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26/01/2017
1
HLA et greffe d’organe :
Groupage, anticorps et crossmatch
JL TAUPIN
INSERM U1160 - Centre Hayem
Lab of Immunology and Histocompatibility
Hôpital Saint-Louis APHP
University Paris-Diderot
Découverte du HLA
Leuco-agglutination
MAC = HLA-A2
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2
Gènes et protéines du HLA
Polygénisme du système HLA
systèmepolygénique
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3
CO
L11A
2
DP
B2
DP
A2
DP
B1
DP
A1
DM
AD
MB
LMP
2
TAP
1
TAP
2
DQ
B3
DQ
A1
DR
B1
DR
B2,
6 o
u 7
DR
B3,
4, 5
ou
rien
DR
B8
ou r
ien
100 kb
centromère télomère
DP DM DQ DR
CO
L11A
2
DP
B2
DP
A2
DP
B1
DP
A1
DM
AD
MB
LMP
2
TAP
1
TAP
2
DQ
B2
DQ
A1
DR
B1
DR
B2,
6 o
u 7
DR
B3,
4, 5
ou
rien
DR
B8
ou r
ien
100 kb
centromère télomère
les gènes ne sont pas représentés à l’échelle, seules les distances les séparant le sont.
en noir: gènes HLA II exprimésen hachuré: pseudogènes HLAen blanc: gènes associés au HLA
DP DM DQ DR
Organisation de la région HLA de classe II
DQ
A2
DQ
B3
DO
B
DO
A
en noir: gènes exprimésen hachuré: pseudogènespour tous les haplotypes, l’allèle DRA exprimé est l’allèle DRA*0101 (il en existe un second, rare)
Impossible …
DRADRB9DRB1 DRB6 DRB5haplotype DR51
DRB1*15DRB1*16
DRB5*01 à *02
Impossible
d'afficher l'i
DRADRB9DRB1 DRB2 DRB3haplotype DR52
DRB1*03DRB1*11DRB1*12DRB1*13DRB1*14
DRB3*01 à *03
Impossible d'afficher l'i
DRADRB9DRB1haplotype DR8
DRB1*08
Impossible d'afficher l'ima… Impossible d'afficher l'image. Votre ordinateur
Impossible d'afficher l'i
DRADRB9DRB1 DRB7 DRB8 DRB4haplotype DR53
DRB1*04DRB1*07DRB1*09
DRB4*01 à *03
DRADRB9DRB1 DRB6haplotype DR1
DRB1*01DRB1*10
Impossible d'afficher l'i
Impossible d'afficher
l'image. Votre ordinateur
Impossible d'afficher l'image. Votre ordinateur
Impossible d'afficher l'ima…
Représentation schématique des cinq haplotypes DR
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4
Exon n° 1 2 3 4 5 6 7 8PS αααα1 αααα2 αααα3 TM CYT
PS αααα1 ou ββββ1 αααα2 ou ββββ2 TM CYT
Exon n° 1 2 3 4 5 6
CMH I
CMH II
Structure schématique des molécules HLA
Sillon d’ancragedu peptide
Structure tridimensionnelle des molécules HLA de cl asse I
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5
Molécule HLA de classe I présentant un peptide
sillon profond aux extrémités ferméespeptide court (8 à 12 acides aminés)
Molécule HLA de classe II présentant un peptide
sillon aux extrémités ouvertes : le peptide peut dé passerpeptide long (16 à 25 acides aminés)
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6
liaison avec le TCR
209 (>5.1011) peptides de 9 AAdans la nature
Présentation et reconnaissance
(Garboczi et al, Nature 1996)
liaison avec la moléculeHLA de classe I
le polymorphisme est principalement localisédans la région qui forme la poche
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7
La fréquence des LyT alloréactifs
• 1 LyT sur 10 5 à 106 reconnaît un peptide viral en l’absencede tout contact antérieur
• mais 1 à 10% des LyT circulants sont alloréactifs, chez unindividu qui n’a jamais été en contact avec un all o-antigène
Pourquoi ?????
Les CMH du Soi et du non-Soiexposent
des surfaces très proches
Le TCR peut donc reconnaîtrele CMH allogénique(sauf exception ?)
Le répertoire de peptidesprésenté par le CMH allo
est différent
Les peptides présents chez le Soi(mais non présentables par le Soi)sont considérés comme étrangers
l’alloréactivité est donc une conséquence directede la réactivité croisée du TCR
… parce que la présentation et la reconnaissancede l’antigène sont des mécanismes très subtils
Limitation possible à considérer : les contraintes potentiellement imposées par leco-récepteur CD4 ou CD8 dans l’orientation du TCR et du pCMH dans le complexe
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Le polymorphisme du HLA
Nomenclature du système HLA
Historique de la classification
Notion de « super-type »Notion de « sous-type » ou spécificitéNotion d’allèle
(Cesbron-Gautier et al, EMC, hématologie, 2007)
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9
Hülsmeyer et al. J Biol Chem 2005, 280 : 2972-80
Un anticorps est beaucoup plus gros qu’une molécule HLA
Un anticorps ne « voit » que lesvariations de surface de la moléculeHLA et pas la région la plus variable, l’intérieur de la poche
Le polymorphisme HLA
Octobre 2015:>10500 allèles de classe I>3000 allèles de classe IIno
mbr
e d’
allè
les
conn
us
année
systèmepolyallélique
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10
Classe I
Octobre 2015 :>7300 protéines de classe I>2500 protéines de classe II
Le répertoire peptidiqueprésentable varie avecla composition de la poche
Le polymorphisme HLAno
mbr
e d’
allè
les
conn
us
année
nombre d’allèles HLA connus (au 01/10/2015)
HLA Class I Alleles 10297 HLA Class II Alleles 3543 HLA Alleles 13840
Gene A B C E F GAlleles 3285 4077 2801 18 22 51 Proteins 2313 3011 1985 7 4 17 Nulls 153 128 93 1 0 2
Gene DRA DRB DQA1 DQB1 DPA1 DPB1 DMA DMB DOA DOBAlleles 7 1932 54 876 42 587 7 13 12 13 Proteins 2 1412 32 595 21 480 4 7 3 5 Nulls 0 47 1 22 0 15 0 0 1 0
Gene DRB1 DRB3 DRB4 DRB5Alleles 1825 60 17 22 Proteins 1335 48 10 19
Nulls 41 1 3 2
Classe I
Classe II
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Nomenclature du système HLA
classe I: HLA- A *02:01classe II: HLA- DRB1*01:01
complexe HLA
locus:gène codant pour la molécule A gène codant pour la chaîne ββββ de lapremière molécule DR
série allélique qui correspondà une spécificité sérologique,
ici A2 et DR1
numéro de l’allèledans la série allélique
Allèles particuliers:
HLA-A*02:01N : indique un allèle nul (non exprimé à la surface cellulaire: non produit ou soluble)HLA-A*02:01:02 : indique un allèle qui diffère de HLA-A*0201 par une mutation synonymeHLA-A*02:01:01:02 : indique un allèle qui contient une mutation en dehors de la région codanteHLA-A*02:01:01:02L : indique un allèle peu exprimé (« low ») qui contient une mutation en dehors de la région codante
HLA-A*02:01S : indique un allèle produit uniquement sous une forme sécrétée
HLA-A*02:01Q : indique un allèle dont le niveau d’expression est encore à confirmer (« questionable »)
mais tous les allèles ne sont pas présentsà la même fréquence dans la population
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Expressionco-dominante
une cellule « normale :classe I seulementdonc 2 molécules A + 2 B + 2 C
une cellule présentatrice de l’antigène :classe Iet deux molécules DR (gène DRB1)et 0 à 2 autres molécules DR (gènes DRB3/4/5)et 4 DQ et 4 DP
car : DQA et DQB polymorphesDPA et DPB polymorphes(mais DRA monomorphe)
le polymorphisme d’expression en classe II est > à la classe I
Combien de molécules HLA différentesune cellule exprime-t-elle ?
“Seen” byA2,A68;B27,B44
“Seen” byA2,A24;B7,B8
“Seen” byA2,A68;B35,B44
Polymorphic Residues on B51
Structural Basis of a HLA-B51 Mismatch(for antibodies)
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Groupage HLA
Groupage HLA de basse résolution: groupage génériqu e
= identifier super-types et sous-types���� sérologie (anticorps) (ex: A2, DR4)���� biologie moléculaire (ex: A*02, DRB1*04)
PCR-SSPPCR-SSO
Groupage HLA de haute résolution: groupage alléliqu e
= identifier les allèles à la base près���� biologie moléculaire (ex: A*02:01, DRB1*04:01)
PCR-SSPséquençage classique et NGS
Entre les deux: résolution intermédiaire���� biologie moléculaire sauf NGS
(ex: A*02:01/05/10, DRB1*04:01/09)
Groupage HLA
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1- Typage HLA par lymphocytotoxicité dépendante du Complément
molécule HLAreconnue
C’
Bromured’éthidium (rouge)
molécule HLAnon reconnue
C’
Acridineorange (vert)
Classe I
Classe II
les plaques de typages en « LCT » :
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Modification avec biotinylation d’une des amorces d e la PCR
2- Typage HLA en PCR-SSO-Reverse type « innolipa »
SSP = Sequence-Specific Primer
en 1992
une PCR par allèle ou par groupe d’allèlesavec une ou deux amorce(s) spécifique(s)
dépôt
ADN génomique
contrôle interne
bande spécifique
3- Typage HLA en PCR-SSP
� analyse du profil de bandes
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4- Typage HLA par NGS ( Next Generation Sequencing )
Principe général
- séquençage par synthèse après immobilisation de la matrice
Rizzo et alCancer Res Prev Rev2012
- multiplexage : plusieurs patients mélangés, indexation des amorces PCR
Amplification HLA par PCR « long range » > 5 kb
Alignement des « reads » pour définir la « couverture » de la région étudiéeet en déduire la séquence sans ambiguïté
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Anticorps anti-HLA et Crossmatch
la page « CRISTAL-immunologie » d’un patient en attente
TGI : nb de donneursincompatibles (=présenced’un Ac) sur5 ans en France
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1- Origine des anticorps anti-HLA
1- ne sont normalement pas présents sans évènementimmunisant allogénique
= anticorps immuns
2- causes:transfusions de culots globulaires
contaminants leucocytairesAc anti-classe I et/ou II
transfusions plaquettairesAc anti-classe I
grossesse10% après une grossesse, 60% après 3Ac anti-classe I et/ou II
transplantation antérieureAc anti-classe I et/ou II
2- Effets pathogènes
� Ac d’isotype IgG, IgA et/ou IgM
� les IgM ne sont pas en général pas pathogènes ; IgA ?
� impliqués dans:rejet hyperaigu :
Ac circulants préexistantsdans les minutes suivant la greffe
rejet aigurejet chronique
� mécanismes:activation du Complémentmobilisation des cellules phagocytaires
destruction cellulaire, inflammation
prolifération endothélium (rejet chronique)
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1969 : l’immunisation anti-donneur impose de procéd erà un crossmatch avant toute transplantation pour év iterle rejet hyperaigu (Patel et Terasaki, NEJM, 1969, 280: 735)
���� DSA pour « Donor Specific Antibody »
En 40 ans, l’identification du donneur compatible a évolué ++ :- meilleure sensibilité du crossmatch
- tests de recherche/identification des anticorpsLCT < ELISA < Luminex
amélioration de sensibilitéspécificitérésolution
La dernière idée à la mode, très « XXI e siècle » := le crossmatch virtuel
Le contexte
1- évolution des techniques de crossmatch
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Virtual crossmatch
The history
Is it possible to get rid of cell-based assays ?
Kidney : « NO ! »
Lung, Heart : CDC XM is usually retrospective
Liver : « what is a DSA ? »Eurotransplant
e.g. USAFrance
1- Technique historique: microlymphocytotoxicité (LCT)
HLA-B 1HLA-B 2
HLA-Cw 1HLA-Cw 2
HLA-A 2
HLA-A 1
C ’
sérum à tester (Ac)
cellule cible(donneur de phénotype HLA connu)
� principe
sérum non traité = IgG et IgMsérum traité DTT = IgG
= technique de référence (LCT type « NIH »)(Patel et Terasaki, NEJM, 1969, 280: 735)
résultat en score : 1, 2, 4, 6, 8
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Mise en évidence de rejets rapides à XM négatif
besoin de techniques plus sensibles
- XM LCT avec lavage (1970)(Amos et al, Transplantation 1970, 7: 220)
- XM LCT sur LyT sensibilisé à l’anti-globuline (1972)(Johnson et al, Tissue Antigens, 1972, 2: 215)
- XM LCT sur LyB sensibilisé à l’anti-globuline (1984)(Gebel et al, Tissue Antigens, 1984, 23: 135)
- XM en cytométrie en flux (1983)(Garavoy et al, Transplant Proc, 1983, 15: 1939)
sensibilité(/ LCT)
1
X 10-30
X 100-300
2- Microlymphocytotoxicité sensibilisée (LCT-AGH)
HLA-B 1HLA-B 2
HLA-Cw 1HLA-Cw 2
HLA-A 2
HLA-A 1
C ’
sérum à tester (Ac)
cellule cible(donneur de phénotype HLA connu)
� principe
Antiglobuline (anti-IgG humaine polyclonale)
C ’
En plus :
- isotypes n’activant pas le Complément- anticorps en trop faible concentration
(système d’amplification du signal)
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3- Cytométrie en flux (CMF)
HLA
cellule cible(donneur de phénotype HLA connu)
sérum à tester (Ac)
Antiglobuline fluorescente (anti-IgG ou IgM humaine polyclonale)
Anti-CD3 (LyT) ou CD19 (LyB)
Anti-CD45 (leucocytes)
amplification du signal ++++
+/- pré-traitement Pronase (digère les RFc des LyB)
2- évolution des techniquesd’identification des anticorps anti-HLA
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1- microlymphocytotoxicité (LCT)
HLA-B 1HLA-B 2
HLA-Cw 1
HLA-Cw 2
HLA-A 2
HLA-A 1
C ’
identifier la(es) molécule(s)HLA reconnue(s)
sérum à tester (Ac)
cellule cible(phénotype HLA connu)
panel de 30 à 60 cellulesrecouvrant les spécificités HLA
rencontrées localementprivilégiant les associations HLA rares
estimer le degré d’immunisationvis à vis de la population générale
panel représentatif de la répartition HLAcalcul du PRA % (panel reactive antibody)
hyperimmunisé: PRA>80%
sérum non traité = IgG et IgMsérum traité DTT = IgG
2- microlymphocytotoxicité sensibilisée (LCT-AGH)
HLA-B 1HLA-B 2
HLA-Cw 1HLA-Cw 2
HLA-A 2
HLA-A 1
C ’
sérum à tester (Ac)
cellule cible(phénotype HLA connu)
� principe
Antiglobuline (anti-IgG humaine)
Comme avec la LCT-NIH, pour identifier les anti-classe II sur LyB,il faut au préalable adsorber les anti-classe I sur pools de plaquettes(très lourd !!!!)
C ’
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3- ELISA et Luminex sur panel
HLA-B 1
HLA-B 2
HLA-Cw 1
HLA-Cw 2
HLA-A 2
HLA-A 1
cellule de phénotype HLA connu
purification des molécules HLA
Principe de l’ELISA Principe du Luminex
sérum à tester (Ac)
coloration
Ac anti-IgG humaines
fluorescence
� principe1 cellule par puits/bille
Appareil Luminex
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� modalités d’application
Screening ou dépistage : réponse + ou –tous les antigènes mélangésséparément classe I et classe II
Identification sur panel : 50 à 60 billes ou puits en classe Ienviron 30 en classe IIcorrespond au panel LCT1 « cellule » par bille ou puitscalcul d’un PRAsensibilité > au dépistage
Identification sur antigènes séparés : « single antigen »sensibilité > au panelpas de PRA
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26
Mr MAR Groupe : A3 A30 B35 B391er rein : A1 A2 B35 en 1982
A2
A28
score 8score 6
sc. 4
sérum du 30/11/04
en panel luminex :
PRA = 22/56 = 40%
4- Techniques de haute résolution ou « single antigen »� principe
HLA-B 1
HLA-B 2
HLA-Cw 1
HLA-Cw 2
HLA-A 2
HLA-A 1
cellule de phénotype HLA connu
purification séparée des molécules HLA(ou molécules recombinantes)
Principe de l’ELISA Principe du Luminex
sérum à tester (Ac)
coloration
Ac anti-IgG humaines
fluorescence
1 antigène par puits/bille
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� modalités d’application
Application récente :
apparition en France en 2000 en classe I en ELISAen 2004 en classe I en Luminexen 2005 en classe II en Luminex
Développement progressif :
gamme Luminex complète en classe I et II depuis fin 2007 seulementA, B et Cw en classe IDR, DQ et DP en classe IIchaîne α et β pour DQavec les allèles qui couvrent > 95% de la pop.
couverture épitopique très proche de 100 %
single antigen, analyse « baseline »
groupe : A1,2 ; B44,57 (Bw4)
Mme REA… (0 greffe, 0 transfusion, 2 grossesses) : suspicion anti-Bw6
� profil d’immunisation classe I en « single antigen » luminex
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LCT ELISA / Luminex
Isotypes détectables IgG et IgM IgG
Fonctionnalité Ac cytotoxiques Tous les anticorps
Ag cibles HLA et autres Ag HLA
Sensibilité + ++ à +++
Distinction cl I/cl II non(ads sur plaquettes) oui
Automatisation non oui
Avantages / Inconvénients des différentes techniques
Test de dépistage non oui
• 189 patients (119 XM + and 70 XM -)• XM : AHG-CDC and FCM• sum DSA (class I + class II)
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29
(-) XMFXMCS < 300
T- AHG-CDC (+)
FXMCS > 300
no DSA sMFI DSA<5000
sMFI DSA 5k - 10k
sMFI DSA> 10k
(-) XM
FXMCS < 300FXMCS > 300T-AHG-CDC (+) sMFI DSA > 10k
sMFI DSA (5k - 10k)sMFI DSA < 5000
no DSA
AMR-free patients
Allograft survival
AAMR
No AAMR
MFI of immunodominant DSA
AAMR risk increases with DSA strength (not consens ual)
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30
3- la notion de réactivité croisée d’un anticorps anti-HLA
1- les molécules HLA sont proches en séquence et en conformation spatiale
2- il existe des épitopes communs à plusieurs molécules HLA: épitopes publicset des épitopes spécifiques d’une molécule HLA: épitopes privés
3- les molécules HLA sont regroupées d’après leur réactivité antigénique en:
spécificités larges Bw4 et Bw6 (pour le HLA-B)
CREG (groupes de réactions croisées)
super-types
sous-types
allèles
La notion de réactivité croisée
public
privé
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31
CREG A1A1A3A11A36
CREG A2A2A28A68(28)A69(28)
CREG A9A9A23(9)A24(9)
CREG A10A10A25(10)A26(10)A34(10)A43A66(10)
CREG A19A19A29(19)A30(19)A31(19)A32(19)A33(19)A74(19)
CREG B7B7B13B22B27B37B40B41B42B47B48B54(22)B55(22)B56(22)B60(40)B61(40)B67B81
CREG B5B5B18B35B51(5)B52(5)B53B70B71(70)B72(70)
CREG B15B15B17B62(15)B63(15)B75(15)B76(15)B77(15)B57(17)B58(17)
CREG B12B12B21B44(12)B45(12)B49(21)B50(21)
CREG B8B8B14B16B38(16)B39(16)B64(14)B65(14)
B59 B73 B78
A80
les CREG (Cross-REacting Groups )
B46
36 1 11 3
24
2403
23
69203 2
9
210 68
28
26
66
34
10
25
80
33
32 74
43
29
31 30
19
Forte réaction croisée
Réaction croisée
CREG
3- Les Groupes de REactivité Croisée (CREG)
HLA-A
26/01/2017
32
HLA-B
4005
12
5045
44 49
21
57 58
62 6376
17
15
777572
70
71
78 51
35 53
52
51035102
18
5
656414
46
8
59 67
39
38
16
3901
3902
55
56 54
13
2708
27
47
41
60
7
42
703
61
48
81
40
22
73
Forte réaction croisée
Réaction croisée
CREG
37
60 70 80 90 100B*070201 CDVGPDGRLL RGHDQYAYDG KDYIALNEDL RSWTAADTAA QITQRKWEAAB*070202 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------B*070203 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------B*070204 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------B*0703 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------B*0704 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------B*0705 ---------- ---N------ ---------- ---------- ----------
B*2701 ---------- --E---C--K ---Y--N--T ALR------- ------N---B*2702 ---------- --E---C--K ------N--I ALR------- ------N---B*2703 --------H- --E---C--K ------D--T -LR------- ------N---B*2704 ---------- --E---C--K ---------T -LR------- ------N---B*270502 ---------- --E---C--K ------D--T -LR------- ------N---B*270503 ---------- --E---C--K ------D--T -LR------- ------N---B*270504 ---------- --E---C--K ------D--T -LR------- ------N---B*270505 ---------- --E---C--K ------D--T -LR------- ------N---B*270506 ---------- --E---C--K ------D--T -LR------- ------N---B*2706 ---------- --E---C--K ---------T -LR------- ------N---B*2707 ---------- --E---C--K ------D--T -LR------- ----------B*2708 ---------- --E---C--K ---------- ---------- ------N---B*2709 ---------- --E---C--K ------D--T -LR------- ------N---B*2710 ---------- --E---C--K ------D--T -LR------- ------N---
domaine αααα1
épitope Bw6
épitope Bw4
La complexité des réactions croisées
TALR
IALR
TLLR
26/01/2017
33
Position de l’épitope Bw4/Bw6
�
Mr MAR Groupe : A3 A30 B35 B391er rein : A1 A2 B35 en 1982
A2
A28
score 8score 6
sc. 4
sérum du 30/11/04
en panel luminex :
en LCT (LyT, +DTT) : PRA = 26/56 = 47% (sc4+6+8)23/23 A2, 1/5 A68, 2/28 autre
PRA = 22/56 = 40%
26/01/2017
34
RECIPIENT : A11,33 ; B39,51 ; DR11,17 ; DR52 ; DQ2,7
LIVER DONOR: A2,29 ; B7,18 ; DR11,15 ; DR51,52 ; DQ6,7
epitope 127K or #19 : restricted to A2, A23, A24, A68 and A69epitope 62G or #17: restricted to A2, B57 and B58.
In situ in a liver transplanted patient (1)
Biopsy eluates
(Neau-Cransac et al, 2015)
Serum class I DSA are negative or close to, while b iopsies are strongly positive
Serum class II DSA levels are more stable (less tra pping ?)
In situ in a liver transplanted patient (3)
Serum
26/01/2017
35
4- faux amis et vrais ennemis
104 sérums de patients en attente rein, avec Ac ant i-DQ
71% ont des Ac reconnaissant au moins une bille por tant le DQdu patient lui-même
49% = DQββββ Soi associé à DQ αααα non-Soi90% = DQαααα Soi associé à DQ ββββ non-Soi
Anti-DQalpha
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Dissociations Ac anti-DQ en SAg : ex de DQ2 (DQB1*02)
Transplantation 2013
chaîne beta chaîne alpha chaîne alpha+ beta
PI = anti-DQ2PII = anti-DQA1*02:01PIII = association DQB1*03:01 et DQA1*05:05
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bille allèle ββββ allèle αααα groupe ASSOCIE DQB1 DQA129 DQB1*0201 DQA1*0301 DQ2 DQ2 47Q39 DQB1*0301 DQA1*0301 DQ7 à DR 4 DQ7 47Q42 DQB1*0302 DQA1*0301 DQ8 à DR 4 DQ8 47Q44 DQB1*0303 DQA1*0301 DQ9 à DR 9 DQ9 47Q68 DQB1*0302 DQA1*0302 DQ8 à DR 4 DQ8 47Q69 DQB1*0303 DQA1*0302 DQ9 à DR 9 DQ9 47Q70 DQB1*0401 DQA1*0303 DQ4 à DR 4 DQ4 47Q28 DQB1*0201 DQA1*0201 DQ2 à DR 7 DQ2 47K31 DQB1*0202 DQA1*0201 DQ2 à DR 7 DQ2 47K32 DQB1*0401 DQA1*0201 DQ4 DQ4 47K33 DQB1*0402 DQA1*0201 DQ4 DQ4 47K40 DQB1*0301 DQA1*0201 DQ7 DQ7 47K45 DQB1*0303 DQA1*0201 DQ9 à DR 7 DQ9 47K82 DQB1*0302 DQA1*0201 DQ8 DQ8 47K30 DQB1*0201 DQA1*0501 DQ2 à DR17 DQ2 40G+47C34 DQB1*0402 DQA1*0401 DQ4 à DR 8,18 DQ4 40G+47C41 DQB1*0301 DQA1*0601 DQ7 à DR11,12 DQ7 40G+47C65 DQB1*0201 DQA1*0401 DQ2 DQ2 40G+47C66 DQB1*0301 DQA1*0503 DQ7 à DR11,12 DQ7 40G+47C67 DQB1*0301 DQA1*0505 DQ7 à DR11,12 DQ7 40G+47C
Anti-DQα : jouer sur les associations DR/DQ pour interdire l’Ag adéquat
C1qrs
IgG
Cécile BordesCours P2
fixé à la cibleinactivé en C4d stable : marquage C4d (biopsie, SA luminex)
IgM>> IgGIgM>> IgGIgM>> IgGIgM>> IgG3333 > IgG> IgG> IgG> IgG1111>> IgG>> IgG>> IgG>> IgG2222
2 molécules d’IgG minimum
Anticorps fixantle C (C1q ou C3d)
en luminex
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Complement interference : prevalence
CLASSE I
253 sera
29 with C-interference = 11.5%
mean 15.1 beads/serum
ROC : MFI threshold = 14001
CLASSE II
258 sera
42 with C-interference = 16.3%
mean 12.3 beads/serum
ROC : MFI threshold = 16295
+ EDTA + EDTA
no
ED
TA
no
ED
TA
Guidicelli et al,
unpublished
(Loupy, Lefaucheur et al, NEJM, 2013)
Detecting complement activating antibodiesto identify clinically relevant DSA (1)
n = 1016 kidney recipients
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Detecting complement activating antibodiesto identify clinically relevant DSA (3)
Sicard et al, JASN 2014
Lyon Bordeaux
kidney
Detecting complement activating antibodiesto identify clinically relevant DSA (4)
C1q+ serum DSA is close to, but does not reach significance
Only one study, two different SAFB kits from different vendors
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Ciurea et al, BBMT 2015
Le test C1q détecte les DSA cliniquement actifs en greffe de CSH aussi
n=73 sera
single antigen revealedfor IgG or C1q
Ab strength very stronglycorrelates with IgG MFI :
C1q+ Threshold = 14000
C1q assay and antibody strength
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Guidicelli/Guerville et al
Les DSA C1q- seraient aussi délétères que
les DSA C1q+ mais à plus long terme
2013
very often >1 isotype
almost always IgG1 (+/- IgG3)
IgG subclasses for anti-HLA antibodies
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IgG subclasses for anti-HLA antibodies
Lefaucheur et al,
5/104 n’ontni G1 ni G3
iDSA préformé chez 78% des patientsiDSA défini par la MFI la plus forteen test pan-IgG � sous-classe iDSA
C1q iDSA
Correlations are antigen-dependent
Anticorps anti-HLAde classe I
dit « dénaturé »
(Visentin et al,Transplantation 2016)
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39% of sera
N DM
FI (
x10
-3)
0
5
10
15
20
not with every Ag
23% 22% 21
%
21
%
0% 0% 0% 1%
% are for D >1.2N, among
the n cases with MFI>1000
in non-denaturing
condition
Visentin et al, Transplantation 2014
N D
MF
I (x1
0-3
)
0
5
10
15
20
kind of targetHLA epitope
Native 100% acid-sensitive
Acid-denatured
Bead-denatured acid-resistantor
+/- +/- +/-
native or , but partlyacid-sensitiveor +
The reality couldbe more subtle…
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85% of
FCXM+
p<0.0001
21% of
FCXM+
threshold for positivity = 50 MCS
64 different donor cells
225 FCXM tests
1 class I Ag mismatch
with SAFB MFI>2000
anti-dHLA :
n=71 tests
for 12 A, 14 B and 1 Cw
with 39 serum samples
antianti--nHLA :nHLA :
n=154 tests
for 13 A, 21 B and 1 Cw
with 84 serum samples
A few examples
80 ERN = native
#5024 (66I+70Q)
= cryptic
161D = native
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A major gain in transplant access
for many patients with
« basal » cPRA below 60%
cPRA decreased for 96/323 patients
cPRA estimated after removal
of the Ab against denatured
Ag (D>1.2N)
5- les stratégies possibles au laboratoire HLA
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2- Anticorps en LCT et crossmatch en cytométrie
3- Anticorps en technique sensible et crossmatch en LCT
4- Le « tout Fluo » : anticorps et crossmatch en techn iques sensibles
1- Le « tout LCT » : anticorps et crossmatch
Peu de sélection immunologique D/RCohérence du raisonnement: techniques de sensibilité comparable
Sélection immunologique D/R +++, mais au moment de l’urgenceIncohérence du raisonnement: sensibilité maximale au dernier moment
Sélection immunologique D/R +++, en amont de l’urgenceCohérence du raisonnement: techniques de sensibilité maximale en amontMais crossmatch peu sensible
Sélection immunologique D/R +++, en amont et au moment de l’urgenceCohérence du raisonnement: techniques de sensibilité comparable
5- Le « tout Fluo » sans crossmatch réel (crossmatch v irtuel)
Remplacer le crossmatch par un « single antigen » du sérum du jour
Conclusions
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single antigen, baselineTests XM CMF
Ag Bw6 nb donneurs résultat (x bt de fd)
B39 1 1,5 sur T et 3 sur B
1- Définir au cas par cas le seuil d’interdiction d’ un Ag HLA ?
DSA faible, crossmatch faible,… Mais s’il s’agit d’un donneur vivant ?
- définir le risque acceptable pour chaque patient immunisé :crossmatch sensible positif toléré ?anticorps faiblement positif non contre-indiqué ?
� à voir en fonction de l’accès à la greffe (FAG, TGI)
voir aussi Gebel et al, Am J Transplant 2003,3: 1488-500et Bray et al, Curr Op Organ Transplant 2009, 14: 392-7
- gestion au cas par cas au laboratoire HLA (CRISTAL)en accord avec l’équipe de greffe
2- stratifier le risque immunologique
(Taylor et al, Hum Immunol, 2009 ; 70: 563)
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non immunisé LCT négative
immunisation
XM
LCT positive (LyT ou totaux)
Force de l’Ac anti-HLA
pasde
greffe
greffe
Il y a 40 ans (Terasaki, NEJM 1969) :
Ac anti-HLA
XM
immunisation faible
non immunisé
immunisation moyenne
immunisation forte
Force de l’Ac anti-HLA
pasde
greffe
greffe sans
risque immuno
greffeà
risqueimmuno
Ag permis
XM LCTpositif
MFI 500
XM B CMF+
>250 MCS
XM B CMF+
<250 MCS
greffe avant le
résultat du XM
REIN:* désinterdire1) MFI <3000 pour TGI>60% inscrit >2 ans2) Ag <5000 5 ans pour HAP >5 ans3) Ag<1000 depuis>5 ans pour tous
*avec prozone, Ac non ABDRDQ, allèles...
Aujourd’hui :
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Ac anti-HLA
XM
immunisation faible
non immunisé
immunisation moyenne
immunisation forte
Force de l’Ac anti-HLA
pasde
greffe
greffe sans
risque immuno
greffeà
risqueimmuno
Ag permis
XM LCTpositif
MFI 500
XM B CMF+
>250 MCS
XM B CMF+
<250 MCS
greffe avant le
résultat du XM
REIN:* désinterdire1) MFI<3000 (dernier sérum) pour TGI>60% inscrit >2 ans2) MFI<5000 (dernier sérum) pour HAP >5 ans3) Ag<1000 depuis >5 ans pour tous immunisés
*prenant en compte prozone, Ac non ABDRDQ, allèles...
Aujourd’hui (ex CHU de Bordeaux):
- logiciel HLA Matchmaker et la notion d’éplet(travaux de René Duquesnoy)
pas de consensus entre les études surl’influence du nombre d’épitopes apportés au receveuret le risque de rejet
- autre approche (charge électrique, hydrophobicité….)
3- raisonner autrement : en épitopes
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Merci de votre attention