Flow Cytometry
A. Flow Cytometry
1. Sejarah perkembangan flow cytometryPada 1934, Moldavan
pertama kali memperkenalkan alat hitung sel darah otomatik dengan
metode flow through. Kemudian, pada 1950 dikomersialkan alat dengan
metode impedansi, tetapi masih menggunakan pengenceran bahan di
luar alat. Sepuluh tahun kemudian, pengenceran tidak dilakukan di
luar alat, tapi secara otomatis.
Pada 1953, Crossland and Taylor memperkenalkan teknik
penghitungan sel darah, di mana sel dialirkan dalam saluran
tunggal, menggunakan bahan cair sebagai laminar sheat flow, dan sel
diperiksa dengan metode pendar cahaya.
Pada 1965, diperkenalkan pengukuran sel dengan pendar cahaya
yang ditangkap oleh detektor di lebih dari satu sudut dan
menggunakan sinar dengan intensitas kuat, yaitu sinar laser. Sinar
ini oleh sel itu dapat dipantulkan, dibias, bahkan tembus ke dalam
sel, sehingga dapat mendeteksi intrasel.
Metode flow cytometry terus berkembang dengan perkembangan
elektrik komputer dan reagen, termasuk digunakannya monoklonal
antibodi. Sampai saat ini, pengukuran dengan metode flow cytometry
menggunakan label fluoresensi, selain mengukur jumlah, ukuran sel,
juga dapat mendeteksi petanda dinding sel, granula intraselular,
struktur intra sitoplasmik, dan inti sel.
2. Definisi dan prinsip kerja flow cytometryFlow cytometry
adalah metode pengukuran (metri) jumlah dan sifat-sifat sel (cyto)
yang dibungkus oleh aliran cairan (flow) melalui celah sempit yang
ditembus oleh seberkas sinar laser. Setiap sel yang melewati berkas
sinar laser menimbulkan sinyal elektronik yang dicatat oleh
instrumen sebagai karakteristik sel bersangkutan. Setiap
karakteristik molekul pada permukaan sel maupun yang terdapat di
dalam sel dapat diidentifikasi dengan menggunakan satu atau lebih
probe. Oleh karena itu, instrumen dapat mengidentifikasi setiap
jenis aktivitas sel dan menghitung jumlah masih-masing dalam suatu
populasi campuran.
Setiap sel yang melewati berkas sinar laser akan menyebabkan
sinar laser terpencar (scattered) ke dua arah, yaitu forward
scatter (FSC) yang pararel dengan arah sinar dan side scatter (SSC)
yang arahnya tegak lurus pada arah sinar laser. Besarnya FSC
berbanding lurus dengan atau menggambarkan volume atau ukuran sel.
Sel yang mati (walaupun penampakan mikroskopis sebaliknya),
terlihat lebih kecil dibanding sel hidup. Sel darah merah juga
berbeda dengan sebenarnya, umumnya lebih kecil dari semua sel
darah. Adapun SSC ditentukan oleh morfologi dan emisi sinar
fluoresen yang dipancarkan oleh fluorokrom yang digunakan untuk
mewarnai sel. Sinyal-sinyal itu dikonversikan menjadi angka digital
dan diperlihatkan pada suatu histogram yang dapat dianalisis untuk
memperoleh informasi tentang karakteristik sel bersangkutan.
Gambar 1. Pancaran sinar laser saat sel melewati berkas sinar
laser
Untuk identifikasi antigen, dapat digunakan berbagai zat pewarna
fluorokrom. Fluorokrom merupakan suatu senyawa fluoresein yang
dapat berpendar saat mengalami eksitasi oleh sinar dengan panjang
gelombang tertentu. Berikut beberapa fluorokrom yang sering
digunakan dalam flow cytometry, yaitu fluorescein isothyocyanate
(FITC) yang memancarkan sinar hijau-kuning dengan emisi 519 nm,
4,6-Diamidino 2-Phenylinidole (DAPI) dengan emisi 455 nm, propidium
iodide (PI) dengan emisi 617 nm dan phycoeritrin (PE) yang
memancarkan sinar merah-orange dengan emisi 578 nm.
3. Kegunaan flow cytometryFlow cytometry merupakan sebuah metode
yang secara luas digunakan untuk meneliti ekspresi permukaan sel
dan molekul sellular, menggolongkan dan mendeskripsikan tipe sel
yang berbeda dalam populasi sel yang heterogen, menaksirkan
kemurnian subpopulasi yang terisolasi, dan menganalisis ukuran dan
jumlah sel.
Flow cytometry dengan cell sorting (fluorescence activated cell
sorter, FACS) memiliki aplikasi dalam sejumlah bidang, termasuk
biologi molekuler, patologi, imunologi, biologi tanaman, dan
biologi kelautan. Beberapa di antaranya, meliputi:
a. Analisis dan pemisahan subpopulasi limfosit dengan
menggunakan antibodi monoklonal terhadap antigen permukaan yang
diberi label dengan zat warna fluorokrom.
b. Pemisahan limfosit yang memproduksi berbagai kelas
imunoglobulin dengan menggunakan antibodimonoklonal terhadap kelas
dan subkelas Ig spesifik dan tipe L-chain.
c. Memisahkan sel hidup dari sel mati.
d. Analisis kinetik atau siklus sel dan kandungan DNA atau
RNA.
B. Flow CytometerFlow cytometer merupakan salah satu instrumen
yang menggunakan metode flow cytometry. Alat tersebut memiliki
kemudahan serta keunggulan dibanding dengan cara konvensional.
Selain dapat mengukur berbagai macam karakteristik sel dalam waktu
yang cepat secara simultan, teknologi ini juga memiliki ketepatan
dan ketelitian yang tinggi.
Flow cytometer pada dasarnya adalah mikroskop yang dilengkapi
dengan komponen yang berfungsi untuk melalukan individu sel secara
sekuensial melalui berkas cahaya (laser) yang akan dianalisis.
Komponen penyusunnya terdiri atas tiga sistem, yaitu fluida, optik,
dan elektronik.
1. Sistem fluidaGambar 2. Cara kerja sistem fluida
Sistem fluida mengarahkan sel melalui cahaya (laser) untuk
dianalisis, terdiri dari sheath fluid dan central channel. Tenaga
hidrodinamik mengakibatkan sel satu per satu melewati central
channel. Fluida merupakan bagian yang paling sensitif pada flow
cytometer. Jika terjadi kesalahan, semuanya akan salah dan fatal.
Masalahnya sebagai berikut:
a. Clogs, celah pada aliran larutan sangat kecil.
b. Gelembung udara, akan mengganngu aliran dan yang akan
diinterpretasikan sebagai sel.
c. Leaks, kurangnya tekanan udara dalam sistem akan mengganggu
aliran selular dan akan memengaruhi hasil.
d. Errors, yang paling umum memengaruhi fluida adalah:
- Clumps of cells. Hal ini akan clog mesin dan berakibat
kesulitan utama dan headaches. Kejadian ini dapat diatasi dengan
pre-filtrasi populasi sel tidak lebih besar dari 50 um filter.
- Konsentrasi sel yang tidak sesuai. Semua larutan memiliki
proporsi partikel debu yang rendah. Suatu flow rate yang lebih
besar sekitar 4.000 sel/sekon meningkatkan resiko pada pengukuran
multiple cell secara simultan.
2. Sistem optikSistem optik terdiri atas laser sebagai sumber
cahaya dan mengeksitasi (fluorokrom) sel dalam aliran sampel, serta
filter optik untuk mengarahkan sinyal cahaya yang dihasilkan ke
detektor yang sesuai.
Alasan penggunaan laser, karena kemampuannya untuk difokuskan
menjadi berkas cahaya elliptis. Ini terkait dengan
komponen-komponen fluida terkait. Laser memancarkan cahaya koheren
dan merupakan berkas sangat pararel. Hal ini memungkinkan dasar
pengukuran yang berbasis pada gangguan berkas (beam disturbance)
dapat dilakukan (forward scatter, side scatter). Penggunaan berkas
terfokus yang elliptis dapat menghasilkan hanya cahaya fluoresensi
dari single cell (size dependent) yang dapat diukur setiap
saat.
Pengukuran sel pada flow cytometer menggunakan prinsip pendar
cahaya (light scattering). Prinsip light scattering adalah metode
di mana sel dalam suatu aliran melewati celah di mana berkas cahaya
difokuskan ke sel (sensing area). Apabila cahaya tersebut mengenai
sel, akan dihamburkan, dipantulkan, atau dibiaskan ke semua arah.
Beberapa detektor yang diletakkan pada sudut-sudut tertentu akan
menangkap berkas-berkas sinar sesudah melewati sel. satu detektor
diletakkan berhadapan dengan sumber sinar (FSC), beberapa
diletakkan dengan membentuk sudut (SSC), dan detektor fluoresen.
FSC berkorelasi dengan volume atau ukuran sel, sedangkan SSC
berhubungan dengan kompleksitas bagian dalam partikel, seperti
ukuran nukleus, tipe granula sitoplasma, dan kekasaran membran
plasma.
Deteksi sinyal dilaksanakan dengan menggunakan kombinasi
photomultiplier (cathode-ray) dan rangkaian elektronika. Sinyal
yang dibangkitkan oleh setiap sel pada dasarnya merupakan
oscilloscope trace. Dengan melakukan integrasi sinyal ini, akan
dihasilkan suatu nilai numerik bagi fluoresensi maupun nilai
SSC.
3. Sistem elektronikSistem elektronik berfungsi untuk mendeteksi
cahaya dan mengubahnya ke bentuk sinyal digital. Data yang
dihasilkan oleh flow cytometer dapat diplot dalam satu dimensi,
untuk menghasilkan histogram atau dalam dua dimensi plot titik,
atau bahkan dalam tiga dimensi. Plot sering dibuat pada skala
logaritmik, karena emisi pewarna fluoresen yang berbeda. Data
akumulasi menggunakan flow cytometer dapat dianalisis menggunakan
perangkat lunak komputer, seperti WinMDI Flowjo, FCS Ekspres,
VenturiOne, CellQuest Pro, atau Cytospec.
Gambar 3. Grafik representasi data flow cytometry
C. Aplikasi Flow Cytometry dengan Flow Cytometer FACS Calibur1.
Analisis DNA (Pengukuran kinetik sel )Pengukuran kinetik
pertumbuhan sel diperlukan untuk menentukan prognosis kanker,
mengetahui dinamika sel T pada infeksi HIV, dan sebagainya. Kinetik
sel dapat dipelajari dengan berbagai cara, salah satunya adalah
dengan mengukur indeks proliferasi. Pengukuran indeks proliferasi
sel dapat dilakukan dengan menentukan proporsi atau fraksi sel
dalam fase-S (yaitu: suatu fraksi dari populasi sel total dalam
siklus sel) dan mengukur kandungan DNA. Salah satu metode yang
dapat digunakan adalah metode flow cytometry. Prinsip metode ini
adalah mengukur emisi fluoresen fluorokrom yang terikat pada DNA
dalam sel apabila sel itu dilewatkan berkas sinar dengan panjang
gelombang yang sesuai (laser). Zat warna fluorokrom dapat mengikat
DNA secara stokiometris. Pengikatan zat warna fluorokrom pada DNA
dapat memberikan informasi tentang kandungan DNA total dan fraksi
sel yang berada pada siklus sel secara cepat, akurat, dan praktis.
Fluorokrom yang digunakan untuk kuantifikasi DNA adalah propidium
iodide (PI) dan ethidium bromida. Interkalasi fluorokrom ini di
antara pasangan basa dsDNA atau RNA menghasilkan suatu kompleks
dengan fluoresensi efisien yang dapat dideteksi dengan sinar laser
dengan kekuatan relatif rendah. Kandungan DNA relatif (status
ploidi) dari satu populasi sel dinyatakan dengan indeks DNA dalam
fraksi Go/G1 populasi sel bersangkutan dibandingkan terhadap
populasi sel kontrol diploidi. Indeks DNA populasi sel normal
ploidi adalah 1.0. Sel ganas, walaupun tidak selalu, biasanya
menunjukkan kandungan DNA abnormal (aneuploidi) dan pada histogram,
populasi abnormal akan menunjukkan puncak ekstra (hiperdiploidi).
Fraksi sel yang berada pada fase Go/G1, S dan G2M dapat dihitung
dari distribusi DNA.
2. Analisis DNA (Analisa status ploidi tanaman)Analisa ploidi
tanaman dapat dilakukan dengan menggunakan flow cytometry. Sampel
dapat berupa jaringan daun tanaman yang kemudian dilisiskan dalam
larutan buffer pelisis dan DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole).
Selanjutnya larutan difiltrasi untuk memisahkan debris. Filtrat
kemudian dideteksi kandungan DNA-nya dengan flow cytometry. Ploidi
dari tanaman ditentukan dengan mengamati peak atau puncak yang
ditunjukkan pada layar monitor.
3. Uji fungsi neutrofil Uji fungsi neutrofil merupakan parameter
penting dalam menganalisis respon imun seluler nonspesifik.
Pengujian ini dapat dilakukan dengan cara uji fagositosis partikel
bakteri dan uji aktivitas phagocyte respiratory burst menggunakan
metode flow cytometry. Prinsip uji fagositosis adalah menganalisis
jumlah neutrofil yang mengandung bakteri berlabel yang
dibubuhkan.
Pengukuran fungsi fagositosis dan respiratory burst secara
simultan dapat dilakukan menggunakan darah yang diinkubasi dengan
kuman Stafilococcus aureus atau E coli yang telah diberi label
fluorescein FITC selama waktu tertentu (biasanya 60 menit) guna
menganalisis proporsi sel yang berisi bakteri. Fungsi respiratory
burst dievaluasi dengan mengukur banyaknya ethidium bromide (EB)
berfluoresensi merah yang dihasilkan oleh oksidasi hidroethidin
yang terjadi akibat dibentuknya produk oksidatif oleh PMN atas
rangsangan bakteri yang difagositosis. Jadi, yang diukur oleh flow
cytometer adalah proporsi sel yang berisi bakteri yang
berfluoresensi hijau dan intensitas fluoresensi merah yang
dihasilkan EB dalam sel PMN bersangkutan. Fluorokrom yang dapat
digunakan, antara lain propidium iodide yang berfluoresensi merah
untuk melabel Stafilococcus dan dihidrorhodamine 123 yang akan
berubah menjadi rhodamine 123 yang berfluoresensi hijau setelah
dioksidasi.
4. Monitoring penderita terinfeksi virus HIV (Pengukuran
limfosit T) Monitoring status imunologi pada infeksi HIV bisa
dilakukan dengan metode flow cytometry. Pemeriksaan menggunakan
flow cytometer yang berbasis flow cytometry merupakan pemeriksaan
yang paling baik untuk limfosit T helper/inducer (CD4+) atau
limfosit T supressor/cytotoxic (CD8+).
Virus HIV menginfeksi limposit T helper atau melalui antigen
CD4+. Limposit yang terinfeksi ini kemudian lisis ketika virion
baru dilepaskan atau dipindahkan oleh sistem imun selular. Pada
infeksi HIV yang progresif, jumlah CD4+ dan limposit T menurun.
Jumlah absolut CD4+ merupakan pengukuran yang penting untuk
memprediksi, menentukan derajat, dan monitoring progresivitas serta
respons terhadap pengobatan pada infeksi HIV. Pemeriksaan jumlah
virus melengkapi pemeriksaan laboratorium untuk monitoring
penyakit. Besarnya berbanding terbalik dengan jumlah CD4+. Jadi,
jumlah CD4+ dan jumlah virus secara langsung menunjukkan status
imun penderita. Ini berguna untuk menentukan diagnosa, prognosa,
dan manajemen pengobatan pada penderita yang terinfeksi HIV.
Nilai normal limfosit TDewasa:
- Limfosit T CD4 absolut :lebih besar dari 500/cmm3- Limfosit T
CD4 % :lebih besar dari 25%
Bayi 12 bulan:
- Limfosit T CD4 absolut :lebih besar dari 1.500/cmm3- Limfosit
T CD4 % :lebih besar dari 25%
Anak-anak 1-5 tahun:
- Limfosit T CD4 absolut :lebih besar dari 1.000/cmm3- Limfosit
T CD4 % :lebih besar dari 25%
Contoh pemeriksaan laboratorium a. Persiapan sampel : 3 ml darah
vena dimasukkan ke dalam tabung vakum K3EDTA dan ditutup rapat
(pada suhu kamar, sampel stabil RBC (36-360 fl) > PLT (2-20 fl).
Iya toh??
Nah, misalnya ada sel yg melewati celah, dan setelah sinyal
terbentuk ternyata sel tsb memiliki volume sebesar 300 fl. Maka sel
tersebut akan dikelompokkan/dibaca detektor sebagai sel darah
merah. Kemudian sel selanjutnya setelah diukur, ternyata memiliki
volume 400 fl. Maka sel tersebut akan dikelompokkan/dibaca sebagai
sel darah putih. Dan begitu seterusnya hingga sel terhitung
semua.
Setelah pengukuran selesai, dapat dilihat berapa jumlah total
RBC, WBC, dan PLT sehingga hasilnya bisa dimanfaatkan untuk
membantu penegakan diagnosa oleh dokter apakah pasien mengnderita
anemia, polisitemia, leukositosis, trombositopenia, atau leukimia.
Setelah mengetahui hal tersebut, maka dokter juga dapat mengetahui
apa penyebabnya dan medikasi bisa ditentukan.
Metode pengukuran dgn impedansi ternyata memiliki kekurangan
yaitu :
- kemungkinan dua sel melewati celah dalam satu waktu.
Akibatnya, detektor akan membaca ukuran sel lebih besar dari
ukurannya yg sebenarnya. Lalu, apa pengaruhnya pada hasil
perhitungan?? - kemungkinan sel yang telah diukur (melalui celah)
akan kembali lagi ke sensing zone. Akibatnya, sel ini akan dihitung
dua kali oleh detektor.
- Akibat adanya sistem vakum (hydrodinamik),yg sebenarnya
dimanfaatkan untuk mengatur jalannya sel melewati apperture, sel
bisa mengalami deformitas atau perubahan bentuk. Misalnya, yang
seharusnya sel berbentuk bulat, menjadi lonjong atau elips. Jika
ini terjadi, maka waktu yg digunakan sel tersebut utk melewati
apperture akan semakin besar.Sehingga detektor akan membaca ukuran
sel tsb lebih besar dari ukurn yang sebenarnya.
* Flowsitometri
Cara mudah utk mingatnya, flowsitometri atau flowcytometry
terdiri dari tiga kata yakni (flow = mengalir), (cyto = sel) dan
(metry = yg berhubungan dgn pengukuran). Kalw diartikan secara
singkat, maka flowsitometri berarti suatu metode pengukuran sel
yang dalam keadaan mengalir. Lho, kok bisa mengalir? Berarti
sel2nya disuspensikan ke dalam cairan dan diberikan tekanan agar
bisa mengalir.
Prinsip kerjanya kurang lebih sepeti ini :
- Sejumlah sel disuspensikan ke dalam suatu cairan
konduktif.
- Sel2 tersebut diatur sedemikian rupa (diberikan tekanan
hydrodynamic focussing) sehingga dapat melewati suatu lorong
(apparatus) satu demi satu.
- Ketika sel sampai di suatu titik di lorong tsb, sel akan
ditembak dengan sinar laser (Light amplification by stimulating
emmision of radiation).
- Lalu, hasil temakan tadi, akan dibaca oleh dua macam
detektor.
detektor yg pertama, letaknya sejajar dengan sumbu X terhadap
sumber tembakan. Sinyal yg didapatkan di sini, akan dibaca sebagai
gambaran ukuran sel yang ditembak.
Detektor yang kedua, letaknya 90 derajat terhadap sumber
tembakan / laser. Sinyal yang didapatkan disini, akan dibaca
sebagai gambaran sitosolik yg ada dalam sel (mis : granul)
Nah, udah dapet toh inti perbedaan dari kedua metode ini?
Kalw belum, coba simak lagi nyank ne.
Misalnya pada pengukuran WBC. Kita tahu bahwa WBC itu jenisnya
terbagi dua. Ada sel agranular (limfosit dan monosit) dan ada sel
granular (neutrofil, basofil, dan eusinofil). Jika kita melihat
jumlah sel darah putih dgn metode impedansi, maka kita akan
mendapatkan jumlah sel darah putih secara keseluruhan. Namun, bila
kita melihat jumlah leukosit dgn metode flowsitometri maka kita
akan mendapatkan jumlah yang lebih rinci dan spesifik. Sebab, alat
ini akan memberitahu berapa jumlah sel bergranul dan jumlah sel tak
bergranul.
