomiSintesi proteica catalizzata dai Ribosomi


Sintesi proteica catalizzata dai RibosomiSintesi proteica catalizzata dai Ribosomi

La formazione di ogni legame peptidico richiede l’idrolisi di 4 gruppi fosfato (da ATP e GTP) pari a 28.000 cal/mole. La formazione di ogni legame peptidico richiede l’idrolisi di 4 gruppi fosfato (da ATP e GTP) pari a 28.000 cal/mole. Essendo l’energia di legame di 5.000 cal/mole, ogni legame peptidico comporta la perdita di 23.000 cal/mole. Essendo l’energia di legame di 5.000 cal/mole, ogni legame peptidico comporta la perdita di 23.000 cal/mole.


“Road Map” del traffico intracellulare delle proteine“Road Map” del traffico intracellulare delle proteine

RibosomiRibosomi

CitosolCitosol Reticolo endoplasmaticoReticolo endoplasmatico

MitocondriMitocondri PerossisomiPerossisomi GolgiGolgi

endosomaendosoma

NucleoNucleo

gg

Vescicole secretorieVescicole secretorie LisosomiLisosomiNucleoNucleo

Membrana plasmaticaMembrana plasmatica

sosososo

pp


Molte proteine sono dotate di sequenze aa (signal peptide o Molte proteine sono dotate di sequenze aa (signal peptide o i l t h) h l i di i ifi i lli i l t h) h l i di i ifi i lli signal patch) che le indirizzano a specifici organelli. signal patch) che le indirizzano a specifici organelli.

In mancanza di signal peptide le proteine restano nel citosol.In mancanza di signal peptide le proteine restano nel citosol.

Ad es., la seguente sequenza del terminale amminico Ad es., la seguente sequenza del terminale amminico determina la translocazione della proteinadetermina la translocazione della proteina al ERal ER

++NHNH M tM t M tM t SS PhPh V lV l SS LL LL LL V lV l GlGl IlIl++NHNH33--MetMet--MetMet--SerSer--PhePhe--ValVal--SerSer--LeuLeu--LeuLeu--LeuLeu--ValVal--GlyGly--IleIle--LeuLeu--PhePhe--TrpTrp--AlaAla--ThrThr--GluGlu----AlaAla--GluGlu----GlnGln--LeuLeu--ThrThr--LysLys++--CysCys--

GluGlu----ValVal--PhePhe--GlnGln--

La seguente sequenza del terminale carbossilico ne determina La seguente sequenza del terminale carbossilico ne determina invece la ritenzione nel REinvece la ritenzione nel RE

--LysLys++--AspAsp----GluGlu----LeuLeu--COOCOO--


Il sistema Nucleo Il sistema Nucleo –– Reticolo Endoplasmatico Reticolo Endoplasmatico -- GolgiGolgi

CitosolCitosolCitosolCitosol

Vescicole secretorieVescicole secretorie


L t i t tt li h l t i it lt L t i t tt li h l t i it lt

Il catabolismo delle proteineIl catabolismo delle proteine

Le proteine strutturali hanno generalmente emivita molto Le proteine strutturali hanno generalmente emivita molto lunga, le proteine con funzione di segnale o con attività lunga, le proteine con funzione di segnale o con attività

enzimatica sono invece degradate rapidamente.enzimatica sono invece degradate rapidamente.






Nel citosol l’emivita della proteina dipende dal tipo di aa sul Nel citosol l’emivita della proteina dipende dal tipo di aa sul terminale amminico della molecola (Met, Ser, Thr, Ala, terminale amminico della molecola (Met, Ser, Thr, Ala,

V l C Gl P t bili n l p t in li lt i l V l C Gl P t bili n l p t in li lt i l Val, Cys, Gly e Pro stabilizzano la proteina, gli altri aa la Val, Cys, Gly e Pro stabilizzano la proteina, gli altri aa la destabilizzano).destabilizzano).






Nel citosol l’emivita della proteina dipende dal tipo di aa sul Nel citosol l’emivita della proteina dipende dal tipo di aa sul terminale amminico della molecola (Met, Ser, Thr, Ala, terminale amminico della molecola (Met, Ser, Thr, Ala,

V l C Gl P t bili n l p t in li lt i l V l C Gl P t bili n l p t in li lt i l Val, Cys, Gly e Pro stabilizzano la proteina, gli altri aa la Val, Cys, Gly e Pro stabilizzano la proteina, gli altri aa la destabilizzano).destabilizzano).

Si riteneva un tempo che la degradazione delle proteine Si riteneva un tempo che la degradazione delle proteine Si riteneva un tempo che la degradazione delle proteine Si riteneva un tempo che la degradazione delle proteine fosse operata dai lisosomi. Ora si sa che un rilevante fosse operata dai lisosomi. Ora si sa che un rilevante

contributo è dato dal “ubiquitincontributo è dato dal “ubiquitin--dependent pathway” che dependent pathway” che i l t t l it li l t t l it lavviene nel proteasoma presente nel citosol.avviene nel proteasoma presente nel citosol.


Degradazione proteica ubiquitinaDegradazione proteica ubiquitina--dipendentedipendente

L’ubiquitina è una proteina L’ubiquitina è una proteina L ubiquitina è una proteina L ubiquitina è una proteina termostabile di 76 aa la cui termostabile di 76 aa la cui estremità carbossilica può legarsi estremità carbossilica può legarsi al gruppo amminico della lisina.al gruppo amminico della lisina.

L’attacco di una singola molecola L’attacco di una singola molecola di ubiquitina è reversibile; la polidi ubiquitina è reversibile; la poli--ubiquitinazione determina invece ubiquitinazione determina invece l’i di d d i d l’i di d d i d l’immediata degradazione ad l’immediata degradazione ad opera di proteasi ATPopera di proteasi ATP--dipendentidipendenti



E1= enzima attivatore E1= enzima attivatore dell’ubiquitinadell’ubiquitina

E2= enzima coniugatore E2= enzima coniugatore dell’ubiquitinadell’ubiquitina

E3 bi iti li iE3 bi iti li iE3= ubiquitina ligasiE3= ubiquitina ligasi



E1= enzima attivatore E1= enzima attivatore dell’ubiquitinadell’ubiquitina

E2= enzima coniugatore E2= enzima coniugatore dell’ubiquitinadell’ubiquitina

E3 bi iti li iE3 bi iti li iE3= ubiquitina ligasiE3= ubiquitina ligasi

La proteina poliLa proteina poli--ubiquitilata è soggetta all’azione di proteasi ATPubiquitilata è soggetta all’azione di proteasi ATP--dipendenti nel proteasomadipendenti nel proteasoma


Il proteasomaIl proteasoma

Vista lateraleVista laterale Vista dall’altoVista dall’altoEntrata substratiEntrata substrati

Subunità Subunità αα

150150ǺǺ Subunità Subunità ββ

Subunità Subunità αα

115115ǺǺØ cavità interna 53 ǺØ cavità interna 53 Ǻ

Ø f i 13 ǺØ f i 13 ǺProdotti di proteolisiProdotti di proteolisi

Ø foro ingresso 13 ǺØ foro ingresso 13 Ǻpp


Danno e risposta cellulareDanno e risposta cellulare

••Molecole ChaperoneMolecole Chaperonepp

••Unfolded Protein ResponseUnfolded Protein Response

••Proteine e lipidi di membranaProteine e lipidi di membrana


Fanno “soffrire” le membrane del ER (e la cellula in generale):Fanno “soffrire” le membrane del ER (e la cellula in generale):

••Fenomeni ischemiciFenomeni ischemici

••Stress ossidativo (apoptosi e infiammazione)Stress ossidativo (apoptosi e infiammazione)

••Eccessivo accumulo intracellulare di lipidi (steatosi)Eccessivo accumulo intracellulare di lipidi (steatosi)

•• Presenza di proteine degradate e/o denaturate nel lume del ERPresenza di proteine degradate e/o denaturate nel lume del ER

••Anomala distribuzione dei lipidi di membrana (ad es., alto CH/PL)Anomala distribuzione dei lipidi di membrana (ad es., alto CH/PL)

•• Prodotti di ossidazione e degradazione dei lipidiProdotti di ossidazione e degradazione dei lipidi

•• Presenza di detergenti endogeni ed esogeni (ad es BS idrofobi)Presenza di detergenti endogeni ed esogeni (ad es BS idrofobi)Presenza di detergenti endogeni ed esogeni (ad es., BS idrofobi)Presenza di detergenti endogeni ed esogeni (ad es., BS idrofobi)

••Farmaci e sostanze tossiche, naturali e sintetiche (ad es., l’alcool)Farmaci e sostanze tossiche, naturali e sintetiche (ad es., l’alcool)

••Disordini metabolici (ad es., diabete, obesità)Disordini metabolici (ad es., diabete, obesità)

•• Infezioni virali (ad es., HCV, HBV)Infezioni virali (ad es., HCV, HBV)


Il R ti l E d l ti i d ll t i ti Il R ti l E d l ti i d ll t i ti Il Reticolo Endoplasmatico risponde allo stress con i seguenti Il Reticolo Endoplasmatico risponde allo stress con i seguenti meccanismi:meccanismi:

Atti i n d ll isp st ll p t in d n tu t (UPR Unf ld d Atti i n d ll isp st ll p t in d n tu t (UPR Unf ld d ••Attivazione della risposta alle proteine denaturate (UPR = Unfolded Attivazione della risposta alle proteine denaturate (UPR = Unfolded Protein Response) mediata da Protein Response) mediata da chaperoni proteici e molecolarichaperoni proteici e molecolari

••Modificazione della Modificazione della biosintesi dei lipidi di membranabiosintesi dei lipidi di membrana in modo da in modo da contrastare le alterazioni della composizionecontrastare le alterazioni della composizionecontrastare le alterazioni della composizionecontrastare le alterazioni della composizione

••Attivazione dei meccanismi di antiAttivazione dei meccanismi di anti--ossidazioneossidazione

••Modificazione delle sostanze tossicheModificazione delle sostanze tossiche

••Attivazione dell’apoptosi in caso di danno irrimediabile Attivazione dell’apoptosi in caso di danno irrimediabile


Che fa lo chaperone ?Che fa lo chaperone ?Dov’è lo chaperone ?Dov’è lo chaperone ?

Gerard ter Borch (Zwolle 1617 Gerard ter Borch (Zwolle 1617 –– Deventer 1681)Deventer 1681)

“The dancing couple” “The dancing couple” –– Amsterdam 1660Amsterdam 1660


Lo ChaperoneLo ChaperoneCcntrolla che le “interazioni” Ccntrolla che le “interazioni” nella coppia siano “corrette”nella coppia siano “corrette”

Gerard ter Borch (Zwolle 1617 Gerard ter Borch (Zwolle 1617 –– Deventer 1681)Deventer 1681)

“The dancing couple” “The dancing couple” –– Amsterdam 1660Amsterdam 1660


Chaperoni molecolariChaperoni molecolari

TUDCATUDCA TauroursodesossicolatoTauroursodesossicolatoTUDCATUDCA TauroursodesossicolatoTauroursodesossicolato

PBAPBA Acido 4Acido 4--fenil butirricofenil butirrico

TMAOTMAO Trimetilammina NTrimetilammina N--ossido diidratoossido diidrato

TAUTAU TaurinaTaurina

Chaperoni proteiciChaperoni proteici

FamigliaFamiglia FunzioneFunzione

HSP90HSP90 Rinaturazione struttura proteica e tolleranza dello stressRinaturazione struttura proteica e tolleranza dello stress

HSP70HSP70 Legame alle proteine denaturate e prevenzione loro aggregazioneLegame alle proteine denaturate e prevenzione loro aggregazione

HSP40HSP40 Consegna dei substrati proteici alle HSP70 e stimolo delle ATPasiConsegna dei substrati proteici alle HSP70 e stimolo delle ATPasiHSP40HSP40 Consegna dei substrati proteici alle HSP70 e stimolo delle ATPasiConsegna dei substrati proteici alle HSP70 e stimolo delle ATPasi

Alcune proteine, come Hop e Ciclofillina 40, sono co-fattori degli chaperon HSP90 e HSP70.


Unfolded Protein ResponseUnfolded Protein ResponseUnfolded Protein ResponseUnfolded Protein Response







Aumento della biosintesi degli chaperoni e della degradazione delle UPs





Riduzione sintesi proteica, attivazione anti-ossidanti, degradazione UPs


Stress del RE e metabolismo lipidico cellulareStress del RE e metabolismo lipidico cellularepp

I cambiamenti nella composizione dei lipidi di membrana I cambiamenti nella composizione dei lipidi di membrana sono mediati da proteine dotate di Sterol Sensing sono mediati da proteine dotate di Sterol Sensing sono mediati da proteine dotate di Sterol Sensing sono mediati da proteine dotate di Sterol Sensing Domain (SSD) che agiscono, in modo indiretto e Domain (SSD) che agiscono, in modo indiretto e complesso, sulla trascrizione di geni muniti di Sterol complesso, sulla trascrizione di geni muniti di Sterol R ul t r El m nt (SRE)R ul t r El m nt (SRE)Regulatory Element (SRE)Regulatory Element (SRE)


Membrana del ER con bassi livelli di colesteroloMembrana del ER con bassi livelli di colesterolo

La proteina La proteina INSIG1, munita di INSIG1, munita di SSD, perde il SSD, perde il contatto con contatto con contatto con contatto con HMGCR e con il HMGCR e con il complesso complesso SCAP/SREBPSCAP/SREBP



Il complesso Il complesso SCAP/SREBP SCAP/SREBP lascia il RE lascia il RE rivestito da rivestito da una coat una coat protein e fonde protein e fonde col Golgicol Golgi



L’attivazione L’attivazione delle proteasi delle proteasi S1P e S2P S1P e S2P stacca il stacca il stacca il stacca il fattore di fattore di trascrizione di trascrizione di SREBP che SREBP che penetra nel penetra nel penetra nel penetra nel nucleo nucleo



Aumenta la Aumenta la trascrizione trascrizione dei geni muniti dei geni muniti ggdi SRE, tra i di SRE, tra i quali HMGCR, quali HMGCR, LDLR e LDLR e INSIG1INSIG1



La proteina La proteina INSIG1 non INSIG1 non legata è legata è soggetta ad un soggetta ad un soggetta ad un soggetta ad un rapido turnover rapido turnover mediato da mediato da ubiquitilazione ubiquitilazione e degradazione e degradazione e degradazione e degradazione proteasomicaproteasomica


Membrana del ER con alti livelli di colesteroloMembrana del ER con alti livelli di colesterolo

Gli alti livelli di Gli alti livelli di CH aumentano CH aumentano l’interazione di l’interazione di INSIG1 con il INSIG1 con il complesso complesso SCAP/SREBP e SCAP/SREBP e con HMGCRcon HMGCR



Il mancato Il mancato rilascio del rilascio del complesso complesso SCAP/SREBP SCAP/SREBP fa crollare la fa crollare la trascrizione trascrizione dei geni muniti dei geni muniti di SREdi SRE



L’interazione L’interazione INSIG1INSIG1--HMGCR HMGCR favorisce la favorisce la ubiquitilazione di ubiquitilazione di qqHMGCR e la sua HMGCR e la sua degradazione degradazione proteasomicaproteasomica


La proteina La proteina La proteina La proteina INSIG1 non INSIG1 non legata subisce legata subisce una rapida una rapida degradazione degradazione degradazione degradazione proteasomica. proteasomica. Nel complesso, Nel complesso, si ferma la si ferma la biosintesi del biosintesi del b os ntes del b os ntes del colesterolo.colesterolo.


I dati sperimentali suggeriscono che INSIG1 è uno chaperone I dati sperimentali suggeriscono che INSIG1 è uno chaperone specifico per proteine che contengono lo SSD quali:specifico per proteine che contengono lo SSD quali:specifico per proteine che contengono lo SSD, quali:specifico per proteine che contengono lo SSD, quali:

••SCAP SCAP (attivatore della proteolisi di SREBP)(attivatore della proteolisi di SREBP)

••HMGCR (enzima limitante la biosintesi del CH)HMGCR (enzima limitante la biosintesi del CH)( m m )( m m )

••NPC1 NPC1 (trasportatore intracellulare del colesterolo)(trasportatore intracellulare del colesterolo)

INSIG1 l i di l’ tti ità l d d i INSIG1 l i di l’ tti ità l d d i di tdi tINSIG1 regola, quindi, l’attività e la degradazione INSIG1 regola, quindi, l’attività e la degradazione di queste di queste proteineproteine mediante meccanismi di translocazione e ubiquitinazionemediante meccanismi di translocazione e ubiquitinazione


I principali effetti della modulazioneI principali effetti della modulazione INSIG1INSIG1--mediatamediata sul sul metabolismo lipidico sono dovuti al rilascio del fattore metabolismo lipidico sono dovuti al rilascio del fattore nucleare derivato da SREBP che agisce su più di 20 geni nucleare derivato da SREBP che agisce su più di 20 geni muniti di SRE, tra i quali:muniti di SRE, tra i quali:

••HMGCR (aumento biosintesi CH)HMGCR (aumento biosintesi CH)

••LDLRLDLR (aumento captazione recettoriale CH)(aumento captazione recettoriale CH)

••NPC1L1(aumento captazione non recettoriale CH)NPC1L1(aumento captazione non recettoriale CH)

••NPC1NPC1 (aumento trasporto intracellulare CH)(aumento trasporto intracellulare CH)

••GPATGPAT (aumento sintesi trigliceridi a scapito dei PL)(aumento sintesi trigliceridi a scapito dei PL)

••Fatty Acid synthasesFatty Acid synthases

••Fatty Acid desaturasesFatty Acid desaturases


Leclercq I.A. Leclercq I.A. et al.et al. J. Hepatol. 47:142J. Hepatol. 47:142--156, 156, 20072007


Conclusioni 1Conclusioni 1

Metabolismo lipidico e proteico del RE s’intrecciano in modo Metabolismo lipidico e proteico del RE s’intrecciano in modo complesso e sono influenzati dalle condizioni di stress.complesso e sono influenzati dalle condizioni di stress.pp

Nell’epatocita, ad es., lo stress prolungato aumenta sintesi e Nell’epatocita, ad es., lo stress prolungato aumenta sintesi e accumulo di colesterolo e dei lipidi intracellulari (fatty liver).accumulo di colesterolo e dei lipidi intracellulari (fatty liver).


In condizione di In condizione di stress moderato stress moderato la sintesi proteica diminuisce la sintesi proteica diminuisce


In cond z one d In cond z one d stress moderato stress moderato la s ntes prote ca d m nu sce la s ntes prote ca d m nu sce di poco e così pure i livelli di INSIG1. Ciò induce la stimolazione di poco e così pure i livelli di INSIG1. Ciò induce la stimolazione dei geni con SRE (HMGCR, NPC1L1) mediato dal processing di dei geni con SRE (HMGCR, NPC1L1) mediato dal processing di SREBP e una maggiore sintesi e assorbimento del colesterolo, SREBP e una maggiore sintesi e assorbimento del colesterolo, gg ,gg ,utile a sostenere i processi di rigenerazione cellulare.utile a sostenere i processi di rigenerazione cellulare.





In condizione di In condizione di forte stressforte stress diminuiscono sintesi proteica e diminuiscono sintesi proteica e livelli di INSIG1 Ne consegue attivazione incontrollata di livelli di INSIG1 Ne consegue attivazione incontrollata di livelli di INSIG1. Ne consegue attivazione incontrollata di livelli di INSIG1. Ne consegue attivazione incontrollata di SREBP e forte stimolo dei geni con SRE. La sovrapproduzione di SREBP e forte stimolo dei geni con SRE. La sovrapproduzione di CH e TG (a scapito dei PL) induce l’accrescimento dei lipid CH e TG (a scapito dei PL) induce l’accrescimento dei lipid stores (da attivazione dei geni ACAT2 e MTTP) stores (da attivazione dei geni ACAT2 e MTTP) stores (da attivazione dei geni ACAT2 e MTTP). stores (da attivazione dei geni ACAT2 e MTTP).





In condizione di In condizione di forte stressforte stress diminuiscono sintesi proteica e diminuiscono sintesi proteica e livelli di INSIG1 Ne consegue attivazione incontrollata di livelli di INSIG1 Ne consegue attivazione incontrollata di livelli di INSIG1. Ne consegue attivazione incontrollata di livelli di INSIG1. Ne consegue attivazione incontrollata di SREBP e forte stimolo dei geni con SRE. La sovrapproduzione di SREBP e forte stimolo dei geni con SRE. La sovrapproduzione di CH e TG (a scapito dei PL) induce l’accrescimento dei lipid CH e TG (a scapito dei PL) induce l’accrescimento dei lipid stores (da attivazione dei geni ACAT2 e MTTP) stores (da attivazione dei geni ACAT2 e MTTP) stores (da attivazione dei geni ACAT2 e MTTP). stores (da attivazione dei geni ACAT2 e MTTP).

Il prolungamento delle condizioni di stress provoca l’accumulo di Il prolungamento delle condizioni di stress provoca l’accumulo di CH nelle membrane che blocca la regolazione della biosintesi dei CH nelle membrane che blocca la regolazione della biosintesi dei li idi di t d l il i d l l SCAP/SREBP tt li idi di t d l il i d l l SCAP/SREBP tt lipidi mediata dal rilascio del complesso SCAP/SREBP attraverso lipidi mediata dal rilascio del complesso SCAP/SREBP attraverso l’interazione con INSIG1. Peggiora il rapporto CH/PL del RE e l’interazione con INSIG1. Peggiora il rapporto CH/PL del RE e ne consegue l’infarcimento lipidico dell’epatocita.ne consegue l’infarcimento lipidico dell’epatocita.


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