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Volumen V No.2 Junio 2006 Higiene Palpebral en el Tratamiento de la Blefaritis David Díaz Valle MD, Jose Manuel Benitez-Del-Castillo Sánchez, MD. Terapia Genética nas Doenças Corneanas Lauro A. Oliveira, MD, Mark I. Rosenblatt, MD, Ph.D. Current Role of Anti-VEGF Therapy in the Management of Choroidal Neovascularization J. Fernando Arévalo, MD FACS, Reinaldo A. García, MD, Juan G. Sánchez, MD. Estandarización de una técnica de cultivo de epitelio, endotelio y fibroblastos corneales y evaluación de su crecimiento sobre mallas de colágeno tipo I. Carlos H. Triana S. MD; Carlos A. Chiriboga N. MD; Marta R. Fontanilla D. PhD

Higiene Palpebral en el Tratamiento de la Blefaritis Terapia

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Volumen V No.2 Junio 2006

Higiene Palpebral en el Tratamiento de la BlefaritisDDaavviidd DDííaazz VVaallllee MMDD,, JJoossee MMaannuueell BBeenniitteezz--DDeell--CCaassttiilllloo SSáánncchheezz,, MMDD..

Terapia Genética nas Doenças CorneanasLLaauurroo AA.. OOlliivveeiirraa,, MMDD,, MMaarrkk II.. RRoosseennbbllaatttt,, MMDD,, PPhh..DD..

Current Role of Anti-VEGF Therapy in the Managementof Choroidal Neovascularization JJ.. FFeerrnnaannddoo AArréévvaalloo,, MMDD FFAACCSS,, RReeiinnaallddoo AA.. GGaarrccííaa,, MMDD,, JJuuaann GG.. SSáánncchheezz,, MMDD..

Estandarización de una técnica de cultivo de epitelio,endotelio y fibroblastos corneales y evaluación de su crecimientosobre mallas de colágeno tipo I.CCaarrllooss HH.. TTrriiaannaa SS.. MMDD;; CCaarrllooss AA.. CChhiirriibbooggaa NN.. MMDD;; MMaarrttaa RR.. FFoonnttaanniillllaa DD.. PPhhDD

PAN-AMERICA 1: :

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l aprendizaje de la oftalmología como una especialidad ha cambiado conel tiempo. Hace menos de un siglo se aprendía al lado de un maestro,

sin un programa definido y en tiempos variables. De ahí evolucionamos a lasresidencias médicas, en ellas, a través de un programa definido, el aspirante aoftalmólogo va cumpliendo en forma gradual y progresiva objetivos en conoci-mientos y destrezas. Este sistema de residencias es el que ha predominado enprácticamente todo el mundo occidental.

Los programas de residencia varían en su calidad; los hay excelentes,muchos buenos y unos más que dejan que desear. Su diversidad sucede porcondiciones socioeconómicas, patología variable y tecnología distintas. Estasdiferencias existen y continuarán existiendo.

Los oftalmólogos que en ellas seforman pueden, en consecuencia, tener dis-tintas capacidades. Sin embargo, es impor-tante buscar que estas diferencias sean lasmenores y que un oftalmólogo que egresade cualquier centro tenga un mínimo deconocimientos necesarios para ejercer unaoftalmología moderna y así cumplir con lasdemandas de salud del país en el que va aejercer. Por lo tanto, el disminuir estas dife-rencias educativas entre los distintos centros

formadores es preocupación constante de los distintos organismos nacionalese internacionales.

En el modelo de residencias médicas un personaje de gran importanciaes el encargado de los residentes (program director). Este puede ser el profesortitular o bien, algún oftalmólogo joven que tiene una inclinación especial para laenseñanza. De él, con frecuencia, depende toda la organización de la estruc-tura curricular de la residencia de oftalmología.

La Asociación Panamericana de Oftalmología ha considerado que unode sus programas prioritarios es el mejorar la calidad de la enseñanza en losprogramas de residencia en Latinoamérica. Para tal efecto el 23 y 24 de marzodel presente año se llevó a cabo en la ciudad de Lima, Perú, el segundo cursolatinoamericano encaminado a enseñar a enseñar, específicamente dirigido alos encargados y responsables de las residencias de Oftalmología del Perú,Bolivia y Ecuador.

El curso fue un gran éxito tanto en la asistencia (51 directores) como enla participación activa y discusión de los temas más importantes relacionadosa la enseñanza de la oftalmología, y en curso se trataron: las formas de superarlos desarrollos curriculares y metas del aprendizaje; las técnicas para mejorarla efectividad de la enseñanza; los distintos métodos para evaluar las compe-tencias adquiridas; la retroalimentación de las virtudes y defectos de los resi-dentes; los métodos de enseñanza clínica y quirúrgica y los programas decertificación.

Para desarrollar un curso de esta naturaleza deben orquestarse unaserie de organizaciones. Se contó con la decidida colaboración del Interna-cional Council de Oftalmología (ICO); de la Academia Americana de Oftalmo-logía (AAO); de la Asociación de Profesores Universitarios de Oftalmología enlos Estados Unidos de Norteamérica (AUPO) y de la Organización de Profe-sores de Oftalmología de la APAO (PACUPO ). Gracias al esfuerzo de todosellos bajo excelente la coordinación del Dr. José Antonio Roca y del Dr KarlGolnik el curso logró sus objetivos.

Participaron como profesores del curso en forma muy destacada losDres: Bradley R. Straatsma, Anthony Arnold, Karl Golnik, Andrew Lee, Peter A.Quiros, Juan Cuadros, Victor Dulanto y Guillermo Barriga.

Una especial mención debe hacerse a la industria. En esta ocasiónLaboratorios Alcon, con discreción y elegancia, cargó con todos los gastos detraslado y hospedaje de los asistentes mientras que el Internacional Councilhizo lo propio con los profesores. Una aportación adicional fue efectuada por laFundación Panamericana de Oftalmología.

De esta forma, entre todos, vamos construyendo un mejor futuro para laoftalmología de este continente.

he training in the field of ophthalmology as a specialty has changad withtime. In less than a century, one learned in an apprentice model at the side

of a teacher, without a defined program and with varied schedules. From therewe developed medical residencies and in those programs, along with a definedprogram, the aspiring ophthalmologist continues gradually with progre-ssiveobjectives in knowledge and skill. This system of residencies has becomestandard in practically all of the Western Hemisphere.

The different residency programs vary in their level of quality; there areexcellent programs, many good ones and some leave something to be desired.Its diversity is a result of socio-economic conditions, varied backgrounds anddifferent technologies. These differences exist and will continue to exist.

The ophthalmologists that train in different residencies, consequently,can have different capacities. Nevertheless, it is important to make sure thatthese differences are minimum and that the ophthalmologist that returns fromwhatever training center has had at the least minimum standards necessary tobe able to do modern ophthalmology and thereby fulfill the health care demandsin the country in which he/she is going to practice. It is a constant concern,therefore, of the different national and internacional training and educationalorganizations that they make sure that the educational differences are as mini-mal as posible.

In the medical residencies model, the person of great importance is theprogram director. This person can be a degreed professor or perhaps a youngophthalmologist that has a special inclination towards teaching. The programdirector is often responsible for the organization of the curricular structure for theophthalmological residency program.

The Pan-American Association of Ophthalmology has determined thatone of its program priorities is to standardize the teaching quality of the resi-dency programs in Latin America. As such, on March 23-24, 2006, in Lima,Peru, the 2nd Latin American "Teaching the Teachers" Course took placedirected to those responsible for ophthalmological residencies in Peru, Boliviaand Ecuador.

The course was a great success. 53 program directors actively partici-pated and they discussed the most important topics related to teaching inophthalmology: Development of the curriculum and training goals; differentmethods of evaluating acquired skills; the nourishment of the virtues and theculling of the defects of the residents; methods of clinical and surgical trainingand certification programs.

To organize a course of this type one needs the collaboration of severalorganizations. We had the committed collaboration of the InternacionalCouncil of Ophthalmology (ICO), the American Academy of Ophthalmology(AAO) and the Association of University Professors in Ophthalmology(AUPO), and the Pan-American Council of University Professors inOphthalmology (PACUPO). The course achieved its objectives, thanks to theefforts of everyone involved and the excellent coordination of José AntonioRoca MD and Dr. Karl Golnik MD.

Also participating as instructors in the course were the esteemedBradley R. Straatsma MD, Anthony Arnold MD, Karl Golnik MD, Andrew LeeMD, Peter A. Quiros MD, Juan Cuadros MD, Victor Dulanto MD and GuillermoBarriga MD.

A very special mention needs to be made regarding industry support.On this occasion, Alcon Laboratorios, with discretion and elegance, took careof transportation and housing of the attendees and meanwhile theInternational Council of Ophthalmology offered an educational grant insupport of the instructors. Additional support was given by an educationalgrant by the Pan-American Ophthalmology Foundation.

Because of this course, and with the collaboration of many individualsand organizations, we are continuing to construct a better future forOphthalmology on this continent.

E T

Enrique GrauePresidente de la Asociación Panamericanade Oftalmología.

PRESIDENT’S MESSAGEMENSAJE DEL PRESIDENTE

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Terapia Genética nas Doenças CorneanasLLaauurroo AA.. OOlliivveeiirraa,, MMDDII,, MMaarrkk II.. RRoosseennbbllaatttt,, MMDD,, PPhh..DD..II

I- Doutorando em Oftalmologia - Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP/EPM. Research Fellow na Universidade da Califórnia - Davis.II- Assistant Professor of the Department of Ophthalmology & Vision Science - University of California - Davis.

ma modalidade eficiente de liberação degenes para tecidos vivos é essencial para

terapia e pesquisas genéticas. As técnicas detransferência de genes se diferenciam de a-cordo com certas características dos vetores.

Primeiramente, os vetores podem ounão possuir habilidades para integrar omaterial genético no DNA das células alvo.Isto define se a transferência será estável,caso consigam integrar o material genético,ou se será transitória, caso os mesmos nãosejam capazes de integrá-lo na célula alvo. O segundo fator é o tropismo dos vetorespor células e ou tecidos específicos. Algunspodem infectar apenas células comcapacidade de divisão, enquanto outrospodem infectar tanto células divisoras

como células não divisoras ao mesmotempo. Isto, teoricamente, reflete na expre-ssividade de certos vetores.

Assim sendo, a escolha do vetorbaseia-se na necessidade terapêutica, nacronicidade da doença a ser tratada e nosriscos potenciais associados a uma superexpressão do gene desejado. Por exemplo:em condições crônicas como síndrome deolho seco, desordens metabólicas e infla-mações crônicas, seria interessante umvetor que promovesse uma expressãoestável (com integração de material ge-nético). Por outro lado, processos agudoscomo nas erosões recorrentes ou al-terações pós-operatórias em cirurgiarefrativa, seria interessante um vetor que

INTRODUÇÃOTerapia genética em seres humanos é um dos mais atuais e excitantes campos de

pesquisa abordados pelas áreas médicas e de biologia molecular. Os avanços tecnológicosnesta área podem ser comprovados pelo grande número de ensaios clínicos nas fases I eII para o tratamento de câncer, AIDS, degeneração macular, doenças cardiovasculares eoutras doenças monogênicas. Além de sua utilização no tratamento de inúmeras doenças,a transferência de genes está sendo utilizada no desenvolvimento de vacinas tanto preven-tivas como terapêuticas para hepatite A, B e C, tuberculose e outras doenças.

É uma abordagem que carrega consigo o potencial de curar doenças ou condiçõesmédicas anormais através da reposição de genes defeituosos por outro normal. É umapromessa para tratar tanto doenças adquiridas como hereditárias em todo o organismo.Distingue-se dos métodos convencionais de tratamento por atuar na fisiopatologia dasdoenças a nível molecular, assim proporcionando benefícios terapêuticos a longo prazo edistinguindo-se dos efeitos transitórios proporcionados pela terapia convencional com drogas.

Apesar do seu enorme potencial terapêutico, existem algumas limitações fundamentaiscom esta forma de medicina molecular. Tais limitações precisam ser sanadas antes queesta tecnologia torne-se terapeuticamente aplicável e viável aos pacientes com desordensgenéticas. Os dois principais desafios são: como transferir material genético de maneiraeficiente para as células alvo; e, talvez ainda mais difícil, como fazer este material genéticoexpressar-se ou tornar-se disponível para o hospedeiro.

Vários estudos têm sido desenvolvidos para analisar sistemas de deliberação de genesque facilitem a transferência de material genético para as células alvo, porém ainda não seencontrou a solução mais segura e eficaz para tal problema.

Algumas características da córnea conferem-lhe significante potencial para aplicação detratamento genético nas doenças corneanas. Isto inclui sua relativa simplicidade naestrutura histológica o que permite fácil acesso para manipulação e exame; outro fatorimportante é que ela também permite monitorização visual da deliberação e expressão dosgenes através da utilização de marcadores genéticos fluorescentes (EGFP). Além disto,usufrui de relativo privilégio imunológico na câmara anterior1 e pode ser mantida em culturapor algumas semanas. Fato este que a qualifica como potencial candidata a provedora detransferência "ex vivo" de material genético.

USistemas de deliberação de genes

REVIEW

ABSTRACT

Technological advances in the field of

molecular biology and especially re-

combinant DNA techniques have ena-

bled scientists to develop gene therapy

techniques for the treatment of human

diseases. The potential therapeutic appli-

cations of gene transfer technology are

enormous. The cornea is an excellent

candidate for gene therapy because of

its accessibility and immune-privileged

nature.

Studies examining the feasibility and

optimal methods for vector-mediated

gene transfer to the cornea have been

performed using histochemical and

fluorescent marker genes. These stu-

dies have utilized various viral vectors, such

as adenovirus, adeno-associated virus,

retrovirus, lentivirus, and herpes simplex

virus, as well as non-viral methods to trans-

fer heterologous genes into corneal cells in

vitro, in vivo and ex vivo.

In this review, we will discuss viral

and non-viral approaches of gene deli-

very into the cornea as well as the limi-

tations of these approaches. Additiona-

lly, we will discuss some potential

applications for gene-based interven-

tions which have been analyzed in

specific corneal disorders such as

allograft rejection, corneal wound healing,

and corneal dystrophies using experi-

mental models.

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promovesse uma expressão estável (comintegração de material genético). Por outrolado, processos agudos como nas erosõesrecorrentes ou alterações pós-operatóriasem cirurgia refrativa, seria interessante umvetor que promovesse expressividade ini-cialmente elevada e que diminuísse com otempo (expressividade transitória).

Basicamente os sistemas de delibe-ração de genes podem ser divididos emduas categorias. Existem os métodos queutilizam vírus como vetores e métodosmediados por vetores não virais2-4.

Vetores virais

Os sistemas de vetores virais tem sidodesenvolvidos utilizando-se técnicas derecombinação de DNA que permitem aprodução de elevados títulos de vírus semcondições de replicação. Os genes viraissão expressos por elementos genéticosseparados do gene a ser transferido, ga-rantindo assim um aceitável nível de segu-rança.

Os primeiros vetores virais utilizadosem terapia genética foram os retrovírus, osquais infectam apenas células com capa-cidade de divisão. O gene desejado éinserido no genoma da célula alvo e é ex-presso estavelmente pela célula infectadae por todas as suas células filhas. Osvetores retrovirais não têm habilidade parainfectar células sem capacidade de divisão.A sua segurança é questionável pelo fatode muitos dos vetores estarem intimamenterelacionados a patógenos e também pelofato de promoverem uma integração dematerial genético de forma randomizada, oque aumenta o risco transformação celularmaligna5,6.

A mais nova geração de vetoreslentivirus, os quais são intimamente relacio-nados aos retrovírus, podem infectar tantocélulas divisoras quanto células não divi-soras. Eles também promovem uma trans-ferência genética estável pelo fato de seintegrarem ao genoma hospedeiro. E damesma maneira que os retrovirus impõemriscos de transformação maligna. Atual-mente constitutem a tecnologia viral líder7,8.

Os virus adenovirus-associado tambéminfectam células divisoras e não divisoras,porém com o benefício adicional de seintegrarem ao genoma hospedeiro (expre-ssão estável) em locais específicos. Dife-rentemente dos adenovirus, eles apre-sentam bem menos imunogenicidade. Po-

rém, devido ao tamanho do genoma destesvírus o tamanho do gene terapêutico usadonestes sistemas é bem limitado9.

Já os vetores adenovirais podeminfectar tanto células divisoras quanto nãodivisoras. Eles apresentam uma expressãotransitória, uma vez que os genes transfe-ridos não são integrados no genomahospedeiro10. Além do efeito transitório, ossistemas adenovirais também são limitadospela elevada antigenicidade, o que resultaem uma resposta imunogênica potente ede alta citotoxicidade.

Vetores não-virais

Os sistemas de vetores não viraisutilizam uma variedade de tecnologias paratransferir o DNA para as células alvo.

A principal vantagem sobre os sistemasvirais diz respeito à segurança. Nenhumdestes mecanismos é capaz de promoverreplicação do material genético ou deintegrá-lo de maneira eficiente no genomada célula alvo. Assim sendo, estes siste-mas promovem apenas uma expressãogênica transitória e bem menos eficiente doque os sistemas virais11.

A forma mais simples de transferênciagenética sem utilização de vetores virais écom a aplicação de "naked DNA". EsteDNA é incorporado pelas células e é ex-presso de forma transitória. Acredita-se queisto ocorra tanto por um processo dedifusão como também mediado por recep-tores celulares. Apesar de seu efeitotransitório e da limitada eficiência em trans-ferir material genético, esta metodologiaproporciona o mais alto nível de segurançaem transferência genética dentre todos osoutros métodos12.

Algumas substâncias podem facilitar aentrada das moléculas de DNA nas células.Isto garante maior eficiência na transfe-rência de genes do que simplesmente aaplicação de "naked DNA". Essas subs-tâncias, ainda em investigação, incluem oslipídeos catiônicos e alguns receptores dasuperfície celular. Cada um desses agentesparece ter sua eficácia ligada a específicostipos celulares assim como também à suatoxicidade11.

Além disto, métodos físicos também temsido desenvolvidos e aplicados com o in-tuito de facilitar a entrada de DNA nascélulas alvo. A estimulação por pulsos

elétricos intensos e curtos pode modificar apermeabilidade da membrana celular deforma reversível e assim permitir maiorentrada de moléculas extra-celulares13,14.

Outro método que está sendo utilizadoé a transferência balística15,16. Com este mé-todo, o DNA é misturado com micropartí-culas de ouro e é transferido para o tecidoalvo através de pistolas específicas. Váriosinvestigadores conseguiram inserir DNA noepitélio corneano de coelhos e ratos usan-do esta tecnologia17,18. Esses dois últimosmétodos requerem equipamentos muitocaros e podem causar danos significativosna membrana das células.

Sobrevida do enxerto corneano

Os transplantes de córnea são rea-lizados na sua grande maioria sem apesquisa de compatibilidade de HLA devidoao relativo privilégio imunológico do olho.Apesar disto, a rejeição imunológica conti-nua sendo a principal causa de falência nostransplantes corneanos19.

Sabemos que a rejeição corneanaenvolve a ativação de resposta imunemediada por células T. Sabemos tambémdo importante papel das citoquinassecretadas por células T e por macófagosnesta resposta imunológica. Assim sendo,a inibição de citoquinas pró-inflamatórias(IL-2, INF- , TNF- ) ou aumento na ex-pressão de citoquinas do subtipo Th2 (IL-4ou IL-10) passam a ser alvos atrativos emterapia genética para prevenção da re-jeição corneana.

Rayner et al., usaram adenovírus semcapacidade de replicação para transferirgenes codificados para expressar recep-tores solúveis de TNF em córneas decoelhos cultivadas ex vivo antes do trans-plante20. Apenas moderado aumento nasobrevida dos enxertos foi observado nesteestudo. Acredita-se que a resposta imuno-gênica elicitada pelo adenovírus tenha sidoresponsável por diminuir os efeitos daterapia com anti-TNF- .

Como mencionado acima, a IL-10 é umoutro alvo na terapia genética contra re-jeição corneana. Esta citoquina diminui aexpressão de MHC II e de moléculas co-

Aplicações Potenciais

REVIEW

REVIEW

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estimulatórias nos monócitos, macrófagos,células dendríticas e também inibe asíntese de citoquinas pró-inflamatórias. Emoutro estudo, córneas de ovinos foraminfectadas com adenovírus codificadospara expressar IL-10. Essas córneasdemonstraram um aumento significativo notempo de sobrevida dos enxertos. RNAmde IL-10 pode ser detectado até 21 diasapós a deliberação dos genes21.

Modulação da cicatrizaçãocorneana

A transparência corneana é funda-mentalpara uma boa visão. Situções comoinfecções, traumas físicos ou químicos e atémesmo pós-operatório de cirurgias refrativaspodem causar opacidades cor-neanas econsequentemente diminuir a acuidade visualdos pacientes.

A deposição excessiva de matrizextracelular, a angiogênese e a inflamaçãosão os principais responsáveis pela opaci-dade corneana. Acredita-se que o papelcentral na cicatrização corneana, especial-mente nos eventos relacionados com a geraçãode miofibroblastos e deposição de matrizextracelular, esteja ligado ao fator decrescimento tumoral (TGF- )22,23. Estes mes-mos estudos sugerem que a redução dos níveisde TGF- para as células estromais podereduzir a formação de miofibroblastos e haze.

Sakamoto et al., injetaram adenovírusrecombinantes e codificados para expre-ssarem receptores solúveis de TGF- , viaintra-muscular, em camundongos, antes deprovocar injúria corneana nos mesmos comnitrato de prata24. O edema corneano, neovas-cularização, inflamação e deposi-ção dematriz extracelular nestes animais foimarcadamente reduzido quando compa-radocom o grupo controle que recebeu apenasadenovírus expressando LacZ.

O papel das metaloproteinases namodulação da cicatrização corneana tam-bém está sendo muito estudado como umaoutra opção de abordagem em terapiagenética para modular as opacidadescorneanas cicatriciais.

O controle da cicatrização constitui umalvo bastante especial, uma vez que a mo-dulação da cicatrização corneana pode sernecessária por um período curto de tempo,como dias ou semanas.

Distrofias corneanas

Infelizmente não dispomos de modelosanimais apropriados para estudarmos as

distrofias corneanas, o que limita o desen-volvimento de novas estratégias de trata-mento para estas desordens. Entretanto,novos conceitos sobre a fisiopatologia dasdistrofias corneanas têm surgido com osavanços alcançados em biologia molecularnos últimos anos.

Algumas mutações nos genes BIH3 eGelsolin já foram identificadas em pacien-tes com distrofia corneana granular, lattice,avellino e Reis-Bucklers25,26. Deste modo, aterapia genética pode ser uma arma degrande valia no desenvolvimento de mo-delos in vivo que simulem as mesmas con-dições médicas das distrofias corneanas. Apartir deste ponto, poderemos investigar afisiopatologia destas desordens genéticas edesenvolvermos novas abordagens tera-pêuticas para as mesmas.

Inúmeros estudos sobre transferênciade genes identificam a córnea como umapromessa potencial para aplicação de tera-pia genética. Estes estudos demonstram quetanto os métodos virais como os não viraispodem deliberar genes marcadores ou biolo-gicamente ativos a todas as camadas dacórnea. Quando comparados com os mé-todos não virais, os vetores virais sãocapazes de deliberar genes com maioreficiência e de expressá-los por maiorperíodo de tempo. Porém, estes métodosainda impõem riscos à saúde dos pacientes.

Os adenovírus conseguem transferirgenes com muita eficiência, porém com ex-pressividade muito curta. Além disto, sãobastante imunogênicos.

Os virus adenovirus-associado não sãotão patogênicos e possuem baixa imuno-genicidade. Entretanto, tem limitações rela-tivas ao tamanho da carga genética quepodem transferir.

Os retrovírus são preferidos emrelação aos outros vetores virais por suarelativa segurança e por sua elevada efi-ciência em transferir genes. Porém, suaincompetência em infectar células nãodivisoras limita bastante a sua utilização nacórnea. Particularmente, quando estamosdiante de patologias estromais e endote-liais. Já os lentivírus, estes mantém amesma eficiência dos retrovírus em trans-ferir genes, porém com habilidade de infectarcélulas não divisoras. Por esta razão, estesvetores podem se tornar os métodos deescolha para deliberação de genes terapêu-ticos para os ceratócitos e para as células

endoteliais. Mas muitas indagações aindapersistem sobre a segurança do seu uso,uma vez que promovem uma integração nãoespecífica no cromossoma das células alvo.

Sobre os métodos não virais, estesdefinitivamente são mais seguros e não pato-gênicos. Porém, são os menos eficientes emtransferir genes. Mesmo assim, ainda podemser úteis em situações especiais onde sedeseja uma expressão gênica transitória comonos processos de cicatrização corneana.

Mesmo cientes de todas as ressalvasrelativas às limitações dos vetores utiliza-dos hoje em dia, muito progresso já podeser visto na modificação genética do epi-télio, endotélio e ceratócitos com a aplica-ção destes modelos.

Apesar destes notáveis avanços, temosmuito a aprimorar nestes sistemas existentesou mesmo desenvolver novas técnicas deterapia genética antes que estas abordagenssejam colocadas em prática e aplicadas emensaios clínicos humanos.

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R E F E R E N C E S :

Conclusão

PAN-AMERICA

INTRODUCCION

La blefaritis es una enfermedad crónicamuy frecuente de la superficie ocular queimplica una gran variedad de procesos infla-matorios palpebrales y presenta un amplioespectro de manifestaciones clínicas. Debi-do a esta alta frecuencia y cronicidad es unmotivo muy frecuente de consulta oftalmoló-gica y es, a menudo, frustrante para el pa-ciente y el oftalmólogo.

En la actualidad, la blefaritis sigue siendouna enfermedad crónica sin curación. Noobstante, con la instauración de un trata-miento adecuado e individualizado puedeconseguirse el control y el alivio de lossíntomas, así como la prevención de com-plicaciones asociadas a la blefaritis, comoel desarrollo de queratopatías punteadassuperficiales, orzuelos, chalación, infiltra-dos corneales marginales, neovasculariza-ción corneal y especialmente cuadros deojo seco evaporativo por inestabilidad delfilm lagrimal precorneal. No debemos tam-poco obviar la existencia de blefaritis enpacientes que van a ser intervenidos decataratas, puesto que los gérmenes im-plicados en las endoftalmitis postoperatoriason los de la flora palpebral del propio pa-ciente, y en estos casos debe instaurarseun tratamiento preoperatorio intensivo paramejorar las condiciones de la superficiepalpebral y reducir la colonización bacteria-na de la misma.

Para realizar una correcta aproximacióndiagnóstica y terapéutica en esta patología,es esencial clasificar la blefaritis según lalocalización anatómica de la misma.

ClasificaciónSe han propuesto varias clasificaciones

de la blefaritis. Thygesson las dividió en esta-filocócicas, seborreicas y mixtas, McCulleypropuso una exhaustiva clasificación en 6grupos clínicos, aunque la clasificación másempleada en la actualidad por su mayorutilidad práctica es la basada en la deWilhelmus (tabla 1) que diferencia dos sub-tipos principales según la afectación delmargen palpebral anterior que engloba la

piel, folículos de las pestañas y músculoorbicular ó del margen palpebral posteriorque contiene el tarso, conjuntiva tarsal, asícomo las glándulas meibomianas y acce-sorias. Un tercer subtipo menos frecuenteen esta clasificación es la blefaritis angular,que afecta la piel y el margen palpebralúnicamente en los cantos interno o externoy que se cree asociada a una infecciónsubyacente por Moraxella sp.

Clínica

Los síntomas de presentación en líneasgenerales consisten en escozor y picor.Otros síntomas referidos incluyen irritación,hinchazón palpebral y sensación de cuerpoextraño, a menudo más acentuados por lasmañanas. Únicamente con los síntomas esdifícil diferenciar entre los subtipos de ble-faritis anterior ó posterior.

La exploración biomicroscópica es clavepara localizar el área de inflamación. Lossignos de afectación del margen anterior sonescamas y costras en la base de las pestañas,hiperemia y telangiectasias en margen palpe-bral, triquiasis y madarosis (fig. 1).

La blefaritis posterior, por su parte, essecundaria a alteraciones en la produccióny excreción de los lípidos que intervienenen la composición de la película lagrimal; yestá, por tanto, asociada a una disfunciónde las glándulas de meibomio (DGM). Lasecreción de estas glándulas debe serclara y fácilmente exprimible con una ligerapresión sobre el margen palpebral. La ex-ploración biomicroscópica en la blefaritisdel margen posterior revela unos orificiosglandulares dilatados, rellenos de una se-creción amarillenta y turbia, difícilmenteexprimible (fig. 2). Pueden existir también

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Higiene Palpebral en el Tratamiento de la Blefaritis

DDaavviidd DDííaazz VVaallllee MMDD,,Facultativo Especialista de Area de Oftalmología. Unidad de Superficie e Inflamación Ocular del Hospital ClínicoSan Carlos (Madrid, España).

JJoosséé MMaannuueell BBeenníítteezz--DDeell--CCaassttiilllloo SSáánncchheezz,, MMDD,,Profesor Titular de Oftalmología (Catedrático habilitado) en la Universidad Complutense de Madrid (España).Jefe de Sección de la Unidad de Superficie e Inflamación Ocular del Hospital Clínico San Carlos (Madrid, España).

Localización

BLEFARITIS

ANTERIOR

Escamas-costras en la base de las

pestañas. Telangiectasias en el

margen palpebral.

Triquiasis. Madarosis.

Limpieza palpebral con

preparados comerciales o

champú infantil diluido.

Antibióticos tópicos en casos

severos.

Lágrimas artificiales si ojo seco

asociado.

Esteroides tópicos si reacción

inmune.

BLEFARITIS

POSTERIOR

Dilatación y distorsión de los

orificios glandulares. Secreciones

espesas y turbias difícilmente

exprimibles.

Compresas calientes

+ masaje.

Tetraciclinas ó Doxiciclina VO.

Lágrimas artificiales

Hallazgos Opción principal

tratamiento

Otras opciones

Tabla I.Clasificación y opciones de tratamiento

Figura 1. Blefaritis anterior:Escamo-costras en la base de las pestañase hiperemia del borde palpebral.

Figura 2. Blefaritis posterior:Dilatación de los orificios glandulares yacúmulo de secreción turbia.

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formas mixtas con hallazgos de blefaritisanterior y posterior asociados (fig. 3).

Existen dos enfermedades dermatoló-gicas que pueden asociarse a la blefaritis,como son el acné rosácea y la dermatitisseborreica y deben tenerse en cuenta paraestablecer un tratamiento integral del pa-ciente, así como un pronóstico en cuanto asu evolución. El acné rosacea es una enfer-medad dermatológica crónica asociada a laDGM en la que suele afectarse la cara y laparte superior del tronco. Aparece más fre-cuentemente en pacientes de 30-50 años,sobre todo en mujeres. A nivel palpebral,cursa con episodios de exacerbaciones yremisiones y suele manifestarse como unablefaritis posterior, con abundantes telan-giectasias palpebrales y engrosamiento ydisfunción de las glándulas meibomianas.

La dermatitis seborreica, por otra parte,se presenta con un cuadro mixto de blefa-ritis anterior y posterior, predominando elcomponente anterior, con escamas grasasy muy adheridas en la base de las pesta-ñas. La inflamación alrededor de los párpa-dos suele tener un aspecto grasoso. Puedeexistir un eritema con escamas y costras anivel del cuero cabelludo, frente y cejas.

Abordaje TerapéuticoSe trata de una enfermedad frustrante

para el paciente por la cronicidad de la mis-ma y por la ausencia de un tratamientocurativo. Debe establecerse un algoritmoterapéutico específico y racional, así comoconocer exactamente qué enfermedadvamos a tratar, evitando el término incon-cluso de "blefaritis". En este sentido, lacomunicación con el paciente es clave. Elpaciente debe comprender la naturaleza dela enfermedad e implicarse en el tratamien-to. Debe explicarse que, si bien la curaciónno es posible, sí lo es el alivio de los sín-tomas. Asimismo, los pacientes con rosá-cea deben conocer que en ellos la enferme-dad seguirá un curso natural más severocon frecuentes exacerbaciones y remisiones.

Opciones de tratamiento

En la tabla I se indican las opciones detratamiento recomendadas para los tiposclínicos de blefaritis más frecuentes.a. Blefaritis anterior

El tratamiento de elección es multifactorial,incluyendo higiene palpebral, antibióticostópicos, lágrimas artificiales y en casos se-

leccionados esteroides tópicos cuandoexiste una reacción de hipersensibilidad a-sociada con infiltrados inflamatorios margi-nales corneales. El elemento básico, encualquier caso, es la higiene palpebral.

Higiene Palpebral

Puede realizarse con los preparadoscomerciales disponibles, o bien empleandoun champú infantil de pH neutro que debediluirse en cuatro partes con agua templa-da. Para aplicarlo, puede empaparse unagasa en la solución y efectuar una limpiezavigorosa del margen palpebral superior einferior con los párpados cerrados. Tambiénpuede emplearse un bastoncillo de oidosempapado en la solución para realizar unaexpresión mecánica del margen palpebralinferior (fig. 4). En general, se recomiendaevitar el uso del bastoncillo en pacientes deedad más avanzada y en pacientes conantecedentes de cirugía intraocular paraevitar el riesgo de un excesivo o inadecua-do frotamiento sobre la superficie ocular.Posteriormente deben lavarse los párpadoscon agua caliente para eliminar los restosdel producto empleado. Esta operacióndebe repetirse dos ó tres veces al día. Elobjetivo del tratamiento es eliminar lasescamas y costras irritantes de las pesta-ñas así como eliminar o reducir la cargabacteriana de la superficie palpebral, y me-jorar el flujo sanguíneo palpebral. La instila-ción de lágrimas artificiales sin conservan-tes inmediatamente después de la limpiezapalpebral mejora el disconfort que produceel frotamiento mecánico de la superficiepalpebral. Se han realizado estudios com-parativos evaluando aspectos clínicos ybiomicroscópicos analizando preparadoscomerciales para el tratamiento de la ble-faritis frente al champú infantil diluido sinencontrar diferencias significativas en cuantoa los dos métodos de limpieza palpebral.

Otros tratamientos

coadyuvantes

El empleo de antibióticos tópicos comoeritromicina, bacitracina ó acido fusídicocon actividad anti-estafilocócica puede sereficaz durante los periodos de exacerba-ción y pueden incluso emplearse duranteperiodos prolongados. Pueden emplearseasimismo cursos cortos de esteroidestópicos en fases de mayor inflamación ycuando se asocian infiltrados marginalescorneales que se atribuyen a reacciones de

hipersensibilidad local frente a tóxinas esta-filocócicas y reconocen, por tanto, un ori-gen inmune. En cualquier caso, y al trata-rse de un proceso crónico, los esteroidesdeben usarse con precaución, periodos detiempo corto y usar esteroides de escasapenetración y potencia, tipo fluorometolona.Es también muy importante asociar lágri-mas artificiales para el tratamiento del ojoseco secundario asociado, frecuentementede tipo evaporativo, puesto que las formasde blefaritis posterior y mixtas presentan unfilm lagrimal inestable debido a una inade-cuada cantidad y calidad de los lípidospresentes en la lágrima.b. Blefaritis posterior.

En este subtipo de blefaritis, la opciónterapéutica principal es la aplicación decompresas calientes.

Compresas Calientes y Masaje

Palpebral

Los pacientes deben empapar un pañofacial o una gasa en agua caliente y apli-carla sobre los párpados cerrados durante5-10 minutos. Este tratamiento debe repe-tirse dos ó tres veces al día, dependiendode la severidad de los síntomas. El paño nodebe estar excesivamente caliente, lo sufi-ciente para ser soportado en las manos sinquemarse y debe ser recalentado si seenfría. Las compresas calientes consiguenderretir las secreciones sebáceas y favore-cen el drenaje glandular. Una vez aplicadoel calor, debe realizarse un masaje palpe-bral dirigido a facilitar la expresión del con-tenido glandular licuado gracias al calorpreviamente administrado. Las propias com-presas pueden emplearse para realizar estaexpresión glandular mediante un masajerotatorio o bien una expresión dirigida haciael borde libre.

Todo este proceso tiene una duraciónde 5-10 minutos y debe insistirse en esta-blecer una rutina diaria de tratamiento. Esmás efectiva realizarla por la mañanapuesto que durante el sueño se acumulanabundantes detritus sobre la superficieglandular que de esta forma son elimina-dos. La expresión manual del contenido delas glándulas de meibomio mejora la com-posición y el grosor de la capa lipídica delfilm lagrimal y produce un evidente aliviosintomático.

Otros tratamientos

La administración de tetraciclinas por vía

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sistémica ha mostrado un efecto favorable enpacientes con blefaritis posterior y acné rosá-cea. Esta acción beneficiosa de las tetraci-clinas se cree relacionada con la inhibición delas lipasas bacterianas lo cual mejora la cali-dad de los lípidos producidos por las glán-dulas de meibomio. Además tiene propieda-des anticolagenolíticas y antiinflamatorias queayudan a eliminar las grasas solidificadas y laqueratinización existente en la superficieglandular, favoreciendo el drenaje de las mis-mas. La doxiciclina tiene un efecto similar ytiene una dosificación más cómoda y es me-jor tolerada. Las pacientes en tratamiento condoxiciclina ó tetraciclina no deben quedarseembarazadas, y deben ser avisados de efec-tos secundarios potenciales como la posibili-dad de presentar molestias gastrointestinales,hipersensibilidad solar ó infecciones vagina-les micóticas. La dosis habitual es de 200mg/día de doxiciclina en dos dosis, durante 2semanas y 100 mg/día de mantenimiento du-rante varios meses. El efecto favorable tardaaproximadamente un mes en observarse, ylos pacientes no deben suspender el trata-miento si tras unos pocos días no observanuna mejoría evidente.

Deben tratarse los síntomas causadospor la sequedad ocular asociada, con lágri-mas artificiales e incluso oclusión de los pun-tos lagrimales en casos más severos. El tipode lágrima se seleccionará según los severi-dad de los síntomas y la periodicidad nece-saria para el alivio de los mismos, reserván-dose las lágrimas sin conservantes para ojossecos severos en pacientes que necesitaninstilaciones muy frecuentes.

Se está investigando si el tratamiento conácidos grasos omega 6 pudiera ser efectivo enrecomponer la composición seborreica normal.

Por otra parte, deben considerarse otrasanomalías palpebrales asociadas que pue-den agravar el problema de la blefaritis, comoun pobre reflejo palpebral, hiperlaxitud pal-pebral, lagoftalmos, queratopatía por exposi-ción y floppy eyelid syndrome. Asimismo, encasos seleccionados y de evolución atípica óunilaterales no debe olvidarse que puedenexistir cuadros que enmascaran blefaritis yque pueden suponer enfermedades poten-cialmente letales como carcinomas de glán-dulas sebáceas, carcinomas epidermoidesatípicos, carcinomas basocelulares ó inclusoformas de lupus eritematoso discoide crónico.

En la tabla II se recogen algunos con-sejos para un mejor tratamiento y segui-miento de los pacientes con blefaritis.

Figura 3. Blefaritis Mixta:Hiperemia del margen palpebral y escamas enlas pestañas.

Figura 4.Técnica de aplicación de la limpieza palpebral,que debe ser vigorosa con el fin de eliminartodas las costras adheridas y reducir la cargabacteriana de la superficie palpebral. Debeexplicarse al paciente y asegurar que se hacomprendido puesto que es el elemento principaldel tratamiento.

Tabla II.Once consejos para un mejor tratamiento de la blefaritis.

11.. Buscar signos de acné rosácea. Dilatación y distorsión de los orificios glandulares.

Secreciones espesas y turbias difícilmente exprimibles.

33.. Especificar claramente el tratamiento. Evitar recomendaciones imprecisas como "higiene palpebral" ó "paños

calientes".

44.. La blefaritis puede asociarse ó producir

un ojo seco.

El uso de lágrimas artificiales suele ayudar.

55.. Una buena comunicación y la educación

del paciente son la clave del tratamiento.

El paciente debe comprender la naturaleza de su problema y la ausencia

de curación del mismo. Debe además conocer que es extremadamente raro

perder visión debido a la blefaritis, así como que existen muchas opciones

de tratamiento para mantenerlo confortable y libre de síntomas.

66.. Un folleto informativo puede ayudar en

pacientes de nuevo diagnóstico.

En cualquier caso, la comunicación directa y explícita es la mejor.

77.. La blefaritis angular es un subtipo poco

frecuente.

Esta entidad, causada por Moraxella sp, debe ser tratada con antibióticos

tópicos e higiene palpebral.

88.. Muchos pacientes presentan formas

mixtas anteriores y posteriores.

Deben asociarse en estos casos, además de otras medidas coadyuvantes, el

calor local y la higiene de los párpados según las técnicas descritas con

anterioridad.

99.. La blefaritis no debe ser ignorada en

presencia de otros problemas oculares.

La blefaritis debe ser tratada convenientemente antes de realizar cualquier

procedimiento quirúrgico intraocular para minimizar el riesgo de

endoftalmitis postoperatorias.

1100.. Buscar otros problemas palpebrales

asociados y tratarlos

Pueden asociarse alteraciones palpebrales como triquiasis, entropión

y ectropion.

1111.. No olvidar que una blefaritis crónica y

refractaria puede enmascarar cuadros

más graves

Si la blefaritis es unilateral, refractaria y asocia ulceraciones del borde libre

puede realizarse una biopsia para descartar un carcinoma de glándulas

sebáceas.

22.. Considerar tetraciclinas VO

en pacientes con acné rosácea

o DGM severa.

En estas formas más severas es recomendable usar Doxiciclina 100 mg/12h

durante 15 días y 100 mg/día durante meses. Los efectos secundarios

potenciales del fármaco son molestias gastroinetstinales, fotosensibilidad

solar e infecciones micóticas vaginales. No usar durante el embarazo.

1.Thygeson P. Etiology and treatment of blepharitis: a study in military personnel. Arch Ophthalmol 1946; 36:445-447.2.McCulley JP, Dougherty JM, Deneau DG. Classification of chronic blepharitis. Ophthalmology 1982; 89: 1173-1180.3.Wilhelmus KR. Inflammatory disorders of the eyelid margin and eye lashes. Ophthalmol Clin North America 1992; 5: 187-194.4.Driver PJ, Lemp MA. Meibomian gland disfunction. Survey of Ophthalmol 1996; 40: 343-367.5.Cady RS, Harrison DA. Management of blepharitis: A step-by-step approach. Comp Ophthalmol Update 2001;2: 39-44.6.Harrison DA, Lawlor D. Experiences in treating patients for blepharitis. Arch Ophthalmol 1998;116: 1133-1134.7.Blepharitis and dry eye in the adult. Preferred Practice Pattern. American Academy of Ophthalmology 1991.8.Key JE. A comparative study of eyelid cleaning regimens in chronic blepharitis. CLAO J 1996; 22: 209-212.9.Dougherty JM, McCulley JP, Silvany RE, Meyer DR. The role of tetracycline in chronic blepharitis. Inhibition of lipase production in staphylococci. Invest

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B I B L I O G R A F Í A

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Current Role of Anti-VEGF Therapy in the Managementof Choroidal Neovascularization JJ.. FFeerrnnaannddoo AArréévvaalloo,, MMDD FFAACCSS,, RReeiinnaallddoo AA.. GGaarrccííaa,, MMDD,, JJuuaann GG.. SSáánncchheezz,, MMDDFrom the Retina and Vitreous Service, Clinica Oftalmológica Centro Caracas, Caracas, Venezuela.The authors have no proprietary or financial interest in any products or techniques described in this article.Supported in part by the Fundacion Arevalo-Coutinho para la Investigacion en Oftalmología (FACO), Caracas, Venezuela.Correspondence: J. Fernando Arévalo, MD FACS, Clinica Oftalmologica Centro Caracas, Edif. Centro Caracas PH-1, Av. Panteon, San Bernardino. Caracas 1010, Venezuela. Phone: (58-212)576-8687. Fax: (58-212) 576-8815. E-mail address: [email protected]

Vascular endothelial growthfactor (VEGF)

Vascular endothelial growth factor(VEGF) was originally described in highlyvascularized tumors where its expression isincreased by hypoxia.3-6 Vascular endothe-lial growth factor is a homodimeric glycosy-lated protein that exists in five isoforms of121, 145, 165, 189, and 206 amino acidsand VEGF form a family of related growthfactors with structural homology to platelet-derived growth factor (PDGF).7 Vascularendothelial growth factor is an endothelianmitogen,8 angiogenic protein5,6,8 and potentvasopermeability factor9,10 that mediates itseffects through the endothelial cell-specific,high-affinity, cell surface transmembranereceptors forms-like tyrosine kinasa (Flt),and fetal liver kinase 1 (Flk-1).8,11-13 Vascularendothelial growth factor possesses asignal sequence and is secreted from intactcells.14,15 Is increased by hypoxia in retinalpigment epithelial cells, retinal endothelialcells, retinal pericytes,13,16,17 and Müllercells.18 Retinal endothelial cells possess nu-merous high affinity VEGF receptors,11,13

however there are other substances withangiogenic activity19

Anti-Vascular EndothelialGrowth Factor (Anti-VEGF)

There are two intraocular anti-VEGFdrugs presently under investigation and oneof them has already been approved by theUS Food and Drug Administration (FDA).One is the antibody fragment (Lucentis,Ranibizumab; Genentech Inc., San Fran-cisco, CA), and the other is pegylatedaptamer (Macugen, Pegaptanib; EyetechPharmaceuticals Inc., New York, NY).Ranibizumab is a recombinant antibodythat consists of 2 parts: a nonbinding hu-man sequence, which makes it less anti-genic in primates, and a high affinity bindingepitope derived from the mouse, which ser-ves to bind the antigen. Its molecular weight

of 48 kd makes it a much smaller moleculeand has been shown to penetrate the inter-nal limiting membrane and access thesubretinal space in animal models wheninjected intravitreously. The anti-VEGF pe-gylated aptamer pegaptanib is a polye-thylene glycol (PEG) conjugated oligo-nucleotide that binds to the major solublehuman VEGF isoform, VEGF165, with highspecificity and affinity. Pegaptanib is anaptamer composed of 28 nucleotide bases,and was produced and screened for itsability to bind and inactivate VEGF in amanner similar to that of a high affinity anti-body directs towards VEGF. Whereas, therecombinant rhuFab anti-VEGF antibodies(ranibizumab) that are currently availableare only partially and are therefore poten-tially able to elicit a human anti-mouseimmune response, aptamers are not immu-nogenic.

Basic Principles ofthe Potential Action ofAnti-VEGF Therapy

Anti-VEGF therapy is based on twoproperties, one is its anti-angiogenic effect,which is well known, and the other is itsanti-permeability effect. The scientific basicprinciples of the potential action of anti-VEGF therapy in choroidal neovascula-rization is given by the following studies:

1) Kvanta et al20 reported that surgicallyremoved subfoveal fibrovascular membra-nes in age-related macular degenerationexpress vascular endothelial growth factor.

2) Lutty et al21 studied the distribution andrelative levels of VEGF in the nondiabeticand preproliferative diabetic human retinaand choroid.

3) Tolentino et al22 showed on the primateretina that VEGF is sufficient to producemany of the vascular abnormalities com-mon to diabetic retinopathy and otherischemic retinopathies.

ABSTRACT

The results of preclinical and finished

clinical trials revealed the efficacy of anti-

vascular endothelial growth factor (anti-

VEGF) therapy as antiangiogenic and

antipermeability agents. The safety of

single-dose intravitreal injections of di-

fferent dosages has been established.

Macugen has been the first approved

anti-VEGF drug in the United States since

December 2004 for the treatment of neo-

vascular AMD. The results of the ongoing

ranibizumab (Lucentis) trials that are

currently running will need to compare to

that observed with pegaptanib in similarly

designed phase trials. In addition, the

preliminary data from the bevacizumab

SANA study and intravitreal bevacizumab

(Avastin) are promising. We are looking

forward to the results of the Phase III

randomized trials. Probably, the combi-

nation of anti-VEGF compounds with

photodynamic therapy or intravitreal

steroids may be the future management

of choroidal neovascularization.

This article will review the current role

of anti-VEGF therapy in the management

of choroidal neovascularization.

INTRODUCTION

Exudative age related macular dege-

neration (AMD) is the most common

cause of irreversible severe vision loss

in the elderly.1,2 There is currently no

effective therapy for the management of

exudative AMD or choroidal neovascu-

larization of other etiologies in most pa-

tients. Currently, there are several drugs

under investigation with clinical human

studies for CNV treatment in AMD. Two

of the most important types are the anti-

vascular endothelial growth factor (anti-

VEGF) and the angiostatic steroids. This

article will discuss the role of intra-

vitreal anti-VEGF therapy in the ma-

nagement of choroidal neovasculari-

zation.

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4) Adamis et al23 produced retinal ischemiawith laser retinal vein occlusion in 16 eyesof eight animals (Macaca fascicularis). Zeroof eight eyes receiving the neutralizing anti-VEGF antibodies developed iris neovascu-larization and five of eight control antibody-treated eyes developed iris neovasculariza-tion. The authors concluded that inhibitionof VEGF is a new potential therapeuticstrategy for the treatment of ocular neovas-cularization.

Anti-VEGF TherapyPublished Studies

Ranibizumab, Preclinical studies

The phase I and phase II studies spon-sored by Genentech evaluated the safetyand efficacy of intravitreal injections of anantigen-binding fragment of a recombinanthumanized monoclonal antibody directedtoward vascular endothelial growth factor(ranibizumab) in a monkey model of CNV.The study concluded that intravitrealranibizumab injections prevented formationof clinically significant CNV in cynomolgusmonkeys and decreased leakage of alrea-dy formed CNV with no significant toxiceffects. The clinical relevance of the studyis that it provides the non-clinical proof ofprinciple for ongoing clinical studies ofintravitreally-injected ranibizumab in pa-tients with neovascular age-related maculardegeneration.24

Anti-VEGF aptamer,preclinical studies.

The cutaneous vascular permeabilityassay (Miles assay), the corneal angioge-nesis assay, the retinopathy of prematuritystudy and the human tumor xenografsstudy showed that leakage, angiogenesis inthe cornea, retinal neovascularization, andtumor growth can be inhibited withpegaptanib.25 Then, intravitreal pharmaco-kinetics of pegaptanib in New Zealandwhite rabbits showed that the estimatedterminal half life was 83 hours, similar to the94 hour half life observed in rhesus mon-keys.26 At 4 weeks after administration ofpegaptanib, drug levels in the vitreoushumor remained well above the KD for

VEGF suggesting that once monthly dosingin humans is appropriate. In contrast, plas-ma concentrations were significantly lowerand ranged from 0.092 to 0.005 µg/mL fromday 1 to day 21.

Clinical studiesand Pegaptanib

Clinical Trial Phase 1

The clinical trial phase 1 was a multi-center, open label, dose-escalating study ofa single intravitreous injection of pegap-tanib in patients with subfoveal CNVsecondary to AMD. Phase 1A clinical studyshowed that single intravitreal doses of theanti-VEGF aptamer could be administeredsafely up to 3 mg/eye. No significant ocularor systemic side effects were noted. At 3months after intravitreal administration ofthe pegaptanib, 80% of eyes showedstabilized or improved vision, with 26.7%showing an increase in three or more lineson the ETDRS chart. In phase 1B study,patients were treated with pegaptanib plusphotodynamic therapy. Sixty percent of thepatients showed an increase of three omore lines on the ETDRS chart, and only40% of cases needed photodynamic re-treatment.25

Clinical Trial Phase II

Phase II study results revealed that87.5% of patients who received pegaptanibalone given every 6 weeks were well toler-ted and stabilized or improved vision 3months after treatment and that 25% ofeyes demonstrated a 3 line or greater im-provement in vision on the ETDRS charts. A60% 3 lines gain at 3 months was noted inpatients who received both the anti-VEGFaptamer and photodynamic therapy (Fig. 1).27

Clinical Trial Phase III

Showed that pegaptanib sodium withcontinuous use of 0.3 mg was efficacious inthe treatment of neovascular AMD after 1year regardless of the angiographic subty-pe, baseline vision or lesion size.28 The pri-mary end point was the proportion ofpatients who had lost fewer than 15 lettersof visual acuity at 54 weeks.The 1-mg and

3-mg dosages did not exhibit additionalbenefit. In the combined analysis, benefitsfor pegaptanib were seen as early as 6weeks after initiation of therapy and conti-nued through 54 weeks. At week 54, therewas a 47% relative difference in mean VAloss between pegaptanib and sham (7.93vs. 15.05 letters; p < 0.05), and maintainedor gained vision (33% vs. 23%; p = 0.003).Severe vision loss occurred in only 10% ofpatients in the pegaptanib arm comparedwith 22% of the patients in the sham arm (p< 0.001). A smaller proportion of patients inthe pegaptanib arm than in the sham armhad a VA of 20/200 or worse in the studyeye at week 54 (38% vs. 56%; p < 0.001).Among the adverse events that occurred,endophthalmitis (in 1.3 percent of patients),traumatic injury to the lens (in 0.7 percent),and retinal detachment (in 0.6% percent)were the most serious. These events wereassociated with a severe loss of visualacuity in 0.1 percent of patients.

VISION study (VEGFInhibition Study in OcularNeovascularization)

Results of the second year of Macugen(pegaptanib) for the treatment of neovas-cular AMD showed that over two years, themean number of treatments for all subjectsre-randomized to therapy was 15.7 of apossible 17 injections (92%).

Figure 1.(Arevalo et al).A. This patient withsubfoveal CNV (A) wastreated with bothphotodynamic therapy(PDT) and threemonthly injections ofthe anti-vascularendothelial growthfactor aptamer. Thepatient's visionimproved by 5 EarlyTreatment of DiabeticRetinopathy Studylines (20/250 to 20/80)with markedlydecreased exudationclinically severalmonths after initiatingtherapy (B). Repeat PDT was not performed at 3 monthsper the decision of the investigator (Reprinted from EyetechStudy Group. Anti-vascular Endothelial Growth Factor forSubfoveal Choroidal Neovascularization Secondary to Age-related Macular Degeneration. Phase II Study Results.Ophthalmology 2003;110:979-86 with permission fromAmerican Academy of Ophthalmology).

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Patients treated with Macugen 0.3 mg for asecond year showed a mean loss of 9.4letters of vision, compared to a loss of 17.0letters for sham. Fewer subjects who con-tinued a second year of Macugen 0.3 mglost 3 lines or more vision: 59% of the 0.3mg arm (78/133) lost < 15 letters versus45% (48/107) of subjects receiving sham(P< 0.05). When comparing subjectsreceiving one vs 2 years of Macugen, thesecond year of therapy afforded additionalprotection from vision loss. Sixty seven per-cent more occurrences of a 3 line loss ofvision were noted in patients receiving 1year of therapy compared to those recei-ving 2 years of therapy (35 occurrences inthe 1-year group versus 21 occurrences inthe 2 year group; P 0.05). They concludedthat no serious adverse events occurred,and no events directly related to the studydrug were identified. The risk of endoph-thalmitis, with attention to injection techni-que, was modifiable. There were no reportsof endophthalmitis or traumatic cataractoccurring within year two.29,30

Clinical studiesand Ranibizumab

Clinical Trial Phase I

Heier and Puliafito et al 31 reportedpositive preliminary data from a Phase Ib/IIrandomized, single-agent study with theinvestigational anti-VEGF product, rhuFabV2 (Lucentis, ranibizumab), for patientswith the wet form of AMD. Sixty-fourpatients were enrolled. Patients weretreated in one eye every four weeks for fourdoses (either 300 or 500 micrograms) ofrhuFab V2 (n=53) or were treated withstandard of care (no rhuFab V2) (n=11).Three different groups of subjects wereenrolled in the study based on diseasepattern and prior treatment: minimallyclassic, predominantly classic, and patientspreviously treated with photodynamictherapy. Of the 53 patients treated withrhuFab V2, 50 patients (94 percent) hadstable or improved vision, of which 14 pa-tients (26%) improved 15 letters or more onthe ETDRS chart, and 36 patients (68%)had stable vision at day 98. Stable vision isdefined as losing or gaining less than 15letters on the ETDRS chart. On average,patients treated with rhuFab V2 gained 9.0letters at day 98 compared to patientstreated with standard of care who lost 4.9

letters. The most common side effects fromtreatment with rhuFab V2 injection weremild transient, reversible inflammation.Heier et al.31 reported their findings at 6months follow up. Its effect on visual acuityin this trial was similar in magnitude to thatobserved with pegaptanib in a similaritydesigned phase II trial.27

Clinical Trial Phase I/II

The FOCUS (RhuFab V2 Ocular Treat-ment Combining the Use of Visudyne™ toEvaluate Safety) trial is a Phase I/IIrandomized, single-masked study eva-luating the safety, tolerability and efficacy ofLucentis in combination with PDT in 162patients with predominantly classic subfo-veal wet AMD. In this study, 162 patientswith predominantly classic subfoveal wetAMD were randomized 2:1 to receive PDTfollowed by either 0.5 mg injections ofLucentis or sham injections for 23 months.All patients received initial treatment withPDT but were only retreated at the treatingphysician's discretion based on the Visu-dyne package insert. At 12 months, patientstreated with Lucentis and PDT gained anaverage of five letters in visual acuity com-pared to study entry, while those in thecontrol group lost an average of eightletters.32 Overall, 90.5% of combinationpatients in the FOCUS trial lost less than 15letters of vision, compared with 68% withPDT alone. Twenty-four percent (25/105) ofpatients treated with Lucentis in combina-tion with PDT versus 5 percent (3/56) ofpatients treated with PDT alone improvedvision by 15 letters or more compared tostudy entry. At 3 months, only 16% ofcombination patients required additionalPDT compared with 80% in the PDT-alonearm. At month 12, there was an astoundingreduction of a mean of only 0.3 additionalPDT treatments required in the combinationarm to 2.4 PDT treatments in the PDT-armalone.32 An analysis of the one-year datashowed that there was an increased risk ofuveitis in patients treated with Lucentis incombination with PDT compared to patientstreated with PDT alone. An amendment tothe study protocol was made and then,intravitreal therapy was held for 1 monthafter PDT was administered. Twelve pa-tients developed severe uveitis when com-bination treatment occurred within the samemonth, and no uveitis occurred subsequentto protocol modification. After uveitis,

endophthalmitis was the second mostcommon ocular serious adverse eventoccurring in patients treated with Lucentis.Among non-ocular serious adverse events,the frequency of cerebral vascular eventswas higher in those treated with Lucentis,while the frequency of myocardial infarc-tions was higher in the PDT-alone arm. Inboth cases, the difference between groupswas not statistically significant. Severevision loss (defined as a loss of 30 letters ormore) was uncommon (1/105) among thosetreated with Lucentis and PDT comparedwith 9 percent (5/56) for those treated withPDT alone.

Clinical Trial Phase III

MARINA studyMinimally classic/occult trial of the Anti-

VEGF antibody Ranibizumab (formerly,RhuFab) In the treatment of NeovascularAMD (MARINA) is a Phase III study of 716patients in the United States with minimallyclassic or occult wet AMD who were rando-mized 2:1 to receive intravitreal Lucentisinjections or a control regimen. Patientstreated with Lucentis were further rando-mized to receive either a 0.3 mg or 0.5 mgdose of Lucentis once a month for twoyears. At 12 months, patients treated withLucentis gained an average of seven lettersin visual acuity compared to study entry,while those in the control group lost anaverage of 10.5 letters.33,39 Additional keystudy findings include: 1) Ninety five per-cent (452/478) of Lucentis-treated patientslost fewer than 15 letters compared tobaseline, the primary endpoint of the study,compared with 62 percent (148/238) for thesham injection control group. 2) Twenty fivepercent (59/238) of patients treated with 0.3mg of Lucentis and 34 percent (81/240)treated with 0.5 mg of Lucentis improvedvision by a gain of 15 letters or more com-pared to approximately 5 percent (11/238)of patients in the control group. 3) Nearly 40percent (188/478) of Lucentis-treated pa-tients achieved a visual acuity score of20/40 or better at 12 months compared to11 percent (26/238) in the control group.Serious ocular adverse events occurringmore frequently in Lucentis-treated patientswere uncommon (<1 percent) and includeduveitis and endophthalmitis. There were noculture-positive cases of endophthalmitis inthe MARINA study. There were 3 cases ofculture-negative endophthalmitis, 3 cases

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of uveitis, 2 retinal tears, 2 with vitreoushemorrhage, and 1 with lens damage.Cerebrovascular accidents occurred, with 1in the sham group, 1 in the 0.3 mg group,and 3 in the 0.5 mg group. Still, there wereno clear statistically significant systemicsafety issues with ranibizumab and noobserved increase in hypertension. Overall,patients treated with ranibizumab gained 7letters and the sham group lost 10.5 lettersand there seemed to be a trend of improvedoutcome with the higher-dose group. Basedon these results, ranibizumab is expectedto be evaluated by the US FDA for thetreatment of choroidal neovascularization(CNV) secondary to AMD.

Ongoing Phase III StudiesGenentech and Novartis Pharma AG

are conducting an additional Phase III studyof Lucentis, ANCHOR (ANti-VEGF Antibodyfor the Treatment of Predominantly ClassicCHORoidal Neovascularization in AMD).This is a randomized, multi-center, double-masked, active treatment controlled studycomparing two different doses of Lucentisto PDT in 423 patients.

Genentech is conducting an additionalPhase IIIb study, PIER (A Phase IIIb,Multicenter, Randomized, Double-Masked,Sham Injection-Controlled Study of theEfficacy and Safety of Ranibizumab inSubjects with Subfoveal Choroidal Neovas-cularization with or without Classic CNVSecondary to Age-Related Macular Dege-neration), in 184 patients in the UnitedStates with wet AMD. In this trial, Lucentis isadministered once per month for the firstthree doses followed thereafter by dosesonce every three months for two years.

Genentech recently began enrollmentin the HORIZON Phase III open-labelextension study, which allows eligiblepatients who have completed participationin certain other Lucentis clinical studies tocontinue to receive the investigational drug.

Systemic therapyand Bevacizumab

SANA study (Systemic Avastin

for Neovascular AMD)

Another method for delivering anti-VEGF therapy to the eye in neovascularAMD patients would be to use systemictherapy rather than an intraocular injection.Currently, a full-length recombinant huma-

nized monoclonal antibody directed againstVEGF known as bevacizumab (Avastin,Genentech, Inc.) is approved by the FDA forthe treatment of metastatic colorectalcancer.34 The antiangiogenic properties ofbevacizumab have been studied in cancerpatients, but never in animal models or hu-mans with CNV. However, fluorescein-conjugated bevacizumab was shown toleak from laser-induced CNV after systemicadministration to a cynomolgus monkey. 23

This observation suggested that systemicbevacizumab could leak from CNV in AMDpatients and competitively inhibit extrace-llular VEGF.

At the time when Michels et al35 initiatedthe open-label prospective clinical studySANA (Systemic Avastin for NeovascularAMD), they proposed that systemicbevacizumab could leak from CNV and bindextracellular VEGF, that inhibition ofextracellular VEGF could improve VA out-comes based on the promising results fromearly-phase studies with intravitreal anti-VEGF drugs, and that bevacizumab couldbe used for this off-label indication in neo-vascular AMD patients destined to legallyblind for whom no approved therapy exis-ted. Michels et al35 reported the first ninepatients enrolled through 12 weeks offollow-up. One week after the initialbevacizumab infusion, statistically signifi-cant changes in VA letter scores and centralretinal thickness measurements on OCTwere observed in both, the treatment andfellow eye respectively, and these signifi-cant changes continued through week 12.By 1 week, both median and mean VA letterscores in the study eyes increased to 62letters. At week 12, there were 3 eyes(33%) with at least 3 lines of VA impro-vement and 8 eyes (89%) with at least 1line of improvement. Recently, Rosenfeld etal36 reported 14 patients followed for at least3 months. After this time the median andmean visual acuity letter scores in the studyeyes increased by 9 letters and 12 letters,respectively. From 14 eyes, CNV wasdiagnosed in 12 fellow eyes and medianand mean visual acuity increased by 27letters and 17 letters in these 14 felloweyes. The median and mean OCT centralretinal thickness measurements in thestudy eyes decreased by 125 and 155microns, and in the fellow eyes 60 and 81microns respectively. After 2 or 4 druginfusions during the first month, systemicbevacizumab therapy resulted in durable

treatment benefits in 8 of 11 patientsthrough the 6 month visit. Only one of the 11patients followed for at least 6 months re-quired additional treatment prior to the 6months visit. Rosenfeld et al believe thatthese results suggest that bevacizumabmay have better durability than similardrugs given intravitreally.36 Finally, since thefirst article was published, a total of 18patients have been followed for at least 24weeks, and the 24-week results confirmand improve upon the preliminary resultsobserved at 12 weeks. Of the 18 patients, 9initially received three treatments and 11received only two treatments, and themajority of patients did not require anothertreatment through 24 weeks.37

A major advantage of systemic therapyis the ability to deliver the drug at atherapeutic level directly to the targetneovascular tissue in the choroid or retina,the elimination of complications related tointravitreal procedure as infectious en-dophthalmitis, retinal detachment, and lensinjury, the ability to treat both eyes simulta-neously in patients with bilateral neovas-cular disease; and the more predictableoutcome in patients who have undergone avitrectomy or who are aphakic, in whichcase the half-life of an intravitreally admi-nistered drug is probably diminished.38

However, systemic administration ofbevacizumab has been associated withhypertension, delayed wound healing,thromboembolic disease, and spontaneousintestinal perforation with patients with gas-trointestinal malignancies. Therefore, themost significant disadvantage of systemicbevacizumab therapy is the possibility oflife-threatening adverse events (estimatedoverall rate of up to 4.4%).

Michels et al35 believe that although therisk of thromboembolic events in elderlycancer patients has been documented, therisk of thromboembolic events in elderlyAMD patients receiving intermittent beva-cizumab therapy, compared with continualtherapy every 2 weeks in cancer patients, isnot known. Even if the risk in AMD patientsis initially low, as additional treatments aregiven to our elderly population, the risk ofthromboembolic events most likely willincrease. The SANA Study group, excludedpatients with a history of cerebrovascularaccident, transient ischemic attack, myocar-dial infarction, angina, or any other throm-boembolic disease.

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Intravitreal use of Bevacizumab

(Avastin)

Positive presentations at retina mee-tings39 and the 2 published case reports ofVA improvement and decreased retinalthickness40,41 have led an exponential increaseof the use of intravitreal bevacizumab in thepast few months. The main force drivingintravitreal bevacizumab usage is the highpercentage of patients who experiencesymptomatic relief from active subfovealCNV and the anatomic changes visualizedwith OCT (Fig. 2).

Because bevacizumab was not createdto be given as an intraocular injection, therehave been no published animal or humansafety data on retinal toxicity. The intra-ocular safety profile of bevacizumab isunknown in contrast to that of pegaptanib oreven ranibizumab. The longer half-life (upto 20 days) of bevacizumab is useful forsystemic cancer but may cause safetyconcerns in the eye. Whether systemicabsorption is more likely with a longer half-life drug is unknown. Although an intravi-treal injection uses minute fractions of thedrug and the systemic absorption is unlikelyto be significant, measurement of systemiclevels after intravitreal injection has notbeen done. The clearance of bevacizumabis 100-fold slower than ranibizumab, andthe affinity of bevacizumab for VEGF is lessthan that of ranibizumab.

Reasons to use bevacizumab includeimproved retinal morphology and visualacuity. Indeed, the anecdotal report showeddramatic improvement in OCT appearanceand corresponding improvement in visualacuity.40,41 Other reasons to use it include itslow cost and wide availability, with nounexpected toxicity shown to date. Appli-cations of its use include salvage therapy(after lack of efficacy of FDA-approveddrugs), lesions that fall outside the indi-cations for approved drugs, patient refusalto use other drugs, and lower cost inuninsured patients.

Figure 2.(Arevalo et al). A-B) Early and latefluorescein angiogram on a patient with age-related macular degeneration and juxtafovealchoroidal neovascularization. C-F)Improvement of visual acuity and opticalcoherence tomography findings at baseline(C), at 1 week (D; from 20/400 to 20/60), 2weeks (E; 20/40), and 6 weeks (F; 20/40)after intravitreal bevacizumab.

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R E F E R E N C E S :

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BASIC INVESTIGATION

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Junio 2006

Estandarización de una técnica de cultivo de epitelio, endotelio y fibroblastoscorneales y evaluación de su crecimiento sobre mallas de colágeno tipo I.Cultivo de epitelio, endotelio y fibroblastos corneales

CCaarrllooss HH.. TTrriiaannaa SS.. MMDD11,,33;; CCaarrllooss AA.. CChhiirriibbooggaa NN.. MMDD11;;MMaarrttaa RR.. FFoonnttaanniillllaa DD.. PPhhDD11,,22**Bogotá. D.E. Colombia.11 Instituto de Biología Molecular - Universidad EL Bosque22 Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias - Universidad

Nacional de Colombia33 Postgrado de Oftalmología - Universidad EL Bosque

**AAuuttoorr ppaarraa ccoorrrreessppoonnddeecciiaa::[email protected]@hotmail.comTransv 9ª Bis No 133-25TEL 6331368 Ext. 291Si existe interés financiero en el producto del presente trabajo.

RESUMEN

La córnea es el tejido responsable de la mayoría del

poder refractivo del ojo, lo que la convierte en una

estructura vital para el adecuado funcionamiento de la

visión. Las patologías de la córnea son múltiples y de

diferentes etiologías; debido a las características de la

cicatrización de este tejido casi todas pueden dañarla,

causando alteraciones dramáticas en la refracción del

paciente. En estos casos el tratamiento indicado es el

transplante de espesor total o parcial. La fuente de

córnea son los donantes cadavéricos, lo cual genera

riesgo de infección y rechazo. Nuestro grupo ha desa-

rrollado sustitutos de tejido conectivo mucoso y dermis

artificiales que en el momento se encuentran en valo-

ración preclínica. En este trabajo nos propusimos apli-

car la metodología estandarizada, para establecer

cultivos primaros de células de la córnea que luego

fueron subcultivados en soportes de colágeno I e incu-

bados. Los resultados indican la obtención de cultivos

primarios de células endoteliales, células epiteliales y

fibroblastos corneales 5 días post-siembra. Igual-

mente, que la siembra de fibroblastos en los soportes

de colágeno I condujo a su adhesión a las fibras y a la

formación de material eosinófilo entre las células.

PPaallaabbrraass CCllaavvee:: Córnea, Cultivo celular, Ingeniería Tisular.

ABSTRACT

The cornea is responsible for the majority of the eye's

refringence, this makes it a vital structure an adequate

visual function. Diseases affecting the eye are various

and have different causes; however the almost always

cause damage to this tissue, which, due to it's scarring

characteristics, can have dramatic consequences in the

affected individual's refraction. The field of tissue engi-

neering offers us now the possibility to obtain functional

tissue substitutes in the laboratory, as has been shown

by our group for skin, cartilage and oral mucosa; these

substitutes are viable alternatives to grafts and trans-

plants due to the fact that they are not associated with

the risks and limitations of these procedures. The aim of

this work was to standardize the culture conditions for

the three types of corneal tissue and, to seed them in

collagen scaffolds. We obtained pure, confluent cul-

tures 5 days post-seeding. Cell morphology allowed

primary identification of the cultures. Fibroblasts

seeded in collagen scaffolds were seen adherent 14

days post-seeding with very little proliferation and

cellular infiltration of the scaffold.

KKeeyywwoorrddss:: Cornea, Cell culture, Tissue engineering

INTRODUCCIÓNLas patologías de cornea (infecciosas, auto inmunes, trauma, etc), producen deficiencia

en la visión y disminución de la calidad de vida. Un porcentaje de estas patologías necesitatratamiento quirúrgico especializado cuando no responden al tratamiento medico esta-blecido o cuando las secuelas son severas. Este tratamiento, genera una alta tasa derechazo inmunológico1,2, sumando la escasez de donantes y el costo. Por esto es de granimportancia desarrollar tejidos alternativos que disminuyan estas complicaciones.

Nuestro grupo ha podido desarrollar in Vitro sustitutos de mucosa oral, piel ycartílago3,4,5,6,7 basados en el cultivo de células aisladas de estos tejidos sobre soportesde colágeno. Considerando la similitud de nuestras técnicas con las empleadas paracultivar cornea8,9,10,11,12 y teniendo en cuenta la importancia que tiene transferir y desa-rrollar la tecnología para la obtención de tejido corneal artificial13,14,15,16,17 en este trabajonos propusimos a estandarizar el aislamiento y cultivo tridimensional de los tres tiposcelulares corneales.

En este estudio se utilizaron las córneasprovenientes de 6 conejos machos razaNueva Zelanda provenientes del bioteriocentral de la Universidad Nacional deColombia, con un peso promedio de 1.5kg.Los animales fueron sacrificados con unasobredosis intravenosa de pentotal-ketamina (Eutanex), una vez entraron enparo cardiorrespiratorio se extrajeron lascórneas con la mínima cantidad de tejidolimbo-escleral. Las córneas fueron trans-portadas en Solución Salina con Buffer deFosfatos (PBS, Ph 7.4) suplementada conPenicilina 100 UI/mL y Estreptomicina 100g/mL. Bajo estereoscopio se retiró todo eltejido limbo-escleral remanente. Siguiendoel protocolo establecido18, con algunas mo-dificaciones, las córneas fueron suspen-didas en una solución de Tripsina 0,25%-EDTA 0,025% (GIBCO BRL) por 10 minutosa 37°C. Luego bajo estereoscopio se iden-tificó la cara endotelial de la córnea y sedesprendió la membrana de Descemetunida al endotelio corneal. Tanto la mem-brana como el endotelio fueron disgregadosmecánicamente con ayuda de la pipeta y

las células obtenidas fueron sembradas encajas de cultivo de 25cm2 (Falcon) conmedio DMEM suplementado con 10% deSuero Fetal Bovino (SFB) y vitaminas,Piruvato y Aminoácidos no esenciales al 1%(GIBCO). El tejido corneal remanente fuesuspendido en una solución de Dispasa0,5% (GIBCO) e incubado 1 hora a 37°C yluego toda la noche a 4°C. Una vez trans-currido este tiempo se separó el epitelio,bajo estereoscopio, mediante raspado sua-ve. El tejido así obtenido se disgregó conpipeta y se sembró en cajas de cultivo de25cm2 (Falcon) con medio DMEM suple-mentado de la manera ya descrita. Final-mente, el tejido corneal se sometió a unatercera digestión, con una solución decolagenasa al 0,1% por 30 min. a 37°C.Posteriormente se pasó la suspensióncelular a través de un tamiz de nylon (70µm Falcon Cell Strainer, Becton Dickinson)para obtener fibroblastos disgregados. Loscultivos se mantuvieron a 37C con unaatmósfera controlada de 5% de CO2 concambios de medio cada tercer día.

Materiales y MétodosEstablecimiento de cultivos primarios de epitelio, queratocitos

y endotelio corneal:

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BASIC INVESTIGATIONJunio 2006

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Siembra de fibroblastos

cornéales sobre soportes decolágeno tipo I:

Las mallas de colágeno tipo I de rata seobtuvieron siguiendo la técnica descrita porPérez y col3 con algunas modificaciones.Las colas de rata se preservaron a -20°Chasta el día de su utilización. Luego sedescongelaron con etanol al 70%, se des-pojaron de la piel, se retiraron los tendonesy se cortaron en pedazos pequeños. Des-pués estos se sumergieron en ácido acéti-co 0.01M y se mantuvieron a 4°C por 14días. Una vez transcurrido este tiempo seprocedió a centrifugar a 12000 g por 15minutos a temperatura ambiente, y a sepa-rar el sobrenadante. Éste fue tratado conNaOH 0.1 N en cantidad suficiente paraajustar el pH a 9, sometido a agitaciónfuerte y centrifugado a 12000 g durante 10minutos y a temperatura ambiente. El preci-pitado se disolvió en la mínima cantidad deácido acético 0.01 N y a dicha solución sele midió la concentración de colágeno por elmétodo de Bradford. Una vez conocida laconcentración del colágeno extraído seajustó a 2 - 2.5 mg/mL. Luego se homo-genizó (homogenizador Ultraturrax T-25Basic S1, IKA WORKS, INC.) y se vertió encajas de cultivo de 60 mm (Becton, Dickin-son Labware, NJ, USA) cubiertas con papelparafinado. Inmediatamente después fueronllevadas a -20°C, para luego ser liofilizadaspor 48 horas. Para poder garantizar unambiente estéril y adecuado para el cultivo,las mallas se esterilizaron con óxido deetileno y se dejaron airear por 24 horas.

Los fibroblastos confluentes fueron re-movidos de la caja de cultivo utilizando unasolución de Tripsina 0,25%-EDTA 0,025%por 15 minutos a 37°C y fueron recolec-tados lavando la caja con 5ml de medioDMEM suplementado. Luego fueron centri-fugados a 1000 X g y el pellet celularobtenido se llevó a una concentración de 1x104 células/ml. Previamente las mallas secolocaron en cajas de 6 pozos (Becton,Dickinson Labware, NJ, USA) con medioDMEM suplementado a 37°C con unaatmósfera controlada de 5% de CO2 por 24horas, pasado este tiempo se sembró 1mlde la suspensión de fibroblastos sobre lasmallas y se incubaron bajo las condicionesdescritas por 2 horas, antes de agregar 5ml de medio al pozo. Las mallas así sem-bradas se incubaron a 37°C con unaatmósfera controlada de 5% de CO2 por 21

días con cambios de medio cada tercer ocuarto día. Pasado este tiempo las mallasse fijaron con formaldehído al 10% en PBSy se procesaron en bloques de parafinapara su posterior tinción con Hematoxilina /Eosina. Las láminas obtenidas se observa-ron al microscopio de luz (Nikon LABOPHOT,Japan) para evaluar proliferación celular einfiltración celular a la malla. Los camposmicroscópicos más significativos fueronfotografiados (Nikon FX-35).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aplicando la metodología descrita anterior-mente obtuvimos cultivos de epitelio,endotelio y fibroblastos corneales, con-fluentes a los 5 días post-aislamiento. Lamorfología de las células aisladas coincidecon la esperada para cada tipo celular(Figura 1). El endotelio corneal muestracélulas poliédricas, confluentes, con la ca-racterística apariencia en "empedrado" delos endotelios, se observan células enestrecha asociación, con un núcleo promi-nente. En cuanto al epitelio se observancélulas con morfología epiteloide, algunasde las células demuestran depósitos intra-celulares. Los fibroblastos corneales demues-tran una morfología ahusada, típica de losfibroblastos en cultivo. La morfología celularconfirma su identidad y es coherente con loreportado en la literatura18,19.

Al sembrar fibroblastos corneales sobremallas de colágeno tipo I aislado de ten-dones de cola de rata por 21 días y al

procesar las mallas para corte y tinción conHematoxilina / eosina observamos cúmulosde células adheridos a la malla decolágeno, no se observaron células infil-tradas en la malla. (Figura 2).

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R E F E R E N C E S :

Figura 1.

Figura 2.

PAN-AMERICA

15: :

Junio 2006

Visión Pan-América es la publicación oficial de la AsociaciónPanamericana de Oftalmología. La publicación está particularmenteinteresada en recibir manuscritos que sean cortas revisiones dematerias novedosas de interés para los oftalmólogos miembros dela Asociación. Además de las revisiones, la publicación está intere-sada en artículos acerca de nuevas técnicas quirúrgicas, nuevasterapias médicas, y casos de correlacion clinico-patológica.

Información de Presentación:Los manuscritos deben enviarse electrónicamente al jefe deredacción, Mark J. Mannis, MD a [email protected] o puedeenviarse vía el correo a:

Mark J. Mannis, MD,Department of OphthalmologyUniversity of California,Davis 4860 Y Street, Suite 2400Sacramento, CA 95817U.S.A

Si se envía el trabajo por correo, este debe ir tanto impreso (amáquina,etc.) y en forma electrónica (CD, etc.). Todas las presen-taciones deben ser publicaciones originales que no se hayanpublicado en otra parte. Las presentaciones pueden ser escritas enidioma español, inglés o portugués. Todos los trabajos deben tenerun resumen en inglés y en español.

Formato de Presentación:Los trabajos presentados no deben sobrepasar las 1500 palabras(seis páginas escritas a doble espacio) más las referencias.

Las referencias deben ser incluidas como una lista en una páginaseparada al final del manuscrito con referencias citadas codificadasal texto en el orden de aparición.

El siguiente formato debe usarse para las referencias: Jones JS, García TL, Perrero M. Retinopatía Diabética en Bolivia.Córnea, 1996; 26 (2): 341 - 343.

Smith DJ, Caldera MC, Chang N, Ferrer RJ. Managing TraumaOcular. Hofstra y Publicadores de Kennimore, Londres, 1989.

Se aceptan figuras de color y deben enviarse en PICT, TIFF oformato de JPEG. El formato de Powerpoint no es aceptable.

La página del título debe incluir lo siguiente:(1) el nombre completo de cada autor (es decir, nombre, apellido yla inicial media si usa,) y el grado académico más alto; (2) la ciudad,estado, y país en el que el trabajo se llevó a cabo; (3) el nombre ydirección del autor para recibir pedidos de separata; (4) declaraciónde los autores si existe o no interés financiero en un producto citadoo utilizado en el trabajo.

Vision Pan-América is the official publication of the Pan-AmericanAssociation of Ophthalmology. The publication is particularly in-terested in receiving manuscripts that are short state–of-the-artreview papers that will be of interest to the practicing PAAO memberophthalmologist. In addition to review articles, the publication isinterested in articles on new surgical techniques, medical therapies,and case reports that emphasize clinicopathologic correlations.

Submission information:Manuscripts should be submitted electronically to the Editor-in-Chief, Mark J. Mannis, MD at [email protected] or can be sentvia mail to:

Mark J. Mannis, MD,Department of OphthalmologyUniversity of California,Davis 4860 Y Street, Suite 2400Sacramento, CA 95817U.S.A.

All submissions must be provided in electronic form as well aswritten manuscript form if mailed. All submissions must be originalpublications that have not been published elsewhere. Submissionscan be in Spanish, English, Portuguese or French. All papers shouldbe preceded by an abstract in either English or Spanish.

Submission Format:Papers submitted should be no longer than 1500 words (six double–spaced type-written pages) plus references.

References should be included as a list on a separate page at theend of the manuscript with cited references keyed to the text in theorder of appearance.

The following format should be used for referenced papers:Jones JS, Garcia TL, Perrero M. Diabetic retinopathy in Bolivia.Cornea, 1996; 26 (2): 341- 343.

Smith DJ, Caldera MC, Chang N, Ferrer RJ. Managing OcularTrauma. Hofstra and Kennimore Publishers, London, 1989.

Color figures are encouraged and should be submitted in PICT, TIFFor JPEG format. Powerpoint format is not acceptable.

The title page should include the following:(1) each author's full name (i.e., first name, middle initial if used, andlast name) and highest degree; (2) city, state, and country in whichwork was carried out; (3) name and address of author to receivereprint requests; (4) statement about the authors' proprietary orfinancial interest in a product or lack thereof.

:::: IInnssttrruucccciioonneess aa llooss AAuuttoorreess

:::: IInnssttrruuccttiioonnss ttoo AAuutthhoorrss

PAN-AMERICA

Junio 2006

16: :

REQUEST FOR INFORMATION (Please print clearly)

I would like to receive information and the application for: Canqui Boyd Scholarship AwardDavid & Julianna Pyott Pan-American Retinal Research FellowshipGillingham Pan-American Fellowship Award Paul Kayser International Scholar Award Sean B. Murphy Ophthalmic Pathology Scholarship Tim & Judith Sear ScholarshipTyson Travel Scholarship to attend the ARVO meeting

Online application forms are available at: www.paao.org/doc/beca_CanquiBoyd_app.docwww.paao.org/doc/beca_Pyott_app.docwww.paao.org/doc/beca_Gillingham_app.docwww.paao.org/doc/beca_Kayser_app.docwww.paao.org/doc/beca_Sear_app.docwww.paao.org/doc/2007_tysonARVO_app.doc

Important notes:All applicants must be or become PAAO members. See online application form at: www.paao.org/newmember.htmlAll applicants are required to submit all required documentation at the time of submission of your application form.No applications are carried over from one year to the next.

APPLICATION RECEIPT DEADLINE:September 1, 2006

Pan-American Ophthalmological Foundation1301 South Bowen Road, Suite 365Arlington, Texas 76013Tel.: (817) 275-7553 / Fax: (817) 275-3961Email: [email protected] site: http://www.paao.org

Canqui Boyd Scholarship Award

One (1) scholarship in the amount of $4,000 is offered in 2007 to Pan-American members. Candidates must have already been accepted into atraining program in Latin America. Funding provided by Canqui Boyd Fundand the PAOF. The applicant should be a general ophthalmologist from LatinAmerica, no more than 2 to 3 years out of his/her residency program.

David & Julianna Pyott Pan-American

Retinal Research Fellowship

This is an opportunity for one (1) fully-qualified ophthalmologist from a LatinAmerican country outside Brazil and Mexico, to spend 2 years at theUniversity of California, Irvine, Department of Ophthalmology as aninternational retina fellow participating in research and clinical work underthe supervision of Dr. Baruch Kuppermann, Professor of Ophthalmology.Applicants should have completed a residency in Ophthalmology, speakfluent conversational English, and be interested in a career in Retina. Thevalue of the Fellowship is U.S. $20,000 per annum.

Gillingham Pan-American Fellowship Award

Two (2) six-month fellowships in the amount of $10,000 each are offered toqualified Latin American candidates in a variety of sub-specialty interests atvarious institutions in the United States and Canada. Funding provided byRetina Research Foundation. The applicant should be a general ophthalmo-logist, no more than 2 to 3 years out of his/her residency program, and fromLatin America. The applicant must have been already accepted into anaccredited fellowship program in the United States or Canada. The PAAO willnot place applicants in institutions. Please include a copy of the acceptanceletter with the application form.

Paul Kayser International Scholar Program

Six (6) two-week scholarships in the amount of $3,000 are offered to US andCanadian candidates for the purpose of introducing exceptional North Ame-rican ophthalmologists to the best practice and research approaches in LatinAmerica. Funding provided by Retina Research Foundation. The candidatemust be a third year resident or a first year fellow.

Sean B. Murphy Ophthalmic Pathology Fellowship Award

One (1) one-year fellowship is offered in the amount of $10,000 (cdn) at McGillUniversity in Montreal, Canada. The selected fellow will participate in variousresearch projects, Grand Round at various hospitals, and have the opportunityto present at the annual ARVO meeting. Funding is provided by the PAOFand matching funding provided by McGill University.

Tim & Judith Sear Scholarship

One (1) scholarship in the amount of $4,000 is offered annually to Pan-American members. Candidates must be outstanding students who have pre-sented papers or published during their training period. Candidates must havealready been accepted into a training program. Funding provided by Tim &Judith Sear for the advancement of education in ophthalmology throughoutthe world. The applicant should be a general ophthalmologist from LatinAmerica and no more than 2 to 3 years out of his/her residency program.

Tyson ARVO/PAAO Travel Scholarship

Up to five (5) travel scholarships are awarded to Latin American candidatesyearly, in the amount of $2,500, to attend the ARVO (Association for Researchin Vision and Ophthalmology) annual meeting. Funding provided by RetinaResearch Foundation. The ophthalmology department chairman or nationalophthalmological society affiliated with the PAAO must recommend thecandidate to the PAAO.

TThhee PPaann--AAmmeerriiccaann OOpphhtthhaallmmoollooggiiccaall FFoouunnddaattiioonn

IIss NNooww AAcccceeppttiinngg AApppplliiccaattiioonnss FFoorr 22000077

Last Name(s) Suffix(es)(Sr, Jr, etc) Degree(s)(MD, PhD)

First Name(s) Middle Name(s)

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Mailing Address (continued)

PAN-AMERICA

1. The AGIS Investigators: The Advanced Glaucoma Intervetion Study - The Relationship Between Control of Intraocular Pressure and Visual Field Deterioration. Am. J. Ophthalmol, 130 (4): 429-40, 2000. 2. Shirakashi, M. et al: Intraocular Pressure-Dependent Progression of VisualField Loss in Advanced Primary Open-Angle Glaucoma: A 15-Year Follow-Up. Ophthalmologica, 207: 1-5, 1993. 3. Mao, LK; Stewart, WC; Shields, MB: Correlation Between Intraocular Pressure Control and Progressive Glaucomatous Damage in Primary Open-Angle Glaucoma. Am.J. Ophthalmol, 111: 51-55, 1991. 4. Higginbotham, EJ et al. One-Year Comparison of Bimatoprost with Timolol in Patients with Glaucoma or Ocular Hypertension. Presented at American Academy Ophthalmology, Nov 11-14, 2001. 5. Gandolfi, S et al. Three-Month Comparison of Bimatoprostand Latanoprost in Patients with Glaucoma and Ocular Hypertension. Adv. Ther, 18 (3): 110-121, 2001. 6. Coleman, AL et al: A 3-Month Comparison of Bimatoprost with Timolol/Dorzolamide in Patients with Glaucoma or Ocular Hypertension. Presented at American Acedemy ofOphthalmol, New Orleans, La, 2001.

Preserva la visión alcanzando las menorespresiones-objetivo en más pacientes

Mejor comodidad posológica:

1 vez al día.

No requiere refrigeración.

Presentación conteniendo 3 ml.

LLLLLumiganumiganumiganumiganumigan® ® ® ® ® (bimatoprost) Forma farmacéutica y prForma farmacéutica y prForma farmacéutica y prForma farmacéutica y prForma farmacéutica y presentación.esentación.esentación.esentación.esentación.Frascos cuenta-gotas conteniendo 5 ml de solución oftalmológica estéril de bimatoprost a 0,03%. USO ADULTO.Composición. Composición. Composición. Composición. Composición. Cada ml contiene: 0,3 mg de bimatoprost. Vehículo: cloreto de sódio, fosfato de sódiohepta-hidratado, ácido cítrico mono-hidratado, ácido clorídrico y/o hidróxido de sódio, cloruro de benzalconio y agua purificada qsp. Indicaciones.Indicaciones.Indicaciones.Indicaciones.Indicaciones. LUMIGAN®®®®® (bimatoprost) es indicado para la reducción de la presión intra-ocular elevada en pacientes con glaucona o hipertensiónocular.Contraindicaciones.Contraindicaciones.Contraindicaciones.Contraindicaciones.Contraindicaciones. LUMIGAN®®®®® (bimatoprost) está contraindicado en pacientes con hipersensibilidad al bimatoprost o cualquier otro componente de la fórmula del producto. Pr Pr Pr Pr Precauciones y Adverecauciones y Adverecauciones y Adverecauciones y Adverecauciones y Advertencias.tencias.tencias.tencias.tencias. Advertencias. Fueron relatados aumento gradual del crescimientode las pestañas en el largo y espesura, y oscurecimiento de las pestañas (en 22% de los pacientes después 3 meses, y 36% después 6 meses de tratamiento), y, oscurecimiento de los párpados (en 1 a <3% de los pacientes después 3 meses y 3 a 10% de los pacientes después6 meses de tratamiento). También fue relatado oscurecimiento del íris en 0,2% de los pacientes tratados durante 3 meses y en 1,1% de los pacientes tratados durante 6 meses. Algunas de esas alteraciones pueden ser permanentes. Pacientes que deben recibir el tratamientode apenas uno de los ojos, deben ser informados a respecto de esas reacciones. PrPrPrPrPrecaucionesecaucionesecaucionesecaucionesecauciones LUMIGAN®®®®® (bimatoprost) no fue estudiado en pacientes con insuficiencia renal o hepática y por lo tanto debe ser utilizado con cautela en tales pacientes.Las lentes de contacto debenser retiradas antes de la instilación de LUMIGAN®®®®® (bimatoprost) y pueden ser recolocadas 15 minutos después. Los pacientes deben ser advertidos de que el producto contiene cloruro de benzalconio, que es absorvido por las lentes hidrofílicas.Si más que un medicamentode uso tópico ocular estuviera siendo utilizado, se debe respetar un intervalo de por lo menos 5 minutos entre las aplicaciones.No está previsto que LUMIGAN®®®®® (bimatoprost) presente influencia sobre la capacidad del paciente conducir vehículos u operar máquinas, sin embargo,así como para cualquier colírio, puede ocurrir visión borrosa transitoria después de la instilación; en estos casos el paciente debe aguardar que la visión se normalice antes de conducir u operar máquinas. Interacciones medicamentosas.Interacciones medicamentosas.Interacciones medicamentosas.Interacciones medicamentosas.Interacciones medicamentosas.Considerando que las concentracionescirculantes sistemicas de bimatoprost son extremadamente bajas después múltiplas instilaciones oculares (menos de 0,2 ng/ml), y, que hay varias vías encimáticas envueltas en la biotransformación de bimatoprost, no son previstas interacciones medicamentosas en humanos.No son conocidas incompatibilidades. R R R R Reacciones adversas.eacciones adversas.eacciones adversas.eacciones adversas.eacciones adversas. LUMIGAN®®®®® (bimatoprost) es bien tolerado, pudiendo causar eventos adversos oculares leves a moderados y no graves.Eventos adversos ocurriendo en 10-40% de los pacientes que recibieron doses únicas diarias, durante3 meses, en orden decreciente de incidencia fueron: hiperenia conjuntival, crecimento de las pestañas y prurito ocular.Eventos adversos ocurriendo en aproximadamente 3 a < 10% de los pacientes, en orden decreciente de incidencia, incluyeron: sequedad ocular, ardor ocular,sensación de cuerpo estraño en el ojo, dolor ocular y distúrbios de la visión.Eventos adversos ocurriendo en 1 a <3% de los pacientes fueron: cefalea, eritema de los párpados, pigmentación de la piel periocular, irritación ocular, secreción ocular, astenopia, conjuntivitis alérgica,lagrimeo, y fotofobia.En menos de 1% de los pacientes fueron relatadas: inflamación intra-ocular, mencionada como iritis y pigmentación del íris, ceratitis puntiforme superficial, alteración de las pruebas de función hepática e infecciones (principalmente resfriados e infeccionesde las vías respiratorias).Con tratamientos de 6 meses de duración fueron observados, además de los eventos adversos relatados más arriba, en aproximadamente 1 a <3% de los pacientes, edema conjuntival, blefaritis y astenia. En tratamientos de asociación con betabloqueador,durante 6 meses, además de los eventos de más arriba, fueron observados en aproximadamente 1 a <3% de los pacientes, erosión de la córnea, y empeoramiento de la acuidad visual. En menos de 1% de los pacientes, blefarospasmo, depresión, retracción de los párpados,hemorragia retiniana y vértigo.La frecuencia y gravedad de los eventos adversos fueron relacionados a la dosis, y, en general, ocurrieron cuando la dosis recomendada no fue seguida.Posología y Administración.Posología y Administración.Posología y Administración.Posología y Administración.Posología y Administración.Aplicar una gota en el ojo afectado, una vez al día, a la noche.La dosis no debe exceder a una dosis única diaria, pues fue demostrado que la administración más frecuente puede disminuir el efecto hipotensor sobre la hipertensión ocular.LUMIGAN®®®®® (bimatoprost) puede ser administrado concomitantemente con otros productos oftálmicostópicos para reducir la hipertensión intra-ocular, respetándose el intervalo de por lo menos 5 minutos entre la administración de los medicamentos. VENTA BAJO PRESCRIPCIÓN MÉDICA.“ESTE PRODUCTO ES UM MEDICAMENTO NUEVO AUNQUE LAS INVESTIGACIONES HAYANINDICADO EFICACIA Y SEGURIDAD, CUANDO CORRECTAMENTE INDICADO, PUEDEN SURGIR REACCIONES ADVERSAS NO PREVISTAS, AÚN NO DESCRIPTAS O CONOCIDAS, EN CASO DE SOSPECHA DE REACCIÓN ADVERSA, EL MÉDICO RESPONSABLE DEBE SER NOTIFICADO.

vs. timolol 4 vs. latanoprost6

Porcentaje de Pacientes quealcanzaron la PIO-Objetivo ≤≤≤≤≤14 21% 9% 17% 2% 19% 9%

Porcentaje de Pacientes quealcanzaron la PIO-Objetivo ≤≤≤≤≤15 31% 16% 24% 9% 29% 14%

dorzolamida/ timolol 5vs.

®®®

Lumigan® alcanza la PIO-objetivo de 14/15 mmHg en un mayor númerode pacientes:

Investigadores de diversos estudios, (AGIS, Shirakashi, Shields)han comprobado que alcanzar y mantener la PIO entre 14 y 15 mmHgreduce la progresión de pérdida del campo visual1,2,3.