Harinosidad en Prunus persica: Un modelo para el estudio de cambios transcripcionales en los componentes de la pared celular durante la maduración de frutos. (Prunus persica mealiness: A model to study gene expression changes of cell wall components during fruit

ripening). Mauricio González-Agüero, Leonardo Pavez, Freddy Ibáñez, Mauricio González y Verónica Cambiazo. Laboratorio de Bioinformática y Expresión Génica. INTA, Universidad de Chile, Macul 5540, Santiago.

LABORATORIO DE BIOINFORMATICA Y EXPRESION

GENICA

INTA – UNIVERSIDAD DE CHILE

Proyectos:

•Genómica Funcional en Nectarines, Plataforma para Potenciar la Competitividad de Chile en Exportación de Frutas, FDI G02 P1001.

• Beca A. Stekel, Nestle-INTA.

Resumen

Procedimiento experimental

Resultados

Conclusiones

Introducción

A

B

C

DE

FG

H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A

B

C

DE

FG

H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Siembra

Genoteca

Mesocarpo de var. Loring

16.000 clones

• Cada membrana tiene 960 puntos (880 clones + 80 controles).

• Se sembró solo 1 vez cada clon en la membrana.

• Se sembró ~ 70 ng del producto de PCR. 960 puntos Clemson University

10 Placas de 96 pocillos Amplificación de 880 clones seleccionados

100 %

Verificación

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

2000bp

600bp

2000bp

600bp

C Metabolismo de pared celular ………………………………... 40 %*

Metabolismo de carotenoides y flavonoides ……………… 10 %

Metabolismo de clorofila ……………………………………… 5 %

Metabolismo de etileno ………………………………………... 15 %

Metabolismo de auxinas y ácido absicico …………………. 10 %

Genes relacionados con estrés ……………………………… 10 %

Genes de expresión constitutiva .…………………………… 10 %

B

Imagen Ubicación de la grilla

Intensidad neta

Selección de puntos

- Intensidad neta > 0

- Intensidad neta > 1SD Ruido

- Qcom > 0.8

- Área variable - Ajuste automático

(Int bruta – Ruido)

Filtros

Normalización Comparación tres muestras

NH v/s H

Coeficiente de Variación

CV < 0.5 entre réplicas

Test de t

NH v/s H

p < 0.05

Tamaño del punto: qtam = exp (- | A - A0 | / A0 )

Relación Señal-Ruido: qS-R = 1 – [ R1 / ( S + R1 ) ]

Variabilidad del Ruido local: qR1 = ƒ1 / CVR

Exceso de Ruido local: qR2 = ƒ2 { 1 – [ R / ( R + R0 ) ] }

Qcom = (qtam x qS-R x qR1 x qR2)0.25 Wang y cols, 2001. N Acid Res. 29: e75

ƒ1 = k normalización qR1

ƒ2 = k normalización qR2

Durante la maduración de frutos almacenados a bajas temperaturas, tienen lugar alteraciones fisiológicas que se manifiestan en una disminución del contenido de jugo dando como resultado un fruto harinoso. Modificaciones en la estructura de la pared celular durante el proceso de maduración serían claves para desencadenar harinosidad. Bajo el supuesto de que cambios en la abundancia relativa de genes relacionados con el metabolismo de la pared celular estarían involucrados en el desarrollo de harinosidad, en este trabajo presentamos un análisis de la expresión de múltiples genes, que permitió aproximarnos a los mecanismos que dan cuenta de esta alteración fisiológica.

La expresión de 880 genes fue examinada mediante hibridaciones en macroarrays con cDNAs representativos de duraznos no harinosos (NH) y duraznos harinosos (H),los resultados indican que el 46% de los transcritos cuyos niveles de expresión son consistentes en todas las replicas biológicas, se activan exclusivamente en la condición NH, y solo el 16% en la condición H. Del 38% restante (transcritos comunes a ambas condiciones) solo un 5% aumenta su abundancia en la condición harinosa, sugiriendo que este fenómeno sería consecuencia de una represión de genes durante la maduración. Se discutirá la implicancia de estos genes en la harinosidad.

Selección de cDNAs

blanco

Selección de sondas

RNA

mRNA

Productos de PCR

Membranas de

macroarray

cDNAs 32P

Hibridación

Exposición

Obtención de la imagen

Análisis de los datos

NH H

B

A

(No Harinoso) (Harinoso)

V/S

Réplicas

experimentales

Réplicas

biológicas

3 duraznos c/u

6 membranas c/u

0

5

10

15

20

25

30

35

NH_1 NH_2 NH_3 H_1 H_2 H_3

Muestras

% d

e ju

go

NH_1 NH_2 NH_3 H_1 H_2 H_3

% D

E J

UG

O

Figura 1: Procedimiento experimental. Se realizaron experimentos de hibridación en macroarrays, para lo cual se seleccionaron según su porcentaje de jugo 3 muestras no harinosas (NH) (frutos colectados después de la cosecha + shelflife) y 3 muestras harinosas (H) (frutos colectados después del packing + 15 días a 4ºC + shelflife)(gráfico en A). Por cada muestra se utilizaron 150 ng de mRNA para sintetizar sondas de cDNA marcadas con α32P-[dCTP]. Las sondas control y experimental fueron hibridadas en series de seis membranas (A). En el panel central se esquematiza el protocolo utilizado para realizar los ensayos de hibridación en macroarrays. En B a la izquierda se observa una imágen obtenida luego de la hibridación con una sonda control (NH) y a la derecha señales de hibridación obtenidas con una sonda experimental (H). En los recuadros pequeños se observan imágenes aumentadas de las membranas, en donde se observan diferencias relativas de expresión.

Figura 2: Selección de cDNAs blanco y configuración de las membranas de macroarrays. La producción y composición de las membranas de macroarrays se esquematiza en el panel A. Los cDNAs sembrados en las membranas fueron obtenidos de una genoteca adquirida en Clemson University Genomics Institute. De esta genoteca se seleccionaron 880 clones en base a las las características de secuencia de las proteínas codificadas por ellos (B). Esta selección se realizó utilizando un alineamiento tBLASTx de 3843 clones secuenciados por Clemson con la base de datos de CDS de Arabidopsis thaliana (http://www.arabidopsis.org). Los insertos contenidos en los clones seleccionados fueron amplificados por PCR a partir de colonias bacterianas usando los partidores universales T3 y T7. Las condiciones de amplificación fueron: 15 min a 94ºC, 35 ciclos de 1 min a 94ºC, 1 min a 55ºC y 5 min a 72ºC. Todos los productos amplificados fueron analizados mediante electroforesis en geles de agarosa. Las reacciones que presentaron un único producto de amplificación (C) fueron transferidas a placas de 96 pocillos para luego ser sembradas en las membranas de macroarrays.

Figura 3: Protocolo de análisis de los datos de hibridación. Las membranas fueron expuestas en pantallas Phosphor screens (Kodak) por 72-96 horas y escaneadas en el equipo Personnal Molecular Image FX (BioRad). En el recuadro de la izquierda se muestra una imagen representativa obtenida con el programa Quantity One (BioRad). Las señales de intensidad fueron cuantificadas utilizando el programa VersArray Analyzer software (BioRad). La intensidad neta para cada punto de siembra se determinó como la diferencia entre la intensidad bruta y el ruido local asociado a ese punto. Para evaluar la eficiencia en la adquisición de señales de hibridación y la reproducibilidad en los eventos de hibridación para cada grupo de seis membranas, se calcularon diferentes parámetros estadísticos. Para cada membrana hibridada con las sondas NH y H se determinó la razón señal/ruido y el número de genes con intensidad neta mayor a cero. La calidad de las señales obtenidas fue evaluada según lo descrito en Wang et al (2001), aceptando un valor de calidad Qcom>0,8. Las señales de buena calidad fueron normalizadas por el control heterólogo dap, el cual fue sembrado en las membranas y adicionado en una cantidad conocida e igual en todos los ensayos de hibridación. Posteriormente, se analizó la calidad de las réplicas de cada punto de hibridación calculando su coeficiente de variación (CV), aceptándose sólo aquellos genes que presentaran un valor de CV menor a 0,5. Por último se determinaron diferencias significativas (p<0,05) de expresión de genes entre las condiciones NH y H calculando el estadístico t (Microsoft Excel).

Figura 4: Análisis porcentual del resultado de las hibridaciones. Un análisis preliminar de los resultados indica que del total de genes analizados en el macroarray, 91 de ellos (10,3 %) no se expresan en ninguno de los 6 duraznos (A), lo que indicaría que estos genes serían propios de la variedad con que se elaboró la genoteca (Loring), o bien que su abundancia se encontraría bajo el límite de detección de nuestro protocolo. 789 genes (89,7 %) son expresados al menos en 1 de los duraznos analizados (A), este resultado confirma que la genoteca de Clemson, efectivamente, representa una colección de transcritos expresados en un durazno maduro. Este conjunto de genes fue utilizado para analizar los cambios en la abundancia relativa de sus transcritos en las muestras de Prunus pérsica expuestas a las dos condiciones de post-cosecha. De los 789 genes, 64 de ellos (8,0 %) son expresados en los 6 duraznos analizados (B), por lo tanto, la expresión de estos genes no es dependiente de las diferencias individuales entre duraznos ni de las condiciones de manejo de post-cosecha; en cambio, 79 genes (10,0) solo se expresan en 1 de los 6 duraznos (B), ellos representarían variaciones individuales entre las muestras de cada condición experimental.

Genes expresados solo en NH...... 46 %

Genes expresados solo en H........ 16 %

Genes expresados comunes......... 38 %

A

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

NH H

B

NH H

% d

e g

ene

s

C Actividad inhibidor de

proteasas1,4%

Unión a actina1,4%

Actividad ATPasa1,4%

Actividad oxidoreductasa

4,2%

Unión a iones4,2%

Actividad liasa1,4%

Actividad molecular estructural

1,4%

Actividad catalítica7,0%

Actividad de transporte

8,5%

Actividad peptidasa12,7%

Actividad transferasa9,9%

Unión a nucleotidos9,9%

Actividad Proteína kinasa9,9%

Actividad hidrolasa8,5%

Unión a hidratos de carbono

1,4%

Actividad factor de transcrición

1,4%

Función Desconocida15,5%

Figura 5: Clasificación de los genes que presentan una expresión diferencial entre los estados H y NH. Del total de genes diferencialmente expresados entre los estados NH y H, 51de ellos presentan niveles de expresión consistentes en todas las replicas biológicas (p<0,05). De ese grupo un 46% de los transcritos se activan exclusivamente en la condición NH, y solo el 16% en la condición H (A). Del 38% restante (transcritos comunes a ambas condiciones) solo un 5% aumenta su abundancia en la condición H (B), mientras que un 95% ve disminuida su expresión en la misma condición, sugiriendo que este fenómeno sería consecuencia de una represión de genes durante la maduración. La clasificación de los genes que presentaron cambios en su expresión entre ambos estados (C), fue realizada utilizando el algoritmo Blastx contra la base de datos de InterProScan con la finalidad de encontrar dominios proteicos que den cuenta de la funcionalidad de las proteínas codificadas por ellos. Con esta información asignamos una función putativa para cada uno de estos productos génicos de acuerdo a los criterios del Gene Ontology Consortium (GO). El grafico en C muestra el porcentaje de genes a cuyos productos se les atribuyen esas funciones moleculares.

89.7 %

10.3 %

A 91 genes no se expresan en ninguno

de los 6 duraznos

789 genes son expresados al menos en 1 de los duraznos

B 79 genes solo

se expresan en 1 durazno

64 genes son expresados en los 6 duraznos

Uno de los principales problemas a los que se ve expuesta la fruta de exportación de Chile se deriva del prolongado tiempo de almacenamiento y transporte a mercados distantes. Esto genera problemas en la calidad de la fruta, siendo la harinosidad uno de los signos más claros, esta alteración se manifiesta en la falta de jugo, lo que otorga a la fruta una consistencia seca e insípida. La harinosidad se desarrolla en dos etapas: una primera etapa generada por el almacenamiento a bajas temperaturas y una segunda alcanzada luego de un periodo de maduración. El reconocimiento de un durazno (Prunus persica) que ha adquirido el fenotipo harinoso sólo es posible al término de la cadena de comercialización del producto, es decir, cuando la fruta es degustada por el consumidor. Además de esta forma subjetiva de determinar la harinosidad de un fruto es posible realizar una medición objetiva a través de la determinación del porcentaje de jugo que contiene un fruto, mediante una técnica implementada en nuestro país por el laboratorio de Post-Cosecha INIA la Platina.

En la actualidad, se postula que la falta de jugo en frutos harinosos se debe a una indisponibilidad del agua, más que a una pérdida de ella. El mecanismo propuesto involucra una gelificación mediada por pectinas de la pared celular que secuestrarían a las moléculas de agua. Las evidencias señalan que la actividad de algunas enzimas que degradan componentes de la pared celular se modifica durante el desarrollo de la harinosidad, produciéndose un desbalance en la degradación de pectinas, como consecuencia de una serie de cambios que alteran el proceso normal de maduración y ablandamiento del fruto.

Hasta la fecha desconocemos las causas de estas alteraciones y muchos de los componentes involucrados en ellas. Por ejemplo, en Arabidopsis thaliana se han identificado al menos 1.000 genes relacionados con la estructura y metabolismo de la pared celular, lo que nos sugiere la complejidad y diversidad funcional de sus constituyentes. En esta perspectiva, un análisis global de los cambios que ocurren durante la génesis de este desorden podría entregarnos información relevante que permita identificar los componentes y vías metabólicas alteradas en el fenotipo harinoso. Nuestra propuesta es que las alteraciones que experimenta Prunus persica durante la adquisición del fenotipo harinoso, se ven reflejados en cambios en el patrón de expresión génica del fruto.

NH_1 NH_2 NH_3 H_1 H_2 H_3 NH H

I 100

80

60

40

20

0

Nº

de m

olé

cu

las

/Nº

de

mo

léc

ula

s d

e t

ub

ulin

a

100

80

60

40

20

0

III

NH H

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0 NH_1 NH_2 NH_3 H_1 H_2 H_3

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

Nº

de m

olé

cu

las

/Nº

de

mo

léc

ula

s d

e t

ub

ulin

a

II

NH_1 NH_2 NH_3 H_1 H_2 H_3

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0

Nº

de m

olé

cu

las

/Nº

de

mo

léc

ula

s d

e t

ub

ulin

a

NH H

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0 NH_1 NH_2 NH_3 H_1 H_2 H_3 NH H

IV

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0 Nº

de m

olé

cu

las

/Nº

de

mo

léc

ula

s d

e t

ub

ulin

a

V

NH H

0,05

0,04

0,03

0,02

0,01

0,00 NH_1 NH_2 NH_3 H_1 H_2 H_3

0,05

0,04

0,03

0,02

0,01

0,00

Nº

de

mo

léc

ula

s/N

º d

e m

olé

cu

las

de

tub

ulin

a VII

NH H

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0,0

NH_1 NH_2 NH_3 H_1 H_2 H_3

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0,0

Nº

de

mo

léc

ula

s/N

º d

e m

olé

cu

las

de

tub

ulin

a

VI

NH H

1,50

1,45

1,40

1,35

1,30

1,25

1,20

1,15

1,10

1,05

1,00

NH_1 NH_2 NH_3 H_1 H_2 H_3

1,50

1,45

1,40

1,35

1,30

1,25

1,20

1,15

1,10

1,05

1,00

Nº

de

mo

léc

ula

s/N

º d

e m

olé

cu

las

de

tub

ulin

a VIII

NH H

18

16

14

12

10

8

6

4

2

0

NH_1 NH_2 NH_3 H_1 H_2 H_3

18

16

14

12

10

8

6

4

2

0 Nº

de

mo

léc

ula

s/N

º d

e m

olé

cu

las

de

tub

ulin

a

Figura 6: Verificación de la expresión de 8 genes que disminuyen su expresión en la condición Harinosa. Mediante PCR cuantitativo en tiempo real, se determinó la abundancia relativa de cada uno de los transcritos (I a VIII) en las 3 muestras NH y H utilizadas para los ensayos de macroarrays. Cada una de las figuras representa la abundancia relativa medida para un gen, a la derecha de la figura se grafica la cantidad normalizada de moléculas detectadas para cada transcrito, en barras azules se observan las muestras NH y en barras rojas las H. A la izquierda de cada figura se grafica el promedio de moléculas calculado para cada condición. Panel I: clon 2F12, Pectin lyase activity; II: clon 3D10, structural molecule activity; III: clon 5D08, Pectate lyase activity; IV: clon 3C12, cell wall metabolism; V: clon 1H06, Cellulose-binding activity; VI: clon 6E09, Ras GTPase activity; VII: 2C09, beta-glucan synthase activity; VIII: clon 4G06, Ras GTPase activity. En general, podemos observar una mayor representatividad de los transcritos de cada gen en las muestras NH en comparación con las muestras H, lo que confirma los datos obtenidos mediante los experimentos de hibridaciones en macroarrays. Observamos nuevamente una variación individual en la expresión de los genes dentro de cada grupo de muestras NH y H.

• La estrategia de hibridación en macroarrays de cDNA permitió identificar 51 genes diferencialmente expresados en Prunus persica, los cuales fueron verificados mediante PCR en tiempo real.

• La comparación de los patrones de expresión génica entre frutos, muestra que del total de genes analizados (789), un 10% de ellos se expresan solo una vez en la población (n=6); mientras que, un 8% del total se expresa en todos los frutos.

• 42 genes disminuyen su expresión en las muestras de frutos harinosos, sugiriendo que el fenómeno de harinosidad en Prunus persica involucra la represión de genes del fruto almacenado a bajas temperaturas.