GENI I EKSPRESIJA GENA HROMOSOMSKE REGIJE REPETITIVNE SEKVENCE PROCES TRANSKRIPCIJE I RNA SPLICING PCR ANALIZA PCR PRODUKATA

Protein-coding genTRANSKRIPCIJA

TRANSKRIPCIJA

5'……TTTACCGGAAAAGGGCTAG……3'sense ( + ) DNA 3'……AAATGGCCTTTTCCCGATC…….5' antisense ( - ) DNA

↓ transkripcija (-) DNA lanca

UUUACCGGUUUUGGGCUAG hnRNA

POLYMERASE CHAIN REACTION

LEUKEMIJA-MRD Monitoring pacijenata sa akutnom leukemijom ( AL), Tokom I nakon tretmana, na prisustvo preostalih leukemicnih celija ( minimal residual

disease –MRD ), vrsi se sa tri metode koje imaju dovoljnu senzitivnost od 10¯³ ( jedna leukemicna celija na 10³ normalnih celija ).

MRD-METODE Protocna citometrija – imunofenotipizacija PCR analiza Ig I T cell receptor gena PCR analiza break-point fuzion regiona hromosomskih aberacija ( RT-PCR analiza fuzionisanih genskih transkripata u slucajevima akutne leukemije).

HROMOSOMSKE ABERACIJE KARAKTERISTIČNE ZA AL t(1;19)(q23;p13) t(4;11)(q21;q23) t(8;21)(q22;q22) t(9;22)(q34;q11) t(9;22)(q34;q11) t(12;21)(p13;q22) t(15;17)(q22;q21) inv(16)(p13;q22) →CBFB/MYH11-1982.-DP-terapija sa BMT-subtipovi 10 del(1)(p32;p32

LEUKEMIJA Leukemija je progresivna maligna bolest koja se karakterise, povecanim brojem

obicno abnormalnih ili nezrelih leukocita u krvi. Takodjer broj eritrocita i krvnih plocica se reducira. Uobicajeni simptomi za leukemiju su anemija, hemoragicna tendencija, i povecana sklonost ka infekcijama.

Postoji akutna i kronicna leukemija a po osnovu tipa celija koje su oboljele( granularni PMNs i njihovi prekursori, BiT limfociti ili limfoblasti ili monociti, mijelociti ) postoji mijeloidna , limfaticna i monocitna leukenija. Leukociti su bijela zrnaca krvi i limfoidnog sistema ( granulociti, makrofagi i limfociti ) te prekursorske forme svakog od navedenih tipova leukocita

Termin leukociti se cesto upotrebljava samo za granulocite. Neki virusi mogu uzrokovati leukemije kod covjeka, zivotinja i ptica ( adult T-cell leukemija, avian acute leukemija virusi, bovine viral leukosis, feline leukemija virus, murine leukemija virus ).

Dakle, leukociti mogu biti granulirani ( bazofilni, eozinofilni i neutrofilni granulociti), te negranulirani ( limfociti B i T- odgovorni za humoralni i celijski imunitet i makrofagi

Granulociti – leukociti sa neutrofilnim, bazofilnim I eozinofilnim granulama u citoplazmi. Nazivaju se jos polimorfonuklearni leukociti. Imaju razlicit afinitet citoplazmatskih granulacija prema bojama. Kratko zive, nemaju sposobnost diobe te se kontinuirano nadomjestaju novim celijama iz kostane srzi.Mijelocit je razvojna forma izmedju promijelocita i metamijelocita u procesu nastanka zrelog segmentiranog polimorfonuklearnog granulocita.

Limfociti – tip leukocita koji su prisutni u krvi, limfi I limfnim cvorovimaSfericni su promjera 8-15 um sa negranuliranom citoplazmom te velikim nukleusom. Postoje B I T limfociti, koji su morfoloski identicni ali se razlikuju po povrsinskim celijskim antigenima ( imunofluorescentna tehnika ).

T limfociti su brojniji te su odgovorni za celijski imunitet a B limfociti za humoralni imunitet.B limfociti su odgovorni za formiranje antitjelaNalaze se u krvotoku, limfi I limfnim cvorovima. Kod sisara B limfociti se stvaraju u jetri fetusa a kasnije , nakon

poroda u kostanoj srzi.Ekspresijom Ig gena nastaju imunoglobulini ( IgG, IgM, IgA, IgE i IgD ).

Takodjer stvaraju receptore egzogenih IgG, klasu II antigena, receptore za T limfocite, komplement komponente te receptore za viruse T limfociti su odgovorni za formiranje antitjela I ima ih vise tipova. Stvaraju se u hematopoetskim ishodnim celijama

Nasuprot B limfocitima, T limfociti I to vecina tipova, prolazi proces sazrijevanja u timusu.T lifociti preko svojih membranskih povrsinskih receptora interreagiraju sa antigenima, mitogenima, limfokinima, Blimfocitima, makrofagima.Postoje citotoksicni T limfociti,helper T limfociti (TH,Th i Thelper celije). TH limfociti pomazu B limfocite u procesu formiranja antitjela. T limfociti-induktori i T limfociti –sMonocit je veliki (13-15 mikrona ) mononuklearni leukocit, koji nastaje u kostanoj srzi I jetri, gdje sazrijeva I razvija se u makrofag ( mononuklearni fagocit )

upresori. AKUTNA LIMFOBLASTICNA LEUKEMIJA(ALL ) PROLIMFOCITNA LEUKEMIJA (PREKURSORI B-LIMFOCITA )(PLL ) AKUTNA MIJELOIDNA LEUKEMIJA( AML )

ALL TIP CITOGENETIKA Burkit-tip t(8;14), t(8;22),

t(8;22 ) Hiperdiploidija broj hromosoma veci

od 50 TEL/AML1 t(12;21 ) E2A/PBX1 t(1;19 ) MLL/AF4 t(4;11 ) BCR/ABL t(9;22 ) Hipodiploidija broj hromosoma manji

od 45 ALL T-limfocita t(14q11 ) Citogeneticke abnormalnosti su pronadjene kod 60-75% pacijenata sa ALL. Iako je

frekvencija slicna, distribucija genetickih abnormalnosti je razlicita kod djece I odraslih. Kada se radi o slucajevima hiperdiploidije ( broj hromosoma veci od 47 ), frekvencija ovog genetickog poremecaja je slicna kod djece I odraslih.

Povecanje broja hromosoma je redovno povezano sa dobrom prognozom a smanjenje sa losom prognozom. BCR/ABL tip je mnogo frekventniji kod odraslih I ima dobru prognozu kao I tip TEL/AML1, kod koga pakje translokacija prikrivena I prisutna na molekularnom nivou kod 25% djece sa ALL I 2% odraslih sa ALL. 25% djece ima relaps ili ponovno vracanje ove bolesti.

PLL-B Karakteristicna je po leukocitozi prolimfocita a radi se o kronicnoj leukemiji B

limfocita. Hromosomi ukljuceni u citogeneticke poremecaje su 1,3,6,7,11,14 I 17. Na 17 hromosomu je smjesten p-53 gen I to na kracem kraku a u slucajevima B-PLL ovaj gen ima najveci broj mutacija u odnosu na sve ostale malgnancije b limfocita. T( 11;14 )( q13;q32) i/ili ciklin D1 ekspresija.

3.AKUTNA MIJELOIDNA LEUKEMIJA-AML Nastaje kao rezultatsomatskih mutacija. Etiologija je uglavnom nepoznata

izuzev poznatih slucajeva izlozenosti zracenju ( Hirosima, Cernobil, Marsalovi Otoci ), radijacijska terapija ili kronicna izlozenost benzenu. Od klasifikacija tipova AML mogu se izdvojiti kao opcepriznati klasifikacije Svjetske zdravstvene organizacije I najnovija FAB ili Francusko-Americko-Britanska klasifikacija

Klasifikacija AML po WHO ( World Health Organisation ) AML sa rekurentnim ili povratnim citogenetickim abnormalnostima

AML sa t(8;21 )( q22;q22 ), AML1/ETO AML sa inv(16)(p13q22), t(16;16 )(p13;q22), CBF/MYH11

(abnormalni eozinofili kostane srzi ) Akutna promijelocitna leukemija (APL) sa t(15;17 )(q22;q12 ) AML sa 11q23 ( MLL ) abnormalnostima

AML sa multilineage displazijama AML sa mijelodisplasticnim sindromom-uzrokovan terapijom AML tipovi koji jos nisu kategorizirani

AML- minimalna diferencijacija AML- bez sazrijevanja AML- sa sazrijevanjem Akutna mijelomonocitna leukemija Akutna monoblasticna/monocitna leukemija Akutna eritroidna leukemija Akutna megakarioblasticna leukemija Akutna bazofilna leukemija Akutna panmijeloza sa mijelofibrozom Mijeloidni sarkom

Metodi za detekciju MRD ( minimal residual disease ) tokom I nakon terapije pacijenata sa AML su: metafazna citogenetika ( target-struktura hromosoma), FISH ( target- struktura hromosoma ), protocna citometrija ( ekspresija povrsinskih antigena ), klonogeni eseji ( uzgoj malignih celija ) I PCR ( target- DNA I RNA sekvence ). Po vazecim parametrima senzitivnost PCR je 0,0001-0,1000, protocne citometrije 0.1-1,0 , FISH-1, a metafazne citogenetike 1-5. U novije vrijeme za pracenje ili monitoring MRD-a koriste se protocna citometrija, RT-PCR za detekciju fuzionisanih transktipata himernih gena, te PCR za analizu Ig-gena I gena odgovornih za receptore T-limfocita.

Monitornig pacijenata sa akutnom leukemijom, tokom I nakon tretmana na prisustvo preostalih leukemicnih celija ( minimal rezidual disease – MRD ili minimum rezidualne bolesti ), vrsi se danas sa tri tehnike cija je senzitivnost 0,0001( jedna leukemicna celija na 10000 normalnih celija ) :

imunofenotipizacija protocnom citometrijom PCR analize Ig gena I gena za receptore T-limfocita PCR analize fuzionisanih genskih transkripata ( multiplex RT-PCR screening split-out multiplex PCR ). Postoji devet dobro definisanih hromosomskih aberacija u osnovi kojih je fuzija

odredjenih gena, koje su najfrekventnije u slucajevima akutne leukemije. t(1;19)(q23;p13 ) – Fuzija gena E2A/PBX1 Prvi put definisana 1984. 25%-balansirana forma, 75%-nebalansirana

forma.Dva subtipa:E13/E2 I E13-27bp-E2. Korelacija sa klinickim simptomima kao sto

su visoki nivo serumske laktat dehidrogenaze te involviranje centralnog nervnog sistema. Sensitivnost detekcije sa PCR second round nested metodom je 0,00001

(4;11)(q21;q23) – Fuzija gena MLL/AF4 50-70% pozitivitet na ovu translokaciju kod ALL djece I 5% kod pedijatrijskih

slucajeva I odraslih sa ALL. 10 subtipova ( e8-e7;e8-e4;e9;e5;e9-e4; e10-e6;e10-e5; e10-e4; e11-e6; e11-e5; e11-e4 ).Delecija exona 11 MLL gena je u osnovi T-ALL. To je utvrdjeno analizama priferne krvi kao I mononuklearnih celija kostane srzi.. Znatan broj subtipova se ne moze otkriti citogenetickim metodama.Reciprocni AF4/MLL fuzionisani transkripti su pronadjeni kod 70% slucajeva.Nepovoljan prognosticki faktor u slucajevima akutne leukemije djece. Kod odraslih prognoza se poboljsava koristenjem visokih doza Ara-C.

(8;21) (q22;q22 ) – Fuzija gena AML1/ETO Prvi put opisana 1973. AML1 gene ili gen akutne mijeloidne leukemije. RT-

PCR pozitivitet fuzionisanih transkripata kod skorosvih slucajeva AML. Dobar prognosticki faktor a terapija sa citozin arabinozidom je vrlo uspjesna. Uobicajena je kod mladjih pacijenata. Najfrekventniji je M2 subtip. Senzitivnost sanested PCR dostize 0.00001

t ( 9;22 )(q34;q11 ) Fuzija gena BCR/ABL-p190, p210. Philadelphia hromosom ( Ph-hromosom )je ukljucen u pojavu kronicne mijeloidne

leukemije a takodjer I kod slucajeva ALL ( 5% djeca I 20-50% odrasli ). Nepovoljan prognosticki faktor.Moze doci to ponovne pojave RT-PCR pozitiviteta I

nakon izvrsene transplantacije kostane srzi. Zna ci da se radi o relapsu. Osam subtipova: e1-a2; e1-a3, e6a2 ( p190 ); b2a2, b3a2, c3a2,b2a3 i b3a3( p210 )

Agresivna terapija, alogena ili autologna transplantacija kostane srzi ili ishodnih celija periferne krvi. U tom slucaju RT-PCR detekcija BCR/ABL fuzionisanih transkripata predstavlja metod izbora kada se radi o monitoringu MRD-a. Adaptivna imunoterapija, antibody-based terapije ili terapija interferonom smanjuju mogucnost post-transplantacijskog relapsa.

Kod nekih pacijenata postoji ekspresija i p-190 i p-210. P-210 protein kodiran od strane fuzije gena BCR/ABL ima povecanu aktivnost tirozin kinaze. Studije su pokazale da dvije trecine pacijenata sa CML produciraju reciprocnu varijantu fuzije ova dva gena, dakle ABL/BCRcija uloga jos nije razjasnjena

BCR/ABL fuzijski protein varira u molekulskoj masi od 190-230 kDa, zavisno od breakpoint mjesta BCR gena.Ovaj diverzitet je u korelaciji sa fenotipom leukemije I njegovom nivou agresivnosti. Sa RT-PCR-om BCR/ABL transkripte je moguce detektovati u skoro > 95% CML-a. Citogenetickim metodama to nije bilo moguce.

Kvantitativni PCR predstavlja rani prediktorski metod u slucajevima izvrsene alogene tranplantacije ili nakon tretmana sa interferonom. Nested PCR imao je senzitivnost u detekciji fuzionisanih transkripata cak 0,000001 ili 10‾º I to neovisno o kojem tipu transkripata se radilo ( b2-a2 ili b3-a2 )

t ( 12;21 ) ( p13;q22 ) Fuzija gena TEL/AML1 Prvi podaci datiraju od 1995. Ova translokacija nije se mogla otkriti postojecim citogenetickim knonvencionalnim metodama. Velika frekvencija ove translokacije je u slucajevima ALL kod djece ( 25% ). Dobar prognosticki faktor.Cetiri subtipa: ex2, ex2∆ex3, ex3 i ex3∆ex3.T(15; 17 ) (q22;q21 ), Fuzija gena PML/RARA

Ova translokacija je najcesce vezana za akutnu promijelocitnu leukemiju ( APL ). Radi se o fuziji gena za alfa receptor retinoidne kiseline – Retinoid acid receptor alfa

gen ili RARA ) te gena za akutnu promijelocitnu leukemiju ( APL ). Kod pacijenata sa APL

Pronadjeni su himarni PML/RARA fuzionisani genski transkripti, kao I reciprocni RARA/APL transkripti, koji nastaju kao posljedica reciprocne translokacije izmedju navedena dva genaska lokusa. Los prognosticki faktor jer cesto dolazi do hiperleukocitoze. Nested PCR ima senzitivnost 10 ‾3. Pojava ekstra elektroforetskih traka uzrokovana je alternativnim splicingom PML exona. Postoje subtipovi: ex3/ex3; ex3δ/ex3; ex6/ex3; ex6D/ex3. Postoji jos translokacija t( 15;17 )(q21;q22 ) uzrokovana fuzijom NPM/RARA gena. Los prognosticki faktor a imaju S i L subtipovi ( kratki i dugi transkripti ).

Pronadjeni su himarni PML/RARA fuzionisani genski transkripti, kao I reciprocni RARA/APL transkripti, koji nastaju kao posljedica reciprocne translokacije izmedju navedena dva genaska lokusa. Los prognosticki faktor jer cesto dolazi do hiperleukocitoze. Nested PCR ima senzitivnost 10 ‾3. Pojava ekstra elektroforetskih traka uzrokovana je alternativnim splicingom PML exona. Postoje subtipovi: ex3/ex3; ex3δ/ex3; ex6/ex3; ex6D/ex3. Postoji jos translokacija t( 15;17 )(q21;q22 ) uzrokovana fuzijom NPM/RARA gena. Los prognosticki faktor a imaju S i L subtipovi ( kratki i dugi transkripti ).

del( 1 )( p32;p32 ) Fuzija gena SIL/TAL TAL je oznaka za T cell leukemia gen ( gen za leukemiju T limfocita ) a SIL je oznaka

za stem cell leukemia lokus ili SCL interrupting lokus. Ovi fuzionisani genski transkripti se ne mogu detektovati klasicnim citogenetickim metodama. Postoje tri tipa: 1a/4; 1a/3 i 1b/3. Po BIO-RAD interpretacijskim tabelama za RT-PCR Split-out subtipizaciju moguce je detektovati d1+d2 kombinaciju od 184 bp. SIL/TAL1 transkripti su karakteristicni za T-ALL ( djeca 5-25% ) I za T-ALL kod mladjih odraslih osoba sa frekvencijom od 10%.

Dakle, za slucajeve AL najcesci geneticki poremecaji su sljedeci: 1. t( 1;19 )(q23;p13 ) E2A/PBX1 nested PCR 10 ALL 2. t( 4;11 )(q21;q23 ) MLL/AF4 nested PCR 10 ALL I AML 3. t(8;21 )(q22;q22 ) AML1/ETO nested PCR 10 AML 4. t( 9;22 )(q34;q11 ) BCR/ABL nested PCR 10 ALL I AML

5. t( 9;22 )(q34:q11 ) BCR/ABL nested PCR 10 ALL I AML 6. t( 12;21 )(p13;q22 ) TEL/AML1 nested PCR 10 ALL 7. t( 15;17 )(q22;q21 ) PML/RARA nested PCR 10 AML 8. inv (16 )(p13;q22 ) CBFB/MYH11 nested PCR 10 AML 9. del(1)(p32;p32 ) SIL/TAL nested PCR 10 ALL ( T-ALL )

IZOLACIJA RNA Cista RNA ima apsorpciju A260/280 1.9-2.1.Mjerenje koncentracije RNA se izvodi

tako da se uzme 20 ul RNA u RNAse free water +80 ul RNAse free water ( 1:5 ). U kivetu koja je RNAse free ( isprana sa 0,1M NaOH, 1mM EDTA pa nakon toga ispiranje sa RNAse free water ).Koncentracija RNA: 40 ug/ml x A260 x dilucioni faktor ( 5 ). NPR. 40 ug/ml x 0,15 x 5 = 30 ug/ml. Ukupni prinos je koncentracija x 100 ul a to je 3 ug.

cDNA sinteza u 0,2 ml PCR epruvetice otpipetirati 10 ul ekstrahovane RNA I 4 ul cDNA primer

mixa. Miksati lagano pipetom smjesu 10 minuta. U posebnu 0,2 PCR epruveticu otpipetirati 10 ul RNAse free vode I 4 ul cDNA pr Primer mixa ( negativna kontrola ). inkubacija 5 minuta na 65ºC. Hladjenje na ledu. Mix za cDNA sintezu:

( 5 uzoraka ) 5x MMLV-RT pufer 27,5 ul 100 mM DTT 13,75 ul 10 mM dNTP mix 13,75 ul MMLV-RT 5,5 ul

Ukupno 60,5 ul

u svaku epruveticu nakon inkubacije otpipetirati po 11 ul cDNA synthesis mixa te lagano miksati pipetom sadrzaj.

Inkubacija na 37ºC 45 minuta U svaku epruveticu otpipetirati po 25 ul RNAse free vode radi razrijedjivanja cDNA. Inkubacija na 95ºC 5 minuta radi inaktivacije reverzne transkriptaze. Hladjenje na ledu. Cuvati na -20ºC.

First PCR master mix ( F-MIX ) – 1,5 ml ependorficaPCR program 15 min 95ºC X1 30 sekundi 95ºC 30 sekundi 58ºC x25 1,5 minuta 72ºC

Hladjenje 4ºC x1II – NESTED MASTER PCR AMPLIFIKACIJA

Nested master PCR mix ( N-MIX ) - 10 x PCR pufer 44 ul - dNTP mix 9 ul Hot Star Taq polimeraza 7 ul - RNAse free voda 275 ul

15 min 95ºC 1x 30 sek 95ºC 30 sek 58ºC 20x 1,5 min 72ºC 10 min 72ºC 1x 4ºC Hold 1x

M6A inv(16)(p13;q22) CBFB(16q22) GENI MYH11(16p13)

CBFB/MYH11 (D) – 288bp

CBFB/MYH11 (E ) –495 bp CBFB/MYH11 (G) –192 bp CBFB/MYH11 (H) –299 bpTIP I SUBTIPOVI LEUKEMIJE

BCR/ABLb3a2 – 472 bp BCR/ABLc3a2 – 1012 bp BCR/ABLb2a3 - 233 bp BCR/ABLb3a3 – 298 bp

BCR(22q11) BCR/ABLb2a2 –397 bp ABL(9q34 ) BCR/ABLb3a2 – 472 bp

BCR/ABLc3a2 – 1012 bp

BCR/ABLb2a3 - 233 bp

BCR/ABLb3a3 – 298 bp