4

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Minyak Ikan

Minyak ikan adalah minyak yang diperoleh dari jaringan-jaringan tubuh

ikan. Minyak ikan dianjurkan untuk diet kesehatan karena banyak mengandung

omega-3 asam eikosapentanoat (EPA) dan asam dokosaheksanoat (DHA) yang

dapat mengurangi masalah peradangan pada tubuh. Omega-3 sebenarnya tidak

diproduksi oleh tubuh ikan itu sendiri, tetapi merupakan akumulasi dari

konsumsi mikroalga yang memproduksi asam lemak (Wikipedia, the free

encyclopedia, 2008).

Komposisi minyak ikan utamanya mengandung trigliserida dari tiga buah

asam lemak (gliserol yang dikombinasi dengan molekul asam yang sama atau

berbeda) dengan fosfolipid, gliserol eter dan ester wax. Karakteristik minyak

adalah bahwa mereka mengandung berbagai asam lemak rantai panjang dengan

jumlah atom karbon yang berkisar antara 14 sampai 22, dan tingkat

ketidakjenuhan yang berkisar antara satu sampai enam buah ikatan rangkap per

molekul (Fisheries and Aquaculture Department, 1986).

Kandungan minyak dan komposisi asam lemak berbeda pada tiap jenis

ikan. Bahkan perbedaan juga ditemukan pada ikan yang sejenis dengan faktor

yang mempengaruhi adalah pola makan, temperatur, pengaruh musim, usia dan

jenis kelamin. Komposisi asam lemak sangat dibutuhkan oleh para ahli gizi

untuk membuat formulasi nilai gizi, pelabelan nutrisi, pemrosesan dan

pengembangan produk (Üstün, 1996). Adapun perbandingan komposisi asam

lemak omega-3 dapat dilihat pada Tabel 1 di bawah ini.

Tabel 1. Tabel perbandingan komposisi omega-3 pada beberapa sumber minyak/lemak

Sumber lemak/minyak

a

Komposisi omega-3 (%) Ikan 13-15 Linseed 26-58 Kedelai 2-10 Rapeseed 1-10

a Jenkins (2008)

5

B. Asam Lemak Omega-3

Asam lemak omega-3 merupakan kelompok asam lemak tak jenuh yang

memiliki ikatan rangkap pada posisi n-3, yaitu pada rantai nomor tiga terhitung

dari ujung metil dari asam lemak. Asam lemak omega-3 yang esensial untuk

manusia adalah α asam linolenat (18:3, n−3; ALA), asam eikosapentanoat

(20:5, n−3; EPA) dan asam dokosaheksanoat (22:6, n−3; DHA) (Wikipedia, the

free encyclopedia, 2008).

Asam lemak omega-3 adalah asam lemak yang memiliki posisi ikatan

rangkap pertama pada rantai karbon nomor tiga dari ujung gugus metilnya.

Asam-asam lemak alami yang termasuk kelompok asam lemak omega-3 adalah

asam linolenat (C18:3), asam eikosapentanoat (C20:5) atau EPA dan asam

dokosaheksanoat (C22:6) atau DHA, sedangkan yang termasuk kelompok asam

lemak omega-6 adalah asam linoleat (C18:2) dan asam arakidonat (C20:4).

Rumus molekul dari asam lemak omega-3 yang banyak terdapat dalam minyak

ikan tertera pada Gambar 1.

CH3-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-(CH2)7

Asam Linolenat (C18:3) -COOH

CH3-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH= CH-(CH2)3

Asam Eikosa Pentanoat(C20:5) -COOH

CH3-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-(CH2)2

Asam Dokosa Heksanoat (C22:6) -COOH

Gambar 1. Rumus molekul dari asam lemak omega-3 (Ackman, 1982)

Asam lemak omega-3 sangat penting untuk membantu fungsi kerja otak,

terutama untuk proses pertumbuhan dan perkembangan otak. Asam lemak

esensial ini banyak terakumulasi di dalam otak terutama penting untuk fungsi

kognitif otak dan mengatur perilaku manusia. Kekurangan asam lemak omega-

3 dalam tubuh manusia dapat menyebabkan kelelahan, daya ingat lemah, kulit

kering, gangguan hati, depresi dan sirkulasi yang tidak teratur (DeBusk, 2007).

6

Asam lemak omega-3 yang terpendek (asam linolenat) ditemukan di dalam

tumbuhan dan minyak tumbuhan, termasuk sayuran, walnut, minyak biji

mustard, minyak kedelai, minyak jagung dan minyak flaxseed (terdiri atas 50%

asam linolenat). Asam lemak omega-3 yang lebih panjang, asam

eikosapentanoat (EPA) dan asam dokosaheksanoat (DHA) ditemukan di dalam

alga yang dimakan oleh ikan dan ikan paus herbivora. Manusia memperoleh

asam lemak ini dari mengonsumsi ikan (misalnya salmon) (Jenkins, 2008).

Beberapa jenis asam lemak omega-3 dan omega-6 yang terletak di dalam

makanan dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Beberapa jenis asam lemak omega-3 dan omega-6 dalam makananb

Asam Lemak Tipe Singkatan Sumber Terbesar dalam Makanan

α-linolenat N-3 ALA Flax, kanola, minyak ikan eikosapentanoat N-3 EPA Minyak ikan dokosaheksanoat N-3 DHA Minyak ikan

linoleat N-6 LA Minyak kedelai, safflower, bunga matahari, minyak jagung

arakidonat N-6 AA Sisa-sisa daging, ikan, unggas b Addis (2000)

Seto et al., (1984) mengemukakan bahwa produsen utama asam lemak

omega-3 sebenarnya bukan ikan, melainkan mikroorganisme laut yang menjadi

makanannya antara lain Chlorella, Diatomea, dan Dinoflagellata yang

merupakan fitoplankton. Mikroorganisme tersebut di samping mensintesis

asam lemak omega-3 juga dapat mensintesa asam lemak omega-6. Sintesa

asam lemak ini sangat efisien karena mikroorganisme tadi mempunyai siklus

rantai makanan yang pendek. Tetapi sebenarnya sintesis asam lemak omega-3

tidak hanya dilakukan oleh fitoplankton tersebut, melainkan juga oleh bakteri,

kapang, algae, dan fitoplankton lain yang mempunyai tingkat efisiensi sintesis

yang berbeda.

Kadar asam lemak omega-3 pada beberapa jenis ikan per 100 gram daging

dapat dilihat pada Tabel 3.

7

Tabel 3. Kadar omega-3 pada beberapa jenis ikan per 100 gram daging ikanc

Jenis ikan Kadar lemak (gram)

Asam arakidonat (g)

EPA (gram)

DHA (gram)

Tuna 6,80 0,14 0,63 1,70 Herring 6,20 0,03 0,33 0,58

Mackerel 9,80 0,12 0,85 1,10 Salmon 13,20 0,06 1,00 0,72

Cod 0,73 0,02 0,08 0,15 Sarden 10,20 0,22 1,70 0,64

c Barlow dan Stansby (1982)

C. Hidrolisis

Hidrolisis merupakan reaksi kimia yang melibatkan molekul air di mana

molekul tersebut terpecah menjadi ion hidrogen dan hidroksida yang kemudian

akan bereaksi lebih lanjut. (Wikipedia, the free encyclopedia, 2009a). Dalam

reaksi hidrolisis, lemak atau minyak akan diubah menjadi asam-asam lemak

bebas dan gliserol (Herlina, 2002). Mekanisme reaksi hidrolisis trigliserida

dengan bantuan lipase dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Mekanisme reaksi hidrolisis trigliserida (Hudiyono, 2009)

Menurut Freidfelder (1987), pada umumnya reaksi hidrolisis berlangsung

ketika garam dari basa lemah atau garam dari asam lemah dilarutkan ke dalam

air. Air akan melakukan autoionisasi menjadi ion hidroksil negatif dan ion

hidrogen. Kemudian garam akan terpecah menjadi ion positif dan ion negatif.

Hanya saja, dalam kondisi normal, reaksi hidrolisis antara air dan beberapa

8

komponen organik hanya sedikit yang terjadi. Umumnya reaksi ini

membutuhkan katalis berupa asam, basa atau secara enzimatis.

D. Lipase

Enzim-enzim hidrolisis telah banyak digunakan dalam sintesa organik

karena ketersediaan bahan baku dan penanganan yang mudah. Enzim ini tidak

membutuhkan koenzim, stabil dan toleran terhadap pelarut organik. Potensi

mereka untuk melakukan sintesis regioselektif dan enantioselektif menjadikan

mereka sebagai alat yang berharga (Schuchardt, 1997).

Asam lemak tak jenuh sangat labil terhadap panas dan oksidasi. Reaksi

enzim telah menarik perhatian karena enzim dapat melakukan proses pada

temperatur dan tekanan lingkungan serta di bawah tekanan nitrogen. Beberapa

lipase tidak bereaksi secara baik pada asam lemak tak jenuh dan asam lemak

tak jenuh dapat dipekatkan melalui keuntungan ini. Misalnya, ketika minyak

ikan, minyak borage dan minyak yang mengandung asam arachidonat dari

Mortierella dihidrolisis dengan menggunakan lipase dari Candida rugosa atau

Geotrichum candidum, kandungan DHA, asam α-linolenat dan asam arakidonat

meningkat di dalam gliserida (Shimada, 1998).

Lipase (triasilgliserol asil hidrolase, EC 3.1.1.4) telah menjadi katalis yang

penting dalam sintesis organik. Karena reaksi hidrolisis merupakan reaksi

kesetimbangan di dalam sistem non aqueous, biokatalis ini juga dapat

mengkatalisis formasi ester dari donor asil dan alkohol. Lipase tidak

membutuhkan kofaktor (Ghanem, 2004).

Lipase memiliki kemampuan untuk mengkatalisis reaksi kebalikan

(esterifikasi, interesterifikasi dan transesterifikasi) yang ada dengan

menggantikan media aqueous dengan media non aqueous. Lipase juga

menunjukkan selektivitas yang tinggi termasuk stereo selektivitas dan

memberikan hasil akhir produk yang murni dan berkualitas baik (Hilal, 2006).

Lipase dikenal bereaksi lemah terhadap asam lemak tak jenuh, seperti asam

α-linolenat (GLA, 18:3n-6), asam arakidonat (20:4n-6), asam eikosapentanoat

9

(EPA, 20:5n-3), dan asam dokosaheksanoat (DHA, 22:6n−3) dan asam lemak

ini dapat diperkaya melalui hidrolisis selektif dan melalui esterifikasi selektif

(Shimada, 1997).

Menurut N. N. Gandhi (1996) ada dua katagori di mana lipase dapat

digunakan sebagai katalis yaitu :

a. Hidrolisis

RCOOR’ + H2

b. Sintesis

O RCOOH + R’OH

Reaksi sintesis dapat dipisahkan menjadi :

i. Esterifikasi

RCOOH + R’OH RCOOR’ + H2

ii. Interesterifikasi

O

RCOOR’ + R”COOR’” RCOOR’” + R”COOR’

iii. Alkoholisis

RCOOR’ + R”OH RCOOR” + R’OH

iv. Asidolisis

RCOOR’ + R”COOH R”COOR’ + RCOOH

Lipase mikroba diproduksi dari fermentasi bakteri, kapang dan khamir,

seperti Rhizopus delemar, Aspergilus niger, Geotrichum candidum, Candida

rugosa, dan Chromobacterium viscocum (Gandhi, 1997). Lipase berdasarkan

cara kerjanya dibagi menjadi tiga yaitu:

a. Lipase non spesifik yaitu lipase yang dapat mengkatalis seluruh ikatan

ester pada trigliserida

b. Lipase spesifik 1,3 atau 2 yaitu lipase yang dapat mengkatalis trigliserida

pada ikatan 1,3 atau 2

c. Lipase spesifik yaitu lipase yang hanya mengkatalis jenis asam lemak

tertentu (Herawan, 1993).

Menurut Amano Enzyme (2007), lipase dapat mengkatalisis reksi hidrolisis,

sintesis dan transfer reaksi dari trigliserida yang terdiri atas asam lemak dengan

gliserin sebagai substratnya. Spesifisitas substrat lipase dapat diklasifikasikan

sebagai berikut:

10

a. Spesifisitas posisi pada hidrolisis ester

Ketika lipase bekerja pada trigliserida untuk melepaskan asam lemak,

posisi dari ester yang dihidrolisis lipase tergantung pada jenis lipase

yang diaplikasikan. Terdapat tiga macam lipase di mana salah satu tipe

bekerja pada posisi α- dan α’-. Tipe lipase lainnya bekerja pada posisi β

dan tipe yang terakhir bekerja pada ketiga posisi tersebut. Di sini, posisi

pusat trigliserida tempat di mana sisa asam lemak melekat dikenal

sebagai posisi β, sedangkan posisi terluar dikenal sebagai posisi α dan α’.

b. Spesifisitas untuk panjang rantai asam lemak

Panjang rantai asam lemak yang terhubung pada trigliserida yang

direpresentasikan dalam jumlah atom karbon memiliki jumlah atom

karbon bervariasi mulai dari 2 sampai 24 atom karbon. Meskipun lipase

dapat dikategorikan menjadi lipase yang menghidrolisis ester asam

lemak rantai pendek secara efisien dan lipase yang dapat menghidrolisis

ester asam lemak rantai sedang-panjang secara efektif. Hanya saja,

batasan pembagiannya masih belum jelas.

Menurut Halldorsson (2003), lipase dapat digunakan untuk membuat

konsentrat EPA dan DHA dari seluruh bagian komposisinya dengan efisien dan

memiliki yield yang tinggi. Pada umumnya, lipase seperti R. miehei lipase,

memiliki regioselektif pada ikatan 1,3 dan hanya beraksi pada posisi akhir

primer dari gliserol dan transformasi yang melibatkan posisi di tengah

tergantung dari proses migrasi asil yang berlangsung.

Purifikasi asam dokosaheksanoat (DHA) telah diuji coba dengan

menggunakan metode enzimatis dua langkah yang terdiri atas hidrolisis minyak

ikan dan selektif esterifikasi yang menghasilkan asam lemak bebas. Ketika

lebih dari 60% minyak tuna dihidrolisis dengan menggunakan Pseudomonas

sp. Lipase (Lipase-AK), kandungan DHA dalam fraksi asam lemak bebas sama

persis dengan kandungan DHA pada minyak tuna sebelumnya. Enzim lipase ini

menunjukkan aktivitas yang lebih kuat pada ester DHA dibandingkan pada

11

ester asam eikosapentanoat dan sesuai untuk persiapan asam lemak bebas yang

kaya DHA (Shimada, 1997).

Tabel 4. Aktivitas mikrobial dan karakteristik lipased

Jenis Lipase (mikroorganisme

penghasilnya)

Produsen Suhu Optimum

(oC)

pH Optimal

Spesifisitas

Aspergillus niger Amano Enzyme 30-40 5-7 1,3 >>2 Mucor miehei Novo Nordisk 30-45 6,5-7,5 1,3 >>>2

Rhizopus oryzae Amano Enzyme 30-45 5-8 1,3 >>>2 Rhizopus niveus Amano Enzyme 30-45 5-8 1,3 >>>2

Candida cylindracea

Amano Enzyme 30-50 5-8 Random

Chromobacterium viscosum

Asahi Chemicals - - Random

Geotrichum candidum

Amano Enzyme 30-45 6-8 Random

Pseudomonas sp Amano Enzyme 40-60 5-9 Random d Shahidi, et al. (1998).

E. Pelarut Organik

Pelarut merupakan cairan atau gas yang melarutkan padatan, cairan lain

atau gas lain sehingga terbentuk suatu larutan. Pelarut yang umum digunakan

adalah air, sedangkan pelarut lainnya adalah bahan organik yang mengandung

karbon dan dikenal sebagai pelarut organik. Pelarut organik ini biasanya

memiliki titik didih yang rendah dan dapat menguap dengan mudah melalui

proses destilasi, kemudian meninggalkan kandungan bahan lain yang ada di

dalamnya (Wikipedia, the free encyclopedia, 2009b).

Pelarut dapat menyebabkan modifikasi bentuk enzim, yaitu mengubah

efisiensi katalitiknya dan spesifitasnya. Berdasarkan Ueji dan Takashi (1999),

penggunaan media non konvensional akan meningkatkan enantioselektivitas

pada reaksi katalisis oleh biokatalis. Keuntungan lain penggunaan pelarut non

aqueous adalah resiko kontaminasi mikrobial lebih rendah daripada pada sistem

aqueous. Ketertarikan khusus terhadap media non konvensional pada reaksi

hidrolisis dengan kadar air yang rendah dapat digunakan untuk reaksi sintesis

12

yang menyediakan kelarutan yang terbaik pada substrat hidrofobik dengan

lipase sebagai katalis (Krieger et al., 2004).

Stabilitas protein lebih rendah dalam air yang tak larut dalam pelarut yang

ada pada -2,5<logP<0 seperti aseton dan eter daripada pada pelarut hidrofobik

(2<logP<4) seperti alkana atau haloalkana. Pelarut organik hidrofobik tidak

dapat memotong ikatan air dari permukaan enzim. Ketika pelarut organik

memotong air dari enzim, berakibat pada tidak adanya ikatan antara molekul.

Oleh sebab itu, penerimaan stabilitas enzim lipase pada penggunaan pelarut

hidrofilik jarang dilakukan (Krieger et al., 2004).

Peptida dan dan protein merupakan molekul kompleks dimana kelarutannya

pada beberapa pelarut aqueous dan organik harus ditentukan secara empiris.

Karakteristik kelarutannya seperti: crosslinker; pelabelan pelarut biotin dan

flourophore; dan pelarut kimia dapat ditentukan dengan mudah dengan

menghitung nilai log P. Nilai log P merupakan logaritma koefisien partisi (P)

yang didefinisikan sebagai rasio konsentrasi bahan organik dengan bahan

aqueous (Anonim, 2007)

Menurut Herees et al, (2008), stabilitas dan aktivitas enzim merupakan

fungsi dari pelarut organik. Untuk menghitung pengaruh pelarut organik

terhadap aktivitas enzim, digunakan konsep log P. Nilai log P suatu pelarut

merupakan logaritma dari koefisien partisi suatu pelarut di dalam larutan

standar 1-oktanol dan air. Tabel 5 menjelaskan hubungan koefisien partisi

dengan laju reaksi.

Tabel 5. Laju reaksi sebagai fungsi dari pelarute

Pelarut Nilai log P Laju reaksi (x 104 mol L-1s-1) Dekana 5,6 9,33 n-Heptana 4 8,17 n-Heksana 3,5 3,33 Toluena 2,5 2

e Herees et al., (2008)

Karakterisasi pelarut toluena dapat dilihat lebih jelas pada Tabel 6. Pelarut

toluena utamanya dipilih karena sifatnya yang non polar dan memiliki nilai log

P sebesar 2,5.

13

Tabel 6. Karakteristik pelarut toluenaf

Karakteristik Toluena

Rumus kimia C7H8

Sifat Nonpolar

Berat molekul 92,14

Log P 2,5

Titik didih (oC) 110,6

Titik leleh (oC) -93

Densitas (g/mL) 0,867

Kelarutan di dalam air (g/100g) 0,05

Konstanta dielektrik 2,38(25)

Titik nyala (oC) 4 f Myers (2009)

Menurut Klibanov (1986), penggunaan pelarut organik pada reaksi

hidrolisis ester mempunyai beberapa keuntungan selain penggunaan air, yaitu:

a. Substrat organik merupakan bahan yang mudah larut, di mana enzim

tidak dapat larut. Oleh karena itu, produk dan enzim mudah didapatkan

kembali dengan metode non ekstraksi sehingga rendemen produk akan

meningkat.

b. Substrat yang sensitif terhadap air dapat digunakan.

c. Kesetimbangan reaksi berubah, dan ester dan amida dapat dipersiapkan.

d. Enzim lebih stabil pada suhu tinggi ketika air yang dapat menghidrolisis

ikatan peptida enzim tidak ada.

e. Enzim menjadi lebih rigid dan menjadi lebih selektif.

f. Tidak ada pengaruh pH sehingga peralatan yang sederhana dapat

digunakan.

F. Pengaruh Suhu

Suhu dapat berpengaruh positif terhadap reaksi hidrolisis maupun

sebaliknya. Kenaikan suhu akan meningkatkan laju reaksi. Pada reaksi

14

menggunakan suhu tinggi struktur tersier enzim terganggu akibat terjadi

denaturasi. Pada suhu 50oC nilai tingkat konversinya berubah menjadi cukup

rendah. Sedangkan suhu 45oC merupakan suhu optimum reaksi hidrolisis sebab

pada suhu diatas 45oC tingkat konversinya turun secara tiba-tiba dikarenakan

enzim mengalami denaturasi (Kamarudin et al., 2008).

Menurut Lehninger (1982), kestabilan enzim erat kaitannya dengan

komposisi enzim yang umumnya merupakan protein. Protein akan mengalami

denaturasi pada suhu tinggi dan menyebabkan lepasnya ikatan-ikatan sekunder

dan tertier antara asam-asam amino penyusunnya. Bila hal ini terjadi pada

enzim, maka enzim akan mengalami deformasi atau perubahan bentuk yang

akan menyebabkan kerusakan pada sisi aktifnya dan menginaktifkan enzim

tersebut.

Suhu berpengaruh terhadap aktivitas dan stabilitas enzim lipase, suhu yang

sesuai untuk penggunaan enzim lipase sebagai katalis adalah dibawah 70oC

karena pada suhu tinggi menyebabkan terjadinya migrasi alkil secara non-

enzimatik, oksidasi, isomerisasi dan denaturasi enzim (Wanasundara dan

Shahidi, 1998).

Suhu juga berpengaruh terhadap kecepatan reaksi pembentukan asam

lemak bebas. Peningkatan suhu reaksi pada reaksi hidrolisis akan mempercepat

kenaikan konsentrasi asam lemak bebas, memperbesar penurunan konsentrasi

air, atau dengan kata lain dapat menaikkan hasil konversi. Karena dengan

naiknya suhu reaksi, maka suplai energi untuk mengaktifkan katalis dan

terjadinya tumbukan antar pereaksi untuk menghasilkan reaksi juga akan

bertambah, sehingga produk yang dihasilkan menjadi lebih banyak. Nilai

konstanta kecepatan reaksi (k) naik dengan kenaikan suhu reaksi (rata-rata

kenaikannya 2 kali dari nilai awal), hal ini sesuai dengan teori Arrhenius dan

pernyataan Westerterp (1984), bahwa kenaikan suhu akan menaikan nilai

konstanta kecepatan reaksi, di mana kenaikan 10°C suhu reaksi menaikan

konstanta kecepatan reaksi sebanyak 2 kali dari nilai awal. Sedangkan apabila

suhu reaksi yang digunakan terlalu rendah maka laju reaksi berjalan lambat

akibatnya tumbukan antar pereaksi rendah dan minyak tidak terhidrolisis secara

15

sempurna. Hidrolisis yang berlangsung secara tidak sempurna akan

menyebabkan lebih sedikitnya produk yang terbentuk atau asam lemak bebas

hasil reaksi hidrolisis menjadi berkurang jumlahnya dibandingkan dengan

reaksi sebenarnya.

G. Pengaruh pH

Enzim sangat sensitif terhadap perlakuan medium pH, karena

memungkinkan perubahan status ionisasi enzim, yang akan mempengaruhi

aktivitas dan selektifitas. Menurut Lehninger (1982), profil aktivitas pH enzim

menggambarkan pH pada saat gugus pemberi atau penerima proton yang

penting pada sisi katalitik enzim berada dalam tingkat ionisasi yang diinginkan.

pH optimum enzim tidak perlu sama dengan pH lingkungan normalnya.

Worthington Biochemical Corporation (2009) juga menyatakan bahwa nilai pH

yang terlalu tinggi atau terlalu rendah akan berakibat pada turunnya aktivitas

sebagian besar enzim. pH juga merupakan faktor yang mempengaruhi stabilitas

enzim.

Berdasarkan Stauffer (1989), ketertarikan studi mengenai tingkat enzim

sebagai fungsi pH dikarenakan karena beberapa faktor yaitu :

a. Status protonasi sisi rantai asam amino pada sisi aktif kompleks enzim

substrat (ES) mungkin akan berubah. Hasilnya perubahan

kemampuan enzim substrat untuk menjadi produk.

b. Perubahan ionik molekul substrat atau perubahan ionik sisi aktif yaitu

kecenderungan dua molekul tersebut unutk menjadi kompleks ES.

c. Perubahan pH dari netral yang memungkinkan melemahkan kekuatan

stabilitas bentuk protein, yang berakibat peningkatan denaturasi

enzim (kehilangan aktivitas).

Berdasarkan studi Microbial Lipase Potential Biocatalist for the future

industry, titik isoelektrik lipase adalah 4,3. Stabilitas lipase berada pada pH 6-

7,5.

16

H. Pengaruh Penambahan Air

Laju reaksi hidrolisis membutuhkan sejumlah air. Namun, terlalu banyak

air akan berakibat pada reaksi hidrolisis trigliserida yang berlebihan yang

berakibat pada peningkatan asam lemak bebas dan gliserida parsial

(monogliserida dan digliserida). Sedikit air baik untuk reaksi transesterifikasi.

Pengaturan kadar air pada sistem ini menjadi sangat penting karena semua

proses didasarkan pada termodinamika dari kesetimbangan reaksi kimia yang

bersifat bolak-balik di mana air berperan penting. Selain itu, air diperlukan

untuk integritas tiga dimensi struktur molekul enzim. Oleh sebab itu, aktivitas

lipase merupakan fungsi dari kadar air. Salah satu hipotesa menyatakan bahwa

dimensi molekul enzim membutuhkan lapisan hidrasi sedikit yang akan

bereaksi sebagai komponen utama pada enzim microenvironment pada media

organik. Lapisan ini akan bertindak sebagai buffer di antara permukaan enzim

dan media reaksi (Dordick, 1989).

Menurut Herees et al, (2008), enzim lipase cenderung bekerja pada

permukaan antar cairan (liquid-liquid interface) dibandingkan dengan suatu

titik tertentu di dalam campuran reaksi. Penggunaan bahan yang dapat

menggabungkan senyawa-senyawa yang akan bereaksi pada reaksi hidrolisis

akan membantu meningkatkan aktivitas dari enzim lipase yang digunakan.

Klibanov (1986) menyatakan bahwa sedikit air diperlukan untuk mencapai

aktivitas maksimal pada pelarut hidrofobik daripada pelarut hidrofilik. Pada

aktivitas kadar air yang rendah, semakin rendah polaritas suatu pelarut

menyebabkan semakin tingginya aktivitas enzim. Ketika aktivitas katalitik

enzim diplotkan terhadap jumlah air yang terikat dengan enzim, suatu pola

muncul untuk beberapa pelarut yang berbeda. Salah satunya dapat disebutkan

bahwa aktivitas enzimatik pada media organik ditentukan bukan oleh interaksi

pelarut dengan enzim tetapi oleh keberadaan air dalam enzim.

Selain itu, rumus terjadinya reaksi hidrolisis menurut NN. Gandhi (1996)

dapat dilihat pada Gambar 3.

RCOOR’ + H2

Gambar 3. Reaksi hidrolisis pada senyawa ester

O RCOOH + R’OH

17

Berdasarkan Gambar 3, dapat dilihat bahwa reaksi hidrolisis membutuhkan

satu molekul air setiap kali melepaskan satu gugus alkil dari senyawa esternya.

Hal ini menunjukkan bahwa penambahan air diperlukan untuk menyediakan

pereaksi yang diperlukan agar terjadi reaksi hidrolisis dari minyak ikan yang

digunakan. Tanpa adanya air di dalam campuran reaksi, maka tidak akan terjadi

reaksi hidrolisis.