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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CAROLINA VIEIRA VIÊGAS
"PRODUÇÃO DE BIODIESEL E DE COPRODUTOS A PARTIR DE MICROALGAS COMERCIAIS:
ABORDAGEM DE BIORREFINARIA"
Rio de Janeiro, Agosto de 2015
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CAROLINA VIEIRA VIÊGAS
"PRODUÇÃO DE BIODIESEL E DE COPRODUTOS A PARTIR
DE MICROALGAS COMERCIAIS: ABORDAGEM DE BIORREFINARIA”
Tese submetida ao Corpo Docente da Coordenação do Programa de Pós-graduação da Escola de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em Ciências em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos.
Orientadores:
Donato A. Gomes Aranda, DSc.
Suely Pereira Freitas, DSc.
Leonardo Brantes Bacellar Mendes,DSc.
RIO DE JANEIRO, Agosto de 2015
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Viêgas, Carolina Vieira Produção de biodiesel e de coprodutos a partir de microalgas comerciais: abordagem de biorrefinaria / Carolina Vieira Viêgas. – 2015. Tese (Doutorado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) –Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Química, Rio de Janeiro, 2015. 155 f.: il. Orientadores: Donato A. Gomes Aranda, DSc; Suely Pereira Freitas, DSc.; Leonardo Brantes Bacellar Mendes,DSc 1. Microalgas 2. Biorrefinarias. 3. Biodiesel – Teses. I. Aranda, Donato Alexandre Gomes (Orient.). II. Freitas, Suely Freitas (Orient). Mendes, Leonardo Brantes Bacellar (Orient). Universidade Federal do Rio de Janeiro, Programa em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, Escola de Química. V. Título.
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“PRODUÇÃO DE BIODIESEL E DE COPRODUTOS A PARTIR DE MICROALGAS COMERCIAIS: ABORDAGEM DE BIORREFINARIA”
Carolina Vieira Viêgas
Tese apresentada ao Corpo Docente da Coordenação do Programa de Pós-graduação da Escola de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em Ciências em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos.
Aprovada por:
________________________________________________________ Donato Alexandre Gomes Aranda, D. Sc., EQ/UFRJ.
________________________________________________________ Suely Pereira Freitas, D.Sc., EQ/UFRJ
________________________________________________________
Leonardo Brantes Bacellar Mendes, DSc, CENPES/PETROBRAS
________________________________________________________
Joaquin Ariel Morón Villareyes, D.Sc., EQA/FURG
________________________________________________________
Neusa Pereira Arruda, D.Sc., IFRJ
________________________________________________________
Jussara Lopes de Miranda, D.Sc., IQ/UFRJ
________________________________________________________
Ana Lúcia do Amaral Vendramini, D.Sc., EQ/UFRJ
________________________________________________________
Fabiana Valéria da Fonseca D.Sc., EQ/UFRJ
v
Dedico esta tese aos meus amores infinitos:
Cláudia, Antônio, Giulliane e
Leonardo.
vi
“...Queda prohibido llorar sin aprender, levantarme un día sin saber qué hacer,
tener miedo a mis recuerdos, sentirme sólo alguna vez.
Queda prohibido no sonreír a los problemas, no luchar por lo que quiero,
abandonarlo todo por tener miedo, no convertir en realidad mis sueños.
Queda prohibido no demostrarte mi amor, hacer que pagues mis dudas y mi mal humor,
inventarme cosas que nunca ocurrieron, recordarte sólo cuando no te tengo.
Queda prohibido dejar a mis amigos, no intentar comprender lo que vivimos,
llamarles sólo cuando les necesito, no ver que también nosotros somos distintos.
Queda prohibido no ser yo ante la gente, fingir ante las personas que no me importan,
hacerme el gracioso con tal de que me recuerden, olvidar a toda la gente que me quiere.
Queda prohibido no hacer las cosas por mí mismo, no creer en mi dios y hacer mi destino, tener miedo a la vida y a sus castigos,
no vivir cada día como si fuera un último suspiro. Queda prohibido echarte de menos sin alegrarme,
olvidar los momentos que me hicieron quererte, todo porque nuestros caminos han dejado de abrazarse,
olvidar nuestro pasado y pagarlo con nuestro presente. Queda prohibido no intentar comprender a las personas,
pensar que sus vidas valen más que la mía, no saber que cada uno tiene su camino y su dicha,
pensar que con su falta el mundo se termina. Queda prohibido no crear mi historia,
dejar de dar las gracias a mi familia por mi vida, no tener un momento para la gente que me necesita,
no comprender que lo que la vida nos da, también nos lo quita”
Pablo Neruda
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AGRADECIMENTOS
Ao professor Donato Alexandre Aranda pela oportunidade de aprender sempre mais, pela amizade, troca constante de conhecimento, por ter acreditado no meu trabalho e pelas críticas e sugestões relevantes feitas durante a orientação. À querida amiga, professora e orientadora Suely Freitas por sua infinita paciência e bondade. Por tardes maravilhosas de troca de conhecimento, pela ajuda nos momentos em que mais precisei sua participação foi fundamental para a realização deste trabalho. Aos professores da Banca Examinadora pela disponibilidade de tempo e por terem aceitado o convite; Aos professores do curso de Tecnologia de processos químicos e bioquímicos da UFRJ que de uma forma ou de outra me ajudaram na construção do meu conhecimento. Aos meus alunos de iniciação científica, especialmente Filipe Fontes e Débora Cristina pela competência e seriedade na realização dos experimentos. Aos colegas do laboratório GREENTEC que sempre estiveram ao meu lado para me ajudar, em especial: Carla Cristina Pereira, Ana Paula da Silva, Leonard Carvalho, Cristiane Gorgônio, Vinícius Rosa e Tiago Bolognini. Com vocês os dias de trabalho foram muito agradáveis e alegres. À Mariana Fortes por toda amizade, companheirismo e muitas aventuras compartilhadas. Todos os momentos que vivemos foram inesquecíveis. À Yordanka Reyes e família por todo incentivo e ajuda, serei sempre grata. A Abo Akademy, Universidade finlandesa que tão bem me recepcionou durante o tempo de intercambio, levarei sempre comigo este lugar maravilhoso. Aos queridos Dmitry Murzin, Paiivi Maki-Arvela, Nareendra Kumar e Imane Ha por toda a experiência vivida e conhecimento adquirido. Ao meu avô Antônio (in memorian), grande incentivador de meus estudos. A Capes, CNPq e PETROBRÁS pelo apoio financeiro. Ao meu marido Leonardo Mendes por todo seu carinho, paciência, compreensão, companheirismo e amor. Minha vida tem outro sentido ao teu lado. À minha amada família pela força e incentivo por não me deixarem desistir jamais. Vocês são a minha vida.
A todos que de uma forma ou de outra contribuíram para a minha formação pessoal e profissional, a vocês meus queridos amigos, que Deus os abençoe. Muito obrigada!
viii
APRESENTAÇÃO DO TRABALHO
Esta tese de doutorado é composta por sete capítulos, sumarizados a seguir:
- O Capítulo 1 apresenta a motivação que levou ao desenvolvimento deste
trabalho, que envolve o desenvolvimento de tecnologias que permitam o
processamento da biomassa de microalgas para produzir ésteres metílicos e outros
compostos de alto valor agregado. Incluindo uma breve introdução sobre o tema.
- No Capitulo 2 estão detalhados os objetivos deste trabalho.
-No Capitulo 3 está descrita a justificativa deste trabalho
- O Capítulo 4 está constituído do referencial teórico necessário para a
realização deste trabalho, temas como: microalgas, química dos lipídeos, métodos de
extração, produção de biodiesel, antioxidantes, açúcares e proteínas. Dentro do
contexto são descritos seus aspectos tecnológicos, ambientais e econômicos.
- O Capítulo 5 refere-se aos materiais e métodos utilizados, definindo-se os
métodos analíticos bem como a metodologia adotada para o desenvolvimento da
tese.
- No Capítulo 6, são apresentados, avaliados e discutidos os resultados do
estudo experimental desenvolvido nesta pesquisa e comparados com os dados
disponíveis na literatura.
- Com base nos resultados relevantes do capítulo anterior, reportam-se no
Capítulo 7 as conclusões principais deste estudo.
Na sequência apresentam-se as sugestões para os próximos trabalhos e
finalmente, citam-se as diversas referências bibliográficas (livros, páginas da internet,
artigos publicados em periódicos internacionais) consultadas para elaboração deste
documento bem como os anexos.
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CONGRESSOS E EVENTOS:
VIÊGAS, C. V.; MAKI-ARVELA, P.; FONTES. F. B.; KUMAR, N.; MURZIN, D.; ARANDA, D.A.G.; FORTES, M.M.;FREITAS, S. P.; Production of Biodiesel and Co-Products with High Added Value from Commercial Microalgae. 8th Annual Algae Biomass Summit. San Diego, California (EUA).Setembro.2014 VIÊGAS, C. V.; MAKI-ARVELA, P.; HA, E FONTES. F. B.; KUMAR, N.; MURZIN, D.; ARANDA, D.A.G.; FORTES, M.M.;FREITAS, S. P.;“Production of Biodiesel from Microalgae Chlorella sp. by in situ Transesterification”. 7th Annual Algae Biomass Summit. Orlando (EUA). Setembro. 2013. VIÊGAS, C. V.; FORTES, M. M.; CRUZ, Y.R.; DÍAZ, G. C.; ARANDA, D.A.G.; GORGÔNIO, C. M. S.; GOMES, M. M. R.; CARVALHO, L.; Development of Photobioreactors for Microalgae Cultivation With the Aim to Produce Biodiesel. 6th Annual Algae Biomass Summit. Denver (EUA). Setembro. 2012. VIÊGAS, C. V.; MAKI-ARVELA, P.; FONTES. F. B.; KUMAR, N.; MURZIN, D.; ARANDA, D. A.G.; FORTES, M. M.; Biodiesel and Green Diesel from Algae: In situ Transesterification of Chlorella to biodiesel, its caracterization catalytic desoxygenation to green Diesel. 12th Euro Feed Congress, Oils fats from lipdomics to industrial Innovation. Montpellier-França. Setembro. 2014 VIÊGAS, C. V.; FORTES, M. M.; HA, E.; MAKI-ARVELLA, P.; MURZIN, D.; SOUZA, M.F.; FREITAS, S. P., ARANDA, D. A. G.; Extraction and identification of the sugars from the microalgae Chlorella. 4th International Conference on Algal Biomass, Biofuels & Bioproducts. 15 – 18 June 2014 Santa Fe Convention Center, New Mexico, USA VIÊGAS, C. V.; ARANDA, D. A. G.; FORTES, M. M. FREITAS, S. P.; FONTES, F. B.; PEREIRA. D. C. S.; Extração de ácidos graxos in situ e obtenção de luteína a partir de microalgas. IV Congresso Latino-Americano de Biotecnologia de Algas e IV Workshop da Redealgas Florianópolis-SC. Novembro 2013. (Congresso). FORTES, M. M.; VIÊGAS, C. V.; ARANDA, D. A. G.; HA, E.; MAKI-ARVELLA, P.; MURZIN, D.; KUMAR, N.; USO DE ZEÓLITA BETA PARA DESOXIGENAÇÃO DE ÉSTERES METÍLICOS OBTIDOS A PARTIR DE MICROALGAS PARA A PRODUÇÃO HIDROCARBONETOS NA FAIXA DO DIESEL. 17 Congresso Brasileiro de Catálise VII Congresso de Catálise do Mercosul. Gramado-RS. 2013. FORTES, M. M.; VIÊGAS, C. V.; ARANDA, D. A. G.; DÍAZ, G. C.; CRUZ, Y. R.; CARVALGO, L. G.; GORGONIO, C. M. S.; GOMES, M. R.;5. Desenvolvimento de Fotobiorreatores para o Cultivo de Microalgas com o Objetivo de Produzir Biodiesel. Congresso da Rede Brasileira de Tecnologia de Biodiesel 8º Congresso Brasileiro de Plantas Oleaginosas, Óleos, Gorduras e Biodiesel. Salvador-BA. 2012. VIÊGAS, C. V.; FORTES, M. M.; ARANDA, D. A. G.; DÍAZ, G. C.; CRUZ, Y. R.; CARVALGO, L. G.; GORGONIO, C. M. S.; GOMES, M. M. R.; Produção de FAMEs através do processo de hidroesterificação a partir dos ácidos graxos da Scenedesmus
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dimorphus. Congresso da Rede Brasileira de Tecnologia de Biodiesel 8º Congresso Brasileiro de Plantas Oleaginosas, Óleos, Gorduras e Biodiesel. Salvador-BA. 2012. FONTES, F. B.; PEREIRA. D. C. S.; VIÊGAS, C. V.; D.; ARANDA, D. A. G.; FREITAS, S. XXXIV Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Tecnológica, artística e Cultural. Efeito dos principais Parâmetros na extração dos lipídeos da microalga Chlorella sp. visando a produção de biodiesel. Rio de Janeiro-RJ.2012. HAKALIN, N. L. S.; PAZ, A. P.; VIÊGAS, C. V.; GOMES, M. M. R.; ARANDA, D. A. G.; MORAES, L. M. P.; II Simpósio Brasileiro do Potencial Energético das Microalgas. Cultivo de Nannochloropsis Oculata para Produção de biodiesel. Natal-RN. 2012. FORTES, M. M.; VIÊGAS, C. V.; ARANDA, D. A. G.; ARCEO, A.; DIAZ, G. C.; II Simpósio Brasileiro do Potencial Energético das Microalgas.Estudo de processos de produção de Biodiesel utilizando biomassa algal como matéria-prima. Natal-RN. 2012.
ARTIGOS PUBLICADOS
DÍAZ, G. C.; CRUZ, Y. R.; FORTES, M. M.; VIÊGAS, C. V.; CARLIZ, R.G.; FURTADO, N. C.; ARANDA, D.A.G.; Primary Separation of Antioxidants (Unsaponifiables) the Wet Biomass Microalgae Chlamydomonas sp. and Production of the Biodiesel. Natural Science (Online), 6,1210-1218, 2014. VIÊGAS, C. V.; ARANDA, D. A. G.; GOMES, M.; Potencial energético das microalgas. Agroenergia em revista ed. 5, p. 36 - 37, 08 dez. 2012. VIÊGAS, C. V. ; ARANDA, D. A. G HACHEMI, H.;FREITAS, S. P.; MÄKI-ARVELA, P; AHO, A.; HEMMING, J.; SMEDS, A.;HEINMAA, I.; FONTES, F. B.; PEREIRA. D. C. S.; KUMAR, N.; MURZIN D. Y.; A route to produce renewable diesel from algae: Synthesis and characterization of biodiesel via in situ transesterification of Chlorella alga and its catalytic deoxygenation to renewable diesel. Fuel, 5 (1), 144–154, 2015. TKACHEVA, A.; DOSMAGAMBETOVA, I.; CHAPELLIE, Y.; MÄKI-ARVELA, P.; HACHEMI, I.; SAVELA, R.; LEINO, R.; VIÊGAS, C.; KUMAR, N.; ERÄNEN, K.; HEMMING, J.; SMEDS, A.; MURZIN, D. Y.; Pharmaceuticals and Surfactants from Alga Derived Feedstock: Catalytic Amination Fatty Acids and their Derivatives with Amino Alcohols over Heterogeneous Catalysts. ChenSusChem, in press. 2015 VIÊGAS, C. V.; ARANDA, D. A. G HACHEMI, H.; FREITAS, S. P.; MÄKI-ARVELA, P.;
KUMAR, N.; MURZIN D. Y PARANKO, J.; PEURLA, M.; FORTES, M. M.; GORGONIO, C..; CARBONETTI, G.; ARANDA, D. A. G.; Algal products beyond lipids: Comprehensive characterization of different products in direct saponification of green alga Chlorella sp. Algal Reserach, 11, 156-164, 2015. MIRANDA, C. T.; COSTA, S. M.; PINTO, R. F.; LIMA, V. M.; VIÊGAS, C, V.; AZEVEDO, S M. F. O.; Microalgae lipid and biodiesel production: a Brazilian challenge. American Journal of plant research, in press. 2015
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ESTÁGIOS SUPERVISIONADOS E INCIAÇÂO CIENTÍFICA
Searitha Couto. Extração de Lipídeos de microalgas comerciais em reator tipo autoclave. 2012. Iniciação científica. Graduando em Química. Universidade do Grande Rio. Filipe Batista Fontes. Obtenção de Carotenoides e ácidos graxos in situ a partir de microalgas comerciais. 2012. Iniciação científica. Graduando em Engenharia Química. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Rodrigo Tackaert. Produção de Biodiesel in situ a partir de microalgas. 2012 – Estágio supervisionado. Graduando em Engenharia Química. Universidade de São Diego-Califórnia-USA. Rony Szuster. Extração de lipídeos de microalgas em microondas. 2012. Iniciação Científica - Universidade Federal do Rio de Janeiro. Débora Cristina Pereira. Identificação e caracterização da fração insaponificável da fração graxa da microalga Chlorella. 2012. Iniciação Científica. (Graduando em Química) - Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro. Rodrigo Gouvêa. Extração de açúcares e extração de óleo da biomassa residual de Chlorella. 2011. Iniciação Científica. Graduando em Engenharia de Alimentos - Universidade Federal do Rio de Janeiro. Luciana Reis. Extração e caracterização da fração Graxa extraída com etanol da Chlorella sp. 2011. Iniciação Científica. Graduando em Química Industrial - Universidade Federal do Rio de Janeiro.
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RESUMO
Título: Produção de biodiesel e de coprodutos de alto valor agregado a partir de microalgas comerciais Autor: Carolina Vieira Viêgas Orientadores: Prof. Dr. Donato Alexandre Gomes Aranda, Profª. Drª. Suely Pereira Freitas e Dr. Leonardo Brantes Bacellar Mendes
As microalgas apresentam diversas vantagens de cultivo quando comparadas as oleaginosas convencionais, por exemplo: não necessitam de terras agriculturáveis podem ser utilizadas residuais industriais para seu crescimento. A valorização da biomassa de microalgas tem sido relatada na literatura como uma das mais promissoras fontes para obtenção de diferentes produtos de interesse industrial como lipídeos (ácidos graxos e carotenoides) proteínas e fibras. Este trabalho teve como objetivo o aproveitamento da biomassa de Chlorella para obtenção de compostos para fins alimentíceos, energéticos e nutracêuticos visando à aplicação do conceito de biorrefinaria. Dentro deste contexto, a biomassa liofilizada de Chlorella comercial foi caracterizada por microscopia eletrônica de transmissão, espectroscopia de raio-X por dispersão de energia, análise elementar (CHNSO), espectroscopia de infravermelho e cromatografia de exclusão de tamanho. Foram determinados a partir dessa biomassa os principais açúcares bem como o teor de proteínas e identificação dos aminoácidos. Foram obtidos aproximadamente 60 % de proteínas totais determinada a partir do método de Kjeldahl, sendo o ácido glutâmico o aminoácido identificado em maior quantidade (11,53 %). Para extração de lipídeos da biomassa liofilizada de Chlorella sp. foi conduzido um estudo comparativo, aplicando-se ou não diferentes procedimentos para rompimento celular em reator tipo autoclave ou em moinho de bolas. Seguido da extração com solventes de diferentes polaridades (clorofórmio:metanol (2:1 v/v), etanol, metanol e hexano) e submetendo a mistura à agitação magnética. Os melhores resultados foram obtidos da mistura clorofórmio:metanol (2:1 v/v) sem pré-tratamento, foram extraídos em média, a partir da biomassa liofilizada, 12 % de lipídeos totais. Este valor aumentou para cerca de 14 % quando a amostra foi submetida ao pré-tratamento em moinho de bolas sendo comparável ao resultado obtido na presença de etanol sob pressão em reator tipo autoclave (14 %). A fração lipídica apresentou alto teor de ácidos graxos livres e atividade antioxidante. A obtenção dos ésteres metílicos foi conduzida a partir do método in situ, no qual se variou a concentração de H2SO4, a temperatura e o tempo. A presença dos ácidos graxos 14:0, 16:0, 18:0, 18:1, 18:2 e 18:3 foram confirmados por cromatografia gasosa. A partir de 100 gramas de biomassa foi possível obter, aproximadamente 7 gramas de ésteres metílicos purificado. Os ésteres metílicos foram caracterizados por infravermelho, calorimetria exploratória, viscosidade, densidade , teor de água , índice de iodo , teor de éster e estabilidade oxidativa, entre outras. Além da extração dos lipídeos da biomassa, também foi realizada a saponificação in situ, a partir da biomassa seca, com diferentes concentrações de KOH para a separação da matéria insaponificável e fração saponificável. Foi possível obter aproximadamente 2 % de matéria insaponificável, rica em carotenoides principalmente luteína, composto tradicionalmente usado na formulação de fitoterápicos. A atividade antioxidante da fração insaponificável foi avaliada pelo método de DPPH bem como a capacidade antioxidante dessa fração testada como antioxidante natural em um biodiesel de soja. A fração saponificável apresentou uma composição rica em ácidos graxos e ésteres etílicos. Visando a possível utilização
xiii
das tortas geradas neste trabalho foram obtidas quantidades entre 61 - 21 % de proteínas nessas frações. Os resultados indicaram que a biomassa de microalgas pode vir a ser uma fonte promissora para produção de biodiesel e obtenção simultânea de diferentes compostos de alto valor comercial.
xiv
ABSTRACT Title: Biodiesel production and co-products from commercial microalgae Author: Carolina Vieira Viêgas Coordinators: Prof. Dr. Donato Alexandre Gomes Aranda, Profª. Drª. Suely Pereira Freitas e Dr. Leonardo Brantes Bacellar Mendes Microalgae have several advantages cultivation compared to conventional oil, for example, don’t require agricultural land can be used for industrial waste their growth. The appreciation of microalgae biomass has been reported in the literature as one of the most promising sources for obtaining different products of industrial interest as lipids (fatty acids and carotenoids) protein and fiber. This study aimed to the use of Chlorella biomass to obtain compounds for food purposes, energy and nutraceuticals aimed at implementing the concept of biorefinery. In this context, the lyophilized biomass commercial Chlorella was characterized by transmission electron microscopy, X-ray spectroscopy, energy dispersive, elemental analysis (CHNSO), infrared spectroscopy and size exclusion chromatography. It was determined from this biomass the main sugars as well as protein content and identification of amino acids. They were obtained approximately 60% total protein determined from the Kjeldahl method, and the glutamic acid amino acid identified in the greatest amount (11.53%). For lipid extraction from lyophilized biomass Chlorella sp. a comparative study was conducted by applying or not different procedures for cell disruption in reactor type autoclave or ball mill. Followed by extraction with polarities different solvents (chloroform: methanol (2: 1 v / v), ethanol, methanol and hexane) and subjecting the mixture to magnetic stirring. The best results were obtained in chloroform: methanol (2: 1 v / v) without pretreatment was extracted on average from lyophilized biomass, 12% of total lipids. This value increased to about 14% when the sample was subjected to pre-treatment in the ball mill being comparable to the result obtained in the presence of ethanol under pressure in an autoclave type reactor (14%). The lipid fraction showed a high content of free fatty acids and antioxidant activity. Obtaining the methyl esters was conducted from the in situ method in which was varied the concentration of H2SO4, temperature, and time. The presence of fatty acids 14:0, 16: 0, 18:0, 18:1, 18:2 and 18:3 was confirmed by gas chromatography. From 100 grams of biomass was possible to obtain approximately 7 grams of purified methyl esters. The methyl esters were characterized by infrared, scanning calorimetry, viscosity, density, water content, iodine value, ester content and oxidative stability, among others. In the extraction of lipids from the biomass, it was also made in situ saponification, the dried biomass with different concentrations of KOH for the separation of the unsaponifiable material and saponifiable fraction. It was possible to obtain about 2% of unsaponifiable matter, rich in carotenoids lutein mainly composed traditionally used in herbal formulation. The antioxidant activity of the unsaponifiable fraction was evaluated by DPPH method and the antioxidant capacity of this fraction tested as a natural antioxidant in a soy biodiesel. The saponifiable fraction had a rich composition of fatty acids and ethyl esters. With a view to possible use pies generated in this study were obtained amounts between 61-21% protein in these fractions. The results indicated that the biomass of microalgae can prove to be a promising source for biodiesel production and simultaneous obtaining of different compounds with a high commercial value.
xv
LISTA DE SIGLAS
AGL-Ácidos graxos livres AGP- Ácidos Graxos Poliinsaturados ANP- Agência nacional do Petróleo AOCS- American Oil Chemists' Society ASTM - American society for testing and materials ATG- Análise termogravimétrica BSTFA- N,O-Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida CED- Calorimetria exploratória diferencial CENPES- Centro de pesquisas e desenvolvimento Miguez de Mello CET- Cromatografia de exclusão de tamanho CG- Cromatografia gasosa CHNSO – Carbono, Hidrogênio, Nitrogênio, Enxofre e Oxigênio CLAE- Cromatografia líquida de alta eficiência DHA- Ácido docosahexaenóico DIC- Detector de ionização de chama DPPH- 2,2-difenil-1-picrilhidrazil EDX-Espectroscopia de raios-X por dispersão de energia EMAG – Ésteres metílicos de ácidos graxos EN – European Standard EPA- Ácido eicosapentaenóico GREENTEC- Laboratório de Tecnologia verdes FTIR- Infravermelho com transformada de Fourier IV- Infravermelho MET- Microscopia eletrônica de transmissão MI- Material insaponificável PEFF – Ponto de entupimento de filtro a frio RANP- Resolução ANP (Agência Nacional de Petróleo) RPM- Rotações por minuto TMCS- Trimethylsilyl chloride
xvi
LISTA DE FIGURAS
Figura 4.1:
Fotobiorreatores verticais em operação no terraço do Núcleo de Biocombustíveis-UFRJ.....................................
12
Figura 4.2 Sistema de cultivo de microalgas em tanques abertos. Planta piloto da PETROBRAS localizada em Extremoz-RN......................................................................................
13
Figura 4.3:
Diferentes estruturas lipídicas encontradas nas microalgas..........................................................................
21
Figura 4.4:
Ilustração do mecanismo de extração com solvente orgânico em microalgas....................................................
25
Figura 4.5:
Algumas estruturas de carotenoides e xantofilas encontradas nas microalgas..............................................
33
Figura 4.6:
Fontes de biomassa........................................................... 34
Figura 4.7:
Biocombustíveis de microalgas: Gasosos e Líquidos.............................................................................. .
35
Figura 4.8:
Esquema simplificado do processo convencional para produção de Biodiesel.......................................................
36
Figura 4.9:
Produção de biodiesel de microalgas.............................. 37
Figura 4.10:
Microalga Biorrefinaria: Conceito: Produção e Valorização.........................................................................
41
Figura 5.1:
A) Biomassa de Chlorella liofilizada. B) Fotomicrografia da biomassa liofilizada de Chlorella (aumento de 200x)...................................................................................
44
Figura 5.2:
Diagrama simplificado para caracterização da biomassa, separação e quantificação dos diferentes compostos e obtenção do biodiesel........................................................
45
Figura 5.3:
Diagrama para extração dos lipídeos da biomassa de Chlorella.............................................................................
50
Figura 5.4:
Esquema simplificado para obtenção dos ésteres metílicos via transesterificação in situ...............................
56
Figura 6.1:
A) e B) Fotomicrografia realizada com microscopia eletrônica de transmissão a partir da Chlorella liofilizada.............................................................................
65
xvii
Figura 6.2:
Espectro de Infravermelho para microalga liofilizada de Chlorella..............................................................................
66
Figura 6.3: Fração lipídica extraída com clorofórmio:metanol (2:1 v/v)......................................................................................
72
Figura 6.4:
Espectro de Infravermelho da fração lipídica extraída com clorofórmio:metanol (2:1 v/v)...................................
76
Figura 6.5:
Espectro de Infravermelho da fração lipídica extraída com hexano........................................................................
76
Figura 6.6:
Espectro de infravermelho da fração insaponificável..... 78
Figura 6.7:
Cromatograma de CLAE para identificação dos carotenoides presentes na material insaponificável....................................................................
79
Figura 6.8: Avaliação da significância dos parâmetros no processo de extração dos lipídeos em reator tipo autoclave e etanol..................................................................................
82
Figura 6.9:
Espectro de infravermelho da fração etanólica............... 82
Figura 6.10:
Avaliação da significância dos parâmetros tempo e temperatura na eficiência da transesterificação in situ....
86
Figura 6.11:
Aspectos visuais dos ésteres A) metílicos Bruto e B) purificados em argila........................................................
87
Figura 6.12:
Espectro de infravermelho dos ésteres metílicos da Chlorella..............................................................................
88
Figura 6.13:
Termograma de CED para o biodiesel. Nota: pico exotérmico (gráfico cor preta) e pico endotérmico (gráfico cor vermelha)......................................................................
89
Figura 6.14: Tempo de indução dos ésteres metílicos da Chlorella..... 93
Figura 6.15:
Espectro de infravermelho da matéria insaponificável obtida in situ........................................................................
95
Figura 6.16:
Cromatograma de CLAE para identificação dos carotenoides presentes na fração insaponificável da Chlorella sp.........................................................................
96
Figura 6.17:
Material insaponificável da Chlorella obtida in situ (produto 1)..........................................................................
96
Figura 6.18: Mistura de ácidos graxos e ésteres graxos da fração
xviii
saponificável (produtos 2)...................................................
99
Figura 6.19: Espectro de FTIR da fração saponificável (produto 2).....
99
Figura 6.20:
Biomassa residual obtida após a extração dos lipídeos...............................................................................
101
Figura 6.21: Cromatograma obtido a partir da análise de CET da biomassa residual do processo de transesterificação in situ (linha vermelha) e biomassa liofilizada (linha azul)...................................................................................
102
Figura 6.22: Fotomicrografia obtida a partir de A) microalga liofilizada;B) microalga após a transesterificação in situ......................................................................................
102
Figura 6.23: Fotomicrografia obtida a partir da biomassa residual após a saponificação in situ........................................................
103
Figura 6.24: Diagrama de operações aplicadas na biomassa de Chlorella para obtenção de diferentes produtos: biorrefinaria................................................................
104
xix
LISTA DE TABELAS
Tabela 4.1:
Comparativo da produtividade de óleo entre microalgas e oleaginosas convencionais.....................
7
Tabela 4.2:
Produtividade de lipídeos e biomassa de alguns gêneros de microalgas.................................................
8
Tabela 4:3:
Composição centesimal de algumas microalgas tendo como base a biomassa seca (%)......................
9
Tabela 4.4:
Produção comercial de microalgas e aplicações biotecnológicas..............................................................
10
Tabela 4.5:
Teor de proteínas de algumas de microalgas.............. 15
Tabela 4.6:
Composição de aminoácidos essenciais de alguns alimentos e microalgas.................................................
17
Tabela 4.7:
Composição da parede celular e produtos de estocagem das principais divisões de microalgas.......
18
Tabela 4.8:
Teor de carboidratos de diferentes gêneros de microalgas....................................................................
19
Tabela 4.9:
Composição de açúcares (%) de microalgas de diferentes gêneros........................................................
19
Tabela 4.10:
Composição dos lipídeos (%) encontrados em algumas microalgas.....................................................
21
Tabela 4.11:
Perfis de ácidos graxos de diferentes microalgas e oleaginosas convencionais..........................................
22
Tabela 4.12:
Composição da fração lipídica de acordo com o solvente extrator...........................................................
24
Tabela 4.13:
Técnicas de rompimento celular.................................. 28
Tabela 4.14:
Fração insaponificável de óleos vegetais..................... 31
Tabela 4.15:
Comparação das propriedades do biodiesel de microalgas com o biodiesel comercial (Resolução N°45/ 2014 da ANP).....................................................
38
Tabela 4.16:
Resumo dos principais conceitos de biorrefinarias......
42
xx
Tabela 5.1:
Planejamento experimental adotado para avaliar a eficiência da extração de lipídeos em reator tipo autoclave e etanol........................................................
52
Tabela 5.2:
Planejamento experimental para selecionar os parâmetros mais favoráveis das reações de transesterificação in situ...............................................
56
Tabela 6.1:
Composição da biomassa e das cinzas de Chlorella...
67
Tabela 6.2:
Rendimentos obtidos na extração dos lipídeos a partir da biomassa de Chlorella....................................
72
Tabela 6.3:
Índice de acidez das frações lipídicas obtidas a partir da biomassa sem pré-tratamento.................................
75
Tabela 6.4:
Perfil de carotenoides da matéria insaponificável de Chlorella........................................................................
79
Tabela 6.5:
Percentual de lipídeos obtidos em reator tipo autoclave usando etanol como solvente extrator.........
81
Tabela 6.6:
Percentual e perfil de ésteres metílicos obtidos para as diferentes reações..................................................
84
Tabela 6.7:
Teor de glicerídeos obtido para as diferentes reações.........................................................................
85
Tabela 6.8:
Rendimento e teor de éster das reações de otimização de tempo e temperatura da reação de transesterificação in situ (20 % de H2SO4)...................
86
Tabela 6.9:
Propriedades físico-químicas dos EMAG da Chlorella determinados de acordo com a Resolução 45/2014 da ANP. ..........................................................................
90
Tabela 6.10:
Resultados de fração insaponificável e ácido graxo a partir da saponificação in situ da Chlorella...................
95
Tabela 6.11:
Comparativo entre os processos de saponificação da fração lipídica e saponificação in situ...........................
95
Tabela 6.12:
Perfil de carotenoides da fração insaponificável de Chlorella obtida pela reação de saponificação in situ com 10 % de KOH. ......................................................
96
Tabela 6.13:
Atividade antioxidante da fração insaponificável testada em um biodiesel comercial..............................
97
xxi
Tabela 6.14:
O perfil de ácidos graxos e de ésteres etílicos (produto 2) identificados por CG-DIC...........................
100
xxii
ANEXOS
ANEXO 6.1: Análise termogravimétrica do EMAGs purificados................
129
ANEXO 6.2: Análise de EDX da argila........................................................
129
ANEXO 6.3: Espectro de infravermelho da argila......................................
130
ANEXO 6.4: Difratograma de raios-X da argila...........................................
130
ANEXO 6.5: Fotomicrografia (MET) da argila.............................................
131
ANEXO 6.6:
Caracterização da biomassa residual obtida na transesterificação in situ (20 %) por análise elementar de CHNOS, EDX e carboidratos..................................................
131
ANEXO 6.7:
Caracterização da biomassa residual obtida na saponificação in situ (5 % KOH) por análise elementar de CHNSO e EDX .......................................................................
132
xxiii
SUMÁRIO
Capítulo 1............................................................................................................... 1
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 1
Capítulo 2............................................................................................................... 4
2 OBJETIVOS........................................................................................................ 4
2.1 Geral................................................................................................................ 4
2.2 Específicos...................................................................................................... 4
Capítulo 3............................................................................................................... 5
3 JUSTIFICATIVA.................................................................................................. 5
Capítulo 4............................................................................................................... 6
4 REFERENCIAL TEÓRICO.................................................................................. 6
4.1 Microalgas....................................................................................................... 6
4.2 Sistemas de Cultivo......................................................................................... 10
4.3 Técnicas de caracterização de biomassa de microalgas............................... 14
4.4 Composição centesimal das microalgas......................................................... 15
4.4.1 Proteínas................................................................................................... 15
4.4.2 Carboidratos.............................................................................................. 18
4.4.3 Lipídeos..................................................................................................... 20
4.4.3.1 Composição de ácidos graxos em microalgas................................... 21
4.4.3.2 Extração de lipídeos com solventes................................................... 23
4.4.3.3 Métodos de extração de lipídeos com solventes............................... 26
4.5 Métodos de rompimento celular...................................................................... 27
4.6 Compostos antioxidantes................................................................................ 29
4.7 Material insaponificável................................................................................... 30
4.7.1 Carotenoides.............................................................................................. 32
4.8 Potencial das microalgas para produção de biocombustíveis......................... 33
4.8.1 Biodiesel.................................................................................................... 35
4.8.2 Biodiesel de microalgas in situ ou reação direta....................................... 38
4.9 Biorrefinarias a partir de microalgas................................................................ 40
xxiv
Capítulo 5............................................................................................................... 44
5 MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................... 44
5.1. Materiais e Matéria-prima................................................................................ 44
5.2. Metodologia.................................................................................................... 45
5.3 Caracterização da biomassa liofilizada de Chlorella sp.................................. 47
5.3.1 Análise de microscopia eletrônica de transmissão................................... 47
5.3.2 Análise de espectroscopia de infravermelho (FTIR)................................. 47
5.3.3 Análise de espectroscopia de raios-X por dispersão de energia.............. 47
5.3.4 Análise elementar orgânica de CHNOS..................................................... 47
5.3.5 Determinação do poder calorífico superior............................................... 48
5.3.6 Determinaçao do teor de proteínas............................................................ 48
5.3.7 Determinação dos teores de aminoácidos individuais totais..................... 48
5.3.8 Identificação e quantificação de açúcares................................................. 48
5.3.9 Cromatografia de exclusão de tamanho.................................................... 49
5.3.10 Determinação do teor de cinzas............................................................ 49
5.4. Extração de lipídeos....................................................................................... 49
5.4.1 Extração dos lipídeos sem pré-tratamento............................................... 50
5.4.2 Extração dos lipídeos com pré-tratamento............................................... 51
5.4.3 Extração dos lipídeos com etanol em reator tipo autoclave...................... 51
5.5.4 Caracterização da fração lipídica............................................................. 52
5.5.4.1 Análise de índice de acidez................................................................ 52
5.5.4.2 Análise de espectroscopia de infravermelho (FTIR)........................... 52
5.5.4.3 Determinação da atividade antioxidante por DPPH............................ 53
5.5.4.4 Saponificação dos lipídeos.................................................................. 53
5.5.4.5 Análise de infravermelho da fração insaponificável............................. 54
5.5.4.6 Análise de CG-DIC da fração insaponificável....................................... 54
5.5.4.6 Identificação dos carotenoides por CLAE............................................ 54
5.5 Produção de ésteres metílicos......................................................................... 54
5.5.1 Transesterificação in situ........................................................................... 54
5.5.2 Caracterização dos ésteres metílicos de ácidos graxos (EMAG)............. 56
5.5.2.1 Espectroscopia de infravermelho....................................................... 56
xxv
5.5.2.2 Análise de calorimetria exploratória diferencial.................................. 57
5.5.3 Caracterização físico-química dos ésteres graxos.................................... 57
5.5.3.1 Determinação da densidade............................................................... 57
5.5.3.2 Determinação de viscosidade............................................................. 57
5.5.3.3 Determinação do teor de água............................................................ 57
5.5.3.4 Determinação do ponto de entupimento de filtro a frio....................... 58
5.5.3.5 Caracterização do perfil graxo e determinação do teor de ésteres
metílicos.................................................................................................................
58
5.5.3.6 Determinação do teor de cinzas.......................................................... 58
5.5.3.7 Determinação do índice de acidez..................................................... 59
5.5.3.8 Determinação de monoglicerídeos, diglicerídeos, triglicerídeos,
glicerina total e livre...............................................................................................
59
5.5.3.9 Determinação do teor de álcool........................................................ 59
5.5.3.10 Determinação do índice de iodo........................................................ 60
5.5.3.11 Determinação da estabilidade oxidativa......................................... 60
5.5.4 Purificação dos ésteres metílicos............................................................. 60
5.6 Saponificação in situ da biomassa................................................................. 60
5.6.1 Caracterização da fração insaponificável................................................ 62
5.6.1.1 Espectroscopia de Infravermelho...................................................... 62
5.6.1.2 Identificação dos carotenoides por CLAE........................................ 62
5.6.1.3 Determinação da atividade antioxidante por DPPH......................... 62
5.6.1.4 Adição de material insaponificável ao biodiesel................................ 62
5.6.1.5 Determinação da estabilidade oxidativa........................................... 62
5.6.1.6 Caracterização da fração saponificável.............................................. 63
5.6.1.7 Espectroscopia de Infravermelho...................................................... 63
5.6.1.8 Caracterização da fração apolar por CG-DIC................................... 63
5.7 Análise Estatística.......................................................................................... 63
Capítulo 6............................................................................................................... 64
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................... 64
6.1 Caracterização da Biomassa liofilizada de Chlorella..................................... 64
6.2 Extração dos lipídeos.................................................................................... 71
6.2.1 Avaliação de solventes e quebra de parede celular .............................. 71
xxvi
6.2.1.1 Caracterização da fração lipídica....................................................... 75
6.2.2 Avaliação da eficiência de extração do etanol em reator tipo
autoclave.................................................................................................................
80
6.3 Transesterificação in situ da biomassa de Chlorella....................................... 83
6.3.1 Purificação dos ésteres metílicos da Chlorella.......................................... 87
6.3.2 Caracterização dos ésteres metílicos da Chlorella.................................... 88
6.3.3 Determinação de propriedades físico-químicas dos EMAG da Chlorella 89
6.4 Saponificação in situ........................................................................................ 93
6.4.1 Fração insaponificável como antioxidante natural para o biodiesel......... 97
6.4.2 Fração saponificável.................................................................................. 98
6.5 Biomassas residuais........................................................................................ 100
6.6 Biorrefinaria de Chlorella ................................................................................. 104
Capítulo 7............................................................................................................... 105
7 CONCLUSÕES................................................................................................... 105
TRABALHOS FUTUROS ..................................................................................... 107
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 108
ANEXOS............................................................................................................... 129
CAPÍTULO 1- INTRODUÇÃO
Nas décadas de 80 e 90, um número expressivo de pesquisas foram realizadas
na área do cultivo de biomassa de microalgas com ênfase na produção de
biocombustíveis. Recentemente, surgiu maior interesse em pesquisas na área de
cultivo de microalgas para produção de bioenergia. Dentre os fatores importantes e
motivadores para as atividades de pesquisa e desenvolvimento destacam-se a
diminuição das fontes de combustíveis fósseis e os impactos das emissões de CO2 no
clima do planeta (ALABI et al., 2009). Segundo Meng et al., (2009) as microalgas são
os organismos fotossintetizantes mais eficazes no processo de conversão da energia
luminosa em energia química. Esta propriedade vem ganhando destaque pelos
benefícios gerados ao meio ambiente, pois as microalgas utilizam o CO2 como
nutriente. A fixação de CO2 por parte das microalgas contribui de forma significativa
no ciclo global do carbono, pois o CO2 produzido pela atividade humana pode ser
parcialmente consumido pelas microalgas convertendo-o em biomassa e outros
produtos metabólicos por meio da fotossintesse. O cultivo de microalgas proporciona
um menor consumo de água quando comparado aos cultivos de plantas e pode ser
realizado em locais cujas condições não são adequadas para a produção de culturas
convencionais (COHEN, 1986). As microalgas, devido às suas propriedades
biotecnológicas e vantagens sob as oleaginosas convencionais, têm sido utilizadas no
desenvolvimento de tecnologias limpas, podendo atuar na biorremediação de metais
pesados bem como na biofixação de nitrogênio e fósforo. Isto se deve à essencial
importância destes seres nas diversas cadeias tróficas e a possibilidade de aplicação
comercial em distintas áreas como no tratamento de águas residuais, produção de
energia e obtenção de compostos de interesse para as indústrias alimentícia, química
e farmacêutica, dentre outras (RICHMOND, 2004; BECKER, 2004).
Um dos principais produtos que vem despertando interesse é o óleo oriundo
das microalgas, que de acordo com a literatura pode representar entre 5 a 80 % em
relação ao peso seco (CHISTI, 2007). Algumas cepas de microalgas podem produzir
ácidos graxos poliinsaturados como ômegas-3, 6 e 9 e ácidos graxos do tipo
Eicopentaenóico (EPA) e Docosahexanóico (DHA), que são utilizados como
suplementos alimentares essenciais para o desenvolvimento humano (GILL & &
VALIETY, 1997). Pode-se destacar também que o óleo é o principal componente para
produção de biodiesel e estes microorganismos vêm sendo amplamente utilizado na
pesquisa para produção desse biocombustível (CHISTI, 2007).
2
Outro produto que vem despertando interesse dos pesquisadores e das
empresas de biotecnologia são os carboidratos, oriundos das microalgas, que foram
citadas como possíveis matérias-primas para produção de etanol (HARUN et al.,
2010-a). E devido ao alto teor de proteínas da Chlorella esta microalga vem sendo
comercializada em cápsulas como suplemento alimentar (BECKER, 1994).
Vários estudos concentraram-se na utilização de produtos das microalgas para
diferentes aplicações (GINZBERG et al., 2000; LU et al., 2004; MANDAL & MALLICK,
2009; METTING, 2006; OLAIZOLA, 2000) e recentemente as pesquisas sobre
derivados de microalgas resultaram no isolamento de mais de 15.000 novos
compostos e muitos destes novos compostos têm apresentado propriedades bioativas
favoráveis para a saúde humana (KOMAKI, 1998; QUEIROZ et al., 2003). Além disso,
as microalgas podem conter enzimas, antioxidantes e moléculas protetoras
semelhantes às das plantas, tais como os compostos fenólicos, micosporina, o ácido
ascórbico, tocoferóis, vitaminas e outros (DERNER, et al. 2006;. SESE, 2010;
LAURIENZO, 2010; VIÊGAS et al., 2015-a). Nesse sentido, pode-se citar a microalga
Dunalliela salina que apresenta uma taxa de produção de 1.200 toneladas/ano tendo
sido explorada devido ao alto conteúdo em β-caroteno que é de 14 % em relação à
massa seca (BEN-AMOTZ, 1999). A grande biodiversidade e variabilidade na
composição bioquímica da biomassa obtida das culturas de microalgas e o
melhoramento tecnológico na produção em massa têm favorecido o cultivo comercial
para a produção de compostos bioativos de alto valor agregado (BEN-AMOTZ, 1999;
OLAIZOLA, 2000). Por exemplo, de acordo com a empresa Sigma Aldrich o padrão
analítico de β-caroteno tem preço de mercado de R$ 1.250,00 (por grama), já um
miligrama de zeastaxantina chega a custar R$ 3.030,00 e de luteína R$ 1.336,00.
Portanto, a possibilidade de obter uma gama de produtos a partir da biomassa
de microalgas envolvendo tecnologias limpas e abordagem sustentável se encaixa
perfeitamente no conceito que está atraindo grande interesse industrial, a
biorrefinaria. O conceito de biorrefinaria aplicada a microalgas consiste na produção
de biocombustíveis e produtos químicos a partir da biomassa algacea (FERREIRA et
al., 2013). Esta biorrefinaria necessita da implementação de novas tecnologias que
ainda estão no início de seu desenvolvimento. Neste trabalho, serão apresentadas
possíveis rotas e condições operacionais no processamento da biomassa seca para
obtenção de diferentes produtos de interesse. Devido à sua biodiversidade e a seus
3
processos metabólicos particulares as microalgas possuem enorme potencial como
fonte de recursos alimentícios, nutracêuticos e energéticos para o futuro.
CAPÍTULO 2 - OBJETIVOS
Objetivo Geral
Sintetizar e caracterizar o biodiesel obtido a partir da microalga Chlorella sp. e
extrair coprodutos de interesse industrial aplicando o conceito de biorrefinaria.
Objetivos específicos
A partir da microalga Chlorella sp. comercial, caracterizar a biomassa liofilizada
pelas técnicas: MET, FTIR, Análise elementar de CHNSO, EDX e CET;
Quantificar e identificar os diferentes compostos de interesse industrial como:
lipídeos, ácidos graxos, proteínas, aminoácidos, açúcares e carotenoides;
Avaliar técnicas combinadas de pré-tratamento mecânico e extração para
determinar o teor lipídico na microalga, utilizando solventes com diferentes
polaridades;
Avaliar a eficiência do processamento da microalga em reator tipo autoclave
usando etanol sob pressão como solvente extrator dos lipídeos;
A partir de técnicas padrões e modificadas utilizadas neste trabalho avaliar a
acidez e atividade antioxidante da fração lipídica da microalga Chlorella sp.
bem como determinar o seu perfil graxo por cromatografia gasosa;
Avaliar o efeito da temperatura, tempo e concentração de ácido sulfúrico nos
rendimentos de ésteres obtidos pela transesterificação in situ;
Caracterizar os ésteres metílicos por espectroscopia de infravermelho e
cromatografia diferencial exploratória;
Avaliar as características físico-químicas dos EMAG de acordo com a
Resolução nº45/2014 da ANP;
Avaliar a influência da concentração de KOH nas reações de saponificação in
situ dos lipídeos, visando à separação do material insaponificável e a formação
de ácidos graxos;
Caracterizar e quantificar os carotenoides da fração insaponificável do óleo da
microalga por CLAE;
Testar a matéria insaponificável como antioxidante natural para aumentar a
estabilidade do biodiesel comercial;
Analisar o teor proteico das correntes sólidas residuais;
CAPÍTULO 3 - JUSTIFICATIVA
O uso de microalgas apresenta diversas vantagens de cultivo se comparadas
às oleaginosas convencionais, adicionalmente, as microalgas são apontadas hoje
como uma fonte promissora de diversos compostos de grande interesse comercial e
biotecnológico. Dessa forma, a principal motivação para este trabalho de doutorado
foi a utilização de microalgas como matéria-prima para a obtenção de ésteres
graxos. A tese de Doutorado "Produção de biodiesel e de coprodutos a partir de
microalgas comerciais: abordagem de biorrefinaria” consistiu em parte de um
trabalho multidisciplinar em colaboração com instituições nacionais
(UFRJ/PETROBRÁS/CENPES). Nesta parceria, sob a coordenação do Prof° Dr.
Donato Aranda, foram realizados ensaios para obtenção de lipídeos/ácidos graxos
visando à produção de biodiesel a partir de microalgas. Para este fim, foram
avaliados e combinados diversos processos para a extração dos lipídeos,
caracterização e identificação dos coprodutos de valor comercial presentes nesta
matéria-prima. Foram reavaliados e adaptados os protocolos oficiais para extração
de lipídeos na tentativa de preservar compostos bioativos (proteínas, compostos
fenólicos entre outros), com a participação da profª. Drª. Suely Pereira Freitas,
orientadora desse trabalho. O outro orientador deste trabalho foi o Dr. Leonardo
Bacellar, um dos mais importantes pesquisadores ligados a esta área de produção
de microalgas no Brasil, com uma larga experiência em projetos relacionados a este
tema. Por meio dos ensaios realizados até o presente momento e pela experiência
do grupo do GREENTEC (Laboratório de Tecnologias Verdes) em aceitar novos
desafios, as microalgas têm-se mostrado uma matéria-prima potencial para
obtenção de diversos compostos de interesse comercial.
CAPÍTULO 4 - REFERENCIAL BIBLIOGRÁFICO
4.1 Microalgas
O termo microalgas engloba microrganismos unicelulares com clorofila a e
outros pigmentos fotossintéticos os quais são capazes de realizar a fotossíntese. As
microalgas são organismos microscópicos, coloniais ou filamentosos, coloridos,
fotoautotróficos, procarióticos e eucarióticos (OLAIZOLA, 2003). Os exemplos de
microalgas procarióticas são cianobactérias (Cyanophyceae) e as microalgas
eucarióticas podem ser exemplificadas por algas verdes (Chlorophyta) e
diatomáceas (Bacillariophyta). As microalgas estão presentes em todos os
ecossistemas existentes na terra, representando uma variedade grande de espécies
que podem viver em condições extremas. Estima-se que mais de 200.000 espécies
existam, porém somente um número limitado de aproximadamente 30.000 já foram
estudadas e analisadas (RICHMOND, 2004).
Conforme Arregondo-Vega (1995) as microalgas são produtores primários
que captam energia solar para convertê-la em energia biológica, sendo a base de
inúmeras cadeias tróficas nos ambientes aquáticos. As microalgas são
principalmente encontradas no meio marinho e na água doce, sendo consideradas
responsáveis por pelo menos 60 % da produção primária da Terra. Uma das
características relevantes das microalgas é a capacidade destes microorganismos
transformarem o dióxido de carbono presente na atmosfera e a luz solar em várias
formas de energia, pelo processo de fotossíntese, produzindo polissacarídeos,
proteínas, lipídeos e hidrocarbonetos (CHISTI, 2007).
Para desenvolver o cultivo maciço de microalgas é necessário isolar e
caracterizar as espécies, aprimorando as ferramentas genéticas em busca de
características específicas. Por exemplo, no cultivo de microalgas, alguns fatores
podem influenciar a produção de lipídeos como: pH, concentração de nutrientes,
intensidade de luz e temperatura. Estas condições ambientais podem ser
controladas e as espécies selecionadas de acordo com o(s) ácido(s) graxo(s)
desejado(s) (CERTIK & SHIMIZU, 1999).
Embora o rendimento de óleo nas microalgas seja dependente de alguns
fatores, esta quantidade ainda é superior às encontradas para as oleaginosas
7
convencionais. Na Tabela 4.1 são listados os dados que comparam a quantidade de
óleo na biomassa seca e o rendimento de óleo por hectare por ano bem como a
produtividade de biodiesel por área de cultivo (CHISTI, 2007).
Tabela 4.1: Comparativo da produtividade de óleo entre microalgas e oleaginosas convencionais
Oleaginosa Óleo (%)
Rendimento de Óleo L.(ha ano)
-1
Área necessária m
2 ano.(Kg
biodiesel)-1
Produtividade de Biodiesel Kg.(ha ano)
-1
Milho (Zea mays L.) 44 172 66 152
Maconha (Cannabis sativa L.) 33 363 31 321
Soja (Glycine Max L.) 18 636 18 562
Jathopha (Jathopha curcas L.) 28 741 15 656
Camelina (Camelina sativa L.) 42 915 12 809
Canola (Brassica napus L.) 41 974 12 862
Girassol (Helianthus annuus L.) 40 1307 11 946
Mamona (Ricinus communis) 48 1070 9 1156
Palma (Elaeis Guinnesis) 36 5366 2 4747
Microalga (baixo teor de óleo) 30 58.700 0,2 51.927
Microalga (médio teor de óleo) 50 97.800 0,1 86.515
Microalga (alto teor de óleo) 70 136.900 0,1 121.104
Fonte: CHISTI, 2007
Conforme Cohen (1986), o cultivo de microalgas pode ser justificado por
apresentar diversas vantagens, dentre as quais podem ser destacadas:
- Representa um sistema biológico eficiente na utilização da energia solar
para produção de matéria orgânica;
-O ciclo de vida da maioria das microalgas se completa em poucas horas o
que favorece a seleção de cepas e o melhoramento genético das espécies e maior
produtividade (Tabela 4.2);
-Os cultivos podem ser desenvolvidos com água marinha ou de estuários, a
qual não pode ser convencionalmente empregada no cultivo de plantas.
-As microalgas podem ser utilizadas para o tratamento de efluentes
contaminados com NH4+, NO3
-, PO4-, uma vez que utilizam esses nutrientes para o
seu crescimento.
8
Tabela 4.2: Produtividade de lipídeos e biomassa de alguns gêneros de microalgas.
Microalga Produtividade de lipídeos
Volume de biomassa produzida
Área destinada à produção
(mg/L.dia)
-1 (g/L.dia)
-1 (g/m
2.dia)
-1
Chlorella protothecoides 1214 2-7,70 -
Chlorella sorokiniana 44,7 0,23-1,47 -
Chlorella vulgaris 11,2-40,0 0,02-0,20 0,57-0,95
Chlorella sp. 42,1 0,02-2,5 1,61-25
Chlorella pyrenoidosa - 2,90-3,64 72,5-130
Dunaliella salina 116 0,22-0,34 14
Dunaliella tertiolecta - 0,12 -
Dunaliella sp. 33,5 - -
Haematococcus pluvialis - 0,05-0,06 -
Isochrysis galbana - 0,32-1,6 -
Isochrysis sp. 37,8 0,08-0,17 10,2-36,4
Nannochloropsis oculata 84,0-142 0,37-0,48 -
Nannochloropsis sp. 37,6-90 0,17-1,43 1,9-5,3
Neochloris Oleabundans 90-134 - -
Pavlova lutheri 40,2 0,14 -
Phaeodactylum tricornutum 44,8 0,003-1,9 2,4-21
Porphyridium cruentum 34,8 0,36-1,50 25
Scenedesmus obliquus - 0,004-0,74 - Scenedesmus quadriculada 35,1 0,19 -
Scenedesmus sp. 40,8-53,9 0,03-0,26 2,43-13,52 Fonte: Adaptado de MATA et al., 2010
9
Na Tabela 4.3 estão apresentadas as composições centesimais das
principais microalgas comercialmente disponíveis observa-se que estes
microorganismos podem apresentar variadas proporções de proteínas, lipídeos e
carboidratos e ácidos nucleicos, sendo essas quantidades fortemente dependentes
da espécie.
Tabela 4:3: Composição centesimal de algumas microalgas tendo como base a biomassa seca (%)
Fonte: Adaptado de BECKER, 2007
Conforme reportado por Borowtizka (1999) e Spolaore (2006) dada a
importância dos compostos sintetizados pelas microalgas e das vantagens de cultivo
frente às oleaginosas convencionais, a produção em grande escala já vem sendo
realizada em alguns países (Tabela 4.4). Por exemplo, a microalga Dunaliella é rica
em β-caroteno e tem sido explorada comercialmente desde o século passado em
diversos países, como Israel.
Microalga Proteínas Carboidratos Lipídeos totais
Anabaena Cylindrica 43-56 25-30 4-7
Aphanizomenon flos-aquae 62 23 3
Chlamydomonas rheinhardii 48 17 21
Chlorella pyrenoidosa 57 26 2
Chlorella vulgaris 51-58 12-17 14-22
Dunaliella salina 57 32 6
Euglena gracilis 39-61 41-18 14-20
Porphyridum cruentum 28-39 40-57 9-14
Scenedesmus obliquus 50-56 10-17 12-14
Spirogyra sp. 46-63 33-64 11-21
Arthrospira platensis 63 8-14 11
10
Tabela 4.4: Produção comercial de microalgas e aplicações biotecnológicas
Microalga Produção Anual País Produtor Aplicação e produtos
Arthrospira sp. 3000 t de biomassa seca China, Índia, USA, Japão
Cosméticos, Ficobiliproteínas e Nutrição animal e humana
Chlorella sp. 2000 t de biomassa seca Taiwan, China, Japão e Alemanha
Nutrição humana, Aquacultura e Cosméticos
Dunaliella salina 1200 t de toneladas de biomassa seca
Austrália, Israel, USA Nutrição humana, Aquacultura e β-caroteno
Aphanizomenon flos-aquae
500 t de biomassa seca USA Nutrição animal
Haematococcus pluvialis
300 t de biomassa seca USA, Israel e Índia Aquacultura e Astaxantina
Crypthecodinium
240 t de DHA USA DHA
Shizochytrium
10 t DHA USA DHA
Fonte: Adaptado de SPOLAORE et. al., 2006; BOROWTIZKA, 1999
4.2 Sistemas de cultivo
Cada espécie de microalga produz diferentes teores de lipídeos, carboidratos
e proteínas, pois estes minúsculos organismos têm a habilidade de alterar seu
metabolismo de acordo com as mudanças na composição química do meio de
cultura (BEHRENS & KYLE 1996). Por exemplo, o conteúdo lipídico da Chlorella
protothecoides pode ser aumentando em 15 % depois da adição de glicose ao meio,
sob limitação de nutrientes como nitratos alcançando até 55 % de lipídeos em
massa seca (XU et al., 2006).
Huang et al., (2010) e Xu et al., (2006) apresentaram dois sistemas de cultivo
de microalgas, sendo eles: sistemas fotoautotrófico e heterotrófico, respectivamente.
No sistema fotoautotrófico, as microalgas são cultivadas na presença de luz e, por
meio da fotossíntese, obtém energia da luz para fixar carbono e produzir biomassa.
Todas as espécies de algas são fotoautotróficas. Embora o sistema autotrófico
apresente eficiente incidência de luz sobre a cultura de microalgas, pode ocorrer que
essa cultura tenha um crescimento muito lento devido ao processo chamado de
fotoinibição (WEN et al., 2003).
O cultivo de microalgas, por meio de um sistema heterotrófico, apresenta
inúmeras vantagens em relação ao sistema anteriormente mencionado, tais como a
11
eliminação da exigência de luz, maior controle do processo de cultivo e baixo custo
na coleta da biomassa. Um importante aspecto do sistema heterotrófico está
relacionado ao baixo custo dos nutrientes, ou fontes de carbono, utilizados no
processo de cultivo (HUANG et al., 2010).
As microalgas podem ser cultivadas em fotobiorreatores fechados ou em
tanques abertos. Os fotobiorreatores fechados consistem basicamente de um
arranjo de tubos transparentes que podem ser feitos de material polimérico
translúcido ou vidro. Este arranjo de tubos é acoplado a uma bomba de circulação e
a uma coluna de desgaseificação, formando um sistema totalmente fechado. O
diâmetro dos tubos é dimensionado de forma a obter um melhor aproveitamento da
luz e o arranjo entre eles pode se apresentar na forma helicoidal, vertical e horizontal
(CHISTI, 2007).
O uso de fotobiorreatores fechados (Figura 4.1) é mais adequado para
algumas microalgas, principalmente as que são facilmente contaminadas por outros
microorganismos, ou aquelas que necessitam de um maior controle dos parâmetros
físico-químicos do meio de cultivo. Existem algumas espécies de microalgas que
podem sobreviver em condições extremas, como por exemplo, os gêneros
Arthrospira e Dunaliella que sobrevivem em ambientes com elevado pH e alta
salinidade, respectivamente (HUANG et al., 2010).
Todos estes parâmetros são mais bem controlados com o uso de
fotobiorreatores. Por outro lado, este sistema apresenta um investimento fixo e
custos operacionais elevados, devido à tecnologia e aos insumos necessários para
colocá-lo em funcionamento (HUANG et al., 2010).
12
Figura 4.1: Fotobiorreatores verticais em operação no terraço do Núcleo de Biocombustíveis-UFRJ. Fonte: Mariana Fortes.
Outra forma de cultivo são os tanques abertos para produção de microalgas e
podem ser construídos em forma circular, retangular, elipsoidal ou cilíndrica e podem
ser conectados, formando um circuito fechado com recirculação.
Independentemente da área do tanque, a profundidade varia de 20 a 30 cm, pois
tanques muito profundos prejudicam o aproveitamento da luz pelas células.
A agitação constante é essencial para promover uma distribuição uniforme
das células, permitindo a iluminação de todas as células. O revestimento é feito com
material plástico, fibra de vidro ou concreto e o material empregado deve ser claro,
para permitir maior reflexão de luz (BOROWITZKA, 1999). Segundo Amin (2009)
grande parte das microalgas produzidas atualmente é cultivada em tanques abertos,
expostos diretamente à luz solar. No cultivo de microalgas grande parte do carbono
acumulado tem origem das moléculas de dióxido de carbono presentes na atmosfera
e são fixadas por essas para síntese de compostos como carboidratos, proteínas e
lipídeos. Para uma produção de aproximadamente 100 toneladas de biomassa de
microalgas, estima-se que 183 toneladas de dióxido de carbono seja absorvido
(CHISTI, 2007).
13
De acordo com Pérez (2007) um problema presente no cultivo de microalgas
em tanques abertos em relação ao uso de fotobiorreatores, está no fato de que as
espécies com conteúdo mais elevado de óleo são as que se reproduzem mais
lentamente. A partir desta realidade, facilmente ocorre contaminação por espécies
de microalgas e bactérias indesejáveis, devido à falta de um controle mais efetivo
sobre o sistema em geral (Figura 4.2).
O crescimento das microalgas tanto em seu ambiente natural como nos
sistemas de cultivo, é o resultado da interação entre fatores biológicos, físicos e
químicos. Todos esses aspectos estão diretamente relacionados ao acesso das
microalgas à iluminação, temperatura adequada, salinidade e também à
disponibilidade aos nutrientes necessários (PÉREZ, 2007).
Figura 4.2 – Sistema de cultivo de microalgas em tanques abertos. Planta piloto da PETROBRAS localizada em Extremoz-RN. Fonte: Leonardo Brantes Bacellar Mendes.
Os custos de investimentos bem como os custos operacionais relacionados
ao processo de upstream para o cultivo de microalgas são altos (DELRUE et al.,
2012), portanto, produzir microalgas exclusivamente para a aplicação em
biocombustíveis tem se mostrado um processo economicamente inviável
14
(WIJFFELS et al., 2010; WIJFFELS & BARBOSA, 2010-a). Ao explorar todo o
potencial das moléculas sintetizadas pelas microalgas diferentes produtos podem
ser obtidos, viabilizando os custos de produção. A produção integrada de alimentos,
substâncias químicas, e biocombustíveis é uma alternativa para viabilizar o uso
destes lipídeos para geração de energia (REE & ANNEVELINK, 2007).
4.3 Técnicas de caracterização da biomassa de microalgas
Um profundo conhecimento da matéria-prima é vital em todas as áreas de
investigação acerca da composição da biomassa que se pretender analisar. De
acordo com a literatura, a biomassa de microalga foi caracterizada por diferentes
técnicas como FTIR, análise elementar de CNHOS, EDX, ATG, CET, MET, bem
como o teor das cinzas presentes nessas amostras (MENG et al., 2014; MAYERS et
al., 2013; MARCÍLLA et al., 2009; GOMES, 2013; PHUKAN et al., 2011).
Uma técnica que vem ganhando espaço para caracterização da biomassa
de microalgas é a espectroscopia de infravermelho (FTIR), pois apresenta diversas
vantagens como: rapidez de análise, não necessita de pré-tratamento e permite a
identificação de grupos funcionais característicos de componentes presentes em sua
composição (NAUMANN et al., 1991; NAUMANN, 2000; STEHFEST et al., 2005;
PHUKAN et al., 2011; MARCILLA et al., 2009).
A análise elementar gera importantes informações sobre os componentes
da biomassa, especificamente na quantificação de carbono, hidrogênio, oxigênio,
nitrogênio e enxofre. A determinação da composição química da matéria-prima é um
parâmetro crítico, pois define a quantidade de energia contida na biomassa e
demonstra a presença de componentes inorgânicos que compõem as cinzas. Os
nutrientes necessários para o crescimento das microalgas, geralmente são
constituintes inorgânicos como: Si, Ca, K, Na, Mg, S, P, Fe, Mn e Al (XIAO et al.,
2011). Alguns macronutrientes desempenham papel importante na microalga dentre
eles é possível destacar o Ca presente na composição estrutural da célula, o Mg
como parte constituinte da clorofila e Na e K na osmose iônica da membrana celular
(REYNOLDS, 2006) e o fósforo como constituinte de fosfolipídeos, nucleotídeos e
ácidos nucleicos (MIYACHI et al., 1964).
Já a análise cromatográfica por exclusão de tamanho foi aplicada com êxito
para determinação da composição lipídica da biomassa de Chlorella vulgaris e
15
Nannochloropsis oculata no trabalho de Biller et al., (2013). Esta técnica fornece
uma informação útil sobre os compostos extraídos da fração lipídica e da eficiência
da extração quando aplicada a biomassa residual.
O conhecimento da composição da matéria-prima é um parâmetro útil para
definir a utilização da biomassa para o uso nos diferentes setores da indústria.
4.4 Composição centesimal das microalgas
4.4.1 Proteínas
O uso de microalgas como alimento para consumo humano é uma tradição
milenar a mais de 2.000 anos atrás, os chineses usaram Nostoc para sobreviver à
fome (MILLEDGE, 2011). Apesar da infinidade de aplicações tecnológicas das
microalgas pelos seres humanos, a cultura de microalgas é uma área relativamente
nova de pesquisa em biotecnologia e sua aplicação comercial é praticamente
inexplorada (SPOLAORE et al, 2006; MILLEDGE, 2011). Cerca de décadas atrás a
produção em massa de certas microalgas foi considerado como uma possibilidade
de fechar o chamado "gap de proteína" para o consumo humano (BECKER, 2007).
Do ponto de vista da humanidade, as proteínas são o componentes mais críticos,
escassos e caros da dieta (SGASBIERI, 1996). De acordo com os pesquisadores, a
biomassa algacea mostra quantidades promissoras para a utilização como uma
possível fonte de proteínas. A qualidade média da maioria das microalgas
examinadas é igual e muitas vezes até superior de comparada às proteínas de
plantas convencionais (BECKER, 2007). Por exemplo, a Arthrospira é uma fonte de
proteína que pode substituir à carne e produtos lácteos e também contém grandes
quantidades de vitamina A e B12 (METTING, 1996). De acordo com Gorgônio
(2013) as microalgas apresentam um teor entre 12 - 63 % de proteínas e a Chlorella
juntamente com a Artrospira tem mostrado grande potencial como fonte proteica
(Tabela 4.5).
As proteínas tem funções estruturais e formam parte das membranas
celulares dos tecidos dos organismos. Além disso, tem outras funções
importantíssimas para o funcionamento do organismo, atuando diretamente nas
reações do metabolismo, do sistema imunológico e do sistema hormonal. As
proteínas são compostos por diferentes aminoácidos e consequentemente, a
16
qualidade nutricional de uma proteína é determinada basicamente pelo conteúdo,
proporção e disponibilidade de seus aminoácidos.
Tabela 4.5: Teor de proteínas de algumas de microalgas
Teor de proteínas em algumas espécies de microalgas (% m/m)
Espécie % Espécie %
Chaetoceros muelleri
17,3 Pavlova lutheri
29
Chaetoceros sp.
37,0 Scenesdesmus obliquus
50 - 60
Chorella vulgaris
33 - 58 Scenesdesmus quadrilata
47
Chorella pyrenoidosa
50 - 57 Arthrospira platensis
46 - 63
Dunaliella salina
57,0 Arthrospira maxima
60 - 71
Dunaliella bioculata
49,0 Thalassiosira fluviatilis
19,4
Dunaliella tertiolecta
26 - 70 Thalassiosira pseudonana
30,0
Euglena gracilis
39 - 61 Tetraselmis chuii
41,5
Isochysis galbana
12 - 37 Tetraselmis gracilis
34 - 64
Isochysis sp.
30,8 Tetraselmis maculate
52
Nannochloropsis oculata
28,9 Tetraselmis sp
44,8
Pavlova salina
26 Tadaetraselmis suecica
27,4
Fonte: Adaptado de GORGONIO, 2013.
Existem vinte aminoácidos, dos quais histidina, isoleucina, lisina, metionina,
fenilalanina, tereonina, triptofano e valina são considerados essenciais e devem ser
consumidos na dieta em quantiadade e proporções definidas, visto que o organismo
não apresenta capacidade de sintetizá-los (BECKER, 2007). Se esses aminoácidos
oriundos das microalgas forem utilizados para alimentação humana, é importante a
sua quantificação (aminograma) para determinar a ausência ou presença desses
nutrientes (FAO WHO UNU/1991). Para avaliar a pontencialidade dessas microalgas
como fonte proteica, deve-se conhecer o seu valor nutricional e a biodisponibilidade
dos aminoácidos no organismo(SPOLAORE et al., 2006). Pode se observar que na
Tabela 4.6 as diferentes composições de aminoácidos essenciais encontrados em
alimentos convencionais e microalgas, enfatizando o elevado teor desses compostos
na microalga Chlorella.
17
Tabela 4.6: Composição de aminoácidos essenciais de alguns alimentos e microalgas
Fonte: Adaptado de GORGÔNIO, 2013. Arg – Arginina ; Fen- Fenilanina; His- Histidina; Leu- Leucina; Lis- Lisina; Met- Metionina; Tre- Treonina; Tri- Triptofano; Val- Valina; Ileu- Isoleucina
Dentre as principais aplicações para a utilização das proteínas oriundas das
microalgas, estima-se que cerca de 30 % da produção atual seja comercializado
para alimentação animal (BECKER, 2004). A utilização da biomassa de microalgas
vem ganhando espaço na aquacultura, devido ao aumento do uso desses
microorganismos como fonte de ração para peixes. De acordo com a cotação atual
estabelecida pelo mercado internacional, o preço da biomassa de microalgas está
sendo comercializada comparavelmente ao preço farelo de peixe, cujo valor atual é
cerca de US$ 2.400/tonelada devido ao alto teor proteico de aproximadamente 60 %.
Esse valor é superior ao preço de comercialização do farelo de soja, de
aproximadamente US$ 360/tonelada com 45 % de proteínas.
Composição de aminoácidos essenciais (% m/m)
Fonte Arg
Fen His
Ileu Leu Lis Met Tre Tri Val
Crustáceo
9,70 2,90 1,60 1,90 5,40 6,30 1,10 3,20 ND 2,20
Feijão 6,90 6,00 3,20 5,30 9,00 7,70 1,30 4,90 ND 5,90
Lentilha
9,10 5,55 6,84 5,06 8,09 5,69 1,18 5,62 ND 7,24
Soja
ND 2,41 1,17 2,08 3,54 3,40 0,69 1,85 0,67 2,41
Chlorella v.
7,97 6,02 2,40 4,82 10,78 7,70 1,55 5,60 1,10 7,88
Dunaliella t.
5,40 5,40 2,10 4,10 8,70 5,40 2,80 5,00 ND 5,50
Isochrysis g.
5,60 5,80 2,00 5,50 9,50 5,40 2,20 5,40 ND 6,70
Tetraselmis g.
6,70 6,10 2,50 4,50 8,90 6,40 1,70 5,70 ND 6,50
Tetraselmis g.
3,53 1,75 0,73 1,40 2,54 2,23 0,68 1,68 ND 1,83
P. donghaiense
2,79 1,50 0,34 1,34 2,89 1,74 1,03 1,43 ND 1,94
18
4.4.2 Carboidratos
Os carboidratos representam um grupo de açúcares redutores e de
polissacarídeos tais como amido e celulose. São geralmente localizados no
cloroplasto e são compostos de amilose e amilopectina. A celulose é um
polissacarídeo estrutural de elevada resistência, que está localizada na parede
celular de Chlorella vulgaris como uma barreira protetora (ABO-SHADY et al.,
1993). A parede celular das microalgas pode ser constituída de até 10 % de
celulose, o que pode acarretar um problema para seres humanos e animais não
ruminantes na digestão desses microorganismos. Assim, tratamentos eficazes são
necessárias para romper a parede celular e tornar as proteínas e outros
componentes acessíveis às enzimas digestivas (BECKER, 2007). A constituição
bioquímica da parede celular e dos produtos de estocagem estão resumidas na
Tabela 4.7 o teor de carboidratos das principais divisões das microalgas estão na
Tabela 4.8 e a composição de açúcares presentes em algumas divisões de
microalgas podem ser observadas na Tabela 4.9.
Tabela 4.7: Composição da parede celular e produtos de estocagem das principais divisões de microalgas.
Divisão Parede Celular Produto de estocagem
Celulose
Amido (20-30 % amilose/ 70-80% amilopectina
Chlorophyta Hemicelloses (Xilanos e mananos)
Heteropolissacarídeos sulfatados
Hidroxiprolina rica em glicosídeos
Celulose
Amido
Galactanas
Rhodofita Carragenas
Agar
Celulose
Manitol
Ácido algínico
Phaeofitas Fucoidan
Polissacarídeos Sulfatados
Fonte: Adaptado de BOLD & WYNNE, 1978
19
Tabela 4.8: Teor de carboidratos de diferentes gêneros de microalgas
Espécie de microalgas Teor de Carboidratos (% m/m) em base seca
Chlorella vulgaris IAM C-534 37,0
Chlorella vulgaris CCAP 211/11B 55
Chlorella vulgaris P12 41,0
Chlorella vulgaris 55
Chlamidomonas reinhardtii UTEX 90 60
Chlamidomonas reinhardtii IAM C-238 55
Chlorococum sp. 32,5
Chlorococum sp. TISTR8583 26
S. acutiformis TISTR 8495 16,4
S. obliquus CNW-N 51,8
Tetraselmis sp. CS-362 26 Fonte: Adaptado de CHEN et al., 2013
Tabela 4.9: Composição de açúcares (%) de microalgas de diferentes gêneros (
Açúcares (%)
Arabinose Fucose Galactose Glicose Manose Ramnose Ribose Xylose
Espécie
C.gracilis 0,3 6,9 14,9 57,9 5,5 6,0 3,5 5,1
N. oculata N.D 4,4 3,8 68,2 6,1 8,3 4,6 4,4
Dunaliela 0,6 N.D 1,1 85,3 4,5 5,5 2,0 1,0
P. salina 1,6 0,5 4,4 81,0 5,1 N.D 2,5 4,8
I. galbana 5,7 0,6 19,0 76,5 3,6 0,3 2,0 2,3
T. suecica 0,5 N.D 15,7 74,8 3,0 0,9 4,5 N.D Fonte: Adaptado de BROWN, 1991. N.D= Não detectado
Os polissacarídeos de microalgas têm atraído considerável atenção como
fontes de moléculas biologicamente ativas, em particular como agentes terapêuticos
naturais, cosméticos, alimentos funcionais (YEN et al., 2013) e para produção de
bioetanol (JOHN, et al 2011; KIM, et al 2012; POWELL & HILL, 2009; CHISTI, 2008;
HARUN et al 2010-b;HARUN & DANQUAH, 2011-b; HARUN & DANQUAH, 2011-a;
CHUN-YEN et al., 2013).
20
4.4.3 Lipídeos
Os lipídeos incluem um conjunto de substâncias químicas que, ao contrário
das outras classes de compostos orgânicos, não são caracterizados por um grupo
funcional comum, e sim pela sua alta solubilidade em solventes orgânicos e baixa
solubilidade em água (SOLOMONS, 2005). Óleos, azeites e gorduras são
substâncias de origem vegetal ou animal, que consistem predominantemente em
misturas de ésteres, oriundos da mistura de ácidos graxos com a glicerina,
chamados de triacilgliceróis (BAILEY, 1944; MORETTO & FETT, 1998).
Os lipídeos são tipicamente compostos por triacilgliceróis, glicolipídeos,
fosfolipídeos, lipoproteínas e ácidos graxos contendo entre 12 e 22 carbonos,
podendo ser componentes da reação de ácidos graxos saturados, monoinsaturados
e poliinsaturados (GRIMA et al., 1999). Os comprimentos de cadeia de mais de 18
átomos de carbono e a presença de ácidos poliinsaturados são tipicos de
microalgas marinhas.
Os lipídeos polares incluem fosfolipídeos e glicolipídeos, sendo estas classes
predominantemente encontradas na maioria das microalgas na composição total dos
lipídeos (BASOVA, 2005). Os lipídeos neutros como os triacilgliceróis são
geralmente considerados como produto de estocagem energética, enquanto que
glicolipídeos são estruturas lipídicas presentes na parede celular. Pode-se observar
na Tabela 4.10 que os compostos polares são majoritários na composição lipídica
de diversas microalgas e na Figura 4.3 estão elucidadas algumas estruturas
químicas encontradas nos lipídeos das microalgas. O termo 'lipídeos totais "é usado
principalmente para fins de análise, além de acilgliceróis, o lipídeos brutos obtidos a
partir de microalgas freqüentemente contêm ácidos graxos livres, hidrocarbonetos,
cetonas, esteróis, carotenóides e clorofilas. Por esse motivo, o extrato lipídico bruto
obtido a partir de microalgas é muitas vezes sujeito a mais de uma etapa de
fracionamento antes de ser transesterificado. Diferentes métodos de purificação, tais
como cromatografia líquida, coluna cromatográfica, cristalizações com ureia são
usados para fracionamento de lipídeos e separação dos ácidos graxos
poliinsaturados (EPA e DHA) (GONZÁLEZ et al., 1998; GU et al., 2009). A detecção,
identificação e quantificação precisa dos compostos lipídicos são pré-requisitos para
verificar o potencial de cada espécie de microalgas na produção de compostos alvo.
21
Tabela 4.10: Composição dos lipídeos (%) de algumas microalgas
Fonte: Adaptado de BASOVA, 2005.
. Figura 4.3: Diferentes estruturas lipídicas encontradas nas microalgas. Fonte:VIÊGAS, 2010
4.4.3.1 Composição de acidos graxos de microalgas
O óleo das microalgas é constituído majoritariamente de ácidos graxos
insaturados como o palmitoleico, oleico, linoleico, linolênico, EPA e DHA. Perfis de
ácidos graxos de diferentes microalgas e oleaginosas convencionais estão
resumidos na Tabela 4.11 na qual se observa que a composição de ácidos graxos é
variável de espécie para espécie e da forma de cultivo, de acordo com Yeh & Chang
(2012). Por exemplo, o perfil dos ácidos graxos de C. vulgaris cultivadas sob
Microalga Hidrocarbonetos Esteróis e Ceras
Triacilglicerídeos Diacilglicerídeos Lipídeos Polares
Isochrysis sp.
0,4 2,8 0,2 83,0
Pavlova lutheri
0,2 4,0 6,3 78,3
Chroomonas salina
3,5 21,9 4,9 67,8
Dunaliella bertiolecta
- 1,9 2,1 94,3
Tetraselmis suecica
1,8 3,3 1,9 91,5
Chaetoceros gracilis
1,3 34,0 6,0 44,2
Thalassiosira pneudonana
1,2 14,4 2,8 80,4
22
condições de crescimento mixotrófico pode acumular 60 - 68 % de ácidos saturados
e mono-insaturados (ZHENG et al., 2012). De acordo com a literatura esse perfil
apresentado para a Chlorella vulgaris é mais adequado para a produção de biodiesel
(YEH & CHANG, 2012). Ácidos graxos poliinsaturados são mais suscetíveis à
oxidação durante o armazenamento, o que os torna menos adequados para uso em
biodiesel (PORTER et al., 1995).
Tabela 4.11: Perfis de ácidos graxos de diferentes microalgas e oleaginosas convencionais
Ácidos Graxos
Microalgas
Matérias-primas convencionais
(%) C.pyrenoidosa D.Tertiolecta I.galbana T.Gracilis Palma Sebo bovino Soja Oliva
AGS
12:0 0,14 ND 0,07 ND 0.22 0.08 0.02 0
14:0 0,46 0,45 20,46 0,58 1.14 2.40 0.06 0
16:0 27,53 30,45 21,47 30.90 59.12 21.83 10.01 10.32
17:0 0,45 1,04 0,18 0.72 ND 1.54 ND 0.05
18:0 3,22 1,52 1,45 1.89 2.98 23.99 2.81 3.32
20:0 0,11 0,21 0,9 0.26 0.07 0.17 0.25 0.33
22:0 0,13 0,05 3,03 0.76 0.12 0.04 0.37 0.17
Soma 32,04 33,36 47,55 35.11 63.65 50.05 13.52 14.19
AGM
16:1 2.45 9.36 10.84 9.31 0.26 6.50 2.44 0.64
18:1 n 4.22 41.32 37.11 40.99 29.69 40.84 23.31 67.99
20:1 0.10 3.87 0.43 4.33 0.05 0.34 0.14 0.21
22:1 0.04 0.04 0.52 0.07 0.03 0.004 0.09 0
Soma 6.81 54.89 48.90 54.70 30.03 47.68 25.97 68,84
AGP
18:2 n6 29.75 3.89 2.24 2.69 6.15 2.07 55.31 15.02
18:3n3 31.42 7.81 1.35 7.51 0.17 0.21 5.2 0.98
Soma 61,17 11.70 3.59 10.20 6.32 2.27 60.42 16.00 AGS=ácidos graxos saturados; AGM: ácidos graxos monoinsaturados; AGP=ácidos graxos poliinsaturados. Fonte: Adaptado de GORGONIO 2013.
Os ácidos graxos poliinsaturados são atualmente obtidos comercialmente a
partir de plantas com sementes selecionadas, peixes marinhos (EPA e DHA) e de
23
certos mamíferos. Os ácidos graxos poliinsaturados possuem importância nutricional
uma vez que não podem ser sintetizados por seres humanos devem ser consumidas
por meio da alimentação (LEMAHIEU et al., 2013). Os ácidos graxos poliinsaturados
de origem microalgacea têm um mercado muito promissor, especialmente na
indústria de alimentos funcionais (BERTOLDI et al., 2008).
4.4.3.2 Extração de lipídeos com solventes
A solubilidade dos lipídeos pode ser prevista qualitativamente pela análise
estrutural das moléculas que compõem a fração. Há dois tipos de associações que
ocorrem nos lipídeos: i) forças de van der Waals nos lipídeos apolares
(triacilgliceróis); ii) ligações de hidrogênio e forças eletrostáticas nos lipídeos polares
(fosfolipídeos e glicolipídeos). A utilização de solventes apolares como no caso o
hexano, remove preferencialmente os triacilgliceróis, glicerídeos, carotenoides,
esteróis e uma escala limitada dos hidrocarbonetos de alto peso molecular que
aparecem naturalmente no óleo de alguns peixes, microalgas e sementes (GRIMA et
al., 1999). Fosfolipídeos e glicolipídeos (lipídeos polares) são mais solúveis em
solventes polares, tais como etanol ou metanol, capazes de enfraquecer ligações de
hidrogênio que os mantêm. No entanto, a sua natureza polar também é uma
desvantagem, uma vez que limita a interação com os lipídeos neutros. Por esta
razão, quando utilizado como um solvente de extração de lipídeos de microalgas, o
álcool é quase sempre combinado com um solvente orgânico apolar, tal como
hexano ou clorofórmio, para garantir a extração total (HALIM et al., 2012). Em geral,
a utilização de misturas de solventes contendo álcool na extração da fração lipídica
pode enfraquecer as ligações lípo-proteícas presentes nas microalgas. A seleção de
um sistema de solventes deve, portanto, levar em conta sua afinidade química com
as classes de lipídeos a serem extraídos. Nas microalgas, a fração lipídica pode
sofrer alterações em sua composição de acordo com a polaridade do solvente
utilizado para sua extração (Tabela 4.12).
24
Tabela 4.12- Composição da fração lipídica de acordo com o solvente extrator
Fonte: GRIMA et al., 1999
O mecanismo pelo qual a mistura de solvente orgânico apolar/polar extrai os
lipídeos associados à membrana foi proposto por Halim et al., (2012) e está ilustrado
na Figura 4.4 e foi dividido em cinco etapas. O solvente orgânico (apolar e polar)
permeia através da membrana celular para o citoplasma (Etapa 1) e interage com o
complexo lipídico (Etapa 2). Durante esta interação, o solvente orgânico apolar
rodeia o complexo lipídico e forma associações de Van der Waals com os lipídeos
neutros desse complexo, enquanto que o solvente polar também envolve o
complexo lipídico e forma ligações de hidrogênio com os lipídeos polares. As
ligações de hidrogênio são suficientemente fortes para deslocar as associações
lipídeo/proteina do complexo lipídeo para a membrana celular. O extrato orgânico
(solvente + lipídeos) é formado e dissocia-se da membrana celular (Etapa 3). O
extrato orgânico, em seguida, se difunde através da membrana da célula (Etapa 4) e
a camada orgânica circundante da célula (Etapa 5) passa para o solvente orgânico.
Como visto acima a adição de um solvente orgânico polar e outro apolar
facilita a extração de lipídeos neutros associados à membrana. No entanto, esse
processo de extração também conduz, inevitavelmente, a co-extracção dos lipídeos
polares que podem ser indesejáveis para produção de biodiesel.
Solvente Componentes extraídos
Clorofórmio Hidrocarbonetos, carotenoides, clorofila, esteróis, triacilglicerídeos, ceras, aldeídos e ácidos graxos.
Acetona Diacilgliceróis, cerebrosídeos e sulfulipídeos. Metanol Fosfolipídeos e glicolipídeos Hexano Hidrocarbonetos, triacilgliceróis e ácidos graxos
25
Figura 4.4: Ilustração do mecanismo de extração com solvente orgânico em microalgas. Fonte: Adaptado de HALIM et al., 2012.
A cinética e o mecanismo subjacente de extração por solvente orgânico de
lipídeos de microalgas ainda não são bem compreendidas e requerem mais
investigação. Note-se que a utilização desses solventes orgânicos na extração dos
lipídeos apresentam várias desvantagens. Quando utiliza grandes quantidades de
solventes orgânicos, normalmente a metodologia é lenta e requer evaporação
(procedimento que consome muita energia para a remoção do solvente). A
solubilidade dos lipídeos em um dado solvente orgânico é também limitada
termodinamicamente (WANG & WELLER, 2006). Uma vez que a concentração de
lipídeos no solvente orgânico e nas matrizes celulares atinge seu nível de equilíbrio
o processo de extração termina, pelo fato de não haver mais diferença de potencial
químico para transferência de lipídeos das células para o solvente orgânico. A
grande maioria das pesquisas de extração com solventes dos lipídeos das
microalgas, envolvem a utilização da biomassa seca. Uma vez seca, a biomassa de
microalgas pode ser moída o que acarreta a quebra celular e redução do tamanho
das células. Quanto menor o tamanho da biomassa, maior a recuperação dos
lipídeos, uma vez que ocorre o aumento da área de superfície interfacial disponível
para os contatos de biomassa-solvente com consequente diminuição do caminho de
difusão no processo de extração. A presença da água, no caso de extração direta de
biomassa úmida, afeta negativamente a eficiência de extração de lipídeos. A água
26
forma barreiras que impedem a transferência de massa de lipídeos a partir das
células para o solvente extrator.
O desenvolvimento de uma técnica eficaz no processo de extração de
lipídeos em grande escala a partir de biomassa de microalgas ainda é um desafio
para os pesquisadores. Os fatores que influenciam neste processo ainda não são
bem conhecidos e nenhum método está estabelecido para extração em escala
industrial. Na extração em escala industrial, os solventes devem ser de baixo custo,
voláteis (para serem facilmente separados do soluto), de baixa toxicidade, puros,
imiscíveis em água e seletivos para compostos de interesse (GRIMA et al., 1999).
4.4.3.3 Métodos de extração de lipídeos com solventes
Um dos sistemas mais eficientes para extração de lipídeos a partir de
microorganismos é a mistura de clorofórmio: metanol (2:1 v/v) (FOLCH et al., 1957)
e este procedimento foi melhorado por Bligh & Dyer (1959). Este método é também
o mais citado para a extração de lipídeos a partir de microalgas, nos últimos 60 anos
com mais de 38.000 citações em periódicos indexados. A mistura,
clorofórmio:metanol é tradicionalmente utilizada para determinação de lipídeos totais
a partir de diferentes espécies de microalgas em escala laboratorial (RYCKEBOSCH
et al., 2012). Entretanto, em grande escala é inviável sua utilização por razões
ambientais e riscos para a saúde (HARA & RADIN, 1978). Para efeitos práticos, a
extração total de lipídeos é completa e a separação de lipídeos e não-lipídeos é
quantitativa.
Em estudo recente conduzido por Burja et al., (2007) vários métodos de
extração de lipídeos foram testados para microalga Thraustochytrium sp., estes
autores utilizaram o método de Bligh & Dyer com três modificações. Os resultados
foram comparados com a saponificação direta de biomassa, usando KOH em etanol
ou a mistura hexano:etanol. A maior recuperação dos ácidos graxos (71,4 %) foi
obtida utilizando-se o método de Bligh & Dyer associado com a sonda de ultrassom,
semelhante ao rendimento obtido por saponificação direta usando KOH (69,7 %).
Outras misturas e métodos para obtenção de lipídeos foram testados por
Guckert & Colaboradores (1988) utilizando a microalga Chlorella. Estes autores
compararam os rendimentos de três procedimentos de extração com o propósito de
determinar o mais eficiente: i) Método de Soxhlet (cloreto de metileno/metanol, 3
horas, sob refluxo), ii) hexano:isopropanol, (3:2 v/v) e iii) o método de Bligh & Dyer
27
original. Este estudo demonstrou que o método de Bligh & Dyer foi o mais eficiente e
reprodutível na recuperação de todos os lipídeos da Chlorella. A mistura
hexano:isopropanol foi seletivo para lipídeos neutros de algas com baixa
recuperação dos lipídeos da membrana (principalmente glicolipídeos e
fosfolipídeos). Finalmente, o método Soxhlet foi o que apresentou menor
rendimento.
O método para extração deve ser rápido e eficiente a fim de reduzir a
degradação dos lipídeos e triacilgliceróis. Atualmente acredita-se que o processo de
extração represente a principal limitação para uso dos lipídeos de microalgas como
combustíveis.
4.5 Métodos de rompimento celular
Microalgas como a Chlorella tem uma parede celular resistente, que é uma
grande barreira para os processos de extração sendo o procedimento para quebra
da parede celular uma operação importante para obtenção dos compostos de
interesse. A parede celular desempenha um importante papel no processo de
extração, por exemplo, a presença de parede celular, pode impedir o contato direto
entre o solvente e a membrana celular e dificultar a extração. A parede celular da
microalga confere rigidez e resistência às células, oferecendo proteção contra
estresse mecânico (MIDDELBERG, 1996; GÜNERKEN et al., 2015). A parede
celular é um polímero extracelular composto de polissacarídeos, proteoglicanos,
peptideos, proteínas e elementos inorgânicos associados. A quebra da parede
celular de acordo com Günerken et al., (2015) é uma das etapas mais críticas para
extração dos compostos de interesse e podem ser encontradas na literatura uma
ampla variedade de métodos para este fim (Tabela 4.13).
Uma das técnicas que vem sendo amplamente aplicada para quebra da
parede celular de microalgas é o procedimento mecânico utilizando moinho de bolas
(FERREIRA et al., 2013). Este procedimento age no rompimento celular por atrito da
células de microalgas contra as superfícies sólidas de bolas de metal ou vidro em
uma agitação constante. Outra técnica comumente aplicada para este fim, é o
microondas, que quebram as células usando o choque de ondas de alta frequência e
esta técnica foi sugerida recentemente como uma técnica para a extração de óleos
vegetais (CRAVOTTO et al., 2008; VIROT et al., 2008) e de microalgas
(BALASUBRAMANIAN et al., 2011).
28
Tabela 4.13: Técnicas de rompimento celular
Método de ruptura Referências
Moinho de bolas ENGLER (1985); FERREIRA et al., (2013); POSTMA et al., (2015); BALASUNDARAM et al., (2012)
Microondas BALASUBRAMANIAN et al., (2011)
Tratamento químico MENDES-PINTO et al., (2001), HARUN & DANQUAH (2011-b), HARUN et al., (2011-a), HALIM et al., (2012a), MIRANDA et al., (2012)
Ultrasonicação CHANDLER et al., (2001), BORTHWICK et al., (2005), GOGATE & PANDIT (2008)
Homogeneização por alta pressão
SPIDEN et al., (2013); SPIDEN et al., (2015); GRIMI et al., (2014)
Corrente pulsada GANEVA et al., (1995); GOETTHEL et al, (2013)
Enzimático RODRIGUES & BOM (2011); HARUN & DANQUAH (2011-a); LIANG et al., (2012)
Visando o aumento da eficiência de extração dos lipídeos de algumas
microalgas, o uso de equipamentos para a quebra prévia da parede celular, quando
comparados com os métodos convencionais (extração por solvente), melhoraram a
eficiência de extração do óleo (LEE et al., 2010). Para a extração dos lipídeos das
microalgas Chlorella vulgaris, Scenedesmus sp. e Botryococcus sp., foram utilizadas
as técnicas de trituração, autoclave, choque osmótico, microondas e ultrasonicação
combinada com a posterior adição da mistura de solventes clorofórmio:metanol (2:1
v/v), visando o rompimento da parede celular. Neste caso, a utilização de
microondas e a trituração aumentaram significativamente a quantidade de lipídeos
extraídos. Consequentemente, o pré-tratamento da amostra e o uso de solventes
apropriados proporcionam um aumento na quantidade de lipídeos extraídos (LEE et
al., 2010).
Estudos revelaram que a homogeneização é eficaz no rompimento celular,
sendo o sucesso desse método influenciado pela alta pressão do sistema e do
número de passagens afetando diretamente o grau de ruptura das células. Uma das
vantagens desse método é a utilização direta da biomassa úmida, porém não
dispensa a utilização de solventes para extração de compostos de interesse. A
homogeneização por alta pressão é indicado na literatura como um método de
possível aplicação industrial para ruptura celular (SAMARASINGHE et al., 2012).
29
Deverão ser realizados mais investimentos e pesquisas em tecnologias
visando à quebra de parede celular das microalgas. O sucesso de técnicas de
rompimento celular é geralmente avaliado por meio de observações microscópicas
ou por comparação do componente desejado, antes e após aplicar o rompimento
celular. Devido à diversidade na composição das paredes celulares é necessário
realizar uma varredura para caracterização das microalgas para que se possa
projetar uma eficiente unidade de pré-tratamento da biomassa.
4.6 Compostos antioxidantes
As microalgas são organismos que estão expostos ao oxigênio e a altas
intensidades de luz e consequentemente, têm desenvolvido vários sistemas de
proteção eficazes contra espécies reativas de oxigênio e radicais livres. Devido a
esta capacidade, as microalgas tem recebido atenção por produzir vários compostos
antioxidantes (compostos fenólicos, carotenoides, micosporinas, ficobiliproteínas e
outros) de forma a protegê-las contra os efeitos nocivos das espécies reativas de
oxigênio. Os antioxidantes são compostos químicos capazes de reagir com radicais
livres e assim, limitar os seus efeitos prejudiciais, retardando a taxa de oxidação por
meio de um ou mais mecanismos, incluindo a inibição de radicais livres e de
complexação de metais (PIMENTEL et al., 2005). Por exemplo, os compostos
fenólicos, antioxidantes naturais formados por um anel aromático e os substituintes
ligados à estrutura, proporcionam a capacidade de sequestrar as espécies reativas e
estes compostos estão presentes em elevadas concentrações nas microalgas
(MARINOVA & YANISHLIEVA, 2003). De acordo com Goh & Colaboradores (2010)
foram avaliadas as propriedades antioxidantes dos diferentes extratos obtidos com
os solventes: hexano, diclorometano, clorofórmio e metanol a partir de Chaetoceros
sp. e Nannochloropsis sp. A avaliação da capacidade antioxidante foi feito pelo
método de DPPH e em geral, a Chaetoceros sp. apresentou capacidade
antioxidantes mais elevada do que Nannochloropsis sp. Este estudo sugere que
diferentes extratos obtidos a partir dos diferentes solventes contêm diferentes
potenciais antioxidantes. De acordo com literatura, o teor e o tipo de compostos
antioxidantes dependem de alguns fatores como a espécie de microalgas, condições
de crescimento e dos solventes utilizados para extração desses compostos
(BATISTA et al., 2010).
30
A atividade antioxidante de compostos fenólicos também pode ser comparada
aos antioxidantes sintéticos, compostos utilizados em grandes quantidades por
vários setores da indústria química global. Além disso, os compostos fenólicos têm
demonstrado capacidade bioativa (OZ & EBERSOLE, 2010; SHANAB et al., 2012).
Os antioxidantes a partir de microalgas estão sendo um dos temas mais promissores
na área de biotecnologia e o aumento dos cultivos de microalgas em maior escala
apontam estes microorganismos como possível fonte de antioxidantes naturais.
4.7 Material insaponificável
Os insaponificáveis são definidos como o total dos componentes dissolvidos
em óleos e gorduras que, após saponificação alcalina, permanecem como resíduo
não reagido e não volátil, sendo solúveis em solventes apolares (MATISSEK et al.,
1998). Estes insaponificáveis contêm principalmente carotenoides, fitoesteróis e
seus derivados (vitamina E), além de alguns componentes menores como clorofila,
polifenóis, hidrocarbonetos e alcoóis terpênicos. Por exemplo, o óleo de palma é
conhecido por apresentar um elevado teor de carotenoides na fração insaponificável
(500 – 700 mg.Kg-1) outros teores e perfis de insaponificáveis de alguns óleos
vegetais podem ser observados na Tabela 4.15 (GUNSTONE & PADLEY, 1997;
GUNSTONE, 2002). Os insaponificáveis são ingredientes nobres para indústria
química e farmacêutica devido às descobertas recentes dos seus inúmeros
benefícios à saúde (GÜÇLÜ-ÜSTÜNDAG & TEMELLI, 2004).
Como consequência dessas descobertas, o interesse na incorporação de
compostos obtidos a partir da fração insaponificável na formulação de cosméticos ou
suplementos nutricionais também aumentou muito. Neste caso, pode-se citar como
exemplos a incorporação de fitoesteróis e β-caroteno em margarinas e outros
alimentos bem como o preparo de microcápsulas contendo vitamina E esteróis
(MOREAU et al., 2002).
31
Tabela 4.14: Fração insaponificável de óleos vegetais
Fonte: Adaptado de GUNSTONE & PADLEY, 1997; GUNSTONE, 2002
As principais formas de obtenção dos insaponificáveis são por síntese
química, geralmente simples e de baixo custo, ou por extração e isolamento a partir
de óleos e gorduras. Também podem ser obtidos a partir de subprodutos do refino
por meio de diversos processos tais como: extração líquido-líquido (BHOSLE &
SUBRAMANIAN, 2005), extração com fluido supercrítico (LAU et al., 2007),
cristalização fracionada (XU et al., 2005), destilação molecular (MORAES et al.,
2006), saponificação (BHOSLE & SUBRAMANIAN, 2005), adsorção (ROSSI et al.,
2001) ou separação por membranas (SUBRAMANIAN et al., 2001).
Para extração da matéria insaponificável da biomassa de microalgas via rota
úmida Grima et al., (2012) realizaram a saponificação direta na presença de KOH e
etanol a temperatura ambiente durante 8 horas e 1 hora a 60 °C. Depois da
saponificação, a matéria insaponificável foi removida pela adição de hexano, a
fração hidroalcoólica contendo os sais de ácidos graxos foi acidificada pela adição
de HCl. A saponificação direta da biomassa de microalgas permite a obtenção de
ácidos graxos na forma de sais em lugar da fração lipídica bruta. Além dos ácidos
graxos, utilizando-se o mesmo processo também se obteve o material
insaponificável rico em carotenoides e outros compostos.
A busca por métodos de extração da matéria insaponificável em óleos
vegetais foi um desafio inovador na ultima década, visto que essa fração apresenta
grande interesse comercial.
Óleos Insaponificáveis (%)
Fitoesteróis (mg Kg
-1)
α- Tocoferol (mg Kg
-1)
Carotenoides (mg Kg
-1)
Algodão 1,5-2,0 2700-5900 389 -
Amendoim 0,4-1,0 900-2900 130 -
Palma 1,2 400-500 130-260 500-700
Oliva 0,5-1,5 1200-2700 119 1-20
Canola 1,2-20 4800-11300 210 130
Soja 0,5-1,6 1800-4100 75-117 -
Girassol 1,5 2400-4500 787-608 1,0-1,5
Arroz 3-5 1800 800 -
32
4.7.1 Carotenoides
Os carotenoides são tetraterpenoides de 40 carbonos unidos por unidades
opostas no centro da molécula, a ciclização, hidrogenação, desidrogenação,
migração de duplas ligações, encurtamento ou alongamento da cadeia, rearranjo,
isomerização, introdução de funções com oxigênio ou a combinação destes
processos resultam na diversidade de estruturas dos carotenoides. Carotenoides
formados somente de carbono e hidrogênio e são chamados de carotenos e os
carotenoides oxidados, são xantofilas. A cadeia poliênica pode ter de 3 a 15 duplas
ligações conjugadas e o comprimento do cromóforo determina o espectro de
absorção e a cor da molécula (RODRIGUES-AMAYA, 1999). Os carotenoides são
um grande grupo de pigmentos presentes na natureza, com mais de 600 estruturas
caracterizadas e identificados em organismos fotossintetizantes e não
fotossintetizantes plantas superiores, fungos, bactérias e microalgas (FRASER &
BRAMLEY, 2004). Algumas informações sobre os principais carotenoides e
xantofilas estão listadas no trabalho de Uenojo et al., (2007) e algumas estruturas
dos carotenoides citados estão ilustrados na Figura 4.5. As principais microalgas
fontes de carotenoides são: Chlorella, Chlamydomonas, Dunaliella, Muriellopsis e
Haematococcus sp., todas pertencentes à família Chlorophyceae (PULZ & GROSS,
2004). Especificamente, cantaxantina, astaxantina e luteína, obtidos a partir de
Chlorella, têm sido utilizadas regularmente como pigmentos na indústria de produtos
naturais (GUERIN et al., 2003). De acordo com estudos recentes (CYSEWSKI &
LORENZ, 2004) os pigmentos oriundos das microalgas apresentaram uma demanda
importante no mercado mundial. Vários pesquisadores têm concentrado esforços na
avaliação da capacidade antioxidante de carotenóides de microalgas, para
aplicações industriais não somente na indústria de alimentos, mas principalmente
para fármacos e cosméticos devido ao alto valor agregado desses compostos
(SPOLAORE et al., 2006). Por exemplo, o β-caroteno tem sido procurado como pró-
vitamina A (retinol) em suplementos vitamínicos, o que é normalmente incluído na
formulação de alimentos nutracêuticos (MURTHY et al., 2005). Dentre todas as
fontes naturais estudadas até o momento, a microalga Dunaliella foi a que
apresentou o maior teor de 9-cis-β-caroteno (BEN-AMOTZ, 1999) atingindo níveis de
até 100 g.kg-1 massa seca).
33
Os pigmentos encontrados nas microalgas são lipofílicos e a extração
geralmente associada com a extração de lipídeos, de acordo com Hua-bin &
Colaboradores (2002). Estes pesquisadores isolaram e purificaram a luteína extraída
a partir da microalga Chlorella vulgaris. Os extratos de luteína obtidos com diferentes
proporções dos solventes etanol-água-diclorometano foram identificados e
analisados em CLAE. A pureza final da luteína obtida foi de 90 - 98 % e o
rendimento foi de 85 - 91 %.
Figura 4.5: Algumas estruturas moleculares de carotenoides encontrados nas microalgas. Fonte: DUFOSSÉ et al.,2005
4.8 Potencial das microalgas para produção de biocombustíveis
A constante ascensão na demanda de biocombustíveis juntamente com a
preocupação em relação aos impactos ambientais tem sido os principais motivos
que fortalecem a busca por novas alternativas de energias renováveis. O termo
biocombustível pode ser definido como uma fonte de combustível derivado de
fixação do carbono ou a redução do CO2 em compostos orgânicos catalisadas por
organismos vivos (DERMIBAS, 2009; DEMIRBAS, 2009-a). A produção de
biocombustíveis visa suprir a necessidade de novas tecnologias e ao mesmo tempo
conciliar ideias ambientalmente corretas com a capacidade de aproveitamento de
resíduos (BORGES, 2010). Inúmeros tipos de biomassa podem ser identificados
como fontes alternativas para a produção de energias limpas. Existem várias
4
34
definições do termo biomassa, entre elas: a quantidade total de matéria orgânica
viva em nosso sistema ecológico; o material das plantas produzido constantemente
pela fotossíntese; a massa das células de plantas, animais e microorganismos
usados como matérias-primas em processos microbiológicos (LIMAYEN & RICKE,
2012). Recentemente,foi sugerida uma definição de biomassa no contexto de
utilização industrial. O termo “biomassa industrial” significa qualquer matéria
orgânica que está disponível em base recorrente ou renovável, incluindo plantas,
resíduos agrícolas, plantas aquáticas, madeira e resíduos de madeira, dejetos de
animais, resíduos urbanos e outros resíduos usados para produção industrial de
energia, combustíveis, químicos e materiais (SINGH & GU, 2010). Uma alternativa
emergente é a utilização de biomassa aquática. Estima-se que a produção primária
global de biomassa seja 50 % aquática e 50 % terrestre outras fontes de biomassa
podem ser observadas na Figura 4.6. Até hoje as políticas de governo têm focado
quase que exlusivamente no uso de biomassa terrestre, dando pouca atenção às
culturas aquáticas, tendo como exemplos macro e microalgas (BORGES, 2010).
Figura 4.6: Fontes de biomassa. Fonte: Adaptado de BORGES, 2010.
Culturas aquáticas oferecem a possibilidade de aumentarem
significativamente a disponibilidade de biomassa para obtenção de energia fato que
norteia as pesquisas de obtenção e processamento eficientes de biomassa
(BORGES, 2010). As microalgas são referenciadas na literatura para obtenção de
biocombustíveis (BENEMANN, 2008; PENG et al., 2001; PENG et al., 2000; VIÊGAS
et al., 2015; BRANDENBERGER et al., 2013; BILLER & ROSS, 2011; SIALVE et al.,
2009; EHIMEN, 2010; D´OCA et al., 2010; VIÊGAS, 2010; ALMARALES et al., 2012;
35
REYES et al., 2012; SUKARNI et al., 2014) a partir de diversos processos conforme
ilustrado na Figura 4.7.
Figura 4.7: Biocombustíveis de microalgas: Gasosos e Líquidos. Fonte: Adaptado de BORGES, 2010.
4.8.1 Biodiesel
O biodiesel é uma mistura de monoalquil ésteres de cadeia longa derivado de
matérias-primas renováveis. O biodiesel é produzido industrialmente a partir de
óleos e gorduras vegetais e animais. É um combustível limpo e renovável e é
definido como uma mistura de monoalquil ésteres metílicos ou etílicos de ácidos
graxos (NAIK et al., 2006; FUKUDA et al., 2001; MARCHETTI et al., 2007).
O biodiesel pode também ser produzido a partir de resíduos de óleos e
gorduras, além de microorganismos como as microalgas (CHISTI, 2007; XU et al.,
2006; HUANG et al., 2010) que devido ao elevado teor lipídico podem ser
consideradas matérias-primas promissoras na produção desse biocombustível.
Para produção de biodiesel podem ser utilizados principalmente os processos
transesterificação ou/e esterificação, sendo o processo de transesterificação ou
alcóolise o mais adotado comercialmente. O biodiesel apresenta algumas vantagens
sobre o óleo diesel: é derivado de matérias-primas renováveis, reduz a atual
dependência sobre os derivados do petróleo e é biodegradável (ALCÂNTARA et al.,
2000). Iniciando pelo processo de extração do óleo as etapas do processo
convencional para produção de biodiesel por transesterificação pode ser observado
na Figura 4.8.
36
Figura 4.8: Esquema simplificado do processo convencional para produção de Biodiesel. Fonte: Adaptado de POLIZEL et al., 2006
A produção de biodiesel a partir de microalgas foi apresentada na literatura
primeiramente a partir de rotas convencionais (XU et al., 2006; HOSSAIN et al.,
2008; NAGLE & LEMKE, 1990; VIÊGAS, 2010), que envolvem a extração dos
lipídeos seguidos pela reação de transesterificação. Para a transesterificação do
óleo das microalgas, o metanol e o ácido sulfúrico são os reagentes mais utilizados
na obtenção dos ésteres metílicos (XU et al., 2006; JOHNSON & WEN, 2009;
EHIMEN et al., 2010.; MATA et al., 2010; NAGLE & LEMKE, 1990). Pesquisas
utilizando-se microalgas como matéria prima para produção de biodiesel vêm sendo
realizadas por diferentes pesquisadores com o objetivo de selecionar as variáveis
que influenciam no rendimento e na qualidade do produto, bem como nos custos do
processo. De uma forma geral, o processo de extração seguido de transesterificação
para obtenção biodiesel de microalgas está descrito na Figura 4.9 na qual podem
ser observadas as várias etapas de up e downstream envolvidas para obtenção
desse biocombustível.
No inicio da década de noventa, Nagle & Lemke (1990) utilizaram dois tipos
de catalisadores (HCl e NaOH) para a conversão do óleo de microalgas em
biodiesel. Estes autores mostraram que o uso de catalisadores ácidos para
produção de ésteres metílicos a partir de microalgas resultou em maiores
rendimentos se comparado ao uso de catalisadores básicos nas mesmas condições.
A influência da concentração do catalisador, tempo e temperatura da
transesterificação também foram investigadas utilizando as seguintes condições HCl
(0,6 M) em metanol por 1 hora a 70°C. Foram obtidos neste experimento 68 % de
conversão dos lipídeos em ésteres metílicos.
37
Figura 4.9 – Produção de biodiesel de microalgas. Fonte: Adaptado de HALIM et al.,2012
De acordo com a literatura, Xu et al., (2006) determinaram os efeitos da
quantidade de catalisador, razão molar metanol:óleo, tempo e temperatura de
reação no rendimento e nas propriedades do biodiesel produzido a partir do óleo de
Chlorella protothecoides, para isso testaram diferentes proporções de óleo:H2SO4 o
em relação à massa de óleo, temperaturas de reação entre 30 a 90 °C e diferentes
razões molares de álcool:óleo. As melhores condições de reação foram 1:1 de
catalisador:óleo, 56:1 razão molar metanol: óleo e 30 °C em 4 horas de reação.
Segundo a literatura algumas propriedades físico-químicas do biodiesel de
microalgas foram determinadas e foram compradas com as especificações exigidas
pela ANP para um biodiesel comercial (Tabela 4.15).
38
Tabela 4.15: Comparação das propriedades do biodiesel de microalgas com o biodiesel comercial (Resolução N°45/ 2014 da ANP)
Fonte: MOSTAFA & EL-GENDY, 2013;HAKALIM, 2014; El-SHIMI et al., 2013
4.8.2 Biodiesel in situ ou reação direta
Atualmente, muitos pesquisadores vêm investigando a produção de biodiesel
a partir de microalgas e têm focado os estudos no desenvolvimento de uma etapa
alternativa no processo de downstream denominado extração/transesterificação ou
transesterificação direta ou processo in situ (WAHLEN et al., 2011). Este método
envolve a adição simultânea de um catalisador ácido e álcool puro à biomassa de
microalgas (geralmente via rota seca).
Recentemente, o processo in situ foi utilizado para obter o biodiesel a partir de
várias microalgas na presença de catalisadores como: H2SO4 (EHIMEN et al., 2010;
HAAS & WAGNER, 2011; JOHNSON & WEN, 2009; WAHLEN et al., 2011), KOH
Propriedades
Biodiesel de microalgas
Biodiesel Comercial
Densidade (Kg/m2 a 20 °C)
836,8 850-900
Viscosidade (mm2/s a 40 °C)
4,8 3-6
Teor de água (mg Kg -1)
39 200
Teor de Éster (% m/m)
94,3 96,5 mín.
Glicerol livre (% m/m) 0,068 0,02 máx.
Glicerol Total (% m/m) 0,026 0,25 máx.
Monoglicerídeos (% m/m)
0,075 0,70 máx.
Diglicerídeos (% m/m)
0,003 0,20 máx.
Triglicerídeos (% m/m)
Não detectado 0,20 máx.
Número de Cetano
70 Anotar
Corrosividade ao Cobre a 80°C
1a 1a-4b
Ponto de Fulgor (°C)
189 Acima de 100
Teor de Cinzas (% massa)
Não detectado 0,02 máximo
Índice de acidez (mg KOH, g-1
)
0,75 Max 0,5
Poder calorífico (MJ/Kg)
41 40-45
Índice de Iodo (mg de I2/g de amostra)
120 Anotar
Estabilidade oxidativa (horas)
3,3 8 horas
39
(PATIL et al., 2011; XU & MI, 2011), SrO (KOBERG et al., 2011) e Nb2O5/Al2O3
(ALMARALES et al., 2012)
Ehimen & Colaboradores (2010) estudaram as variáveis que influenciam nos
custos do processo de transesterificação in situ para produção de biodiesel a partir
da microalga Chlorella avaliando a influência do volume de álcool, temperatura,
tempo de reação, agitação e teor de umidade da biomassa no rendimento de
reação. Neste estudo, a proporção de catalisador, H2SO4, foi mantida constante em
100 % (em relação à massa de óleo da microalga). Estes autores observaram que o
rendimento do produto aumenta com o aumento da temperatura e do volume de
álcool, porém, a partir de 60 mL de álcool (correspondente à razão molar álcool: óleo
de 315:1) para a faixa de temperatura de 60 a 90 °C este aumento não foi
significativo. A 90 °C os rendimentos foram de 70 % e 92 % após 15 minutos e 1
hora de reação, os autores observaram também, que após 2 horas de reação a 60 e
90 °C não houve diferença significativa nos rendimentos, que o aumento do teor de
umidade teve influência negativa no rendimento de biodiesel e a transesterificação in
situ foi inibida quando o teor de água foi maior que 115 % em relação à massa de
óleo.
Chen & Colaboradores (2013) obtiveram o biodiesel a partir da microalga
Chlorella sorokiniana por meio de um processo de pré-esterificação usando
catalisador heterogêneo (Amberlist-15) para reduzir o teor de AGL antes da
transesterificação. As duas etapas do processo in situ resultaram num total de 94,87
± 0,86 %, de esteres que foi muito superior ao obtido em apenas uma etapa do
processo (com catalisador básico ou ácido, 50 – 60 % de EMAG). Ainda segundo os
mesmos autores o catalisador heterogêneo, Amberlyst-15, poderia ser reutilizado em
8 ciclos sem perda significativa da atividade. Este processo, utilizando catálise
heterogênea, têm o potencial de reduzir o custo de produção de biodiesel de
microalgas devido a reutilização do catalisador e diminuição da etapa de extração
dos lipídeos.
O potencial da microalga Arthrospira platensis foi investigado por El-Shimi et
al., (2013) para avaliar os efeitos das variávies que afetam a reação de
transesterificação in situ. Alguns parametros reacionais foram analisados como: o
volume de metanol, a concentração de um catalisador ácido, tempo, temperatura e
agitação sobre o rendimento de biodiesel. As melhores condições testadas foram
100 % de catalisador/g de óleo, 80 ml volume de metanol, 8 horas de tempo de
40
reação e a 65 °C de temperatura com agitação contínua a 650 rpm, obtendo-se um
produto com 84,7 % de esteres metílicos.
Lewis & Colaboradores (2000) estudaram a extração sobre duas espécies de
microalgas através de dois procedimentos: (i) a extração de lipídeos a partir de
biomassa pelo o método de Bligh & Dyer seguido de transesterificação do material
graxos (extração-transesterificação) e (ii) transesterificação direta da biomassa para
a produção de EMAG (ou seja, sem a etapa de extração inicial). Para as duas
espécies estudadas a transesterificação direta de biomassa foi mais eficiente do que
o método de extração de ácidos graxos seguida da transesterificação.
Recentemente, esta transesterificação direta catalisada por ácido tem
provado ser uma tecnologia promissora para a produção de biodiesel a partir de
matéria-prima que contém grandes quantidades de ácidos graxos livres, tais como
óleo de semente de Jatropha curcas (SHUIT et al., 2010).
A produção de biodiesel é baseada principalmente no uso de óleos refinados
como matéria-prima, o que contribui com até 70 % do custo total do biodiesel (HAAS
et al., 2006). Portanto, reduzir o custo do processo de extração e purificação dos
lipídeos, pode ser uma maneira mais viável para reduzir os custos de produção do
biodiesel de microalgas (GUEDES et al., 2011). Uma das principais desvantagens
associadas a este método (processo in situ) é a necessidade de secagem da
biomassa de microalgas. A desidratação e secagem de biomassa de microalgas de
acordo com algumas referências bibliográficas, se faz necessária, pois a presença
de água inibe severamente a produção de biodiesel (LIU et al., 2006.; CARRAPISO
& GARCIA, 2000; HAAS & SCOTT, 2006; JOHNSON & WEN, 2009; EHIMEN et al.,
2010.; GRIFFITHS et al., 2010).
4.9 Biorrefinarias a partir de microalgas
O conceito essencial de uma biorrefinaria é o de um processamento
sustentável em uma planta industrial que integra diversos processos para produzir
combustíveis, produtos químicos de alto valor agregado e energia (REE &
ANNEVELINK, 2007). Especialistas acreditam que as biorrefinarias possam vir a
construir uma indústria-chave do século XXI, responsável até mesmo por uma
revolução industrial, em virtude da importância das tecnologias que empregam . Por
se tratar de um ser vivo, a biomassa de microalgas apresenta uma composição de
41
C:H:O:N diferente do petróleo. Uma vez que esta biomassa apresenta uma
composição complexa, é apropriado fazer uma separação dos principais grupos de
substâncias que a compõem (BORGES, 2010). Os tratamentos e processamentos
subsequentes desses compostos conduzem a uma gama de diferentes produtos
podem como ilustrado na Figura 4.10.
Figura 4.10: Microalga Biorrefinaria: Conceito: Produção e Valorização. Fonte:Adaptado de CARLSSON et al., 2007
O principal foco das biorrefinarias é dirigido aos chamados precursores:
carboidratos, óleos e proteínas e à combinação entre conversões biotecnológicas e
químicas das substâncias para obtenção de produtos intermediários e finais
(BORGES, 2010). Os principais tipos, aspectos e as principais características de
biorrefinarias estão descritas na Tabela 4.16.
42
Tabela 4.16: Resumo dos principais conceitos de biorrefinarias
Fonte: Adaptado de BORGES, 2010.
O conceito de biorrefinarias a partir de microalgas foi proposto por Wijffels &
Colaboradores (2012) e envolve uma sequência de operações unitárias para
obtenção de produtos de interesse:
1) Rompimento celular: Serve para liberar os produtos ou para torná-los disponíveis
para a extração. Quando os produtos são liberados das células, diferentes técnicas
de extração e de separação devem ser utilizadas. É importante salientar que
diferentes tecnologias para o rompimento celular podem ser adaptadas devido a
grande variabilidade de composição bioquímica da parede celular das microalgas.
2) A extração de proteínas, lipídeos e carboidratos deve ser realizada utilizando
condições e métodos brandos, pois todos os componentes disponíveis nessa
biomassa precisam manter a sua funcionalidade.
3) Além disso, o fracionamento das diferentes frações da biomassa deve ser
realizado para obtenção de produtos específicos, por exemplo, os ômegas 3 e 6.
Estes ácidos graxos devem ser separados da fração lipídica, pois influenciam
Conceito Tipo de alimentação Tecnologia predominante
Biorrefinarias Verdes
Biomassa úmida: como grama e pastagens
Pré-tratamento, pressurização, fracionamento, separação e digestão
Biorrefinarias de Cereais
Colheita integral (inclusive o bagaço): cereais como centeio, trigo e milho
Moenda seca ou úmida e conversão bioquímica
Biorrefinarias de Lignocelulose
Biomassa rica em lignocelulósicos: como bagaço, nós, cana e madeira
Pré-tratamento,hidrólise química e enzimática, fermentação e separação
Biorrefinarias de Plataforma dual
Todos os tipos de biomassas
Combinação de plataforma de açúcar (conversão bioquímica) e plataforma de gás de síntese (conversão termoquímica)
Biorrefinarias Termoquímicas
Todos os tipos de biomassas
Conversões termoquímicas: torrefação, pirólise, gaseificação, separação de produtos, síntese catalítica
Biorrefinarias Aquáticas
Biomassa aquática: micro e macroalgas
Ruptura celular, extração e separação de produtos
43
negativamente na qualidade do biodiesel. Em geral os lipídeos para biocombustíveis
possuem baixo preço de mercado (cerca de R$ 2,1/litro), o que é uma razão
adicional para explorar o conceito de biorrefinaria. De acordo com o mercado atual
os lipídeos podem ser mais rentáveis se os ácidos graxos poliinsaturados forem
separados e comercializados. Atualmente os óleos ricos em ômega-3 e ômega-6,
como por exemplo, o óleo de cártamo apresenta valor de mercado superior a R$
81,00/ litro.
Após a extração do óleo, a torta residual pode ser usada como ração
animal, produção de biogás por digestão anaeróbica e posterior cogeração de
energia elétrica. Este potencial de reaproveitamento pode ser incorporado pelas
outras receitas, geradas pela comercialização dos subprodutos da biomassa e da
biodigestão. O aproveitamento dos coprodutos poderá contribuir para redução dos
custos de produção do biodiesel (CHISTI, 2007).
Alguns exemplos podem ser citados na aplicação do conceito de
biorrefinaria a partir de microalgas, em um estudo recente realizado por Nobre et al.,
(2013) utilizando a Nannochloropsis sp. avaliou-se a possibilidade de produzir
pigmentos com posterior extração de óleos para produção de biodiesel e utilização
final da biomassa residual para produção de bio-hidrogênio. De acordo com estes
autores a biorrefinaria de microalgas foi aplicada com sucesso e os coprodutos
gerados apresentaram ampla aplicação industrial. De forma a tornar mais
sustentável este processo e aumentar a viabilidade econômica, os sistemas de
cultivos de microalgas deverão ser implantadas junto às instalações industriais e
zonas de tratamento de efluentes (SLADE & BAUEN, 2013).
Diversos estudos em escala laboratorial têm sido realizados aplicando o
conceito de biorrefinaria (SUBHADRA & GRINSON, 2011; YEN et al., 2013; SAFI
2013; WIJFFELS et al., 2010; WIJFFELS et al., 2013). No entanto, a análise
econômica e o scale up para escala industrial estão em estágios iniciais de
desenvolvimento.
CAPÍTULO 5-MATERIAS E MÉTODOS
5.1 Materiais e matéria-prima
Esta tese de doutorado foi desenvolvida no Laboratório de processos
químicos da ABO Akademy (Finlândia), GREENTEC e no laboratório de
processamento de matérias primas vegetais (LADEQ) ambos na escola de Química
da UFRJ. Os materiais utilizados foram: balanças analíticas e semi-analíticas, estufa,
vidrarias diversas como balões de vidro, béqueres, erlenmeyers, condensadores,
provetas, pipetas, espátulas e funis de separação. Os reagentes químicos utilizados
foram: Álcool metílico (99.9 % Tédia), Hexano (Pró-Quimios), Clorofórmio (Pró-
Quimios) Etanol (96 % Tédia), KOH em pastilha (Pró-Quimios) e H2SO4 (98 % Pró-
Quimios). As extrações utilizando etanol sob pressão foram realizadas em um reator
tipo autoclave (Parr Instruments Inc. - Modelo 4842), de aço inoxidável, com volume
útil de 300 mL e pressão máxima de trabalho de 3.000 psi. Para extrações e
reações, foi utilizada uma placa agitadora e aquecedora modelo Quimis (modelo
0261-22). Para as leituras em espectrofotômetro foi utilizado um equipamento da
marca BEL Photonics (modelo SP1105).
A microalga Chlorella sp. (Figura 5.1) foi produzida comercialmente pela
Fuking King Dnarmsa Arthospira Co Ltda® (China) comprada no Brasil diretamente
do distribuidor (Galena). O laudo emitido pela empresa forneceu a granulometria da
amostra (d<120 mesh) e a seguinte composição centesimal: 57,3 % de proteínas,
17,3 % de carboidratos, 12 % lipídeos, 2,3 % de clorofila, máximo de 7 % em
umidade e cinzas e 12 % em fibras. Para as extrações, a amostra foi conservada a
temperatura ambiente em recipiente protegido da luz e, umidade e segundo o
fabricante, foi seca por spray drier.
Figura 5.1: A) Biomassa de Chlorella liofilizada. B) Fotomicrografia da biomassa liofilizada de
Chlorella (aumento de 200x)
45
5.2 Metodologia
Para a execução deste trabalho foram realizados procedimentos visando à
caracterização da biomassa liofilizada Chlorella conforme os procedimentos
descritos na Figura 5.2. Ainda na mesma figura estão ilustradas de forma
simplificada as principais etapas para separação, quantificação e identificação de
lipídeos, ésteres metílicos, material insaponificável e saponificável.
Figura 5.2: Diagrama simplificado para caracterização da biomassa de Chlorella, separação e quantificação dos diferentes compostos e obtenção do biodiesel
Determinou-se o teor de lipídeos da biomassa seca de Chlorella sp.(A) fator
limitante para produção de biodiesel. Para este fim, selecionou-se o solvente extrator
e a metodologia mais apropriada para a matéria-prima em questão. Para extração
dos lipídeos, foram realizados experimentos com a biomassa íntegra e após pré-
tratamento em moinho de bolas, visando aumentar o transporte difusivo. Para fins
comparativos, selecionou-se diferentes solventes: clorofórmio:metanol, etanol,
46
metanol e hexano, e o processo de extração foi realizado com auxílio de agitação
magnética (D´OCA et al., 2010; VIÊGAS, 2010). Foi realizada uma nova
investigação usando o etanol como solvente com base em um planejamento
experimental completo com triplicata e ponto central para avaliar a eficiência da
extração dos lipídeos em Reator tipo autoclave (Parr Instruments Inc. - Modelo
4842). A escolha do etanol deve-se ao fato de que este é oriundo de fonte renovável
e é pouco agressivo ao meio ambiente
As frações lipídicas foram caracterizadas quanto o índice de acidez, FTIR
atividade antioxidante por DPPH (1). A matéria insaponificável da Chlorella foi
isolada e quantificada após saponificação dos lipídeos. Determinaram-se os
principais componentes dessa fração por espectroscopia de infravermelho bem
como identificação dos carotenoides por CLAE. As biomassas residuais obtidas
após extração dos lipídeos foram caracterizadas quanto ao teor de proteínas pelo
método de Kjeldahl.
Para obtenção dos ésteres metílicos (B) as reações foram conduzidas in situ,
ou seja, sem uma prévia extração dos lipídeos. Para estes experimentos foram
testadas diferentes condições operacionais nas quais foram avaliados os efeitos da
concentração do catalisador (H2SO4), da temperatura e do tempo de reação.
A argila utilizada para o processo de purificação do biodiesel foi caracterizada
pelas técnicas de área superficial, volume de poros e EDX. Os EMAGs (2) foram
caracterizados por FTIR, CED e CG-DIC. Outras propriedades físico-químicas do
biodiesel foram determinadas como: densidade, viscosidade, teor de água, índice de
acidez, teor de éster, teor de glicerídeos, teor de álcool, índice de iodo e estabilidade
oxidativa de acordo Resolução nº 45/2014 da ANP. Na biomassa residual (torta)
obtida após o processo in situ foram determinados os teores de proteínas e
carboidratos.
A matéria insaponificável da Chlorella (C) foi obtida in situ na presença de
KOH em etanol sob diferentes concentrações de KOH e a seguir o sabão foi
acidificado e convertido fração saponificável (D).
Na matéria insaponificável (3) foram aplicadas as técnicas de FTIR para
identificação dos principais compostos. Foi utilizado o CLAE para quantificação e
identificação dos carotenoides bem como foi testada a atividade antioxidante por
DPPH. A matéria insaponificável foi avaliada a capacidade antioxidante natural em
um biodiesel de soja. A fração saponificável foi caracterizada por FTIR e CG-DIC (4).
47
A partir da biomassa residual gerada neste procedimento foi determinado o teor de
proteínas nessa fração.
5.3 Caracterização da biomassa liofilizada de Chlorella sp.
5.3.1 Análise de microscopia eletrônica de transmissão
Para a análise morfológica da microalga liofilizada foi visualizada de acordo
com a metodologia descrita por Viêgas et al., (2015-a) e para os resíduos sólidos,
após o tratamento com 5 % em peso de KOH e 20 % em peso de H2SO4, foi
utilizada a microscopia eletrônica de tramissão. As amostras foram fixadas em 5 %
de glutaraldeido em 0,16 mol.L-1 de s-collidina, pH 7,4 e pós fixadas em 2 % de
OsO4 contendo 3 % ferrocianeto de potássio por 2 horas. As amostras foram
desidratadas em etanol e embebidas em epóxidos. As amostras foram examinadas
em um microscopio JEOL JEM-1400 Plus® utilizando uma câmera digital Quemesa
11 Mpix.
5.3.2 Análise de espectroscopia de infravermelho (FTIR)
A análise da biomassa liofilizada por espectroscopia de infravermelho foi
realizada em um equipamento da marca Shimadzu®-IR PRESTIGE-21. Os espectros
foram obtidos na faixa de 4000 a 400 cm-1 com resolução de 1 cm-1 usando 64
varreduras por espectro.
5.3.3 Análise de espectroscopia de raio-X por dispersão de energia
Para determinação da composição dos metais e minerais da microalga
liofilizada e também dos resíduos sólidos foi utilizada a microscopia eletrônica de
varrredura (Zeiss Leo Peixes 1530®) com um detector de raios-X ThemoNORAN. A
metododologia utilizada nesta análise foi descrita por Viêgas et al., (2015).
5.3.4 Análise elementar orgânica de CHNSO
A partir da análise elementar orgânica foram quantificados os seguintes
48
elementos, C, H, N, S e O na biomasssa liofilizada de Chlorella e nas biomassas
residuais e foram pesados aproximadamente 30 mg de amostra em uma balança de
precisão. As amostras foram colocadas em cápsulas de estanho e a digestão do
material foi feita em câmara de combustão em temperatura de aproximadamente
975 °C. Os gases foram detectados por um sensor de termocondutividade e
convertidos em porcentagem de carbono por analise automática com o auxílio do
instrumento Flash 2000 de Thermo Scientific® conforme descrito por Viêgas et al.,
(2015-a). Para todos os ensaios as análises foram realizadas triplicatas
5.3.5 Determinação do poder calorífico superior
Para determinação do poder calorífico superior da biomassa liofilizada de
Chlorella foi utilizada uma bomba calorimétrica de acordo com a norma ASTM D
2015 (2000), sendo os experimentos realizados em triplicata.
5.3.6 Determinaçao do teor de proteínas
A determinação da de proteínas foi realizado no laboratório de Tecnologia de
Alimentos da UFRJ coordenado pela professora Ana Lúcia Vendramini. Para
determinação de proteínas da biomassa e das correntes sólidas residuais utilizou-se
o método de Kjeldahl descrito por Lemões (2011) determinando-se o nitrogênio
proteico total. Todos os ensaios foram realizados em triplicatas.
5.3.7 Determinação dos teores de aminoácidos individuais totais
Esta análise foi realizada no Laboratório de Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência da EMBRAPA – Agroindústria de Alimentos, de acordo com a metodologia
descrita por Gorgônio, (2013). Foi empregada técnica de derivação pré-coluna,
desenvolvida por Cohen & Michaud (1993).
5.3.8 Identificação e quantificação de açúcares
A partir das amostras secas da Chlorella e da biomassa residual (20 % de
H2SO4) a fração de açúcares foi derivatizado na presença de TMS e posteriormente
49
analisados em cromatografia gasosa, usando o método descrito por Sunberg et al.,
(1996). O Resorcinol foi substituído por sorbitol como padrão interno. Para
identificação e quantificação dos açúcares presentes o cromatógrafo utilizado neste
procedimento foi o Perkin-Elmer Autosystem XL® com detector DIC.
5.3.9 Cromatografia de exclusão de tamanho (CET)
Conforme descrito por Viêgas et al., (2015) a biomassa liofilizada da
Chlorella foi agitada na presença de THF (Tetrahidrofurano) a 60 °C durante 1 hora
e a seguir analisada. Após a quantificação do rendimento por gravimetria, a fração
obtida foi diluída até a concentração de 1 mg/ml, a amostra foi filtrada e analisada
por CET. O sistema cromatográfico foi composto de um detector LT-ELS (Low
Temperature Evaporative Light-Scattering Detector, Sedex 85, Sedere LT-ELSD) um
desgaseificador (DGUl14A), uma bomba (FCV-10ALVP) e um coletor de fração
(Pharmacia LKB-Helifrac) acoplado a um sistema de controle (SCL-10AVP). Três
colunas, duas da marca Jordi Gel DVB 500A (tamanho 300mm x 7.8 mm) e outra da
marca Guard (tamanho 50 x 7.8 mm) foram usadas para separação dos compostos
obtidos integrados por um detector Shimadzu® Class-VP 8v.6.12 SP5.
5.3.10 Determinação do teor de cinzas
O teor das cinzas da biomassa liofilizada foi determinado por
termogravimetria conduzida em um equipamento modelo: Pyris-TGA marca Perkin
Elmer®,utilizando-se como gás inerte N2 de alta pureza a uma vazão de 20 mL.min-1
e uma faixa de temperatura de 20 ºC a 800 ºC conforme descrito por Viêgas et al.,
(2015). A composição das cinzas da biomassa foi determinada por EDX de acordo
com o procedimento descrito no item 5.3.3.
5.4. Extração de lipídeos
As etapas de extração e análise dos lipídeos obtidos a partir das microalgas,
com e sem pré-tratamento e em reator tipo autoclave, estão resumidas na Figura
5.3, abaixo:
50
Figura 5.3: Diagrama para extração dos lipídeos da biomassa de Chlorella
5.4.1 Extração dos lipídeos sem pré-tratamento da biomassa
As extrações foram realizadas em balão de 50 mL a partir de 3 g da biomassa
com volume de 9 mL de solvente de acordo com dados da literatura (FREITAS et al.,
(2007); VIÊGAS, (2010)). Utilizou-se a relação solvente/carga 3:1 (mL de solvente:
g de biomassa), tempo de extração de 2 horas, 120 °C e agitação de 200 rpm em
agitador magnético. Os solventes selecionados foram clorofórmio: metanol (2:1 v/v),
metanol, etanol e hexano e para a separação da biomassa da fase líquida (fração
lipídica + solvente) foi realizado um processo de filtração em papel filtro. A seguir a
biomassa foi lavada com 30 mL do solvente selecionado para a etapa de extração.
O solvente foi removido da solução extratora sob pressão reduzida e a fração
lipídica (não volátil nas condições operacionais) foi seca até peso constante em
estufa a 60 °C. O rendimento da extração foi determinado em massa de lipídeos
obtidos em relação à massa seca. A biomassa residual obtida em cada um dos
51
processos foi analisada quanto ao teor de proteínas de acordo com o método de
Kjeldahl (descrito na sessão 5.3.6).
5.4.2 Extração dos lipídeos com pré-tratamento mecânico da biomassa
Aproximadamente 100 gramas de biomassa liofilizada foram adicionadas ao
moinho de bolas (Retsch MM400®) durante 4 horas usando uma bola de aço inox
(10 cm), e uma frequência de 25 Hz. Ao fim deste tempo, a biomassa moída foi
cuidadosamente removida para uma placa de Petri. A seguir, os lipídeos foram
extraídos, de cerca de 3g de biomassa, sob agitação magnética, num balão de 50
mL com 9 mL de solvente orgânico. Os solventes extratores usados foram: uma
mistura de clorofórmio: metanol (2:1 v/v), metanol, etanol e hexano,
respectivamente. Após a adição do solvente, todas as extrações foram realizadas
submetendo-se as amostras à agitação magnética de 200 rpm durante 2 horas a 20
°C. A solução contendo a fração dos lipídeos extraída foi separada por filtração
(através de papel filtro) e a biomassa retida no filtro foi lavada com 30 mL do
solvente orgânico. O solvente foi evaporado e a fração lípidica foi seca até peso
constante em estufa a 60 °C e o rendimento da extração foi determinado em relação
à massa seca. A biomassa residual foi analisada quanto ao teor de proteínas de
acordo com o método de Kjeldahl (descrito na sessão 5.3.6).
5.4.3 Extração dos lipídeos com etanol em reator tipo autoclave
Aproximadamente 10 gramas de biomassa foram adicionados em um reator
tipo autoclave (Marca Parr Instruments Inc®. - Modelo 4842) nas condições
experimentais definidas no planejamento estatístico sob agitação de 200 rpm na
pressão exercida pelo sistema (veja Tabela 5.1). A seguir, as amostras foram
filtradas em papel filtro e lavadas com 30 mL de etanol. A fase alcoólica foi
evaporada a pressão reduzida (evaporador rotativo) e o rendimento da extração
foram determinados pela razão entre a massa do soluto obtida e a massa seca da
amostra. A biomassa residual foi analisada quanto ao teor de proteínas de acordo
com o método de Kjeldahl (descrito na sessão 5.3.6).
52
Tabela 5.1: Planejamento experimental adotado para avaliar a eficiência da extração de lipídeos em reator tipo autoclave e etanol*
RSC = razão solvente:carga (mL.g)-1, T= Temperatura (°C), t= tempo (minutos) *Pressão de vapor do etanol: 23 psi (120°C), 42
psi (130°C), 60 psi (140°C)
5.4.4 Caracterização da fração lipídica 5.4.4.1 Análise de índice de acidez
O índice de acidez foi determinado a partir das frações extraídas por
agitação magnética da biomassa sem pré-tratamento na presença de
clorofórmio:metanol (2:1 v/v), metanol, etanol e hexano com base na norma ASTM D
664:2011 a partir da metodologia descrita por Lemões, (2011). Para esta
determinação utilizou-se titulador automático da marca Metrohm® (modelo Titrino
Plus 848), solução titulante de KOH 0,1 mol.L-1 em isopropanol sendo realizada uma
solubilização de 1:10 (m/m - amostra:metanol). Foi determinado o valor da acidez
do solvente (branco) e todas as análises foram realizadas em triplicatas e expresso
pela média dos dados obtidos foi calculado o valor final.
5.4.4.2 Análise de espectroscopia de infravermelho (FTIR) Para caracterização por espectroscopia de infravermelho da fração lipídica
utilizou-se a metodologia descrita no item 5.3.2.
Ensaio*
Variáveis Independentes
Codificadas Reais*
X1 X2 X3 RSC T t
1 -1 -1 -1 2 120 30
2 -1 -1 +1 2 120 120
3 +1 -1 -1 4 120 30
4 +1 -1 +1 4 120 120
5 -1 +1 -1 2 140 30
6 -1 +1 +1 2 140 120
7 +1 +1 -1 4 140 30
8 +1 +1 +1 4 140 120
9 0 0 0 3 130 60
10 0 0 0 3 130 60
11 0 0 0 3 130 60
53
5.4.4.3 Determinação da atividade antioxidante por DPPH
As dosagens de atividade antioxidante das frações lipídicas foram realizadas
pelo método fotocolorimétrico in vitro do radical livre estável DPPH (2,2-difenil-1-
picrilidrazila) baseada na metodologia descrita por Mensor et al., (2001). Nesse
método foi preparada uma solução 0,06 mM de DPPH em metanol e uma solução
estoque de concentração 0,01 µM da amostra diluída em etanol. A partir da solução
estoque da amostra foram feitas diluições em etanol a concentrações de 5, 10, 25,
50, 125 e 250 µg.mL-1. Em seguida, foram adicionados 4 mL de DPPH a tubos de
ensaio contendo 100 µL de cada diluição. No branco, adicionaram-se 4 mL de
metanol e 100 µL de etanol. O controle foi preparado apenas com 4 mL de DPPH e
100 µL de etanol. A solução de DPPH possui uma coloração roxa intensa e a ação
antioxidante do extrato pode ser visualizada pelo progressivo descoloramento da
solução, ao final do qual a mesma torna-se amarelada. Em 30 e 60 minutos após a
adição de DPPH às amostras, foram realizadas as leituras das absorvâncias em um
espectrofotômetro de ultravioleta UV-vis em 515 nm. Todas as leituras foram
realizadas em triplicatas e com a média dos dados obtidos foi realizado o ajuste de
uma curva padrão.
5.4.4.4 Saponificação dos lipídeos A saponificação da fração lipídica foi realizada a partir de 5 gramas da fração
lipídica obtida com clorofórmio:metanol (2:1 v/v), misturando aproximadamente 10
mL da solução hidroalcoólica contendo 30 % de KOH em relação à massa dos
lipídeos de acordo com a norma oficial da AOCS (Ca 6-a40). Para esta reação
utilizou-se um balão de 250 mL, sob refluxo por 1 hora a 70 °C sob agitação
magnética de 200 rpm. A solução saponificada obtida foi transferida ainda aquecida
para um funil de decantação e, após atingir a temperatura ambiente, foram
adicionados 100 mL da solução (70:30 hexano: água) agitando-se energicamente o
funil. Este procedimento foi repetido por 4 vezes. A mistura homogeneizada foi
mantida em repouso até a separação efetiva das fases. A fase contendo a fração
insaponificável, foi rotaevaporada sob pressão reduzida e posteriormente
quantificada gravimetricamente.
54
5.4.4.5 Análise de espectroscopia de infravermelho
Para caracterização da fração insaponificável por espectroscopia de
infravermelho utilizou-se a mesma metodologia descrita no item 5.3.2.
5.4.4.6 Análise de CG-DIC da fração insaponificável
A amostra foi analisada conforme descrito por Viêgas et al., (2015-a) utilizando
um CG-DIC (Shimadzu® CG-2010) foi diluída em dodecano com a proporção
aproximada de 1:10 (v/v). A amostra foi derivatizada na presença de BSTFA e TMCS
e foi utilizado o eicosano como padrão interno. As amostras foram analisadas em um
cromatógrafo gasoso equipado com uma coluna capilar - ZB-5HT Inferno,
comprimento 30 m, diâmetro interno de 0,32 milímetros e espessura de filme 0,25
um. As temperaturas do detector e do injetor eram de 300 °C em ambos os casos.
5.4.4.7 Identificação dos carotenoides por CLAE
A identificação dos carotenoides, presentes na fração insaponificável da
fração lipídica da Chlorella, foi realizada na Embrapa por Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE) conforme descrito por Pacheco (2009). Para esta análise
cromatográfica foi utilizado um cromatógrafo líquido modular Waters® composto por
uma bomba W600, um degaseificador em linha, um injetor automático 717 plus e um
detector de arranjo de fotodiodos 996. A separação foi feita em coluna YMC C30
Carotenoid (250 x 4,6 mm x 3 μm), com eluição em modo gradiente de éter metil
terc-butilico em metanol, variando-se de 20 a 90 % e volume de injeção de 15 μL.
5.5 Produção de ésteres metílicos
5.5.1 Transesterificação in situ
Inicialmente a transesterificação in situ da biomassa seca foi realizada em
sistema composto por agitador magnético com aquecimento, banho de óleo, balão
de 50 mL e condensador de refluxo. Inicialmente as reações foram realizadas a
partir de 10 g de biomassa, variando-se a concentração de ácido sulfúrico de 5,10,
55
15 e 20 % em relação à biomassa seca (g de H2SO4/g de biomassa) e uma
proporção de 3:1 metanol/biomassa (mL.g-1). A mistura reacional foi mantida a 60
°C, durante 4 horas. Ao final da reação, a biomassa foi separada por filtração a
vácuo e o álcool evaporado e recuperado em um evaporador rotativo. Após filtração
em um funil de separação de 250 mL à fase orgânica contendo os ésteres foi
adicionado um volume de 100 mL de hexano para separação dos compostos
apolares. A fração polar foi drenada e a fração solúvel em hexano (produto principal)
foi separada. Após o tratamento, a solução contendo os ésteres graxos e o hexano
foi evaporado em evaporador rotatório. A amostra foi seca em estufa a 60 °C até
peso constante onde posteriormente o peso foi determinado por gravimetria. Os
ésteres metílicos apresentaram uma coloração verde escuro. Para purificação dos
ésteres graxos, a amostra foi adicionada em uma coluna filtrante contendo argila
como fase fixa para retirada dos pigmentos. Os procedimentos utilizados para
obtenção do biodiesel in situ estão ilustrados na Figura 5.4. Visando selecionar as
condições operacionais mais favoráveis, um planejamento experimental foi proposto
fixando-se a condição de 20 % de H2SO4 (massa de ácido sulfúrico em relação à
biomassa seca). As variáveis e os níveis utilizados para este planejamento
experimental estão apresentados na Tabela 5.2.
A biomassa residual foi analisada quanto ao teor de proteínas de acordo com
o método de Kjeldahl (descrito na sessão 5.3.6) teor de açúcares (sessão 5.3.8) e
CET (sessão 5.3.9). A morfologia da biomassa residual também foi observada e a
metodologia utilizada está de acordo com a sessão 5.3.1.
56
Figura 5.4: Esquema simplificado para obtenção dos ésteres metílicos via transesterificação in situ.
Tabela 5.2: Planejamento experimental 2
2 com ponto central para selecionar os parâmetros mais
favoráveis das reações de transesterificação in situ
Ensaio
Variáveis Independentes
Codificadas Reais
X1 X2 T t
1 -1 -1 60 2
2 +1 -1 100 2
3 -1 +1 60 4
4 +1 +1 100 4
5 0 0 80 3
6 0 0 80 3
7 0 0 80 3
T= Temperatura (°C) e t= tempo (horas)
5.5.2 Caracterização dos ésteres ácidos graxos
5.5.2.1 Espectroscopia de infravermelho
A análise dos EMAG purificados foi realizada por espectroscopia de
infravermelho de acordo com o procedimento descrito no item 5.3.2.
57
5.5.2.2 Análise de calorimetria exploratória diferencial
As propriedades térmicas do biodiesel foram realizadas utilizando um
instrumento DSC Q1000 v9®. As amostras foram pesadas (2 mg) em recipientes de
alumínio e aquecidas de -90 °C a 85 °C em uma taxa de 10 °C.min-1, de acordo com
o método descrito por Viêgas et al., (2015).
5.5.3 Caracterização físico-química dos ésteres graxos
Todos os ensaios de caracterização físico-química dos EMAG foram
realizados seguindo as metodologias estabelecidas pela ANP (Resolução 45/2014
de 26 de Agosto 2014).
5.5.3.1 Determinação da densidade
Foram coletados 3 mL de amostra, em uma seringa plástica, e injetada no
equipamento ANTON PAAR CT-2000®. A análise foi realizada a 20 °C. A densidade
do biodiesel foi determinada de acordo com a norma ASTM D 4052:2011.
5.5.3.2 Determinação de viscosidade
Foram adicionados 5 mL de amostra em um tubo de viscosidade (Tamanho
100) específico para EMAG num equipamento da marca CANNON CT2000®. A
análise foi realizada a 40 °C, medindo-se o tempo de escoamento do volume da
amostra por meio da ação da gravidade em um tubo capilar. A viscosidade dos
ésteres metílicos foi determinada de acordo com a norma ASTM D 445:2014.
5.5.3.3 Determinação do teor de água
Para análise de água foi medido aproximadamente 1 mL de amostra em uma
seringa plástica e injetada no equipamento de Karl Fischer (modelo KF columeter
831 e Stirrer 728) da marca Metrohm®. O método é baseado na redução de iodo por
dióxido de enxofre na presença de água por titulação potenciométrica. A quantidade
58
de água presente no biodiesel foi determinada conforme a norma EN ISO
12937:2000.
5.5.3.4 Determinação do ponto de entupimento de filtro a frio (PEFF)
As análises de PEFF foram realizadas em um equipamento da marca
Tanaka® Modelo: AFP 102. Foram medidos aproximadamente 50 mL de amostra
sob resfriamento de -34 até 21 ºC de temperatura. Os ensaios foram conduzidos de
acordo com a norma ASTM D 6371:2010.
5.5.3.5 Caracterização do perfil graxo e determinação do teor de ésteres
metílicos
A identificação dos perfis dos ésteres metílicos de ácidos graxos de Chlorella,
foi realizada de acordo com Cardenás (2013) em um cromatógrafo a gás, marca
Shimadzu®, modelo GC-2014, acoplado a um detector de ionização de chama,
injetor do tipo split (injeção com divisão de fluxo) e uma coluna capilar Carbowax 20
M, com 30 m de comprimento, diâmetro interno de 0,32 mm e espessura do filme de
0,25 μm. Para a identificação dos ésteres metílicos de ácidos graxos foram
realizados os seguintes procedimentos:
Por comparação do tempo de retenção dos constituintes da amostra com a
mistura de padrões de ésteres metílicos de ácidos graxos da Sigma (C8:0-C24:0);
Pela adição de padrão interno nonadecanoato de metila (C19:0).
A quantificação dos ésteres metílicos dos ácidos graxos obtidos nas reações
in situ foram efetuadas então em relação ao padrão interno, nonadecanoato de
metila (C19:0) de acordo com a EN 14103:2011. As injeções foram realizadas em
triplicatas.
5.5.3.6 Determinação do teor de cinzas
O teor de cinzas dos EMAG foi determinado de acordo com a metodologia
descrita no item 5.3.10.
59
5.5.3.7 Determinação do índice de acidez
Foram medidos aproximadamente 5 gramas de amostra em um béquer, que
foi titulada com um titulador automático da marca Metrohm® (modelo Titrino plus 848
- Stirrer 801). A concentração da solução titulante usada foi de 0,01 M. Antes da
análise da amostra foi realizado um ensaio utilizando somente o solvente para
descontar a acidez do mesmo. A acidez dos ésteres metílicos foi determinada de
acordo com a norma ASTM 664:2011.
5.5.3.8 Determinação de monoglicerídeos, diglicerídeos, triglicerídeos,
glicerina total e livre
Para determinação de glicerídeos na amostra de EMAG da Chlorella foi
utilizado um cromatográfo gasoso CG 2010 Shimadzu® com Injetor: on-colunm,
volume de injeção foi de 1μl o gás de arraste foi o hidrogênio (3 mL por minuto) a 50
ºC foram utilizados detector de ionização de chama e coluna capilar de 15 m
comprimento x 0,32 mm de diâmetro interno x 0,1 m de espessura, contendo 5 %
de fenilpolidimetilsiloxano (DB5-HT). Toda a metodologia utilizada para
determinação dos glicerídeos foi realizada de acordo com a norma ASTM D
6584:2013 e os resultados obtidos foram obtidos em triplicatas de injeção.
5.5.3.9 Determinação do teor de álcool no biodiesel
Para determinação de álcool na amostra de EMAG da Chlorella foi
utilizado um cromatográfo gasoso CG 2010 Shimadzu® com Injetor: split/splitless,
volume de injeção foi de 500 μl, gás de arraste foi Helio (3 mL por minuto) a 50 ºC
foram utilizados um detector de ionização de chama e uma coluna capilar de 30 m
comprimento x 0,32 mm de diâmetro interno x 0,3 m de espessura, contendo
polietilienoglicol como fase estacionária (DB1). O teor de álcool no presente nos
EMAG de microalgas foi realizado de acordo com a metodologia EN 14110:2003.
60
5.5.3.10 Determinação do índice de iodo
Foram pesados aproximadamente 0,15 gramas de amostra em um
erlenmeyer de 500 mL e acrescentados 15 mL de clorofórmio e 25 mL do reagente
de Wijjs. A amostra foi colocada em repouso durante o tempo de 1 hora à
temperatura ambiente. Após esta etapa iniciou-se a titulação com tiossulfato de
sódio 0,1 N. Foi realizada paralelamente a determinação de índice iodo da amostra
contendo apenas os reagentes. O índice de iodo dos ésteres metílicos obtidos in situ
foi determinado de acordo com a metodologia EN 14111:2003.
5.5.3.11 Determinação da estabilidade oxidativa
As análises de tempo de indução foram conduzidas em aparelho Rancimat da
marca Metrohm® (modelo 743 Biodiesel Rancimat), utilizando-se aproximadamente
3,00 g de amostra, atmosfera ar com fluxo de 10 L.h-1, a 110 ºC. As análises foram
realizadas de acordo com a norma EN 14112:2003.
5.5.4 Purificação dos ésteres metílicos
Os ésteres metílicos foram purificados em uma coluna de vidro de bancada,
na qual foram adicionados 100 g de argila como agente purificador. Cerca de 200
gramas de biodiesel bruto foram adicionados à coluna, sendo esta eluída com
hexano. A adição de ar comprimido na coluna foi adotada para aumentar a
velocidade de escoamento do biodiesel bruto no leito. A área superficial e volume
dos poros dessa argila foi medida antes e depois do processo de purificação
utilizando o equipamento Tristar 300® conforme descrito por Viêgas et al., (2015),
bem como sua composição química que foi dada pela análise de EDX descrita no
item 5.3.3 e o teor de cinzas de acordo o com o item 5.3.10.
5.6 Saponificação in situ da biomassa
Baseado no processo descrito por González et al., (1998) para microalga
Phaedoctylum tricornutum este processo foi testado visando um procedimento mais
rápido para obtenção da fração insaponificável e uma fração mais pura de ácidos
61
graxos. A saponificação in situ foi conduzida misturando-se 5 g de biomassa seca a
50 mL de solução hidroalcoólica (96 % álcool) e adicionando-se KOH nas seguintes
proporções: 5, 10, 15, 20, 25 % (em relação à massa de base/massa de amostra)
em um balão reacional, sob-refluxo por 1 hora a 70 °C sob agitação magnética de
200 rpm. A amostra foi filtrada a vácuo para retirada da biomassa. A solução
saponificada obtida foi transferida ainda aquecida para um funil de decantação e,
após atingir a temperatura ambiente, foram adicionados 100 mL da solução (70:30
v/v - hexano:água) agitando-se energicamente o funil. Este procedimento foi repetido
por 4 vezes. A mistura foi mantida em repouso até separação efetiva das fases. A
fase inferior foi removida (Fase S), obtendo-se então a fase superior contendo a
matéria insaponificável (Fase I). A Fase I foi lavada com 150 mL de água para
remoção de sabões até atingir o pH neutro. A seguir, a Fase I foi transferida para um
balão acoplado a um evaporador rotativo para remoção do solvente. Finalmente, a
amostra foi seca na estufa até peso constante a 60 °C. A massa de material
insaponificável obtida pelos diferentes experimentos foi determinada por gravimetria
e seu rendimento foi calculado em relação ao peso de biomassa de Chlorella.
À fase superior (fase S) adicionou-se à fase uma quantidade molar
estequiométrica de H2SO4 (em solução aquosa) obtendo-se, desta forma, a fração
saponificável. Este procedimento foi adotado para cada uma das frações
previamente saponificadas. A reação inversa foi conduzida sob agitação magnética
de 200 rpm a 80 ºC. Após o tempo reacional, de 1 hora, a amostra foi transferida
para um funil de decantação separando-se a fração saponificável (fração apolar)
com adição de 4 x 50 mL de hexano, logo esta fração hexânica foi lavada com 3 X
100 mL de H2O para retirada do sal remanescente. O hexano foi rotaevaporado e
recuperado a fração saponificável foi pesada e submetida às análises de
espectroscopia de infravermelho e CG-DIC.
A biomassa residual foi analisada quanto ao teor de proteínas de acordo com
o método de Kjeldahl (descrito na sessão 5.3.6), e a morfologia da biomassa
residual também foi observada e a metodologia utilizada está descrita na sessão
5.3.1.
62
5.6.1 Caracterização da fração insaponificável
5.6.1.1 Espectroscopia de infravermelho
O material insaponificável foi caracterizado por espectroscopia de
infravermelho conforme o procedimento descrito no item 5.3.2.
5.6.1.2 Identificação dos carotenoides por CLAE
A identificação dos carotenoides, presentes na fração insaponificável da
Chlorella, foi realizada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) conforme
descrito no item 5.4.4.7.
5.6.1.3 Atividade antioxidante por DPPH
A atividade antioxidante dessa fração foi medida conforme o descrito no item
5.4.4.3
5.6.1.4 Adição de matéria insaponificável ao biodiesel
Com o material insaponificável obtido a partir da saponificação in situ, foi
testada a atividade antioxidante dessa fração em um biodiesel comercial de soja.
Numa amostra de aproximadamente 3 gramas de biodiesel de soja foram
adicionadas quantidades variáveis de 2000 a 8000 mg.Kg-1, da matéria
insaponificável da Chlorella. Após a adição da fração insaponificável ao biodiesel, foi
testada a estabilidade oxidativa de cada amostra.
5.6.1.5 Determinação da estabilidade oxidativa
A estabilidade oxidativa do biodiesel de soja antes e após a adição de
material insaponificável da Chlorella foi determinada conforme o método descrito no
item 5.5.3.11.
63
5.6.1.6 Caracterização da fração saponificável
5.6.1.7 Espectroscopia de infravermelho
A análise da fração saponificável foi caracterizada por espectroscopia de
infravermelho conforme o procedimento descrito no item 5.3.2.
5.6.1.8 Caracterização da fração apolar por CG-DIC
A amostra foi analisada conforme descrito por Viêgas et al., (2015-a)
utilizando um CG-DIC (Shimadzu® CG-2010) foi diluída em dodecano com a
proporção aproximada de 1:10 (v/v). A amostra foi derivatizada na presença de
BSTFA e TMCS e foi utilizado o eicosano como padrão interno a 70 ºC durante 1
hora. As amostras foram analisadas em um cromatógrafo gasoso equipado com
uma coluna capilar - ZB-5HT Inferno, comprimento 30 m, diâmetro interno de 0,32
milímetros e espessura de filme 0,25 um. As temperaturas do detector e do injetor
eram de 300 °C em ambos os casos.
5.7 Análise estatística
Para avaliação dos dados experimentais, foram realizadas análises
estatísticas (ANOVA) utilizando-se o programa STATISTICA (v. 7.0). As médias dos
tratamentos foram comparadas aplicando-se o teste de Fischer LSD (p<0,05).
CAPÍTULO 6 -RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 Caracterização da biomassa liofilizada de Chlorella
A partir da biomassa liofilizada de Chlorella foi possível avaliar, por
microscopia eletrônica de transmissão o aspecto e o diâmetro das células que
apresentaram tamanhos entre 2 e 5 µm (Figuras 6.1 A e B). A parede celular da
Chlorella pode ser observada claramente conforme ilustrado na Figura 6.1 A, na
qual se pode confirmar que a Chlorella possui paredes relativamente espessas se
comparada com a microalga Dunaliella que, em geral, não apresenta paredes
celulares (BOROWITKZA & MOHEIMANI, 2013). A rigidez da parede celular
preserva a integridade da célula e é basicamente uma proteção contra invasores e
ao ambiente hostil. Nas Figuras 6.1 A e B pode-se identificar amido, cloroplastos
com suas membranas tilacoidais, citoplasma, núcleo e pirenóides no interior da
célula. A estrutura da Chlorella visualizada por microscopia no presente trabalho é
análoga às imagens relatadas por Nemkova & Kalina (2000) para diferentes
espécies de Chlorella.
Utilizando-se a técnica de FTIR (Espectrometria de Infravermelho), foi
possível identificar os principais componentes da biomassa de Chlorella, conforme o
espectro ilustrado na Figura 6.2. Os espectros de infravermelho foram interpretados
de acordo com as referências disponíveis na literatura (STUART, 2004;
BRANDENBURG & SEYDEL, 1996; GONZÁLEZ-FERNÁNDEZ & BALLESTEROS,
2012; SILVERSTEIN & WESBSTER, 1998; SILVERSTEIN, 1979; PHUNKAN et al.,
2011). A região de 3000 a 3300 cm-1 apresentou vibrações de ligações C-H e
grupos funcionais do tipo CHO e OH. Já na faixa entre 1500 a 1800 cm-1 foram
detectadas bandas características de moléculas de proteínas, específica para
amidas na região de 1600 e 1700 cm-1. Estas bandas são fortemente marcadas para
biomassa de Chlorella, devido ao seu alto teor de proteínas. A região entre 900 a
1200 cm-1 compreende a sequência de ligações do tipo C-O, C-C, C-O-C dos
polissacarídeos presentes nesta biomassa. Os carboidratos presentes nas
microalgas representam um grupo complexo que consistem em polissacarídeos
ramificados e frequentemente grandes reservas de carboidratos de armazenamento
tal como o amido. Os espectros padrões de glicose e amido apresentam uma
sobreposição de espectros nas faixas compreendidas entre 1000 e 1200 cm-1
(PISTORIUS et al., 2009). De acordo com Pistorius et al., (2009) o pico relativo a
1050 cm-1 tem sido relacionado ao teor de carboidratos presente na biomassa e
65
apresentou uma boa correlação linear com o conteúdo de carboidratos
obtidos por estes autores. Na região entre 3000 a 3500 cm-1 fica evidente a presença
de uma banda característica da ligação OH, que está relacionada à presença de
umidade nessa biomassa.
Figura 6.1 : A) e B) Fotomicrografia realizada com microscopia eletrônica de transmissão a partir da Chlorella liofilizada. Nota: 1) amido; 2) cloroplasto com tilacóides; 3) citoplasma; 4) núcleo; 5) pirenoide; seta) parede celular
1
2
3
4
A)
B)
5
1
2
66
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Microalga Pó
Tran
smitâ
ncia
(%)
Número de Onda (cm-1)
Figura 6.2: Espectro de Infravermelho para microalga liofilizada de Chlorella.
A presença dos lipídeos pode ser confirmada pela absorção das bandas na
região de 2800 e 2900 cm-1 conforme indicado na Figura 6.2. Os resultados obtidos
para espectroscopia de infravermelho visando à identificação dos principais
componentes da Chlorella estão de acordo com os resultados obtidos por Giordano
et al.,(2001), Pistorius et al.,(2009) e Pkuhan et al., (2011) para microalgas
liofilizadas.
Comparando-se o teor de carbono presente na Chlorella por dois métodos
(EDX e análise elementar de CHNOS), foram obtidos 47,6 e 42,7 %,
respectivamente, em relação à massa seca (Tabela 6.1). O teor de carbono relatado
por Phukan et al., (2011) para Chlorella sp. MP1 foi 47,5 % praticamente igual aos
valores obtidos neste trabalho para a Chlorella sp. De acordo com Biller (2003) o
teor de carbono da Pseudochoricystis ellipsoidea (61,3 %) foi superior ao obtido para
a Chlorella utilizada neste trabalho. Conforme este autor após um estudo realizado
com 5 microalgas, constatou-se que a Pseudochoricystis ellipsoidea apresentou o
maior teor lipídico (Bligh & Dyer ~ 60 %) dentre as microalgas estudadas, indicando
uma forte relação entre o teor de carbono e o teor de lipídeos presentes nessa
biomassa.
67
Tabela 6.1: Composição da biomassa e das cinzas de Chlorella obtidas neste trabalho Características Chlorella (%)
Umidade 6,7 (±0,5) Material orgânico 87,4 (± 0,8) Cinzas 5,9 (±0,1)
Análise elementar (% ) Chlorella (%) Cinzas (%)
C (42.6 - 47,6B) N.D
N 8,9 N.D H 6,9 N.D S 0,5 N.D O 34,6 47,1
Metais Chlorella (%) Cinzas (%)
Fe N.D 4,7 Na 0,1 1,6 Mg 0,34 4,6 K 0,92 18,4 P 1,77 23,3 S 0,71 N.D Ca 0,29 N.D Al N.D N.D Si N.D N.D
FAO (1985) * Chlorellac
Aminoácidos Adultos/Crianças
Ácido aspártico N.C 8,98 (±0,21) Serina N.C 6,87 (±0,58) Ácido glutâmico N.C 11,83 (±0,56) Glicina N.C 6,58 (±0,23) Histidina
a 1,6 / 1,9 2,21 (±0,28)
Arginina N.C 8,17 (±0,52) Treonina 0,5 / 3,4 4,84 (±0,17) Alanina N.C 8,19 (±0,38) Prolina N.C 4,32 (±0,21) Tirosina N.C 3,80 (±0,13) Valina 0,3 / 3,5 5,32 (±0,24) Lisina 1,6 / 5,8 7,61 (±0,44) Isoleucina 1,3 / 2,8 3,45 (±0,15) Leucina 1,9 / 6,6 8,20 (±0,99) Fenilalanina 1,9
+ / 6,3
+ 4,63 (±0,50)
Metionina 1,7** / 2,5** 0,98 (±0,10) Ácido cisteico N.C 1,53 (±0,12) Triptofano 0,9 / 1,1 2,50 (±0,17)
Carboidratos Chlorella (%)
Arabinose 1.1 Galactose 47,3 Ácido Galactonico 0.8 Glicose 126,3 Ácido Glucurônico 5 Mannose 6,1 Ramnose 12,7 Xilose 4,4
B- Determinado por EDX; * Requerimento de aminoácidos sugerido pela FAO g/100g (FAO/WHO/ONU, 1985) para adultos e
crianças de 2 a 5 anos. +Fenelilanina+tirosina; **Metionina+Cisteína;
acondicionalmente essencial.
cOs resultados de
aminoácidos representam a percentagem de cada aminoácido em 100g de proteínas algaceas, indicando a recuperação real dos aminoácidos após as análises. Os valores referem-se a duplicatas ± desvio padrão (n = 2). B- Determinado por EDX . N.C = Não consta recomendações. N. D = Não detectado
68
O teor de oxigênio obtido para Chlorella foi em média de 34,6 % em relação à
massa seca (Tabela 6.1). O teor de oxigênio das microalgas geralmente varia entre
25 a 30 % em relação à massa seca, algumas cepas de microalgas que contém
altas quantidades de carboidratos tendem a ter maiores teores de oxigênio, fato que
pode reduz o poder calorífico. De acordo Sukarmi et al., (2014) para microalga
Nannochloropisis oculata o teor de oxigênio presente na biomassa foi de 43,8 %,
superior ao valor obtido para Chlorella.
O poder calorífico superior determinado para a Chlorella foi de 13,4 (±1,05)
MJ.kg-1 inferior ao obtido por Kanemoto (2012) para microalga Nannochloropsis 19,6
± 2,87 MJ/ kg . O poder calorífico da Chlorella também pode ser comparado com o
da casca de arroz (15,5 MJ.kg-1) (MORAIS et al., 2006).
Após a análise elementar de CHNSO, foi determinado o teor de nitrogênio
presente na biomassa liofilizada de Chlorella, obtendo-se 8,9 % em relação à massa
seca (Tabela 6.1). Superior ao valor relatado por Phukan et al., (2011) para Chlorella
sp. MP1 que apresentou 6,7 % de nitrogênio na biomassa. Biomassas com alto teor
de nitrogênio não são apropriadas para fins energéticos, porém são desejadas para
fins alimentícios (BECKER, 2007; BROWN, 1990).
O conteúdo de proteínas totais da biomassa de Chlorella foi determinado
experimentalmente pelo método de Kjeldahl e obteve-se 63,0 ± 5,5 % de proteínas
em relação ao peso seco. Quando o teor de proteínas da Chlorella comercial foi
comparado à outra espécie do mesmo gênero os valores se aproximam dos
resultados obtidos nesta tese. Por exemplo, para a microalga Chlorella sp. o teor de
proteínas variou entre 40 a 55 % (BECKER & VENKATARAMAN, 1981) e 50 - 58 %
para Chlorella Vulgaris (BECKER, 2004). O teor de proteínas obtido para Chlorella
pode ser considerado alto quando comparado com as microalgas Chaetoceros
muelleri e Thalassiosira pseudonana ambas com um teor médio de 19 % de
proteínas totais (OHSE et al., 2009). Alguns fatores como temperatura e nutrientes
do meio de cultura podem ser atribuídos à variação do teor de proteínas nas
microalgas (OGBONNA & TANAKA, 1996). A qualidade nutricional de uma proteína
é determinada pela composição, proporção e disponibilidade dos seus aminoácidos
(BECKER, 2004). Devido ao elevado teor de proteínas, alguns gêneros de
microalgas como a Chlorella vêm sendo comparadas com a soja e com o leite
devido à qualidade dessa fração (BECKER, 2004). O valor de aproximadamente 63
% de proteínas da Chlorella também pode ser comparado ao teor de proteínas
69
encontradas na farinha de peixe (60 %). De acordo com Walker & Berlinsky (2011)
supõe-se que a proteína oriunda de microalgas venha a ser um substituto em
potencial da farinha de peixe. O alto teor de proteínas e aminoácidos essenciais é
característico para a microalga Chlorella que pode ser considerada como uma fonte
promissora de alimento/suplemento proteico ou como ração animal (GARCIA et al.,
2012; GORGÔNIO, 2013).
A composição em aminoácidos da Chlorella foi determinada por Gorgônio
(2013) e os resultados obtidos para esta biomassa estão listados na Tabela 6.1. Os
aminoácidos mais abundantes foram os ácidos glutâmico (11,83 ± 0,56) e aspártico
(8,98 ± 0,21), enquanto a quantidade de metionina (0,98 ± 0,10) foi menos
significativa. Estes resultados são semelhantes aos encontrados por Safi (2013) e
Naik et al., (2010) para o gênero Chlorella contendo níveis análogos de
aminoácidos. De acordo com Spolaore et al., (2006), os 9 aminoácidos essenciais
para alimentação humana estão presentes em microalgas em quantidades
comparativas aos alimentos proteicos convencionais. Os valores de ácido aspártico,
serina, glicina arginina, alanina, lisina, tirosina, leucina e triptofano na Chlorella
foram maiores dos que os encontrados comumente para soja (SHABANN, 2001;
FAHEED & FATAAH, 2008). Os aminoácidos essenciais tais como arginina
fenilalanina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, treonina, triptofano e
valina, pois eles não são sintetizados no corpo humano e devem ser consumidos a
partir de alimentos (BECKER, 2014). É importante ressaltar que a microalga
avaliada mostrou uma quantidade acima do estabelecido para aminoácidos
essenciais (g/100 g) sugeridos pela FAO para adultos e crianças (2 a 5 anos de
idade). Quando verificada a disponibilidade desses aminoácidos, pode-se afirmar
que as microalgas possuem potencial para formulação de compostos com
características funcionais (GORGÔNIO, 2013).
A biomassa liofilizada de Chlorella apresentou 20,3 % de carboidratos totais
em relação ao peso seco e os principais açúcares identificados nesta fração foram
majoritariamente a glicose (63 %) e galactose (23,2 %) (Tabela 6.1). De acordo com
os resultados relatados por Zhongquan et al., (2012) a Chlorella apresentou 22 % de
carboidratos quantidade semelhante a obtida nesta tese. De acordo com a literatura
os carboidratos nas microalgas estão localizados principalmente na parede celular e
a composição dos açúcares em diferentes espécies de Chlorella pode variar
significativamente. Por exemplo, Behrens et al., (1989) obtiveram aproximadamente
70
55 % de amido (base seca) em microalgas da espécie Chlorella vulgaris cultivadas
em meio com limitação de nitrogênio. Os carboidratos presentes nas Clorofíceas são
principalmente amido (dos cloroplastos) e a celulose (polissacarídeos da parede
celular) (RICHAMOND, 2004), porém eles não são diretamente fermentáveis para
produção de etanol a partir de microorganismos. Uma das vantagens do uso de
biomassa de microalgas sobre plantas lignocelulósicas como matéria-prima para a
produção de biocombustíveis é a ausência de lignina, o potencial de obtenção de
coprodutos de alto valor comercial, além da incorporação com outras aplicações,
como o tratamento da água e sequestro de CO2 (HEJAZI & WIJFFELS 2004; PULZ
& GROZZ 2004;. SPOLAORE et al., 2006; PONNUSWAMY et al., 2013; SUBHADRA
& GRINSON 2011). A produção de etanol a partir de microalgas pode ser
considerada como um processo potencial para obter “biocombustível de terceira
geração” (JOHN et al., 2011).
A composição de alguns metais presentes na biomassa liofilizada da
Chlorella e das cinzas obtidas após a análise termogravimétrica pode ser observada
na Tabela 6.1. Os analitos presentes nesta biomassa liofilizada de Chlorella, como
Ca e Na foram obtidos numa concentração inferior aos referenciados na literatura
para Chlorella vulgaris, 0,59 e 1,35 % respectivamente (TOKUSOGLU & UNAL,
2003). Esta diferença pode ser explicada pelo elevado teor de minerais associados
com o ambiente de crescimento dessas microalgas. Na fração lipídica, os elementos
tais como Ca, Co, Cu, Fe, Mg, Mn, e Ni devem estar presentes em pequenas
proporções pois podem promover a degradação oxidativa e afetam diretamente a
qualidade e conservação de óleos e gorduras durante o processo de
armazenamento (GONZALVES et al., 2010).
O teor de cinzas, determinado por ATG obtido para Chlorella foi de 5,9 %
(Tabela 6.1), igualmente aos dados reportados por Phukan et al., (2011), para outra
espécie de Chlorella (5,9 %). O teor de cinzas para cada microalga está relacionado
com a quantidade de nutrientes disponibilizados para o cultivo desses
microorganismos. .As cinzas são um subproduto da maior parte da biomassa
utilizada para processos de conversão térmica, incluindo pirólise e gaseificação. O
teor de cinzas pode afetar o projeto da unidade, bem como os processos de
purificação e de controle de qualidade do produto (BI & HE, 2012).
A composição das cinzas obtida por EDX apresentou uma quantidade
expressiva de fósforo (23,3 %), potássio (18,4 %), magnésio (4,6 %) e de outros
71
metais em menores proporções. Os valores obtidos para estes metais são maiores
quando comparados com a composição de cinzas da mistura de microalgas
marinhas do trabalho de Bi & He (2012), no qual reportaram concentrações de
fósforo (6,6 %), potássio (12 %) e magnésio (1,5 %). As proporções registradas nas
cinzas da Chlorella, para P, K e Mg indicam que este resíduo pode ser aproveitado
para o reciclo de nutrientes do cultivo dessa microalga.
Os principais componentes da biomassa como proteínas, aminoácidos,
carboidratos e lipídeos foram identificados por FTIR que se revelou uma técnica
rápida e segura para identificação desses compostos. A análise elementar forneceu
informações comparativas para seleção de espécies de microalgas quando se
deseja obter diferentes produtos, porém não dispensa as análises gravimétricas para
confirmação exata dos teores lipídicos, proteicos e de carboidratos.
6.2 Extração dos lipídeos
6.2.1 Avaliação de solventes e quebra de parede celular
Após vários testes selecionou-se o método mais indicado para extração, a
agitação magnética foi a escolhida na presença de solventes como clorofórmio:
metanol (2:1 v/v), metanol, etanol e hexano para a extração dos lipídeos. Em todos
os ensaios foram utilizadas a biomassa liofilizada de Chlorella, pois além de eliminar
a água a liofilização preserva os componentes funcionais e aumenta a eficiência de
extração dos lipídeos. Porém, para extração dos lipídeos das microalgas grande
parte da energia requerida no processo é consumida na secagem da mesma.
Sistemas contendo água e solvente apolar não são termodinamicamente favoráveis
para quebra das ligações de hidrogênio presentes nas ligações lipoproteicas, pois
formam forças de dipolo-dipolo induzido entre a água e o solvente apolar. A
hidrofobicidade da maioria dos solventes apolares é a base para o processo de
extração (SHULER, 2002).
Os valores médios obtidos nas extrações dos lipídeos estão apresentados na
Tabela 6.2, expressos em porcentagem em relação à massa seca da microalga.
Para um dado solvente ou mistura de solventes pode-se observar que os resultados
foram similares aos ensaios conduzidos com a biomassa de Chlorella tratada e não
tratada. Os rendimentos de lipídeos apresentaram diferenças estatísticas
72
significativas para todos os testes realizados (p<0,05). Em ambos os casos, a
mistura clorofórmio:metanol (2:1 v/v) foi a mistura de solventes mais eficiente,
seguido por metanol, etanol e hexano para extração dos lipídeos da Chlorella. Este
fato também foi observado por Viêgas (2010) e Lemões (2011) na extração dos
lipídeos da biomassa de Chlorella liofilizada.
Tabela 6.2: Rendimentos obtidos na extração dos lipídeos a partir da biomassa de Chlorella
Ensaio Solvente Sem pré-tratamento* Moagem*
1 CHCl3:CH3OH (2:1) 11,97(±0,13) b 14,72 (±0,21)
a
2 CH3OH 10,75 (±0,24) d 12,83(±0,17)
c
3 C2H5OH 7,34 (±0,18) f 8,84(±0,11)
e
4 C6H14 0,81 (±0,15) h 1,74 (±0,12)
g
* valores calculados com base em triplicadas de experimentos. Letras iguais na mesma coluna não diferem entre si pelo teste de Fischer L.S.D (p ≤ 0,05).
Os melhores resultados para extração dos lipídeos sem e com a etapa de
moagem, foram obtidos na presença de clorofórmio:metanol (2:1 v/v) cujos
resultados foram 11,97 ± 0,13 e 14,72 ± 0,21 %, respectivamente (Tabela 6.2).
Seguido dos resultados obtidos para os extratos metanólicos 10,75 ± 0,24 e 12,83 ±
0,17 %. O aspecto visual da fração lipídica obtida com clorofórmio:metanol (2:1 v/v)
pode ser observada na Figura 6.3.
Figura 6.3: Fração lipídica extraída com clorofórmio:metanol (2:1 v/v). Foto tirada por Ivan Sandoval
Como esperado, em um processo de extração sólido-líquido, a polaridade do
solvente utilizado define as condições termodinâmicas selecionadas e a qualidade
73
da fração lipídica (GRIMA et al., 2012). Uma vez que a solução lipídeos-solvente é
formada, a difusão ocorre da membrana para o meio. Sendo assim, a mistura de
solventes apolar/polar facilita a extração dos lipídeos (HALIM et al., 2012).
A mistura de solventes (clorofórmio:metanol) foi capaz de remover
simultaneamente os lipídeos apolares e polares. No entanto os lipídeos neutros
formam um complexo com os lipídeos polares fortemente ligados por ligações de
hidrogênio com as proteínas das membranas celulares. A interação de Van der
Waals formada entre os lipídeos neutros e solventes apolares não são capazes de
romper a membrana ligação lipoproteica. Os solventes polares ajudam no
rompimento dessa ligação e dissolvem os lipídeos (HALIM et al., 2012; MEDINA et
al., 1998) facilitando o mecanismo de entrada da mistura do solventes polar e apolar
na parede celular até o citoplasma interagindo com os lipídeos.
O teor de lipídeos a partir da biomassa sem pré-tratamento (~12 %) foi o
mesmo obtido por Lemões, (2011) para microalga Chlorella na presença de
clorofórmio:metanol (2:1 v/v). Esta mistura de solventes também foi responsável
pelos maiores teores lipídicos, quando aplicada à microalga Chlorella vulgaris no
trabalho de Araújo (2011). De acordo com os resultados obtidos por este autor a
Chlorella vulgaris apresentou 52 % de lipídeos extraídos com clorofórmio:metanol
(2:1 v/v). Esta quantidade de lipídeos foi superior a obtida para a Chlorella utilizada
nesta tese usando a mesma mistura de solventes (12 a 14 %) devido as diferentes
condições de cultivo. No entanto dentro da faixa obtida utilizando
clorofórmio:metanol (2:1 v/v), coexistem outros compostos não lipídicos como
carboidratos, proteínas, hidrocarbonetos, esteróis, cetonas, carotenoides e clorofilas
(HALIN, 2012; MEDINA et al., 1998).
Avaliando o processo de moagem sob a biomassa liofilizada, nota-se um
aumento de aproximadamente 20 % na eficiência da extração dos lipídeos obtidos
com clorofórmio:metanol (2:1 v/v) em relação a mesma fração sem o pré-tratamento.
De forma análoga Lee et al., (1998) realizou um exame detalhado dos métodos
mecânicos para quebra da parede celular da microalga Botryococcus braunii. Estes
autores concluíram que o maior resultado obtido na extração dos lipídeos dessa
microalga foi alcançado quando se utilizou um moinho de bolas na etapa de pré-
tratamento. O aumento da eficiência de extração dos lipídeos utilizando o método de
Folch et al., (1957) com auxílio do moinho de bolas também foi relatado para
microalga Arthospira (STRIEDER et al., 2013). Para microorganismos com parede
74
celular altamente resistente, a combinação de diferentes métodos de quebra da
parede é adequada para tornar o processo de extração viável.
Na extração sem e com moagem, utilizando-se o metanol como solvente, foi
obtido um rendimento de 10,75 ± 0,24 % de lipídeos (Tabela 6.2), inferior ao valor
relatado por Lemões (2011), na mesma temperatura de extração (20 ºC) sem pré-
tratamento (12 %). De acordo com o mesmo autor a fração metanólica apresentou o
mesmo teor lipídico quando comparado ao extrato obtido com clorofórmio:metanol
(2:1 v/v). Entretanto neste trabalho, para se alcançar rendimentos comparáveis aos
obtidos com a mistura de clorofórmio:metanol (2:1 v/v) foi necessário a etapa de
moagem.
De acordo com a Tabela 6.2, utilizando o etanol como solvente extrator sem e
com moagem, a quantidade de lipídeos extraídos foi entre 7,34 a 8,84 %,
respectivamente, similar ao reportado por Viêgas (2010) para os lipídeos da
Chlorella pyrenoidosa obtidos com o mesmo solvente. Resultados reportados por
Fajardo et al., (2007) indicaram uma recuperação de 96 % de lipídeos extraídos com
etanol a partir da microalga Phaeodactylum tricornutum. Esses resultados foram
obtidos num tempo de 24 horas e temperatura ambiente, condições diferentes das
aplicadas neste trabalho (2 horas). A utilização de metanol e do etanol pode ser
vantajosa em escala industrial, pois estes solventes podem ser usados
simultaneamente nas etapas de extração dos lipídeos e na conversão à biodiesel
(WAHLEN et al., 2011).
Pode-se observar que ao contrário dos inúmeros resultados reportados para
extração de óleo a partir de matérias primas vegetais, os menores valores foram
obtidos quando se utilizou o hexano como solvente extrator (Tabela 6.2). Neste
caso, a partir da biomassa pré-tratada, obteve-se maior recuperação da fração
lipídica apolar. Comparado aos dados de extração com hexano a partir da biomassa
com e sem moagem, estes valores foram 1,74 ± 0,12 e 0,80 ± 0,15 %,
respectivamente, estatisticamente diferentes segundo o teste de Fischer LSD
(p<0,05). Os menores resultados também foram relatados na literatura quando se
utilizou o hexano para extração de lipídeos a partir de microalgas (LEMÕES, 2011;
VIÊGAS, 2010; BASOVA, 2005; SILVA, 2013; ARAUJO, 2011). Este resultado pode
ser atribuído à presença de lipídeos mais polares na parede celular, impedindo a
entrada desse solvente na célula. Após a etapa de moagem da biomassa a extração
75
dos lipídeos em todos os ensaios apresentaram aumento no rendimento lipídico
entretanto apenas com hexano este resultado foi significativo.
6.2.1.1 Caracterização da fração lipídica
Na Tabela 6.3 estão listados os resultados de índice de acidez de cada
fração lipídica obtida sem pré-tratamento. Os altos índices de acidez das frações
podem ser atribuídos principalmente às temperaturas do processo de liofilização e à
grande quantidade de ácidos graxos poliinsaturados presentes. A fração hexânica
apresentou o maior índice de acidez (122,99 ± 0,35 mg KOH/g de amostra) seguida
da fração etanólica (85,77 ± 0,83 mg KOH/g). Este resultado é compatível com a
polaridade do hexano e do etanol visto que estes solventes são mais seletivos para
extração de ácidos graxos (LEMÕES, 2011). Valores de índice de acidez inferiores
aos obtidos neste trabalho foram reportados na literatura para o óleo de Chlorella
fresca de 8,97 mg KOH/g e 0,13 mg KOH/g, respectivamente de acordo com Xu et
al., (2006) e Chen et al., (2012). Pode-se observar que com o aumento dos lipídeos
mais polares no óleo, a quantidade de ácidos graxos livre diminui. Em razão disto, o
menor índice de acidez, 36,39 mg KOH/g, foi obtido com a utilização de
clorofórmio:metanol (2:1 v/v) como solventes extratores. Semelhantes concentrações
de ácidos graxos livres foram encontrados para Arthospira platensis 37,4 mg KOH/g
para fração extraída com a mesma mistura de solventes (EL-SHIMI et al., 2013). Os
índices de acidez para as diferentes frações lipídicas extraídas com os mesmos
solventes utilizados nesta tese estão de acordo com os valores obtidos por Lemões
(2011) e favorece o uso destas na produção de biodiesel usando catalisador ácido
ou enzimático (lipase).
Tabela 6.3: Índice de Acidez das frações lipídicas obtidas a partir da biomassa sem pré-tratamento
Solvente IA (mg KOH/ g de amostra)
Clorofórmio:Metanol (2:1 v/v) 36,39 (±0,78)
Metanol 55,75 (± 0,54)
Etanol 85,77 (± 0,83)
Hexano 122,99 (± 0,35)
Os espectros de infravermelho ilustrados nas Figuras 6.4 e 6.5 referem-se à
fração lipídica extraída com clorofórmio:metanol (2:1 v/v) e hexano. Todos os
76
espectros a seguir foram interpretados de acordo com Silverstein & Wesbster, (1998)
e Stuart, (2004) e em ambos os espectros podem ser observadas bandas
espectroscópicas características de ésteres, identificadas pela deformação axial da
ligação dupla de C=O em 1740 cm-1, e de deformação angular de C-C(=O)-O e C-O
entre 1150 e 1242 cm-1. As bandas espectroscópicas mostram a presença de
cadeias hidrocarbônicas longas, do tipo deformação axiais da ligação H-C (saturado)
entre 2800 a 2900 cm-1, deformação angular C-H de alcano em 1460 cm-1 e
deformação angular C-H em 720 cm-1 e ainda o aparecimento de insaturações pela
deformação axial da ligação C=C-H de alcenos em 3012 cm-1. Para a fração
hexânica (Figura 6.5), pode-se observar uma banda espectroscópica na região de
1710 cm-1 característica para ácidos graxos, confirmando o resultado obtido
anteriormente.
Figura 6.4: Espectro de Infravermelho da fração lipídica extraída com clorofórmio:metanol (2:1 v/v)
Figura 6.5: Espectro de Infravermelho da fração lipídica extraída com hexano
77
A presença de compostos antioxidantes nos extratos lipídicos foi confirmada
pelo teste do DPPH. A capacidade antioxidante no extrato foi expressa pelo CE50
necessária para neutralizar 50% do DPPH radical (mg de amostra por grama de
DPPH). Os melhores resultados alcançados foram nos extratos metánolicos (28,34 ±
1,88 mg/g) e extrato etanólico (35,67 ± 2,13 mg/g). O extrato hexanico (258,51 ±
1,54 mg/g) e o extrato clorofórmio/metanol 2:1 v/v (89,97 ± 1,18 mg/g) apresentaram
os piores resultados para a capacidade antioxidante. Segundo Manivannan et al.,
(2012) estes resultados podem ser atribuídos a diferença de polaridade dos solvente
utilizados. O melhor resultado obtido a partir do extrato metanólico está relacionado
à grande quantidade de fitoquímicos, substâncias biologicamente ativas nesta fração
como: esteróis e flavonoides. Estes compostos podem apresentar atividade
antioxidante adicional aos exercida pelos fenólicos (SHALABY & SHANAB, 2013).
Segundo Hemalatha et al., (2013) o extrato metanólico da Chlorella marina
apresentou a maior atividade antioxidante (1,03 ± 0,02 mg / g) quando comparada
atividade obtida neste trabalho. Além disso, outros autores como Uma et al., (2011)
observaram que os extratos metanólicos exibiram um maior potencial quando
comparado com os extratos etanólicos e acetônicos nas microalgas verdes como a
Desmococcus olivaceous e Humicola Chlorococcum. Embora os resultados obtidos
por Hemelatha (2013) indiquem alta atividade antioxidante da microalga do gênero
Chlorella, as comparações entre os resultados e outros dados da literatura se
tornam difíceis de serem realizados. Isto se deve principalmente aos métodos de
extração aplicados bem como as variações do período de coleta e ao gênero de
microalga. Além de propriedades antioxidantes, os compostos fenólicos presentes
nas microalgas vêm apresentando propriedades nutracêuticas, bactericida (DU et
al., 2011) e antifúngica (BIERHALS, et al., 2009).
Visto que o resultado mais elevado para quantificação dos lipídeos foi obtido
na presença de clorofórmio:metanol (2:1 v/v) investigou-se o teor e a composição da
matéria insaponificável presentes nesta fração. Neste caso, obteve-se 12,3 ± 0,75 %
de material insaponificável em relação à massa de lipídeos sendo este resultado da
mesma ordem de grandeza reportada por Wang & Wang (2012) para a microalga
Nannochloropsis. A quantidade de matéria insaponificável nos lipídeos da microalga
foi superior aos valores típicos para o óleo de arroz que apresenta de 3 a 5 % dessa
fração e é considerada rica em MI (GUNSTONE, 2002). A partir da quantidade da
78
matéria insaponificável é possível estimar quanto da fração lipídica pode ser
convertida em biodiesel, que no caso da Chlorella a partir do extrato obtido com
clorofórmio:metanol (2:1 v/v) foi de aproximadamente de 83 %.
A partir da avaliação do espectro de infravermelho da matéria insaponificável
(Figura 6.6) foi possível identificar os principais componentes dessa fração e
observar vibrações na região de 2800 a 2900, características de cadeias
hidrocarbônicas longas com deformação axial da ligação H-C. Os grupos metilênicos
também aparecem nas regiões de 1460, 1350 e 700 cm-1 referente às deformações
axiais e angulares das molécula de (CH2)n. Foi possível identificar na região da
vibrações na região de 3277 cm-1 característica para xantofilas como a luteína e
zeaxantina devido a vibração da ligação de OH presentes nestas moléculas. Nesta
mesma região está sobreposta a banda característica para alcoóis devido à
presença de fitol nessa fração (3250 a 3500 cm-1). O espectro de infravermelho
indica a presença de compostos α,β-insaturados na região de 1010 cm-1, banda
característica de carotenoides. Como esperado, a intensidade dos sinais dos
carotenoides foi visivelmente alta. Isto ocorre, pois as microalgas são organismos de
atividade fotossintética, que metabolizam compostos de alta atividade eletrônica,
denominados compostos cromóforos, como os carotenoides, responsáveis pela
transformação de energia solar em energia química. Estes carotenoides foram
identificados por CLAE e estão apresentados na Tabela 6.4 e Figura 6.7.
Figura 6.6: Espectro de infravermelho da fração insaponificável
Na matéria insaponificável da Chlorella foram quantificados 70 % de fitol
(álcool diterpenoide) e 1,1 % de carotenoides, nesta fração foram identificados 20,5
79
% de luteína, seguido de 17,1 % de β-Caroteno, 17,1 % de 9-cis-β-caroteno e 36,7
% de carotenoides não identificados. O carotenoide presente em maior quantidade
na fração insaponificável foi a luteína (2,4 mg/g - 20,5 %) que de acordo com a
literatura pode ser considerando o principal carotenoide entre as espécies de
Chlorella (PLAZA et al., 2009). Pequenas quantidades dos carotenoides zeaxantina,
α-caroteno e 13-cis-β-caroteno, identificadas neste trabalho, também foram
reportados para Chlorella por Redeali (2012). As quantidades de carotenoides
obtidas para a Chlorella foram inferiores ao reportados por Mogedas et al., (2009)
para a microalga Dunaliella salina, que apresenta 10 % de betacaroteno em relação
ao peso seco. De acordo com Paoletti et al., (1976) a matéria insaponificável de
Chlorella, contém majoritariamente alcoóis graxos (40 a 50 %) hidrocarbonetos
(principalmente C15 C16 e C17) na proporção de 30 a 40 % e os esteróis
representam cerca de 20 %.
Tabela 6.4: Perfil de carotenoides da matéria insaponificável de Chlorella
Carotenoides mg de carotenoides/g de matéria insaponificável
Luteína 2,4
Zeaxantina 0,20
α-Caroteno 0,67
β-Caroteno 2,0
13-cis-β-Caroteno 0,06
9-cis-β-caroteno 2,0
Não identificados 4,3
Total 11,7
Figura 6.7: Cromatograma de CLAE para identificação dos carotenoides presentes na fração insaponificável
80
6.2.2 Avaliação da eficiência de extração do etanol em reator tipo autoclave
Os rendimentos em lipídeos obtidos em reator tipo autoclave a partir da
biomassa liofilizada, estão apresentados na Tabela 6.5 na qual se obteve valores
máximos de 14 % em relação à biomassa seca. Estes resultados igualam-se à
quantidade de lipídeos extraídos a partir da biomassa com pré-tratamento de
moagem utilizando clorofórmio:metanol (2:1 v/v) (14 % de lipídeos). O aumento de
temperatura nos ensaios e consequente aumento da pressão manteve o solvente no
estado líquido aumentando a eficiência do processo de difusão (WANG & WELLER,
2006). As condições físico-químicas utilizadas nos ensaios (120 a 140 ºC)
favoreceram a solubilidade completa do óleo no etanol. Temperaturas elevadas
modificam a constante dielétrica da molécula possibilitando a mudança da
polaridade (DEGUCHI & TSUJII, 2007). Em outros trabalhos disponíveis na literatura
o aumento da temperatura favoreceu a extração dos lipídeos da Chlorella, quando
se utilizou etanol como solvente (CANDIDO, 2014; LEMÕES, 2011).
De acordo com Ruong et al., (2012) para a microalga Nannochloropsis na
extração com etanol sob pressão a 125 ºC durante 4 minutos foram obtidos 14,87 %
de lipídeos, resultado semelhante ao obtido neste trabalho para os ensaios 2 a 5
reportados na Tabela 6.5. Diferentes estudos indicam que o rendimento do produto
alvo e a eficiência da extração com solvente sob pressão são mais eficientes quando
comparadas a técnicas convencionais (ZHANG et al., 2004).
81
Tabela 6.5: Percentual de lipídeos obtidos em reator tipo autoclave usando etanol como solvente extrator
Ensaio* Lipídeos (%) ** (Variável Dependente)
1 5,250
2 13,59
3 14,78
4 13,72
5 13,39
6 4,42
7 10,03
8 12,39
9 8,160
10 7,360 11 7,110
* desvio médio = 0,41 e desvio padrão = 0,54 **O percentual de lipídeos refere-se à extração em reator tipo autoclave com etanol.
Os dados experimentais da Tabela 6.5 foram analisados utilizando-se o
software Statistica® v.7. Os resultados demonstram que para extração de lipídeos em
reator tipo autoclave usando-se etanol, as variáveis: (1) razão solvente:carga (RSC) e
(2) temperatura (T) e as interações (2) (3) e 1*2*3 foram significativas (p < 0,05), com
nível de confiança de 95 %. O planejamento experimental permitiu eliminar a variável
tempo (3), pois este não foi significativo dentro da faixa analisada (30 - 120 minutos).
Sendo assim os experimentos podem ser conduzidos no menor tempo avaliado (30
minutos). O gráfico de Pareto (Figura 6.8) confirma graficamente quais foram os
efeitos mais relevantes.
De acordo com a Figura 6.9, obtida a partir do espectro de FTIR da fração
etanólica extraída sob pressão, as bandas foram comparadas àquelas obtidas para
fração lipídica com clorofórmio:metanol (2:1 v/v). A partir da avaliação do espectro
de infravermelho da fração extraída com etanol sob pressão foi possível identificar
os principais componentes dessa fração e observar vibrações na região de 2800 a
2900, características de cadeias hidrocarbônicas longas com deformação axial da
ligação H-C. Os grupos metilênicos também foram identificados nas regiões de 1460
e 700 cm-1 referente às deformações axiais e angulares das molécula de (CH2)n.
Porém, de acordo com o espectro, foi possível observar uma diferença de
intensidade na região de 1740 cm-1, sendo mais intenso para fração etanólica. e os
estiramentos de deformação angular de C–O-C na faixa de 1180 a 1246 cm-1
82
também foram observados. Este fato indica que devido ao aumento da temperatura
ocorre, simultaneamente, extração dos lipídeos e produção de ésteres etílicos
durante o processo. A vibração observada na região entre 3000 a 3500 cm-1
denotam a presença de ligações do tipo OH, provavelmente oriundas do etanol que
ainda permaneceu na amostra mesmo após a evaporação.
Figura 6.8: Avaliação pelo método de pareto a significância dos parâmetros no processo de extração dos lipídeos em reator tipo autoclave e etanol. (1) Razão solvente:carga (RSC), (2) Temperatura (T) e Tempo (3)
Figura 6.9: Espectro de infravermelho da fração etanólica
Sob temperaturas elevadas a ligação de hidrogênio em etanol sofre uma
mudança na molécula para monômero livre que pode favorecer a transesterificação
83
de triglicerídeos em ésteres etílicos sem a presença de catalisador. Temperaturas
elevadas entre 245 a 270 ºC na presença de etanol sob pressão e na ausência de
catalisadores favoreceram a reação de transesterificação direta da biomassa de
Nannochloropsis salina em ésteres etílicos (REDDY et al.,2014). A temperatura entre
50 - 200 ºC utilizada para extração acelerada por solvente tem sido considerada
ideal para extração de lipídeos (WANG & WELLER, 2006).
A extração com etanol em reator tipo autoclave tem potencial para aplicação
na produção de biodiesel, visto que apenas um único solvente seria utilizado no
processo de extração e transesterificação. O etanol é derivado de uma fonte
renovável e menos tóxico do que os solventes tradicionais, geralmente derivados de
combustível fóssil. Adicionalmente, o etanol é produzido em grande escala no Brasil
a custo competitivo no mercado mundial, a partir da cana de açúcar. O etanol pode
ser utilizado para substituir o metanol, no processo de transesterificação, o que
permitiria o uso de um solvente renovável na cadeia produtiva do biodiesel,
favorecendo o meio ambiente.
6.3 Transesterificação in situ da biomassa de Chlorella
As quantidades de 5 a 15 % de catalisador de acordo com a Tabela 6.6 não
foram suficientes para uma conversão satisfatória da biomassa a ésteres metílicos (5
- 41 %). Este resultado confirma que o excesso de catalisador utilizado na reação
(20 % de H2SO4) foi necessário para alcançar altas conversões (~ 99 %). O teor de
éster de 98,8 %, para reação com 20 % de catalisador, foi compatível com os
valores obtidos para a biomassa de Chlorella descrita por Lemões (2011) e para
Isochrysis galbana avaliada por Procópio (2014). Desta forma, este valor atende a
especificação ANP para o teor de ésteres metílicos, que de acordo com a legislação
vigente, todo o biodiesel comercializado no país deve ter uma composição mínima
de 96,5 % de ésteres. A partir de 100 gramas de biomassa seca de Chlorella foram
obtidos cerca de 6,0 a 8,7 gramas de ésteres metílicos. Este valor pode ser
considerado satisfatório quando comparado as oleaginosas convencionais. No caso,
às oleaginosas contêm entre 18 – 50 % de lipídeos que é destinado ao biodiesel o
que representa uma pequena fração em relação à planta como um todo (VIÊGAS,
2010).
84
Tabela 6.6: Percentual e perfil de ésteres metílicos obtidos nas diferentes condições reacionais
Reação
Perfil de ésteres metílicos de ácidos graxos
12:0 14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3 20:4 Soma
(%)
5 % de H2SO4 0,159 0,079 1,076 0,138 0,255 0,317 1,335 2,019 0,358 5,7(±1,1)
10 % de H2SO4 0,254 0,299 0,223 0,787 0,490 1,770 10,138 12,210 0,828 24,1(±1,5)
15 % de H2SO4 0,163 1,441 10,787 1,063 1,321 2,090 12,711 10,863 1,283 41,5(±2,1)
20 % de H2SO4 0,263 2,081 23,245 11,181 2,854 4,523 31,227 23,411 0,277 98,8(±1,3)
Na Tabela 6.6 apresentam-se o teor e o perfil de ésteres metílicos bem como
percentuais relativos a cada éster obtidos por cromatografia gasosa. Foram
identificados seis ácidos graxos principais nas frações lipídicas de Chlorella sp., dos
quais dois saturados e quatro insaturados. De acordo com o experimento conduzido
com 20 % de catalisador, o ácido graxo saturado identificado na fração foi o ácido
palmítico (C16:0) (23,24 %). Fato comumente observado para Chlorella que em
outros estudos apresentou quantidades similares às obtidas nesse trabalho
(PETKOV & GARCIA, 2007). Neste trabalho, o ácido esteárico (C18:0) foi registrado
em quantidades muito baixas (2,85 %) igualmente aos valores relatados para a
Chlorella pyrenoidosa (1,1 %) (PETKOV & GARCIA, 2007). Os ácidos graxos
insaturados majoritários identificados nas amostras analisadas foram o linolênico
(C18:3) (23,41 %) e o linoleico (C18:2) (31,22 %). A classe Chlorophyceae tem uma
enzima ativa, a estearil-CoA desaturase, que favorece maiores níveis de ácidos
graxos insaturados C18 nestas espécies (YONGMANITCHAI & WARD, 1991). Nos
ensaios foi identificado o ácido araquidônico (C20:4) em concentrações muito baixas
(0,27 a 1,28 %), já em condições especiais de cultivo das microalgas da classe
Chlorophycea foram encontradas altas concentração desse ácido (C20:4) (CHEN &
JOHNS, 1991). O perfil de ácidos graxos nas microalgas é conhecido por ser
altamente variável e, dependente do grupo ao qual a espécie em estudo pertence e
da forma de cultivo (LEE et al., 1971; MORTENSEN et al., 1988)
Os ácidos graxos poliinsaturados, especialmente os ácidos linoleico (ω-6) e
linolênico (ω-3) quando somados, foram obtidos em uma quantidade de 54,6 % na
fração lipídica da Chlorella utilizada neste trabalho (Tabela 6.6), altas quantidades
desses ácidos também foram relatadas para Chlorella (65,7 %) descrita por
Abubakar et al., (2012). Estes ácidos graxos em altas concentrações não são
85
desejados, na composição do biodiesel, pois diminuem a estabilidade à oxidação. As
microalgas podem ser uma alternativa potencial para obtenção de ácidos graxos
essenciais para o consumo humano, já que apresentam quantidades significativas
desses compostos (BARCLAY et al., 1994). Neste caso, uma prévia separação dos
poliinsaturados antes da reação de transesterificação pode vir a ser uma alternativa
promissora, visto que estes compostos apresentam valor comercial muito superior
ao do biodiesel.
Nos ésteres metílicos produzidos na presença de 20 % do catalisador as
quantidades de monoglicerídeos, diglicerídeos, glicerina livre e total (Tabela 6.7)
estão de acordo com limites aceitáveis pela RANP 45/2014, que são 0,7, 0,25, 0,02
e 0,25 % em massa, respectivamente (Tabela 6.7). No entanto a quantidade de
triglicerídeos foi de 0,37 %, superior ao estabelecido pela mesma Resolução que é
de 0,02 % em massa.
Tabela 6.7: Teor de glicerídeos obtidos nas reações.
No caso de transesterificação in situ a combinação de álcool e catalisador
funciona para degradar as células de microalgas e transferir lipídeos do interior da
célula para a solução conforme já observado por Carrapiso & Garcia (2000). De
acordo com Haas & Wagner (2011), o álcool além de servir como um reagente no
processo in situ, enfraquece as membranas celulares da microalga e facilita a
extração e a conversão dos lipídeos à ésteres metílicos.
Na Tabela 6.8 estão apresentados os resultados obtidos a partir do
planejamento experimental para seleção da temperatura (1) e tempo (2) do
processo, fixando-se a condição de 20 % de H2SO4. As melhores condições
experimentais foram alcançadas nos ensaios 3 e 4 após 4 horas de reação
(conversão de aproximadamente 98 % de ésteres). De acordo com Figura 6.10,
apenas a variável tempo (2) foi considerada significativa quando o processo de
Glicerídeos
5 % 10 % 15 % 20 %
H2SO4
(%)
Monoglicerídeos 1,818 0,241 0,235 0,172
Diglicerídeos 22,515 0,562 1,189 0,082
Triglicerídeos 14,857 1,168 0,396 0,371
Glicerina livre 0,1364 0,028 0,037 0,002
Glicerina total 5,507 0,297 0,313 0,095
86
transesterificação foi conduzido entre 60 e 100 °C (p<0,05). Ehimen et al., (2010)
afirmam que o equilíbrio para conversão da biomassa a EMAG foi alcançado entre
60 °C e 90 °C durante 4 h, usando 0,14 ml de H2SO4 para 1 g de Chlorella, que é
comparável com as condições utilizadas nesta tese (0,11 ml de H2SO4 por 1 g de
Chlorella).
Tabela 6.8: Rendimento e teor de éster das reações de otimização de tempo e temperatura da reação de transesterificação in situ (20 % de H2SO4)
Ensaio
Variável Dependente Produto em relação à biomassa inicial (%)
Teor de éster
(%)
1 70,04 8,36
2 67,30 7,27
3 98,44 7,85
4 97,98 7,34
5 68,15 5,09
6 69,05 5,00
7 69,21 5,13
Figura 6.10: Avaliação da significância dos parâmetros tempo e temperatura na eficiência da transesterificação in situ.Onde: t(2)= tempo e T(1)= temperatura
O processo de transesterificação in situ elimina a etapa de extração do óleo, o
que pode ser considerado um ponto positivo, diminuindo assim as etapas do
processo e como consequência o tempo total para obtenção do biodiesel. No
entanto, sob o ponto de vista econômico, um grande excesso de metanol e ácido
sulfúrico foi utilizado para reação de transesterificação in situ, o que pode não ser
87
viável em grande escala.
6.3.1 Purificação dos ésteres metílicos da Chlorella
Os EMAGs da Chlorella obtidos após a transesterificação com 20 % em peso
de H2SO4 exibiram uma coloração verde escura devido à presença de clorofila e
carotenoides (Figuras 6.11 A), necessitando uma etapa de purificação. Tendo em
vista o alto preço de alguns agentes purificantes encontrados no mercado, utilizou-
se uma argila comercial de valor mais compatível com o processo. Após a
purificação foram obtidos 6,5 % de ésteres metílicos em relação à massa seca de
Chlorella. Os principais componentes da argila foram Si (16,6 %), Al (7,8 %), Fe (4,9
%) e 14,7 % de cinzas. A área superficial inicial da argila foi de 151 m2/GCAT e o
volume de microporos de 0,053 (cm3.GCAT)-1 medido pelo método de Dubinin. Após
o processo de purificação dos ésteres metílicos ocorreram reduções na área
superficial e volume específico dos microporos para 119 (m2.g)-1 e 0,043 (cm3.g)-1
indicando a redução de 21 e 19 % na área de superfície e no volume dos microporo,
respectivamente. Mais especificações técnicas da argila utilizada para purificação
dos EMAGs estão em ANEXO 6.1 - 6.5. Nas Figuras 6.11 A e B podem ser
observados os aspectos visuais dos ésteres metílicos antes e depois da purificação.
Figura 6.11: Aspectos visuais dos ésteres metílicos A) Bruto e B) purificados em argila
B) A)
88
6.3.2 Caracterização dos ésteres metílicos da Chlorella
Para confirmar a presença dos ésteres metílicos na amostra obtida no
processo de transesterificação in situ (20 % de catalisador), o produto da reação foi
analisado por espectrometria de infravermelho. Todos os experimentos de
caracterização a seguir foram realizados com os ésteres metílicos purificados e a
interpretação do espectro foi baseada em referências clássicas da literatura
(Silverstein & Wesbster, 1998). Esta técnica permitiu identificar bandas típicas de
estiramentos de ligação de carbonila de éster C=O em 1740 a 1750 cm-1 e os
estiramentos de deformação angular de C–O-C na faixa de 1180 a 1246 cm-1
(Figura 6.12). No espectro abaixo também foram identificadas regiões de 2800 a
3000 cm-1, características para os estiramentos das ligações alifáticas de CH, CH2 e
CH3 enquanto que as vibrações de flexão desses grupos aparecem nas regiões de
1350-1750, 1150 a 1350 e 700 cm-1. Este comportamento é similar ao reportado
para outros ésteres metílicos de microalgas como a Chlorella (VIÊGAS, 2010;
LEMÕES, 2011) e Arthospira platensis (MOSTAFA et al., 2013).
Figura 6.12: Espectro de infravermelho dos ésteres metílicos da Chlorella
As propriedades térmicas dessa amostra foram determinadas por calorimetria
exploratória diferencial. Os ciclos de aquecimento dos EMAG da Chlorella
89
apresentam dois picos: um endotérmico e outro exotérmico. As energias de
cristalização e fusão foram 33.2 J/g e 14.5 J/g, respectivamente. As temperaturas de
cristalização e fusão foram -4,0 e 5,9 °C, respectivamente (Figura 6.13). A
temperatura de cristalização para o biodiesel de soja é de -4,0 °C igualmente ao
resultado obtido neste trabalho (LEE et al.,1996). De acordo com Xu & Hanna (2009)
a temperatura de fusão para o biodiesel de soja é de 1,7 °C menor do que a obtida
para Chlorella.
Figura 6.13: Termograma de CED dos ésteres metílicos da Chlorella. Nota: pico exotérmico (gráfico
cor preta) e pico endotérmico (gráfico cor vermelha)
6.3.3 Determinação de propriedades físico-químicas dos EMAG da Chlorella
As propriedades físico-químicas dos EMAGs da Chlorella foram comparadas
com as especificações do biodiesel (ANP-Resolução n°45/2014) e os resultados
obtidos estão relacionados na Tabela 6.9.
A densidade dos EMAGs da Chlorella foi de 879,9 kg/m3 e está de acordo
com o limite especificado pela ANP que é de 850 - 900 kg/m3. O valor obtido neste
trabalho é similar aos valores que vêm sendo relatados para densidade do biodiesel
a partir de microalgas que está entre 879,4 - 864,0 kg/m3 (XU et al., 2006;
PROCÓPIO, 2014). A densidade do biodiesel está diretamente ligada com a estrutu-
ra molecular. Quanto maior o comprimento da cadeia carbônica do alquiléster, maior
a densidade. No entanto, este valor decrescerá quanto maior for o número de
90
insaturações presentes na molécula (LÔBO et al., 2009). A presença de impurezas
também poderá influenciar na densidade do biodiesel como, por exemplo, o álcool
ou substâncias adulterantes.
Tabela 6.9: Propriedades físico-químicas dos EMAG da Chlorella determinados de acordo com a Resolução 45/2014 da ANP.
**Determinado por termogravimetria
A viscosidade dos ésteres metílicos da Chlorella sp. apresentou um valor de
4,078 mm/s2 o que segundo a resolução vigente está dentro do limite aceitável (3 a 6
mm/s2). A viscosidade obtida para a Chlorella foi inferior à relatada para o biodiesel
de outra espécie de Chlorella (5,2 mm2/s) (AHMAD et al., 2013). De acordo com os
ensaios poderíamos esperar uma viscosidade dentro dos limites, devido à presença
de uma quantidade de ácidos graxos insaturados o que confere melhor escoamento
ao combustível formado. A viscosidade do biodiesel aumenta com o comprimento da
cadeia carbônica e com o grau de saturação e tem influência no processo de queima
CARACTERÍSTICAS
MÉTODO/ANO
UNIDADE
EMAG
da Chlorella
RESOLUÇÃO Nº45 /2014-ANP
MÍN. MÁX.
Massa específica a 20º C ASTM
D4052/2011 kg/m
3 879,7 850 900
Viscosidade Cinemática a 40ºC ASTM
D445/2014 mm
2/s 4,078 3 6
Teor de Água, máx. EN 12937/2000 mg/kg 1019
200
Teor de éster, mín EN 14103/2011 % massa 98,8 96,5
Teor de Cinzas ** % massa 0,39 0,02
Ponto de entupimento de filtro a frio, máx.
ASTM D6371/2010
ºC -5 14
Índice de Acidez, máx ASTM
D664/2011
mg KOH/g
0,35 0,50
Glicerol livre, máx ASTM
D6584/2013 % massa 0,002 0,02
Glicerol total, máx. ASTM
D6584/2013 % massa 0,098 0,25
Monoacilglicerol, máx. ASTM
D6584/2013 % massa 0,175 0,70
Diacilglicerol, máx. ASTM
D6584/2013 % massa 0,081 0,20
Triacilglicerol, máx. ASTM
D6584/2013 % massa 0,375 0,20
Metanol ou Etanol, máx. EN 14110/2003 % massa 0,081 0,20
Índice de Iodo EN 14111/2003 g de I2
/100g 164 Anotar Anotar
Estabilidade à oxidação a 110ºC, mín.
EN 14112/2003 h 1,1 8
91
na câmara de combustão do motor. Os sabões residuais, bem como os glicerídeos
não reagidos (mono-, di- e triglicerídeos) e os produtos da degradação oxidativa do
biodiesel, aumentam a viscosidade do biodiesel (LÔBO, et al., 2009).
Os níveis de glicerídeos e ésteres metílicos obtidos neste trabalho
determinados por cromatografia gasosa de acordo com a ASTM D 6584 e EN
14103, respectivamente já foram discutidos anteriormente no item 6.3.
O conteúdo de água nos EMAGs da Chlorella foi de 1019 mg/kg que está fora
do limite especificado pela ANP de 200 mg/Kg. O teor de água de 100 a 200 mg /kg
foi relatado no biodiesel da microalga Scenedesmus oblíquos, quantidade inferior a
obtida nesse trabalho. Este teor elevado de água dos ésteres metílicos da Chlorella
pode ter sido atribuído ao processo de lavagem do biodiesel, já que a água remove
o catalisador residual e outras impurezas. A água geralmente pode causar
problemas relacionados com a corrosão dos motores e contaminação microbiológica
(ATABANI et al., 2012). No entanto, dependendo da quantidade de água
remanescente no biodiesel o uso de um secador a vácuo ou da adição de sulfato de
sódio anidro podem ser utilizados para atender a especificação.
Os EMAGs da Chlorella apresentaram um ponto de entupimento de filtro a frio
de -5 ºC, este resultado está de acordo com o esperado para esta matéria-prima,
visto que esta apresenta uma grande quantidade de ácidos graxos poliinsaturados.
Temperaturas inferiores aos relatados neste trabalho foram encontradas para
microalga Chlorella (-11 ºC) (XU et al., 2006) e para Nannochloropsis oculata (-10
°C) (MUTHUKUMAR et al., 2012). Este resultado está de acordo com o especificado
pela ANP que estipula temperaturas máximas entre +5 a +19 °C dependendo da
região e da época do ano. Devido à temperatura obtida para os EMAGs da Chlorella,
a utilização desse combustível em lugares de clima frio seria vantajosa.
A partir da análise termogravimétrica (Anexo 6.1), foi determinada a
quantidade de cinzas dos EMAGs da Chlorella sendo obtido 0,39 %, quantidade
superior ao que é aceitável pela legislação brasileira para o biodiesel que é de 0,02
% em massa (RANP 45/2014). A quantidade de cinzas obtida neste trabalho foi
superior ao encontrado para o teor de cinzas do biodiesel de Chlorella vulgaris (0,01
%) (MALLICK et al., 2012). O alto teor de cinzas presentes nos EMAG da Chlorella
pode estar relacionado com a presença de contaminantes oriundos do catalisador e
de compostos inorgânicos vindos do cultivo da microalga (ANWAR et al., 2010).
92
De acordo com a norma ASTM 664 foi obtido o índice de acidez de 0,35 mg
KOH/g de amostra para os EMAGs da Chlorella. Este valor está de acordo com os
limites estabelecidos pela RANP 45/2014 que é de no máximo 0,5 KOH/g de
amostra. O índice de acidez dos EMAG da Chlorella foram próximos aos relatados
por outros autores para outras amostras de biodiesel de Chlorella como 0,37 mg
KOH/ g de amostra (XU et al., 2006) e 0,39 mg KOH/ g de amostra (PROCÓPIO,
2014). Os ácidos graxos livres ocorrem naturalmente em óleos vegetais e
principalmente no óleo das microalgas conforme descrito no item 6.2.1.1 e foi
possível verificar que o índice de acidez após a transesterificação foi reduzido. A
diminuição desse índice indica que grande parte dos ácidos graxos anteriormente
presentes na fração lipídica foram convertidos com sucesso em ésteres metílicos.
Os EMAGs da Chlorella apresentaram um teor de álcool de 0,08 % em
massa de metanol, este resultado esta dentro do limite aceitável pela legislação
vigente que é de 0,20 % em massa. O teor de álcool para o biodiesel da microalga
Scenedesmus dimorphus foi de 0,12 % em massa (ARCEO, 2012) resultado
superior ao obtido nesta tese para os EMAGs da Chlorella. O teor de álcool após a
transesterificação vai depender da quantidade de energia utilizada para evaporação
do solvente presente no biodiesel. Baixos teores de álcool no biodiesel apresentam
temperaturas mais apropriadas para um alto ponto de fulgor.
De acordo com os ensaios realizados em conformidade com a EN 14111 o
índice de iodo para Chlorella foi de 164 g I2/100g de amostra. Visto que os EMAG da
Chlorella apresentaram uma quantidade significativa de ésteres graxos insaturados,
é de se esperar que o índice de iodo para esta matéria-prima seja alta. A microalga
Chlorella protothecoides apresentou um índice de iodo de 154 g I2/grama de amostra
próximo ao obtido neste trabalho (XU et al., 2006). Comparado o valor obtido para
Chlorella foi superior ao biodiesel de girassol que apresenta um alto índice de iodo
entre 110 - 143 g I2/100g de amostra (GUNSTONE & HAMILTON, 2001). Segundo a
legislação brasileira, pela resolução RANP 45/2014 não existe um limite máximo
estabelecido para o índice de iodo, devendo apenas ser registrado seu valor. Por
outro lado, a especificação europeia, norma EN 14214, estabelece um limite máximo
de 120 g de Iodo/100g amostra. Para a utilização do biodiesel como combustível
também existem restrições para matérias-primas com alto teor de ácidos graxos
poliinsaturados definidos pela norma EN 14214. Esta norma também limita as
quantidades de EMAGs contendo ácido linolênico ou ácidos graxos com quatro ou
93
mais duplas ligações em 12 e 1 %, respectivamente (BUCY et al., 2013). Ao
comparar o perfil dos EMAGs obtidos neste trabalho, pode-se concluir que a
quantidade de EMAGs a partir do ácido linolênico não atende ao critério citado.
A estabilidade oxidativa dos ésteres metílicos da Chlorella sp. foi de 1,1
horas de acordo com o ensaio EN 14112 realizado no aparelho de rancimat (Figura
6.14). A baixa estabilidade oxidativa do biodiesel de Chlorella pode ser atribuída a
grande quantidade de ácidos graxos poliinsaturados presentes no combustível e do
H2SO4 utilizado para obtenção dos EMAGs, visto que este ácido é um oxidante muito
forte. De acordo com a literatura, a Chlorella protothecoides apresentou uma
estabilidade oxidativa de 4,5 horas (CHEN et al., 2012) e 4,7 horas para microalga
Monoraphidium Contortum (REYES et al., 2012), resultados superiores aos obtidos
nesta tese. Porém, ainda não foram satisfatórios para atingir o tempo mínimo exigido
na RANP 45/2014 que é de 8 horas. O processo de hidrogenação parcial seria
vantajoso para a modificação de alguns parâmetros físico-químicos analisados
visando atender as especificações da ANP. A adição de antioxidantes sintéticos
também seria um dos recursos utilizados para aumentar a estabilidade oxidativa
desse combustível.
Figura 6.14: Tempo de indução dos ésteres metílicos da Chlorella
6.4 Saponificação in situ
A saponificação in situ da biomassa da Chlorella, foi testada com diferentes
percentuais de KOH (5 a 20 %) em relação a massa seca de Chlorella. Neste
processo foram geradas 3 frações: fração insaponificável (produto 1), fração apolar
94
(produto 2) e biomassa residual (produto 3). De acordo com os resultados foram
obtidos 2,5 ± 0,3 % do produto 1 e após o tratamento estatístico verificou-se que não
há diferença significativa entre os resultados obtidos pelo mesmo processo sob
diferentes concentrações de álcali (Tabela 6.10). Esta quantidade foi semelhante a
relatada por Iwata & Sakurai (1963) que obteve 2,7 % de matéria insaponificável em
relação a massa seca de Chlorella e foi superior ao relatado por Diaz et al., (2014)
para microalga Chlamydomonas (~ 1,7 % média) a partir do processo de
saponificação in situ. Ainda de acordo com o mesmo autor, com o aumento da
concentração de KOH, ocorreu um aumento na quantidade de matéria
insaponificável. Este relato não foi comprovado para Chlorella utilizada neste
trabalho. Partindo de 100 gramas de biomassa seca, foi obtida uma quantidade
superior de material insaponificável utilizando a saponificação in situ quando
comparada com a quantidade obtida a partir da saponificação do extrato lipídico
(Tabela 6.11) e pode-se constatar que a quantidade de carotenoides totais em
ambos os casos foi semelhante (Tabela 6.11). O espectro de infravermelho da
fração insaponificável obtida in situ, apresentou as mesmas bandas ilustradas
anteriormente para a fração insaponificável obtida a partir da fração lipídica (item
6.2.1.1 Figura 6.15). Podem ser observadas bandas intensas na região de 2800 a
3000 cm-1 que são referenciadas na literatura como características para compostos
ligações CH de cadeia alifática. Devido à intensidade desta banda pode-se sugerir
que a quantidade desses compostos seja alta conforme o descrita por Paoletti et al.,
(1976). Foram obtidos 4,9 mg/g de carotenoides presentes na fração insaponificável
quantidade ainda inferior a relatada para Clamydomonas (7,5 mg de carotenoides/g)
descrita por Diaz et al., (2014) utilizando o mesmo processo (Tabela 6.12 e Figura
6.16). O material insaponificável obtido a partir do processo in situ (Figura 6.17)
quando comparado àquele obtido a partir da extração dos lipídeos forneceu
quantidade inferior de carotenoides. Comparando-se os teores de luteína nos
extratos obtidos in situ e a partir da fração lipídica foram detectadas concentrações
semelhantes nos dois processos (0,27 e 0,24 %, respectivamente.
95
Tabela 6.10: Resultados de fração insaponificável e ácido graxo a partir da saponificação in situ da Chlorella
* valores calculados com base em triplicadas de experimentos. Letras iguais na mesma coluna não diferem entre si pelo teste de Fischer L.S.D (p ≤ 0,05).
Tabela 6.11: Comparativo entre os processos de saponificação da fração lipídica e saponificação in situ Saponificação (lipídeos) Saponificação in situ
Lipídeos Totais (g/100 g de biomassa) 12 -
Matéria saponificável (g/100 g de biomassa) 10,6 6
Matéria insaponificável (g/100 g de biomassa) 1,4 2,5
Carotenoides totais (mg/100 g de biomassa) 16,3 12,2
Luteína (mg/100 g de biomassa) 3,2 6,7
Figura 6.15: Espectro de infravermelho da matéria insaponificável obtida in situ
Experimento KOH Insaponificáveis* % Fração Apolar* %
1 5 % 2,37 (±0,52) a 5,74(±0,61)
b
2 10 % 2,46 (±0,38) a 5.83 (± 0,43)
b
3 15 % 2,54(±0,31) a
6,15 (±0,45)b
4 20 % 2,69 (± 0,48) a 5,92(0,53)
b
96
Tabela 6.12: Perfil de carotenoides da fração insaponificável de Chlorella obtida pela reação de saponificação in situ com 10 % de KOH.
Carotenoides Fração insaponificável (mg/g)
Luteína 2,7
Zeaxantina 0,37
α-Caroteno 0,20
β-Caroteno 0,62
13-cis-β-Caroteno 0,02
9-cis-β-caroteno 0,01
Não identificados 0,8
Total (mg/g) 4,9
Figura 6.16: Cromatograma de CLAE para identificação dos carotenoides presentes na fração insaponificável da Chlorella sp.
Figura 6.17: Material insaponificável da Chlorella obtida in situ (produto 1)
97
A saponificação in situ gerou a obtenção de compostos de alto valor agregado
que precisam ser separados e quantificados e podem ter uma ampla aplicabilidade
industrial, porém grandes quantidades de insumos são requeridas.
6.4.1 Fração insaponificável como antioxidante natural para o biodiesel
Tendo em vista a capacidade antioxidante apresentada pela fração
insaponificável (EC50= 250 mg/g de DPPH) a mesma foi testada em um biodiesel de
soja como antioxidante natural. As concentrações usadas foram de 2000 a 8000 mg
Kg -1 de fração antioxidante em relação à massa de biodiesel (Tabela 6.13). Apenas
a concentração de 8000 mg Kg -1 foi observada um aumento de 80 % na
estabilidade oxidativa do biodiesel quando comparado com amostra sem o
antioxidante. Os carotenoides como caroteno e astaxantina foram avaliados como
antioxidantes em um biodiesel de girassol por Fröhlich (2005), no qual foram
adicionados numa quantidade entre 100 e 500 mg Kg -1, inferiores, porém nesta
faixa estes compostos não apresentaram atividade antioxidante.
Tabela 6.13: Atividade antioxidante da fração insaponificável testada em um biodiesel comercial
Entrada Fração insaponificável (mg Kg -1)
Tempo (horas)
Branco 0 5,1
Amostra 1 2000 6,0
Amostra 2 3000 6,2
Amostra 3 4000 6,4
Amostra 4 8000 9,0
Observou-se que na amostra 4 (Tabela 6.13) foi registrado um tempo de
indução de 9 horas na análise de estabilidade oxidativa desse biodiesel. Este
resultado é superior ao estabelecido pela Resolução nº45/2014 da ANP que
preconiza um tempo mínimo de 8 horas de indução. Nos demais ensaios, todos os
resultados ficaram abaixo do tempo de 8 horas. A fração insaponificável da Chlorella
não pode ser comprada com a de outras microalgas, pois não foram encontrados
relatos da utilização desta fração como antioxidante natural para biodiesel. A
atividade antioxidante da fração insaponificável da Chlorella pode ser atribuída à
98
presença de carotenoides (4,9 mg/g de extrato insaponificável) que são compostos
tradicionalmente utilizados com esta finalidade na preservação de produtos naturais.
6.4.2 Fração saponificável Foram obtidas aproximadamente 5,9 ± 0,4 % em massa da fração apolar
resultante da acidificação do sabão (Tabela 6.10). A mesma quantidade dessa
fração, obtida pelo mesmo processo, foi relatada no trabalho de Schroeder (2013)
para a microalga Scenedesmus. A fração saponificável obtida após o processo de
acidulação do sabão, produto 2 (Figura 6.18), foi caracterizada por FTIR e CG-DIC.
O espectro de infravermelho da fração do produto 2, (Figura 6.19) apresentou uma
vibração intensa na região de 1710 cm-1, sendo esta banda característica para as
moléculas ácidos graxos (carbonila de ácido graxo). Além disso, as bandas no
intervalo de 2800 a 3100 cm-1 denotam as vibrações CH2 de cadeias alquílicas.
Também foi identificada uma banda na região de 1740 a 1750 cm-1 característica
para carbonila de éster (C=O). O cromatograma GC-DIC obtido a partir da matéria
saponificável apresentou dois produtos: ácidos graxos e ésteres etílicos cujas
quantidades obtidas estão mostradas na Tabela 6.14. Esses dois compostos estão
relacionados à presença de água e álcool etílico no meio reacional que favorece a
produção desses compostos em paralelo. Conforme pode ser observado, o perfil
graxo apresentado no produto 2 com 5 % de ácidos graxos poliinsaturados difere do
perfil graxo obtido anteriormente para os EMAGs que apresentou 80 % desses
ácidos. Nota-se que no produto 2 ocorreu uma diminuição no teor de ácidos graxos
poliinsaturados devido à presença de base e ácido nas etapas do processo no qual
esta fração foi submetida, reação que é altamente oxidante. A principal vantagem da
utilização do processo in situ é a possibilidade de utilizar a biomassa úmida de
microalgas para obtenção de material saponificável e obtenção de matéria-prima
com um perfil graxo mais adequado para obtenção de biodiesel. Outro ponto que
deve ser levado em consideração é a adição direta de ácido a fração polar obtida
após a saponificação fazendo que o sabão seja convertido diretamente a ésteres
etílicos. A principal desvantagem deste processo consiste na utilização de excesso
de base seguida de uma acidificação, o que resulta num elevado teor de sais no
produto final. Este processo, além de requerer maiores dispêndios de reagentes,
requer também um maior número de operações de separação/purificação (VERGA
99
REI, 2007). A biomassa residual originada nesse processo, o produto 3, será
discutido no item 6.5.
Figura 6.18: Mistura de ácidos graxos e ésteres graxos da fração saponificável (produto 2)
Figura 6.19: Espectro de FTIR da fração saponificável (produto 2)
100
Tabela 6.14: O perfil de ácidos graxos e de ésteres etílicos (produto 2) identificados por CG-DIC
Composição Percentual mássico (%)
Palmitoleato de Etila 0,4
Palmitato de Etila 0,4
Ácido palmitoleico 0,3
Ácido palmítico 0,8
Ácido Margárico 0,3
Linoleato de etila 1,7
Oleato de Etila 35,2
Ácido Linoleico 2,8
Ácido Oleico 54,8
Ácido Esteárico 3,3
6.5 Biomassas residuais
Após a extração de lipídeos da biomassa algacea com e sem pré-tratamento
foram geradas biomassas residuais (Figura 6.20). A determinação de proteínas
nestas frações foi realizada pelo método de Kjeldahl em triplicatas. A biomassa
residual oriunda dos processos de extração dos lipídeos apresentou uma quantidade
de 61,6 ± 5,8 % de proteínas sendo estatisticamente iguais, independentemente do
solvente e do método utilizado. Esta quantidade de proteínas foi igualmente
encontrada na biomassa liofilizada sem nenhum tipo de tratamento, mostrando que
o processo de extração dos lipídeos foi bastante seletivo para o fim requerido. Os
teores de proteínas residuais obtidas após os processos de extração dos lipídeos
foram semelhantes aos obtidos por Lemões (2011) para biomassa residual da
Chlorella (66,5 %).
101
Figura 6.20: Biomassa residual obtida após a extração dos lipídeos.
Os teores de açúcares e proteínas foram avaliados na biomassa residual
obtida após o a transesterificação in situ com 20 % de catalisador. Neste caso, a
análise de açúcares apresentou um total 19,2 % em relação ao peso seco, que foi
relativamente próximo ao valor obtido para biomassa liofilizada 20,3 %. A glicose foi
o principal açúcar identificado nesta fração (70 % em relação ao total de
carboidratos). O teor de proteínas foi de 54,8 ± 4,5 % semelhante ao relatado para
biomassa residual obtida por Lemões (2011) pelo mesmo processo de
transesterificação in situ (49,1 % de proteínas). A biomassa residual analisada por
cromatografia por exclusão de partículas (Figura 6.21) mostrou-se praticamente livre
de fração lipídica (linha vermelha) quando comparada com a biomassa liofilizada
(linha azul) confirmando a eficiência do processo. A partir das análises das imagens
de microscopia eletrônica de transmissão foram comparados os efeitos na
morfologia da célula antes e depois de aplicada a transesterificação in situ (Figura
6.22 A). A análise de MET da biomassa residual difere da imagem da microalga
liofilizada, mostrando claramente a ruptura das estruturas (Figura 6.22 B). Como
esperado, a biomassa residual apresentou 3,25 ± 0,54 % de enxofre, quantidade
superior à obtida na biomassa liofilizada (0,52 ± 0,07 %). Devido a estes altos níveis
de enxofre a sua utilização da biomassa residual como fonte proteica para
alimentação animal não seria permitida. Mais informações sobre a composição da
biomassa residual obtida na transesterificação in situ estão disponíveis no Anexo
6.6.
102
Figura 6.21: Cromatograma obtido a partir da análise de CET da biomassa residual do processo de transesterificação in situ (linha vermelha) e biomassa liofilizada (linha azul). Nota: 1 e 2) Triglicerídeos e diglicerídeos, 3) ácidos graxos livres e monoglicerídeos.
Figura 6.22: Fotomicrografia obtida a partir de A) microalga liofilizada; B) microalga após a transesterificação in situ.
A A
B B
103
As biomassas residuais obtidas no processo de saponificação in situ
apresentaram uma redução da quantidade de proteínas proporcionalmente ao
aumento da quantidade de KOH. O produto 3 apresentou uma quantidade média de
proteínas de 21,1 ± 5,4 %, inferior aos dados obtidos neste trabalho para às outras
biomassas residuais. De acordo com Parsons et al., (1991) a presença de KOH na
reação de saponificação pode ter ocasionado solubilização dessas proteínas. A
análise de MET foi realizada para avaliar o resíduo após a reação de saponificação,
evidenciando que a estrutura ficou completamente destruída (Figura 6.23). Após a
saponificação a grande maioria das membranas, incluindo os tilacóides e amido
foram rompidos. Também foi observada a perda da rigidez da estrutura original o
que refletiu em formas celulares mais amorfas (Figura 6.23) diferindo da estrutura
apresentada para a biomassa intacta (Figura 6.22 A). Conforme esperado após a
análise de EDX a biomassa residual apresentou 21,2 ± 0,7 % de K em relação à
massa seca, níveis superiores quando comparados a biomassa liofilizada (0,92 %).
Mais informações da composição das biomassas residuais podem ser visualizadas
no Anexo 6.7.
Figura 6.23: Fotomicrografia obtida a partir da biomassa residual após a saponificação in situ
104
6.6 Biorrefinaria de Chlorella
Finalmente, de acordo com que foi exposto neste trabalho, pode-se propor
uma sequência de operações para obtenção dos diferentes produtos da biorrefinaria
de Chlorella (Figura 6.24).
Figura 6.24: Esquema de operações aplicadas na biomassa de Chlorella para obtenção de diferentes produtos: biorrefinaria.
CAPÍTULO 7 – CONCLUSÕES
Foi demonstrado neste trabalho que a Chlorella sp. possui amplo potencial de
aplicação dessa matéria-prima como fonte de proteínas, lipídeos, carboidratos e
carotenoides. A composição centesimal da Chlorella sp.é uma importante
informação para orientar futuras utilizações da biomassa.
Como esperado a mistura clorofórmio:metanol (2:1 v/v) foi a melhor solução
extratora para os lipídeos de microalgas tanto para a biomassa sem e com pré-
tratamento. Diferente dos processos tradicionais indicados para extração de óleo, o
hexano foi o solvente que apresentou os piores rendimentos em ambos os testes. O
pré-tratamento mecânico resultou no aumento na extração dos lipídeos quando
comparada com a biomassa sem pré-tratamento. O índice de acidez dos lipídeos
das microalgas extraídos com os diferentes solventes pode ser considerado alto
quando comparados ao de óleos vegetais, acarretando a busca de novos processos
para produção de biodiesel.
Do ponto de vista do aumento de escala, devido ao custo e toxicidade o
etanol mostrou-se o solvente mais indicado para extração dos lipídeos. Com o
aumento da temperatura e da razão solvente:carga os resultados obtidos nesta
condição foram comparados com os obtidos a partir da extração dos lipídeos
biomassa na pré-tratada com clorofórmio:metanol (2:1 v/v). Os extratos lipídicos
obtidos com solventes polares apresentaram maior capacidade antioxidante quando
comparados aos extratos apolares.
Os lipídeos da Chlorella sp. apresentaram uma grande quantidade de ácidos
graxos poliinsaturados, sendo o ácido linoleico presente em maior proporção e
consequentemente no biodiesel produzido nas reações in situ. Para produção dos
EMAGs o aumento da concentração do ácido sulfúrico e o tempo reacional foram
variáveis significativas para melhorar a taxa de conversão da biomassa em ésteres.
Fato que comprovado pela redução dos teores de ácidos graxos, mono, di e
triglicerídeos no produto final. Dentre os parâmetros obtidos, o teor de água,
triglicerídeos e estabilidade oxidativa não atenderam aos limites especificados pela
ANP. A produção de biodiesel da Chlorella pode ser viável a partir de uma espécie
com um perfil graxo mais adequado para este fim e do aproveitamento de seus
coprodutos. A argila selecionada foi eficaz para remoção dos pigmentos presentes
nos ésteres metílicos brutos, podendo ser aplicada para este fim em maior escala.
Aplicar o conceito de biorrefinaria para a separação das matérias
insaponificáveis e saponificáveis foi possível a partir da saponificação in situ.
106
No entanto, pode ser observada maior seletividade da extração em relação à luteína
quando se aplicou a saponificação in situ. A matéria insaponificável foi eficaz para
estabilização do biodiesel comercial, embora utilizada em quantidades superiores a
dos antioxidantes sintéticos.
Os ácidos graxos, obtidos neste processo, apresentam grande interesse
como matéria-prima para produção de biodiesel, uma vez que também foram
identificados ésteres etílicos com um perfil mais adequado para produção desse
biocombustível.
Os coprodutos sólidos apresentaram elevados teores de proteínas superiores
a de carboidratos quando comparados as outras biomassas residuais.
Por fim, a extração de diferentes compostos foi alcançada com sucesso,
porém alguns desafios ainda permanecem para viabilizar a inclusão das microalgas
como matéria-prima para aplicação no setor energético.
TRABALHOS FUTUROS
- Investigação da biomassa úmida para extração de diferentes compostos
como carotenoides, compostos fenólicos, ácidos graxos.
- Avaliar o solvente etanol para extração e transesterificação in situ, sob
condições mais elevadas de temperatura a partir de biomassa úmida de microalga.
- Extração de lipídeos a partir de biomassa úmida com homogeinizador e
identificação de compostos lipídicos.
-Obtenção de diesel verde a partir de microalgas.
-Avaliação da viabilidade econômica do processo, determinando os principais
gargalos tecnológicos e os pontos críticos para viabilização da biorrefinaria em
grande escala.
- Utilização da biomassa de microalgas para obtenção de bio-óleo com prévia
extração de compostos de alto valor comercial.
- Extração de EPA e DHA de biomassa úmida de microalgas.
- Avaliação do potencial nutricional da biomassa liofilizada e residual da
Chlorella.
- Utilização dos carboidratos da microalga para possível conversão a bioetanol.
-Caracterização completa da matéria insaponificável dos lipídeos da Chlorella
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ANEXOS
ANEXO 6.1: Análise termogravimétrica do EMAGs purificados
ANEXO 6.2: Análise de EDX da argila
130
ANEXO 6.3: Espectro de infravermelho da argila
ANEXO 6.4: Difratograma de raio-X da argila
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
20
40
60
80
100
Tran
smitâ
ncia
(%)
Número de Onda (cm-1)
Argila Verde
131
ANEXO 6.5: Fotomicrografia (MET) da argila
ANEXO 6.6: Caracterização da biomassa residual obtida na transesterificação in situ (20 %) por análise elementar de CHNSO, EDX e carboidratos
*Não detectado
ANÁLISE ELEMENTAR (%)
C 31,7 H 4,72 N 6,35 S 3,25 O 38,27
EDX (%)
Fe N.D Na N.D Mg 0,15 K 0,60 P 0,95 S 5,21 Ca 0,20 Al N.D Si 0,16
CARBOIDRATOS (mg/g)
Arabinose 1,5 Galactose 29,7 Ácido Galactonico 1,1 Glicose 143 Ácido Glucurônico 4,0 Mannose 4,7 Ramnose 5,9 Xilose 2,7
Total 192,5
132
ANEXO 6.7: Caracterização da biomassa residual obtida na saponificação in situ (5 % KOH) por análise elementar de CHNSO e EDX
*Não detectado
ANÄLISE ELEMENTAR (%)
C 26,86
H 5,31
N 3,52
S 0,22
O 40,22
EDX (%)
Fe 0
Na 0,42
Mg 0,40
K 21,25
P 1,99
S N.D*
Ca N.D
Al N.D
Si 0,09
