Gének koordinált regulációjának két fő mechanizmusabaktériumokban

A) operon: gének egy lókuszban, közös transzkript, közös regulátorpolicisztronos elrendezés

B) regulon: gének szétszórva a genomban, közös regulátor

operon

regulon

A TRANSZKRIPCIÓS SZABÁLYOZÁS FŐBB GLOBÁLIS STRATÉGIÁI PROKARIÓTÁKBAN

inaktív aktivátor

inaktív

aktívaktivátor

indukálószerindukálószer

represszor

inaktív represszor

derepresszált

KATABOLIKUS

derepresszált

aktívrepresszor

indukálószer

represszált

BIOSZINTETIKUS

KATABOLIKUS

BIOSZINTETIKUS

indukált

aktív aktivátor

inaktív

inaktívaktivátor

indukálószer

RNS polimerázRNS polimeráz

inaktív represszor

RNS polimeráz RNS polimeráz

represszált

negatív szabályozás pozitív szabályozás

ind

uk

ció

rep

ress

zió

A transzkripciós faktorok és aDNS közötti specifikus kölcsönhatás

ún. Hélix-Turn-Hélix (HTH) motívumon megy keresztül

csgD: NNEIARSLFISENTVKTH LY

merR: IGEVALLCDINPVTLRAWQR

HTH Motívumok:

luxR: SWDISKILGCSERTVTFHLT

lehet a faktor N vagy C terminálisán,a másik végen szokott lenni a ligand, kofaktor kötő régió

BAKTERIÁLIS TRANSZKRIPCIÓS FAKTOROK FŐBB CSALÁDJAI

AraC család AraC, MelR, RhaS, RhaR, SoxS

LysR család LysR, OxyR, MetR, CysB

Crp család Crp, Fnr

MerR család SoxR

Két komponensű NarL, OmpR, Arc szabályozó család

Lac represszor család LacI, GalR

MetJ család MetJ

Faktor család Tagok

Aktiváció a gén Aktiváció a gén expresszióban I.expresszióban I.

Kölcsönhatás:

- CTD-nel (CRP)

- 70 4-es régiójával ( cI aktivátor)

- NTD-nel (CRP)

- alegységgel (DnaA)

- ’ alegységgel

(N4 single-stranded DNA kötő fehérje)

- CTD-nel és 70 4-es régiójával (FNR)

Positive activation of gene expression Virgil A Rhodius, Stephen JW BusbyCurrent Opinion in Microbiology 1998, 1:152-159.

Positive activation of gene expression Virgil A Rhodius, Stephen JW BusbyCurrent Opinion in Microbiology 1998, 1:152-159.

Aktiváció a gén expresszióban Aktiváció a gén expresszióban II.II.

Promóter konformáció megváltoztatása:

- “-35” és “-10” régió azonos oldalra kerül (MerR, SoxR)

- DNS visszahajlik és az aktiváló cis szekvencia RNAP fölé kerül

- DNS konformáció változást indukál (FIS, IHF)

DNS-hajlító fehérje(pl. IHF)

Specifius kötőhely

Távoli aktivátor helyek segítséget igényelnek

Aktiváció a gén expresszióban Aktiváció a gén expresszióban III.III.

2 aktivátortól függő promóterek:

- az aktivátor kötődése egy másik

aktivátortól függ (eukarióta)

- aktivátor kötődése egy másik aktivátor

áthelyeződését eredményezi

(CRP-MalT a malK promóteren)

- független aktiváció

(70 vagy NTD és CTD)

- represszor müködését gátolja

(FIS-NARL/P-FNR)

Positive activation of gene expression Virgil A Rhodius, Stephen JW BusbyCurrent Opinion in Microbiology 1998, 1:152-159

Transzkripció repressziója baktériumokban

FNRFNR- fumarát nitrát reduktáz regulátor

- citoplazmatikus szenzor-regulátor

- dimer[4Fe-4S]2+ DNS-t köt

- monomer[2Fe-2S]2+ inaktív

- aenaerob respirációra (+) vagy (-) hatás

- pO2 1 mbar alatt

- TTGAT-N4-ATCAA konszenzus szekvencia

- [2Fe-2S]2+ [4Fe-4S]2+ (in vitro)

Cys, Fe, DTT, NifS

- Pseudomonas: ANR; Bacillus: FNR

Rhodobacter sphaeroides: FnrL

O2

FNRred

FNRox

Komponensek

- egy szenzor kináz és egy DNS kötő regulátor

- E. coli genom 2%

- kb 50 különböző 2 komponensű rendszer

- 3 alcsalád: OmpR, FixJ és NtrC

Két komponensű szabályozó rendszerek

P

szenzor kináz fehérje

DNS kötő fehérje

P

Érzékelő Foszforilációs

Érzékelő Foszforilációs

Érzékelő Foszforilációs

Felvevő DNS kötő

Felvevő DNS kötő

szignál

transzfoszforiláció

DNS

DNS

A bakteriális kétkomponensű szabályozó rendszerek működése elve

- OmpR (E. coli):

porin szerveződés szabályozása ozmózis változás hatására

- általában 70 használó transzkripciót aktivál

- kölcsönhatás az RNS polimeráz alegységének C terminálisával

- ha az N terminális foszforilálódik megszünik a gátló hatása a C

terminális DNS kötő domén felé

OmpR

- általában 70 használó transzkripciót aktivál

- receiver domén deléciója esetén aktív transzkripció lesz

FixJ

NtrC

- N terminális receiver és C terminális DNS kötő domén között

egy központi ATPáz domén (glicin gazdag “Walker box”)

- DNS kötő domén FIS-hez homológ

(FIS: eukarióta enhancer kötő fehérje)

- általában 54 használó transzkripciót aktivál

ArcA/BArcA/B- aerobic respiratory control

- ArcB (szenzor kináz): sejt redox és metabolikus helyzet

(elektron transzport változást érzékel)

- ArcA(citoplazmatikus regulátor): ArcB foszforilálja aktív

- pO2 1-5 mbar között

- TATTTaa konszenzus szekvencia- Haemophilus: ArcA

- E. coli homológ gén: OmpR

O2

P

PArcB

ArcAP

ArcA

ArcA

ArcB

oxigén mentes környezet

FNR

P

Az ArcAB és FNR anaerob aktivációja

NarX/L és NarP/Q NarX/L és NarP/Q - nitrát regulator

- NarX és NarQ: membrán szenzor kináz

- NarL és NarP: citoplazmatikus regulátor

- szignál: nitrát és nitrit

- nitrát metabolizmusra hat

- NarL és NarP különböző génekre különböző atás a génexpresszió finom hangolása

NO3

NarPP

NarX

NarQ

NarLP

P

Kétkomponensű rendszerekvége

A lac operon kettős szabályozása

laktóz (allolaktóz) indukál glükóz gátol, cAMP/CAP-n

keresztül

glükóz/egyéb cukorkiiktatása tápból nem

célszerű

glükóz szabályozáskikapcsolása

trpAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCA

tacAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGA

lacUV5CCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGTGGA

lacCCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGGTGTGTGGA

“-35” “-10”

lac (és trp) alapú promóterek

lacUV5 lac promóter

UV

erősség

A transzkripciós faktorok sokoldalúak….

Ara C

-Ara PBAD represszió+Ara PBAD indukció

RNS polimeráz

PBAD

AraC

AraC

PBAD

a) hurok képződés indul

b) hurok képződés indul hibrid destabilizálódik

c) termináció

a) Rho kötődik és üldözi a polimerázt

b) hurok képződés, polimeráz megáll

c) Rho helikáz felszabadítja a transzkriptet, termináció

Transzkripció termináció baktériumokbanRho független Rho függő

A transzkripció és a transzláció párhuzamosanmegy baktériumokban

protein antranilát szintáz indol-glicerin szintáz triptofán szintáz

A triptofán operon szerkezete

A triptofán operon szabályozása

Termináció – attenuáció – trp operon

Termináció - antitermináció

túl sokat nemlehet vele kezdeni,génen belüli sajátság

E. coli-ban fehérje túltermeltetésre használt promóterek

mRNS degradáció baktériumokban

mRNS stabilitás prokariótákban néhány perc, eukariótákban órás nagyságrend

 előbb utóbb minden RNS lebomlik mRNS stabilitását meghatározó faktorok:

- belső, saját szerkezet- a környezet hatására bekövetkezett változás

a degradációs apparátusban

puf operon (a fotoszintetikus komplex komponensei) Rhodobacter capsulatus degradációja O2 hatására felgyorsul

policisztronos rendszerek esetén az alegységek arányának szabályozása

a mRNS régióinak eltérő stabilitásával

A R. capsulatus puf mRNS régióinak stabilitása

 - transzkripció gátlása (pl. rifampicin)t=0 időpontban, majd időközönként mintavétel és RNS analízis (Northern..)

- a degradációs mechanizmusban szerepet játszó gének deléciója, hőmérséklet érzékeny expressziós változatának kialakítása

- in vitro transzkripció jelölt nukleotidokkal, a kapott termék inkubációja a sejtextraktummal különböző ideig, majd analízis gélelektroforézissel, kvantitálás

mRNS degradáció baktériumokban, vizsgálati módszerek

Bacterial exoribonucleases

Polynucleotide phosphorylase

Ribonuclease PH

Ribonuclease II

Ribonuclease R

RNase D

Ribonuclease T

Ribonuclease BN

Oligoribonuclease

Bacterial endoribonucleases

Ribonuclease I

Ribonuclease III

Ribonuclease P

Ribonuclease E

Ribonuclease HI

A degradáció iránya virtuálisan 5' 3' irányú,

de ilyen enzimaktivitást nem lehet kimutatni prokariótákban

Megoldás: kombinált enzimműködés degradoszóma

RNázok, RNS degradáció

mRNS-t stabilizáló-destabilizáló tényezők

Az 5’ végi struktúra stabilizáló hatása

a stabillizálódás a mRNS hurok struktúrájában

vannem a riboszóma véd,a stabilizáló effektus átvihető más génekre

mRNS-eket stabilizáló (védő) tényezők

1. 5’ végi trifoszfát

2. RNS struktúra

3. riboszóma

A degradoszóma felépítése

Az RNaseE elsődleges felépítése

Érdekes módon sok bakteriális genomban nincs meg

A degradoszóma komponensei I.

Endoribonuclease E (RNáz E)

1061 aminosav 118 kDa fehérje, virtuálisan 180 kDa(oka prolin gazdag régió)

felismerő hely:(A/G)AUU(A/T)vagy egy komplex másodlagos struktúra

5' monofoszfátot preferál 5' trifoszfát stabilizál

N-terminális régió (50 kDa) hasonlít a Caf-re (cytoplasmic axial filament protein) feltételezett funkció a belső RNS transzportbanN terminális 70 aa (S1 domén) hasonlít a PNPase és RnaseII (illetve (CSP, cold shock protein, RNS chaperon) RNS kötő doménjére

C-terminálisa degradoszóma egyéb komponenseire megfelelő kötő domének

A degradoszóma komponensei II.

PNPase (polynucleotide phosphorylase)

78 kDa alegységek, homotrimer 3' 5' foszfát függő processzív exonukleáz, ribonukleotid difoszfátok képződnek poliadenilációs aktivitás

Polyphosphate Kinase (PPK)

funkció: ATP regeneráció,polifoszfát (inhibiálja a degradációt) eltávolítás

ppk mínusz törzs : megnövekedett mRNS stabilitás

80 kDa alegységek, homotetramer, sok van E. coli-ban

A degradoszóma komponensei III.

Helikáz

ATP függő DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) helikáz50 kDa RhlBa másodlagos struktúrák kinyitása szétroncsolása

ATP hiányában a hurokstruktúra

stabil marad

Egyéb – mRNS degradációjában résztvevő – enzimek

RNáz II

70 kDa monomer,a sejt 3' 5' exoribonukláz aktivitásának 90%-a ribonukleotid monofoszfátok képződneka PNPáz-zal együttes deléciója letális !!!

PolyA polimerázok

PAPI 53 kDaPAPII 35 kDa poliadeniláció, 15- 50 bázis hosszúmRNS instabilitás

A mRNS degradáció mechanizmusa