Guide Des Colonne Hplc

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GUIDE DES COLONNES HPLC

Supports Et Modes Chromatographiques

SUPPORTS :La Silice est le support le plus utilis. Sa rsistance mcanique est trs importante. On peut modier facilement sa surface chimique et sa polarit pour lutiliser dans beaucoup de modes chromatographiques. Normalement, la silice se dissout dans leau un pH > 6,5 et son greffage est instable pH < 2,5. Cependant, les nouvelles gnrations ont une gamme de pH tendue de 1,5 10. Le Polymre a moins de restriction au niveau du pH mais une rsistance mcanique faible. Son efcacit est moins importante que la silice pour la sparation des petites molcules mais quivalente pour les grandes molcules (protines et polymres de synthse). Le titane (TiO2) est stable dans une large gamme de pH et aux tempratures leves. A la diffrence de la silice sa surface est alcaline ce qui est un avantage pour lanalyse des composs basiques. Cependant, les sparations et ses performances sont gnralement faibles en raison dune surface spcique moindre. Lalumine a une meilleure stabilit au pH que la silice mais sa surface ne peut tre modie facilement. Le carbone graphite a une rsistance mcanique et une gamme de pH importante mais ne peut tre modi. Cest un support cher qui nest utilis que pour quelques applications ou il a une slectivit unique. Le zirconium (ZrO2) a lavantage davoir une slectivit unique combine une extrme stabilit chimique et thermique (plus de 200C). Cependant, ce support nest pas toujours reproductible.

MODES DE SPARATIONS :Soluble dans leau

Phase Inverse (Pores troits)

Poids Molculaire < 5000

Echange dions (Pores troits)

Soluble dans les solvants organiques

Phase normale

ECHANTILLON

Phase Inverse (Pores troits)

Soluble dans leau

Echange dions (Pores troits)

Poids Molculaire >5000

Filtration de Gel

Interaction Hydrophobe Soluble dans les solvants organiques

Permation de Gel

A.I.T FRANCE

Supports Et Modes Chromatographiques

GUIDE DES COLONNES HPLC

CHOIX DES COLONNES PAR MODE CHROMATOGRAPHIQUE :

Phase Inverse (Pores troits)

Le plus populaire Silice pores troits ou autres supports Eluants : Mthanol eau Actonitrile eau Chimie : C18, C8, C6, Phenyl, C4, C3, C2, C1, CN, NH2.

ACE, Brownlee, Capcell Pak, Daiso, Develosil, Exsil, Genesis, Hamilton, Hypersil, Inertsil, Kromasil, Lichrosorb, Lichrospher, Nucleosil, Partisil, Vydac, Spherisorb, YMC, Zorbax.

Echange dions (Pores troits)

Silice pores troits ou polymre Echangeur de cations forts SCX Echangeur danions forts SAX Echangeur dion indpendant du pH

Capcell Pak, Exsil, Hamilton, Nucleosil, Partisil, Spherisorb,

Phase normale

Eluants organiques Phase stationnaire polaire : - Silice - Alumine : plus rtentive - Diol : Moins polaire - Amino : Plus polaire - NO2 : Transfert de charge

ACE, Cosmosil, Daiso, Exsil, Hypersil, Inertsil, Kromasil, Lichrosorb, Lichrospher, Nucleosil, Partisil, Vydac, Spherisorb, YMC, Zorbax.

Phase Inverse (Pores troits)

Silice large pore Eluants : Actonitrile eau (TFA) Chimies : C18, C8, C4, Phenyl, CN

ACE, Brownlee, Daiso, Inertsil, Kromasil, Nucleosil, Vydac, Spherisorb, YMC, Zorbax.

Echange dions (Pores troits)

Silice ou polymre large pore Echange fort ou faible Anion et Cation

BioBasic, TSK, Hamilton, Jordy, Vydac

Filtration de Gel

Silice ou polymre large pore Relation entre la taille des pores et le poids molculaire

TSK, Zorbax, BioRad, Jordy

Interaction Hydrophobe

Silice large pore Chimie : C4, C3, C2, C1 Eluant : Tampon, sels inorganiques en gradient

Cosmosil, Daiso, Kromasil, TSK,

Permation de Gel

Styrne-divinylbenzne Large chelle de pore

Reprogel, TSK

www.aitfrance.fr

GUIDE DES COLONNES HPLC

Caractrisations des phases

PHASES INVERSES :La performance des phases inverse dpend de nombreux paramtres. Deux proprits sont importantes car elles dterminent le choix des colonnes cest lhydrophobicit et la polarit. LHydrophobicit : La force des interactions hydrophobes peut tre mesure par la rtention des molcules neutres (non polaires). Le pourcentage de carbone dun support est une information simple mais trs utile pour caractriser une phase. La gure 1 montre que laugmentation de la rtention est en relation avec la longueur de la chane carbone (taux de carbone). La diffrence de rtention entre les colonnes C18 de diffrentes fabrications est souvent trs visible. La polarit : Le second point important est lactivit des silanols souvent compar en terme de polarit. Ce facteur peut tre dtermin par comparaison de la rtention dun compos polaire (interactions hydrophobes et ioniques) et de celle dun compos neutre (seulement interactions hydrophobes). Les phases ultra pures dsactives pour les bases : Ces dernires annes beaucoup de nouvelles phases ont t introduites. Le niveau des impurets mtalliques a t diminu en dessous de la barre des 10 ppm. En rsulte une baisse de la polarit de la silice et labsence de groupements silanols rsiduels. Coupl un greffage plus efcace et plus reproductible cela donne des phases nouvelles gnrations adaptes la sparation des composs basiques. De plus, lassociation dune chane carbone et dun compos polaire (polar embedded) apporte une slectivit diffrente et des proprits jamais atteintes (voir phase stable leau ci-dessous).

Figure 1 : Augmentation de la rtention avec la longueur de la chane carbone. Silice greffe C4 (taux de carbone : 8%)

Silice greffe C8 (taux de carbone : 11%)

Silice greffe C18 (taux de carbone : 17%)

Colonnes : 150 x 4,6 mm Eluants : Mthanol / eau (80/20) Dbit : 1,0mL/min Temprature : 37C Dtection UV 254nm

A.I.T FRANCE

Caractrisations des phases

GUIDE DES COLONNES HPLC

LISTE DES DIFFRENTES GNRATIONS DE SILICE GREFFE C18: SILICE IRREGULIERE : Alphabond (Alltech), RSil (Alltech), Versapak (Alltech), Lichrosorb (VWR), Bondapak (Waters), Partisil (Whatman). SILICE SPHERIQUE (TYPE A) : Zorbax (Agilent), Adsobosphere (Alltech), Alltima (Alltech), Chromegabond (ES Industries), Vydac (GraceVydac), Nucleosil (Macherey-Nagel), Aqua (Phenomenex), Ultracarb (Phenomenex), Allure (Restek), Supelcosil (Supelco), Hypersil (Thermo), Microsorb (Varian), Omnisphere (Varian), Lichrosphere (VWR), Superphere (VWR), Novapak (Waters), Spherisorb (Waters), Symmetry (Waters), Partisphere (Whatman), Jsphere (YMC), ODS-A (YMC). SILICE SPHERIQUE ULTRA PURE (TYPE B) : ACE (ACT), Zorbax RX, SB, Eclipse, Extend (Agilent), Apollo, Prevail, Alltima HP (Alltech), Daisogel A (Daiso), Acclaim (Dionex), Kromasil (Eka Chimie), Chromegabond WR (ES Industries), Inertsil (GL Sciences), Denali, Everest (Vydac), Nucleodur (Macherey-Nagel), Cosmosil (Nacalai Tesque), Luna, Synergi, Jupiter (Phenomenex), Pinnacle II (Restek), Discovery (Supelco), Hypersil Gold, Hypurity (Hypersil), Pursuit (Varian), Purosphere (VWR), XTerra (Waters), Pro C18 (YMC). SILICE SPHERIQUE ULTRA PURE AVEC SITE POLAIRE : ACE AQ (ACT), Zorbax Bonus RP, SB-Aq (Agilent), Alltima HP Amide, EPS (Alltech), Daisogel B (Daiso), Acclaim PA (Dionex), Aquasep, Protect RP (ES Industries), Inertsil ODS-EP (GL Sciences), Pyramid (MachereyNagel), Fusion Hydro, Polar RP (Phenomenex), Ascentis (Supelco), Hypurity Aquastar (Thermo), Polaris (Varian), Atlantis, SymmetryShield (Waters), Hydrosphere (YMC). SILICE MODIFIEE : Chromolith (VWR) : silice monolithique Hypercarb (Thermo) : silice enrobe dun polymre de carbone SILICE ULTRA PURE HYBRIDE (TYPE C) : Gemini (Phenomenex), XTerra (Waters), Cogent Bidentate C18 (Microsolv).

COMPARAISON DE LHYDROPHOBICIT ET DE LA POLARIT DES DIFFRENTES PHASES C18 :

FAIBLEACE CN, Hypersil CPS, Inertsil CN-3, Spherisorb CN, Zobax TMS, Zorbax SB CN, Kromasil CN

MOYENACE Phenyl, Hypersil MOS, Inertsil Ph-3, Kromasil Phenyl, Spherisorb C8, Zobax C8, Zorbax SB Phenyl

FORTExsil ODS et ODS 1, Lichrospher RP18, Nuclosil C18, Sphrisorb ODS1 et 2, Zorbax ODS

FAIBLE

Polarit

Inertsil C4, Zorbax SB C3, Vydac 300P

Lichrospher RPSelect B YMC basic Zorbax Rx C8 Zorbax SB C8

Hypersil BDS C18 Inertsil ODS Inertsil ODS 2 Nucleosil C18 AB Zorbax Rx C18 Zorbax SB C18

MOYEN

ACE C4, Kromasil C1, Kromasil C4,, Vydac 300M, YMC ProC4

ACE C8, Kromasil C8, YMC ProC8 Zorbax XDB C8

ACE C18 Develosil ODS-UG Hypurity C18 Kromasil C18 YMC ProC18 Zorbax XDB C18

FORT

Hydrophobicit

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GUIDE DES COLONNES HPLCPHASES INVERSES STABLES LEAU :

Caractrisations des phases

(la colonne idale : ACE C18 AQ) Introduction Pour avoir une bonne sparation des composs solubles dans leau et trs polaires, on utilise gnralement moins de 5% de solvant organiques. Avec de telle proportion de solvant aqueux, les temps de rtention diminuent vite et la reproductibilit est mauvaise. Les phases C8 et C18 traditionnelles se dgradent rapidement, les chanes carbones se couchent sur elles-mmes et deviennent inaccessibles. Phases stables leau Ce problme est rsolu en ajoutant un site polaire sur la chane carbone (voir gure suivante) ou en Endcapping. Ces deux approches avec celle dutiliser une C30 constituent la solution pour travailler dans 100% de phase aqueuse. Bonne rtention et rsolution des composs polaires Contrairement aux phases traditionnelles greffes, les phases polaires sont trs rsistantes aux conditions aqueuses (pendant plusieurs semaines) et ne perdent pas leur rtention. Elles ont une excellente reproductibilit, amliore la nesse des pics et sont adaptes aux composs acides, basiques et amphotres. Slectivit diffrente Les phases C18 dpendent principalement des interactions hydrophobes entre lanalyte et la phase stationnaire. La