UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE

MEDICINA

CATEDRA DE BIOQUIMICA

GUA DE PRCTICAS DEL CURSO DE BIOQUIMICA

PARA LOS ALUMNOS DE MEDICINA 2015-I

ELABORADO POR: Dra. SILVIA SUAREZ CUNZA

Mg. LUIS CLEVER ARIAS CAYCHO

2015

NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO ANTES DE LA PRCTICA

1. Estudie cuidadosamente el protocolo que corresponda antes del comienzo de cada prctica. La introduccin que el profesor dicte al inicio de la misma ser breve y muy general, servir para resolver las posibles dudas que se tenga al respecto.

2. Se pasar lista al ingresar al laboratorio para comprobar la asistencia a la prctica, por lo que se pide puntualidad. La tolerancia ser de 5 minutos, luego de ese lapso de tiempo no se podr ingresar al laboratorio, por lo tanto se le considerara como una inasistencia, y no tendr derecho a nota de informe de esa prctica.

3. Tenga en cuenta las indicaciones de los profesores sobre el uso del material y equipo de laboratorio, as como el orden, limpieza y seguridad que debe mantenerse.

4. Por cada prctica de laboratorio, el grupo de prcticas por mesa presentar un nico INFORME DE PRACTICA. Debindose presentarlo al ingresar a la siguiente prctica en el horario y grupo respectivo. (Excepto, lgicamente en la primera prctica)

5. Las inasistencias a las prcticas de laboratorio NO SON RECUPERABLES EN NINGUNO DE LOS GRUPOS, por lo tanto dichas faltas debern de ser justificadas en el plazo mximo de una (01) semana.

6. El alumno (a) ingresar al laboratorio con el mandil puesto y abotonado; en caso contrario no se le permitir el ingreso.

DURANTE LA REALIZACIN DE LA PRCTICA

1. Realizar las prcticas de laboratorio con el debido inters y responsabilidad. 2. El alumno (a) deber ocupar la mesa de trabajo que se le ha asignado durante

todo el semestre acadmico. 3. Por mesa de trabajo, se nombrar un responsable del material y equipo. 4. Al iniciarse la prctica, el responsable de mesa canjear su carn universitario,

por el material y reactivos a utilizarse en la prctica.

DESPUS DE LA REALIZACIN DE LA PRCTICA

1. Al final de la prctica, se proceder a enjuagar el material usado antes de entregarlo.

2. Solo en estas condiciones, el responsable de mesa lo devolver a la persona encargada de laboratorio y proceder a recibir su carn.

3. El laboratorio deber quedar completamente limpio, las mesas secas y limpias, debiendo arrojar todos los desechos al tacho de basura.

INDICACIONES GENERALES

1. Las pertenencias no deben ser colocadas en las mesas de trabajo, su cuidado

es de entera responsabilidad de cada alumno(a). 2. En caso de dao, deterioro o prdida del material y equipo, el responsable de

mesa informar del hecho al profesor, y todo el grupo asumir la responsabilidad del dao, debiendo repararlo en la brevedad posible, mximo de una (01) semana despus del incidente. En caso de incumplimiento el informe no ser evaluado.

ELABORACIN DEL INFORME DE LABORATORIO

REGISTRO DE LOS RESULTADOS: Lo ms conveniente es usar un cuaderno para ese fin o archivar hojas numeradas en un flder. A continuacin se sugiere un orden de presentacin que es el encontrado en la mayora de artculos bioqumicos que se publican: Ttulo: Todos los ensayos llevan un ttulo que debe aparecer en la parte superior de la hoja, debe ser conciso pero completo en forma tal que se entienda claramente el objeto del experimento. Objetivos: Debe redactarse en forma clara y concisa, debe reflejar lo que se va a demostrar en la ejecucin del protocolo de prctica. Materiales y Equipos: Debe hacerse una lista de reactivos y equipos necesarios. En caso de reactivos deben evitarse los nombres de fbrica, para esto se deben utilizar nombres genricos. Mtodo o Procedimiento: En esta seccin se describe exactamente lo que usted realiz en el laboratorio, en el mismo orden y evitando que sea solo copia de un libro o gua de prcticas. Puede ayudarse con diagramas de flujo, cuadros o grficos que sean de su ingenio. Al describir debe usarse tiempo pasado y forma impersonal: Por ejemplo Se tomaron 5 mL de H2SO4 que fueron agregados a 2 mL de H2O." La descripcin del experimento debe ser concisa, pero debe suministrar suficiente informacin para que ser reproducible. Resultados: Debe consignarse estrictamente lo que se obtuvo como resultados. Se deben dar datos completos de sus resultados sea que estos fueron los esperados o no. En caso de haberse obtenido resultados inesperados, estos deben ser analizados exhaustivamente desde dos perspectivas, el primero considerando la parte operativa, es decir considerando la destreza del o los operadores, as como la calidad y condiciones de reactivos y equipos; en segundo lugar considerando el resultado como verdadero y por tanto un resultado sospechoso clnicamente. Discusin y Conclusiones: La discusin no debe ser una repeticin de los resultados sino un argumento lgico basado en el anlisis de los resultados explicando el producto de la prctica sea este el esperado o no. Siempre se debe enunciar al menos una conclusin y debe ser concisa y precisa. Bibliografa consultada: Enumerar en orden alfabtico la bibliografa siguiendo las reglas de Vancouver.

PRACTICA N 01

FOTOCOLORIMETRIA COMPETENCIAS PROCEDIMENTALES: Al finalizar esta prctica, el alumno:

1. Explica la ley de Lambert y Beer y sus limitaciones. 2. Construye una curva de calibracin. 3. Aplica los dos mtodos de clculo de la concentracin de una muestra

problema. INTRODUCCIN: Fotocolorimetria es la medida de la luz absorbida por una solucin coloreada empleando el fotocolormetro. Si la solucin no tiene color, es posible inducirle color empleando reactivos. Si no fuera posible se debe emplear un espectrofotmetro. La diferencia entre ambos equipos es que el fotocolormetro mide en la regin visible y el espectrofotmetro mide en la regin ultravioleta y visible. Esta medicin permite la cuantificacin de sustancias. El fundamento de ambos equipos es el mismo y est basado en la medicin de la intensidad de la luz monocromtica transmitida a travs de una solucin, ya sea que se trate de sustancias naturalmente coloreadas o que se has hecho de tan calidad mediante reacciones qumicas adecuadas en caso se disponga solo de fotocolormetro. La mayora de los cuerpos en solucin tienen una capacidad de absorcin selectiva sobre determinadas radiaciones luminosas, cuando sta absorcin se realiza en la zona espectral visible, las soluciones las ve el observador de un color que es producido por las radiaciones que no has sido absorbidas. FUNDAMENTOS FISICO QUIMICO: Cuando un haz de luz (Luz, Incidente, I0) atraviesa una solucin, una parte de la radiacin queda absorbida por las molculas del soluto coloreado, sufriendo una reduccin de su intensidad (Luz Transmitida, It), proporcional a la capacidad de absorcin de dicha molcula, otra parte de la radiacin se pierde por fenmenos fsicos como reflexin, refraccin y difraccin de la luz. IO It

Luz Incidente Luz Transmitida La longitud de onda en la que las molculas de dicha sustancia absorbe con mayor intensidad la luz, se denomina Longitud de mxima absorcin o Lambda mxima.

Si consideramos que cada molcula absorbe una determinada cantidad de luz, la intensidad de la luz transmitida por una solucin disminuir en relacin con el nmero de molculas que si interpongan entre la fuente luminosa u el observador. Este nmero vara de acuerdo con la concentracin del soluto y el espesor del recipiente que contiene la solucin, estos factores estn considerados en la Ley de Lambert y Beer, que rige los principios de la colorimetra y cuyas formas de expresin son:

..1)/(log ODAcII to

Dnde: Io = Intensidad de la Luz Incidente. It = Intensidad de la Luz Transmitida.

= Coeficiente de Extincin Molar. Valor constante dependiendo de la naturaleza de la sustancia y de la longitud de onda. l = Espesor del recipiente en cm.

C = concentracin de la solucin A = D.O = Absorbancia = Densidad ptica = Extincin La Absorbancia (A) aumenta conforme disminuye la Transmitancia (T) y la relacin entre ambas es logartmica. FUNDAMENTO DE LA FOTOCOLORIMETRIA La luz que llega a la celda fotoelctrica genera una corriente elctrica en proporcin directa a la luz incidente. Esta seal elctrica pequea es incrementada por un amplificador, y la seal amplificada llega a un galvanmetro calibrado a una escala logartmica que da directamente las lecturas en absorbancia. En los fotocolormetros se efecta una seleccin de la longitud de onda en la que se produce la mayor absorcin mediante el uso de un prisma que descompone el espectro de luz blanca, y para eliminar el factor que depende del espesor del recipiente, se usan celdas especiales de longitud estndar. La medida de la densidad ptica de las soluciones se ven una escala expresada en unidades logartmicas que van de 0,000 2,000, el 0,000 corresponde 100% de transmite es decir una absorcin igual a cero y el 2.000 correspondiente a una absorcin del 100% y no se transmite luz. Se coloca primero la solucin blanco, suele ser agua destilada, y se ajusta el galvanmetro a una absorbancia de cero. Luego se coloca la solucin problema y se lee directamente la absorbancia. CALCULO DE LA CONCENTRACIN DE UNA SOLUCIN PROBLEMA Para calcular la concentracin de una solucin problema con el empleo de un fotocolormetro. Existen dos formas:

A. Mtodo de la curva estndar o curva de calibracin. B. Factor de calibracin.

A. METODO DE LA CURVA ESTNDAR: Este mtodo consiste en utilizar varios estndares de concentraciones conocidas y progresivas para luego construir un grfico en un sistema de coordenadas en el que se colocan las lecturas de absorbancia en las ordenadas (Eje Y) y las concentraciones en las abscisas (Eje X). En la recta obtenida (Funcin lineal), se puede interpolar la Absorbancia o Densidad ptica de la muestra problema, trazando una perpendicular al eje X y de esa manera se halla la concentracin de la muestra problema.

B. FACTOR DE CALIBRACIN (Fc): El factor de calibracin es un trmino que relaciona la masa de una sustancia o la concentracin de la misma con su Absorbancia, es decir la intensidad de luz que absorbe una sustancia de concentracin conocida estndar o patrn. Matemticamente es la inversa de la pendiente de la curva de calibracin. Puede expresarse en peso (FCw) o en concentracin (FC[]), siendo para el primer cas el peso que existe de la sustancia que da dolor en el tubo que se est midiendo la absorbancia. As:

FC w = W Estndar/ Abs Estndar

FC [ ] = [estndar/ Abs estndar Donde: W estndar = Peso del estndar en el tubo de reaccin Abs estndar = Absorbancia del tubo estndar [Estndar] = Concentracin del estndar. Con el factor de calibracin se puede fcilmente determinar la concentracin de una muestra desconocida o problema (MP), conociendo su Absorbancia. Si la muestra problema y el estndar son procesados de la misma manera se podr usar directamente la siguiente frmula: [MP] = AMP FC [ ] (1) Si la muestra problema sufre diluciones previas se encontrara el Factor de dilucin (Fd) que es matemticamente la inversa de la dilucin y esta a su vez es:

Dilucin: volumen MP / volumen total Dnde: Volumen MP = volumen de la muestra problema tomada para hacer la dilucin. Para este segundo caso cuando se quiere saber la concentracin de una muestra problema se proceder usando la siguiente frmula:

[MP] = Abs MP x FC [ ] x Fd (2) Donde: Abs MP = Absorbancia de la muestra problema. FC = Factor de calibracin Fd = Factor de Dilucin [MP] = Concentracin de la muestra problema

Cuando la muestra problema y el estndar tienen diferentes procesamientos o son medidos en diferentes proporciones en los tubos de reaccin, se recomienda usar la siguiente frmula:

[MP] = Abs MP x FC w x (100/VR) (3) Donde: VR = volumen real de la muestra en el tubo de reaccin. La concentracin de la muestra problema queda expresada en mg/dL o g/dL dependiendo de las unidades de W en unidades qumicas de molaridad (mol/L,

mol/L, etc.) PROCEDIMENTOS EXPERIMENTALES Los ensayos a realizar en la prctica son dos y consistirn en medir las absorbancias en cantidades creciente y decreciente. A.- AZUL DE METILENO - AUMENTO DE LA ABSORBANCIA Preparar la siguiente batera de tubos: Solucin Stock: Azul de metileno 6 mg/L

Tubos N 1 2 3 4

Azul de metileno 6 mg/L 0,5 1 1,5 2

ml. Agua destilada 3,5 3 2,5 2

Concentracin mg/L

En el espectrofotmetro leer las absorbancias de los 4 tubos a 660nm.

Lectura a 660 nm.

Con los datos obtenidos: APLICANDO EL MTODO GRFICO

1. Construya en un papel milimetrado la grfica de absorbancia frente concentracin de azul de metileno. Ejemplo:

2. Una vez obtenida la curva de calibracin, mida la absorbancia de la muestra

problema que el profesor le entregar. 3. Calcule la concentracin de la muestra problema por el mtodo grafico

interpolando su absorbancia en el grfico. APLICANDO EL MTODO ANALTICO

1. Obtenga el factor de calibracin (Fc) promedio con las soluciones estndar utilizadas

Fc [ ] = [estndar] / Abs estndar

2. Calcule la concentracin de la muestra problema por el mtodo analtico usando las formulas explicadas (1) y (3).

Finalmente compare los resultados obtenidos por los dos mtodos y analcelos. B.- ABTS.+ DISMINUCIN DE LA ABSORBANCIA FUNDAMENTO: La molcula ABTS [cido 2,2-azinobis-(3-etil benzotiazolina-6-

sulfnico)] es el sustrato para la formacin del radical libre catinico ABTS*+ que se

genera en reaccin con el persulfato de potasio. Este radical en presencia de

antioxidantes es reducido en funcin de la concentracin del antioxidante. La reaccin

se mide por la decoloracin del radical ABTS*+ a una longitud de 734 nm.

Preparar la siguiente batera de tubos: Solucin Stock: vitamina C, 250 ug/mL

Tubos N 1 2 3 4

uL Vitamina C [250 g/mL] 100 200 300 400

uL. Agua destilada 900 800 700 600

Concentracin ug/mL

De la batera anterior tomar los siguientes volmenes de vitamina C

Tubo ref. 4 3 2 1

L. AGUA 50 -- -- -- --

L. Vitamina C -- 50 50 50 50

L ABTS*+ 950 950 950 950 950

Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente por 7 minutos. Leer a 734 nm.

absorbancias

Elabore un grfico en papel milimetrado, colocando Y=absorbancia X= concentracin

(mM). Por ejemplo:

Luego, 1.- Determine la pendiente de la curva de la vitamina C. 2.- Mida la absorbancia de la muestra problema que el profesor le entregar. 3.- Determine la concentracin de la muestra problema empleando el grfico. CUESTIONARIO 1- Qu diferencia hay entre un espectrofotmetro y un fotocolormetro? Fue

necesario un espectrofotmetro para la realizacin de la prctica? Por qu? 2- Qu limitaciones tiene la ley de Lambert- Beer? 3- Describa con ejemplos dos mtodos para la eleccin de la longitud de onda

ptima para medir la absorbancia de una solucin? 4- Muestre dos ejemplos de mediciones por espectrofotometra uno por aumento y

otro por disminucin de absorbancia de aplicacin en bioqumica. 5- Problema: Una solucin coloreada presenta una A (absorbancia) de 0,450 en una

cubeta de 2 cm, hallar la A cuando la sustancia se ha diluido 5 veces y se lee en una cubeta de 1 cm.

BIBLIOGRAFIA: Fritz, J . S. Schenk, G. H. 1992. Qumica Analtica Cuantitativa. Editorial Limusa. S.A. Mxico D.F. Mxico. Melona, C.E. Kiser, R. M. 1973. Problemas y Experimentos en Anlisis Instrumental. Editorial Revert S.A. Mxico D.F. Mxico. Snchez, L.D. 1995. Instrumentacin en Bioqumicas. Fundamentos Bsicos. CONYTEC. Lima - Per. Skoog, D.A. 1989. Anlisis Instrumental. MC Graw-Hill. Mxico D.F. Mxico http://www.bioquimica.dogsleep.net/Laboratorio/Plummer/Chp04.pdf

PRACTICA N 02 A

FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

COMPETENCIAS PROCEDIMENTALES: Al finalizar la practica el alumno:

1. Explica la influencia de los factores que afectan la actividad enzimtica. 2. Determina el pH y la T ptima de la enzima pepsina.

INTRODUCCION:

Las enzimas son macromolculas catalticas principalmente de naturaleza proteica que aumentan las velocidades de reaccin bioqumica, siempre que sean termodinmicamente posibles. Una enzima hace que una reaccin energticamente posible pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. 1

Casi todos los procesos en las clulas necesitan enzimas para que ocurran a velocidades compatibles con la vida. A las reacciones mediadas por enzimas se les denomina reacciones enzimticas.

Como todos los catalizadores, las enzimas funcionan disminuyendo la energa de activacin (G) de una reaccin, de forma que se acelera sustancialmente la tasa de reaccin. Las enzimas no alteran el balance energtico de las reacciones en que intervienen, ni modifican, por lo tanto, el equilibrio de la reaccin, pero consiguen acelerar el proceso incluso millones de veces.

La actividad de las enzimas puede ser afectada por diversos factores. Existen molculas que actan como inhibidores enzimticos, estos disminuyen o impiden la actividad de las enzimas, mientras que los activadores son molculas que incrementan dicha actividad. Asimismo, gran cantidad de enzimas requieren de cofactores para su actividad. Muchas drogas o frmacos son molculas inhibidoras. Igualmente, la actividad es afectada por otros factores como la temperatura, el pH, la concentracin de la propia enzima y del sustrato, y otros factores fsico-qumicos.

La catlisis enzimtica es un fenmeno importante en la existencia de la vida tal como la conocemos. Por esto el estudio de las enzimas y de la catlisis enzimtica es de inters; en ausencia de una enzima apropiada, una gran cantidad de reacciones qumicas no slo ocurren muy lentamente sino que pueden no ocurrir del todo, esto indica que la presencia de la enzima es capaz de acelerar la velocidad de reaccin de una reaccin qumica especfica. La concentracin del catalizador es importante ya que al aumentar la cantidad de molculas de enzima presentes en la solucin aumenta la probabilidad de que los reactantes choquen con la enzima y ocurra as el evento cataltico. La forma en que la concentracin de un reactante afecta a la velocidad de reaccin se expresa a travs de lo que se conoce como orden de reaccin. A. Los factores que modifican la actividad enzimtica, son: 1) Concentracin de Substrato [S] 2) Concentracin de la Enzima [E] 3) pH del medio 4) Influencia de la temperatura 5) Efecto de inhibidores activadores

B. La actividad enzimtica puede expresarse: 1) Por la desaparicin del Substrato (S) 2) Por la aparicin de Productos (P) 3) Por modificacin de Cofactores (C) Las enzimas por su carcter proteico, poseen una composicin especfica de cadenas laterales determinadas por la secuencia de aminocidos del polipptido. La presencia de grupos ionizables en esta estructura explica el hecho de que las enzimas sean sensibles al pH tanto en su estabilidad, como en su capacidad cataltica. La determinacin de la actividad enzimtica en un ensayo depende de la energa cintica de las molculas y de la estabilidad de la enzima presente en el medio. Cuando se aumenta la temperatura, ambas reacciones se aceleran, observndose dos respuestas diferentes, en una se produce un aumento de la velocidad de reaccin, intervalo en el cual la enzima permanece relativamente estable y en la otra hay disminucin de la velocidad; en ambos casos, la cantidad de productos acumulados o de enzima desnaturalizadas, depende a su vez del tiempo que se haya permitido transcurrir, la temperatura optima ser dependiente del tiempo de ensayo y de factores como la fuerza inica. SUSTRATO: Son sustancias sobre las que actan las enzimas. En una reaccin bioqumica catalizada por una enzima, a medida que progresa la reaccin aumenta la concentracin de los productos a expensas de la desaparicin de los correspondientes sustratos; en tanto que la enzima (E) no se modifica. Cada sustrato puede ser caracterizado por el valor de Km, este corresponde a la concentracin necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad mxima de la enzima que cataliza esa reaccin. Las enzimas actan sobre un sustrato o un grupo reducido de sustratos. Esta caracterstica de alta especificidad de las enzimas permite la clasificacin de las enzimas. La pepsina es un enzima proteoltica (proteasa cida) secretada por las clulas principales de las glndulas gstricas, tiene un peso molecular aproximado de 34,644 Da. Hidroliza los enlaces peptdicos, descomponiendo as las protenas en pptidos y aminocidos. La pepsina solo realiza la protelisis en medio cido (pH bajo), por lo que es precisa la presencia de cido clorhdrico para la realizacin de la digestin gstrica de las protenas. Las clulas de las glndulas gstricas secretan la pepsina en forma inactiva bajo la forma de pepsingeno. Esta proenzima es convertida en pepsina en la luz de la glndula, al entrar en contacto con el cido clorhdrico y con la pepsina ya producida. En la prctica, se medir la actividad enzimtica de la pepsina. El sustrato empleado ser la albmina, a esta solucin le corresponder una determinada absorbancia, cuando se prepare el medio de reaccin, este ser evaluado por la desaparicin del substrato (disminucin de la turbidez en los tubos que contiene albmina), la cual se determinar en el espectrofotmetro 450 nm.

EXPERIENCIA N 1

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE LA TEMPERATURA

OBJETIVO: Determinar la temperatura ptima para la actividad de la pepsina.

Preparar dos series de tubos:

SERIE N 1

TUBOS N 1A 2A 3A B

mL H2O 3.5 3.5 3.5 4

mL HCl 1N 0.5 0.5 0.5 --

mL albumina 5 5 5 5

SERIE N 2

TUBOS N 1B 2B 3B ---

mL pepsina 1 1 1 ---

Pre-Incubar por separado los 6 tubos a 37C por 5 min segn el siguiente cuadro de temperaturas:

TUBOS N 1A y 1B 2A y 2B 3A 3B

Temperatura C 0 37 37 100

Agregar el contenido de los tubos 1A, 2A, y 3A a sus respectivos tubos 1B, 2B, y 3B. Luego incubar los 3 tubos a las siguientes temperaturas.

TUBOS N MEZCLA 1A+1B

MEZCLA 2A y 2B

MEZCLA 3A y 3B

Temperatura C 0 37 37

Posteriormente colocar los tubos en agua helada por 2 minutos para detener la reaccin. Leer las absorbancias en el espectrofotmetro a 450 nm.

La actividad enzimtica se encontrar restando la lectura del tubo blanco (B) menos lectura de los otros tres tubos (correspondiente a cada temperatura).

Graficar en papel milimetrado:

Actividad Enzimtica (Y) frente a Temperatura (X)

EXPERIENCIA N 2

EFECTO DEL pH OBJETIVO: Determinar el pH ptimo en el cual la actividad enzimtica de la pepsina es mxima.

Seguir el siguiente protocolo de trabajo:

Tubo 1 2 3 4 5 6 B mL Agua dest. - 1,5 2 1,5 - - 5

mL. HCL 2 0,5 - - - - -

mL Na2CO3 10% - - - 0,5 2 - -

mL albmina 5 5 5 5 5 - 5

mL pepsina 1% - - - - - 20

Calcule pH

Incube los tubos (del 1 al 6) por 5 min.

Aada del tubo N 6 (con cuidado), 3 mL de pepsina a los tubos N 1 al 5. Mezcle e incube a 37 C por 5 min.

Lea en el fotocolormetro a 450 nm. los tubos 1, 2, 3, 4, 5 y el tubo (B).

La actividad enzimtica ser obtenida de restar la lectura del tubo blanco (B) menos la lectura de cada uno de los 5 tubos.

Determine: Los valores del pH final para cada uno de los tubos Grafique en papel milimetrado:

Actividad Enzimtica (Y) frente a pH (X)

CUESTIONARIO 1. Problema.-

Las velocidades iniciales a varias concentraciones de sustrato para una reaccin catalizada por un enzima pepsina son:

[S] (moles/L) V (moles/min)

5x10-2 0.25

5x10-3 0.50 5x10-4 0.74 5x10-5 0.97 5x10-6 0.99 5x10-7 0.98

a.- Grafique segn MICHAELIS-MENTEN y tambin por el diagrama de LINEWEAVER-BURK. b.- Determine la velocidad mxima para esta reaccin. b.- Determine el valor de Km del sustrato en esta reaccin enzimtica

2. Interprete el valor del Km 4. Que efectos produce las altas temperaturas sobre las enzimas del tubo 3B? 5. Que otros factores conoce Ud. que puedan afectar la actividad enzimtica, como

lo hacen? 6. Cul es la funcin que cumple el carbonato de sodio en nuestro protocolo de trabajo?

BIBLIOGRAFIA: Bohinski, R.C. 1991. Bioqumica Addison _ Wesley Iberoamericana S.A. Wilmington, Delaware, USA. Fritz, J . S. Schenk, G. H. 1992. Qumica Analtica Cuantitativa. Editorial Limusa. S.A. Mxico D.F. Mxico. Melona, C.E. Kiser, R. M. 1973. Problemas y Experimentos en Anlisis Instrumental. Editorial Revert S.A. Mxico D.F. Mxico. Sanchez, L. D. 1992. Tcnicas Instrumentales de uso ms Frecuente en el Clnico y de Investigacin. Lima Per. Snchez, L.D. 1995. Instrumentacin en Bioqumicas. Fundamentos Bsicos. CONYTEC. Lima - Per.

PRACTICA N 02 B

DETERMINACIN DE LCTICO DESHIDROGENASA

COMPETENCIAS PROCEDIMENTALES

Al finalizar la Prctica de Laboratorio el alumno: 1. Determina la actividad enzimtica de la Lctico Deshidrogenasa en suero. 2. Interpreta y explica el significado de la elevacin de la Lctico Deshidrogenasa

en suero. INTRODUCCIN: SIGNIFICADO CLINICO

La enzima Lactato deshidrogenasa se encuentra concentrada en el corazn, rin, hgado, msculo y otros tejidos corporales. El dao a alguno de estos tejidos resulta en un aumento de los niveles sricos de LDH. La determinacin de la actividad de lactato deshidrogenasa (LDH) en suero, tiene una gran variedad de aplicaciones clnicas. Niveles elevados de LDH estn asociados con infarto del miocardio, dao renal, hepatitis, enfermedades musculares y otras patologas. Existen al menos cinco isoenzimas de LDH dependiendo de su origen tisular. En el caso del infarto agudo de miocardio (IAM), la actividad de LDH total (junto con las enzimas CK y GOT) constituye un elemento importante de diagnstico. La misma comienza a aumentar de 12 a 24 horas despus de producido el infarto; alcanza un pico entre las 48 - 72 horas y permanece elevada hasta el sptimo o dcimo da. Por otra parte, tambin se registra un aumento de la actividad de LDH total en pacientes con necrosis heptica (producida por agentes txicos o por infecciones agudas como la hepatitis viral) e incluso acompaando a necrosis tubular renal, pielonefritis, etc. FUNDAMENTO.- La enzima LDH cataliza la reaccin reversible de Piruvato a Lactato, pudindose emplear ambos como sustratos. El protocolo a trabajar est basado en el siguiente esquema de reaccin:

LDH Piruvato + NADH + H+ L-Lactato + NAD+ En este caso la enzima cataliza la reduccin del Piruvato a Lactato oxidando el NADH a NAD+. La coenzima NADH tiene un pico de absorbancia caracterstica a 340 nm. La concentracin de LDH se determina midiendo la disminucin de absorbancia a 340 nm a medida que se oxida el NADH. REACTIVO PROVISTO (se emplear un kit comercial) Solucin de buffer Tris, pH 7,2 conteniendo Piruvato y cloruro de sodio. Solucin conteniendo NADH. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". B. MUESTRA Se debe obtener suero de la manera usual libre de hemlisis y separar del cogulo dentro de las dos horas de su obtencin. Tambin puede usarse plasma C. MATERIAL Y EQUIPOS DE LABORATORIO - Espectrofotmetro. - Micropipetas. - Pipetas capaces de medir los volmenes. - Tubos de ensayo. - Cubetas espectrofotomtricas. - Reloj. - Bao de agua a temperatura indicada en el procedimiento. D. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LDH 1.- En una cubeta de cuarzo mantenida a la temperatura de trabajo de 30-37C colocar: 2.- Mezclar inmediatamente y disparar simultneamente el cronmetro. 3.- Esperar 30 segundos. 4.- Leer la Absorbancia inicial y luego a los 1, 2 y 3 minutos de la primera lectura a 340 nm. 5.- Determinar la diferencia promedio de Absorbancia/min (Abs/min), restando cada lectura de la anterior y promediando los valores. 6.- Utilizar este promedio para los clculos. CALCULO DE LOS RESULTADOS Los clculos se realizan como sigue:

LDH (U/L) = ( Abs / min) x 8095

REACTIVOS CUBETA

Reactivo LDH 2000 uL

Agua Destilada 1000 uL

Pre-incubar unos minutos, luego agregar

Muestra 50 uL

VALORES DE REFERENCIA

120 240 U/L a 25C 160 320 U/L a 30C 230 460 U/L a 37C

CUESTIONARIO:

1. Por qu es necesario obtener suero libre de hemlisis? 2. Si la reaccin enzimtica se midiera usando como sustrato lactato, cmo

realizara la medicin de la actividad enzimtica? 3. En un paciente con IAM cuando se debera determinar la concentracin de la

enzima LDH. 4. Un paciente con cncer le comenta a Ud.: me hice el examen LDH me salieron

los valores 19701 U/L? Cmo explicara esa situacin? 5. Un paciente de 37 aos lleva haciendo ejercicios por una temporada y al

realizar esfuerzos siente mucho dolor muscular en los das siguientes. El mdico le ha realizado una serie de pruebas para determinar si tiene algn problema muscular, una de las pruebas ha sido la actividad de LDH srica. El resultado ha sido que todo est bien menos en la parte de bioqumica suero, ya que la enzima LDH est por debajo de los niveles adecuados; el valor encontrado fue 160U/L cuando tendra que estar entre 240-480. Cmo explicara esa situacin?

BIBLIOGRAFIA: Bohinski, R.C. 1991. Bioqumica Addison _ Wesley Iberoamericana S.A. Wilmington, Delaware, USA. Fritz, J . S. Schenk, G. H. 1992. Qumica Analtica Cuantitativa. Editorial Limusa. S.A. Mxico D.F. Mxico.