Gena- og gagnasGena- og gagnasöfn (GEG1103)öfn (GEG1103)

Fyrirlestrar 31-32

Umritamengi

DNA-flögur (microarrays)

UmritamengiUmritamengi

• Genamengi (genome): Hvað getur lífveran gert?

• Umritamengi (transcriptome): Hvað er lífveran að gera?

• Breytilegt milli vefja og með tíma• Geta verið mjög praktískar

upplýsingar• Þúsundir gena tjáðar samtímis

óhentugt að einangra hvert umrit fyrir sig þurfum aðferð sem getur skimað mikinn fjölda umrita samtímis

DNA-flögur (DNA-flögur (microarraysmicroarrays))

Box bls. 68-69 í Lesk http://www.sciencemag.org/feature/e-market/benchtop/chips_030405.sh

l

Nýleg tækni. Fyrst lýst af Schena et al. 1995 (Science 270,

467-470) Lesum tjáningu þúsunda gena samtímis Berum saman tjáningu milli tilraunaaðstæðna

• Kjarnsýra ýmist “spottuð” (array) eða “prentuð” á glerflögu með photolithography (chip)

• Tækni fengin úr hálfleiðara-iðnaðinum

• Oftast cDNA oligonucleotide (~ 25-500 basar)

Prentunartækni Affymetrix við gerð GeneChip® DNA-flagna

http://www.affymetrix.com

DNA-flögur (DNA-flögur (microarraysmicroarrays))

DNA-flögur (DNA-flögur (microarraysmicroarrays))

– mRNA einangrað úr vef

– mRNA merkt, t.d. með flúrljómandi efni

– mRNA-ið binzt (basaparast) við samsvarandi röð á flögunni

http://www.transcriptome.ens.fr

DNA-flögur (DNA-flögur (microarraysmicroarrays))

• Einlitar flögur:– eitt sýni, merkt með

einu litarefni– hver depill táknar eitt

gen– því dekkri depill, þess

meira magn af mRNA umriti

• Þurfum gagnabanka sem segir hvaða gen er í hverjum punkti

Tvílitar DNA-flögur Tvílitar DNA-flögur ((two channeltwo channel microarraysmicroarrays))

• Tvö mismunandi sýni:– Kontról (grænn litur – t.d.

Cy3)– Sample (rauður litur – t.d.

Cy5)

• Bæði sýnin látin á sömu flöguna og basapörun látin eiga sér stað– Hver depill getur nú fengið

einn af 4 mögulegum litum

http://www.bsi.vt.edu

Tvílitar DNA-flögur Tvílitar DNA-flögur ((two channeltwo channel microarraysmicroarrays))

• 4 litir: – GrænnGrænn: tjáning hærri í

kontról-sýni– RauðurRauður: tjáning hærri í

tilrauna-sýni– GulurGulur: jöfn tjáning í báðum

sýnum– SvarturSvartur: engin tjáning

• Magngreinum tjáninguna afstætt

• Getum flokkað gen eftir tjáningarmunstri

Hierarchical ClusteringHierarchical Clustering

http://cfpub.epa.gov/ncer_abstracts/index.cfm/fuseaction/display.abstractDetail/abstract/975/report/2001

• Getum stillt upp mörgum tilraunum og flokkað gen eftir tjáningu við mismunandi aðstæður

Krol & Becker 2004Krol & Becker 2004

• Sinorhizobium meliloti– -proteobaktería – vex í samlífi með

baunaplöntum– myndar rótarhnúða

(root nodules)– Rm1021 tjáir phoD

óskilyrt (constitutive), en í Rm2011 er phoD aðeins tjáð við fosfatskort

– RmH406: phoB stökkbrigði

http://soils.usda.gov/sqi/soil_quality/soil_biology/images/

Krol & Becker 2004Krol & Becker 2004

• “Pho regulon”– PhoB og PhoR stýra

tjáningu fjölda gena (a.m.k. 31 gen í E. coli), þ.m.t. S

– Virkjast við fosfórskort– phoCDET operon (tjáir

fosfat-ferju) er stýrt af PhoB/R í S. meliloti, tjáning eykst við fosfatskort

– Tjáning pit operons minnkar við fosfatskort http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Krol & Becker 2004Krol & Becker 2004 DNA-flögur búnar til:

6223 fákirni (70-liður) smíðuð skv. S. meliloti genamengi á NCBI

Rm1021, Rm2011 & RmH406 ræktaðar í æti með 100 mM Pi 2 mM Pi 0,1 mM Pi

mRNA safnað og cDNA búið til og merkt með Cy3 og Cy5

Tjáning pit og phoC er eins og við mátti búast DNA-flögurnar virka rétt

Krol & Becker 2004Krol & Becker 2004

http://www.genetik.uni-bielefeld.de/~abecker

Krol & Becker 2004Krol & Becker 2004

http://www.genetik.uni-bielefeld.de/~abecker

Krol & Becker Krol & Becker 20042004

• Hierarchical clustering sýnir 3 megin-hópa gena sem fosfórskortur og/eða phoB hafði áhrif á– I: Tjáning eykst við

fosfórskort og er háð phoB– II: Tjáning óháð phoB, en er

samt aukin við fosfórskort– III: Tjáning minnkuð við

fosfórskort, óháð phoB