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HEMOGRAMA AUTOMATIZADO

BQCO. GONZALO OJEDAHEMATOLOGÍA CLÍNICA FaCENA – UNNE2013

AUTOMATIZACIÓN EN HEMATOLOGÍA

ExactitudPrecisiónRapidezStandarizaciónScreening

TOMA DE MUESTRA Y PROCESAMIENTO

Sangre entera(EDTA-K3)Volumen requeridoProcesamiento dentro de las 8 hConservar refrigeradaTemperatura ambiente

PRINCIPIOS DE MEDICION

Impedancia EléctricaEspectrometría de AbsorciónCitometría de FlujoDispersión ópticaFluorescenciaCitoquímica: Peroxidasa

EQUIPOS

IMPEDANCIA + ESPECTROMETRÍA ABSORCIÓN : COULTER (RBC-INDICE HEMATIMÉTRICOS – PLT – WBC – HB)IMPEDANCIA + RADIOFRECUENCIA + ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN: 3 DIFFIMPEDANCIA + RADIOFRECUENCIA + ESPECTROMETRÍA + DISPERCIÓN DE LUZ/FLUORESCENCIA/ OTRA : EQUIPOS 5 DIFF

PRINCIPIO COULTERWallace Coulter (1913-1998)

IMPEDANCIA ELECTRÓNICA Y RADIOFRECUENCIAImpedancia electrónica o la resistencia a la corriente continua (cc) de bajo voltaje fue desarrollada por Wallace Coulter en la década de 1950 y es la metodología utilizada con mayor frecuenciaLa radiofrecuencia (RF) o la resistencia a la corriente electromagnética de alto voltaje a veces se utiliza junto con la impedancia electrónica de la CC.

IMPEDANCIA ELECTRÓNICAEl principio de impedancia en el recuento de células se basa en la detección y medición de cambios en la resistencia eléctrica producida por las células cuando atraviesan una apertura pequeña Las células suspendidas en un diluyente conductor de la electricidad ,se arrastran a través de una apertura (orificio) en un tubo de vidrio

RECUENTO DE PLT Y RBCs

Impedancia VolumétricaN° Pulsos :proporcional al N° de célulasAmplitud del pulso :proporcional al tamaño de la célula

El numero de pulsos es proporcional al numero de células contadas

El tamaño del pulso de voltaje es proporcional al tamaño de la célula (volumen)

Lo que permite la discriminación y el conteo de células de tamaño especifico

INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS SANGUINEOS.

RBC`s

Plaquetas.

CLASIFICACION DE LOS IMPULSOS ELECTRICOS GENERADOS POR RBC Y PLT.

Los pulsos se reúnen y ordenan (canalizan) según su amplitud mediante analizadores de la altura de pulsos

Los datos se trazan en un grafico de distribución de frecuencias o histograma de distribución de tamaño con el numero relativo en el eje de las y el tamaño ( numero del canal equivalente al tamaño especifico) en el eje de las x

El histograma producido representa la distribución del volumen de las células contadas

Histograma de Eritrocitos

















Limite flotante para división de PLQ/RBC Media

MCV

Ancho de Distribución

Conteo por impedancia: RBC y PLT

50 100 150 200 250 300 350

MCV

Zona Microcitica.

Zona Macrocitica.

PLQ's

Linfocitos.

50 100 150 200 250 300 350

PLQ'sAncho de Distribución Eritrocítica.

Conteo por impedancia: RBC y PLT.

ADE – RDW – INDICE DE ANISOCITOSISLa amplitud de distribución eritrocitaria (RDW) se calcula a partir del histograma como el coeficiente de variación de la distribución del volumen eritrocitario. Con valores de referencia de 11.5-14 %El RDW es un índice de anisocitocis, que en realidad refleja la relación entre la desviación estándar y el VCMEl VCM es un promedio tomado de los datos de distribución eritrocitaria de tamaño.

¿Qué significa RDW?

“RDW – Ancho de la distribución de la curva de los eritrocitos ”

Dos fórmulas matemáticas usadas para describir la variación de tamaño de los eritrocitos (Anisocitosis).

RDW-CV

Definición: Es el coeficiente de variación alrededor de la media (X) correspondiente a la curva de distribución del volumen de los glóbulos rojosVR: 11.5 – 14 %

RDW-SD

Definición: Medida directa (en fl) del ancho de lacurva de los glóbulos rojos (RBC) Tomada 20%arriba de la línea base

El ancho es medido al 20% de la altura relativa. Aesta altura es donde se encuentra la mayorvariación de tamaños de las células

RDW-SD

Tamaño de los Eritrocitos en fl

20%

Alturarelativa


La curva más anchaRepresenta a la poblaciónCon mayor anisocitosis

50 100 150 200 250 300 350

Macrocitosis.

Conteo por impedancia: RBC y PLQ.

50 100 150 200 250 300 350

Macrocitosis.

MCV aprox. de 102 fl


50 100 150 200 250 300 350

Microcitosis.


50 100 150 200 250 300 350

Microcitosis.

MCV Aprox de 70 fl


FACTORES QUE PRODUCEN INTERFERENCIA

FACTORES PARÁMETROAFECTADO

Crioaglutinina GR ,VCM ,CHCM Aglutinaciòn de GR

Lipemia ,ictericia ,quilomicrones

Hb HbCM La turbidez afecta la lectura espectrofotomètrica

Hemólisis GR , Hto Gr lisados y no contados

GR resistentes a la lisis con Hb anormales

GB , Hb Gr (Hb : S,C,F) no pueden lisarse y se cuentan como GB

Microcitosis o esquistocitos

GR El tamaño eritrocitario < que el umbral

GR nucleados ,fragmento de Megacariocitos

GB Se cuentan como GB

Histograma de plaquetas.

2 fl Plaquetas

Límite para la zona de plaquetas.

Zona para cálculo del . VPM

Límite flotante para división de PLQ/RBC

35 fl

Histograma de plaquetas.

5 10 15 20 25 30 352

Histograma normal de plaquetas.

5 10 15 20 25 30 352

Histograma normal de plaquetas.El punto de partida debe ser 2 fl en la base del histograma.


5 10 15 20 25 30 352


El VPM es la media aritmética de la población de plaquetas.No será calculado en presencia de alertas de plaquetas.


5 10 15 20 25 30 352


El histograma debe hacerse asintótico con la horizontal hacia los 25-30 fl


ALARMAS PARA RBC Y PLT

RBC/MORPHLRIURILURI

PSEUDOAGLUTINACIÓN CON EDTA

IMPORTANCIA DEL FROTIS DE PUNTA DE AGUJA

RECUENTO VS ESTIMACIÓN

RECUENTO POR IMPEDANCIA DE

WBC

RECUENTO DE LEUCOCITOS El conteo se realiza en un transductor de Von Behrens. Los impulsos eléctricos detectados son clasificados y

almacenados en un histograma con canales de 1 fl de ancho

SOBREESTIMACIÓN POR PRESENCIA DE ERITROBLASTOS Ej: WBC 30.000 /mm3

200 eritroblastos por cada 100 GB

300 (WBC+EB)-----------10030.000 ---------------------x=10.000

Gb corregidos= Gb contador – (Gb contador x 100)(EB+100)

50 100 150 200 250 300 350

Histograma Normal de Leucocitos por Impedancia.

Conteo por impedancia: WBC.

50 100 150 200 250 300 350

Histograma Normal de Leucocitos por Impedancia. LIM MID GRAN


50100 150 200 250 300 350


Ubicación Normal del pico LIM es entre 50-75 fl


50 100 150 200 250 300 350


MID La región MID debe ser un valle entre las regiones LIM y GRAN.


ALARMAS

DOSAJE DE HEMOGLOBINASe utiliza el sobrante de la dilución con que se realizó el conteo de WBC.Método de la CianmetahemoglobinaSe realiza la lectura en la celda de hemoglobina a 540 nm con un blanco para cada muestra.El valor de absorbancia obtenido se interpola en la curva de calibración almacenada en el instrumento.

DISPERSIÓN ÓPTICA

Una corriente de muestra centrada en forma hidrodinámica se dirige a través de un cuarzo para flujo celular por el que pasa una fuente de luz centrada (un láser de helio neón polarizado en sentido vertical). La luz dispersada se divide en varios ángulos

Se utilizan varias combinaciones de estas mediciones para diferenciar y cuantificar las cinco subpoblaciones leucocitaria principales :neutrófilos ,linfocitos ,monocitos , eosinófilosy basófilos

Enfoque hidrodinámicoMinimiza la acumulación de proteínasElimina la circulación retrogradaReduce la irregularidad de la altura de pulsoReduce la perdida por pasaje coincidente

Enfoque analíticoIluminado por medio de un laser helio neón

Enfocado hidrodinámicamente a traves de una celda de flujo de diseño especial

Medición de las carácteristicas de dispersión óptica de la luz para las celdas individuales

Separación por dispersión polarizada con múltiples ángulos (M.A.P.S.S).

-La dispersión frontal de luz 0° :se usa para determinar el TAMAÑO CELULAR (FORWARD SCATTER)

-La dispersión ortogonal de 90° : para determinar la LOBULARIDAD CELULAR. (SIDE SCATTER)

-La dispersión de la luz en ángulo estrecho de 10°:se correlaciona con COMPLEJIDAD CELULAR (SIDE SCATTER)

-La dispersión de luz despolarizada de 90° (90D)para evaluar la GRANULARIDAD CELULAR.

El citograma MAPSS final muestra los eventos de celdas individuales los cuales se definen por medio del uso del color

TECNOLOGIA CVS

La muestra una vez tratada es dirigida a una celda de flujo (Flow cell) en la cual por el diseño hidrodinámico, los leucocitos se alinean y pasan formados uno a uno y en donde se realizan las siguientes mediciones

VolumenMediante impedancia de baja frecuencia se determina el

volumen de la célula Impedancia (resistencia a la cc de bajo voltaje)

ConductividadLa densidad interna de la célula es proporcional al

tamaño del pulso o al cambio de la señal de Radiofrecuencia RF(ola resistencia a la corriente magnética de alta

voltaje)

ScatterLa dispersión (scatter) de luz láser indica la estructura y

forma de la célula

Los cambios de voltaje de CC y RF pueden detectarse en forma simultánea

Pueden graficarse en forma comparativa la impedancia y la conductividad :se formaUn citograma de distribución bidimensional ,este trazado de dispersión muestra poblaciones celulares como cúmulos <por análisis computarizado se determinan los recuentos celulares

DF1: Volumen vs. Scatter

El trazado de dispersión de la función de discriminación DF1 del volumen vs dispersión de la luz muestra. una separación clara de Nt ,L y, Mo, Eo

Sysmex XS-1000i

Descripción del Cell Dyn 3200Tecnología óptica :PLT,WBC;RBCTecnología diferencial MAPSSReticulocitos

OTRAS TECNOLOGÍAS

Tecnología para HemoglobinaReactivo libre de cianuro Grupo hidrofóbico del SLS que se une a la molécula de la globina Ocurre un cambio de configuración Oxidación de Fe 2+ --> Fe 3+

Grupos Hidrofílicos de SLS se unen a Fe --> SLS-Hb

Fe 2+ Fe 3+Fe 3+

SLS

Sysmex XS-1000iTecnologíaEn los Xs el Hto se mide electrónicamente, basado en el principio de que el pulso producido cuando un Gr pasa a través de la apertura es proporcional al volumen de la célula

El Hto se determina comparando el volumen total o acumulado de Gr con el volumen de sangre completa en la dilución

Por Citometría de Flujo se obtiene información acerca de la composición y madurez celular

Dispersión lateral

Información del contenido de RNA y DNA

Información de la estructura interna

Tamaño de la célula

Dispersión frontal

Fluorescencia

Láser

Sysmex XS-1000iTecnología

Cuantificación de Gránulos InmadurosInformación útil sobre el diferencial extendido de leucocitos

IG:promielocitosmielocitosmetamielocitos

promielo mielo metamieloBlastos bandas segmentos

Maduración de neutrófilos

IG

Cuantificación de Gránulos InmadurosIG Master

Canal del diferencial

IG % , #

Normal

Dispersión lateral

Detección de los RBC resistentes a la hemólisis

Conteo óptico nucleado NOC

Análisis óptico de las plaquetasPor medio del uso de

un enfoque de dispersión óptica de la luz con ángulo dual se logra una buena separación de los GR y las plqAdemas , la

presencia de los cúmulos de plq se puede detectar en forma confiable

Medida de los eritroblastos

Los EB son contados y separados de los WBC basados en su tamaño y cantidad de fluorescencia

Recuentos de Reticulocitos

Método de Referencia: Azul de MetilenoVariación entre observadoresAltos coeficientes de variaciónLaboriosos

Métodos automatizadosAzul de metilenoFluorescentes

Canal reticulocitos - Fluorescente

Fl alta

Fl baja

Fl muy alta

Tinción: Polimetino: ARNOxazina: ADN

RET

WBC

RBC

RETSEARCH II (Diluyente + Colorante)

Canal de los reticulocitos

Utilidad Clínica - FIR.Confirmación de Anemia Aplástica.Permite la clasificación de anemias por su capacidad eritropoyética.Talasemia vs. deficiencia de Hierro.Anemia de los procesos crónicos.Hipoproducción vs. respuesta eritroide

temprana.Detección de implante correcto luego de transplante

Contenido de Hb de los reticulocitosRet-He

Reticulocitos con contenido de Hb<28pg HipocrómicosSon identificados con colorantes fluorescentes por la posición en el dispersograma de acuerdo con la fluorescencia y la luz dispersada frontalmente

Contenido de Hb de los reticulocitosRet-He

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